BRPI0610012A2 - ensaio molecular por aspiração com agulha fina da tiróide - Google Patents
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Abstract
ENSAIO MOLECULAR POR ASPIRAçãO COM AGULHA FINA DA TIROIDE. A presente invenção refere-se a processos, composições e artigos direcionados para o diagnóstico de carcinoma de tiróide, diferenciando entre carcinoma de tiróide e doenças benignas da tiróide, testando amostras de aspirado com agulha fina da tiróide indeterminado de nódulos da tiróide e determinando protocolos e resultados dos pacientes.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ENSAIO MOLECULAR POR ASPIRAÇÃO COM AGULHA FINA DA TIRÓIDE"
FUNDAMENTO DA INVENÇÃO
Há aproximadamente 25.600 novos casos de carcinoma de tirói-de diagnosticados nos Estados Unidos da América a cada ano e 1.400 paci-entes morrerão da doença. Aproximadamente 75% de todos os cânceres detiróide pertencem ao tipo de carcinoma de tiróide papilar. O resto consiste de10% de carcinoma folicular, 5% até 9% de câncer medular de tiróide, 1% até2% de câncer anaplásico, 1% até 3% de linfoma e menos que 1% de sarco-ma e outros tumores raros. Geralmente uma massa informe (nódulo) na ti-róide é o primeiro sinal de câncer de tiróide. Há 10 até 18 milhões de pesso-as nos EUA com um único nódulo na tiróide e aproximadamente 490.000 setornam clinicamente evidentes a cada ano. Felizmente apenas aproximada-mente 5% destes nódulos são cancerosos.
O método comumente utilizado para o diagnóstico de câncer detiróide é a biópsia por aspiração com agulha fina (FNA). As amostras de FNAsão verificadas citologicamente para determinar se os nódulos são benignosou cancerosos. A gravidade e a especificidade da FNA variam de 68% até98% e 72% até 100% respectivamente, dependendo das instituições e dosmédicos. Infelizmente, em 25% dos casos os espécimes são inadequadospara diagnóstico ou não podem ser determinados por citologia. Na práticamédica atual, os pacientes com resultados indeterminados são mandadospara cirurgia, com a conseqüência de que apenas 25% possuem câncer e75% acabam passando por cirurgia desnecessária. Um ensaio molecularcom alta sensibilidade e uma melhor especificidade (maior que 25%) aumen-taria enormemente a acurácia do diagnóstico de câncer de tiróide e omitiria acirurgia desnecessária para pacientes que não possuem câncer.
A hibridização genômica comparativa (CGH), a análise em sérieda expressão gênica (SAGE) e o microarranjo de DNA foram utilizados paraa identificação de eventos genéticos que ocorrem em cânceres de tiróide taiscomo a perda de heterozigosidade, regulação para mais e para menos dogene e rearranjos genéticos. Foi demonstrado que o evento de rearranjo ge-nético de PAX8 e PPARv estava associado com o câncer folicular de tiróide(FTC). O rearranjo do proto-oncogene ret está relacionado com o câncerpapilar de tiróide (PTC). A regulação para menos do gene da peroxidase datiróide (TPO) é observada tanto no FTC quanto no PTC. Foi relatado que aGalectina-3 é um marcador candidato para diferenciar neoplasmas malignosda tiróide de lesões benignas. Entretanto, há outros estudos que demons-tram que a Galectina-3 não é um marcador específico para câncer. Muitosgenes que pareciam ser úteis no diagnóstico de câncer de tiróide não pos-suem a sensibilidade e a especificidade necessária para um ensaio molecu-lar acurado.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção abrange métodos de diagnóstico de câncerde tiróide através da obtenção de uma amostra biológica de um paciente; eda medida dos níveis de expressão na amostra de genes selecionados dogrupo que consiste daqueles que codificam mRNA: correspondendo às SEQID NOs: 36, 53, 73, 211 e 242; e/ou correspondendo às SEQ ID NOs: 199,207, 255 e 354; ou reconhecidos especificamente pelos conjuntos de sondasselecionados do grupo que consiste de psids correspondendo às SEQ IDNOs: 36, 53, 73, 211 e 242 como apresentado na Tabela 25; e/ou reconhe-cidos especificamente pelos conjuntos de sondas selecionados do grupo queconsiste de psids correspondendo às SEQ ID NOs: 199, 207, 255 e 354 co-mo apresentado na Tabela 25; em que os níveis de expressão gênica acimaou abaixo dos níveis de limite pré-determinados são indicativos de câncer de tiróide.
A presente invenção abrange métodos de diferenciação entrecarcinoma de tiróide e doenças benignas da tiróide através da obtenção deuma amostra de um paciente; e da medida dos níveis de expressão na a-mostra de genes selecionados do grupo que consiste daqueles que codifi-cam mRNA: correspondendo às SEQ ID NOs: 36, 53, 73, 211 e 242; e/oucorrespondendo às SEQ ID NOs: 199, 207, 255 e 354; ou reconhecidos es-pecificamente pelos conjuntos de sondas selecionados do grupo que consis-te de psids correspondendo às SEQ ID NOs: 36, 53, 73, 211 e 242 comoapresentado na Tabela 25; e/ou reconhecidos especificamente pelos conjun-tos de sondas selecionados do grupo que consiste de psids correspondendoàs SEQ ID NOs: 199, 207, 255 e 354 como apresentado na Tabela 25; emque os níveis de expressão gênica acima ou abaixo dos níveis de limite pré-determinados são indicativos de carcinoma de tiróide.
A presente invenção abrange métodos de teste de amostras denódulos de tiróide indeterminadas por aspirados com agulha fina da tiróide(FNA) através: da obtenção de uma amostra de um paciente; e da medidados níveis de expressão na amostra de genes selecionados do grupo queconsiste daqueles que codificam mRNA: correspondendo às SEQ ID NOs:36, 53, 73, 211 e 242; e/ou correspondendo às SEQ ID NOs: 199, 207, 255 e354; ou reconhecidos especificamente pelos conjuntos de sondas seleciona-dos do grupo que consiste de psids correspondendo às SEQ ID NOs: 36, 53,73, 211 e 242 como apresentado na Tabela 25; e/ou reconhecidos especifi-camente pelos conjuntos de sondas selecionados do grupo que consiste depsids correspondendo às SEQ ID NOs: 199, 207, 255 e 354 como apresen-tado na Tabela 25; em que os níveis de expressão gênica acima ou abaixodos níveis de limite pré-determinados são indicativos de câncer de tiróide.
A presente invenção abrange métodos de determinação do pro-tocolo de tratamento de um paciente com câncer de tiróide através: da ob-tenção de uma amostra biológica de um paciente com câncer de tiróide; e damedida dos níveis de expressão na amostra de genes selecionados do gru-po que consiste daqueles que codificam mRNA: correspondendo às SEQ IDNOs: 36, 53, 73, 211 e 242; e/ou correspondendo às SEQ ID NOs: 199, 207,255 e 354; ou reconhecidos especificamente pelos conjuntos de sondas se-lecionados do grupo que consiste de psids correspondendo às SEQ ID NOs:36, 53, 73, 211 e 242 como apresentado na Tabela 25; e/ou reconhecidosespecificamente pelos conjuntos de sondas selecionados do grupo que con-siste de psids correspondendo às SEQ ID NOs: 199, 207, 255 e 354 comoapresentado na Tabela 25; em que os níveis de expressão gênica acima ouabaixo dos níveis de limite pré-determinados são suficientemente indicativosde câncer para possibilitar que um médico determine o tipo de cirurgia e/outerapia recomendado para tratar a doença.
A presente invenção abrange métodos de tratamento de um pa-ciente com câncer de tiróide através da obtenção de uma amostra biológicade um paciente com câncer de tiróide; e da medida dos níveis de expressãona amostra de genes selecionados do grupo que consiste daqueles que co-dificam mRNA: correspondendo às SEQ ID NOs: 36, 53, 73, 211 e 242; e/oucorrespondendo às SEQ ID NOs: 199, 207, 255 e 354; ou reconhecidos es-pecificamente pelos conjuntos de sondas selecionados do grupo que consis-te de psids correspondendo às SEQ ID NOs: 36, 53, 73, 211 e 242 comoapresentado na Tabela 25; e/ou reconhecidos especificamente pelos conjun-tos de sondas selecionados do grupo que consiste de psids correspondendoàs SEQ ID NOs: 199, 207, 255 e 354 como apresentado na Tabela 25; emque os níveis de expressão gênica acima ou abaixo dos níveis de limite pre-determinados são indicativos de câncer; e do tratamento do paciente comuma tiroidectomia se este for positivo em relação ao câncer.
A presente invenção abrange métodos de validação cruzada deum perfil de expressão gência para pacientes com carcinoma de tiróide atra-vés: a. da obtenção dos dados de expressão gênica partindo de um númeroestatisticamente significativo de amostras biológicas de pacientes; b. da mis-tura aleatória da ordem das amostras; c. do ajuste de dados aparte de apro-ximadamente 10% - 50% das amostras; d. da computação, para o restantedas amostras, em relação ao fator de interesse em todas as variáveis e daseleção das variáveis que satisfazem um limite de valor de p (p); e. da sele-ção de variáveis que se ajustam com um modelo de previsão utilizando umabusca para frente e avaliando o erro de treinamento até que atinja uma taxade erro pré-determinada; f. do teste do modelo de previsão nos restantes 10-50% das amostras; g. da repetição das etapas c, -g. com um novo conjuntode amostras removido; e h. da continuação das c) -g) até 100% das amos-tras terem sido testados e o desempenho de classificação registrado.
A presente invenção abrange métodos de validação independen-te de um perfil de expressão gênica e de perfis gênicos obtidos através dosmesmos para pacientes com carcinoma de tiróide através da obtenção dosdados de expressão gênica partindo de um número estatisticamente signifi-cativo de amostras biológicas de pacientes; da normalização das variabilida-des das fontes nos dados de expressão gênica; da computação em relaçãoao fator de interesse em todas as variáveis que foram selecionadas anteri-ormente; e do teste do modelo de previsão na amostra e o desempenho declassificação registrado.
A presente invenção abrange um método de produção de umescore de probabilidade posterior para possibilitar o diagnóstico de pacientescom carcinoma de tiróide através: da obtenção de dados de expressão gêni-ca partindo de um número estatisticamente significativo de amostras biológi-cas de pacientes; da aplicação da análise de discriminação linear aos dadospara a obtenção de genes selecionados; e da aplicação dos níveis de ex-pressão pesados aos genes selecionados com o fator de função discrimina-do para a obtenção de um modelo de previsão que pode ser aplicado comoum escore de probabilidade posterior.
A presente invenção abrange métodos de produção de um relatode pacientes com prognóstico de carcinoma de tiróide e relatos obtidos atra-vés dos mesmos, através da obtenção de uma amostra biológica do pacien-te; da medida da expressão gênica da amostra; da aplicação de uma proba-bilidade posterior aos mesmos; e da utilização dos resultados obtidos atra-vés dos mesmos para gerar o relato.
A presente invenção abrange composições que contêm pelomenos um conjunto de sondas selecionado do grupo que consiste de: SEQID NOs: 36, 53, 73, 211 e 242; e/ou SEQ ID NOs: 199, 207, 255 e 354; ou ospsids correspondendo às SEQ ID NOs: 36, 53, 73, 211 e 242; e/ou SEQ IDNOs: 199, 207, 255 e 354 como apresentado na Tabela 25.
A presente invenção abrange kits para a realização de um en-saio para determinar o diagnóstico de carcinoma de tiróide em uma amostrabiológica contendo: materiais para a detecção de seqüências de ácidos nu-cléicos isoladas, seus complementos ou partes das mesmas de uma combi-nação de genes selecionados do grupo que consiste daqueles que codificammRNA: correspondendo às SEQ ID NOs: 36, 53, 73, 211 e 242; e/ou corres-pondendo às SEQ ID NOs: 199, 207, 255 e 354; ou reconhecidos especifi-camente pelos conjuntos de sondas selecionados do grupo que consiste depsids correspondendo às SEQ ID NOs: 36, 53, 73, 211 e 242 como apresen-tado na Tabela 25; e/ou reconhecidos especificamente pelos conjuntos desondas selecionados do grupo que consiste de psids correspondendo àsSEQ ID NOs: 199, 207, 255 e 354 como apresentado na Tabela 25.
A presente invenção abrange artigos para a avaliação da condi-ção do carcinoma de tiróide contendo: materiais para a detecção de seqüên-cias de ácidos nucléicos isoladas, seus complementos ou partes das mes-mas de uma combinação de genes selecionados do grupo que consiste da-queles que codificam mRNA: correspondendo às SEQ ID NOs: 36, 53, 73,211 e 242; e/ou correspondendo às SEQ ID NOs: 199, 207, 255 e 354; oureconhecidos especificamente pelos conjuntos de sondas selecionados dogrupo que consiste de psids correspondendo às SEQ ID NOs: 36, 53, 73,211 e 242 como apresentado na Tabela 25; e/ou reconhecidos especifica-mente pelos conjuntos de sondas selecionados do grupo que consiste depsids correspondendo às SEQ ID NOs: 199, 207, 255 e 354 como apresen-tado na Tabela 25.
A presente invenção abrange microarranjos ou chips de genespara a realização dos métodos fornecidos aqui.
