CN104593255B - 一种即时检测egfr突变的微流控芯片 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种即时检测EGFR突变的微流控芯片。该微流控芯片集核酸提取、LAMP扩增、即时检测为一体。本发明解决了恒温扩增DNA步骤之前DNA提取所需要的离心步骤和扩增DNA所需要的热循环仪器，同时也符合WHO提出的适用于欠发达地区诊断检测的一般要求。

Description

一种即时检测EGFR突变的微流控芯片

技术领域

本发明属于临床医学应用领域，涉及一种即时检测EGFR突变的微流控芯片。本发明的微流控芯片集核酸提取、LAMP扩增、即时检测为一体。

背景技术

肺癌已成为当前国内外公认的发病率第一、死亡率第一的恶性肿瘤。大量研究显示表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)作为受体酪氨酸超家族成员在多种恶性肿瘤中表达。配体与EGFR结合诱导形成二聚体，使构象发生变化活化酪氨酸激酶及信号转导途径，产生细胞增殖、侵润、转移及抗凋亡等效应。临床研究显示，EGFR激酶结构域的活化突变与药物敏感性相关，使得仅10％～30％患者对EGFR酪氨酸激酶抑制剂敏感，所以，检测EGFR基因突变有助于预测患者对药物的敏感性，筛查对靶向药敏感的人群，从而提高疗效，实现对患者的靶向个体化治疗。

肺癌的个体化治疗模式迫切需要一种能在患者旁边实现快速临床检测——即时检验(POCT)的装置。研究发现，EGFR酪氨酸激酶的突变主要发生在18-21外显子，其中19和21号外显子突变覆盖突变的90％。目前对EGFR突变的检测步骤包括标本获得、DNA抽提、EGFR突变检测和结果分析。检测的方法包括：DNA测序、ARMS及其它如DHPLC等。

随着等温扩增核酸技术(环介导等温扩增、解旋酶依赖的扩增、滚环扩增等)的兴起，为EGFR突变的POCT检测带来了新的契机。环介导等温扩增(LAMP)技术是2000年开始兴起的一个相对新的恒温基因扩增技术，它最突出的特点是高特异性、高敏感性、快速和高产出率。LAMP是在60-65℃执行的扩增技术，主要反应物是具有链置换活性的Bst DNA聚合酶和四条引物。一般在LAMP管中LAMP的阳性结果可通过浊度增加、发绿色荧光或者通过实时定量PCR仪检测。因此LAMP技术用于实时检测(POCT)方面的突出优势是不需要热循环仪器和结果的肉眼可视化。

世界卫生组织(WHO)做出了一系列适用于经济欠发达地区的一般诊断检测方法的方针，简称ASSURED：负担得起(affordable)、灵敏(sensitive)、特异(specific)、容易使用(user-friendly)、快速稳定(rapid and robust)、无需设备(equipment free)和可传送给终端使用者(deliverable to end users)。但是，聚合酶链反应(PCR)依赖精确的温度循环装置，此缺点导致PCR不便于成为POCT检测方法。后来，以恒温扩增核酸为基础的方法被证实有卓越的灵敏性和特异性但不算是负担得起、扩增速度较慢和需要较大的能量供应。在资源缺乏地区，微小化、无需大型仪器的LAMP系统在廉价实时检测(POCT)方面显示出了巨大的潜力。目前，微型LAMP系统在无需大型仪器(无需电泳仪等大型仪器)和操作方面还没有完全符合WHO所提出的标准。因此，目前在临床检测基因突变POCT化方面有强烈的需求。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种能够即时检测EGFR突变的微流控芯片。本发明的微流控芯片使得细胞或组织DNA的提取、扩增、目的序列基因突变的检测在一个微流控芯片中得以简便、快速、高效、无污染地实现。

