JP2016510992A - ゲノムDNAおよびcDANの両方を含む全核酸の濃縮および次世代シークエンシング - Google Patents
ゲノムDNAおよびcDANの両方を含む全核酸の濃縮および次世代シークエンシング Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、試験試料から得たゲノムDNA配列およびcDNA配列を含む核酸の混合物を濃縮し、配列決定を行う方法に関する。本出願は、一態様では、試験試料(例えば、試験ヒト試料など)から、目的の核酸が濃縮された集団を得る方法であって、(a)試験試料から得たゲノムDNA配列およびcDNA配列を含む核酸の混合物を提供するステップ;(b)核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;および(c)前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップを含む方法を提供する。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、「全核酸の濃縮および次世代シークエンシング」という発明の名称の、2013年3月11日に出願され米国仮出願第61/776,666号の利益を請求し、すべての目的についてその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本出願は、「全核酸の濃縮および次世代シークエンシング」という発明の名称の、2013年3月11日に出願され米国仮出願第61/776,666号の利益を請求し、すべての目的についてその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
技術分野
本発明は、核酸の混合物を分析することによる、次世代シークエンシングおよびがん診断などの疾患診断に関する。
本発明は、核酸の混合物を分析することによる、次世代シークエンシングおよびがん診断などの疾患診断に関する。
核酸配列解析ツールが遺伝子の改変を同定するための基礎になり、それが今度は、遺伝病を診断するため、薬物治療に対する応答性を予測するため、および薬物の薬理ゲノミクスを解析するために有用になる。がん診断が1つの例である。がんにつながる遺伝的変異としては、一塩基変異(SNV)、挿入および欠失(Indel)、コピー数変異(CNV)、ならびに転座などが挙げられる。解析には限られた量の試料における稀な遺伝的改変の決定が必要であることが多いので、感度が大きな難題になっている。これは、特に、体細胞突然変異を、当該突然変異を有する細胞に混じって正常な細胞が含有されることが多い組織試料(例えば、がん試料など)において解析する際に当てはまる。
次世代シークエンシング(NGS)は、がんなどの疾患に関連する異なる種類の遺伝的変異の分子プロファイリングおよび特徴付けのための強力なツールである。ヒトゲノムDNAは複雑であり、多くの反復配列を有する。これにより、配列解析に関するさらなる難題が生じる。第1に、目的の核酸は核酸の混合物の中で著しく不十分に表される可能性がある。第2に、複雑なDNA試料を分析するための費用は、特にゲノムDNAの解析および多数の遺伝子突然変異の検出に関しては法外に高いことがある。多くの次世代シークエンシング法が開発されてきたが、核酸の調製および配列決定解析のための、高感度であり、正確であり、効率的な方法が依然として必要である。
本明細書において引用されている全ての参考文献の内容は、その全体が参照により組み込まれる。
本出願は、一態様では、試験試料(例えば、試験ヒト試料など)から、目的の核酸が濃縮された集団を得る方法であって、(a)試験試料から得たゲノムDNA配列およびcDNA配列を含む核酸の混合物を提供するステップ;(b)核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;および(c)前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、核酸の混合物は、試験試料から作製されたゲノムDNAライブラリーおよびcDNAライブラリーを混合することによって得られる。一部の実施形態では、核酸の混合物は、(i)試験試料中のRNAをcDNAに逆転写するステップ、および(ii)ゲノムDNA配列およびcDNA配列を含むDNAライブラリーを作製して核酸の混合物を提供するステップによって得られる。
上記の実施形態のいずれかに従う(またはそれに適用される)一部の実施形態では、プローブの少なくとも1つは、ゲノムDNA配列中に存在する目的の核酸およびcDNA配列中に存在する目的の核酸と相補的である。
上記の実施形態のいずれかに従う(またはそれに適用される)一部の実施形態では、ゲノムDNA配列およびcDNA配列は、混合物中に所定の比率で存在する。
上記の実施形態のいずれかに従う(またはそれに適用される)一部の実施形態では、目的の核酸は、複数のエクソン配列、複数のイントロン配列、複数のイントロン−エクソン接合部、または非コード領域中の複数の配列を含む。
上記の実施形態のいずれかに従う(またはそれに適用される)一部の実施形態では、プローブのセットは、少なくとも約100種の異なるプローブを含む。
上記の実施形態のいずれかに従う(またはそれに適用される)一部の実施形態では、プローブは、核酸混合物内の相補領域と比較して少なくとも約10×モル過剰で存在する。
上記の実施形態のいずれかに従う(またはそれに適用される)一部の実施形態では、プローブは、癌遺伝子、腫瘍抑制因子、チロシンキナーゼ、ホスファターゼ、または血管遺伝子(vascular gene)と相補的な配列を含む。
上記の実施形態のいずれかに従う(またはそれに適用される)一部の実施形態では、プローブを、核酸の混合物と接触させる前または接触させた後に固体支持体に付着させる。一部の実施形態では、当該方法は、プローブおよびプローブとハイブリダイズした目的の核酸を固体支持体から溶出させるステップをさらに含む。
上記の実施形態のいずれかに従う(またはそれに適用される)一部の実施形態では、前記目的の核酸を増幅するステップをさらに含む。
上記の実施形態のいずれかに従う(またはそれに適用される)一部の実施形態では、濃縮された目的の核酸の配列決定などの、濃縮された核酸を分析するステップをさらに含む。
別の態様では、試験試料中の核酸を特徴付ける方法であって、(a)試験試料から得たゲノムDNA配列およびcDNA配列を含む核酸の混合物を提供するステップ;および(b)混合物中のゲノムDNA配列およびcDNA配列の配列決定を同時に行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、核酸の混合物は、試験試料から作製されたゲノムDNAライブラリーおよびcDNAライブラリーを混合することによって得られる。一部の実施形態では、核酸の混合物は、(i)試験試料中のRNAをcDNAに逆転写するステップ、および(ii)ゲノムDNA配列およびcDNA配列を含むDNAライブラリーを作製して核酸の混合物を提供するステップによって得られる。
上記の実施形態のいずれかに従う一部の実施形態では、特徴付けは、これらに限定されないが、染色体再編成、一塩基変異(SNV)、またはコピー数変異(CNV)を含めた、試験試料中のゲノムDNA配列における変異の決定を含む。一部の実施形態では、染色体再編成は、DNA配列の欠失、挿入、および転座を含む。
上記の実施形態のいずれかに従う一部の実施形態では、特徴付けは、これらに限定されないが、欠失、挿入、転座、SNV、または示差的な遺伝子発現を含めた、試験試料中のRNA転写物における変異の決定を含む。
上記の実施形態のいずれかに従う一部の実施形態では、方法は、配列決定ステップの前に、核酸混合物を目的の核酸について濃縮するステップを含む。一部の実施形態では、濃縮は、(a)核酸の混合物を、前記核酸混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;および(b)前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップを含む。
上記の実施形態のいずれかに従う一部の実施形態では、方法は、配列決定ステップの前に、核酸が濃縮された集団に最初の核酸の混合物を添加するステップをさらに含む。代替の実施形態では、当該方法は、配列決定ステップの前に、核酸が濃縮された集団にゲノムDNA配列を添加するステップをさらに含む。さらに別の代替的な実施形態では、当該方法は、配列決定ステップの前に、核酸が濃縮された集団にcDNA配列を添加するステップをさらに含む。
上記の実施形態のいずれかに従う一部の実施形態では、核酸混合物は、対照試料、例えば、同じまたは異なる個体由来の対照試料由来のゲノムDNA配列をさらに含む。
上記の実施形態のいずれかに従う一部の実施形態では、核酸混合物は、対照試料、例えば、同じまたは異なる個体由来の対照試料由来のcDNA配列をさらに含む。
本明細書に記載の方法のいずれか1つに適したキットおよび製造品も提供される。
本発明のさらなる実施形態、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から、また本発明の実施を通して明らかになるであろう。
簡潔にするために、本明細書において引用されている特許を含めた刊行物の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、同じ試験試料(例えば、単一の個体由来の試験試料)に由来するゲノムDNAとRNA(cDNA)を同時に分析および配列決定することを可能にする核酸調製および濃縮方法を提供する。同時に分析することにより、希少かつ貴重な試料が最大限利用されるようになり、また、臨床の場での核酸の操作および分析が単純化される。ゲノムDNAとRNA(cDNA)の複合分析により、試験試料中のゲノムおよびトランスクリプトームに関する補完的な情報がもたらされる。これにより、ゲノムの変異と転写レベルでの変異の両方を反映する試験試料の完全な核酸プロファイルを得ることが可能になる。さらに、ゲノムDNAを分析することによって得られる情報およびRNA(cDNA)を分析することによって得られる情報は互いに重複する場合があり、したがって、相互検証が可能になり、核酸分析における信頼度が増す。
したがって、本発明は、一態様では、同じ試験試料から得たゲノムDNA配列およびcDNA配列を含む核酸の混合物から、目的の核酸が濃縮された集団を得る方法を提供する。
別の態様では、同じ試験試料から得たゲノムDNA配列およびcDNA配列を含む核酸の混合物中の核酸を特徴付ける(例えば、配列決定する)方法が提供される。
本明細書に記載の方法に有用なキット、組成物、および製造品も提供される。
定義
定義