A presente invenção abrange portifólios para diagnósti-co/prognóstico contendo seqüências de ácidos nucléicos isoladas, seuscomplementos ou partes das mesmas de uma combinação de genes sele-cionados do grupo que consiste daqueles que codificam mRNA: correspon-dendo às SEQ ID NOs: 36, 53, 73, 211 e 242; e/ou correspondendo às SEQID NOs: 199, 207, 255 e 354; ou reconhecidos especificamente pelos con-juntos de sondas selecionados do grupo que consiste de psids correspon-dendo às SEQ ID NOs: 36, 53, 73, 211 e 242 como apresentado na Tabela25; e/ou reconhecidos especificamente pelos conjuntos de sondas selecio-nados do grupo que consiste de psids correspondendo às SEQ ID NOs: 199,207, 255 e 354 como apresentado na Tabela 25 em que a combinação ésuficiente para caracterizar a condição do carcinoma de tiróide ou o risco dereincidência em uma amostra biológica.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
A figura 1 é uma curva de ROC do LOOCV da assinatura de 4genes em 98 amostras de treinamento.
A figura 2 é uma curva de ROC da assinatura de 5 genes nas 98amostras de treinamento.
A figura 3a é uma curva de ROC da assinatura de 4 genes em74 amostras de validação independentes; 3b é uma curva de ROC da assi-natura de 5 genes em 74 amostras de validação independentes.
A figura 4a é uma curva de ROC da assinatura de 4 genes que énormalizada aos três genes de controle de tiroide; 4b é uma curva de ROCda assinatura de 5 genes que é normalizada aos três genes de controle datiroide.
A figura 5a é uma curva de ROC da assinatura de 4 genes comuma amplificação de uma rodada em 47 amostras de tiroide; 5b é uma curvade ROC da assinatura de 4 genes com uma amplificação de duas rodadasem 47 amostras de tiroide; 5c é uma curva de ROC da assinatura de 5 ge-nes com uma amplificação de uma rodada em 47 amostras de tiroide; 5d éuma curva de ROC da assinatura de 5 genes com uma amplificação de duasrodadas em 47 amostras de tiroide.
As figuras 6a e 6b representam as curvas de ROC para a valida-ção cruzada com 83 amostras de tiroide congeladas frescas independentes.
As figuras 7a e 7b representam as curvas de ROC para a valida-ção de assinatura com as 47 amostras de tiroide de aspirados com agulhafina(FNA).
As figuras 8a e 8b representam as curvas de ROC para o de-sempenho da assinatura em 28 amostras congeladas frescas e de tiroide porFNA pareadas.
DESCRIÇÃO DETALHADA
Neste estudo a finalidade era identificar assinaturas que pudes-sem ser utilizadas em ensaios tal como o ensaio baseado em chips de DNApara a diferenciação de carcinomas de tiroide de doenças benignas da tirói-de. 31 tumores papilares de tiróide primários, 21 cânceres foliculares de ti-róide, 33 amostras de adenoma folicular e 13 doenças benignas de tiróideforam analisados através da utilização do Affymetrix human U133A GeneChip. A comparação dos perfis de expressão gênica entre cânceres de tirói-de e tecidos benignos possibilitou que os presentes inventores identificas-sem duas assinaturas: uma assinatura de 5 genes identificada pela análisepercentual e a seleção manual e uma assinatura de 4 genes selecionadaatravés da abordagem de Análise de Discriminação Linear (LDA). Estas du-as assinaturas possuem o desempenho de sensibilidade/especificidade de92%/70% e 92%/61%, respectivamente e foram validadas em 74 amostrasde tiróide diferentes. Os resultados apresentados aqui demonstram que es-tas assinaturas candidatas facilitam o diagnóstico de cânceres de tiróide commelhor sensibilidade e especificidade que os procedimentos para diagnósti-co disponíveis atualmente. Estas duas assinaturas são adequadas para usono teste de amostras de FNA indeterminadas.
Realizando o perfil gênico em 98 amostras representativas be-nignas de tiróide e de tumor em chips Affymetrix U133a, foram selecionadasduas assinaturas gênicas, uma assinatura de 5 genes e uma assinatura de 4genes, para o ensaio molecular de FNA da tiróide. As assinaturas foram se-lecionadas para atingir a melhor sensibilidade do ensaio até próximo a 95%.Exceto para a fibronectinaa e a peroxidase da tiróide, os outros sete genesdas duas assinaturas não foram implicados anteriormente na tumorogênesede tiróide. Ambas as assinaturas foram validadas com 74 amostras de tiróideindependentes e atingiram um desempenho que é equivalente aquele nas 98amostras de treinamento. Os desempenhos das duas assinaturas gênicassão 92% de sensibilidade e 70%/61% de especificidade, respectivamente.Quando estas duas assinaturas são normalizadas em relação aos genes decontrole de tiróide específicos os desempenhos são aumentados em relaçãoaqueles das assinaturas não normalizadas. Além disso, as assinaturas tive-ram desempenho equivalente com duas preparações alvo diferentes, a sa-ber, a amplificação de uma rodada e as amplificações de duas rodadas. Avalidação é extremamente importante para os ensaios de tiróide que sãoamostras de FNA, que contêm geralmente números limitados de células detiróide.
Foi descoberto que a mera presença ou ausência de seqüênciasde ácidos nucléicos particulares em uma amostra de tecido apenas raramen-te possui valor para diagnóstico ou prognóstico. A informação em relação àexpressão de várias proteínas, peptídeos ou mRNA, por outro lado, é obser-vada de forma crescente como sendo importante. A mera presença de se-qüências de ácidos nucléicos que possuem o potencial de expressar proteí-nas, peptídeos ou mRNA (tais seqüências referidas como "genes") dentro dogenoma por si só não é determinante do fato de uma proteína, um peptídeoou um mRNA ser expresso em uma certa célula. Se um certo gene capaz ounão de expressar proteínas, peptídeos ou mRNA o fizer e até que extensãotal expressão ocorre, se ocorrer, são determinados por uma variedade defatores complexos. Independente das dificuldades de entender e avaliar es-tes fatores, o ensaio da expressão gênica pode fornecer informação útil emrelação à ocorrência de eventos importantes tais como tumorogênese, me-tástase, apoptose e outros fenômenos clinicamente relevantes. As indica-ções relativas do grau até o qual os genes são ativos ou inativos podem serobservadas nos perfis de expressão gênica. Os perfis de expressão gênicadesta invenção são utilizados para fornecer um diagnóstico e tratar pacien-tes em relação ao câncer de tiróide.
A preparação das amostras requer a coleta de amostras do pa-ciente. As amostras do paciente utilizadas no método da invenção são aque-las que são suspeitas de conter células doentes tais como as células tiradasde um nódulo em um aspirado com agulha fina (FNA) de tecido de tiróide. Apreparação do tecido em massa obtido de uma biópsia ou de um espécimecirúrgico e a microdissecção por captura a laser também são adequadaspara uso. A tecnologia de Microdissecção por Captura a Laser (LCM) é umamaneira de selecionar as células que serão estudadas, minimizando a varia-bilidade causada pela heterogeneidade do tipo celular. Conseqüentemente,alterações moderadas ou pequenas na expressão gênica entre células be-nignas e cancerosas podem ser facilmente detectadas. As amostras tambémpodem compreender a circulação de células epiteliais extraídas do sangueperiférico. Estas podem ser obtidas de acordo com um número de métodos,mas o método mais preferido é a técnica de separação magnética descritana Patente U.S. N- 6.136.182. Uma vez que a amostra contendo as célulasde interesse foi obtida, o RNA é extraído e amplificado e é obtido um perfilde expressão gênica, preferencialmente através de microarranjo, para osgenes nos portifólios apropriados.
A presente invenção abrange métodos de diagnóstico de câncerde tiróide através da obtenção de uma amostra biológica de um paciente; eda medida dos níveis de expressão na amostra de genes daqueles que codi-ficam mRNA: correspondendo às SEQ ID NOs: 36, 53, 73, 211 e 242; e/oucorrespondendo às SEQ ID NOs: 199, 207, 255 e 354; ou reconhecidos es-pecificamente pelos conjuntos de sondas de psids correspondendo às SEQID NOs: 36, 53, 73, 211 e 242 como apresentado na Tabela 25; e/ou reco-nhecidos especificamente pelos conjuntos de sondas de psids correspon-dendo às SEQ ID NOs: 199, 207, 255 e 354 como apresentado na Tabela25; em que os níveis de expressão gênica acima ou abaixo dos níveis delimite pré-determinados são indicativos de câncer de tiróide.
A presente invenção abrange métodos de diferenciação entrecarcinoma de tiróide e doenças benignas de tiróide através da obtenção deuma amostra de um paciente; e da medida dos níveis de expressão na a-mostra de genes daqueles que codificam mRNA: correspondendo às SEQ IDNOs: 36, 53, 73, 211 e 242; e/ou correspondendo às SEQ ID NOs: 199, 207,255 e 354; ou reconhecidos especificamente pelos conjuntos de sondas depsids correspondendo às SEQ ID NOs: 36, 53, 73, 211 e 242 como apresen-tado na Tabela 25; e/ou reconhecidos especificamente pelos conjuntos desondas de psids correspondendo às SEQ ID NOs: 199, 207, 255 e 354 comoapresentado na Tabela 25; em que os níveis de expressão gênica acima ouabaixo dos níveis de limite pré-determinados são indicativos de carcinomade tiróide.
A presente invenção abrange métodos de teste de amostras denódulos de tiróide de aspirado com agulha fina indeterminadas (FNA) atra-vés: da obtenção de uma amostra de um paciente; e da medida dos níveisde expressão na amostra de genes daqueles que codificam mRNA: corres-pondendo às SEQ ID NOs: 36, 53, 73, 211 e 242; e/ou correspondendo àsSEQ ID NOs: 199, 207, 255 e 354; ou reconhecidos especificamente pelosconjuntos de sondas de psids correspondendo às SEQ ID NOs: 36, 53, 73,211 e 242 como apresentado na Tabela 25; e/ou reconhecidos especifica-mente pelos conjuntos de sondas de psids correspondendo às SEQ ID NOs:199, 207, 255 e 354 como apresentado na Tabela 25; em que os níveis deexpressão gênica acima ou abaixo dos níveis de limite pré-determinados sãoindicativos de câncer de tiróide.
A presente invenção abrange métodos de determinação de umprotocolo de tratamento de um paciente com câncer de tiróide através: daobtenção de uma amostra biológica de um paciente com câncer de tiróide; eda medida dos níveis de expressão na amostra de genes daqueles que codi-ficam mRNA: correspondendo às SEQ ID NOs: 36, 53, 73, 211 e 242; e/oucorrespondendo às SEQ ID NOs: 199, 207, 255 e 354; ou reconhecidos es-pecificamente pelos conjuntos de sondas de psids correspondendo às SEQID NOs: 36, 53, 73, 211 e 242 como apresentado na Tabela 25; e/ou reco-nhecidos especificamente pelos conjuntos de sondas de psids correspon-dendo às SEQ ID NOs: 199, 207, 255 e 354 como apresentado na Tabela25; em que os níveis de expressão gênica acima ou abaixo dos níveis delimite pré-determinados são suficientemente indicativos de câncer para pos-sibilitar que um médico determine o tipo de cirurgia e/ou terapia recomenda-da para tratar a doença.
A presente invenção abrange métodos de tratamento de um pa-ciente com câncer de tiróide através da obtenção de uma amostra biológicade um paciente com câncer de tiróide; e da medida dos níveis de expressãona amostra de genes daqueles que codificam mRNA: correspondendo àsSEQ ID NOs: 36, 53, 73, 211 e 242; e/ou correspondendo às SEQ ID NOs:199, 207, 255 e 354; ou reconhecidos especificamente pelos conjuntos desondas de psids correspondendo às SEQ ID NOs: 36, 53, 73, 211 e 242 co-mo apresentado na Tabela 25; e/ou reconhecidos especificamente pelosconjuntos de sondas de psids correspondendo às SEQ ID NOs: 199, 207,255 e 354 como apresentado na Tabela 25; em que os níveis de expressãogênica acima ou abaixo dos níveis de limite pré-determinados são indicativosde câncer; e do tratamento do paciente com tiroidectomia se for positivo emrelação a câncer.
As SEQ ID NOs nos métodos anteriores podem ser 36, 53, 73,211 e 242 ou 199, 207, 255 e 354 ou 45, 215, 65, 29, 190, 199, 207, 255 e 354.
A invenção abrange ainda os métodos anteriores que contêm asetapas de medir adicionalmente o nível de expressão de pelo menos um ge-ne que codifica mRNA: correspondendo às SEQ ID NOs: 142, 219 e 309;e/ou correspondendo às SEQ ID NOs: 9, 12 e 18; ou reconhecido especifi-camente pelos conjuntos de sondas de psids correspondendo às SEQ IDNOs: 130, 190 e 276 como apresentado na Tabela 25; e/ou reconhecido es-pecificamente pelos conjuntos de sondas de psids correspondendo às SEQID NOs: 9, 12 e 18 como apresentado na Tabela 25. A invenção abrangeainda os métodos anteriores que contêm as etapas de medida adicional donível de expressão de pelo menos um gene expresso de forma constitutivana amostra.