本发明采用了如下技术方案：

一种即时检测EGFR突变的微流控芯片，所述微流控芯片是由上层基片1和下层基片2键合而成的一个密闭整体；所述微流控芯片上设有三个相同且彼此独立的LAMP系统；每一个所述LAMP系统包括一个气囊小室11、一个装有恒温扩增缓冲液的小室21、一个装有引物的小室22、一个装有Bst DNA聚合酶的小室23、一个LAMP反应室15、一条气体通道16、一条气体通道17、一条气体通道18；所述气囊小室11的上半部分，所述装有恒温扩增缓冲液的小室21的上半部分、所述装有引物的小室22的上半部分、所述装有Bst DNA聚合酶的小室23的上半部分、所述LAMP反应室15的上半部分、所述气体通道16、所述气体通道17、所述气体通道18位于所述上层基片1上，且所述气体通道16的一端与所述气囊小室11的上半部分连通，所述装有恒温扩增缓冲液的小室21的上半部分、所述装有引物的小室22的上半部分、所述装有Bst DNA聚合酶的小室23的上半部分依次排列于所述气体通道16上且与所述气体通道16连通；所述气体通道16的另一端与所述气体通道17的一端连通，所述气体通道17的另一端与所述LAMP反应室15的上半部分连通，所述气体通道18穿过所述LAMP反应室15的上半部分并与之连通；所述气体通道18的一端设有样本入口181，另一端设有废液出口182，所述气体通道17、所述气体通道18与所述LAMP反应室15的连接处设有微缝19；所述气囊小室11的下半部分、所述装有恒温扩增缓冲液的小室21的下半部分、所述装有引物的小室22的下半部分、所述装有Bst DNA聚合酶的小室23的下半部分、所述LAMP反应室15的下半部分位于所述下层基片2上，所述气囊小室11、所述装有恒温扩增缓冲液的小室21、所述装有引物小室22、所述装有Bst DNA聚合酶的小室23、所述LAMP反应室15中设有微柱111，多个所述微柱111均匀分布，所述微柱111的高度小于所述气囊小室11的高度、小于所述装有恒温扩增缓冲液的小室21的高度、小于所述装有引物小室22的高度、小于所述装有Bst DNA聚合酶的小室23的高度、小于所述LAMP反应室15的高度；所述装有恒温扩增缓冲液的小室21的上半部分直径比下半部分多1mm、所述装有引物的小室22的上半部分直径比下半部分多1mm、所述装有Bst DNA聚合酶的小室23的上半部分直径比下半部分多1mm、所述LAMP反应室15的下半部分与所述LAMP反应室15的上半部分相对应；所述气囊小室11的下半部分与所述气囊小室11的上半部分相对应。

本发明的LAMP反应室15的上半部分是设置在上层基片1上的凹槽结构，LAMP反应室15的下半部分是设置在下层基片2上的凹槽结构，上下凹槽结构契合形成一个可以进行LAMP反应的空间。所述凹槽结构可以是任何形状。在本发明的具体实施方案中，所述凹槽结构的横截面是圆形。

本发明的气体通道16、17、18是设置在上层基片1上的沟槽，所述沟槽的横截面可以是任何形状。在本发明的具体实施方案中，所述沟槽结构的横截面是半圆形。

本发明的气囊小室11的上半部分是设置在上层基片1上的凹槽结构，气囊小室11的下半部分是设置在下层基片2上的凹槽结构，上下凹槽结构契合形成一个完整的气囊小室11。所述凹槽结构可以是任何形状。在本发明的具体实施方案中，所述凹槽结构的横截面是圆形。为了使25μL反应体系顺利进入反应室，需要使气囊小室储存气体体积大于25μL，根据相同高度及底面积的条件下，圆柱形体积最大的原理，发明人设计了此气囊室，根据计算，气囊室体积为40.192μL，满足条件。

本发明的装有恒温扩增缓冲液的小室21、装有引物的小室22、装有Bst DNA聚合酶的小室23的上半部分是设置在上层基片1上的凹槽结构，装有恒温扩增缓冲液的小室21、装有引物的小室22、装有Bst DNA聚合酶的小室23的下半部分是设置在下层基片2上的凹槽结构，上下凹槽结构契合形成一个可以进行LAMP反应的空间。所述凹槽结构可以是任何形状。在本发明的具体实施方案中，所述凹槽结构的横截面是圆形。

构成微流控芯片上下两层基片的材料可以是PDMS(聚二甲基硅氧烷)、PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)、PC(聚碳酸酯)、COC树脂、ABS(丙烯腈-苯乙烯-丁二烯共聚物)、玻璃、石英或铜。在本发明的具体实施方案中，所述上层基片1和下层基片2的制备材料选用PDMS。

本发明的气囊小室11、装有恒温扩增缓冲液的小室21、装有引物的小室22、装有Bst DNA聚合酶的小室23、LAMP反应室15的内部设置的微柱111目的是用于防止气囊塌陷，多个所述微柱111均匀分布。所述微柱111可以是任何形状。在本发明的具体实施方案中，所述微柱111的形状是正立方体。优选地，所述气囊小室11中设有9个微柱，装有恒温扩增缓冲液的小室21中设有5个微柱，装有引物的小室22中设有3个微柱；装有Bst DNA聚合酶的小室23中设有1个微柱，LAMP反应室15中设有9个微柱。

