JP2008545400A - 甲状腺穿刺吸引分子分析 - Google Patents

甲状腺穿刺吸引分子分析 Download PDF

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Abstract

【課題】 甲状腺癌腫と良性甲状腺病変を識別するための、ＤＮＡチップに基づく分析等の分析において使用できる特性を同定する。
【解決手段】 本発明は、甲状腺癌腫の診断、甲状腺癌腫と良性甲状腺病変との間の識別、未確定の甲状腺小結節の甲状腺穿刺吸引試料の検定、ならびに、患者のプロトコルおよび転帰の決定を対象とする方法と、構成物と、物品とを提供する。
【選択図】図１

Description

開示の内容
〔発明の背景〕
米国において毎年診断される新たな甲状腺癌の症例はおよそ２５，６００であり、１，４００人の患者がこの病気によって死亡する。全ての甲状腺癌の約７５％は、甲状腺乳頭癌型に属する。残りは、１０％の濾胞性癌、５％から９％の甲状腺髄様癌、１％から２％の未分化癌、１％から３％のリンパ腫、ならびに、１％未満の肉腫および他の稀な腫瘍、からなる。通常、甲状腺のしこり（小結節）は甲状腺癌の最初の兆候である。単発性甲状腺結節を有する人々は米国内で１０００万から１８００万人おり、毎年およそ４９０，０００人が臨床的に顕著になる。幸いなことに、これらの小結節の約５％だけが癌性である。
通例使用される甲状腺癌の診断のための方法は、穿刺吸引（ＦＮＡ）生検である。ＦＮＡ試料は、小結節が良性か癌性かを決定するために、細胞学的に検査される。ＦＮＡの感度と特異性は、設備と医師によって、それぞれ６８％から９８％、および７２％から１００％の範囲を取る。不運なことに、症例の２５％で、検体は診断に不適切であるか、または細胞学的に決定不能であるかのどちらかである。現在の医療慣行では、決定不能な結果を有する患者は手術に送られ、結果として、２５％だけが癌を有し、７５％は不要な手術で終わる。高感度で、より良い特異性（２５％より高い）を有する分子分析は、現在の甲状腺癌の診断の精度を大いに向上させ、非癌性の患者への不要な手術を取り除くであろう。
比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）、および、ＤＮＡマイクロアレイは、異型接合性の消失、遺伝子の発現亢進、および、発現抑制、ならびに、遺伝子再配列等の甲状腺癌内で起こっている遺伝子的事象を同定することに使用されてきた。ＰＡＸ８およびＰＰＡＲγ遺伝子再配列事象は、濾胞性甲状腺癌（ＦＴＣ）と関連があることが示されてきた。ｒｅｔガン原遺伝子は、甲状腺乳頭癌（ＰＴＣ）と関連がある。甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）遺伝子の発現抑制は、ＦＴＣとＰＴＣの双方で認められる。ガレクチン−３（Galectin-3）は、悪性甲状腺新生物と良性病巣を識別するための候補マーカーであると報告された。しかしながら、ガレクチン−３は癌特異的マーカーではないことを示す他の研究がある。甲状腺癌の診断で有用であると主張されている多くの遺伝子は、正確な分子分析に必要とされる感度および特異性を欠いている。
〔発明の概要〕
本発明は、以下のステップにより甲状腺癌を診断する方法を含む。すなわち、患者から生体試料を取得するステップと、ｍＲＮＡをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の上記試料中の発現レベルを測定するステップであって、上記ｍＲＮＡが、配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｍＲＮＡ、または、表２５に示す配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、表２５に示す配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、であり、所定のカットオフレベルより高いまたは低い上記遺伝子の発現レベルが甲状腺癌を示すステップと、である。
本発明は、以下のステップにより甲状腺癌腫と良性甲状腺病変とを識別する方法を含む。すなわち、患者から試料を取得するステップと、ｍＲＮＡをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の上記試料中の発現レベルを測定するステップであって、上記ｍＲＮＡが、配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｍＲＮＡ、または、表２５に示す配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および２４２に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、表２５に示す配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、であり、所定のカットオフレベルより高いまたは低い上記遺伝子の発現レベルが甲状腺癌腫を示すステップと、である。
本発明は、以下のステップにより不確定の甲状腺穿刺吸引（ＦＮＡ）甲状腺小結節試料を検査する方法を含む。すなわち、患者から試料を取得するステップと、ｍＲＮＡをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の上記試料中の発現レベルを測定するステップであって、上記ｍＲＮＡが、配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｍＲＮＡ、または、表２５に示す配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、表２５に示す配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、であり、所定のカットオフレベルより高いまたは低い上記遺伝子の発現レベルが甲状腺癌を示すステップと、である。
本発明は、以下のステップにより甲状腺癌患者の治療プロトコルを決定する方法を含む。すなわち、甲状腺癌患者から生体試料を取得するステップと、ｍＲＮＡをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の上記試料中の発現レベルを測定するステップであって、上記ｍＲＮＡが、配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｍＲＮＡ、または、表２５に示す配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、表２５に示す、配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、であり、所定のカットオフレベルより高いまたは低い上記遺伝子の発現レベルが、病変を治療するために推奨される手術および／または治療のタイプを、医師が決定することを可能にするのに十分に癌を示すステップと、である。
本発明は、以下のステップにより甲状腺癌患者を治療する方法を含む。すなわち、甲状腺癌患者から生体試料を取得するステップと、ｍＲＮＡをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の上記試料中の発現レベルを測定するステップであって、上記ｍＲＮＡが、配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｍＲＮＡ、または、表２５に示す配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、表２５に示す配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、であり、所定のカットオフレベルより高いまたは低い当該遺伝子の発現レベルが甲状腺癌を示すステップと、上記患者が癌陽性の場合は甲状腺切除術で上記患者を治療するステップと、である。
本発明は、以下のステップにより甲状腺癌腫患者に対する遺伝子発現プロファイルを相互検証する方法を含む。すなわち、ａ．統計的に有意な数の患者の生体試料からの遺伝子発現データを取得するステップと、ｂ．試料の順番をランダム化するステップと、ｃ．試料の約１０〜５０％からのデータを除外するステップと、ｄ．残りの試料に対して、全ての変数に関して関心のある要素に対する計算を行い、ｐ値カットオフ（ｐ）に見合う変数を選択するステップと、ｅ．順方向検索を使用して予測モデルに合致する変数を選択し、所定のエラーレートに達するまでトレーニングエラーを評価するステップと、ｆ．除外されていた試料の１０〜５０％に対して予測モデルを検定するステップと、ｇ．ステップｃ．とステップｇ．までを、除外されていた試料の新たなセットを用いて繰り返すステップと、ｈ．ステップｃ）ないしステップｇ）を１００％の試料が検定されるまで継続し、分類性能を記録するステップと、である。
本発明は、以下のステップにより、甲状腺癌腫患者に対して、遺伝子発現プロファイルおよび遺伝子発現プロファイルにより取得された遺伝子プロファイルを個別に検証する方法を含む。ステップとは、統計的に有意な数の患者の生体試料から遺伝子発現データを取得するステップと、上記遺伝子発現データ内の情報源の変動を正規化するステップと、事前に選択された全ての変数に関して関心のある要素に対する計算を行うステップと、上記試料に対して予測モデルを検定し、分類性能を記録するステップと、である。
本発明は、以下のステップにより、甲状腺癌腫患者の診断を可能にする事後確率スコアを生成する方法を含む。本ステップとは、統計的に有意な数の患者の生体試料から遺伝子発現データを取得するステップと、選択される遺伝子を取得するために上記データに線形判別分析を適用するステップと、事後確率スコアとして適用されることが可能な予測モデルを取得するために、判別関数因子（discriminate function factor）で選択された遺伝子に、重み付けされた発現レベルを適用するステップと、である。
本発明は、以下のステップにより、甲状腺癌腫の予後の患者報告書を作成する方法および本作成方法で取得された報告書を含む。本ステップとは、上記患者から生体試料を取得するステップと、上記試料の遺伝子発現を測定するステップと、上記遺伝子発現に事後確率を適用するステップと、報告書を作成するためにここで取得された結果を使用するステップと、である。
本発明は、配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２；ならびに／もしくは、配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４；または、配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｐｓｉｄ；ならびに／もしくは、表２５に示す配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４；からなる群から選択される少なくとも１つのプローブのセットを包含する成分を含む。
本発明は、生体試料中の甲状腺癌腫の診断を決定するために分析を行うためのキットを含む。本キットは、以下のｍＲＮＡをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組み合わせの、単離された核酸配列、この配列の相補配列、または、これら配列および相補配列の一部を検出するための材料を含み、上記ｍＲＮＡとは、配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｍＲＮＡ、または、表２５に示す配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、表２５に示す配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、である、キットである。
本発明は、甲状腺癌腫の状態を判定するための物品を含む。本物品は、以下のｍＲＮＡをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組み合わせの、単離された核酸配列、この配列の相補配列、または、これら配列および相補配列の一部、を検出するための材料を含み、上記ｍＲＮＡとは、配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｍＲＮＡ、または、表２５に示す配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、表２５に示す配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、である、物品である。
本発明は、本明細書で提供される方法を行うためのマイクロアレイまたは遺伝子チップを含む。
本発明は、ｍＲＮＡをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組み合わせの、単離された核酸配列、この配列の相補配列、または、この配列および相補配列の一部を含む診断／予後診断ポートフォリオであって、上記ｍＲＮＡが、配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４、に対応するｍＲＮＡ、または、表２５に示す配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、表２５に示す配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４、に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、であり、上記組み合わせが生体試料中の甲状腺癌腫の状態または再発の危険性を特徴付けるのに十分である、ポートフォリオを含む。
〔詳細な説明〕
本研究における目的は、甲状腺癌腫と良性甲状腺病変を識別するための、ＤＮＡチップに基づく分析等の分析において使用できる特性を同定することであった。３１の原発性甲状腺乳頭腫瘍、２１の濾胞性甲状腺癌、３３の濾胞性腺腫試料、および、１３の良性甲状腺病変が、アフィメトリクス社製ヒトＵ１３３Ａ遺伝子チップを使用して分析された。甲状腺癌と良性組織の間の遺伝子発現プロファイルの比較は、２つの特性、すなわち百分率分析および手動選択によって同定された５−遺伝子特性と、線形判別分析（ＬＤＡ）アプローチによって選択された４−遺伝子特性と、の同定を可能にした。これらの２つの特性は、感度／特異性がそれぞれ、９２％／７０％および９２％／６１％の性能を有し、７４の個別の甲状腺試料で検証された。本明細書で示された結果は、これらの候補の特性が、現在利用できる診断手法よりも優れた感度および特異性で、甲状腺癌の診断を促進することを示す。これらの２つの特性は、未確定のＦＮＡ試料の検定における使用に適している。
アフィメトリクス社製Ｕ１３３ａチップ上で、９８の代表的な甲状腺の良性および腫瘍試料に関して遺伝子プロファイリングを行うことによって、甲状腺ＦＮＡ分子分析のための、５−遺伝子特性と４−遺伝子特性の２つの遺伝子特性を選択した。特性は、９５％に近い最良の分析感度を達成するために選択された。フィブロネクチンおよび甲状腺ペルオキシダーゼを除いて、２つの特性からの他の７つの遺伝子は、以前には甲状腺の腫瘍発症においては示唆されていなかった。両特性は、個別の７４の甲状腺試料で検証され、９８のトレーニングサンプルの性能に匹敵する性能を達成した。２つの遺伝子特性の性能はそれぞれ、感度が双方で９２％、特異性が７０％／６１％であった。２つの特性が特定の甲状腺対照遺伝子に正規化された場合、正規化されていない特性の性能と比較して性能は改善される。さらに、上記特性は、２つの異なる標的標本、すなわち１−ラウンド増幅および２−ラウンド増幅で、同等に実施した。この検証は、通常限られた数の甲状腺細胞を含むＦＮＡ試料である甲状腺分析に対して、非常に重要である。
組織試料中に特定の核酸配列が存在するまたは存在しないことだけでは、診断的または予後診断的価値を有すると見出されることはほぼ無い。一方で、種々のタンパク質、ペプチド、または、ｍＲＮＡの発現に関する情報は、重要と見られることが多くなっている。ゲノム中に、タンパク質、ペプチド、または、ｍＲＮＡを発現する潜在能力を有する核酸配列（そのような配列は「遺伝子」と呼ばれる）が存在すること自体は、タンパク質、ペプチド、または、ｍＲＮＡが所与の細胞中で発現しているか否かを決定するものではない。タンパク質、ペプチド、または、ｍＲＮＡを発現する能力のある所与の遺伝子が発現しているか否かについても同様であり、たとえ発現していたとしても、そのような発現がどの程度起こっているかは種々の複雑な要素によって決定される。これらの要素を理解および判定する際の難度に関係なく、遺伝子発現の分析は、腫瘍発生、転移、アポトーシス、および、他の臨床的に関連のある現象等の、重要な事象の発生に関して有用な情報を提供することができる。遺伝子がどの程度活性または不活性かの相対的指標は、遺伝子発現プロファイルに見出すことができる。本発明の遺伝子発現プロファイルは、甲状腺癌に対する診断の提供および患者の治療のために使用される。