A Caderina 3, tipo 1 (SEQ ID NO: 53) é mencionada naUS20030194406; na US 20050037439; e na US 20040137539. A Fibronecti-na (SEQ ID NO: 242) é mencionada na US6436642 e na US20030104419.O grânulo secretor, proteína neuroendócrina 1 (SEQ ID NO: 76) é mencio-nado na US20030232350; e na US20040002067. O Testican-1 (SEQ ID NO:36) é mencionado na US20030108963; e na US20050037463. A peroxidaseda tiróide (SEQ ID NO: 211) é mencionada na US6066449, naUS20030118553; na US20030054571; na W09102061; e na W09856953. Omotivo do ligante 18 da Quimiocina C (C-C) (SEQ ID NO: 354) é mencionadona WO2005005601 e na US20020114806. A proteína B associada ao tenso-ativo pulmonar (SEQ ID NO: 355) é mencionada na US20030219760; e naUS20030232350. A subunidade beta do canal de K+ (SEQ ID NO: 207) émencionada na US20030096782; e na US 20020168638. O suposto supres-sor de câncer de próstata (SEQ ID NO: 178) é mencionado naWO2005020784. O antígeno 1 de célula de estroma de medula óssea (SEQID NO: 142) é mencionado na WO2004040014; e na WO2005020784. Oreceptor-6b similar à imunoglobulina de leucócito (SEQ ID NO: 219) é men-cionado na US20030060614. O integrador de ponte 2 (SEQ ID NO: 309) émencionado na EP1393776; na WO02057414; na WO0116158 e naUS6831063. O indutor angiogênico rico em cisteína, 61 (SEQ ID NO: 9) émencionado na WO2004030615; e na W09733995. A Selenoproteína P,Plasma 1 (SEQ ID NO: 12) é mencionada na US20040241653 e naWO2005015236. A proteína 4 de ligação ao fator de crescimento similar àinsulina (SEQ ID NO: 18) é mencionada na WO2005015236; naWO9203469; na WO9203152; e na EP0546053.
Nesta invenção, o método mais preferido para analisar o padrãode expressão gênica de um paciente nos métodos fornecidos aqui é atravésdo uso de um programa de análise de discriminação linear. A presente in-venção abrange um método de produção de um escore de probabilidadeposterior para possibilitar o diagnóstico de pacientes com carcinoma de tirói-de através: da obtenção dos dados de expressão gênica partindo de umnúmero estatisticamente significativo de amostras biológicas de pacientes;da aplicação da análise de discriminação linear para a obtenção de genesselecionados; e da aplicação dos níveis de expressão pesados aos genesselecionados com um fator de função discriminado para a obtenção de ummodelo de previsão que possa ser aplicado como um escore de probabilida-de posterior. Outras ferramentas analíticas também podem ser utilizadaspara responder à mesma pergunta tais como as abordagens de regressãologística e de redes neuronais.
Por exemplo, o seguinte pode ser utilizado para a análise de dis-criminação linear:
<formula>formula see original document page 14</formula>em que,
l(psid) = A intensidade em log em base 2 do conjunto de sondas inserido entreparênteses.
d(cp) = A função discriminante para a classe positiva de câncer d(cn) = A função discriminante para a classe negativa de câncerP(cp) = O valor de p posterior para a classe positiva de câncerP(cn) = O valor de p posterior para a classe negativa de câncer
Estão disponíveis vários outros métodos bem conhecidos dereconhecimento de padrões. As referências a seguir fornecem alguns exem-pios: Weighted Voting: Golub e outros (1999); Support Vector Machines: Sue outros (2001); e Ramaswamy e outros (2001); K-nearest Neighbors: Ra-maswamy (2001); e Correlation Coefficients: van 't Veer e outros (2002).
Preferencialmente, são estabelecidos portifólios de forma que acombinação de genes no portifólio exibe maior sensibilidade e especificidadeem relação a genes individuais ou combinações de genes selecionadas a-leatoriamente. No contexto da presente invenção, a sensibilidade do portifó-lio pode ser refletida nas diferenças de vezes exibidas pela expressão de umgene no estado doente em relação ao estado normal. A especificidade podeser refletida nas medidas estatísticas da correlação da sinalização da ex-pressão gênica com a condição de interesse. Por exemplo, o desvio padrãopode ser utilizado como tal medida. Considerando um grupo de genes parainclusão em um portifólio, um desvio padrão pequeno nas medidas de ex-pressão se correlaciona com uma maior especificidade. Outras medidas devariação tais como coeficientes de correlação também podem ser utilizadasnesta capacidade. A invenção abrange ainda os métodos anteriores em quea especificidade é de pelo menos aproximadamente 40%, de pelo menosaproximadamente 50% e de pelo menos aproximadamente 60%. A invençãoabrange ainda os métodos anteriores em que a sensibilidade é de pelo me-nos pelo menos aproximadamente 90% e de pelo menos aproximadamente92%.
A invenção abrange ainda os métodos anteriores em que acomparação dos padrões de expressão é realizada com métodos de reco-nhecimento de padrões. Um método da invenção envolve a comparação dosperfis de expressão gênica para vários genes (ou portifólios) para atribuirdiagnósticos. Os perfis de expressão gênica de cada um dos genes quecompreendem o portifólio são fixados em um meio tal como um meio quepode ser lido por computador. Este pode tomar um número de formas. Porexemplo, pode ser estabelecida uma tabela na qual a faixa de sinais (porexemplo, medidas de intensidade) indicativa de doença é a entrada. Os da-dos reais do paciente podem então ser comparados com os valores na tabe-la para determinar se as amostras do paciente são normais, benignas oudoentes. Em uma modalidade mais sofisticada, os padrões dos sinais deexpressão (por exemplo, intensidade fluorescente) são registrados digital-mente ou graficamente. Os padrões de expressão gênica dos portifólios degenes utilizados em associação com as amostras do paciente são entãocomparados com os padrões de expressão.
O software de comparação de padrões pode então ser utilizadopara determinar se as amostras do paciente possuem um padrão indicativoda doença. Evidentemente, estas comparações também podem ser utiliza-das para determinar a probabilidade do paciente não sofrer a doença. Osperfis de expressão das amostras são então comparados com o portifólio deuma célula de controle. Se os padrões de expressão das amostras foremcoerentes com o padrão de expressão para câncer então (na ausência deconsiderações médicas de anulação) o paciente é tratado como seria tratadoum paciente com câncer de tiróide. Se os padrões de expressão das amos-tras forem coerentes com o padrão de expressão da célula normal/de contro-le então o paciente é diagnosticado como sendo negativo em relação aocâncer.
Preferencialmente, os níveis de regulação para mais e para me-nos são distinguidos com base na alteração de vezes das medidas de inten-sidade de sondas de microarranjo hibridizadas. Uma diferença de 1,5 vez épreferida para fazer tais distinções (ou um valor de p menor que 0,05). Ouseja, antes de se dizer que um gene é diferencialmente expresso em célulasdoentes versus normais, é observado que a célula doente produz pelo me-nos aproximadamente 1,5 vez mais ou 1,5 vez menos intensidade que ascélulas normais. Quanto maior a diferença de vezes, é mais preferido o usodo gene como uma ferramenta de diagnóstico ou prognóstico. Os genes se-lecionados para os perfis de expressão gênica desta invenção possuem ní-veis de expressão que resultam na produção de um sinal que pode ser dis-tinguido daqueles dos genes normais ou não modulados em uma quantidadeque excede o fundo utilizando instrumentação de laboratório clínico.
Valores estatísticos podem ser utilizados para distinguir de formaconfiável genes modulados dos não modulados e ruído. Os testes estatísti-cos encontram os genes mais significativamente diferentes entre grupos di-versos de amostras. O teste T de Student é um exemplo de um teste estatís-tico robusto que pode ser utilizado para encontrar diferenças significativasentre os dois grupos. Quanto menor o valor de p, mais forte é a evidência deque o gene está exibindo uma diferença entre os grupos diferentes. Todavia,uma vez que os microarranjos medem mais de um gene por vez, dezenas demilhares de testes estatísticos podem ser verificados de uma vez. Por causadisso, pode ser improvável observar valores de p pequenos apenas ao aca-so e podem ser feitos ajustes para isso utilizando uma correção de Sidakassim como um experimento de escolha aleatória/permuta. Um valor de pmenor que 0,05 pelo teste T é uma evidência de que o gene é significativa-mente diferente. Uma evidência mais forte é um valor de p menor que 0,05após a correção de Sidak ser fatorada. Para um número grande de amostrasem cada grupo, um valor de p menor que 0,05 após o teste de escolha alea-tória/permuta é a evidência mais forte de uma diferença significativa.
A presente invenção abrange microarranjos ou chips de genespara a realização dos métodos fornecidos aqui. Os microarranjos podemconter seqüências de ácidos nucléicos isoladas, seus complementos ou par-tes das mesmas de uma combinação de genes daqueles que codificammRNA: correspondendo às SEQ ID NOs: 36, 53, 73, 211 e 242; e/ou corres-pondendo às SEQ ID NOs: 199, 207, 255 e 354; ou reconhecidos especifi-camente pelos conjuntos de sondas de psids correspondendo às SEQ IDNOs: 36, 53, 73, 211 e 242 como apresentado na Tabela 25; e/ou reconhe-cidos especificamente pelos conjuntos de sondas de psids correspondendoàs SEQ ID NOs: 199, 207, 255 e 354 como apresentado na Tabela 25 emque a combinação é suficiente para caracterizar carcinoma de tiróide ou ris-co de reincidência em uma amostra biológica. O microarranjo mede ou ca-racteriza preferencialmente uma super ou subexpressão de pelo menos a-proximadamente 1,5 vez, fornece uma super ou subexpressão com valor dep estatisticamente significativo ou um valor de p é menor que 0,05. Preferen-cialmente, o microarranjo contém um arranjo de cDNA ou um arranjo de oli-gonucleotídeo e pode conter um ou mais reagentes de controle interno. Umreagente de controle interno preferido é um método de detecção da expres-são do gene PAX8 que pode ser medida utilizando as SEQ ID NOs:409-411.
Preferencialmente, um oligonucleotídeo no arranjo correspondeà região não codificadora a 3' do gene cuja expressão está sendo medida.
Um outro parâmetro que pode ser utilizado para selecionar ge-nes que geram um sinal que é maior que o do gene não modulado ou que oruído é o uso de uma medida de diferença absoluta de sinal. Preferencial-mente, o sinal gerado pela expressão do gene modulado é pelo menos 20%diferente daquele do gene normal ou não modulado (em uma base absolu-ta). É ainda mais preferido que tais genes produzam padrões de expressãoque são pelo menos 30% diferentes daqueles de genes normais ou não mo-dulados.
Os métodos preferidos para o estabelecimento de perfis de ex-pressão gênica incluem a determinação da quantidade de RNA que é produ-zida por um gene que pode codificar uma proteína ou um peptídeo. Isto érealizado através da PCR com transcriptase reversa (RT-PCR), da RT-PCRcompetitiva, da RT-PCR em tempo real, da RT-PCR com exibição diferenci-al, da análise de Northern Blot e de outros testes relacionados. Embora sejapossível realizar estas técnicas utilizando reações de PCR individuais, é me-lhor amplificar o DNA complementar (cDNA) ou o RNA complementar (cR-NA) produzido partindo do mRNA e analisá-lo através de um microarranjo.Um número de configurações de arranjos diferentes e de métodos para aprodução dos mesmos é conhecido pelos peritos na arte e é descrito nasPatentes U.S. tais como: 5.445.934; 5.532.128; 5.556.752; 5.242.974;5.384.261; 5.405.783; 5.412.087; 5.424.186; 5.429.807; 5.436.327;5.472.672; 5.527.681; 5.529.756; 5.545.531; 5.554.501; 5.561.071;5.571.639; 5.593.839; 5.599.695; 5.624.711; 5.658.734; e 5.700.637.
A tecnologia de microarranjo permite a medida do nível de mR-NA no estado estacionário de milares de genes simultaneamente sendo as-sim uma ferramenta útil para a identificação de efeitos tal como o início, ainterrupção ou a modulação da proliferação celular descontrolada. Duas tec-nologias de microarranjo estão atualmente em uso amplo. A primeira é cons-tituída pelos arranjos de cDNA e a segunda é constituída por arranjos deoligonucleotídeos. Embora haja diferenças na construção destes chips, es-sencialmente todas as análises de dados a jusante e de saída são as mes-mas. O produto destas análises são tipicamente medidas da intensidade dosinal recebido de uma sonda marcada utilizada para detectar uma seqüênciade cDNA da amostra que se hibridiza com uma seqüência de ácido nucléicoem uma localização conhecida no microarranjo. Tipicamente, a intensidadedo sinal é proporcional à quantidade de cDNA e assim de mRNA, expressanas células da amostra. Um grande número de tais técnicas está disponívele é útil. Os métodos preferidos para a determinação da expressão gênicapodem ser encontrados nas Patentes U.S. N- 6.271.002; 6.218.122;6.218.114; e 6.004.755.
A análise dos níveis de expressão é realizada através da compa-ração de tais intensidades de sinal. Está é mais bem feita através da gera-ção de uma matriz de proporção das intensidades de expressão dos genesem uma amostra de teste versus aquelas em uma amostra de controle. Porexemplo, as intensidades da expressão gênica de um tecido doente podemser comparadas com as intensidades de expressão geradas partindo de te-cido benigno ou normal do mesmo tipo. Uma proporção destas intensidadesde expressão indica a alteração de vezes na expressão gênica entre as a-mostras de teste e de controle.