优选地，所述微柱的高度为80μm。

本发明使用的玻璃粉(直径为63-93μm)为EDC/NHS修饰的带有羧基的玻璃粉(购自绵阳光耀新材料有限责任公司)，利于吸附细胞裂解后释放的DNA。

玻璃粉的修饰方法：取适量SiO₂微球，放置1.5ml离心管中，用95％乙醇洗涤2次，重悬于100μL 95％乙醇中。加入2.5％氨基硅烷400μL，振荡充分，超声片刻，振摇30min(Invitrogen hulamixer 80rpm)。用无水乙醇洗涤3次，重悬于100μL无水乙醇中。用N.N-二甲基甲酰胺洗涤1次，重悬于100μL N.N-二甲基甲酰胺中。加入10％丁二酸酐(溶剂：N.N-二甲基甲酰胺)，在N₂中室温反应6h。用双蒸水洗涤3次，重悬于100μL双蒸水中。

为了防止吸附DNA的玻璃粉溢出LAMP反应室15，气体通道17、18和LAMP反应室15连通处设计微缝19。所述微缝19的微缝间隙为50μm。

进一步，所述气囊小室11的直径为8mm、高度为0.2mm；所述气体通道16的尺寸为45mm×3mm；所述气体通道18的尺寸为25mm×3mm；所述气体通道17的尺寸为3mm×4mm；所述LAMP反应室15的直径为7.5mm、高度为0.2mm；所述装有恒温扩增缓冲液的小室21的下半部分的直径为6mm、高度为0.2mm；所述装有引物的小室22的下半部分的直径为3mm、高度为0.2mm；所述装有Bst DNA聚合酶的小室23的下半部分的直径为2mm、高度为0.2mm。

优选地，每一个LAMP系统中：所述气体通道16和所述气体通道18彼此平行。

优选地，每一个LAMP系统中：所述气体通道16和所述气体通道17相互垂直；所述气体通道17和所述气体通道18相互垂直。

每一个LAMP系统中：所述装有恒温扩增缓冲液的小室21中含有下列混合液19μL(所示浓度均为终浓度)：Tris-HCL 20mM、KCL 10mM、MgSO₄8mM、(NH4)₂SO₄10mM、TritonX-1000.1％、甜菜碱0.8M、dNTPs每种1.4mM、MnCL₂0.5mM、钙黄绿素25μM。

三个所述LAMP系统中：两个所述装有引物的小室22中各含有引物4μL，所述引物序列如下所示：

SEQ ID NO.1：5’-GCAGGGTCTTCTCTGTTTCA-3’(终浓度0.4μM)；

SEQ ID NO.2：5’-TCAGGAAAATGCTGGCTGAC-3’(终浓度0.4μM)；

SEQ ID NO.3：5’-TTCACCAGTACGTTCCTGGCTG-AACTACTTGGAGGACCGTCG-3’(终浓度1.6μM)；

SEQ ID NO.4：5’-GTGCCAAACTGCTGGGTGCGGA-CCACCTCCTTACTTTGCCTC-3’(终浓度1.6μM)；含有上述引物序列的小室22的LAMP系统一个作为样本LAMP系统，一个作为阴性对照LAMP系统。

另外一个LAMP系统中：所述装有引物的小室22中含有阳性对照DNA的扩增引物4μL(购自荣研生物科技有限公司，货号为slp204)，上述LAMP系统作为阳性对照LAMP系统。

每一个LAMP系统中：装有Bst DNA聚合酶的小室23中含有1μL Bst DNA聚合酶(8U)。

所述样本入口181和废液出口182可以是任何形状。在本发明的具体实施方案中，样本入口181和废液出口182横截面是圆形，直径是0.75mm。

本发明使用氯化锰和钙黄绿素作为显色剂，显色原理在于：首先，钙黄绿素的荧光被体系中的锰离子淬灭，基因扩增过程中产生的副产物焦磷酸镁置换出钙黄绿素结合的锰离子，产生钙黄绿素镁，发出肉眼可见的绿色荧光。

本发明还提供了上述微流控芯片的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

(1)制备具有上述微流控芯片上的微通道和微结构的SU-8阳模；

(2)以步骤(1)制备的SU-8阳模为模板，以PDMS为原料复制，然后将上下层PDMS封接。

步骤(1)的具体操作方法如下：首先，用计算机辅助设计软件Freehand设计微流控芯片的微通道与微结构；其次，将Freehand绘制的芯片构道图打印在SU-8胶(Microchem，型号为2075)作为掩模，采用标准光刻工艺制作模具，获得SU-8阳模。