試料の調製は患者試料の収集を必要とする。本発明の方法で使用された患者試料は、甲状腺組織の穿刺吸引（ＦＮＡ）で小結節から取得された細胞等の、病変細胞を含むと疑われる試料である。生検または手術標本およびレーザーキャプチャーマイクロダイセクションから取得された組織塊標本も、使用に適している。レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）技術は、研究されるべき細胞を選択する一方法であり、細胞型の不均一性による変動を最小化する。したがって、正常または良性の細胞と癌性の細胞の間の中程度または小程度の遺伝子発現の変化は、容易に検出されることができる。試料はまた、末梢血から抽出される循環上皮細胞を含むこともできる。上記循環上皮細胞はいくつかの方法で取得することができるが、最も好ましい方法は、米国特許第６１３６１８２号に記載された磁気分離技術である。関心のある細胞を含む試料が取得されたならば、ＲＮＡは抽出されて、増幅され、好ましくはマイクロアレイによって、適切なポートフォリオ中の遺伝子に対する遺伝子発現プロファイルが取得される。
本発明は、以下のステップにより甲状腺癌を診断する方法を含む。すなわち、患者から生体試料を取得するステップと、ｍＲＮＡをコードする遺伝子からの遺伝子の試料中の発現レベルを測定するステップであって、上記ｍＲＮＡが、配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｍＲＮＡ、または、表２５に示す配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｐｓｉｄからのプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、表２５に示す配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｐｓｉｄからのプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、であり、所定のカットオフレベルより高いかまたは低い前記遺伝子の発現レベルが甲状腺癌を示すステップと、である。
本発明は、以下のステップにより甲状腺癌腫と良性甲状腺病変とを識別する方法を含む。すなわち、患者から試料を取得するステップと、ｍＲＮＡをコードする遺伝子からの遺伝子の試料中の発現レベルを測定するステップであって、上記ｍＲＮＡが、配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｍＲＮＡ、または、表２５に示す配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｐｓｉｄからのプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、表２５に示す配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｐｓｉｄからのプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、であり、所定のカットオフレベルより高いまたは低い上記遺伝子の発現レベルが甲状腺癌を示すステップと、である。
本発明は、以下のステップにより未確定の甲状腺穿刺吸引（ＦＮＡ）甲状腺小結節試料を検査する方法を含む。本ステップとは、患者から生体試料を取得するステップと、ｍＲＮＡをコードする遺伝子の上記試料中の発現レベルを測定するステップであって、上記ｍＲＮＡが、配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｍＲＮＡ、または、表２５に示す配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｐｓｉｄからのプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、表２５に示す配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｐｓｉｄからのプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、である、ステップである。ここで、所定のカットオフレベルより高いまたは低い上記遺伝子の発現レベルは、甲状腺癌を示す。
本発明は、以下のステップにより甲状腺癌患者の治療プロトコルを決定する方法を含む。すなわち、甲状腺癌患者から生体試料を取得するステップと、ｍＲＮＡをコードする遺伝子からの遺伝子の試料中の発現レベルを測定するステップであって、上記ｍＲＮＡが、配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｍＲＮＡ、または、表２５に示す配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｐｓｉｄからのプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、表２５に示す配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｐｓｉｄからのプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、であり、所定のカットオフレベルより高いまたは低い上記遺伝子の発現レベルが、病変を治療するために推奨される手術および／または治療のタイプを、医師が決定することを可能にするのに十分に癌を示すステップと、である。
本発明は、以下のステップにより甲状腺癌患者を治療する方法を含む。すなわち、甲状腺癌患者から生体試料を取得するステップと、ｍＲＮＡをコードする遺伝子からの遺伝子の試料中の発現レベルを測定するステップであって、上記ｍＲＮＡが、配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｍＲＮＡ、または、表２５に示す配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｐｓｉｄからのプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、表２５に示す配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｐｓｉｄからのプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、であり、所定のカットオフレベルより高いまたは低い上記遺伝子の発現レベルが甲状腺癌を示すステップと、前記患者が癌陽性の場合は甲状腺切除術で前記患者を治療するステップと、である。
上記方法における配列識別番号は、３６、５３、７３、２１１、および、２４２、または、１９９、２０７、２５５、および、３５４、または、４５、２１５、６５、２９、１９０、１９９、２０７、２５５、および、３５４であることができる。
本発明はまた、以下のｍＲＮＡをコードする少なくとも１つの遺伝子の発現レベルをさらに測定するステップを含めた上記方法をも含む。上記ｍＲＮＡとは、配列識別番号１４２、２１９、および、３０９に対応するｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、配列識別番号９、１２、および、１８に対応するｍＲＮＡ、または、表２５に示す配列識別番号１３０、１９０、および、２７６に対応するｐｓｉｄからのプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、表２５に示す配列識別番号９、１２、および、１８に対応するｐｓｉｄからのプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、である。本発明はまた、試料中に構成的に発現している少なくとも１つの遺伝子の発現レベルをさらに測定するステップを含めた上記方法をも含む。
カドヘリン３タイプ１（Cadherin 3, type 1）（配列識別番号：５３）はＵＳ２００３０１９４４０６、ＵＳ２００５００３７４３９、および、ＵＳ２００４０１３７５３９に述べられている。フィブロネクチン（Fibronectin）（配列識別番号：２４２）は、ＵＳ６４３６６４２およびＵＳ２００３０１０４４１９に述べられている。分泌顆粒、ニューロエンドクリンタンパク質１（Secretory granule, neuroendocrine protein 1）（配列識別番号：７６）は、ＵＳ２００３０２３２３５０およびＵＳ２００４０００２０６７に述べられている。テスティカン−１（Testican-1）（配列識別番号：３６）は、ＵＳ２００３０１０８９６３およびＵＳ２００５００３７４６３に述べられている。甲状腺ペルオキシダーゼ（Thyroid peroxidase）（配列識別番号：２１１）は、ＵＳ６０６６４４９、ＵＳ２００３０１１８５５３、ＵＳ２００３００５４５７１、ＷＯ９１０２０６１、および、ＷＯ９８５６９５３に述べられている。ケモカインC（C−C）モチーフリガンド１８（Chemokine C(C-C)motif ligand 18）（配列識別番号：３５４）は、ＷＯ２００５００５６０１およびＵＳ２００２０１１４８０６に述べられている。肺界面活性物質関連タンパク質Ｂ（Pulmonary surfactant-associated protein B）（配列識別番号：３５５）は、ＵＳ２００３０２１９７６０およびＵＳ２００３０２３２３５０に述べられている。カリウムチャネルベータサブユニット（K+ channel beta subunit）（配列識別番号：２０７）は、ＵＳ２００３００９６７８２およびＵＳ２００２０１６８６３８に述べられている。仮想前立腺癌抑制因子（Putative prostate cancer suppressor）（配列識別番号：１７８）は、ＷＯ２００５０２０７８４に述べられている。骨髄間質細胞抗原１（Bone marrow stromal cell antigen 1）（配列識別番号：１４２）は、ＷＯ２００４０４００１４およびＷＯ２００５０２０７８４に述べられている。白血球免疫グロブリン様受容体−６b（Leucocyte immunoglobulin-like receptor-6b）（配列識別番号：２１９）は、ＵＳ２００３００６０６１４に述べられている。ブリッジングインテグレーター２（Bridging integrator 2）（配列識別番号：３０９）は、ＥＰ１３９３７７６、ＷＯ０２０５７４１４、ＷＯ０１１６１５８、および、ＵＳ６８３１０６３に述べられている。システインリッチ血管新生誘導因子６１（Cysteine-rich, angiogenic inducer, 61）（配列識別番号：９）は、ＷＯ２００４０３０６１５およびＷＯ９７３３９９５に述べられている。セレノプロテインＰ血漿１（Selenoprotein P, Plasma 1）（配列識別番号：１２）は、ＵＳ２００４０２４１６５３およびＷＯ２００５０１５２３６に述べられている。インスリン様成長因子結合タンパク質４（Insulin-like growth factor-binding protein 4）（配列識別番号：１８）は、ＷＯ２００５０１５２３６、ＷＯ９２０３４６９、ＷＯ９２０３１５２、および、ＥＰ０５４６０５３に述べられている。
本発明において、本明細書によって提供される方法における、患者の遺伝子発現パターンの解析のための最も好ましい方法は、線形判別分析プログラムの使用を通じたものである。本発明は、以下のステップにより、甲状腺癌腫患者の診断を可能にするための事後確率スコアを生成する方法を含む。すなわち、統計的に有意な数の患者の生体試料から遺伝子発現データを取得するステップと、選択される遺伝子を取得するために上記データに線形判別分析を適用するステップと、事後確率スコアとして適用されることが可能な予測モデルを取得するために、判別関数因子で選択された遺伝子に、重み付けされた発現レベルを適用するステップと、である。同じ問題に答えるために、ロジスティック回帰およびニューラルネットワークアプローチ等の、他の解析手段も使用されることができる。
例えば、以下は線形判別分析に使用されることができる：
Figure 2008545400
 式中、
Ｉ(psid)＝括弧内のプローブセットの強度の底２の対数
ｄ(CP)＝癌陽性群に対する判別関数
ｄ(CN)＝癌陰性群に対する判別関数
Ｐ(CP)＝癌陽性群に対する事後ｐ値
Ｐ(CN)＝癌陰性群に対する事後ｐ値、である。
多くの他の周知のパターン認識方法が入手可能である。いくつかの例を提供する参考文献は、加重投票法（Golubら、１９９９）、サポートベクターマシーン（Support Vector Machines）（Suら、２００１およびRamaswamyら、２００１）、K−最近傍法（Ramaswamy、２００１）、ならびに、相関係数（van't Veerら、２００２）である。
好ましくは、ポートフォリオは、ポートフォリオ内の遺伝子の組み合わせが、個々の遺伝子またはランダムに選択された遺伝子の組み合わせと比較して、改善された感度と特異性を示すように構築される。本発明の文脈において、ポートフォリオの感度は、正常状態と比較したときの、病変状態における遺伝子の発現によって示される、倍数の相異に反映されることができる。特異性は、遺伝子発現の信号の、関心のある条件に対する相関の統計的な測定に反映されることができる。例えば、標準偏差はこのような測定として使用されることができる。ポートフォリオに包含するための遺伝子群を考える場合、発現の測定における小さな標準偏差は、より高い特異性と相関する。相関係数等の他の変法の測定もまた、この限りにおいて使用されることができる。本発明はまた、特異性が、少なくとも約４０％の方法、少なくとも約５０％の方法、および少なくとも約６０％の方法である、上記方法も含む。本発明はまた、感度が、少なくとも、約９０％を下らない方法および約９２％を下らない方法である、上記方法も含む。
本発明はまた、発現パターンの比較がパターン認識法で行われる上記方法をも含む。本発明の１つの方法は、診断に帰するために、種々の遺伝子（またはポートフォリオ）に対する遺伝子発現プロファイルを比較することを含む。ポートフォリオを構成する各々の遺伝子の遺伝子発現プロファイルは、コンピュータによって読むことのできる媒体等の媒体中に固定される。この固定方法はいくつもの形式を取ることができる。例えば、表は、病変を示す信号（例、強度測定）の範囲が内部に入力されるように構築されることができる。続いて、患者の試料が、正常、良性、または、病変であるかどうかを決定するために、実際の患者のデータが表中の値と比較されることができる。より洗練された実施形態では、発現信号のパターン（例、蛍光強度）が、デジタル的にまたは図表的に記録される。患者の試料と組み合わせて使用される遺伝子ポートフォリオからの遺伝子発現パターンは、続いて上記発現パターンと比較される。
パターン認識ソフトウェアは、続いて、患者試料が病変を示すパターンを有するか否かを決定するために使用されることができる。もちろん、これらの比較はまた、患者が病変を経験する可能性が無いか否か決定するために使用されることもできる。上記試料の発現プロファイルは、続いて、対照細胞のポートフォリオと比較される。もし上記試料の発現パターンが癌に対する発現パターンと一致する場合、（対抗する医学的考察が存在しない場合には）上記患者は甲状腺癌患者を治療するように治療される。もし上記試料の発現パターンが正常／対照細胞からの発現パターンと一致する場合、上記患者は癌に対して陰性であると診断される。
好ましくは、上方および下方制御は、ハイブリダイズされたマイクロアレイプローブの強度測定の倍数の変化に基づいて識別される。このような識別を行うためには、１．５倍の相異（または０．０５未満のｐ値）が好ましい。つまり、正常細胞と比較して、病変細胞中で遺伝子が差次的に発現していると言われる前に、病変細胞は正常細胞よりも少なくとも約１．５倍大きいか、または約１．５倍小さい強度をもたらすことが見出される。上記倍数の相異が大きくなる程、上記遺伝子の診断的または予後診断的手段としての使用がより好ましくなる。本発明の遺伝子発現プロファイルのために選択される遺伝子は、臨床検査室の機器を使用して、背景ノイズを超える強度の、正常または変調されていない遺伝子の信号と識別することができる信号の発生を結果としてもたらす発現レベルを有する。