「濃縮」という用語は、試料中の特定の核酸配列の相対的な存在量を、濃縮前に前記試料中に最初に存在していた核酸配列全体のレベルと比較して増加させるプロセスを指す。したがって、濃縮ステップにより、例えば目的の核酸配列の絶対的なコピー数が直接増加するのではなく、相対的な百分率または分数としての増加がもたらされる。濃縮のステップ後には、当該試料を、濃縮された核酸集団と称することができる。
本明細書で使用される場合、核酸試料の「複雑さ」とは、その試料中に存在する異なる独特の配列の数を指す。試料は、それが由来する核酸試料よりも複雑でなければ、「複雑さが低い」とみなされる。
本明細書で使用される場合、「固体支持体」とは、タグと結合する性質を、本質的にまたは当該性質を付与するいくつかの構成成分(例えば、抗体、ストレプトアビジン、核酸、または他の結合性リガンド)の付着によって有する固体または半固体材料を指す。そのような結合は、直接的であっても間接的であってもよい。固体支持体の例としては、これらに限定されないが、ニトロセルロースおよびナイロンメンブレン、アガロースまたはセルロースに基づくビーズ(例えば、セファロース)および常磁性ビーズが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「ライブラリー」という用語は、核酸配列の収集物を指す。
本明細書で使用される場合、「特異的にハイブリダイズする」という用語は、核酸が、配列が相補的な核酸とハイブリダイズすることを意味する。本明細書で使用される場合、核酸分子の一部が別の核酸分子の相補配列と特異的にハイブリダイズし得る。すなわち、そのような配列の一部が別の分子と「特異的にハイブリダイズ」するために、核酸配列の全長が必ずしもハイブリダイズする必要はない。
本明細書では互換的に使用される、核酸またはオリゴヌクレオチドの「部分」または「領域」とは、2またはそれ超の塩基の連続した配列である。他の実施形態では、領域または部分は、少なくとも約3個、5個、10個、15個、20個、25個のいずれかの連続したヌクレオチドである。
配列「突然変異」または「変異」とは、本明細書で使用される場合、参照配列と比較した、目的の配列における任意の配列の改変を指す。参照配列は野生型配列であっても目的の配列と比較したい配列であってもよい。突然変異は、置換、欠失または挿入などの機構に起因する配列内の2つ以上のヌクレオチドの一塩基の変化または改変を含む。
核酸またはプライマーは、例えば、第1の核酸またはプライマーの少なくとも2つの連続した塩基が第2の核酸の少なくとも部分配列と逆平行の関係で組み合わさってまたはハイブリダイズして2重鎖を形成し得る場合、別の核酸と「相補的」である。一部の実施形態では、例えばプライマーと標的核酸配列の間の相補性は100%完全なものではない。
本明細書で使用される「目的の核酸」という用語は、研究者が目的とする核酸を指す。
「増幅」とは、本明細書で使用される場合、一般に、所望の配列の2つまたはそれ超のコピーを生成するプロセスを指す。「核酸」とは、本明細書で使用される場合、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、DNAおよびRNAを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドもしくは塩基、および/もしくはそれらの類似体、またはDNAポリメラーゼまたはRNAポリメラーゼによってポリマーに組み入れられ得る任意の基質であってよい。核酸は、修飾されたヌクレオチド、例えば、メチル化されたヌクレオチドおよびそれらの類似体などを含んでよい。
「オリゴヌクレオチド」とは、本明細書で使用される場合、一般に、必ずしもではないが一般に約200ヌクレオチド以下の長さである、短く、一般に一本鎖であり、一般に合成の核酸を指す。「オリゴヌクレオチド」および「核酸」という用語は相互排他的なものではない。核酸についての上記の説明がオリゴヌクレオチドに同等にかつ完全に適用可能である。
本明細書で使用される核酸の「断片化」とは、核酸を壊して異なる核酸断片にすることを指す。断片化は、例えば、せん断することによって、または酵素的な反応によって実現することができる。
「プライマー」とは、一般に、標的配列とハイブリダイズすることによって目的の標的に結合し、その後、標的と相補的な核酸の重合を促進する、一般に遊離の3’−OH基を有する短い一本鎖核酸である。
「ハイブリダイゼーション」および「アニーリング」とは、1つまたは複数の核酸が反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合によって安定化された複合体が形成される反応を指す。水素結合は、ワトソン・クリック塩基対合によって、フーグスティーン結合によって、または任意の他の配列特異的な様式で起こり得る。
本明細書で使用される「アダプター」とは、核酸断片と接合することができるオリゴヌクレオチドを指す。
「ライゲーション」という用語は、アダプターと核酸断片などの2つの核酸に関して本明細書で使用される場合、2つの別々の核酸を共有結合により付着させて、連続した骨格を有する単一のより大きな核酸を生成することを指す。
「3’」という用語は、一般に、核酸またはオリゴヌクレオチド内の、同じ核酸またはオリゴヌクレオチド内の別の領域または位置に対して下流の領域または位置を指す。
「5’」という用語は、一般に、核酸またはオリゴヌクレオチド内の、同じ核酸またはオリゴヌクレオチド内の別の領域または位置に対して上流の領域または位置を指す。
本明細書で使用される「アレイ」とは、核酸または他の分子を担持する、空間的または光学的にアドレス指定可能な領域の配置を含む。アレイが核酸のアレイである場合、核酸は、核酸鎖に沿って任意の点(複数可)でアレイに物理的に吸収させることもでき、化学的に吸収させることもでき、共有結合により付着させることもできる。
本明細書で使用される場合、「一塩基変異」または略して「SNV」という用語は、野生型対立遺伝子と比較した、ゲノム配列内の一塩基位置における変化を指す。
「コピー数変異」または略して「CNV」という用語は、野生型ゲノムDNAと比較した、ゲノム配列内の遺伝子コピー数の変化を指す。
「変性」という用語とは、本明細書で使用される場合、核酸2重鎖が2つの単一の鎖に分離することを指す。
本明細書に記載の本発明の態様および実施形態は、態様および実施形態「からなる(consisting)」および/または「から本質的になる(consisting essentially of)」を含むことが理解される。
本明細書で使用される場合、単数形「a(1つの)」、「an(1つの)」、および「the(その)」は、別段の指定のない限り、複数の参照対象を包含する。
当業者には理解される通り、「約」値またはパラメータとの言及は、本明細書では、その値またはパラメータ自体を対象とする実施形態を含む(かつそれを記載する)。例えば、「約X」と言及される説明は、「X」の記載を含む。
本発明の方法
本出願は、一部の実施形態では、試験試料から、目的の核酸が濃縮された集団を得る方法であって、(a)試験試料から得たゲノムDNA配列およびcDNA配列を含む核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;および(b)前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップを含む方法を提供する。
本出願は、一部の実施形態では、試験試料から、目的の核酸が濃縮された集団を得る方法であって、(a)試験試料から得たゲノムDNA配列およびcDNA配列を含む核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;および(b)前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップを含む方法を提供する。
一部の実施形態では、試験試料から、目的の核酸が濃縮された集団を得る方法であって、(a)試験試料から得たゲノムDNA配列およびcDNA配列を含む核酸の混合物を提供するステップ;(b)核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;および(c)前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップを含む方法が提供される。
一部の実施形態では、試験試料から、目的の核酸が濃縮された集団を得る方法であって、(a)試験試料から作製されたゲノムDNAライブラリーと、試験試料から作製されたcDNAライブラリーを混合して核酸の混合物を提供するステップ;(b)核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;および(c)前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、試験試料から、目的の核酸が濃縮された集団を得る方法であって、(a)試験試料から作製されたゲノムDNAライブラリーと、試験試料から作製されたcDNAライブラリーを、所定の比率(例えば、約10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10の比率)で混合して、核酸の混合物を提供するステップ;(b)核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;および(c)前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、cDNAライブラリーは、例えば、mRNA、リボソームRNA、核内RNA、細胞質RNA、キャップ形成されたRNA、および低分子RNAを含む試験試料中の全RNAから調製されたものである。一部の実施形態では、cDNAライブラリーは、リボソームRNAが除去された処理済みRNA試料から調製されたものである。一部の実施形態では、cDNAライブラリーはmRNAから調製されたものである。
一部の実施形態では、試験試料から、目的の核酸が濃縮された集団を得る方法であって、(a)試験試料中のRNAをcDNAに逆転写するステップ;(b)ゲノムDNA配列およびcDNA配列を含むDNAライブラリーを作製して核酸の混合物を提供するステップ;(b)核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;および(c)前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、逆転写は、例えば、mRNA、リボソームRNA、核内RNA、細胞質RNA、キャップ形成されたRNA、および低分子RNAを含む試験試料中の全RNAを用いて行われる。一部の実施形態では、逆転写は、リボソームRNAが除去された処理済みRNA試料を用いて行われる。一部の実施形態では、逆転写は、mRNAを用いて行われる。
一部の実施形態では、当該方法は、濃縮された目的の核酸を分析する(例えば、配列決定する)ステップをさらに含む。一部の実施形態では、当該方法は、分析前に目的の核酸を増幅するステップをさらに含む。