Su-8光刻技术：新型的化学增幅型负像SU-8光刻胶克服了普通光刻胶采用UV光刻深宽比不足的问题，十分适合于制备高深宽比微结构，因此SU-8胶是一种负性、环氧树脂型、近紫外线光刻胶。它在近紫外光(365nm-400nm)范围内光吸收度很低，且整个光刻胶层所获得的曝光量均匀一致，可得到具有垂直侧壁和高深宽比的厚膜图形；它还具有良好的力学性能、抗化学腐蚀性和热稳定性；SU-8在受到紫外辐射后发生交联，是一种化学扩大负性胶，可以形成台阶等结构复杂的图形；且SU-8胶不导电，在电镀时可以直接作为绝缘体使用。由于它具有较多优点，SU-8胶正被逐渐应用于MFMS、芯片封装和微加工等领域。直接采用SU-8光刻胶来制备深宽比高的微结构与微零件是微加工领域的一项新技术。

步骤(2)的具体操作方法如下：

a、将PDMS(Dow Corning，货号为0007883528)和固化剂按质量比10：1混匀，在真空干燥箱中抽气，倾倒在模具表面，80℃烘烤1h后取出；

b、冷却后缓慢将PDMS在模板上撕下，在PDMS基片相应位置钻出进样孔、废液孔，然后切割成合适的大小；

c、将上下两层PDMS基片放入等离子清洗机真空轰击1min，然后迅速在下层PDMS基片装载各个反应试剂和玻璃粉，然后迅速将两层PDMS对齐，进行不可逆的结合；

d、用夹子夹住反应试剂储存小室周边通道，避免样品的混合。

在本发明的具体实施方案中，验证制备的微流控芯片的效果采用如下方法：

(1)细胞收集与裂解

取汇合度为80％-90％的H1975(该细胞基因组上EGFP基因21号外显子存在T>C的点突变)和阴性对照人类肺腺癌细胞系A549各一瓶，用PBS冲洗后，分别加入1.5mL的DNAiso试剂(Takara)，轻轻摇晃细胞培养瓶。

(2)样本DNA上EGFP基因21号外显子点突变T>C的检测

a、用注射器将含有细胞碎片的裂解液吸出，注入制备的微流控芯片中，静置数分钟，使细胞裂解释放的核酸吸附到玻璃粉表面，然后用注射器在样本入口处注入空气，使混合液通过废液出口排除；

b、打开储存LAMP反应试剂小室两边的夹子，挤压气囊，使所有LAMP反应试剂进入LAMP反应室；用夹子夹住反应室周边的通道，使反应与外界空气隔离，防止空气污染；

c、将微流控芯片放入65℃恒温装置中，进行扩增反应；

d、25-30min后，观察扩增后反应液的颜色。突变的细胞系H1975裂解扩增反应后为绿色，未突变的细胞系A549细胞裂解扩增反应后依然为黄色。

本发明还提供了即时检测EGFR突变的方法，所述方法如下所示：

(1)制备含有DNA的裂解液；

(2)将步骤(1)制备的裂解液注入微流控芯片的LAMP反应室15中，提取DNA；

(3)去除储存反应试剂的小室周围的夹子，将所述反应试剂分别送入微流控芯片的LAMP反应室中；

(4)将经过步骤(3)处理的微流控芯片放入65℃恒温装置中，进行扩增反应；

(5)判断扩增后反应液的颜色，如果反应液呈绿色，则检测样本DNA上EGFR基因21号外显子存在T>C的突变；如果反应液呈黄色，则检测样本DNA上EGFR基因21号外显子不存在T>C的突变。

本发明还提供了上述微流控芯片在检测未知样本EGFR基因21号外显子上T>C点突变中的应用。

本发明的优点和有益效果：

(1)本发明的微流控芯片使用玻璃粉一步法提取纯化样本DNA，避免了使用离心机经过多步洗脱的复杂程序；本发明的微流控芯片采用即时检测的反应系统，避免了使用PCR仪经过不同温度反应的循环过程；本发明的微流控芯片操作方便、简单、快速。

(2)本发明的微流控芯片集核酸提取、LAMP扩增、即时检测为一体，方便了实验操作，缩短了实验时间。

(3)本发明的微流控芯片将LAMP反应试剂分类放置于不同的储存小室中，避免了试剂之间的污染。

(4)本发明的微流控芯片设置了三个平行系统，可以同时进行实验组、阴性对照组、阳性对照组的检测。

附图说明

图1显示本发明的微流控芯片整体结构的侧视图；

图2显示本发明的微流控芯片整体结构的俯视图；

图3显示本发明的微流控芯片的上层结构；

图4显示本发明的微流控芯片的下层结构；

图5显示本发明的微流控芯片中微柱的结构；

图6显示本发明的微流控芯片中微缝的结构；

其中，1：上层基片；11：气囊小室；111：微柱；16、17、18：气体通道；19：微缝；181：样本入口；182：废液出口；2：下层基片；21：装有恒温扩增缓冲液的小室；22：装有引物的小室；23：装有Bst DNA聚合酶的小室。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照制造厂商所建议的条件。