統計値は、変調された遺伝子と、変調されていない遺伝子およびノイズとを、確実に識別するために使用されることができる。統計的検定は、多様な試料群の間で最も有意に相異した遺伝子を発見する。スチューデントＴ−検定は、２群間の有意な相異を発見するために使用されることのできる強力な統計的検定の１つの例である。ｐ値が低くなる程、上記遺伝子が異なった群の間で差異を示しているという証拠はより説得力を持つ。しかしながら、マイクロアレイは一度に１つ以上の遺伝子を測定するため、数万の統計的検定が一度に要求される可能性がある。このことによって、全くの偶然によって低いｐ値を見出す可能性は低いので、シダックの補正およびランダム化／置換検定を使用したこれに対する調整が行われることができる。Ｔ−検定による０．０５未満のｐ値は、遺伝子が有意に相異している証拠である。より強力な証拠は、シダックの補正を計算に入れた後の０．０５未満のｐ値である。それぞれの群の大量の試料に対しては、ランダム化／置換検定を行った後の０．０５未満のｐ値が、有意な相異の最も強力な証拠である。
本発明は、本明細書で提供される方法を行うためのマイクロアレイまたは遺伝子チップを含む。本マイクロアレイは、以下のｍＲＮＡをコードする遺伝子の組み合わせの、単離された核酸配列、この配列の相補配列、または、この配列および相補配列の一部を含むことができるマイクロアレイであって、上記ｍＲＮＡが、配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｍＲＮＡ、または、表２５に示す配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｐｓｉｄからのプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、表２５に示す配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｐｓｉｄからのプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、であり、上記組み合わせが、生体試料中の甲状腺癌腫の状態または再発の危険性を特徴付けるのに十分である、マイクロアレイである。上記マイクロアレイは、好ましくは、少なくとも約１．５倍の過剰発現または過少発現を測定または特性化し、統計的に有意なｐ値の過剰発現または過少発現（すなわちｐ値が０．０５未満）を提供する。好ましくは、上記マイクロアレイは、ｃＤＮＡアレイまたはオリゴヌクレオチドアレイを含み、１つまたはそれ以上の内部対照試薬を含んでもよい。１つの好ましい内部対照試薬は、配列識別番号４０９〜４１１を使用して測定されることのできるＰＡＸ８遺伝子の発現を検出する方法である。
好ましくは、上記アレイ中のオリゴヌクレオチドは、発現が測定される遺伝子の３’非コーディング領域に対応する。
変調されていない遺伝子またはノイズの信号より大きい信号を発生する遺伝子を選択するために使用されることができる他のパラメータは、信号の相異の絶対値の測定の使用である。好ましくは、変調された遺伝子の発現によって生成された信号は、正常または変調されていない遺伝子の信号と（絶対値で）少なくとも２０％相異している。この遺伝子は、正常または変調されていない遺伝子の発現パターンと少なくとも３０％相異している発現パターンを生成することが、さらに好ましい。
遺伝子発現プロファイルを構築するための好ましい方法は、タンパク質またはペプチドをコードすることのできる遺伝子によって生産されるＲＮＡの量を決定することを含む。これは、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、競合的ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、ディファレンシャルディスプレイＲＴ−ＰＣＲ（differential display RT-PCR）、ノザンブロット解析、および、他の関連する検定によって達成される。個別のＰＣＲ反応を使用してこれらの技術を行うことが可能であるが、ｍＲＮＡから生産される相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）または相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を増幅し、マイクロアレイを通じて解析することが最も良い。いくつかの異なったアレイ配置およびこのアレイの製造法は、当業者には既知のものであり、米国特許第５４４５９３４号、第５５３２１２８号、第５５５６７５２号、第５２４２９７４号、第５３８４２６１号、第５４０５７８３号、第５４１２０８７号、第５４２４１８６号、第５４２９８０７号、第５４３６３２７号、第５４７２６７２号、第５５２７６８１号、第５５２９７５６号、第５５４５５３１号、第５５５４５０１号、第５５６１０７１号、第５５７１６３９号、第５５９３８３９号、第５５９９６９５号、第５６２４７１１号、第５６５８７３４号、および第５７００６３７号等に記載されている。
マイクロアレイ技術は、数千の遺伝子の定常状態のｍＲＮＡレベルを同時に測定することを可能にし、これにより、制御されない細胞増殖の開始、停止、または、変調等の効果を同定するための強力な手段を提供する。２つのマイクロアレイ技術が現在広く使用されている。第１はｃＤＮＡアレイであり、第２はオリゴヌクレオチドアレイである。これらのチップ構成には相異が存在するが、本質的に全ての下流のデータ解析および出力は同じである。これらの解析の産物は、典型的には、マイクロアレイ上の既知の位置の核酸配列にハイブリダイズする試料から、ｃＤＮＡ配列を検出するために使用される、標識プローブから受信される信号の強度の測定である。典型的には、信号の強度は、試料細胞中で発現されたｃＤＮＡ、すなわちｍＲＮＡの量に比例する。このような技術の多くが入手可能であり、有用である。遺伝子発現を決定する好ましい方法は、米国特許第６２７１００２号、第６２１８１２２号、第６２１８１１４号、および第６００４７５５号に見出されることができる。
発現レベルの解析は、このような信号強度を比較することによって行われる。この解析は、対照試料と比べて被験試料の遺伝子の発現強度の比率マトリクスを生成することによって最適に行われる。例えば、病変組織からの遺伝子発現強度は、同型の良性または正常組織から生成された発現強度と比較されることができる。これらの発現強度の比率は、上記被験試料と対照試料の間の遺伝子発現の倍数変化を示す。
遺伝子発現プロファイルはまた、いくつかの方法で表現されることができる。最も一般的な方法は、縦の列が被験試料を表わし、横の行が遺伝子を表わす図式的なデンドグラム（dendogram）に、未加工の蛍光強度または比率マトリクスを、配置することである。上記データは、類似した発現プロファイルを有する遺伝子が互いに近位に配置される。各々の遺伝子に対する発現比率は、色として視覚化される。例えば、１未満の比率（発現抑制を示す）は、その領域を青い部分として表われてもよく、１より大きい比率（発現亢進を示す）は、その領域を赤い部分として表われてもよい。このようなデータを表示するために市販のコンピュータソフトウェアプログラムが入手可能であり、シリコンジェネティクス社（Silicon Genetics, Inc.）製の「ＧＥＮＥＳＰＲＩＮＧ」ならびにパーテック社（Partek, Inc.）製の「ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ」および「ＩＮＦＥＲ」を含む。
本発明の方法中で使用される変調された遺伝子は、実施例の中に記載されている。差次的に発現された遺伝子は、良性甲状腺病変を有する患者と比較して、甲状腺癌を有する患者中で上方または下方制御を受けている。上方制御および下方制御は相対的な用語であり、ある基準と比較して、遺伝子の発現量に検出可能な差異（測定に使用されたシステムのノイズの寄与を超える）が見出されることを意味している。この場合には、上記基準は、良性病変患者の測定された遺伝子発現である。病変細胞中の関心のある遺伝子は、その結果、同じ測定方法を使用する基準レベルと比較して、発現亢進または発現抑制となる。本発明の文脈における病変とは、調節されない細胞増殖に伴って生起する、身体機能の適正な作用を停止する、妨害する、または、妨害の可能性を有する、身体状態の変化に言及している。ある人物の遺伝子型や表現型のある側面が病変の存在と矛盾が無い場合に、この人物は病気と診断される。しかしながら、診断や予後診断を行うという行為は、再発の可能性、治療のタイプ、および、治療観察の決定等の病気／状態の問題の決定を含む。治療観察では、遺伝子発現プロファイルが正常組織とより一致するパターンに変化したまたは変化しつつあるということを決定するために、長期に渡って遺伝子の発現を比較することによって、所与の治療方針の効果に関して臨床的判断が行われる。
遺伝子は、診断、予後診断、または、治療法の選択等の、臨床的に適切な判断を行うための妥当な根拠を提供するグループの遺伝子のセットについて情報が得られるように、分類されることができる。遺伝子のこれらのセットは、本発明のポートフォリオを形成する。ほとんどの診断マーカーと同様に、正しい医療的判断をするために十分な、最少のマーカーを使用することが多くの場合で望ましい。これは、さらなる解析を保留にする治療の遅れを防止するとともに時間および資源の非生産的な使用を防止する。
遺伝子発現ポートフォリオを構築する１つの方法は、株のポートフォリオを構築する際に広く使用されている、平均分散アルゴリズム等の最適化アルゴリズムの使用を介する。本方法は、米国特許公開公報第２００３０１９４７３４に詳細に記載されている。本質的には、この方法は、返り値（例、生成された信号）の変動を最小化することで、この方法を使用することによって受け取る返り値を最適化するような入力のセット（金融応用においては株であり、ここでは強度によって測定される発現）の構築を必要とする。このような作業を行うための多くの市販ソフトウェアプログラムが入手可能である。本明細書中で「ワグナーソフトウェア」（Wagner Software）として言及される「ワグナーアソシエイツ（Wagner Associates）平均分散最適化アプリケーション」が好ましい。このソフトウェアは、マルコヴィッツ的に有効フロンティアおよび最適ポートフォリオを決定するために、「ワグナーアソシエイツ平均分散最適化ライブラリー」からの関数を使用することが好ましい。このタイプのソフトウェアの使用には、このソフトウェアが本来の経済分析目的のために使用される際に、株の収益とリスク管理が使用されるような形式で、マイクロアレイのデータが入力として扱われることのできるように変形することが要求される。
上記ポートフォリオを選択する過程はまた、発見的な規則の適用を含むことができる。好ましくは、このような規則は、生物学および臨床的な結果を生成するために使用される技術の理解に基づいて作り出される。さらに好ましくは、このような規則は、最適化法からの出力に適用される。例えば、ポートフォリオ選択の平均分散法は、癌を有する対象で差次的に発現されたいくつかの遺伝子に対するマイクロアレイデータに適用されることができる。この方法からの出力は、病変組織と同様に末梢血中に発現されたいくつかの遺伝子を含む可能性のある、最適化された遺伝子のセットであることが推測される。もし上記検定法で使用される試料が末梢血から取得されたものであり、癌の例の中で差次的に発現されているある遺伝子が末梢血中でも差次的に発現されている場合、末梢血中で差次的に発現している遺伝子を排除するような有効フロンティアからポートフォリオが選択される、という発見的な規則が適用されることができる。もちろん、上記規則は、例えばデータの前選択の間に上記規則を適用することによって、有効フロンティアの形成の前に適用されることができる。
問題としている生物学と必ずしも関連の無い他の発見的規則が適用されることもできる。例えば、定められた割合の上記ポートフォリオだけが、特定の遺伝子または遺伝子群によって代表されることができるという規則を適用することができる。ワグナーソフトウェア等の市販ソフトウェアは、これらの形式の発見法に容易に対応できる。これは、例えば、正確度と精密度以外の要素（例、予想されるライセンス料）が、１つまたはそれ以上の遺伝子を含める好ましさに影響を与える場合に有用である。
本発明の遺伝子発現プロファイルはまた、癌の診断、予後診断、または、治療観察に有用な他の非遺伝子的な診断方法と組み合わせて使用されることもできる。例えば、ある状況においては、上記に記載の遺伝子発現に基づく方法の診断力と、血清タンパク質マーカー（例、癌抗体２７．２９（「ＣＡ２７．２９」））等の従来のマーカーからのデータを組み合わせることが有益である。ＣＡ２７．２９等の分析物を含む、一連のこのようなマーカーが存在する。このような方法の１つにおいては、治療中の患者から定期的に血液が採取され、次いで上記に記載の血清マーカーの１つに対して酵素免疫測定が行われる。マーカー濃度が腫瘍の再発または治療の失敗を示唆する場合は、遺伝子発現解析に使用できる試料源が取得される。疑わしい腫塊が存在する場所には、穿刺吸引（ＦＮＡ）が行われ、腫塊から採取された細胞の遺伝子発現プロファイルが上記に記載のように解析される。別の方法としては、以前に腫瘍が切除された組織に隣接する部位から組織試料が採取されてもよい。本アプローチは他の検定があいまいな結果を生成する場合に特に有用でありうる。
本発明は、甲状腺癌腫患者に対して、以下のステップにより、遺伝子発現プロファイルを相互検証する方法と、これにより取得された遺伝子発現プロファイル、とを含む。本ステップとは、ａ．統計的に有意な数の患者の生体試料からの遺伝子発現データを取得するステップと、ｂ．試料の順番をランダム化するステップと、ｃ．試料の約１０〜５０％からのデータを除外することを設定するステップと、ｄ．残試料に対して、全ての変数に関して関心のある要素に対する計算を行い、ｐ値カットオフ（ｐ）に見合う変数を選択するステップと、ｅ．順方向検索を使用して予測モデルに合致する変数を選択し、所定のエラー率に達するまでトレーニングエラーを評価するステップと、ｆ．除外されていた試料の１０〜５０％に対して予測モデルを検定するステップと、ｇ．ステップｃ．と、ステップｇ．までを除外されていた試料の新たなセットを用いて繰り返すステップと、ｈ．ステップｃ．ないしステップｇ．までを１００％の試料が検定されるまで継続し、分類性能を記録するステップと、である。本方法において、好ましくは、ステップｈ．で取得される遺伝子発現データは、ｍＲＮＡをコードする遺伝子によって表わされる。上記ｍＲＮＡとは、配列識別番号１、４、７、８、１０〜１１、１３〜１７、１９〜２４、２６〜２７、２９〜３１、３３〜３５、３７〜３８、４０〜５２、５４〜７２、７５〜８２、８４〜１３５、１３８〜１４１、１４４〜１５１、１５３〜１５９、１６１〜１６２、１６４、１６６〜１７３、１７６〜１９８、２００〜２０１、２０３〜２０６、２０８〜２０９、２１２〜２１３、２１５〜２１８、２２０〜２２１、２２３、２２７〜２３３、２３５〜２４１、２４３〜２４４、２４６〜２４９、２５１、２５３〜２５４、２５６〜２６３、２６５〜２８９、２９１〜２９３、２９５〜３０８、３１０〜３３１、３３３〜３４１、３４３〜３４５、３４７〜３４８、３５０〜３５３、および、３５５〜３６３に対応するｍＲＮＡ、または、配列識別番号１、４、７、８、１０〜１１、１３〜１７、１９〜２４、２６〜２７、２９〜３１、３３〜３５、３７〜３８、４０〜５２、５４〜７２、７５〜８２、８４〜１３５、１３８〜１４１、１４４〜１５１、１５３〜１５９、１６１〜１６２、１６４、１６６〜１７３、１７６〜１９８、２００〜２０１、２０３〜２０６、２０８〜２０９、２１２〜２１３、２１５〜２１８、２２０〜２２１、２２３、２２７〜２３３、２３５〜２４１、２４３〜２４４、２４６〜２４９、２５１、２５３〜２５４、２５６〜２６３、２６５〜２８９、２９１〜２９３、２９５〜３０８、３１０〜３３１、３３３〜３４１、３４３〜３４５、３４７〜３４８、３５０〜３５３、および、３５５〜３６３に対応する表２５中のｐｓｉｄからのプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、である。