別の態様では、本出願は、試験試料中の核酸を特徴付ける方法であって、試験試料から得たゲノムDNA配列およびcDNA配列を含む核酸混合物中のゲノムDNA配列およびcDNA配列の配列決定を同時に行うステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、試験試料中の核酸を特徴付ける方法であって、(a)試験試料から得たゲノムDNA配列およびcDNA配列を含む核酸の混合物を提供するステップ;および(b)混合物中のゲノムDNA配列およびcDNA配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、試験試料中の核酸を特徴付ける方法であって、(a)試験試料から作製されたゲノムDNAライブラリーと、試験試料から作製されたcDNAライブラリーを混合して核酸の混合物を提供するステップ;および(b)混合物中のゲノムDNA配列およびcDNA配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、試験試料中の核酸を特徴付ける方法であって、(a)試験試料から作製されたゲノムDNAライブラリーと、試験試料から作製されたcDNAライブラリーを、所定の比率(例えば、約10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10の比率)で混合して、核酸の混合物を提供するステップ;および(b)混合物中のゲノムDNA配列およびcDNA配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、cDNAライブラリーは、例えば、mRNA、リボソームRNA、核内RNA、細胞質RNA、キャップ形成されたRNA、および低分子RNAを含む試験試料中の全RNAから調製されたものである。一部の実施形態では、cDNAライブラリーは、リボソームRNAが除去された処理済みRNA試料から調製されたものである。一部の実施形態では、cDNAライブラリーはmRNAから調製されたものである。
一部の実施形態では、試験試料中の核酸を特徴付ける方法であって、(a)試験試料中のRNAをcDNAに逆転写するステップ;(b)ゲノムDNA配列およびcDNA配列を含むDNAライブラリーを作製して核酸の混合物を提供するステップ;および(c)混合物中のゲノムDNA配列およびcDNA配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、逆転写は、例えば、mRNA、リボソームRNA、核内RNA、細胞質RNA、キャップ形成されたRNA、および低分子RNAを含む試験試料中の全RNAを用いて行われる。一部の実施形態では、逆転写は、リボソームRNAが除去された処理済みRNA試料を用いて行われる。一部の実施形態では、逆転写は、mRNAを用いて行われる。
一部の実施形態では、核酸の混合物を、分析前に濃縮ステップに供する。したがって、例えば、一部の実施形態では、試験試料中の核酸を特徴付ける方法であって、(a)試験試料から得たゲノムDNA配列およびcDNA配列を含む核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;(b)前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ;および(c)目的の核酸の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。
一部の実施形態では、試験試料中の核酸を特徴付ける方法であって、(a)試験試料から得たゲノムDNA配列およびcDNA配列を含む核酸の混合物を提供するステップ;(b)核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;(c)前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ;および(d)目的の核酸の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、試験試料中の核酸を特徴付ける方法であって、(a)試験試料から作製されたゲノムDNAライブラリーと、試験試料から作製されたcDNAライブラリーを混合して核酸の混合物を提供するステップ;(b)核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;(c)前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ;および(d)目的の核酸の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、ゲノムDNAライブラリーおよびcDNAライブラリーは、所定の比率(例えば、約10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10の比率)で混合される。
一部の実施形態では、試験試料中の核酸を特徴付ける方法であって、(a)試験試料中のRNAをcDNAに逆転写するステップ;(b)ゲノムDNA配列およびcDNA配列を含むDNAライブラリーを作製して核酸の混合物を提供するステップ;(c)核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;(d)前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ;および(e)目的の核酸の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。
一部の実施形態では、試験試料中の核酸を特徴付ける方法であって、(a)試験試料から作製されたゲノムDNAライブラリーを、前記ゲノムDNAライブラリー中に存在する目的の核酸と相補的な第1のプローブのセットと、前記ゲノムDNAと前記第1のプローブのセットがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;(b)前記第1のプローブのセットとハイブリダイズしたゲノムDNAをハイブリダイズしていないゲノムDNAから分離し、それにより、目的のゲノムDNAが濃縮された集団を得るステップ;(c)試験試料から作製されたcDNAライブラリーを、前記cDNAライブラリー中に存在する目的のcDNAと相補的な第2のプローブのセットと、前記cDNAと前記第2のプローブのセットがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;(d)前記第2のプローブのセットとハイブリダイズしたcDNAをハイブリダイズしていないcDNAから分離し、それにより、目的のcDNAが濃縮された集団を得るステップ;(d)濃縮された前記目的のゲノムDNAと濃縮された前記目的のcDNAを混合して目的の核酸の集団を得るステップ;および(e)目的の核酸の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、濃縮された目的のゲノムDNAおよび濃縮された目的のcDNAは、所定の比率(例えば、約10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10の比率)で混合される。
本明細書に記載の方法は、これらに限定されないが、ゲノムおよび/またはトランスクリプトームの核酸プロファイルを得ること、核酸の配列決定を行うこと、核酸における変異の有無を決定すること、核酸の多型を分析すること、核酸におけるコピー数変異を分析すること、試験試料における遺伝子発現レベルを分析することなどを含めた核酸分析方法のいずれか1つに対して有用であり得る。
したがって、例えば、一部の実施形態では、試験試料中のゲノムおよびトランスクリプトームの核酸プロファイルを得る方法であって、試験試料から得たゲノムDNA配列およびcDNA配列を含む核酸混合物中のゲノムDNA配列およびcDNA配列の配列決定を同時に行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、試験試料中のゲノムおよびトランスクリプトームの核酸プロファイルを得る方法であって、(a)試験試料から得たゲノムDNA配列およびcDNA配列を含む核酸の混合物を提供するステップ;および(b)混合物中のゲノムDNA配列およびcDNA配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、試験試料中のゲノムおよびトランスクリプトームの核酸プロファイルを得る方法であって、(a)試験試料から作製されたゲノムDNAライブラリーと、試験試料から作製されたcDNAライブラリーを混合して核酸の混合物を提供するステップ;および(b)混合物中のゲノムDNA配列およびcDNA配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、試験試料中のゲノムおよびトランスクリプトームの核酸プロファイルを得る方法であって、(a)試験試料から作製されたゲノムDNAライブラリーと、試験試料から作製されたcDNAライブラリーを、所定の比率(例えば、約10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10の比率)で混合して、核酸の混合物を提供するステップ;および(b)混合物中のゲノムDNA配列およびcDNA配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、cDNAライブラリーは、例えば、mRNA、リボソームRNA、核内RNA、細胞質RNA、キャップ形成されたRNA、および低分子RNAを含む試験試料中の全RNAから調製されたものである。一部の実施形態では、cDNAライブラリーは、リボソームRNAが除去された処理済みRNA試料から調製されたものである。一部の実施形態では、cDNAライブラリーはmRNAから調製されたものである。
一部の実施形態では、試験試料中のゲノムおよびトランスクリプトームの核酸プロファイルを得る方法であって、(a)試験試料中のRNAをcDNAに逆転写するステップ;(b)ゲノムDNA配列およびcDNA配列を含むDNAライブラリーを作製して核酸の混合物を提供するステップ;および(c)混合物中のゲノムDNA配列およびcDNA配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、逆転写は、例えば、mRNA、リボソームRNA、核内RNA、細胞質RNA、キャップ形成されたRNA、および低分子RNAを含む試験試料中の全RNAを用いて行われる。一部の実施形態では、逆転写は、リボソームRNAが除去された処理済みRNA試料を用いて行われる。一部の実施形態では、逆転写は、mRNAを用いて行われる。