下列实施例中未注明来源的实验试剂，均可从商业途径获得。

实施例1 一种微流控芯片

微流控芯片是由上层基片1和下层基片2键合而成的一个密闭整体；微流控芯片上设有三个相同且彼此独立的LAMP系统；每一个LAMP系统包括一个气囊小室11、一个装有恒温扩增缓冲液的小室21、一个装有引物的小室22、一个装有Bst DNA聚合酶的小室23、一个LAMP反应室15、一条气体通道16、一条气体通道17、一条气体通道18；气囊小室11的上半部分，装有恒温扩增缓冲液的小室21的上半部分、装有引物的小室22的上半部分、装有BstDNA聚合酶的小室23的上半部分、LAMP反应室15的上半部分、气体通道16、气体通道17、气体通道18位于上层基片1上，且气体通道16的一端与气囊小室11的上半部分连通，装有恒温扩增缓冲液的小室21的上半部分、装有引物的小室22的上半部分、装有Bst DNA聚合酶的小室23的上半部分依次排列于气体通道16上且与气体通道16连通；气体通道16的另一端与气体通道17的一端连通，气体通道17的另一端与LAMP反应室15的上半部分连通，气体通道18穿过LAMP反应室15的上半部分并与之连通；气体通道18的一端设有样本入口181，另一端设有废液出口182，气体通道17、气体通道18与LAMP反应室15的连接处设有微缝19；气囊小室11的下半部分、装有恒温扩增缓冲液的小室21的下半部分、装有引物的小室22的下半部分、装有Bst DNA聚合酶的小室23的下半部分、LAMP反应室15的下半部分位于下层基片2上，气囊小室11、装有恒温扩增缓冲液的小室21、装有引物小室22、装有Bst DNA聚合酶的小室23、LAMP反应室15中设有微柱111，多个微柱111均匀分布，微柱111的高度小于气囊小室11的高度、小于装有恒温扩增缓冲液的小室21的高度、小于装有引物小室22的高度、小于装有BstDNA聚合酶的小室23的高度、小于LAMP反应室15的高度；装有恒温扩增缓冲液的小室21的上半部分直径比下半部分多1mm、装有引物的小室22的上半部分直径比下半部分多1mm、装有Bst DNA聚合酶的小室23的上半部分直径比下半部分多1mm、LAMP反应室15的下半部分与LAMP反应室15的上半部分相对应；气囊小室11的下半部分与所述气囊小室11的上半部分相对应。

LAMP反应室15的上半部分是设置在上层基片1上的凹槽结构，LAMP反应室15的下半部分是设置在下层基片2上的凹槽结构，上下凹槽结构契合形成一个可以进行LAMP反应的空间。凹槽结构的横截面是圆形。

气体通道16、气体通道17、气体通道18是设置在上层基片1上的沟槽，沟槽的横截面是半圆形。

气囊小室11的上半部分是设置在上层基片1上的凹槽结构，气囊小室11的下半部分是设置在下层基片2上的凹槽结构，上下凹槽结构契合形成一个完整的气囊小室。凹槽结构的横截面是圆形。

装有恒温扩增缓冲液的小室21、装有引物的小室22、装有Bst DNA聚合酶的小室23的上半部分是设置在上层基片1上的凹槽结构，装有恒温扩增缓冲液的小室21、装有引物的小室22、装有Bst DNA聚合酶的小室23的下半部分是设置在下层基片2上的凹槽结构，上下凹槽结构契合形成一个可以进行LAMP反应的空间。凹槽结构的横截面是圆形。

构成微流控芯片上下两层基片的材料是PDMS(聚二甲基硅氧烷)。

微柱111目的是用于防止气囊塌陷，多个微柱111均匀分布。微柱111的形状是正立方体。气囊小室11中设有9个微柱，装有恒温扩增缓冲液的小室21中设有5个微柱，装有引物的小室22中设有3个微柱；装有Bst DNA聚合酶的小室23中设有1个微柱、LAMP反应室15中设有9个微柱。