本発明は、甲状腺癌患者に対して、以下のステップにより、遺伝子発現プロファイルを個別に検証する方法と、これにより取得された遺伝子発現プロファイルと、を含む。上記ステップとは、統計的に有意な数の患者の生体試料から遺伝子発現データを取得するステップと、上記遺伝子発現データ内の情報源の変動を正規化するステップと、関心のある要素に対して事前に選択された全ての変数に関する計算を行うステップと、上記試料に対して予測モデルを検定し、分類性能を記録するステップと、である。本方法において、好ましくは、ステップｄ．中で取得される遺伝子発現データは、以下のｍＲＮＡをコードする遺伝子によって表わされる。上記ｍＲＮＡとは、配列識別番号１、４、７、８、１０〜１１、１３〜１７、１９〜２４、２６〜２７、２９〜３１、３３〜３５、３７〜３８、４０〜５２、５４〜７２、７５〜８２、８４〜１３５、１３８〜１４１、１４４〜１５１、１５３〜１５９、１６１〜１６２、１６４、１６６〜１７３、１７６〜１９８、２００〜２０１、２０３〜２０６、２０８〜２０９、２１２〜２１３、２１５〜２１８、２２０〜２２１、２２３、２２７〜２３３、２３５〜２４１、２４３〜２４４、２４６〜２４９、２５１、２５３〜２５４、２５６〜２６３、２６５〜２８９、２９１〜２９３、２９５〜３０８、３１０〜３３１、３３３〜３４１、３４３〜３４５、３４７〜３４８、３５０〜３５３、および、３５５〜３６３、に対応するｍＲＮＡ、または、配列識別番号１、４、７、８、１０〜１１、１３〜１７、１９〜２４、２６〜２７、２９〜３１、３３〜３５、３７〜３８、４０〜５２、５４〜７２、７５〜８２、８４〜１３５、１３８〜１４１、１４４〜１５１、１５３〜１５９、１６１〜１６２、１６４、１６６〜１７３、１７６〜１９８、２００〜２０１、２０３〜２０６、２０８〜２０９、２１２〜２１３、２１５〜２１８、２２０〜２２１、２２３、２２７〜２３３、２３５〜２４１、２４３〜２４４、２４６〜２４９、２５１、２５３〜２５４、２５６〜２６３、２６５〜２８９、２９１〜２９３、２９５〜３０８、３１０〜３３１、３３３〜３４１、３４３〜３４５、３４７〜３４８、３５０〜３５３、および、３５５〜３６３、に対応する、表２５中のｐｓｉｄからのプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、である。
本発明は、以下のステップにより、甲状腺癌患者の診断を可能にする事後確率を生成する方法を含む。上記ステップとは、統計的に有意な数の患者の生体試料から遺伝子発現データを取得するステップと、選択された遺伝子を取得するために上記データに線形判別分析を適用するステップと、事後確率スコアとして適用されることが可能な予測モデルを取得するために、判別関数因子で選択された遺伝子に、重み付けされた発現レベルを適用するステップと、である。例えば、以下は線形判別分析に使用されることができる：
Figure 2008545400
 式中、
Ｉ(psid)＝括弧内のプローブセットの強度の底２の対数
ｄ(CP)＝癌陽性群に対する判別関数
ｄ(CN)＝癌陰性群に対する判別関数
Ｐ(CP)＝癌陽性群に対する事後ｐ値
Ｐ(CN)＝癌陰性群に対する事後ｐ値、である。
本発明は、以下のステップにより、甲状腺癌腫診断の患者報告書を作成する方法およびこれにより取得された報告書を含む。上記ステップとは、上記患者から生体試料を取得するステップと、上記試料の遺伝子発現を測定するステップと、これに事後確率スコアを適用するステップと、報告書を作成するために上記ステップで取得された結果を使用するステップと、である。上記報告書はまた、患者の転帰および／または患者集団と比較した危険性の確率の評価も含むことができる。
本発明は、以下のセットからの少なくとも１つのプローブのセットを包含する成分を含む。上記セットとは、配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２、ならびに／もしくは、配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４、または、配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｐｓｉｄ、ならびに／もしくは、表２５に示す配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４、である。
本発明は、生体試料中の甲状腺癌腫の診断を決定するために分析を行うためのキットであって、以下のｍＲＮＡをコードする遺伝子の組み合わせの、単離された核酸配列、この配列の相補配列、または、この配列および相補配列の一部、を検出するための材料を包含する、キットを含む。上記ｍＲＮＡとは、配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｍＲＮＡ、または、表２５に示す配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｐｓｉｄからのプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、表２５に示す配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｐｓｉｄからのプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、である。配列識別番号は、３６、５３、７３、２１１、および、２４２；１９９、２０７、２５５、および、３５４；ならびに４５、２１５、６５、２９、１９０、１９９、２０７、２５５、および、３５４；であることができる。
本発明にしたがって作成されたキットは、上記遺伝子発現プロファイルを決定するための形式の整った分析を含む。本キットは、試薬および説明書、ならびに、核酸配列、この配列の相補配列、または、この配列および相補配列の一部が上記媒体を通じて分析される媒体等の、分析を行うために必要とされる材料の全てまたはいくつかを含むことができる。
本発明の物品は、治療、診断、予後診断、および、そうでない場合は病気を評価するために有用な、遺伝子発現プロファイルの表現方法を含む。これらのプロファイルの表現方法は、コンピュータが読み込むことのできる媒体（磁気的、光学的、および類似の方式）等の、機械によって自動的に読まれることのできる媒体に記録される。この物品はまた、上記媒体中の遺伝子発現プロファイルを解析するための説明書も含むことができる。例えば、上記物品は、上記に記載された遺伝子のポートフォリオの遺伝子発現プロファイルを比較するための、コンピュータ取扱説明書を有するＣＤ ＲＯＭを含んでもよい。上記物品はまた、患者の試料からの遺伝子発現データと比較されてもよいように、上記媒体中にデジタル的に記録された遺伝子発現プロファイルをも有してもよい。別の場合には、上記プロファイルは異なった表現形式で記録されることができる。画像的な記録は、このような形式の１つである。上記に記載したパーテック社製の「ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ」および「ＩＮＦＥＲ」ソフトウェアに組み込まれたアルゴリズム等のアルゴリズムのクラスタリングは、データの視覚化の際に最も良く補助することができる。
本発明に記載の製造の物品の異なる形式は、遺伝子発現プロファイルを明らかにするために使用される、媒体または形式の整った分析である。上記の物品は例えば、マイクロアレイであって、このマイクロアレイ内部では相補配列またはプローブがマトリクスに固定され、このマトリクスには関心のある遺伝子を示す配列が、読み取ることが可能な上記遺伝子の明確な存在を付与する、マイクロアレイを含むことがでる。他の場合には、本発明に記載の物品は、ハイブリダイゼーション、増幅、および、癌を検出するために関心のある遺伝子の発現レベルを示す信号の発生、を行うための試薬キットの様式にされることも可能である。
本発明は、以下の材料を含む甲状腺癌腫の状態を分析するための物品を含む。本材料とは、以下のｍＲＮＡをコードする遺伝子の組み合わせの、単離された核酸配列、この配列の相補配列、または、この配列および相補配列の一部を検出するための材料である。上記ｍＲＮＡとは、配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｍＲＮＡ、または、表２５に示す配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｐｓｉｄからのプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、表２５に示す配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｐｓｉｄからのプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、である。配列識別番号は、３６、５３、７３、２１１、および、２４２；１９９、２０７、２５５、および、３５４；または、４５、２１５、６５、２９、１９０、１９９、２０７、２５５、および、３５４であることができる。
本発明は、ｍＲＮＡをコードする遺伝子の組み合わせの、単離された核酸配列、この配列の相補配列、または、この配列および相補配列の一部を含む診断／予後診断ポートフォリオであって、上記ｍＲＮＡが、配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｍＲＮＡ、または、表２５に示す配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｐｓｉｄからのプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、表２５に示す配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｐｓｉｄからのプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、である、ことを含み、上記組み合わせが生体試料中の甲状腺癌腫の状態または再発の危険性を特徴付けるのに十分である、ポートフォリオである。好ましくは、上記ポートフォリオは、少なくとも約１．５倍の過剰発現もしくは過少発現を測定もしくは特徴付けする、または、統計的に有意なｐ値の過剰発現もしくは過少発現を提供する。好ましくは、ｐ値は０．０５未満である。
以下の実施例は詳述のために提供されているが、本発明の請求範囲を制限するものではない。明細書に引用した全ての参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
〔実施例１〕
材料および方法
組織試料
甲状腺良性病変、濾胞性腺腫、濾胞性癌、および、乳頭癌の新鮮凍結試料が、ゲノミクスコラボラティブ社（Genomics Collaborative, Inc.）（ケンブリッジ、マサチューセッツ州）、アステランド社（Asterand）（デトロイト、ミシガン州）、プロテオジェネクス社（Proteogenex）（ロサンゼルス、カリフォルニア州）を含む、異なった商用ベンダーから取得された。全ての試料は、治験審査委員会承認プロトコルにしたがって収集された。患者の人口統計および病理学的情報もまた収集された。診断、試料の保存、および、腫瘍の含有量を確認するために、各々の試料の組織病理学的特徴が再調査された。
ＲＮＡの単離
全てのＲＮＡの単離に対して、標準的なＴｒｉＺｏｌプロトコルが使用された。組織は、ＴｒｉＺｏｌ試薬（インビトロジェン（Invitrogen）、カールズバッド、カリフォルニア州）中でホモジナイズされた。ＴｒｉＺｏｌから全ＲＮＡを単離し、−２０℃でイソプロピルアルコールを用いて沈殿させた。ＲＮＡのペレットは７５％エタノールで洗浄され、水に溶解され、使用まで−８０℃で保管された。ＲＮＡの完全性は、アグリエント２１００バイオアナライザーＲＮＡ６０００ナノアッセイ（Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 NanoAssay）（アグリエントテクノロジー社（Agilent Technologies）、パロアルト、カリフォルニア州）を用いて検討された。
線形判別分析
以下のステップを使用して線形判別分析が行われた。本ステップとは、共通の（プールされていた）共分散行列および群内平均値を計算するステップと、上記共通の共分散および群内平均値から線形判別関数のセットを計算するステップと、線形判別関数を使用して分類を行うステップと、である。
各々のプローブに対するチップ強度の読みを以下の等式に当てはめることは、癌陽性または陰性いずれかとして未知の甲状腺試料の事後確率を導くことに使用されることができる。例えば、もし甲状腺試料が上記の分析によって検定され、ｐ(CP)＞０．５を与える場合、この試料は甲状腺癌として分類されることになる。
４−遺伝子特性に対し、
ｄ(CP)＝−５０．９９６４＋０．２２０４２４（Ｉ(32128_at)）＋１．５２０１８５（Ｉ(209810_at)）＋３．０９４３１（Ｉ(210078_s_at)）＋６．１１２８３（Ｉ(213423_x_at)）
ｄ(CN)＝−４６．７４４５＋０．３７４７５１（Ｉ(32128_at)）＋１．０１０８５２（Ｉ(209810_at)）＋３．６４５５１５（Ｉ(210078_s_at)）＋５．３３７２９６（Ｉ(213423_x_at)）
５−遺伝子特性に対し、
ｄ(CP)＝−１３５．９３１＋４．７３７８３８（Ｉ(202363_at)）−１．２３７６３（Ｉ(203256_at)）＋１．９８４１４８（Ｉ(203889_at)）＋６．６３８０８２（Ｉ(210342_s_at)＋１０．７７０４（Ｉ(212464_s_at)）
ｄ(CN)＝−１２８．９７８＋４．６１０４９８（Ｉ(202363_at)）−１．２８６８５（Ｉ(203256_at)）＋１．６５６７７２（Ｉ(203889_at)）＋６．８５９１３３（Ｉ(210342_s_at)＋１０．２４４８２（Ｉ(212464_s_at)）
Figure 2008545400
 式中、
Ｉ(psid)＝括弧内のプローブセットの強度の底２の対数
ｄ(CP)＝癌陽性群に対する判別関数
ｄ(CN)＝癌陰性群に対する判別関数
Ｐ(CP)＝癌陽性群に対する事後ｐ値
Ｐ(CN)＝癌陰性群に対する事後ｐ値、である。
２ラウンドのａＲＮＡ増幅
ａＲＮＡは、リボビースト２−ラウンドアミノアリル−ａＲＮＡ増幅キット（RiboBeast 2-Round Aminoallyl-aRNA Amplification kit）（エピセンター（Epicentre）、ウィスコンシン州）（Ｔ７をベースにしたＲＮＡ線形増幅プロトコル）をいくつか改変して使用し、１０ｎｇの全ＲＮＡから増幅された。全ＲＮＡは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含むオリゴ（ｄＴ）プライマーおよびスーパースクリプトＩＩＩ ＲＴ（Superscript III RT）を使用して逆転写された。第２の鎖の合成は、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼを使用して行われた。バックグランドノイズを減少させるために、Ｅｘｏ ＩとＥｘｏ ＶＩＩのエキソヌクレアーゼ混合液と共にインキュベートする追加のステップが行われた。二本鎖ｃＤＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によるＴ７を介した線形増幅のための鋳型として使用された。増幅の第２のラウンドのためには、リボビースト試薬を使用する代わりにＥＮＺＯバイオアレイ高収率ＲＮＡ転写標識キット（ENZO BioArray HighYield RNA Transcript Labeling kit）（アフィメトリクス社、カリフォルニア州）が、アミノアリル−ａＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ステップと入れ替えて、使用された。ａＲＮＡはアグリエントナノチップ（Agilent Nano Chip）技術によって定量された。
〔実施例２〕
マイクロアレイ解析
標識されたｃＲＮＡが調製され、合計２２，０００プローブセットを含む高密度オリゴヌクレオチドアレイＨｕ１３３Ａ遺伝子チップ（アフィメトリクス社、サンタクララ、カリフォルニア州）とハイブリダイズされた。ハイブリダイゼーションは、製造元によって供給される標準的プロトコルにしたがって行われた。アレイは、アフィメトリクス社のプロトコルおよびスキャナーを使用してスキャンされた。続く解析のために、各々のプローブセットは個別の遺伝子と見なされた。各々の遺伝子に対する発現値が、アフィメトリクス社遺伝子チップ解析ソフトウェアＭＡＳ５．０を使用して計算された。全てのチップは以下の品質管理基準に合致した。この品質管理基準では、「Ｐｒｅｓｅｎｔ」判定の割合、倍率、バックグランドレベル、および、ノイズレベルが、平均のプラスまたはマイナス３標準偏差の範囲内である必要がある。続く解析に使用された全てのチップは、上記の品質管理基準を通過した。特性選択および検証のための試料のコレクションは、表１に要約されている。
Figure 2008545400
〔実施例３〕
特性同定の結果
Ａ．遺伝子選択
３１の原発性甲状腺乳頭癌、２１の濾胞性甲状腺癌、３３の濾胞性腺腫、および、１３の良性甲状腺組織を含む合計９８の試料が、アフィメトリクス社ヒトＵ１３３Ａ遺伝子チップを使用して分析された。後に続く遺伝子マーカーまたは特性の同定のための限られた数の遺伝子を取得するために、全てのデータセットに対して以下の５つの遺伝子選択基準が適用された。
１．この試料セット中で、少なくとも１つの「Ｐｒｅｓｅｎｔ」判定を持つ遺伝子が検討された。
２．１２のＰＢＬ試料中で、１つより多い「Ｐｒｅｓｅｎｔ」判定を持つ遺伝子は、除外された。
３．全ての試料中で、２００より大きいチップ強度を持つ遺伝子だけが選択された。
４．上記３つの基準を通過した遺伝子を使用して、発明者らは、表２に挙げられたような種々の分析を行い、甲状腺腫瘍中で発現亢進または発現抑制されている遺伝子を同定した。
５．最後に、１．４倍より大きい発現の変化を持つ遺伝子が選択された。