一部の実施形態では、試験試料中の目的のゲノムDNAおよびRNAの核酸プロファイルを得る方法であって、(a)試験試料から得たゲノムDNA配列およびcDNA配列を含む核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;(b)前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ;および(c)目的の核酸の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、試験試料中の目的のゲノムDNAおよびRNAの核酸プロファイルを得る方法であって、(a)試験試料から得たゲノムDNA配列およびcDNA配列を含む核酸の混合物を提供するステップ;(b)核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;(c)前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ;および(d)目的の核酸の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、試験試料中の目的のゲノムDNAおよびRNAの核酸プロファイルを得る方法であって、(a)試験試料から作製されたゲノムDNAライブラリーと、試験試料から作製されたcDNAライブラリーを混合して核酸の混合物を提供するステップ;(b)核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;(c)前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ;および(d)目的の核酸の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、ゲノムDNAライブラリーおよびcDNAライブラリーは、所定の比率(例えば、約10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10の比率)で混合される。
一部の実施形態では、試験試料中の目的のゲノムDNAおよびRNAの核酸プロファイルを得る方法であって、(a)試験試料中のRNAをcDNAに逆転写するステップ;(b)ゲノムDNA配列およびcDNA配列を含むDNAライブラリーを作製して核酸の混合物を提供するステップ;(c)核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;(d)前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ;および(e)目的の核酸の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。
一部の実施形態では、試験試料中の目的のゲノムDNAおよびRNAの核酸プロファイルを得る方法であって、(a)試験試料から作製されたゲノムDNAライブラリーを、前記ゲノムDNAライブラリー中に存在する目的の核酸と相補的な第1のプローブのセットと、前記ゲノムDNAと前記第1のプローブのセットがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;(b)前記第1のプローブのセットとハイブリダイズしたゲノムDNAをハイブリダイズしていないゲノムDNAから分離し、それにより、目的のゲノムDNAが濃縮された集団を得るステップ;(c)試験試料から作製されたcDNAライブラリーを、前記cDNAライブラリー中に存在する目的のcDNAと相補的な第2のプローブのセットと、前記cDNAと前記第2のプローブのセットがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;(d)前記第2のプローブのセットとハイブリダイズしたcDNAをハイブリダイズしていないcDNAから分離し、それにより、目的のcDNAが濃縮された集団を得るステップ;(d)濃縮された前記目的のゲノムDNAと濃縮された前記目的のcDNAを混合して目的の核酸の集団を得るステップ;および(e)目的の核酸の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、濃縮された目的のゲノムDNAおよび濃縮された目的のcDNAは、所定の比率(例えば、約10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10の比率)で混合される。
一部の実施形態では、試験試料における、遺伝的変異およびRNA転写物における変異を同時に決定する方法であって、試験試料から得たゲノムDNA配列およびcDNA配列を含む核酸混合物中のゲノムDNA配列およびcDNA配列の配列決定を同時に行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、遺伝的変異およびRNA転写物における変異を同時に決定する方法であって、(a)試験試料から得たゲノムDNA配列およびcDNA配列を含む核酸の混合物を提供するステップ;および(b)混合物中のゲノムDNA配列およびcDNA配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、遺伝的変異およびRNA転写物における変異を同時に決定する方法であって、(a)試験試料から作製されたゲノムDNAライブラリーと、試験試料から作製されたcDNAライブラリーを混合して核酸の混合物を提供するステップ;および(b)混合物中のゲノムDNA配列およびcDNA配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、遺伝的変異およびRNA転写物における変異を同時に決定する方法であって、(a)試験試料から作製されたゲノムDNAライブラリーと、試験試料から作製されたcDNAライブラリーを、所定の比率(例えば、約10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10の比率)で混合して、核酸の混合物を提供するステップ;および(b)混合物中のゲノムDNA配列およびcDNA配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、cDNAライブラリーは、例えば、mRNA、リボソームRNA、核内RNA、細胞質RNA、キャップ形成されたRNA、および低分子RNAを含む試験試料中の全RNAから調製されたものである。一部の実施形態では、cDNAライブラリーは、リボソームRNAが除去された処理済みRNA試料から調製されたものである。一部の実施形態では、cDNAライブラリーはmRNAから調製されたものである。
一部の実施形態では、試験試料における、遺伝的変異およびRNA転写物における変異を同時に決定する方法であって、(a)試験試料中のRNAをcDNAに逆転写するステップ;(b)ゲノムDNA配列およびcDNA配列を含むDNAライブラリーを作製して核酸の混合物を提供するステップ;および(c)混合物中のゲノムDNA配列およびcDNA配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、逆転写は、例えば、mRNA、リボソームRNA、核内RNA、細胞質RNA、キャップ形成されたRNA、および低分子RNAを含む試験試料中の全RNAを用いて行われる。一部の実施形態では、逆転写は、リボソームRNAが除去された処理済みRNA試料を用いて行われる。一部の実施形態では、逆転写は、mRNAを用いて行われる。
一部の実施形態では、試験試料における、遺伝的変異およびRNA転写物における変異を同時に決定する方法であって、(a)試験試料から作製されたゲノムDNAライブラリーを、前記ゲノムDNAライブラリー中に存在する目的の核酸と相補的な第1のプローブのセットと、前記ゲノムDNAと前記第1のプローブのセットがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;(b)前記第1のプローブのセットとハイブリダイズしたゲノムDNAをハイブリダイズしていないゲノムDNAから分離し、それにより、目的のゲノムDNAが濃縮された集団を得るステップ;(c)試験試料から作製されたcDNAライブラリーを、前記cDNAライブラリー中に存在する目的のcDNAと相補的な第2のプローブのセットと、前記cDNAと前記第2のプローブのセットがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;(d)前記第2のプローブのセットとハイブリダイズしたcDNAをハイブリダイズしていないcDNAから分離し、それにより、目的のcDNAが濃縮された集団を得るステップ;(d)濃縮された前記目的のゲノムDNAと濃縮された前記目的のcDNAを混合して目的の核酸の集団を得るステップ;および(e)目的の核酸の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、濃縮された目的のゲノムDNAおよび濃縮された目的のcDNAは、所定の比率(例えば、約10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10の比率)で混合される。
一部の実施形態では、試験試料中の目的の核酸の遺伝的変異およびRNA転写物における変異を同時に決定する方法であって、(a)試験試料から得たゲノムDNA配列およびcDNA配列を含む核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;(b)前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ;および(c)目的の核酸の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、試験試料中の目的の核酸の遺伝的変異およびRNA転写物における変異を同時に決定する方法であって、(a)試験試料から得たゲノムDNA配列およびcDNA配列を含む核酸の混合物を提供するステップ;(b)核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;(c)前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ;および(d)目的の核酸の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、試験試料中の目的の核酸の遺伝的変異およびRNA転写物における変異を同時に決定する方法であって、(a)試験試料から作製されたゲノムDNAライブラリーと、試験試料から作製されたcDNAライブラリーを混合して核酸の混合物を提供するステップ;(b)核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;(c)前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ;および(d)目的の核酸の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、ゲノムDNAライブラリーおよびcDNAライブラリーは、所定の比率(例えば、約10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10の比率)で混合される。