微柱的高度为80μm。

使用的玻璃粉(直径为63-93μm)为EDC/NHS修饰的带有羧基的玻璃粉(购自绵阳光耀新材料有限责任公司)，利于吸附细胞裂解后释放的DNA。

玻璃粉的修饰方法：取适量SiO₂微球，放置1.5ml离心管中，用95％乙醇洗涤2次，重悬于100μL 95％乙醇中。加入2.5％氨基硅烷400μL，振荡充分，超声片刻，振摇30min(Invitrogen hulamixer 80rpm)。用无水乙醇洗涤3次，重悬于100μL无水乙醇中。用N.N-二甲基甲酰胺洗涤1次，重悬于100μL N.N-二甲基甲酰胺中。加入10％丁二酸酐(溶剂：N.N-二甲基甲酰胺)，在N₂中室温反应6h。用双蒸水洗涤3次，重悬于100μL双蒸水中。

微缝19的微缝间隙为50μm。

气囊小室11的直径为8mm、高度为0.2mm；气体通道16的尺寸为45mm×3mm；气体通道18的尺寸为25mm×3mm；气体通道17的尺寸为3mm×4mm；所述LAMP反应室15的直径为7.5mm、高度为0.2mm；装有恒温扩增缓冲液的小室21的下半部分的直径为6mm、高度为0.2mm；装有引物的小室22的下半部分的直径为3mm、高度为0.2mm；装有Bst DNA聚合酶的小室23的下半部分的直径为2mm、高度为0.2mm。

每一个LAMP系统中：气体通道16和气体通道18彼此平行。

每一个LAMP系统中：气体通道16和气体通道17相互垂直；气体通道17和气体通道18相互垂直。

每一个LAMP系统中：装有恒温扩增缓冲液的小室21含有下列混合液19μL(所示浓度均为终浓度)：Tris-HCL 20mM、KCL 10mM、MgSO₄8mM、(NH4)₂SO₄10mM、TritonX-1000.1％、甜菜碱0.8M、dNTPs每种1.4mM、MnCL₂0.5mM、钙黄绿素25μM。

三个LAMP系统中：两个装有引物的小室22中各含有引物4μL，引物序列如下所示：

SEQ ID NO.1：5’-GCAGGGTCTTCTCTGTTTCA-3’(终浓度0.4μM)；

SEQ ID NO.2：5’-TCAGGAAAATGCTGGCTGAC-3’(终浓度0.4μM)；

SEQ ID NO.3：5’-TTCACCAGTACGTTCCTGGCTG-AACTACTTGGAGGACCGTCG-3’(终浓度1.6μM)；

SEQ ID NO.4：5’-GTGCCAAACTGCTGGGTGCGGA-CCACCTCCTTACTTTGCCTC-3’(终浓度1.6μM)；含有上述引物序列的小室22的LAMP系统一个作为样本LAMP系统，一个作为阴性对照LAMP系统。

另外一个LAMP系统中：装有引物的小室22中含有阳性对照DNA的扩增引物4μL(购自荣研生物科技有限公司，货号为slp204)。上述LAMP系统作为阳性对照LAMP系统。

每一个LAMP系统中：装有Bst DNA聚合酶的小室23中含有1μL Bst DNA聚合酶(8U)。

样本入口181和废液出口182的横截面是圆形，直径是0.75mm。

实施例2 实施例1中的微流控芯片的制备方法

步骤：

1、制备具有实施例1中的微流控芯片上的微通道和微结构的SU-8阳模

首先，用计算机辅助设计软件(Freehand)设计微流控芯片的微通道与微结构；其次，将Freehand绘制的芯片构道图打印在SU-8胶(Microchem，型号为2075)作为掩模，采用标准光刻工艺制作模具，获得SU-8阳模。

2、PDMS复制

(1)将PDMS(Dow Corning，货号：0007883528)和固化剂按质量比10：1混匀，在真空干燥箱中抽气，倾倒在模具表面，80℃烘烤1h后取出；

(2)冷却后缓慢将PDMS在模板上撕下，在PDMS基片相应位置钻出进样孔、废液孔，然后切割成合适的大小。

3、PDMS层封接

将上下两层PDMS基片放入等离子清洗机真空轰击1min，然后迅速在下层PDMS基片装载各个反应试剂和玻璃粉，然后迅速将两层PDMS对齐，进行不可逆封接。

4、微流控芯片保存

用夹子夹住反应试剂储存小室周边的通道，避免样品的混合。

实施例3 实施例1中的微流控芯片检测EGFR基因点突变效果的研究

步骤：

1、细胞收集与裂解

取汇合度为80％-90％的H1975(该细胞基因组上EGFP基因21号外显子存在点突变)和阴性对照人类肺腺癌细胞系A549各一瓶，用PBS冲洗后，分别加入1.5mL的DNAiso试剂(Takara)，轻轻摇晃细胞培养瓶。