Figure 2008545400
特性の同定のために選択された遺伝子の最終的な数は３２２であり、表２５中に記載の配列識別番号１、４、７、８、１０〜１１、１３〜１７、１９〜２４、２６〜２７、２９〜３１、３３〜３５、３７〜３８、４０〜５２、５４〜７２、７５〜８２、８４〜１３５、１３８〜１４１、１４４〜１５１、１５３〜１５９、１６１〜１６２、１６４、１６６〜１７３、１７６〜１９８、２００〜２０１、２０３〜２０６、２０８〜２０９、２１２〜２１３、２１５〜２１８、２２０〜２２１、２２３、２２７〜２３３、２３５〜２４１、２４３〜２４４、２４６〜２４９、２５１、２５３〜２５４、２５６〜２６３、２６５〜２８９、２９１〜２９３、２９５〜３０８、３１０〜３３１、３３３〜３４１、３４３〜３４５、３４７〜３４８、３５０〜３５３、および、３５５〜３６３である。３２２の選択された遺伝子から取得されたデータは、表３に提供されており、表４に要約されている。
Figure 2008545400
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Ｂ．線形判別分析を使用した特性の同定
発明者らは、線形判別式（linear discriminator）によって評価された事後エラーが０．１より少ないかまたは０．１に等しくなるまで、一回に１つの遺伝子を加える前進選択工程（forward selection process）を使用した。本アプローチを３２２の遺伝子に使用することにより、４遺伝子特性が発見された。上記４遺伝子の同定は、表５および表１６に示されており、これらのチップのデータは、表６および表７に示されている。
Figure 2008545400
リーブ・ワン・アウト・クロス・バリデーション（Leave One Out Cross Validation、ＬＯＯＣＶ）法は、９２％の感度および６１％の特異性を結果として示した（表４に示す）。ＲＯＣ曲線は、図１に示されるように、０．８９７のＡＵＣを与えた。
Figure 2008545400
Figure 2008545400
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Ｃ．マーカーの手動選択
個々の遺伝子は、ＲＴ−ＰＣＲに基づいた分析を構成することを目標として選別された。甲状腺癌と非癌性組織の間の遺伝子発現プロファイルの比較は、３２２の遺伝子から５−遺伝子特性を同定した。これら５−遺伝子の同定は、表８および表１６に示されており、チップのデータは、表９に示されている。この特性の性能は、９８の試料中でＬＤＡを使用して判定され、特性は９２％の感度および７０％の特異性を与える（表１０に示す）。ＲＯＣ曲線は、図２に示されるように、０．８８のＡＶＣを与えた。
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Ｄ．７４の個別の甲状腺試料を用いた相互検証
７４の個別の甲状腺試料が、Ｕ１３３Ａチップを用いて処理され、プロファイリングされた。これらの２つの特性に対するチップのデータは表１１に示されている。４−遺伝子および５−遺伝子特性の性能は、ＬＤＡを用いて判定された。両特性は、９８のトレーニング試料と比較して、７４の試料中で同等の性能を与えた。両特性に対する感度および特異性は、表１２に示されており、ＲＯＣ曲線は図３ａおよび図３ｂに示されている。
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Ｅ．対照遺伝子マーカーの同定
９８の甲状腺試料および１２のＰＢＬ試料を使用して、発明者らは、試料採取対照として２つの群の遺伝子を選択した。第１の群は、甲状腺中では発現されているがＰＢＬ中では発現されていない遺伝子からなり、第２の群は、ＰＢＬ中では発現されているが甲状腺中では発現されていない遺伝子を含む。全遺伝子のリストおよび対応するチップのデータは、表１３ａおよび表１３ｂに示されている。これらの遺伝子から、発明者らは、量が豊富であり、甲状腺とＰＢＬの間の差が比較的大きい６つの遺伝子を選択した。６つの遺伝子の発現プロファイルは、７４の個別の甲状腺試料中で検証された。上記６つの遺伝子の同定は、表１４に示されており、これらのチップのデータは、表１５ａおよび表１５ｂに示されている。
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Ｆ．対照遺伝子に正規化された特性
発明者らはさらに、５−遺伝子および４−遺伝子特性を、遺伝子チップデータ正規化アルゴリズムと同様に、上記遺伝子を３つの選択された甲状腺対照遺伝子に正規化することによって、検討した。３つの甲状腺対照遺伝子の平均の蛍光強度が、特性遺伝子の信号正規化のために使用された。上記２つの特性が正規化された場合、両特性の性能はわずかに向上した。上記２つの特性の感度と特異性は、表１６に示されており、ＲＯＣ曲線は、図４ａおよび図４ｂに示されている。
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Ｇ．２−ラウンド増幅プローブを使用した特性の検証
標的ＲＮＡの１−ラウンドの増幅後、すなわち２−ラウンドの増幅において、ＦＮＡ試料がアフィメトリクス社Ｕ１３３ａ遺伝子チップにハイブリダイズするための十分なプローブ材料を提供する必要量の甲状腺細胞を欠いているかを決定する目的で、発明者らは、７４の個別の検証試料セットに含まれる４７の試料を用いて２−ラウンドの増幅を行った。取得されたデータは、５−遺伝子および４−遺伝子特性の性能が１−ラウンドまたは２−ラウンドの増幅のいずれかと同等であることを示す。２種類の異なった目的物調製の２つの遺伝子特性のＲＯＣ曲線は、図５ａ、図５ｂ、図５ｃ、および、図５ｄに示されている。
〔実施例４〕
個別の試料を使用した相互検証
Ａ．８３の個別の新鮮凍結甲状腺試料を使用した相互検証
８３の個別の甲状腺試料が、Ｕ１３３ａチップを用いて処理され、プロファイリングされた。各々のカテゴリー中の試料数を、表１７に記載している。
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４−遺伝子特性および５−遺伝子特性の性能は、トレーニングセットと同じカットオフ値を使用して、ＬＤＡで判定された。両特性は、これらの試料中で同等の性能を与え、両特性の性能は、９８のトレーニングセット中での性能と同等である。両特性の感度と特異性は表１８に示されており、ＲＯＣ曲線は、図６ａおよび図６ｂに示されている。
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Ｂ．４７の穿刺吸引（ＦＮＡ）甲状腺試料を用いた特性検証
４７の甲状腺ＦＮＡ試料が、Ｕ１３３ａチップを用いて処理され、プロファイリングされた。各々のカテゴリーの試料数を、表１９に記載している。
Figure 2008545400
４−遺伝子特性および５−遺伝子特性の性能は、ＬＤＡモデルを用いて判定された。両特性は、ＦＮＡ試料中で同等の性能を与え、両特性の性能は９８のトレーニングセット中での性能に匹敵する。両特性の感度と特異性は、表２０に示されており、ＲＯＣ曲線は、図７ａおよび図７ｂに示されている。
Figure 2008545400
Ｃ．２８対の新鮮凍結試料とＦＮＡ甲状腺試料の対における特性性能
８３の新鮮凍結試料および４７のＦＮＡ試料の収集物の中には、同じ患者からの２８の試料がある。これらの対になった試料における上記特性の直接の比較は、上記特性がどれだけ良く最終的な分子分析に翻訳されるかを示す。４−遺伝子特性および５−遺伝子特性の性能は、ＬＤＡモデルを用いて判定された。両特性は、新鮮凍結試料およびＦＮＡ試料中で同等の性能を与えた。これらの結果は、本発明者らの４−遺伝子および５−遺伝子特性が、両試料型において同様に良く機能できることを示し、新鮮凍結試料を遺伝子／特性同定に使用するアプローチが妥当であることを証明した。両特性の感度と特異性は、表２１に示されており、ＲＯＣ曲線は、図８ａおよび図８ｂに示されている。
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〔実施例５〕
リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ
試料採取：
遺伝子プロファイルおよび／または対照の一部が、ＲＴ−ＰＣＲで適切な特異性および感度を与えるかどうか決定するために、以下の実験が行われた。以下は、１−ラウンドのＲＮＡ増幅しか必要としないという利点を持っている。
本発明者らの研究では、以下の合計１０７の生検が分析された。１０７の生検とは、２６の濾胞性腺腫、２３の濾胞性癌、３８の乳頭癌、５つの正常、３つの濾胞性乳頭癌、３つの橋本甲状腺炎、２つの小濾胞状腺腫、１つの広汎性甲状腺腫、１つの乳頭過形成を伴う甲状腺腫、１つのヒュルトレ細胞腺腫、１つの乳頭状過形成、１つの多結節性甲状腺腫、１つの好酸性過形成（oncocytic hyperplasia）、１つの甲状腺炎、の生検である。全ＲＮＡの単離は、製造元の取扱説明書にしたがってＴｒｉＺｏｌ試薬を使用することによって抽出された。ＲＮＡ濃度は、Ｇｅｎｅ−Ｓｐｅｃ（日立）分光光度計を使用して、２６０ｎｍでの吸光度の読みによって決定された。単離されたＲＮＡは、ＲＮａｓｅフリーの水中に−８０℃で、使用まで保管された。
プライマーおよびプローブの設計：
プライマーおよび加水分解プローブは、Ｏｌｉｇｏ ６．０および甲状腺癌状態のマーカーに対するジーンバンクの配列（表２２）を使用して設計された。これらのプライマーおよびプローブセットは、プライマーのアニーリング温度が６２℃に、プローブのアニーリング温度がそれより５〜１０℃高くなるように、増幅生成物の長さが１００〜１５０塩基対の範囲になるようにデザインされた。ゲノムＤＮＡ増幅は、本発明者らのプライマーをエクソン−イントロンスプライシング部位の近傍にデザインすることによって除外された。加水分解プローブは、５’ヌクレオチド側ではレポーター染料としてＦＡＭで標識され、３’ヌクレオチド側では消光染料としてＴＡＭＲＡで標識された。
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リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ：
２１の甲状腺癌状態遺伝子およびハウスキーピング遺伝子の遺伝子特異的リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ増幅が、ＴａｑＭａｎワンステップＲＴ−ＰＣＲマスター混合液（TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix）（２×）（アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystems））およびＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴ配列検出システム（アプライドバイオシステムズ社）を使用して行われた。２５μＬの１ステップ反応では、１× ＲＴ−ＰＣＲマスター混合液、Ｍｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ酵素 ０．２５Ｕ／μＬ、プライマー ０．６μＭ、および、プローブ ０．２５μＭ、を含む混合液に全ＲＮＡ（１０ｎｇ）が加えられた。サイクルパラメータは、４８℃で３０分、９５℃で１０分、続いて、９５℃で１５秒と６２℃で１分を４０サイクル、であった。リアルタイムのＰＣＲモニタリングは、各サイクルのアニーリング段階の終わりにおける蛍光信号を測定することによって達成された。蛍光閾値に達するためのサイクル数は、サイクル閾値（Ｃｔ値）として定義された。試料中のＲＮＡの完全性から生じるエラーを最小化するために、β−アクチンのｍＲＮＡが内部対照として増幅された。外部標準は、既知の甲状腺癌陽性のＲＮＡの１０倍希釈系列によって調製され、本発明者らの分析を通じて、線形性を確認するために使用された。結果は平均Ｃｔ値で表わされ、標準偏差が１より大きい試料は除外された。結果は、表２３ａ、表２３ｂ、表２３ｃ、表２４ａ、および表２４ｂに提供されている。
上記データは、表２３ｂに示される２組の遺伝子特性がそこから導き出された４−遺伝子特性ほどの感度および特異性を示さないことを示している。表２４は、ＲＴ−ＰＣＲ反応中でＰＡＸ８遺伝子を甲状腺特異的組織に対する対照として使用することが、ＲＴ−ＰＣＲ反応中で効果的であることを示している。
上述の本発明は、図解と実施例を、理解を明瞭にする目的でいくつか詳細に記載しているが、上記の記述と例示は本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。
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〔実施の態様〕
（１）甲状腺癌を診断する方法において、
ａ．患者から生体試料を取得するステップと、
ｂ．ｍＲＮＡをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の、前記試料中の発現レベルを測定するステップであって、前記ｍＲＮＡは、
ｉ．配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、
ｉｉ．配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｍＲＮＡ、または、
ｉｉｉ．表２５に示す配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、
ｉｖ．表２５に示す配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡである、ステップと、
を含み、
所定のカットオフレベルより高いまたは低い前記遺伝子発現レベルは、甲状腺癌を示す、方法。
（２）甲状腺癌腫と良性甲状腺病変とを識別する方法において、
ａ．患者から試料を取得するステップと、
ｂ．ｍＲＮＡをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の、前記試料中の発現レベルを測定するステップであって、前記ｍＲＮＡは、
ｉ．配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、
ｉｉ．配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｍＲＮＡ、または、
ｉｉｉ．表２５に示す配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、
ｉｖ．表２５に示す配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡである、ステップと、
を含み、
所定のカットオフレベルより高いまたは低い前記遺伝子発現レベルは、甲状腺癌腫を示す、方法。
（３）未確定の甲状腺穿刺吸引（ＦＮＡ）甲状腺結節試料を検査する方法において、
ａ．患者から生体試料を取得するステップと、
ｂ．ｍＲＮＡをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の、前記試料中の発現レベルを測定するステップであって、前記ｍＲＮＡは、
ｉ．配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、
ｉｉ．配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４、に対応するｍＲＮＡ、または、
ｉｉｉ．表２５に示す配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、
ｉｖ．表２５に示す配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡである、ステップと、
を含み、
所定のカットオフレベルより高いまたは低い前記遺伝子発現レベルは、甲状腺癌腫を示す、方法。
（４）甲状腺癌患者の治療プロトコルを決定する方法において、
ａ．甲状腺癌患者から生体試料を取得するステップと、
ｂ．ｍＲＮＡをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の、前記試料中の発現レベルを測定するステップであって、前記ｍＲＮＡは、
ｉ．配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、
ｉｉ．配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｍＲＮＡ、または、
ｉｉｉ．表２５に示す配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、
ｉｖ．表２５に示す配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡである、ステップと、