Os perfis de expressão gênica também podem ser exibidos emum número de maneiras. O método mais comum é dispor as intensidades defluorescência bruta ou uma matriz de proporção em um dendograma gráficoem que as colunas indicam as amostras de teste e as fileiras indicam os ge-nes. Os dados são dispostos de forma que os genes que possuem perfis deexpressão similares ficam próximos um aos outros. A proporção de expres-são para cada gene é visualizada na forma de uma coloração. Por exemplo,uma proporção menor que um (indicando regulação para menos) pode apa-recer na parte azul do espectro enquanto que uma proporção maior que um(indicando regulação para mais) pode aparecer na forma de uma coloraçãona parte vermelha do espectro. Os programas de software de computadordisponíveis comercialmente estão disponíveis para a exibição de tais dadosincluindo "GENESPRING" da Silicon Genetics, Inc. e os softwares "DISCO-VERY" e "INFER" da Partek, Inc.
Os genes modulados utilizados nos métodos da invenção sãodescritos nos Exemplos. Os genes que são diferencialmente expressos sãoregulados para mais ou regulados para menos em pacientes com câncer detiróide em relação aqueles com doenças benignas de tiróide. A regulaçãopara mais e a regulação para menos são termos relativos que significam queé observada uma diferença detectável (além da contribuição do ruído no sis-tema utilizado para medi-la) na quantidade de expressão dos genes relativosa alguma linha de base. Neste caso, a linha de base é a expressão gênicamedida de um paciente com doença benigna. Os genes de interesse nascélulas doentes são então regulados para mais ou regulados para menos emrelação ao nível da linha de base utilizando o mesmo método de medida.
Doente, neste contexto, se refere a uma alteração do estado de um corpoque interrompe ou perturba ou possui o potencial de perturbar, o desempe-nho apropriado das funções corpóreas como ocorre com a proliferação des-controlada de células. Uma pessoa é diagnosticada com uma doença quan-do algum aspecto do genótipo ou do fenótipo de tal pessoa é coerente com apresença da doença. Entretanto, o ato de realizar um diagnóstico ou umprognóstico inclui a determinação de questões de doença/condição tal comoa determinação da probabilidade de reincidência, do tipo de terapia e domonitoramento da terapia. No monitoramento da terapia, são feitos julga-mentos clínicos em relação ao efeito de um certo curso de terapia através dacomparação da expressão de genes ao longo de um período de tempo paradeterminar se os perfis de expressão gênica se modificaram ou estão semodificando para padrões mais coerentes com os do tecido normal.
Os genes podem ser agrupados de forma que a informação ob-tida em relação ao conjunto de genes no grupo fornece uma base justa paraa obtenção de um julgamento clinicamente relevante tal como um diagnósti-co, um prognóstico ou uma escolha de tratamento. Estes conjuntos de genesconstituem os portifólios da invenção. Como com a maior parte dos marca-dores de diagnóstico, é freqüentemente desejável utilizar o número menorde marcadores suficiente para a obtenção de um julgamento médico correto.Isto previne um retardo no tratamento dependente de uma análise adicionalassim como o uso improdutivo de tempo e recursos.
Um método de estabelecimento de portifólios de expressão gê-nica é através do uso de algoritmos de otimização tal como o algoritmo devariância da média amplamente utilizado no estabelecimento de portifóliosde estoque. Este método é descrito em detalhes na publicação de PatenteU.S. número 20030194734. Essencialmente, o método necessita do estabe-lecimento de um conjunto de entradas (estoques em aplicações financeiras,expressão que é medida através da intensidade aqui) que otimizará o retor-no (por exemplo, um sinal que é gerado) que será recebido para a utilizaçãodo mesmo enquanto se minimiza a variabilidade do retorno. Muitos progra-mas de software comerciais estão disponíveis para realizar tais operações. Épreferida a "Wagner Associates Mean-Variance Optimization Application",referida aqui como "Wagner Software" ao longo de todo este pedido de pa-tente. Este software utiliza funções da "Wagner Associates Mean-VarianceOptimization Library" para determinar uma fronteira eficiente e são preferidosos portifólios ótimos no sentido de Markowitz. O uso deste tipo de softwarerequer que os dados do microarranjo sejam transformados de forma quepossam ser tratados como uma entrada da maneira que o estoque retorna eas medidas de risco são utilizadas quando o software é utilizado para suasfinalidades de análises financeiras pretendidas.
O processo de seleção de um portifólio pode incluir ainda a apli-cação de regras heurísticas. Preferencialmente, tais regras são formuladascom base na biologia e em um entendimento da tecnologia utilizada paraproduzir resultados clínicos. Mais preferencialmente, são aplicadas na saídado método de otimização. Por exemplo, o método de variância média de se-leção de portifólios pode ser aplicado aos dados de microarranjo para umnúmero de genes expressos diferencialmente em indivíduos com câncer. Asaída do método seria um conjunto otimizado de genes que poderia incluiralguns genes que são expressos no sangue periférico assim como no tecidodoente. Se as amostras utilizadas no método de teste forem obtidas partindodo sangue periférico e certos genes expressos diferencialmente em casosde câncer poderiam também ser diferencialmente expressos no sangue peri-férico, então pode ser aplicada uma regra heurística em que um portifólio éselecionado da fronteira eficiente excluindo aqueles que são diferencialmen-te expressos no sangue periférico. Evidentemente, a regra pode ser aplicadaantes da formação da fronteira eficiente, por exemplo, através da aplicaçãoda regra durante a pré-seleção dos dados.
Podem ser aplicadas outras regras heurísticas que não estãonecessariamente relacionadas com a biologia em questão. Por exemplo,pode-se aplicar uma regra que apenas uma porcentagem prescrita do porti-fólio pode ser representada por um gene particular ou um grupo de genes. Osoftware comercialmente disponível tal como o Wagner Software acomodafacilmente estes tipos de regras heurísticas. Isto pode ser útil, por exemplo,quando fatores sem ser a acurácia e a precisão (por exemplo, taxas de li-cenciamento antecipadas) possuem um impacto sobre o desejo de incluir umou mais genes.
Os perfis de expressão gênica desta invenção também podemser utilizados em associação com outros métodos de diagnósticos que nãosão genéticos úteis no diagnóstico, prognóstico ou monitoramento do trata-mento de câncer. Por exemplo, em algumas circunstâncias é benéfico com-binar o poder de diagnóstico da expressão gênica com base nos métodosdescritos anteriormente com dados provenientes dos marcadores conven-cionais tais como os marcadores de proteínas do soro (por exemplo, CâncerAntigen 27.29 ("CA 27.29")). Existe uma faixa de tais marcadores incluindoanalitos tais como CA 27.29. Em um tal método, o sangue é periodicamentetirado de um paciente tratado e então submetido a um ensaio imunológicocom enzima para um dos marcadores do soro descritos anteriormente.Quando a concentração do marcador sugerir o retorno de tumores ou a falhada terapia, é tirada uma fonte de amostra tratável à análise da expressãogênica. Quando existe uma massa suspeita, é tirado um aspirado com agu-lha fina (FNA) e os perfis de expressão gênica de células tiradas da massasão então analisados como descrito anteriormente. Alternativamente, amos-tras de tecido podem ser tiradas de áreas adjacentes ao tecido do qual umtumor foi previamente removido. Esta abordagem pode ser particularmenteútil quando outro teste produzir resultados ambíguos.
A presente invenção abrange métodos de validação cruzada deum perfil de expressão gência e dos perfis obtidos dessa maneira, para pa-cientes com carcinoma de tiróide através: a. da obtenção dos dados de ex-pressão gênica partindo de um número estatisticamente significativo de a-mostras biológicas de pacientes; b. da escolha aleatória da ordem das a-mostras; c. do ajuste dos dados a parte de aproximadamente 10% - 50% dasamostras; d. da computação, para as amostras restantes, em relação ao fa-tor de interesse em todas as variáveis e seleção da variáveis que satisfazemum limite de valor de p (p); e. da seleção de variáveis que se ajustam comum modelo de previsão utilizando uma busca para frente e avaliação do errode treinamento até que atinga uma taxa de erro pré-determinada; f. do testedo modelo de previsão no restante dos 10-50% das amostras; g. da repeti-ção das etapas c, -g. com um novo conjunto de amostras removido; e h. dacontinuação das etapas c) -g) até que 100% das amostras tenham sido tes-tados e o desempenho de classificação registrado. Neste método, preferen-cialmente, os dados de expressão gênica obtidos na etapa h. são represen-tados pelos genes daqueles que codificam mRNA: correspondendo às SEQID NOs: 1, 4, 7, 8, 10-11, 13-17, 19-24, 26-27, 29-31, 33-35, 37-38, 40-52,54-72, 75-82, 84-135, 138-141, 144-151, 153-159, 161-162, 164, 166-173,176-198, 200-201, 203-206, 208-209, 212-213, 215-218, 220-221, 223,227-233, 235-241, 243-244, 246-249, 251, 253-254, 256-263, 265-289,291-293, 295-308, 310-331, 333-341, 343-345, 347-348, 350-353 e 355-363;ou reconhecidos especificamente pelos conjuntos de sondas de psids naTabela 25 correspondendo às SEQ ID NOs: 1, 4, 7, 8, 10-11, 13-17, 19-24,26-27, 29-31, 33-35, 37-38, 40-52, 54-72, 75-82, 84-135, 138-141, 144-151,153-159, 161-162, 164, 166-173, 176-198, 200-201, 203-206, 208-209,253-254, 256-263, 265-289, 291-293, 295-308, 310-331, 333-341, 343-345,347-348, 350-353 e 355-363.
A presente invenção abrange métodos de validação independen-te de um perfil de expressão gênica e dos perfis obtidos dessa maneira, parapacientes com câncer de tiróide através da obtenção dos dados de expres-são gênica partindo de um número estatisticamente significativo de amostrasbiológicas de pacientes; da normalização das variabilidades das fontes nosdados de expressão gênica; da computação em relação ao fator de interessesobre todas as variáveis que foram selecionadas anteriormente; e do testedo modelo de previsão sobre a amostra e o desempenho de classificação éregistrado. Neste método, preferencialmente, os dados de expressão gênicaobtidos na etapa d. são representados pelos genes daqueles que codificammRNA: correspondendo às SEQ ID NOs: 1, 4, 7, 8, 10-11, 13-17, 19-24,26-27, 29-31, 33-35, 37-38, 40-52, 54-72, 75-82, 84-135, 138-141, 144-151,153-159, 161-162, 164, 166-173, 176-198, 200-201, 203-206, 208-209,212-213, 215-218, 220-221, 223, 227-233, 235-241, 243-244, 246-249, 251,253-254, 256-263, 265-289, 291-293, 295-308, 310-331, 333-341, 343-345,347-348, 350-353 e 355-363; ou reconhecidos especificamente pelos con-juntos de sondas de psids na Tabela 25 correspondendo às SEQ ID NOs: 1,4, 7, 8, 10-11, 13-17, 19-24, 26-27, 29-31, 33-35, 37-38, 40-52, 54-72, 75-82,84-135, 138-141, 144-151, 153-159, 161-162, 164, 166-173, 176-198,200-201, 203-206, 208-209, 212-213, 215-218, 220-221, 223, 227-233,235-241, 243-244, 246-249, 251, 253-254, 256-263, 265-289, 291-293,295-308, 310-331, 333-341, 343-345, 347-348, 350-353 e 355-363.
A presente invenção abrange métodos de obtenção de uma pro-babilidade posterior para possibilitar o diagnóstico de pacientes com carci-noma de tiróide através da obtenção dos dados de expressão gênica partin-do de um número estatisticamente significativo de amostras biológicas depacientes; da aplicação da análise de discriminação linear aos dados para aobtenção de genes selecionados; da aplicação de níveis de expressão pe-sados aos genes selecionados que discriminam o fator de função para a ob-tenção de um modelo de previsão que pode ser aplicado como um escore deprobabilidade posterior. Por exemplo, o seguinte pode ser utilizado para a
Análise de Discriminação Linear:
<formula>formula see original document page 25</formula>
em que,
l(psid) = A intensidade em log em base 2 do conjunto de sondas inserido entreparênteses.
d(cp) = A função discriminante para a classe positiva de câncer
d(cn) = A função discriminante para a classe negativa de câncer
P(cp) = O valor de p posterior para a classe positiva de câncer
P(cn) = O valor de p posterior para a classe negativa de câncer
A presente invenção abrange métodos de obtenção do relato deum paciente com diagnóstico de carcinoma de tiróide e relatos obtidos dessamaneira, através da obtenção de uma amostra biológica do paciente; damedida da expressão gênica da amostra; da aplicação de um escore de pro-babilidade posterior à mesma; e da utilização dos resultados obtidos dessamaneira para gerar o relato. O relato também pode conter uma avaliação doresultado do paciente e/ou da probabilidade de risco relativo à população dopaciente.
A presente invenção abrange composições que contêm pelomenos um conjunto de sondas das: SEQ ID NOs: 36, 53, 73, 211 e 242; e/oudas SEQ ID NOs: 199, 207, 255 e 354; ou os psids correspondendo às SEQID NOs: 36, 53, 73, 211 e 242; e/ou SEQ ID NOs: 199, 207, 255 e 354 comoapresentado na Tabela 25.
A presente invenção abrange kits para a realização de um en-5 saio para determinar o diagnóstico de carcinoma de tiróide em uma amostrabiológica contendo: materiais para a detecção de seqüências de ácidos nu-cléicos isoladas, seus complementos ou partes das mesmas de uma combi-nação de genes daqueles que codificam mRNA: correspondendo às SEQ IDNOs: 36, 53, 73, 211 e 242; e/ou correspondendo às SEQ ID NOs: 199, 207,255 e 354; ou reconhecidos especificamente pelos conjuntos de sondas depsids correspondendo às SEQ ID NOs: 36, 53, 73, 211 e 242 como apresen-tado na Tabela 25; e/ou reconhecidos especificamente pelos conjuntos desondas de psids correspondendo às SEQ ID NOs: 199, 207, 255 e 354 comoapresentado na Tabela 25. As SEQ ID NOs. podem ser 36, 53, 73, 211 e242, 199, 207, 255 e 354 e 45, 215, 65, 29, 190, 199, 207, 255 e 354.