一部の実施形態では、試験試料中の目的の核酸の遺伝的変異およびRNA転写物における変異を同時に決定する方法であって、(a)試験試料中のRNAをcDNAに逆転写するステップ;(b)ゲノムDNA配列およびcDNA配列を含むDNAライブラリーを作製して核酸の混合物を提供するステップ;(c)核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;(d)前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ;および(e)目的の核酸の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。
本明細書に記載の方法は、これらに限定されないが、1)個体における疾患(例えば、がんなど)の診断、2)個体における疾患(例えば、がんなど)が発生するリスクの評価、3)治療レジメ(例えば、がん治療など)に対する個体の応答性の決定、4)個体に対する治療(例えば、がん治療など)の有効性の評価、5)個体に対する継続治療(例えば、がん治療など)の決定;および6)治療レジメ(例えば、がんなど)に対する個体の応答性の予測を含めた目的に有用であり得る、個体由来の核酸試料の分析に有用であり得る。一部の実施形態では、当該方法は、遺伝子検査(例えば、出生前スクリーニングなど)に有用である。一部の実施形態では、当該方法は、個体における薬物の薬物動態学を予測するために有用である。
本明細書に記載の方法は、個人向けの薬の状況において特に有用であり、その場合、個体のゲノムDNAおよびRNAに関する情報を含めた核酸プロファイルを決定し、それを個人向けの治療レジメを考案するための指針として使用する。個体の試料からゲノムDNAおよびRNAに関する情報を得ることができることにより、試料が最大限使用されるようになり、また、臨床試験が単純かつ効率的なものになる。
一部の実施形態では、試験試料由来の核酸の混合物は、対照ゲノムDNA配列および/または対照cDNA配列をさらに含んでよい。データの解析および比較を容易にするために、これらの対照配列には別々に指標を付ける。対照配列は同じ個体に由来してもよい。例えば、試験試料が腫瘍試料である一部の実施形態では、対照配列は同じ個体の正常な組織由来の対照試料由来であってよい。一部の実施形態では、対照配列は、疾患の診断を受けていない個体などの別の個体から得た対照試料に由来する。
一部の実施形態では、濃縮前の核酸混合物と目的の核酸が濃縮された集団を所定の比率(例えば、約100,000:1、10,000:1、1,000:1、100:1、10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1,000、1:10,000、または1:100,000のいずれかの比率)で組み合わせることによって核酸の混合物を得ることができる。これにより、ゲノムワイドなレベルおよび/またはトランスクリプトームワイドなレベルでの広範な配列決定(または分析)と目的の核酸のディープシークエンシングの両方が可能になる。
したがって、例えば、一部の実施形態では、試験試料中の核酸を特徴付ける(例えば、ゲノムDNAおよびRNAの核酸プロファイルを得、かつ/または遺伝的変異およびRNA転写物における変異を同時に検出するなどの)方法であって、(a)試験試料から得たゲノムDNA配列およびcDNA配列を含む核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;(b)前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ;(c)目的の核酸が濃縮された集団に最初の核酸の混合物を所定の比率(例えば、混合物:濃縮物について約100,000:1、10,000:1、1,000:1、100:1、10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1,000、1:10,000、または1:100,000のいずれかの重量比)で添加するステップ、および(d)新しい混合物中のゲノムDNA配列およびcDNA配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、核酸を特徴付ける(例えば、ゲノムDNAおよびRNAの核酸プロファイルを得、かつ/または遺伝的変異およびRNA転写物における変異を同時に検出するなどの)方法であって、(a)試験試料から得たゲノムDNA配列およびcDNA配列を含む核酸の混合物を提供するステップ;(b)核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;(c)前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ;(d)目的の核酸が濃縮された集団に最初の核酸の混合物を所定の比率(例えば、混合物:濃縮物について約100,000:1、10,000:1、1,000:1、100:1、10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1,000、1:10,000、または1:100,000のいずれかの重量比)で添加するステップ、および(e)新しい混合物中のゲノムDNA配列およびcDNA配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、試験試料中の核酸を特徴付ける(例えば、ゲノムDNAおよびRNAの核酸プロファイルを得、かつ/または遺伝的変異およびRNA転写物における変異を同時に検出するなどの)方法であって、(a)試験試料から作製されたゲノムDNAライブラリーと、試験試料から作製されたcDNAライブラリーを混合して核酸の混合物を提供するステップ;(b)核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;(c)前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ;(d)目的の核酸が濃縮された集団に最初の核酸の混合物を所定の比率(例えば、混合物:濃縮物について約100,000:1、10,000:1、1,000:1、100:1、10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1,000、1:10,000、または1:100,000のいずれかの重量比)で添加するステップ、および(e)新しい混合物中のゲノムDNA配列およびcDNA配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、ゲノムDNAライブラリーおよびcDNAライブラリーは、所定の比率(例えば、約10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10の比率)で混合される。
一部の実施形態では、試験試料中の核酸を特徴付ける(例えば、ゲノムDNAおよびRNAの核酸プロファイルを得、かつ/または遺伝的変異およびRNA転写物における変異を同時に検出するなどの)方法であって、(a)試験試料中のRNAをcDNAに逆転写するステップ;(b)ゲノムDNA配列およびcDNA配列を含むDNAライブラリーを作製して核酸の混合物を提供するステップ;(c)核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;(d)前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ;(e)目的の核酸が濃縮された集団に最初の核酸の混合物を所定の比率(例えば、混合物:濃縮物について約100,000:1、10,000:1、1,000:1、100:1、10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1,000、1:10,000、または1:100,000のいずれかの重量比)で添加するステップ、および(f)新しい混合物中のゲノムDNA配列およびcDNA配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。
一部の実施形態では、試験試料中の核酸を特徴付ける(例えば、ゲノムDNAおよびRNAの核酸プロファイルを得、かつ/または遺伝的変異およびRNA転写物における変異を同時に検出するなどの)方法であって、(a)試験試料から作製されたゲノムDNAライブラリーを、前記ゲノムDNAライブラリー中に存在する目的の核酸と相補的な第1のプローブのセットと、前記ゲノムDNAと前記第1のプローブのセットがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;(b)前記第1のプローブのセットとハイブリダイズしたゲノムDNAをハイブリダイズしていないゲノムDNAから分離し、それにより、目的のゲノムDNAが濃縮された集団を得るステップ;(c)試験試料から作製されたcDNAライブラリーを、前記cDNAライブラリー中に存在する目的のcDNAと相補的な第2のプローブのセットと、前記cDNAと前記第2のプローブのセットがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;(d)前記第2のプローブのセットとハイブリダイズしたcDNAをハイブリダイズしていないcDNAから分離し、それにより、目的のcDNAが濃縮された集団を得るステップ;(e)濃縮された前記目的のゲノムDNAと濃縮された前記目的のcDNAを混合して目的の核酸の集団を得るステップ;(f)目的の核酸の集団に濃縮前のゲノムDNAライブラリーとcDNAライブラリーの混合物を所定の比率(例えば、未濃縮物:濃縮物について約100,000:1、10,000:1、1,000:1、100:1、10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1,000、1:10,000、または1:100,000のいずれかの重量比)で添加するステップ、および(f)新しい混合物中のゲノムDNA配列およびcDNA配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。