を含み、
所定のカットオフレベルより高いかまたは低い前記遺伝子発現レベルは、病変を治療するために推奨される手術および／または治療のタイプを、医師が決定することを可能にするのに十分に癌を示す、方法。
（５）甲状腺癌患者を治療する方法において、
ａ．甲状腺癌患者から生体試料を取得するステップと、
ｂ．ｍＲＮＡをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の、前記試料中の発現レベルを測定するステップであって、前記ｍＲＮＡは、
ｉ．配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、
ｉｉ．配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｍＲＮＡ、または、
ｉｉｉ．表２５に示す配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、
ｉｖ．表２５に示す配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、であり、
所定のカットオフレベルより高いまたは低い前記遺伝子発現レベルは、癌を示す、ステップと、
ｃ．前記患者が癌陽性の場合には、甲状腺切除術で前記患者を治療するステップと、
を含む、方法。
（６）実施態様１から実施態様５の１つに記載の方法において、
前記配列識別番号は、３６、５３、７３、２１１、および、２４２である、方法。
（７）実施態様１から実施態様５の１つに記載の方法において、
前記配列識別番号は、１９９、２０７、２５５、および、３５４である、方法。
（８）実施態様１から実施態様５の１つに記載の方法において、
前記配列識別番号は、４５、２１５、６５、２９、１９０、１９９、２０７、２５５、および、３５４である、方法。
（９）実施態様１から実施態様５の１つに記載の方法において、
前記試料は、穿刺吸引、組織塊標本、および、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションからなる群から選択される方法によって調製される、方法。
（１０）実施態様９に記載の方法において、
前記組織塊標本は、生検または手術検体から取得される、方法。
（１１）実施態様１から実施態様５の１つに記載の方法において、
ｍＲＮＡをコードする少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定するステップであって、前記ｍＲＮＡは、
ａ．配列識別番号１４２、２１９、および、３０９に対応するｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、
ｂ．配列識別番号９、１２、および、１８に対応するｍＲＮＡ、または、
ｃ．表２５に示す配列識別番号１３０、１９０、および、２７６に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、
ｄ．表２５に示す配列識別番号９、１２、および、１８に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡである、ステップ、
をさらに含む、方法。
（１２）実施態様１から実施態様５の１つに記載の方法において、
前記試料中に構成的に発現されている少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定するステップ、
をさらに含む、方法。
（１３）実施態様１から実施態様５の１つに記載の方法において、
前記特異性は、少なくとも４０％である、方法。
（１４）実施態様１から実施態様５の１つに記載の方法において、
前記特異性は、少なくとも５０％である、方法。
（１５）実施態様１から実施態様５の１つに記載の方法において、
前記特異性は、少なくとも６０％である、方法。
（１６）実施態様１から実施態様５の１つに記載の方法において、
前記感度は、少なくとも９０％である、方法。
（１７）実施態様１から実施態様５の１つに記載の方法において、
前記感度は、少なくとも９２％である、方法。
（１８）実施態様１から実施態様５の１つに記載の方法において、
発現パターンの比較が、パターン認識法を用いて行われる、方法。
（１９）実施態様１８に記載の方法において、
前記パターン認識法は、コックスの比例ハザード解析の使用を含む、方法。
（２０）実施態様１から実施態様５の１つに記載の方法において、
前記所定のカットオフレベルは、良性細胞または正常組織と比較して、前記試料中での少なくとも約１．５倍の過剰発現または過少発現（about 1.5-fold over- or under- expression）である、方法。
（２１）実施態様１から実施態様５の１つに記載の方法において、
前記所定のカットオフレベルは、良性細胞または正常組織と比較して、甲状腺癌腫細胞を有する前記試料中での少なくとも統計的に有意なｐ値の過剰発現を有する、方法。
（２２）実施態様２１に記載の方法において、
前記ｐ値は、約０．０５未満である、方法。
（２３）実施態様１から実施態様５の１つに記載の方法において、
遺伝子発現は、マイクロアレイまたは遺伝子チップ上で測定される、方法。
（２４）実施態様２３に記載の方法において、
前記マイクロアレイは、ｃＤＮＡアレイまたはオリゴヌクレオチドアレイである、方法。
（２５）実施態様２４に記載の方法において、
前記マイクロアレイまたは遺伝子チップは、１つまたはそれ以上の内部対照試薬をさらに含む、方法。
（２６）実施態様１から実施態様５の１つに記載の方法において、
遺伝子発現は、前記試料から抽出されるＲＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行われる核酸増幅によって決定される、方法。
（２７）実施態様２６に記載の方法において、
前記ＰＣＲは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）である、方法。
（２８）実施態様２７に記載の方法において、
前記ＲＴ−ＰＣＲは、１つまたはそれ以上の内部対照試薬をさらに含む、方法。
（２９）実施態様２８に記載の方法において、
前記内部対照試薬は、ＰＡＸ８遺伝子発現を検出する方法である、方法。
（３０）実施態様２９に記載の方法において、
前記ＰＡＸ８遺伝子発現は、配列識別番号４０９〜４１１を使用して測定される、方法。
（３１）実施態様１から実施態様５の１つに記載の方法において、
遺伝子発現は、前記遺伝子によってコードされるタンパク質を測定または検出することによって検出される、方法。
（３２）実施態様３１に記載の方法において、
前記タンパク質は、当該タンパク質に特異的な抗体によって検出される、方法。
（３３）実施態様１から実施態様５の１つに記載の方法において、
遺伝子発現は、当該遺伝子の特性を測定することによって検出される、方法。
（３４）実施態様３３に記載の方法において、
測定される前記特性は、ＤＮＡの増幅、メチル化、変異、および、対立遺伝子変異からなる群から選択される、方法。
（３５）甲状腺癌腫患者に対する遺伝子発現プロファイルを相互検証する方法において、
ａ．統計的に有意な数の患者の生体試料から遺伝子発現データを取得するステップと、
ｂ．試料の順番をランダム化するステップと、
ｃ．試料の約１０〜５０％からのデータを除外することを設定するステップと、
ｄ．残試料に対して、全ての変数に関して関心のある要素に対する計算を行い、ｐ値カットオフ（ｐ）に見合う変数を選択するステップと、
ｅ．順方向検索を使用して予測モデルに合致する変数を選択し、所定のエラー率に達するまでトレーニングエラーを評価するステップと、
ｆ．前記除外されていた試料の１０〜５０％に対して前記予測モデルを検定するステップと、
ｇ．ステップｃ．からステップｇ．まで（steps c., -g.）を除外されていた試料の新たなセットを用いて繰り返すステップと、
ｈ．ステップｃ）〜ステップｇ）を、１００％の試料が検定されるまで継続し、分類性能を記録するステップと、
を含む、方法。
（３６）実施態様３５に記載の方法において、
前記ステップｈ．で取得される前記遺伝子発現データは、ｍＲＮＡをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子によって表わされ、前記ｍＲＮＡは、
ａ．配列識別番号１、４、７、８、１０〜１１、１３〜１７、１９〜２４、２６〜２７、２９〜３１、３３〜３５、３７〜３８、４０〜５２、５４〜７２、７５〜８２、８４〜１３５、１３８〜１４１、１４４〜１５１、１５３〜１５９、１６１〜１６２、１６４、１６６〜１７３、１７６〜１９８、２００〜２０１、２０３〜２０６、２０８〜２０９、２１２〜２１３、２１５〜２１８、２２０〜２２１、２２３、２２７〜２３３、２３５〜２４１、２４３〜２４４、２４６〜２４９、２５１、２５３〜２５４、２５６〜２６３、２６５〜２８９、２９１〜２９３、２９５〜３０８、３１０〜３３１、３３３〜３４１、３４３〜３４５、３４７〜３４８、３５０〜３５３、および、３５５〜３６３、に対応するｍＲＮＡ、または、
ｂ．配列識別番号１、４、７、８、１０〜１１、１３〜１７、１９〜２４、２６〜２７、２９〜３１、３３〜３５、３７〜３８、４０〜５２、５４〜７２、７５〜８２、８４〜１３５、１３８〜１４１、１４４〜１５１、１５３〜１５９、１６１〜１６２、１６４、１６６〜１７３、１７６〜１９８、２００〜２０１、２０３〜２０６、２０８〜２０９、２１２〜２１３、２１５〜２１８、２２０〜２２１、２２３、２２７〜２３３、２３５〜２４１、２４３〜２４４、２４６〜２４９、２５１、２５３〜２５４、２５６〜２６３、２６５〜２８９、２９１〜２９３、２９５〜３０８、３１０〜３３１、３３３〜３４１、３４３〜３４５、３４７〜３４８、３５０〜３５３、および、３５５〜３６３、に対応する、表２５中のｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、である、方法。
（３７）甲状腺癌腫患者に対する遺伝子発現プロファイルを個別に検証する方法において、
ａ．統計的に有意な数の患者の生体試料から遺伝子発現データを取得するステップと、
ｂ．前記遺伝子発現データ内の情報源の変動を正規化するステップと、
ｃ．関心のある要素に対して、事前に選択された全ての変数に関する計算を行うステップと、
ｄ．前記試料に対して予測モデルを検定し、分類性能を記録するステップと、
を含む、方法。
（３８）実施態様３７に記載の方法において、
前記ステップｄ．で取得される前記遺伝子発現データは、ｍＲＮＡをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子によって表わされ、前記ｍＲＮＡは、
ａ．配列識別番号１、４、７、８、１０〜１１、１３〜１７、１９〜２４、２６〜２７、２９〜３１、３３〜３５、３７〜３８、４０〜５２、５４〜７２、７５〜８２、８４〜１３５、１３８〜１４１、１４４〜１５１、１５３〜１５９、１６１〜１６２、１６４、１６６〜１７３、１７６〜１９８、２００〜２０１、２０３〜２０６、２０８〜２０９、２１２〜２１３、２１５〜２１８、２２０〜２２１、２２３、２２７〜２３３、２３５〜２４１、２４３〜２４４、２４６〜２４９、２５１、２５３〜２５４、２５６〜２６３、２６５〜２８９、２９１〜２９３、２９５〜３０８、３１０〜３３１、３３３〜３４１、３４３〜３４５、３４７〜３４８、３５０〜３５３、および、３５５〜３６３、に対応するｍＲＮＡ、または、
ｂ．配列識別番号１、４、７、８、１０〜１１、１３〜１７、１９〜２４、２６〜２７、２９〜３１、３３〜３５、３７〜３８、４０〜５２、５４〜７２、７５〜８２、８４〜１３５、１３８〜１４１、１４４〜１５１、１５３〜１５９、１６１〜１６２、１６４、１６６〜１７３、１７６〜１９８、２００〜２０１、２０３〜２０６、２０８〜２０９、２１２〜２１３、２１５〜２１８、２２０〜２２１、２２３、２２７〜２３３、２３５〜２４１、２４３〜２４４、２４６〜２４９、２５１、２５３〜２５４、２５６〜２６３、２６５〜２８９、２９１〜２９３、２９５〜３０８、３１０〜３３１、３３３〜３４１、３４３〜３４５、３４７〜３４８、３５０〜３５３、および、３５５〜３６３、に対応する、表２５中のｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、である、方法。
（３９）遺伝子プロファイルにおいて、
実施態様３７または実施態様３８に記載の方法によって取得される、遺伝子プロファイル。
（４０）甲状腺癌腫患者の診断を可能にする事後確率スコアを生成する方法において、
ａ．統計的に有意な数の患者の生体試料から遺伝子発現データを取得するステップと、
ｂ．選択される遺伝子を取得するために前記データに線形判別分析を適用するステップと、
ｃ．事後確率スコアとして適用されることができる予測モデルを取得するために、判別関数因子を用いて（with discriminate function factor）、前記選択された遺伝子に対して、重み付けされた発現レベルを適用するステップと、
を含む、方法。
（４１）実施態様４０に記載の方法において、
前記線形判別分析は、下記の数式を使用して計算され、
Figure 2008545400
 式中、
Ｉ(psid)＝括弧内のプローブセットの強度の底２の対数
ｄ(CP)＝癌陽性群に対する判別関数
ｄ(CN)＝癌陰性群に対する判別関数
Ｐ(CP)＝癌陽性群に対する事後ｐ値
Ｐ(CN)＝癌陰性群に対する事後ｐ値、である、方法。
（４２）甲状腺癌腫予後診断の患者報告書を作成する方法において、
ａ．前記患者から生体試料を取得するステップと、
ｂ．前記試料の遺伝子発現を測定するステップと、
ｃ．ステップｂ．の結果に再発ハザードスコアを適用するステップと、
ｄ．ステップｃ．で取得された結果を前記報告書を作成するために使用するステップと、
を含む、方法。
（４３）実施態様４２に記載の方法において、
前記報告書は、患者の転帰および／または患者集団と比較した危険性の確率の評価を含む、方法。
（４４）患者報告書において、
実施態様４２に記載の方法によって作成された、患者報告書。
（４５）成分において、
配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２、ならびに／もしくは、配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４、または、配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｐｓｉｄ、ならびに／もしくは、表２５に示す配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４からなる群から選択される、少なくとも１つのプローブのセットを含む、成分。
（４６）生体試料中で甲状腺癌腫の予後診断を決定するための分析を行うためのキットにおいて、
ｍＲＮＡをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組み合わせの、単離された核酸配列、前記配列の相補配列、または、前記配列および前記相補配列の一部を検出するための材料であって、前記ｍＲＮＡは、
ａ．配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、
ｂ．配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｍＲＮＡ、または、
ｃ．表２５に示す配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、
ｄ．表２５に示す配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、である、材料、
を含む、キット。
（４７）実施態様４６に記載のキットにおいて、
前記配列識別番号は、３６、５３、７３、２１１、および、２４２である、キット。
（４８）実施態様４６に記載のキットにおいて、
前記配列識別番号は、１９９、２０７、２５５、および、３５４である、キット。
（４９）実施態様４６に記載のキットにおいて、
前記配列識別番号は、４５、２１５、６５、２９、１９０、１９９、２０７、２５５、および、３５４である、キット。
（５０）実施態様４６に記載のキットにおいて、
マイクロアレイ解析を行うための試薬、
をさらに含む、キット。
（５１）実施態様４６に記載のキットにおいて、
媒体であって、前記核酸配列、前記配列の相補配列、または、前記配列および前記相補配列の一部が、前記媒体を介して分析される、媒体、
をさらに含む、キット。
（５２）甲状腺癌腫の状態を評価するための物品において、
ｍＲＮＡをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組み合わせの、単離された核酸配列、前記配列の相補配列、または、前記配列および前記相補配列の一部を検出するための材料であって、前記ｍＲＮＡは、