Os kits produzidos de acordo com a invenção incluem ensaiosformatados para a determinação dos perfis de expressão gênica. Estes po-dem incluir todos ou alguns dos materiais necessários para realizar os en-saios tais como reagentes e instruções e um meio através do qual as se-qüências de ácidos nucléicos, seus complementos ou partes das mesmassão analisadas.
Os artigos desta invenção incluem representações dos perfis deexpressão gênica úteis para o tratamento, o diagnóstico, o prognóstico epara a avaliação de outra maneira das doenças. Estas representações deperfis são reduzidas a um meio que pode ser lido automaticamente atravésde uma máquina tal como um meio que pode ser lido por computador (mag-nético, óptico e similares). Os artigos também podem incluir instruções paraa avaliação dos perfis de expressão gênica em tal meio. Por exemplo, osartigos podem compreender um CD ROM que possuem instruções paracomputador para a comparação dos perfis de expressão gênica dos portifó-lios de genes descritos anteriormente. Os artigos também podem ter os per-fis de expressão gênica registrados digitalmente nos mesmos de forma quepossam ser comparados com os dados de expressão gênica das amostrasdos pacientes. Alternativamente, os perfis podem ser registrados em umformato com representação diferente. Um registro gráfico é um tal formato.Os algoritmos de formação de aglomeramentos tais como os incorporadosnos softwares "DISCOVERY" e "INFER" da Partek, Inc. mencionados anteri-ormente podem melhor auxiliar a visualização de tais dados.
Os tipos diferentes de artigos de produção de acordo com a in-venção são meios ou ensaios formatados utilizados para revelar perfis deexpressão gênica. Estes podem compreender, por exemplo, microarranjosnos quais complementos de seqüências ou sondas são afixadas em umamatriz à qual as seqüências indicativas dos genes de interesse se combinamcriando um determinante que pode ser lido de sua presença. Alternativamen-te, os artigos de acordo com a invenção podem ser ajustados nos kits dereagentes para a realização de hibridização, amplificação e produção de si-nal indicativas do nível de expressão dos genes de interesse para a detec-ção de câncer.
A presente invenção abrange artigos para a avaliação da condi-ção do carcinoma de tiróide contendo: materiais para a detecção de seqüên-cias de ácidos nucléicos isoladas, seus complementos ou partes das mes-mas de uma combinação de genes daqueles que codificam mRNA: corres-pondendo às SEQ ID NOs: 36, 53, 73, 211 e 242; e/ou correspondendo àsSEQ ID NOs: 199, 207, 255 e 354; ou reconhecidos especificamente pelosconjuntos de sondas de psids correspondendo às SEQ ID NOs: 36, 53, 73,211 e 242 como apresentado na Tabela 25; e/ou reconhecidos especifica-mente pelos conjuntos de sondas de psids correspondendo às SEQ ID NOs:199, 207, 255 e 354 como apresentado na Tabela 25. As SEQ ID NOs. po-dem ser 36, 53, 73, 211 e 242; 199, 207, 255 e 354; ou 45, 215, 65, 29, 190,199, 207, 255 e 354.
A presente invenção abrange portifólios de diagnósti-co/prognóstico contendo seqüências de ácidos nucléicos isoladas, seuscomplementos ou partes das mesmas de uma combinação de genes daque-les que codificam mRNA: correspondendo às SEQ ID NOs: 36, 53, 73, 211 e242; e/ou correspondendo às SEQ ID NOs: 199, 207, 255 e 354; ou reco-nhecidos especificamente pelos conjuntos de sondas de psids correspon-dendo às SEQ ID NOs: 36, 53, 73, 211 e 242 como apresentado na Tabela25; e/ou reconhecidos especificamente pelos conjuntos de sondas de psidscorrespondendo às SEQ ID NOs: 199, 207, 255 e 354 como apresentado naTabela 25 em que a combinação é suficiente para caracterizar a condição decarcinoma de tiróide ou o risco de reincidência em uma amostra biológica.Preferencialmente, o portifólio mede ou caracteriza uma super ou subex-pressão de pelo menos aproximadamente 1,5 vez ou fornece uma super ousubexpressão com valor de p estatisticamente significativo. Preferencialmen-te, o valor de p é menor que 0,05.
Os exemplos a seguir são fornecidos para ilustrar, mas não limi-tar a invenção reivindicada. Todas as referências citadas aqui são incorpo-radas aqui como referência.
EXEMPLO 1
Materiais e Métodos
Amostras de Tecido
Amostras congeladas frescas de doenças benigas de tiróide,adenoma folicular, carcinoma folicular e carcinoma papilar foram obtidas defornecedores comerciais diferentes incluindo Genomics Collaborative, Inc.(Cambridge, MA), Asterand (Detroit, Ml) e Proteogenex (Los Angeles, CA).Todas as amostras foram coletadas de acordo com um protocolo de aprova-ção do Institutional Review Board (Grupo de Revisão Institucional). A infor-mação demográfica e patológica dos pacientes também foi coletada. As ca-racterísticas histopatológicas de cada amostra foram revisadas para confir-mar o diagnóstico, estimar a preservação das amostras e o conteúdo dostumores.
Isolamento de RNA
Foi utilizado o protocolo padronizado de TriZol para todos osisolamentos de RNA. O tecido foi homogeneizado no reagente TriZol (Invi-trogen, Carlsbad, CA). O RNA total foi isolado do TriZol e precipitado a -20°C com álcool isopropílico. As pelotas de RNA foram lavadas com etanol a75%, dissolvidas em água e armazenadas a -80°C até o uso. A integridadedo RNA foi verificada com Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 NanoAssay(Agilent Technologies, Paio Alto, CA).
Análise de Discriminação Linear
A Análise de Discriminação Linear foi realizada utilizando estasetapas: cálculo de uma matriz de co-variância comum (agrupada) e das mé-dias dentro dos grupos; cálculo do conjunto de funções de discriminaçãolineares partindo da co-variância comum e das médias dentro dos grupos; eclassificação utilizando as funções de discriminação lineares.
O ajuste das leituras de intensidade dos chips para cada sondana equação a seguir pode ser utilizado para derivar a probabilidade posteriorde uma amostra de tiróide desconhecida como positiva ou negativa paracâncer. Por exemplo, se uma amostra de tiróide for testada com o ensaio efornecer um p(Cp) > 0,5 esta amostra será classificada como câncer de tiróide.
Para a assinatura de 4 genes:
d(cp) = -50,9964 + 0,220424(l(32i28_at)) + 1,520185(l(2o98io_at)) + 3,09431 (l(210078_s_at)) + 6,1 1 283(l(213423_x_at))
d(cN) = -46,7445 + 0,374751 (I(32i28_at)) + 1,010852(l(2098io_at)) + 3,645515(l(2i0078_s_at)) + 5,337296(l(2i3423_x_at))
Para a assinatura de 5 genes:
d(cp) = -135,931 + 4,737838(l(202363_at)) - 1,23763(l(203256_at)) + 1,984148(l(203889_at)) + 6,638082(l(2l0342_s_at)+ 10,7704(l(212464_s_at))
d(cN) = -128,978 + 4,610498 (l(202363_at)) - 1,28685 (l(203256_at)) + 1,656772
(l(203889_at)) + 6,859133 (l(210342_s_at)+ 10,24482 (l(212464_s_at)) Çd(CP)-d(CN) ^
P<Ciy> = l + edíCPrd(CN) P(CN) = j + ed(CP)-d(cN)em que,
l(psid) = A intensidade em log em base 2 do conjunto de sondas inserido entreparênteses.
d(cp) = A função discriminante para a classe positiva de câncerd(cn) = A função discriminante para a classe negativa de câncerP(cp) = O valor de p posterior para a classe positiva de câncerP(cn) = O valor de p posterior para a classe negativa de câncer
Amplificação do aRNA em Duas Rodadas
O aRNA foi amplificado partindo de 10 ng de RNA total utilizandoo RiboBeast 2-Round Aminoallyl-aRNA Amplification kit (Epicentre, Wl), umprotocolo de amplificação linear de RNA baseada no T7, com algumas modi-ficações. O RNA total foi transcrito de forma inversa utilizando um iniciadoroligo(dT) contendo uma seqüência do promotor da RNA polimerase de T7RNA e Superscript III RT. A síntese do segundo filamento foi realizada utili-zando a DNA polimerase Bst. Foi realizada uma etapa extra de incubaçãocom uma mistura de exonucleases Exo I e Exo VII para reduzir o fundo. OcDNA de filamento duplo serviu como o molde para a amplificação linearmediada por T7 através da transcrição in vitro. Para a segunda rodada deamplificação, ao invés da utilização dos reagentes RiboBeast, o kit ENZOBioArray HighYield RNA Transcript Labeling (Affymetrix, CA) foi utilizado nolugar da etapa de transcrição in vitro do Aminoalil-aRNA. O aRNA foi quanti-ficado através da tecnologia Agilent Nano Chip.
EXEMPLO 2
Análise de Microarranio
O cRNA marcado foi preparado e hibridizado com o arranjo deoligonucleotídeo de alta densidade Hu133A Gene Chip (Affymetrix, SantaClara, CA) contendo um total de 22.000 conjuntos de sondas. A hibridizaçãofoi realizada de acordo com um protocolo padronizado fornecido pelo fabri-cante. Os arranjos foram verificados utilizando protocolos e scanners Affy-metrix. Para a análise subseqüente, cada conjunto de sonda foi consideradocomo um gene independente. Os valores de expressão para cada gene fo-ram calculados através da utilização do software de análise Affymetrix GeneChip MAS 5.0. Todos os chips satisfaziam os padrões de controle de quali-dade a seguir: a porcentagem da busca por "presença", o fator de gradação,o nível de fundo e o nível de ruído tinham que estar dentro da faixa da médiacom um desvio padrão de mais ou menos 3. Todos os chips utilizados para aanálise subseqüente passaram por estes critérios de controle de qualidade.
A coleta das amostras para a seleção da assinatura e a validação indepen-dente é resumida na Tabela 1.
Tabela 1
<table>table see original document page 31</column></row><table>
EXEMPLO 3
Resultados da Identificação da Assinatura
A. Seleção de Genes
Um total-de 98 amostras incluindo 31 tumores papilares de tirói-de primários, 21 cânceres foliculares de tiróide, 33 adenomas foliculares e13 tecidos benignos de tiróide foi analisado através da utilização de Affyme-trix human U133A gene chips. Foram aplicados cinco critérios de seleção degenes ao conjunto inteiro de dados para a obtenção de um número limitadode genes para a identificação subseqüente de marcadores ou de assinaturasgênicas:1. Foram considerados os genes com pelo menos uma "Busca de Pre-sença" neste conjunto de amostras.
2. Foram excluídos os genes com mais de uma "Busca de Presença" em 12 amostras de PBL.
3. Foram selecionados apenas os genes com intensidade de chip maiorque 200 em todas as amostras.
4. Utilizando os genes que passaram pelos três critérios anteriores, foirealizada uma variedade de análises, como listado na Tabela 2, para aidentificação dos genes que são regulados para mais ou regulados para menos nos tumores de tiróide.