一部の実施形態では、同じ試験試料から得たゲノムDNA配列を濃縮された核酸混合物に添加することができる。ゲノムDNA配列を添加することにより、例えば、ゲノムワイドなレベルでの広範な配列決定(または分析)と目的の核酸のディープシークエンシングの両方が可能になる。一部の実施形態では、ゲノムDNA配列と核酸混合物の所望の比率は、約100,000:1、10,000:1、1,000:1、100:1、10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1,000、1:10,000、または1:100,000のいずれかである。
したがって、例えば、一部の実施形態では、試験試料中の核酸を特徴付ける(例えば、ゲノムDNAおよびRNAの核酸プロファイルを得、かつ/または遺伝的変異およびRNA転写物における変異を同時に検出するなどの)方法であって、(a)試験試料から得たゲノムDNA配列およびcDNA配列を含む核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;(b)前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ;(c)目的の核酸が濃縮された集団に試験試料由来のゲノムDNA配列を添加して、所定の比率(例えば、約100,000:1、10,000:1、1,000:1、100:1、10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1,000、1:10,000、または1:100,000のいずれかの重量比)の、ゲノムDNA配列と濃縮された核酸の混合物を得るステップおよび(d)新しい混合物中のゲノムDNA配列およびcDNA配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、試験試料中の核酸を特徴付ける(例えば、ゲノムDNAおよびRNAの核酸プロファイルを得、かつ/または遺伝的変異およびRNA転写物における変異を同時に検出するなどの)方法であって、(a)試験試料から得たゲノムDNA配列およびcDNA配列を含む核酸の混合物を提供するステップ;(b)核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;(c)前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ;(d)目的の核酸が濃縮された集団に試験試料由来のゲノムDNA配列を添加して、所定の比率(例えば、約100,000:1、10,000:1、1,000:1、100:1、10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1,000、1:10,000、または1:100,000のいずれかの重量比)の、ゲノムDNA配列と濃縮された核酸の混合物を得るステップおよび(e)新しい混合物中のゲノムDNA配列およびcDNA配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、試験試料中の核酸を特徴付ける(例えば、ゲノムDNAおよびRNAの核酸プロファイルを得、かつ/または遺伝的変異およびRNA転写物における変異を同時に検出するなどの)方法であって、(a)試験試料から作製されたゲノムDNAライブラリーと、試験試料から作製されたcDNAライブラリーを混合して核酸の混合物を提供するステップ;(b)核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;(c)前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ;(d)目的の核酸が濃縮された集団に試験試料由来のゲノムDNA配列を添加して、所定の比率(例えば、約100,000:1、10,000:1、1,000:1、100:1、10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1,000、1:10,000、または1:100,000のいずれかの重量比)の、ゲノムDNA配列と濃縮された核酸の混合物を得るステップ、および(e)新しい混合物中のゲノムDNA配列およびcDNA配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、ゲノムDNAライブラリーおよびcDNAライブラリーを、濃縮前に所定の比率(例えば、約10:1、5:1、2:1、1:1、1:0、0:1、1:2、1:5、1:10の比率)で混合する。
一部の実施形態では、試験試料中の核酸を特徴付ける(例えば、ゲノムDNAおよびRNAの核酸プロファイルを得、かつ/または遺伝的変異およびRNA転写物における変異を同時に検出するなどの)方法であって、(a)試験試料中のRNAをcDNAに逆転写するステップ;(b)ゲノムDNA配列およびcDNA配列を含むDNAライブラリーを作製して核酸の混合物を提供するステップ;(c)核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;(d)前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ;(e)目的の核酸が濃縮された集団に試験試料由来のゲノムDNA配列を添加して、所定の比率(例えば、約100,000:1、10,000:1、1,000:1、100:1、10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1,000、1:10,000、または1:100,000のいずれかの重量比)の、ゲノムDNA配列と濃縮された核酸の混合物を得るステップおよび(f)新しい混合物中のゲノムDNA配列およびcDNA配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。
一部の実施形態では、試験試料中の核酸を特徴付ける(例えば、ゲノムDNAおよびRNAの核酸プロファイルを得、かつ/または遺伝的変異およびRNA転写物における変異を同時に検出するなどの)方法であって、(a)試験試料から作製されたゲノムDNAライブラリーを、前記ゲノムDNAライブラリー中に存在する目的の核酸と相補的な第1のプローブのセットと、前記ゲノムDNAと前記第1のプローブのセットがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;(b)前記第1のプローブのセットとハイブリダイズしたゲノムDNAをハイブリダイズしていないゲノムDNAから分離し、それにより、目的のゲノムDNAが濃縮された集団を得るステップ;(c)試験試料から作製されたcDNAライブラリーを、前記cDNAライブラリー中に存在する目的のcDNAと相補的な第2のプローブのセットと、前記cDNAと前記第2のプローブのセットがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;(d)前記第2のプローブのセットとハイブリダイズしたcDNAをハイブリダイズしていないcDNAから分離し、それにより、目的のcDNAが濃縮された集団を得るステップ;(e)濃縮された前記目的のゲノムDNAと濃縮された前記目的のcDNAを混合して目的の核酸の集団を得るステップ;(f)目的の核酸の集団に試験試料由来のゲノムDNA配列を添加して、所定の比率(例えば、約100,000:1、10,000:1、1,000:1、100:1、10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1,000、1:10,000、または1:100,000のいずれかの重量比)の、ゲノムDNA配列と濃縮された核酸の混合物を得るステップ、および(f)新しい混合物中のゲノムDNA配列およびcDNA配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。
一部の実施形態では、同じ試験試料から得たcDNA配列を濃縮された核酸混合物に添加することができる。cDNA配列を添加することにより、例えば、トランスクリプトームワイドなレベルでの広範な配列決定(または分析)と目的の核酸のディープシークエンシングの両方が可能になる。一部の実施形態では、cDNA配列と核酸混合物の所望の比率は、約100,000:1、10,000:1、1,000:1、100:1、10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1,000、1:10,000、または1:100,000のいずれかである。
したがって、例えば、一部の実施形態では、試験試料中の核酸を特徴付ける(例えば、ゲノムDNAおよびRNAの核酸プロファイルを得、かつ/または遺伝的変異およびRNA転写物における変異を同時に検出するなどの)方法であって、(a)試験試料から得たゲノムDNA配列およびcDNA配列を含む核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;(b)前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ;(c)目的の核酸が濃縮された集団に試験試料由来のcDNA配列を添加して、所定の比率(例えば、約100,000:1、10,000:1、1,000:1、100:1、10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1,000、1:10,000、または1:100,000のいずれかの重量比)の、cDNA配列と濃縮された核酸の混合物を得るステップ、および(d)新しい混合物中のゲノムDNA配列およびcDNA配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、試験試料中の核酸を特徴付ける(例えば、ゲノムDNAおよびRNAの核酸プロファイルを得、かつ/または遺伝的変異およびRNA転写物における変異を同時に検出するなどの)方法であって、(a)試験試料から得たゲノムDNA配列およびcDNA配列を含む核酸の混合物を提供するステップ;(b)核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;(c)前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ;(d)目的の核酸が濃縮された集団に試験試料由来のcDNA配列を添加して、所定の比率(例えば、約100,000:1、10,000:1、1,000:1、100:1、10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1,000、1:10,000、または1:100,000のいずれかの重量比)の、cDNA配列と濃縮された核酸の混合物を得るステップ、および(e)新しい混合物中のゲノムDNA配列およびcDNA配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、試験試料中の核酸を特徴付ける(例えば、ゲノムDNAおよびRNAの核酸プロファイルを得、かつ/または遺伝的変異およびRNA転写物における変異を同時に検出するなどの)方法であって、(a)試験試料から作製されたゲノムDNAライブラリーと、試験試料から作製されたcDNAライブラリーを混合して核酸の混合物を提供するステップ;(b)核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;(c)前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ;(d)目的の核酸が濃縮された集団に試験試料由来のcDNA配列を添加して、所定の比率(例えば、約100,000:1、10,000:1、1,000:1、100:1、10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1,000、1:10,000、または1:100,000のいずれかの重量比)の、cDNA配列と濃縮された核酸の混合物を得るステップ、および(e)新しい混合物中のゲノムDNA配列およびcDNA配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、ゲノムDNAライブラリーおよびcDNAライブラリーを、濃縮前に所定の比率(例えば、約10:1、5:1、2:1、1:1、1:0、0:1、1:2、1:5、1:10の比率)で混合する。