ａ．配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、
ｂ．配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｍＲＮＡ、または、
ｃ．表２５に示す配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、
ｄ．表２５に示す配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡである、材料、
を含む、物品。
（５３）実施態様５２に記載の物品において、
前記配列識別番号は、３６、５３、７３、２１１、および、２４２である、物品。
（５４）実施態様５２に記載の物品において、
前記配列識別番号は、１９９、２０７、２５５、および、３５４である、物品。
（５５）実施態様５２に記載の物品において、
前記配列識別番号は、４５、２１５、６５、２９、１９０、１９９、２０７、２５５、および、３５４である、物品。
（５６）実施態様５２に記載の物品において、
マイクロアレイ解析を行うための試薬、
をさらに含む、物品。
（５７）実施態様５２に記載の物品において、
媒体であって、前記核酸配列、前記配列の相補配列、または前記配列および前記相補配列の一部が、前記媒体を介して分析される、媒体、
をさらに含む、物品。
（５８）マイクロアレイまたは遺伝子チップにおいて、
実施態様１から実施態様５の１つに記載の方法を施行するための、マイクロアレイまたは遺伝子チップ。
（５９）実施態様５８に記載のマイクロアレイにおいて、
ｍＲＮＡをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組み合わせの、単離された核酸配列、前記配列の相補配列、または、前記配列および前記相補配列の一部、
を含み、
前記ｍＲＮＡは、
ａ．配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、
ｂ．配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｍＲＮＡ、または、
ｃ．表２５に示す配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、
ｄ．表２５に示す配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡであり、
前記組み合わせは、生体試料中の甲状腺癌腫または再発の危険性を特徴付ける（characterize）のに十分である、マイクロアレイ。
（６０）実施態様５９に記載のマイクロアレイにおいて、
前記測定または特徴付け（characterization）が、少なくとも約１．５倍の過剰発現または過少発現である、マイクロアレイ。
（６１）実施態様５９に記載のマイクロアレイにおいて、
前記測定が、統計的に有意なｐ値の過剰発現または過少発現を提供する、マイクロアレイ。
（６２）実施態様５９に記載のマイクロアレイにおいて、
前記ｐ値は、約０．０５未満である、マイクロアレイ。
（６３）実施態様５９に記載のマイクロアレイにおいて、
ｃＤＮＡアレイ、またはオリゴヌクレオチドアレイ、
を含む、マイクロアレイ。
（６４）実施態様５９に記載のマイクロアレイにおいて、
１つ以上の内部対照試薬、
をさらに含む、マイクロアレイ。
（６５）診断／予後診断ポートフォリオにおいて、
ｍＲＮＡをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組み合わせの、単離された核酸配列、前記配列の相補配列、または、前記配列および前記相補配列の一部、
を含み、
前記ｍＲＮＡは、
ａ．配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、
ｂ．配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｍＲＮＡ、または、
ｃ．表２５に示す配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、
ｄ．表２５に示す配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識される、ｍＲＮＡであり、
前記組み合わせは、生体試料中の甲状腺癌腫の状態または再発の危険性を特徴付けるのに十分である、診断／予後診断ポートフォリオ。
（６６）実施態様６５に記載のポートフォリオにおいて、
前記測定または特徴付けが、少なくとも約１．５倍の過剰発現または過少発現である、ポートフォリオ。
（６７）実施態様６５に記載のポートフォリオにおいて、
前記測定が、統計的に有意なｐ値の過剰発現または過少発現を提供する、ポートフォリオ。
（６８）実施態様６５に記載のポートフォリオにおいて、
前記ｐ値は、約０．０５未満である、ポートフォリオ。
図１は、９８のトレーニング試料中の４−遺伝子特性のＬＯＯＣＶ法のＲＯＣ曲線である。 図２は、９８のトレーニング試料中の５−遺伝子特性のＲＯＣ曲線である。 図３ａは、７４の個別の検証試料中の４−遺伝子特性のＲＯＣ曲線である。 図３ｂは、７４の個別の検証試料中の５−遺伝子特性のＲＯＣ曲線である。 図４ａは、３つの甲状腺対照遺伝子に正規化された４−遺伝子特性のＲＯＣ曲線である。 図４ｂは、３つの甲状腺対照遺伝子に正規化された５−遺伝子特性のＲＯＣ曲線である。 図５ａは、４７の甲状腺試料中の１−ラウンド増幅の４−遺伝子特性のＲＯＣ曲線である。 図５ｂは、４７の甲状腺試料中の２−ラウンド増幅の４−遺伝子特性のＲＯＣ曲線である。 図５ｃは、４７の甲状腺試料中の１−ラウンド増幅の５−遺伝子特性のＲＯＣ曲線である。 図５ｄは、４７の甲状腺試料中の２−ラウンド増幅の５−遺伝子特性のＲＯＣ曲線である。 図６ａは、８３の個別の新鮮凍結甲状腺試料を用いた相互検証に対するＲＯＣ曲線を示す。 図６ｂは、８３の個別の新鮮凍結甲状腺試料を用いた相互検証に対するＲＯＣ曲線を示す。 図７ａは、４７の穿刺吸引（ＦＮＡ）甲状腺試料を用いた特性検証に対するＲＯＣ曲線を示す。 図７ｂは、４７の穿刺吸引（ＦＮＡ）甲状腺試料を用いた特性検証に対するＲＯＣ曲線を示す。 図８ａは、２８組の新鮮凍結試料とＦＮＡ甲状腺試料の対における特性性能に対するＲＯＣ曲線を示す。 図８ｂは、２８組の新鮮凍結試料とＦＮＡ甲状腺試料の対における特性性能に対するＲＯＣ曲線を示す。

Claims (68)

  1. 甲状腺癌を診断する方法において、
    ａ．患者から生体試料を取得するステップと、
    ｂ．ｍＲＮＡをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の、前記試料中の発現レベルを測定するステップであって、前記ｍＲＮＡは、
    ｉ．配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、
    ｉｉ．配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｍＲＮＡ、または、
    ｉｉｉ．表２５に示す配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、
    ｉｖ．表２５に示す配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡである、ステップと、
    を含み、
    所定のカットオフレベルより高いまたは低い前記遺伝子発現レベルは、甲状腺癌を示す、方法。
  2. 甲状腺癌腫と良性甲状腺病変とを識別する方法において、
    ａ．患者から試料を取得するステップと、
    ｂ．ｍＲＮＡをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の、前記試料中の発現レベルを測定するステップであって、前記ｍＲＮＡは、
    ｉ．配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、
    ｉｉ．配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｍＲＮＡ、または、
    ｉｉｉ．表２５に示す配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、
    ｉｖ．表２５に示す配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡである、ステップと、
    を含み、
    所定のカットオフレベルより高いまたは低い前記遺伝子発現レベルは、甲状腺癌腫を示す、方法。
  3. 未確定の甲状腺穿刺吸引（ＦＮＡ）甲状腺結節試料を検査する方法において、
    ａ．患者から生体試料を取得するステップと、
    ｂ．ｍＲＮＡをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の、前記試料中の発現レベルを測定するステップであって、前記ｍＲＮＡは、
    ｉ．配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、
    ｉｉ．配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４、に対応するｍＲＮＡ、または、
    ｉｉｉ．表２５に示す配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、
    ｉｖ．表２５に示す配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡである、ステップと、
    を含み、
    所定のカットオフレベルより高いまたは低い前記遺伝子発現レベルは、甲状腺癌腫を示す、方法。
  4. 甲状腺癌患者の治療プロトコルを決定する方法において、
    ａ．甲状腺癌患者から生体試料を取得するステップと、
    ｂ．ｍＲＮＡをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の、前記試料中の発現レベルを測定するステップであって、前記ｍＲＮＡは、
    ｉ．配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、
    ｉｉ．配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｍＲＮＡ、または、
    ｉｉｉ．表２５に示す配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、
    ｉｖ．表２５に示す配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡである、ステップと、
    を含み、
    所定のカットオフレベルより高いかまたは低い前記遺伝子発現レベルは、病変を治療するために推奨される手術および／または治療のタイプを、医師が決定することを可能にするのに十分に癌を示す、方法。
  5. 甲状腺癌患者を治療する方法において、
    ａ．甲状腺癌患者から生体試料を取得するステップと、
    ｂ．ｍＲＮＡをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の、前記試料中の発現レベルを測定するステップであって、前記ｍＲＮＡは、
    ｉ．配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、
    ｉｉ．配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｍＲＮＡ、または、
    ｉｉｉ．表２５に示す配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、
    ｉｖ．表２５に示す配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、であり、
    所定のカットオフレベルより高いまたは低い前記遺伝子発現レベルは、癌を示す、ステップと、
    ｃ．前記患者が癌陽性の場合には、甲状腺切除術で前記患者を治療するステップと、
    を含む、方法。
  6. 請求項１から請求項５の１つに記載の方法において、
    前記配列識別番号は、３６、５３、７３、２１１、および、２４２である、方法。
  7. 請求項１から請求項５の１つに記載の方法において、
    前記配列識別番号は、１９９、２０７、２５５、および、３５４である、方法。
  8. 請求項１から請求項５の１つに記載の方法において、
    前記配列識別番号は、４５、２１５、６５、２９、１９０、１９９、２０７、２５５、および、３５４である、方法。
  9. 請求項１から請求項５の１つに記載の方法において、
    前記試料は、穿刺吸引、組織塊標本、および、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションからなる群から選択される方法によって調製される、方法。
  10. 請求項９に記載の方法において、
    前記組織塊標本は、生検または手術検体から取得される、方法。
  11. 請求項１から請求項５の１つに記載の方法において、
    ｍＲＮＡをコードする少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定するステップであって、前記ｍＲＮＡは、
    ａ．配列識別番号１４２、２１９、および、３０９に対応するｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、
    ｂ．配列識別番号９、１２、および、１８に対応するｍＲＮＡ、または、
    ｃ．表２５に示す配列識別番号１３０、１９０、および、２７６に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、
    ｄ．表２５に示す配列識別番号９、１２、および、１８に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡである、ステップ、
    をさらに含む、方法。
  12. 請求項１から請求項５の１つに記載の方法において、
    前記試料中に構成的に発現されている少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定するステップ、
    をさらに含む、方法。
  13. 請求項１から請求項５の１つに記載の方法において、
    前記特異性は、少なくとも４０％である、方法。
  14. 請求項１から請求項５の１つに記載の方法において、
    前記特異性は、少なくとも５０％である、方法。
  15. 請求項１から請求項５の１つに記載の方法において、
    前記特異性は、少なくとも６０％である、方法。
  16. 請求項１から請求項５の１つに記載の方法において、
    前記感度は、少なくとも９０％である、方法。
  17. 請求項１から請求項５の１つに記載の方法において、
    前記感度は、少なくとも９２％である、方法。
  18. 請求項１から請求項５の１つに記載の方法において、
    発現パターンの比較が、パターン認識法を用いて行われる、方法。
  19. 請求項１８に記載の方法において、
    前記パターン認識法は、コックスの比例ハザード解析の使用を含む、方法。
  20. 請求項１から請求項５の１つに記載の方法において、
    前記所定のカットオフレベルは、良性細胞または正常組織と比較して、前記試料中での少なくとも約１．５倍の過剰発現または過少発現である、方法。
  21. 請求項１から請求項５の１つに記載の方法において、
    前記所定のカットオフレベルは、良性細胞または正常組織と比較して、甲状腺癌腫細胞を有する前記試料中での少なくとも統計的に有意なｐ値の過剰発現を有する、方法。
  22. 請求項２１に記載の方法において、
    前記ｐ値は、約０．０５未満である、方法。
  23. 請求項１から請求項５の１つに記載の方法において、
    遺伝子発現は、マイクロアレイまたは遺伝子チップ上で測定される、方法。
  24. 請求項２３に記載の方法において、
    前記マイクロアレイは、ｃＤＮＡアレイまたはオリゴヌクレオチドアレイである、方法。
  25. 請求項２４に記載の方法において、
    前記マイクロアレイまたは遺伝子チップは、１つまたはそれ以上の内部対照試薬をさらに含む、方法。
  26. 請求項１から請求項５の１つに記載の方法において、
    遺伝子発現は、前記試料から抽出されるＲＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行われる核酸増幅によって決定される、方法。
  27. 請求項２６に記載の方法において、