5. Finalmente, foram selecionados os genes com alteração de expressãomaior que 1,4 vez.
Tabela 2
Resumo dos tipos diferentes de análises percentuaisTipo de Análise Percentual
1 20% FC vs 100% Benigno
2 30% FC vs 90% Benigno
3 30% PC vs 90% Benigno
4 70% FC vs 50% Benigno
5 70% PC vs 50% Benigno
6 90% Benigno vs 30% FC
7 90% Benigno vs 30% PC
O número final de genes selecionados para a identificação daassinatura é de 322, descrito na Tabela 25, SEQ ID NOs: 1, 4, 7, 8, 10-11,13-17, 19-24, 26-27, 29-31, 33-35, 37-38, 40-52, 54-72, 75-82, 84-135,138-141, 144-151, 153-159, 161-162, 164, 166-173, 176-198, 200-201,203-206, 208-209, 212-213, 215-218, 220-221, 223, 227-233, 235-241,243-244, 246-249, 251, 253-254, 256-263, 265-289, 291-293, 295-308,310-331, 333-341, 343-345, 347-348, 350-353 e 355-363. Os dados obtidosdos 322 genes selecionados são fornecidos Tabela 3 e resumidos na Tabela 4.Tabela 3
<table>table see original document page 33</column></row><table><table>table see original document page 34</column></row><table><table>table see original document page 35</column></row><table><table>table see original document page 36</column></row><table><table>table see original document page 37</column></row><table><table>table see original document page 38</column></row><table><table>table see original document page 39</column></row><table><table>table see original document page 40</column></row><table><table>table see original document page 41</column></row><table><table>table see original document page 42</column></row><table><table>table see original document page 43</column></row><table><table>table see original document page 44</column></row><table><table>table see original document page 45</column></row><table><table>table see original document page 46</column></row><table><table>table see original document page 47</column></row><table><table>table see original document page 48</column></row><table><table>table see original document page 49</column></row><table><table>table see original document page 50</column></row><table><table>table see original document page 51</column></row><table><table>table see original document page 52</column></row><table><table>table see original document page 53</column></row><table><table>table see original document page 54</column></row><table><table>table see original document page 55</column></row><table><table>table see original document page 56</column></row><table><table>table see original document page 57</column></row><table><table>table see original document page 58</column></row><table><table>table see original document page 59</column></row><table><table>table see original document page 60</column></row><table><table>table see original document page 61</column></row><table><table>table see original document page 62</column></row><table><table>table see original document page 63</column></row><table><table>table see original document page 64</column></row><table><table>table see original document page 65</column></row><table><table>table see original document page 66</column></row><table><table>table see original document page 67</column></row><table><table>table see original document page 68</column></row><table><table>table see original document page 69</column></row><table><table>table see original document page 70</column></row><table><table>table see original document page 71</column></row><table><table>table see original document page 72</column></row><table><table>table see original document page 73</column></row><table><table>table see original document page 74</column></row><table><table>table see original document page 75</column></row><table><table>table see original document page 76</column></row><table><table>table see original document page 77</column></row><table><table>table see original document page 78</column></row><table><table>table see original document page 79</column></row><table><table>table see original document page 80</column></row><table><table>table see original document page 81</column></row><table><table>table see original document page 82</column></row><table><table>table see original document page 83</column></row><table><table>table see original document page 84</column></row><table><table>table see original document page 85</column></row><table><table>table see original document page 86</column></row><table><table>table see original document page 87</column></row><table><table>table see original document page 88</column></row><table><table>table see original document page 89</column></row><table><table>table see original document page 90</column></row><table><table>table see original document page 91</column></row><table><table>table see original document page 92</column></row><table><table>table see original document page 93</column></row><table><table>table see original document page 94</column></row><table><table>table see original document page 95</column></row><table><table>table see original document page 96</column></row><table><table>table see original document page 97</column></row><table><table>table see original document page 98</column></row><table><table>table see original document page 99</column></row><table><table>table see original document page 100</column></row><table><table>table see original document page 101</column></row><table>Tabela 5
Assinatura de 4 Genes
<table>table see original document page 102</column></row><table>
A Validação Cruzada de Deixar Um de Fora (LOOCV) resultouem 92% de sensibilidade e 61% de especificidade, mostradas na Tabela 4. Acurva de ROC forneceu uma AUC de 0,897, como mostrado na Figura 1.Tabela 6
<table>table see original document page 103</column></row><table>Tabela 7
<table>table see original document page 104</column></row><table><table>table see original document page 105</column></row><table>Tabela 6
<table>table see original document page 106</column></row><table>Tabela 7
<table>table see original document page 107</column></row><table><table>table see original document page 108</column></row><table>
C. Seleção Manual de Marcadores
Os genes individuais foram selecionados com uma finalidade deformular um ensaio baseado na RT-PCR. A comparação dos perfis de ex-pressão gênica entre os cânceres de tiróide e os tecidos que não possuemcâncer identificou uma assinatura de cinco genes partindo destes 322 genes.As identidades destes cinco genes são mostradas nas Tabelas 8 e 16 e osdados de chips são mostrados na Tabela 9. O desempenho desta assinaturafoi avaliado utilizando LDA nas 98 amostras e a assinatura fornece 92% desensibilidade e 70% de especificidade, mostradas na Tabela 10. A curva deROC forneceu uma AUC de 0,88, como mostrado na Figura 2.
Tabela 8
<table>table see original document page 108</column></row><table>Tabela 9
<table>table see original document page 109</column></row><table><table>table see original document page 110</column></row><table>D. Validação Cruzada com as 74 Amostras de Tiróide Independentes
As 74 amostras de tiróide independentes foram processas e seus perfisforam obtidos com o chip U133a e os dados dos chips para estas duas assinaturassão mostrados na Tabela 11. Os desempenhos das assinaturas de 4 genes e de 5genes foram avaliados com LDA. Ambas as assinaturas forneceram desempenhoequivalente nestas amostras comparadas com as 98 amostras de treinamento. Asensibilidade e a especificidade para ambas as assinaturas são mostradas na Tabela12 e as curvas de ROC são demonstradas nas Figuras 3a e 3b.
Tabela 11
<table>table see original document page 111</column></row><table><table>table see original document page 112</column></row><table><table>table see original document page 113</column></row><table>tes. As identidades destes seis genes estão listadas na Tabela 14 e seusdados de chips são mostrados nas Tabelas 15a e 15b.
Tabela 13a
<table>table see original document page 114</column></row><table><table>table see original document page 115</column></row><table><table>table see original document page 116</column></row><table><table>table see original document page 117</column></row><table><table>table see original document page 118</column></row><table><table>table see original document page 119</column></row><table><table>table see original document page 120</column></row><table><table>table see original document page 121</column></row><table><table>table see original document page 122</column></row><table><table>table see original document page 123</column></row><table><table>table see original document page 124</column></row><table><table>table see original document page 125</column></row><table><table>table see original document page 126</column></row><table><table>table see original document page 127</column></row><table><table>table see original document page 128</column></row><table><table>table see original document page 129</column></row><table><table>table see original document page 130</column></row><table><table>table see original document page 131</column></row><table><table>table see original document page 132</column></row><table><table>table see original document page 133</column></row><table><table>table see original document page 134</column></row><table>
Tabela 14
Genes de Controle
Genes de Controle para o Sangue
SEQ ID NO: Nome do gene
142 Antígeno 1 de célula de estroma de medula óssea (BST1)
219 Receptor 6b similar à imunoglobulina de leucócitos (LIR-6)
309 Integrador de formação de pontes 2 (BIN2)
Genes de Controle para a Tiróide
9 Indutor angiogênico rico em cisteína, 61 (CYR61)
12 Selenoproteína P, plasma, 1 (SEPP1)
Proteína 4 de ligação ao fator de crescimento similar à insulina
18 (IGFBP4)<table>table see original document page 135</column></row><table><table>table see original document page 136</column></row><table><table>table see original document page 137</column></row><table>
F. Assinatura Normalizada Em Relação aos Genes de Controle
Foram adicionalmente verificadas as assinaturas de 5 genes ede 4 genes dos presentes inventores através da normalização destes genesem relação aos três genes de controle de tiróide selecionados como um al-goritmo para a normalização dos dados de chip gênico. As intensidades mé-dias de fluorescência dos três genes de controle de tiróide foram utilizadaspara a normalização dos sinais dos genes da assinatura. O desempenho deambas as assinaturas aumentou ligeiramente quando estas duas assinatu-ras foram normalizadas. A sensibilidade e a especificidade das duas assina-turas são listadas na Tabela 16 e as curvas de ROC são mostradas nas Fi-guras 4a e 4b.
Tabela 16
Os desempenhos das assinaturas de 4 genes e de 5 genes normalizadas em relação aos genes de controle
Assinatura de 4 Genes
Tumor Benigno
Positivo 33 11
Negativo 3 27
Sensibilidade 92% (0,78, 0,97)<table>table see original document page 138</column></row><table>
G. Validação das Assinaturas com Sondas Amplificadas em Duas Rodadas
Para determinar se as amostras de FNA não possuíam célulasde tiróide suficientes para fornecer material de sonda suficiente para a hibri-dização com os Affymetrix U133a gene chips após uma rodada de amplifica-ção, uma amplificação de duas rodadas dos RNAs alvos foi realizada com47 amostras que estavam entre o conjunto de 74 amostras de validação in-dependentes. Os dados obtidos mostram que os desempenhos das assina-turas de 5 genes e de 4 genes são idênticos com amplificações de uma ro-dada ou de duas rodadas. As curvas de ROC das duas assinaturas gênicascom duas preparações alvos diferentes são mostradas nas Figuras 5a, 5b, 5c e 5d.
Exemplo 4
Validação cruzada com amostras independentes
A. Validação Cruzada com as 83 Amostras de Tiróide Congeladas Frescas Independentes
83 amostras de tiróide independentes foram processadas e seusperfis foram obtidos com o chip U133a. O número de amostras em cada categoria está listado na Tabela 17.
Tabela 17
Coleta das amostras congeladas frescas para a validação das assinaturas
Tipo de Amostra Número de Amostras
Adenoma folicular 18
Carcinoma Folicular de Tiróide 1
Carcinoma Papilar, Variação Folicular 18Tipo de Amostra Número de Amostras
Carcinoma Papilar de Tiróide 11
Nódulos Adenomatóides 18
Nódulos Adenomatóides com Hashimoto 1
Hiperplasia Multinodular 16
O desempenho da assinatura de 4 genes e da assinatura de 5genes foi avaliado com LDA utilizando o mesmo valor limite que no conjuntode treinamento. Ambas as assinaturas forneceram desempenho equivalentenestas amostras e são comparáveis com o desempenho no conjunto de trei-namento com 98. A sensibilidade e a especificidade para ambas as assinatu-ras são mostradas na Tabela 18 e as curvas de ROC são demonstradas nas Figuras 6a e 6b.
Tabela 18
Desempenho das assinaturas de 4 genes e de 5 genes nas 83 amostras de validação
Assinatura de 4 Genes
Tumor Benigno
Positivo 20 11
Negativo 10 42
Sensibilidade 67% (0,49, 0,81)
Especificidade 79% (0,67, 0,88)
Assinatura de 5 Genes
Tumor Benigno
Positivo 24 24
Negativo 6 29
Sensibilidade 80% (0,63, 0,90)
Especificidade 55% (0,41, 0,67)
B. Validação das Assinaturas com as 47 Amostras de Tiróide de Aspirado deAgulha Fina (FNA)
47 amostras de FNA de tiróide foram processadas e seus perfisobtidos com o chip U133a. O número de amostras em cada categoria estálistado na Tabela 19.Tabela 19
Coleta de amostras de FNA para a validação das assinaturas
Tipo de Amostra Número de Amostras
Adenoma folicular 10
Carcinoma Folicular de Tiróide 2
Carcinoma Papilar, Variação Folicular 3
Carcinoma Papilar de Tiróide 13
Nódulos Adenomatóides 10
Nódulos Adenomatóides com Hashimoto 1
Hiperplasia Multinodular 8
O desempenho da assinatura de 4 genes e da assinatura de 5genes foi avaliado com o modelo de LDA. Ambas as assinaturas forneceramdesempenho equivalente nas amostras de FNA e são comparáveis com odesempenho no conjunto de treinamento com 98. A sensibilidade e a especi-ficidade para ambas as assinaturas são mostradas na Tabela 20 e as curvasde ROC são demonstradas nas Figuras 7a e 7b.
Tabela 20
Desempenho das assinaturas de 4 genes e de 5 genes nas 47 amostras de FNA
Assinatura de 4 Genes
Tumor Benigno
Positivo 15 4
Negativo 3 25
Sensibilidade 94% (0,74, 0,99)
Especificidade 62% (0,44, 0,77)
Assinatura de 5 Genes
Tumor Benigno
Positivo 17 10
Negativo 1 19
Sensibilidade 94% (0,74, 0,99
Especificidade 66% (0,47, 0,80)
C. Desempenho das Assinaturas em 28 Amostras de Tiróide CongeladasFrescas e de FNA Pareadas
Dentro das coleções de 83 amostras congeladas frescas e de 47de FNA há 28 amostras que eram do mesmo paciente. A comparação diretadas assinaturas dos presentes inventores nestas amostras pareadas de-monstra o quão bem a assinatura será traduzida no ensaio molecular final. Odesempenho da assinatura de 4 genes e da assinatura de 5 genes foi avali-ado com o modelo de LDA. Ambas as assinaturas forneceram desempenhoequivalente nas amostras congeladas frescas e de FNA. Estes resultadosdemonstraram que as assinaturas de 4 genes e de 5 genes dos presentesinventores podem ter desempenhos equivalentemente bons em ambos ostipos de amostras e provaram que a abordagem utilizando amostras conge-ladas frescas para a identificação de gene/assinatura é válida. A sensibilida-de e a especificidade para ambas as assinaturas são mostradas na Tabela21 e as curvas de ROC são demonstradas nas Figuras 8a e 8b.
Tabela 21
Desempenho das assinaturas de 4 genes e de 5 genes em 28amostras congeladas frescas e de FNA combinadas
Assinatura de 4 Genes
<table>table see original document page 141</column></row><table>Exemplo 5
RT-PCR quantitativa em tempo real
Aquisição de Amostras:
Para determinar se um subconjunto dos perfis e/ou dos controlesgênicos forneceria especificidade e sensibilidade adequadas com a RT-PCR,foi realizado o experimento a seguir. O que é descrito a seguir possui a van-tagem de requerer apenas uma rodada de amplificação de RNA.
Um total de 107 biópsias de tiróide foi analisado no presente es-tudo: 26 adenomas foliculare, 23 carcinomas foliculares, 38 carcinomas papi-lares, 5 normais, 3 carcinomas papilares variação folicular, 3 tiroidite de Ha-shimoto, 2 microadenomas foliculares, 1 bócio difuso, 1 bócio com hiperpla-sia papilar, 1 adenoma de célula de Hurthle, 1 hiperplasia com estrutura pa-pilar, 1 bócio multinodular, 1 hiperplasia oncocítica, 1 tiroidite. O isolamentodo RNA total foi extraído através da utilização do reagente Trizol de acordocom as instruções do fabricante. As concentrações de RNA foram determi-nadas através de leituras da absorbância a 260 nm com o espectrofotômetroGene-Spec (Hitachi). O RNA isolado foi armazenado em água isenta deRNase a -80°C até o uso.