一部の実施形態では、試験試料中の核酸を特徴付ける(例えば、ゲノムDNAおよびRNAの核酸プロファイルを得、かつ/または遺伝的変異およびRNA転写物における変異を同時に検出するなどの)方法であって、(a)試験試料中のRNAをcDNAに逆転写するステップ;(b)ゲノムDNA配列およびcDNA配列を含むDNAライブラリーを作製して核酸の混合物を提供するステップ;(c)核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;(d)前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ;(e)目的の核酸が濃縮された集団に試験試料由来のcDNA配列を添加して、所定の比率(例えば、約100,000:1、10,000:1、1,000:1、100:1、10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1,000、1:10,000、または1:100,000のいずれかの重量比)の、cDNA配列と濃縮された核酸の混合物を得るステップ、および(f)新しい混合物中のゲノムDNA配列およびcDNA配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。
一部の実施形態では、試験試料中の核酸を特徴付ける(例えば、ゲノムDNAおよびRNAの核酸プロファイルを得、かつ/または遺伝的変異およびRNA転写物における変異を同時に検出するなどの)方法であって、(a)試験試料から作製されたゲノムDNAライブラリーを、前記ゲノムDNAライブラリー中に存在する目的の核酸と相補的な第1のプローブのセットと、前記ゲノムDNAと前記第1のプローブのセットがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;(b)前記第1のプローブのセットとハイブリダイズしたゲノムDNAをハイブリダイズしていないゲノムDNAから分離し、それにより、目的のゲノムDNAが濃縮された集団を得るステップ;(c)試験試料から作製されたcDNAライブラリーを、前記cDNAライブラリー中に存在する目的のcDNAと相補的な第2のプローブのセットと、前記cDNAと前記第2のプローブのセットがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;(d)前記第2のプローブのセットとハイブリダイズしたcDNAをハイブリダイズしていないcDNAから分離し、それにより、目的のcDNAが濃縮された集団を得るステップ;(e)濃縮された前記目的のゲノムDNAと濃縮された前記目的のcDNAを混合して目的の核酸の集団を得るステップ;(f)目的の核酸の集団に試験試料由来のcDNA配列を添加して、所定の比率(例えば、約100,000:1、10,000:1、1,000:1、100:1、10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1,000、1:10,000、または1:100,000のいずれかの重量比)の、cDNA配列と濃縮された核酸の混合物を得るステップ、および(f)新しい混合物中のゲノムDNA配列およびcDNA配列の配列決定を行うステップを含む方法が提供される。
一部の実施形態では、核酸は、対照試料から得たゲノムDNA配列および/またはcDNA配列をさらに含む。対照試料中のこれらの配列は違うように指標付けされるが、他の点では試験試料と同じように処理される。一部の実施形態では、対照試料は同じ個体由来である。一部の実施形態では、対照試料は異なる個体由来である。
核酸の混合物を提供すること
本出願の方法は、一部の実施形態では、同じ試料、例えばヒト試料から得たゲノムDNA配列およびcDNA配列を含む核酸の混合物を提供することを含む。一部の実施形態では、試料は、組織試料または組織試料から抽出された核酸である。一部の実施形態では、試料は、細胞試料(例えば、CTC試料)または細胞試料から抽出された核酸である。一部の実施形態では、試料は、単一細胞または単一細胞から抽出された核酸である。一部の実施形態では、試料は、腫瘍試料または腫瘍試料から抽出された核酸である。一部の実施形態では、試料は、生検試料または生検試料から抽出された核酸である。一部の実施形態では、試料は、ホルムアルデヒド固定パラフィン包埋(FFPE)試料またはFFPE試料から抽出された核酸である。
本出願の方法は、一部の実施形態では、同じ試料、例えばヒト試料から得たゲノムDNA配列およびcDNA配列を含む核酸の混合物を提供することを含む。一部の実施形態では、試料は、組織試料または組織試料から抽出された核酸である。一部の実施形態では、試料は、細胞試料(例えば、CTC試料)または細胞試料から抽出された核酸である。一部の実施形態では、試料は、単一細胞または単一細胞から抽出された核酸である。一部の実施形態では、試料は、腫瘍試料または腫瘍試料から抽出された核酸である。一部の実施形態では、試料は、生検試料または生検試料から抽出された核酸である。一部の実施形態では、試料は、ホルムアルデヒド固定パラフィン包埋(FFPE)試料またはFFPE試料から抽出された核酸である。
本出願は、本明細書に記載のいずれかの核酸混合物も包含する。本明細書に記載の核酸混合物は、例えば、試験試料由来のゲノムDNAライブラリーおよびcDNAライブラリーを別々に調製し、次いで、これらの2つのライブラリーを、例えば所定の比率で混合することによって得ることができる。
ゲノムDNAライブラリーは、例えば、試料中のゲノムDNAをゲノムDNA断片に断片化することによって得ることができる。核酸を断片化する方法は当技術分野で周知である。例示的な方法としては、これらに限定されないが、エキソヌクレアーゼ消化またはエンドヌクレアーゼ消化などの酵素による消化、化学的切断、光切断、およびせん断などの機械力およびこれらの方法の組合せが挙げられる。
次世代シークエンシングを容易にするために、一部の実施形態では、DNA断片をプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチドアダプターにライゲーションして、配列決定の準備ができたライブラリーを得る。一部の実施形態では、ライブラリー内のゲノムDNA配列は、同じ混合物中のゲノムDNA配列とcDNA配列の弁別を可能にする指標を含む。当該指標は、ゲノムDNA配列を示すために使用され、また、試験試料中のゲノムDNA配列のみに関連し、同じ実験に関与する可能性がある他の核酸配列には関連しない情報を報告することができるものである。これにより、ゲノムDNA配列が他の配列(例えばcDNA配列など)と物理的に混在しており、物理的に分離または区別することができない場合でさえも、分析の間に得られた情報をゲノムDNA配列にまでたどることが可能になる。
本明細書に記載のゲノムDNAは1つまたは複数の染色体を有してよい。例えば、染色体を1つ含む原核生物のゲノムDNAを使用することができる。あるいは、染色体を複数含む真核生物のゲノムDNAを本明細書に開示されている方法において使用することができる。したがって、当該方法は、例えば、2もしくはそれ超、4もしくはそれ超、6もしくはそれ超、8もしくはそれ超、10もしくはそれ超、15もしくはそれ超、20もしくはそれ超、23もしくはそれ超、25もしくはそれ超、30もしくはそれ超、または35もしくはそれ超の染色体と同等のn(nは一倍体染色体数であり、二倍体染色体数は2nになる)を有するゲノムDNAを選択、増幅または分析するために使用することができる。本発明の方法において使用されるゲノムDNAのサイズは、染色体組の塩基対の数またはヌクレオチドの長さに従って測定することもできる。本発明において有用であるゲノムのいくつかの例示的なサイズ推定値は、約3.1Gbp(ヒト)、2.7Gbp(マウス)、2.8Gbp(ラット)、1.7Gbp(ゼブラフィッシュ)、165Mbp(ショウジョウバエ)、13.5Mbp(S.cerevisiae)、390Mbp(fiigu)、278Mbp(蚊)または103Mbp(C.elegans)である。例えば、より小さなまたはより大きなゲノムを含めた、上に例示されているもの以外のサイズを有するゲノムも使用することができることが当業者には理解されよう。
cDNAライブラリーは、例えば、試料中のRNAをcDNAに逆転写することによって得ることができる。一部の実施形態では、RNAは、例えば、mRNA、リボソームRNA、核内RNA、細胞質RNA、キャップ形成されたRNA、および低分子RNAを含む試験試料中の全RNAである。一部の実施形態では、RNAは、リボソームRNAが除去された処理済みRNA試料である。一部の実施形態では、RNAはmRNAである。次世代シークエンシングを容易にするために、一部の実施形態では、cDNAまたはcDNA断片をプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチドアダプターにライゲーションして配列決定の準備ができたライブラリーを得る。一部の実施形態では、クローニングされたcDNA配列は、同じ混合物中のゲノムDNA配列とcDNA配列の弁別を可能にする指標を含む。