    前記ＰＣＲは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）である、方法。
  28. 請求項２７に記載の方法において、
    前記ＲＴ−ＰＣＲは、１つまたはそれ以上の内部対照試薬をさらに含む、方法。
  29. 請求項２８に記載の方法において、
    前記内部対照試薬は、ＰＡＸ８遺伝子発現を検出する方法である、方法。
  30. 請求項２９に記載の方法において、
    前記ＰＡＸ８遺伝子発現は、配列識別番号４０９〜４１１を使用して測定される、方法。
  31. 請求項１から請求項５の１つに記載の方法において、
    遺伝子発現は、前記遺伝子によってコードされるタンパク質を測定または検出することによって検出される、方法。
  32. 請求項３１に記載の方法において、
    前記タンパク質は、当該タンパク質に特異的な抗体によって検出される、方法。
  33. 請求項１から請求項５の１つに記載の方法において、
    遺伝子発現は、当該遺伝子の特性を測定することによって検出される、方法。
  34. 請求項３３に記載の方法において、
    測定される前記特性は、ＤＮＡの増幅、メチル化、変異、および、対立遺伝子変異からなる群から選択される、方法。
  35. 甲状腺癌腫患者に対する遺伝子発現プロファイルを相互検証する方法において、
    ａ．統計的に有意な数の患者の生体試料から遺伝子発現データを取得するステップと、
    ｂ．試料の順番をランダム化するステップと、
    ｃ．試料の約１０〜５０％からのデータを除外することを設定するステップと、
    ｄ．残試料に対して、全ての変数に関して関心のある要素に対する計算を行い、ｐ値カットオフ（ｐ）に見合う変数を選択するステップと、
    ｅ．順方向検索を使用して予測モデルに合致する変数を選択し、所定のエラー率に達するまでトレーニングエラーを評価するステップと、
    ｆ．前記除外されていた試料の１０〜５０％に対して前記予測モデルを検定するステップと、
    ｇ．ステップｃ．からステップｇ．までを除外されていた試料の新たなセットを用いて繰り返すステップと、
    ｈ．ステップｃ）〜ステップｇ）を、１００％の試料が検定されるまで継続し、分類性能を記録するステップと、
    を含む、方法。
  36. 請求項３５に記載の方法において、
    前記ステップｈ．で取得される前記遺伝子発現データは、ｍＲＮＡをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子によって表わされ、前記ｍＲＮＡは、
    ａ．配列識別番号１、４、７、８、１０〜１１、１３〜１７、１９〜２４、２６〜２７、２９〜３１、３３〜３５、３７〜３８、４０〜５２、５４〜７２、７５〜８２、８４〜１３５、１３８〜１４１、１４４〜１５１、１５３〜１５９、１６１〜１６２、１６４、１６６〜１７３、１７６〜１９８、２００〜２０１、２０３〜２０６、２０８〜２０９、２１２〜２１３、２１５〜２１８、２２０〜２２１、２２３、２２７〜２３３、２３５〜２４１、２４３〜２４４、２４６〜２４９、２５１、２５３〜２５４、２５６〜２６３、２６５〜２８９、２９１〜２９３、２９５〜３０８、３１０〜３３１、３３３〜３４１、３４３〜３４５、３４７〜３４８、３５０〜３５３、および、３５５〜３６３、に対応するｍＲＮＡ、または、
    ｂ．配列識別番号１、４、７、８、１０〜１１、１３〜１７、１９〜２４、２６〜２７、２９〜３１、３３〜３５、３７〜３８、４０〜５２、５４〜７２、７５〜８２、８４〜１３５、１３８〜１４１、１４４〜１５１、１５３〜１５９、１６１〜１６２、１６４、１６６〜１７３、１７６〜１９８、２００〜２０１、２０３〜２０６、２０８〜２０９、２１２〜２１３、２１５〜２１８、２２０〜２２１、２２３、２２７〜２３３、２３５〜２４１、２４３〜２４４、２４６〜２４９、２５１、２５３〜２５４、２５６〜２６３、２６５〜２８９、２９１〜２９３、２９５〜３０８、３１０〜３３１、３３３〜３４１、３４３〜３４５、３４７〜３４８、３５０〜３５３、および、３５５〜３６３、に対応する、表２５中のｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、である、方法。
  37. 甲状腺癌腫患者に対する遺伝子発現プロファイルを個別に検証する方法において、
    ａ．統計的に有意な数の患者の生体試料から遺伝子発現データを取得するステップと、
    ｂ．前記遺伝子発現データ内の情報源の変動を正規化するステップと、
    ｃ．関心のある要素に対して、事前に選択された全ての変数に関する計算を行うステップと、
    ｄ．前記試料に対して予測モデルを検定し、分類性能を記録するステップと、
    を含む、方法。
  38. 請求項３７に記載の方法において、
    前記ステップｄ．で取得される前記遺伝子発現データは、ｍＲＮＡをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子によって表わされ、前記ｍＲＮＡは、
    ａ．配列識別番号１、４、７、８、１０〜１１、１３〜１７、１９〜２４、２６〜２７、２９〜３１、３３〜３５、３７〜３８、４０〜５２、５４〜７２、７５〜８２、８４〜１３５、１３８〜１４１、１４４〜１５１、１５３〜１５９、１６１〜１６２、１６４、１６６〜１７３、１７６〜１９８、２００〜２０１、２０３〜２０６、２０８〜２０９、２１２〜２１３、２１５〜２１８、２２０〜２２１、２２３、２２７〜２３３、２３５〜２４１、２４３〜２４４、２４６〜２４９、２５１、２５３〜２５４、２５６〜２６３、２６５〜２８９、２９１〜２９３、２９５〜３０８、３１０〜３３１、３３３〜３４１、３４３〜３４５、３４７〜３４８、３５０〜３５３、および、３５５〜３６３、に対応するｍＲＮＡ、または、
    ｂ．配列識別番号１、４、７、８、１０〜１１、１３〜１７、１９〜２４、２６〜２７、２９〜３１、３３〜３５、３７〜３８、４０〜５２、５４〜７２、７５〜８２、８４〜１３５、１３８〜１４１、１４４〜１５１、１５３〜１５９、１６１〜１６２、１６４、１６６〜１７３、１７６〜１９８、２００〜２０１、２０３〜２０６、２０８〜２０９、２１２〜２１３、２１５〜２１８、２２０〜２２１、２２３、２２７〜２３３、２３５〜２４１、２４３〜２４４、２４６〜２４９、２５１、２５３〜２５４、２５６〜２６３、２６５〜２８９、２９１〜２９３、２９５〜３０８、３１０〜３３１、３３３〜３４１、３４３〜３４５、３４７〜３４８、３５０〜３５３、および、３５５〜３６３、に対応する、表２５中のｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、である、方法。
  39. 遺伝子プロファイルにおいて、
    請求項３７または請求項３８に記載の方法によって取得される、遺伝子プロファイル。
  40. 甲状腺癌腫患者の診断を可能にする事後確率スコアを生成する方法において、
    ａ．統計的に有意な数の患者の生体試料から遺伝子発現データを取得するステップと、
    ｂ．選択される遺伝子を取得するために前記データに線形判別分析を適用するステップと、
    ｃ．事後確率スコアとして適用されることができる予測モデルを取得するために、判別関数因子を用いて、前記選択された遺伝子に対して、重み付けされた発現レベルを適用するステップと、
    を含む、方法。
  41. 請求項４０に記載の方法において、
    前記線形判別分析は、下記の数式を使用して計算され、
    Figure 2008545400
     式中、
    Ｉ(psid)＝括弧内のプローブセットの強度の底２の対数
    ｄ(CP)＝癌陽性群に対する判別関数
    ｄ(CN)＝癌陰性群に対する判別関数
    Ｐ(CP)＝癌陽性群に対する事後ｐ値
    Ｐ(CN)＝癌陰性群に対する事後ｐ値、である、方法。
  42. 甲状腺癌腫予後診断の患者報告書を作成する方法において、
    ａ．前記患者から生体試料を取得するステップと、
    ｂ．前記試料の遺伝子発現を測定するステップと、
    ｃ．ステップｂ．の結果に再発ハザードスコアを適用するステップと、
    ｄ．ステップｃ．で取得された結果を前記報告書を作成するために使用するステップと、
    を含む、方法。
  43. 請求項４２に記載の方法において、
    前記報告書は、患者の転帰および／または患者集団と比較した危険性の確率の評価を含む、方法。
  44. 患者報告書において、
    請求項４２に記載の方法によって作成された、患者報告書。
  45. 成分において、
    配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２、ならびに／もしくは、配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４、または、配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｐｓｉｄ、ならびに／もしくは、表２５に示す配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４からなる群から選択される、少なくとも１つのプローブのセットを含む、成分。
  46. 生体試料中で甲状腺癌腫の予後診断を決定するための分析を行うためのキットにおいて、
    ｍＲＮＡをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組み合わせの、単離された核酸配列、前記配列の相補配列、または、前記配列および前記相補配列の一部を検出するための材料であって、前記ｍＲＮＡは、
    ａ．配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、
    ｂ．配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｍＲＮＡ、または、
    ｃ．表２５に示す配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、
    ｄ．表２５に示す配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、である、材料、
    を含む、キット。
  47. 請求項４６に記載のキットにおいて、
    前記配列識別番号は、３６、５３、７３、２１１、および、２４２である、キット。
  48. 請求項４６に記載のキットにおいて、
    前記配列識別番号は、１９９、２０７、２５５、および、３５４である、キット。
  49. 請求項４６に記載のキットにおいて、
    前記配列識別番号は、４５、２１５、６５、２９、１９０、１９９、２０７、２５５、および、３５４である、キット。
  50. 請求項４６に記載のキットにおいて、
    マイクロアレイ解析を行うための試薬、
    をさらに含む、キット。
  51. 請求項４６に記載のキットにおいて、
    媒体であって、前記核酸配列、前記配列の相補配列、または、前記配列および前記相補配列の一部が、前記媒体を介して分析される、媒体、
    をさらに含む、キット。
  52. 甲状腺癌腫の状態を評価するための物品において、
    ｍＲＮＡをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組み合わせの、単離された核酸配列、前記配列の相補配列、または、前記配列および前記相補配列の一部を検出するための材料であって、前記ｍＲＮＡは、
    ａ．配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、
    ｂ．配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｍＲＮＡ、または、
    ｃ．表２５に示す配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、
    ｄ．表２５に示す配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡである、材料、
    を含む、物品。
  53. 請求項５２に記載の物品において、
    前記配列識別番号は、３６、５３、７３、２１１、および、２４２である、物品。
  54. 請求項５２に記載の物品において、
    前記配列識別番号は、１９９、２０７、２５５、および、３５４である、物品。
  55. 請求項５２に記載の物品において、
    前記配列識別番号は、４５、２１５、６５、２９、１９０、１９９、２０７、２５５、および、３５４である、物品。
  56. 請求項５２に記載の物品において、
    マイクロアレイ解析を行うための試薬、
    をさらに含む、物品。
  57. 請求項５２に記載の物品において、
    媒体であって、前記核酸配列、前記配列の相補配列、または前記配列および前記相補配列の一部が、前記媒体を介して分析される、媒体、
    をさらに含む、物品。
  58. マイクロアレイまたは遺伝子チップにおいて、
    請求項１から請求項５の１つに記載の方法を施行するための、マイクロアレイまたは遺伝子チップ。
  59. 請求項５８に記載のマイクロアレイにおいて、
    ｍＲＮＡをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組み合わせの、単離された核酸配列、前記配列の相補配列、または、前記配列および前記相補配列の一部、
    を含み、
    前記ｍＲＮＡは、
    ａ．配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、
    ｂ．配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｍＲＮＡ、または、
    ｃ．表２５に示す配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、
    ｄ．表２５に示す配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡであり、
    前記組み合わせは、生体試料中の甲状腺癌腫または再発の危険性を特徴付けるのに十分である、マイクロアレイ。
  60. 請求項５９に記載のマイクロアレイにおいて、
    前記測定または特徴付けが、少なくとも約１．５倍の過剰発現または過少発現である、マイクロアレイ。
  61. 請求項５９に記載のマイクロアレイにおいて、
    前記測定が、統計的に有意なｐ値の過剰発現または過少発現を提供する、マイクロアレイ。
  62. 請求項５９に記載のマイクロアレイにおいて、
    前記ｐ値は、約０．０５未満である、マイクロアレイ。
  63. 請求項５９に記載のマイクロアレイにおいて、
    ｃＤＮＡアレイ、またはオリゴヌクレオチドアレイ、
    を含む、マイクロアレイ。
  64. 請求項５９に記載のマイクロアレイにおいて、
    １つ以上の内部対照試薬、
    をさらに含む、マイクロアレイ。
  65. 診断／予後診断ポートフォリオにおいて、
    ｍＲＮＡをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組み合わせの、単離された核酸配列、前記配列の相補配列、または、前記配列および前記相補配列の一部、
    を含み、
    前記ｍＲＮＡは、
    ａ．配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、
    ｂ．配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｍＲＮＡ、または、
    ｃ．表２５に示す配列識別番号３６、５３、７３、２１１、および、２４２に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識されるｍＲＮＡ、ならびに／もしくは、
    ｄ．表２５に示す配列識別番号１９９、２０７、２５５、および、３５４に対応するｐｓｉｄからなる群から選択されるプローブのセットによって特異的に認識される、ｍＲＮＡであり、
    前記組み合わせは、生体試料中の甲状腺癌腫の状態または再発の危険性を特徴付けるのに十分である、診断／予後診断ポートフォリオ。
  66. 請求項６５に記載のポートフォリオにおいて、
    前記測定または特徴付けが、少なくとも約１．５倍の過剰発現または過少発現である、ポートフォリオ。
  67. 請求項６５に記載のポートフォリオにおいて、
    前記測定が、統計的に有意なｐ値の過剰発現または過少発現を提供する、ポートフォリオ。
  68. 請求項６５に記載のポートフォリオにおいて、
    前記ｐ値は、約０．０５未満である、ポートフォリオ。
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