Planejamento dos Iniciadores e das Sondas:
Os inciadores e as sondas de hidrólise foram planejados utili-zando Oligo 6.0 e as seqüências do Genebank para marcadores de condi-ção de câncer de tiróide (Tabela 22). Estes iniciadores e conjuntos de son-das foram planejados de forma que a temperatura de anelamento dos inicia-dores era de 62°C e a das sondas 5-10°C maiores e faixas de tamanhos deamplicons de 100-150 pb. A amplificação do DNA genômico foi excluída a-través do planejamento dos iniciadores dos presentes inventores em tornodos sítios de processamento de éxon-íntron. As sondas de hidrólise forammarcadas no nucleotídeo a 5' com FAM como o corante repórter e no nucle-otídeo a 3' com TAMRA como o corante de decaimento.Tabela 22
<table>table see original document page 143</column></row><table>RT-PCR Quantitativa em Tempo Real:
A amplificação por RT-PCR quantitativa em tempo real específi-ca ao gene de 21 genes de condição de câncer de tiróide e de um gene"housekeeping" foi realizada utilizando o TaqMan One-Step RT-PCR MasterMix (2x) (Applied Biosystems) e o sistema de detecção de seqüências ABIPrism 7900HT (Applied Biosystems). Em uma reação de uma etapa de 25 pLo RNA total (10 ng) foi adicionado a uma mistura que continha: 1x RT-PCRMaster Mix, 0,25 U/uL de Multiscribe Enzyme, 0,6 uM de iniciadores e 0,25uM de sonda. Os parâmetros de ciclos eram 48°C durante 30min e 95°C 10min, seguidos por 40 ciclos de 95°C 15 s e 62°C 1 min. O monitoramento daPCR em Tempo Real foi conseguido através da medida do sinal fluorescenteno final da fase de anelamento para cada ciclo. O número de ciclos para a-tingir o limite de fluorescência foi definido como o limite de ciclos (valor Ct).Para minimizar os erros que surgem da integridade do RNA nas amostras omRNA da (3-actina foi amplificado como uma referência interna. Padrões ex-ternos foram preparados através de diluições em série de 10 vezes de RNApositivo para câncer de tiróide conhecido e utilizados para garantir a lineari-dade ao longo de todos os ensaios dos presentes inventores. Os resultadosforam expressos no valor médio de Ct e foram excluídas as amostras quetinham um desvio padrão maior que um. Os resultados são fornecidos nasTabelas 23a, 23b, 23c, 24a e 24b.
Os dados mostram que a assinatura de dois genes mostrada naTabela 23b não é tão sensível e específica quanto a assinatura de quatrogenes da qual foi derivada. A Tabela 24 mostra que o uso do gene PAX8 nareação de RT-PCR como um controle para o tecido específico à tiróide é efi-ciente em uma reação de RT-PCR.
Embora a invenção anterior tenha sido descrita em alguns deta-lhes com a finalidade de ilustração e exemplo com a finalidade de esclareci-mento do entendimento, as descrições e os exemplos não devem ser inter-pretados como limitantes do âmbito da invenção.Tabela 23
<table>table see original document page 145</column></row><table><table>table see original document page 146</column></row><table><table>table see original document page 147</column></row><table><table>table see original document page 148</column></row><table>Tabela 23b
<table>table see original document page 149</column></row><table><table>table see original document page 150</column></row><table><table>table see original document page 151</column></row><table><table>table see original document page 152</column></row><table>Tabela 23c
<table>table see original document page 153</column></row><table><table>table see original document page 154</column></row><table><table>table see original document page 155</column></row><table><table>table see original document page 156</column></row><table>Legenda Tabela 23c:SensibilidadeEspecificidade% Dentro de ± 5 do LimiteBenignoCâncerPositivo
Pontos fora da faixaMarcadores com Melhor DesempenhoBenignoMalignoTabela 24a
<table>table see original document page 158</column></row><table><table>table see original document page 159</column></row><table><table>table see original document page 160</column></row><table><table>table see original document page 161</column></row><table><table>table see original document page 162</column></row><table><table>table see original document page 163</column></row><table><table>table see original document page 164</column></row><table><table>table see original document page 165</column></row><table><table>table see original document page 166</column></row><table>Tabela 25
Identificações de Seqüências
<table>table see original document page 167</column></row><table><table>table see original document page 168</column></row><table><table>table see original document page 169</column></row><table><table>table see original document page 170</column></row><table><table>table see original document page 171</column></row><table><table>table see original document page 172</column></row><table><table>table see original document page 173</column></row><table><table>table see original document page 174</column></row><table><table>table see original document page 175</column></row><table><table>table see original document page 176</column></row><table><table>table see original document page 177</column></row><table><table>table see original document page 178</column></row><table><table>table see original document page 179</column></row><table><table>table see original document page 180</column></row><table><table>table see original document page 181</column></row><table><table>table see original document page 182</column></row><table><table>table see original document page 183</column></row><table>
Claims (68)
1. Processo de diagnóstico de câncer de tiróide que compreendeas etapas de:a. obtenção de uma amostra biológica de um paciente; eb. medida dos níveis de expressão na amostra de genes selecionados dogrupo que consiste daqueles que codificam mRNA:i. correspondendo às SEQ ID N-: 36, 53, 73, 211 e 242; e/ouii. correspondendo às SEQ ID N-: 199, 207, 255 e 354; ouiii. reconhecido especificamente pelos conjuntos de sondas selecio-nadas do grupo que consiste de psids que correspondem às SEQID N-: 36, 53, 73, 211 e 242 como representado na Tabela 25;e/ouiv. reconhecido especificamente pelos conjuntos de sondas selecio-nados do grupo que consiste de psids que correspondem às SEQID N-: 199, 207, 255 e 354 como apresentado na Tabela 25em que os níveis de expressão gênica acima ou abaixo de níveis limites pre-determinados são indicativos de câncer de tiróide.
2. Processo de diferenciação entre carcinoma de tiróide e doen-ças benignas da tiróide que compreende as etapas de:a. obtenção de uma amostra de um paciente; eb. medida dos níveis de expressão na amostra de genes selecionados dogrupo que consiste daqueles que codificam mRNA:i. correspondendo às SEQ ID N—: 36, 53, 73, 211 e 242; e/ouii. correspondendo às SEQ ID N—: 199, 207, 255 e 354; ouiii. reconhecido especificamente pelos conjuntos de sondas selecio-nados do grupo que consiste de psids que correspondem às SEQID N-: 36, 53, 73, 211 e 242 como apresentado na Tabela 25;e/ouiv. reconhecido especificamente pelos conjuntos de sondas selecio-nados do grupo que consiste de psids que correspondem às SEQID N-: 199, 207, 255 e 354 como apresentado na Tabela 25em que os níveis de expressão gênica acima ou abaixo de níveis limites pré-determinados são indicativos de carcinoma de tiróide.
3. Processo de teste de amostras de nódulos de tiróide de aspi-rados com agulha fina de tiróide indeterminados (FNA) que compreende asetapas de:a. obtenção de uma amostra de um paciente; eb. medida dos níveis de expressão na amostra de genes selecionados dogrupo que consiste daqueles que codificam mRNA:i. correspondendo às SEQ ID Nos: 36, 53, 73, 211 e 242; e/ouii. correspondendo às SEQ ID N—: 199, 207, 255 e 354; ouiii. reconhecido especificamente pelos conjuntos de sondas selecio-nados do grupo que consiste de psids que correspondem às SEQID N-: 36, 53, 73, 211 e 242 como apresentado na Tabela 25;e/ouiv. reconhecido especificamente pelos conjuntos de sondas selecio-nados do grupo que consiste de psids que correspondem às SEQID N—: 199, 207, 255 e 354 como apresentado na Tabela 25em que os níveis de expressão gênica acima ou abaixo de níveis limites pre-determinados são indicativos de câncer de tiróide.
4. Processo de determinação de um protocolo de tratamento deum paciente com câncer de tiróide que compreende as etapas de:a. obtenção de uma amostra biológica de um paciente com câncer de ti-róide; eb. medida dos níveis de expressão na amostra de genes selecionados dogrupo que consiste daqueles que codificam mRNA:i. correspondendo às SEQ ID N-: 36, 53, 73, 211 e 242; e/ouii. correspondendo às SEQ ID N-: 199, 207, 255 e 354; ouiii. reconhecido especificamente pelos conjuntos de sondas selecio-nados do grupo que consiste de psids que correspondem às SEQ ID N—: 36,-53, 73, 211 e 242 como apresentado na Tabela 25; e/ouiv. reconhecido especificamente pelos conjuntos de sondas selecio-nados do grupo que consiste de psids que correspondem às SEQ ID N—:-199, 207, 255 e 354 como apresentado na Tabela 25em que os níveis de expressão gênica acima ou abaixo de níveis limites pre-determinados são suficientemente indicativos de câncer para possibilitar queum médico determine o tipo de cirurgia e/ou de terapia recomendada paratratar a doença.
5. Processo de tratamento de um paciente com câncer de tiróideque compreende as etapas de:a. obtenção a amostra biológica de um paciente com câncer de tiróide; eb. medida dos níveis de expressão na amostra de genes selecionados dogrupo que consiste daqueles que codificam mRNA:i.correspondendo às SEQ ID N—: 36, 53, 73, 211 e 242; e/ouii. correspondendo às SEQ ID N-: 199, 207, 255 e 354; ouiii. reconhecido especificamente pelos conjuntos de sondas selecio-nados do grupo que consiste de psids que correspondem às SEQID N-: 36, 53, 73, 211 e 242 como apresentado na Tabela 25;e/ouiv. reconhecido especificamente pelos conjuntos de sondas selecio-nados do grupo que consiste de psids que correspondem às SEQID N—: 199, 207, 255 e 354 como apresentado na Tabela 25em que os níveis de expressão gênica acima ou abaixo de níveis limites pré-determinados são indicativos de câncer; ec. tratamento do paciente com tiroidectomia se for positivo em relação ao câncer.
6. Processo de uma das reivindicações 1-5 em que as SEQ IDsão 36, 53, 73, 211 e 242.
7. Processo de uma das reivindicações 1-5 em que as SEQ ID N— são 199, 207, 255 e 354.
8. Processo de uma das reivindicações 1-5 em que as SEQ ID N— são 45, 215, 65, 29, 190, 199, 207, 255 e 354.
9. Processo de uma das reivindicações 1-5 em que a amostra épreparada através de um processo que é selecionado do grupo que consistede aspiração com agulha, preparação de tecido em massa e microdissecçãopor captura a laser.
10. Processo da reivindicação 9 em que a preparação de tecidoem massa é obtida partindo de uma biopsia ou de um espécime cirúrgico.
11. Processo de uma das reivindicações 1-5 que compreendeainda a medida do nível de expressão de pelo menos um gene que codificamRNA:a. correspondendo às SEQ ID N-: 142, 219 e 309; e/oub. correspondendo às SEQ ID N-: 9, 12 e 18; ouc. reconhecido especificamente pelos conjuntos de sondas selecionadosdo grupo que consiste de psids que correspondem às SEQ ID N—: 130,-190 e 276 como apresentado na Tabela 25;e/oud. reconhecido especificamente pelos conjuntos de sondas selecionadosdo grupo que consiste de psids que correspondem às SEQ ID N—: 9,-12 e 18 como apresentado na Tabela 25.
12. Processo de uma das reivindicações 1-5 que compreendeainda medir o nível de expressão gênica de pelo menos um gene expressoconstitutivamente na amostra.
13. Processo de uma das reivindicações 1-5 em que a especifi-cidade é de pelo menos aproximadamente 40%.
14. Processo de uma das reivindicações 1-5 em que a especifi-cidade é de pelo menos aproximadamente 50%.
15. Processo de uma das reivindicações 1-5 em que a especifi-cidade é de pelo menos aproximadamente 60%.
16. Processo de uma das reivindicações 1-5 em que a sensibili-dade é de pelo menos pelo menos aproximadamente 90%.
17. Processo de uma das reivindicações 1-5 em que a sensibili-dade é de pelo menos pelo menos aproximadamente 92%.
18. Processo de uma das reivindicações 1-5 em que a compara-ção dos padrões de expressão é realizada com processos de reconhecimen-to de padrões.
19. Processo da reivindicação 18 em que os processos de reco-nhecimento de padrões incluem o uso de uma análise de danos proporcio-nais a Cox.
20. Processo de uma das reivindicações 1-5 em que os níveis delimite pré-determinados estão pelo menos aproximadamente 1,5 vez acimaou abaixo da expressão na amostra em relação às células benignas ou aotecido normal.
21. Processo de uma das reivindicações 1-5 em que os níveis delimite pré-determinados possuem pelo menos uma superexpressão com va-lor de p estatisticamente significativo na amostra que possui células de car-cinoma de tiróide em relação às células benignas ou ao tecido normal.
22. Processo da reivindicação 21 em que o valor de p é menorque aproximadamente 0,05.
23. Processo de uma das reivindicações 1-5 em que a expres-são gênica é medida em um microarranjo ou um chip gênico.
24. Processo da reivindicação 23 em que o microarranjo é umarranjo de cDNA ou um arranjo de oligonucleotídeos.
25. Processo da reivindicação 24 em que o microarranjo ou ochip gênico compreende ainda um ou mais reagentes de controle interno.
26. Processo de uma das reivindicações 1 -5 em que a expres-são gênica é determinada através da amplificação de ácidos nucléicos pelareação em cadeia da polimerase (PCR) do RNA extraído da amostra.