2、样本DNA上EGFP基因21号外显子的点突变检测

(1)用注射器将含有细胞碎片的裂解液吸出，通过微流控芯片上样本LAMP系统中样本入口181将上述细胞裂解液注入LAMP反应室15中，静置数分钟，使细胞裂解释放的核酸吸附到玻璃粉表面，然后用注射器在样本入口181处注入空气，使混合液通过废液出口182排除；另外将1μL阳性对照DNA(购自荣研生物科技有限公司，货号为slp204)通过阳性对照LAMP系统中的样本入口181注入到LAMP反应室15中，将1μL双蒸水通过阴性对照LAMP系统中的样本入口181注入到LAMP反应室15中。

(2)打开存放LAMP反应试剂小室两边的夹子，挤压气囊，使所有LAMP反应试剂进入反应室；用夹子夹住反应室周边的通道，使反应与外界空气隔离，防止空气污染；

(3)将微流控芯片放入65℃恒温装置中，进行扩增反应；

(4)25-30min后，依据颜色变化进行EGFP基因21号外显子上T>C点突变的判断。突变细胞系H1975裂解扩增反应后为绿色，未突变的细胞系A549细胞裂解扩增反应后依然为黄色。

通过上述实验结果可知，使用本发明制备的微流控芯片可以很好的识别EGFP基因21号外显子上T>C点突变的样本和野生型样本。

由以上可知，判断未知样本DNA上EGFP基因21号外显子上T>C点突变存在与否的标准是：样本裂解扩增反应后呈现绿色的为突变样本；样本裂解扩增反应后呈现黄色的为正常样本。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种即时检测EGFR突变的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片是由上层基片(1)和下层基片(2)键合而成的一个密闭整体；所述微流控芯片上设有三个相同且彼此独立的LAMP系统；每一个所述LAMP系统包括一个气囊小室(11)、一个装有恒温扩增缓冲液的小室(21)、一个装有引物的小室(22)、一个装有Bst DNA聚合酶的小室(23)、一个LAMP反应室(15)、一条气体通道(16)、一条气体通道(17)、一条气体通道(18)；所述气囊小室(11)的上半部分，所述装有恒温扩增缓冲液的小室(21)的上半部分、所述装有引物的小室(22)的上半部分、所述装有Bst DNA聚合酶的小室(23)的上半部分、所述LAMP反应室(15)的上半部分、所述气体通道(16)、所述气体通道(17)、所述气体通道(18)位于所述上层基片(1)上，且所述气体通道(16)的一端与所述气囊小室(11)的上半部分连通，所述装有恒温扩增缓冲液的小室(21)的上半部分、所述装有引物的小室(22)的上半部分、所述装有Bst DNA聚合酶的小室(23)的上半部分依次排列于所述气体通道(16)上且与所述气体通道(16)连通；所述气体通道(16)的另一端与所述气体通道(17)的一端连通，所述气体通道(17)的另一端与所述LAMP反应室(15)的上半部分连通，所述气体通道(18)穿过所述LAMP反应室(15)的上半部分并与之连通；所述气体通道(18)的一端设有样本入口(181)，另一端设有废液出口(182)，所述气体通道(17)、所述气体通道(18)与所述LAMP反应室(15)的连接处设有微缝(19)；所述气囊小室(11)的下半部分、所述装有恒温扩增缓冲液的小室(21)的下半部分、所述装有引物的小室(22)的下半部分、所述装有Bst DNA聚合酶的小室(23)的下半部分、所述LAMP反应室(15)的下半部分位于所述下层基片(2)上，所述气囊小室(11)、所述装有恒温扩增缓冲液的小室(21)、所述装有引物小室(22)、所述装有Bst DNA聚合酶的小室(23)、所述LAMP反应室(15)中设有微柱(111)，多个所述微柱(111)均匀分布，所述微柱(111)的高度小于所述气囊小室(11)的高度、小于所述装有恒温扩增缓冲液的小室(21)的高度、小于所述装有引物小室(22)的高度、小于所述装有Bst DNA聚合酶的小室(23)的高度、小于所述LAMP反应室(15)的高度；所述装有恒温扩增缓冲液的小室(21)的上半部分直径比下半部分多1mm、所述装有引物的小室(22)的上半部分直径比下半部分多1mm、所述装有Bst DNA聚合酶的小室(23)的上半部分直径比下半部分多1mm、所述LAMP反应室(15)的下半部分与所述LAMP反应室(15)的上半部分相对应；所述气囊小室(11)的下半部分与所述气囊小室(11)的上半部分相对应；所述微缝(19)的微缝间隙为50μm；所述LAMP反应室(15)中装有吸附核酸化学修饰的玻璃粉；所述玻璃粉的直径为63-93μm；所述装有恒温扩增缓冲液的小室(21)中含有MnCL₂、钙黄绿素作为显色剂。