27. Processo da reivindicação 26 em que a dita PCR é uma rea-ção em cadeia da polimerase com transcrição inversa (RT-PCR).
28. Processo da reivindicação 27, em que a RT-PCR compreen-de ainda um ou mais reagentes de controle interno.
29. Processo da reivindicação 28, em que o reagente de controleinterno é um processo de detecção da expressão gênica de PAX8.
30. Processo da reivindicação 29, em que a expressão gênicade PAX8 é medida utilizando as SEQ ID N—: 409-411.
31. Processo de uma das reivindicações 1-5 em que a expres-são gênica é detectada através da medida ou da detecção de uma proteínacodificada pelo gene.
32. Processo da reivindicação 31 em que a proteína é detectadapor um anticorpo específico à proteína.
33. Processo de uma das reivindicações 1 -5 em que a expres-são gênica é detectada através da medida de uma característica do gene.
34. Processo da reivindicação 33 em que a característica medi-da é selecionada do grupo que consiste de amplificaçao, metilaçao, mutaçãoe variação alélica do DNA.
35. Processo de validação cruzada de um perfil de expressãogênica para pacientes com carcinoma de tiróide que compreende as etapas de:a. obtenção dos dados da expressão gênica partindo de um número esta-tisticamente significativo de amostras biológicas dos pacientes;b. tornar aleatória a ordem das amostras;c. ajuste além dos dados partindo de aproximadamente 10% - 50% dasamostras;d. computação, para as amostras remanescentes, em relação a um fatorde interesse em todas as variáveis e selecionando variáveis que satis-fazem um limite do valor de p (p);e. seleção de variáveis que se ajustam com um modelo de previsão utili-zando uma busca para frente e avaliando o erro de treinamento até queatinja uma taxa de erro pré-determinada;f. teste do modelo de previsão no restante dos 10-50% das amostras;g. repetição das etapas c, -g. com um novo conjunto de amostras removidas; eh. continuação das etapas c) -g) até 100% das amostras terem sido tes-tadas e registrar o desempenho de classificação.
36. Processo de acordo com a reivindicação 35 em que os da-dos de expressão gênica obtidos na etapa h. são representados pelos genesselecionados do grupo que consiste daqueles que codificam mRNA:a. correspondendo às SEQ ID N—: 1, 4, 7, 8, 10-11, 13-17, 19-24, 26-27,29-31, 33-35, 37-38, 40-52, 54-72, 75-82, 84-135, --138-141, 144-151, 153-159, 161-162, 164, 166-173, 176-198, 200-201, 203-206, 208-209,-212-213, 215-218, 220-221, 223, 227-233, 235-241, 243-244, 246-249,-251, 253-254, 256-263, 265-289, 291-293, 295-308, 310-331, 333-341,343-345, 347-348, 350-353 e 355-363; oub. reconhecido especificamente pelos conjuntos de sondas selecionadosdo grupo que consiste de psids na Tabela 25 correspondendo às SEQID N—: 1, 4, 7, 8, 10-11, 13-17, 19-24, 26-27, 29-31, 33-35, 37-38,-40-52, 54-72, 75-82, 84-135, 138-141, 144-151, 153-159, 161-162, 164,-166-173, 176-198, 200-201, 203-206, 208-209, 212-213, 215-218,-220-221, 223, 227-233, 235-241, 243-244, 246-249, 251, 253-254,-256-263, 265-289, 291-293, 295-308, 310-331, 333-341, 343-345,-347-348, 350-353 e 355-363.
37. Processo de validação independente de um perfil de expres-são gênica para pacientes com carcinoma de tiróide que compreende asetapas de:a. obtenção dos dados da expressão gênica partindo de um número esta-tisticamente significativo de amostras biológicas de pacientes;b. normalização das variabilidades das fontes nos dados de expressãogênica;c. computação em relação ao fator de interesse em todas as variáveisque foram selecionadas anteriormente; ed. teste do modelo de previsão sobre a amostra e registrar o desempenhode classificação.
38. Processo de acordo com a reivindicação 37 em que os da-dos da expressão gênica obtidos na etapa d. são representados pelos genesselecionados do grupo que consiste daqueles que codificam mRNA:a. correspondendo às SEQ ID N—: 1, 4, 7, 8, 10-11, 13-17, 19-24, 26-27,-29-31, 33-35, 37-38, 40-52, 54-72, 75-82, 84-135, 138-141, 144-151,-153-159, 161-162, 164, 166-173, 176-198, 200-201, 203-206, 208-209,-212-213, 215-218, 220-221, 223, 227-233, 235-241, 243-244, 246-249,-251, 253-254, 256-263, 265-289, 291-293, 295-308, 310-331, 333-341,-343-345, 347-348, 350-353 e 355-363; oub. reconhecido especificamente pelos conjuntos de sondas selecionadosdo grupo que consiste de psids na Tabela 25 correspondendo às SEQID N—: 1, 4, 7, 8, 10-11, 13-17, 19-24, 26-27, 29-31, 33-35, 37-38,-40-52, 54-72, 75-82, 84-135, 138-141, 144-151, 153-159, 161-162, 164,-166-173, 176-198, 200-201, 203-206, 208-209, 212-213, 215-218,-220-221, 223, 227-233, 235-241, 243-244, 246-249, 251, 253-254,-256-263, 265-289, 291-293, 295-308, 310-331, 333-341, 343-345,-347-348, 350-353 e 355-363.
39. Perfil gênico obtido através do processo de acordo com areivindicação 37 ou 38.
40. Processo de obtenção de um escore de probabilidade poste-rior para possibilitar o diagnóstico de pacientes com carcinoma de tiróide quecompreende as etapas de:a. obtenção de dados da expressão gênica partindo de um número esta-tisticamente significativo de amostras biológicas de pacientes;b. aplicação da análise de discriminação linear aos dados para a obten-ção dos genes selecionados;c. aplicação de níveis de expressão pesados aos genes selecionadoscom fator de função discriminado para a obtenção de um modelo deprevisão que pode ser aplicado como um escore de probabilidade pos-terior.
41. Processo de acordo com a reivindicação 40, em que a análi-se de discriminação linear é calculada utilizando a equação:<formula>formula see original document page 191</formula>em que,l(psid) = A intensidade em log de base 2 do conjunto de sondas incluídoentre parênteses.d(cp) = A função de discriminação para a classe positiva em relação aocâncerd(CN) = A função de discriminação para a classe negativa em relação aocâncerP(cp) = O valor de p posterior para a classe positiva em relação ao cân-cerP(cn) = O valor de p posterior para a classe negativa em relação aocâncer
42. Processo de obtenção de um relato de paciente com prog-nóstico de carcinoma de tiróide que compreende as etapas de:a. obtenção de uma amostra biológica de um paciente;b. medida da expressão gênica da amostra;c. aplicação de um Escore de Danos Reincidentes aos resultados da eta-pa b.; ed. utilização dos resultados obtidos na etapa c. para gerar o relato.
43. Processo da reivindicação 42 em que o relato contém umaavaliação do resultado do paciente e/ou da probabilidade de risco relativa àpopulação de pacientes.
44. Relato de um paciente gerado através do processo de acor-do com a reivindicação 42.
45. Composição que compreende pelo menos um conjunto desondas selecionado do grupo que consiste de: SEQ ID N—: 36, 53, 73, 211 e-242; e/ou SEQ ID N-: 199, 207, 255 e 354; ou os psids que correspondemàs SEQ ID N—: 36, 53, 73, 211 e 242; e/ou SEQ ID N—: 199, 207, 255 e 354como apresentado na Tabela 25.
46. Kit para a realização de um ensaio para determinar o prog-nóstico de carcinoma de tiróide em uma amostra biológica que compreende:materiais para a detecção de seqüências de ácidos nucléicos isoladas, seuscomplementos ou partes dos mesmos de uma combinação de genes sele-cionados do grupo que consiste daqueles que codificam mRNA:a. correspondendo às SEQ ID N—: 36, 53, 73, 211 e 242; e/oub. correspondendo às SEQ ID N-: 199, 207, 255 e 354; ouc. reconhecido especificamente pelos conjuntos de sondas selecionadosdo grupo que consiste de psids que correspondem às SEQ ID N—: 36,-53, 73, 211 e 242 como apresentado na Tabela 25; e/oud. reconhecido especificamente pelos conjuntos de sondas selecionadosdo grupo que consiste de psids que correspondem às SEQ ID N—: 199, 207, 255 e 354 como apresentado na Tabela 25.
47. Kit da reivindicação 46 em que as SEQ ID N- são 36, 53, 73, 211 e 242.
48. Kit da reivindicação 46 em que as SEQ ID N— são 199, 207, 255 e 354.
49. Kit da reivindicação 46 em que as SEQ ID N- são 45, 215, 65, 29, 190,199, 207, 255 e 354.
50. Kit da reivindicação 46 que compreende ainda reagentes para a realização de uma análise por micro arranjo.
51. Kit da reivindicação 46 que compreende ainda um meio através do qual as ditas seqüências de ácidos nucléicos, seus complementos ou porções dos mesmos são analisados.
52. Artigos para avaliar a condição do carcinoma de tiróide quecompreende: materiais para a detecção de seqüências de ácidos nucléicosisoladas, seus complementos ou partes dos mesmos de uma combinação degenes selecionados do grupo que consiste daqueles que codificam mRNA:a. correspondendo às SEQ ID N—: 36, 53, 73, 211 e 242; e/oub. correspondendo às SEQ ID N—: 199, 207, 255 e 354; ouc. reconhecido especificamente pelos conjuntos de sondas selecionadosdo grupo que consiste de psids que correspondem às SEQ ID N—: 36, 53, 73, 211 e 242 como apresentado na Tabela 25; e/oud. reconhecido especificamente pelos conjuntos de sondas selecionadosdo grupo que consiste de psids que correspondem às SEQ ID N—: 199, 207, 255 e 354 como apresentado na Tabela 25.
53. Artigos da reivindicação 52 em que as SEQ ID N— são 36, 53, 73, 211 e 242.
54. Artigos da reivindicação 52 em que as SEQ ID N— são 199, 207, 255 e 354.
55. Artigos da reivindicação 52 em que as SEQ ID N— são 45, 215, 65, 29, 190, 199, 207, 255 e 354.
56. Artigos da reivindicação 52 que compreendem ainda reagen-tes para a realização de uma análise por microarranjo.
57. Artigos da reivindicação 52 que compreendem ainda ummeio através do qual as ditas seqüências de ácidos nucléicos, seus com-plementos ou partes dos mesmos são analisados.
58. Microarranjo ou chip gênico para a realização do processode uma das reivindicações 1-5.
59. Microarranjo da reivindicação 58 que compreende seqüên-cias de ácidos nucléicos isoladas, seus complementos ou partes dos mes-mos de uma combinação de genes selecionados do grupo que consiste da-queles que codificam mRNA:a. correspondendo às SEQ ID N-: 36, 53, 73, 211 e 242; e/oub. correspondendo às SEQ ID N—: 199, 207, 255 e 354; ouc. reconhecido especificamente pelos conjuntos de sondas selecionadosdo grupo que consiste de psids que correspondem às SEQ ID N—: 36,-53, 73, 211 e 242 como apresentado na Tabela 25; e/oud. reconhecido especificamente pelos conjuntos de sondas selecionadosdo grupo que consiste de psids que correspondem às SEQ ID N—: 199,-207, 255 e 354 como apresentado na Tabela 25em que a combinação é suficiente para caracterizar o carcinoma de tiróideou o risco de reincidência em uma amostra biológica.
60. Microarranjo da reivindicação 59 em que a medida ou a ca-racterização está pelo menos aproximadamente 1,5 vez acima ou abaixo daexpressão.
61. Microarranjo da reivindicação 59 em que a medida forneceum valor de p estatisticamente significativo acima ou abaixo da expressão.
62. Microarranjo da reivindicação 59 em que o valor de p é me-nor que aproximadamente 0,05.
63. Microarranjo da reivindicação 59 que compreende um arran-jo de cDNA ou um arranjo de oligonucleotídeos.
64. Microarranjo da reivindicação 59 que compreende ainda umou mais reagentes de controle interno.
65. Portifólio de diagóstico/prognóstico que compreende se-qüências de ácidos nucléicos isoladas, seus complementos ou partes dosmesmos de uma combinação de genes selecionados do grupo que consistedaqueles que codificam mRNA:a. correspondendo às SEQ ID N-: 36, 53, 73, 211 e 242; e/oub. correspondendo às SEQ IDN-: 199, 207, 255 e 354; ouc. reconhecido especificamente pelos conjuntos de sondas selecionadosdo grupo que consiste de psids que correspondem às SEQ ID N—: 36, 53, 73, 211 e 242 como apresentado na Tabela 25; e/oud. reconhecido especificamente pelos conjuntos de sondas selecionadosdo grupo que consiste de psids que correspondem às SEQ ID N—: 199, 207, 255 e 354 como apresentado na Tabela 25em que a combinação é suficiente para caracterizar a condição de carcino-ma de tiróidê ou o risco de reincidência em uma amostra biológica.
66. Portifólio da reivindicação 65 em que a medida ou a caracte-rização está pelo menos aproximadamente 1,5 vez acima ou abaixo da expressão.
67. Portifólio da reivindicação 65 em que a medida fornece umvalor de p estatisticamente significativo acima ou abaixo da expressão.
68. Portifólio da reivindicação 65 em que o valor de p é menorque aproximadamente 0,05.
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