2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，每一个所述LAMP系统中：所述气囊小室(11)的直径为8mm、高度为0.2mm；所述气体通道(16)的尺寸为45mm×3mm；所述气体通道(18)的尺寸为25mm×3mm；所述气体通道(17)的尺寸为3mm×4mm；所述LAMP反应室(15)的直径为7.5mm、高度为0.2mm；所述装有恒温扩增缓冲液的小室(21)的下半部分的直径为6mm、高度为0.2mm；所述装有引物的小室(22)的下半部分的直径为3mm、高度为0.2mm；所述装有Bst DNA聚合酶的小室(23)的下半部分的直径为2mm、高度为0.2mm；所述样本入口(181)和所述废液出口(182)的直径是0.75mm；所述微柱(111)的高度为80μm。

3.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，每一个所述LAMP系统中：所述气体通道(16)与所述气体通道(17)相互垂直，所述气体通道(16)与所述气体通道(18)相互平行，所述气体通道(17)与所述气体通道(18)相互垂直。

4.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，每一个所述LAMP系统中：所述装有恒温扩增缓冲液的小室(21)中含有下列混合液19μL：Tris-HCL20mM、KCL 10mM、MgSO₄ 8mM、(NH4)₂SO₄ 10mM、TritonX-100 0.1％、甜菜碱0.8M、dNTPs每种1.4mM、MnCL₂ 0.5mM、钙黄绿素25μM；上述浓度均为终浓度；三个所述LAMP系统中：两个所述装有引物的小室(22)中各含有引物4μL，所述引物序列为：5’-GCAGGGTCTTCTCTGTTTCA-3’，终浓度为0.4μM，5’-TCAGGAAAATGCTGGCTGAC-3’，终浓度为0.4μM，5’-TTCACCAGTACGTTCCTGGCTG-AACTACTTGGAGGACCGTCG-3’，终浓度为1.6μM，5’-GTGCCAAACTGCTGGGTGCGGA-CCACCTCCTTACTTTGCCTC-3’，终浓度为1.6μM；另外一个所述装有引物的小室(22)中含有阳性对照DNA的扩增引物4μL，所述阳性对照DNA的扩增引物从商业途径获得；

每一个所述LAMP系统中：所述装有Bst DNA聚合酶的小室(23)中含有1μL Bst DNA聚合酶。

5.一种权利要求1-4中任一项所述的微流控芯片的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

(1)制备具有所需微通道和微结构的SU-8阳模；

(2)以步骤(1)制备的SU-8阳模为模板，以PDMS为原料复制，然后将上下两层PDMS封接。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

(1)用计算机辅助设计软件Freehand设计权利要求1-4中任一项所述的微流控芯片中的微通道和微结构，以SU-8胶为材料，制备含有所述微通道与所述微结构的SU-8阳模；

(2)将PDMS和固化剂按质量比10：1混匀，抽真空之后浇涂在SU-8阳模上，85℃烘制1h；

(3)冷却后缓慢将PDMS在模板上撕下，切割整齐，出入口用打孔器打孔；

(4)将上下两层PDMS基片放入等离子清洗机真空轰击1min，然后迅速在下层PDMS基片装载各个反应试剂和玻璃粉，然后迅速将两层PDMS对齐，进行不可逆的结合；

(5)用夹子夹住储存反应试剂的小室之间的通道，避免样品的混合。

7.一种非诊断目的的即时检测EGFR突变的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)将含有DNA的检测样本注入权利要求1-4中任一项所述的微流控芯片的LAMP反应室(15)中，提取DNA；

(2)去除反应试剂储存小室周围的夹子，将反应试剂分别送入所述微流控芯片的LAMP反应室(15)中；

(3)将经过步骤(2)处理的微流控芯片放入65℃恒温装置中，进行扩增反应；

(4)判断扩增后反应液的颜色，如果反应液呈绿色，则检测样本DNA上EGFR基因21号外显子上存在T>C的突变；如果反应液呈黄色，则检测样本DNA上EGFR基因21号外显子上不存在T>C的突变。