ゲノムDNAライブラリーおよびcDNAライブラリーは、所定の比率で混合することができる。一部の実施形態では、核酸混合物中のゲノムDNAライブラリーとcDNAライブラリーの重量比は、約100:1、90:1、80:1、70:1、60:1、50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90、または1:100のいずれかである。一部の実施形態では、核酸混合物中のゲノムDNAライブラリーとcDNAライブラリーの重量比は、約10:1、約5:1、約2:1、約1:1、約1:2、約1:5、または約1:10である。
一部の実施形態では、試料中のDNAとRNAの両方を含有する全核酸を直接使用して核酸の混合物を作製することができる。全核酸を用いて逆転写反応を行い、cDNAの集団を作製することができる。あるいは、リボソームRNAを除去した後にcDNAの集団を作製することができる。逆転写プロセスの間に、例えば逆転写反応に使用するランダムなプライマーの突出部を使用することによって指標を付加することができ、したがって、それにより、作製したcDNA配列をゲノムDNA配列と区別することができる。次いで、ゲノムDNA配列とcDNA配列の両方を含有する単一のライブラリーを作製することができる。
一部の実施形態では、試験試料由来のゲノムDNAおよびcDNAを別々に濃縮し、次いで、混合して、濃縮されたゲノムDNAとcDNAの単一の混合物を提供する。
目的の核酸を濃縮すること
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、目的の核酸を濃縮するステップを含む。当該方法は、一般には、核酸の混合物(または本明細書に記載のゲノムDNAライブラリーもしくはcDNAライブラリー)を、混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップを含む。本明細書に記載の濃縮方法により、分析される核酸配列の複雑さが低下し、プール内で目的の核酸がより良好に表されることが可能になる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、目的の核酸を濃縮するステップを含む。当該方法は、一般には、核酸の混合物(または本明細書に記載のゲノムDNAライブラリーもしくはcDNAライブラリー)を、混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップを含む。本明細書に記載の濃縮方法により、分析される核酸配列の複雑さが低下し、プール内で目的の核酸がより良好に表されることが可能になる。
したがって、一部の実施形態では、試験試料中の目的の核酸が濃縮された集団を得る方法であって、(a)試験試料から得たゲノムDNA配列およびcDNA配列を含む核酸の混合物を、核酸の混合物中に集合的に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸と前記プローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;および(b)前記プローブとハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップを含む方法が提供される。
一部の実施形態では、試験試料中の目的の核酸が濃縮された集団を得る方法であって、(a)試験試料から作製されたゲノムDNAライブラリーを、前記ゲノムDNAライブラリー中に存在する目的の核酸と相補的な第1のプローブのセットと、前記ゲノムDNAと前記第1のプローブのセットがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;(b)前記第1のプローブのセットとハイブリダイズしたゲノムDNAをハイブリダイズしていないゲノムDNAから分離し、それにより、目的のゲノムDNAが濃縮された集団を得るステップ;(c)試験試料から作製されたcDNAライブラリーを、前記cDNAライブラリー中に存在する目的のcDNAと相補的な第2のプローブのセットと、前記cDNAと前記第2のプローブのセットがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;(d)前記第2のプローブのセットとハイブリダイズしたcDNAをハイブリダイズしていないcDNAから分離し、それにより、目的のcDNAが濃縮された集団を得るステップ;(e)濃縮された前記目的のゲノムDNAと濃縮された前記目的のcDNAを混合して目的の核酸の集団を得るステップを含む方法が提供される。
一部の実施形態では、当該方法は、プローブのセットと混合物を接触させるステップの前に、核酸混合物(または本明細書に記載のゲノムDNAもしくはcDNA)を変性させるステップを含む。一部の実施形態では、当該方法は、プローブと混合物を接触させるステップの後に、核酸混合物(または本明細書に記載のゲノムDNAもしくはcDNA)を変性させるステップを含む。次いで、混合物を、プローブが目的の核酸が濃縮された集団とハイブリダイズすることが可能になるアニーリング条件に供する。
一部の実施形態では、目的の核酸は、癌遺伝子が位置する1つまたは複数の所望の領域を含む。一部の実施形態では、目的の核酸は、腫瘍抑制因子が位置する1つまたは複数の所望の領域を含む。一部の実施形態では、目的の核酸は、チロシンキナーゼが位置する1つまたは複数の所望の領域を含む。一部の実施形態では、目的の核酸は、ホスファターゼが位置する1つまたは複数の所望の領域を含む。一部の実施形態では、目的の核酸は、血管遺伝子が位置する1つまたは複数の所望の領域を含む。一部の実施形態では、目的の核酸は、遺伝子突然変異が位置する1つまたは複数の所望の領域を含む。
一部の実施形態では、目的の核酸は、疾患を示す一塩基変異を含む。一部の実施形態では、目的の核酸は、疾患試料において示差的に発現する遺伝子転写物に対応する。一部の実施形態では、目的の核酸は、疾患試料における転座事象を反映する。一部の実施形態では、目的の核酸は、疾患試料におけるコピー数変異を生じた核酸に対応する。一部の実施形態では、目的の核酸は、本明細書に記載の特性の2つ以上を集合的に有する核酸を含む。例えば、一部の実施形態では、目的の核酸は、一塩基変異を有する少なくとも1つの核酸および示差的に発現する遺伝子転写物に対応する少なくとも1つの核酸を含む。一部の実施形態では、目的の核酸は、転座事象を反映する少なくとも1つの核酸およびコピー数変異を伴う少なくとも1つの核酸を含む。一部の実施形態では、目的の核酸としては、これらに限定されないが、ゲノム、ゲノム内の遺伝子、コード領域、エクソン、イントロン、遺伝子間領域、イントロン/エクソン接合部、示差的に発現する遺伝子転写物、転座部位などの独特の配列が挙げられる。
プローブの数は、配列決定が望まれる試料材料の複雑さおよび配列の長さに基づいて選択することができる。本明細書に記載の方法は、単一のプローブまたは複数(すなわち、少なくとも2、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも500、少なくとも1000、少なくとも10,000、少なくとも100,000、またはそれ超の混合物)の異なるプローブを使用して行うことができる。これらのプローブを使用して、核酸配列の複数(すなわち、少なくとも2、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも500、少なくとも1000、少なくとも10,000、少なくとも100,000、またはそれ超)の異なる領域を濃縮することができる。
本明細書に記載の方法において使用されるプローブのセットは、所望の目的の核酸に基づいて選択される。本発明の方法を使用した目的の核酸の濃縮は、一部の実施形態では、これらの配列の所定の集団と相補的なプローブを設計し、それらを親和性結合体として使用して目的の核酸を核酸混合物内の望ましくない配列から分離することを伴う。
核酸の所定の部分と相補的なプローブは、当技術分野で周知の種々の供給源および方法から入手可能な核酸配列情報を使用して設計することができる。例えば、ゲノム配列を含めた核酸配列は、当業者に周知の種々の供給源のいずれかから入手することができる。そのような供給源としては、例えば、ユーザー由来の、公共のまたは民間のデータベース、定期購読供給源およびオンラインの公共のまたは民間の供給源が挙げられる。例えば、ゲノム配列および遺伝子配列を得るための例示的な公共のデータベースとしては、例えば、UCSCヒトゲノムデータベース、dbEST−human、UniGene−human、gb−new−EST、Genbank、Gb_pat、Gb_htgs、Refseq、Derwent GeneseqおよびRaw Reedデータベースが挙げられる。さらに、使用者が核酸配列情報を作製し、直接使用すること、または、例えばローカルデータベースに保存することができる。ゲノム情報およびトランスクリプトーム情報に関する当業者に周知の種々の他の供給源も存在し、プローブを作製するために同様に使用され得る。
本明細書に記載の方法において使用されるプローブは、これらに限定されないが、約10〜約50、約50〜約100、約100〜約120、約120〜約140、約140〜約160、約160〜約180、約180〜約200、約200〜約300、約300〜約400、または約400〜約500ヌクレオチドの長さを含めた任意の長さであってよい。一部の実施形態では、プローブは、約100、約105、約110、約115、約120、約125、約130、約135、約140、約145または約150ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、プローブは濃縮される核酸に対して過剰にもたらされる。例えば、一部の実施形態では、プローブは、濃縮される核酸の量の少なくとも約1倍、2倍、5倍、10倍、102倍、103倍、104倍、またはそれ超のいずれかである。一部の実施形態では、プローブは、濃縮される核酸の量の約10倍、102倍、103倍、または104倍以下である。一部の実施形態では、目的の核酸と比較してモル過剰(例えば、少なくとも約2×、5×、10×、15×、20×、30×、40×、50×、60×、70×、80×、90×、100×、または1000×、またはそれ超のいずれか)のプローブを使用する。
一部の実施形態では、プローブの少なくとも1つは、ゲノムDNA配列中に存在する目的の核酸およびcDNA配列中に存在する目的の核酸と相補的である。例えば、実施形態のいくつかでは、プローブは、ゲノムDNA配列とcDNA配列のどちらにおいても見出され得る遺伝子のエクソンと相補的である。一部の実施形態では、プローブは一本鎖である。一部の実施形態では、プローブは二本鎖であり、それにより、目的の核酸の両方の鎖に対する相補性を有する配列を含む。一部の実施形態では、プローブは、癌遺伝子、腫瘍抑制因子、キナーゼ、ホスファターゼ、細胞周期遺伝子、増殖因子遺伝子、受容体遺伝子、および/または血管遺伝子などの領域と相補的な配列を含む。一部の実施形態では、プローブは、Elim RightOn(商標)1000 cancer gene panelを含む。
接触させるステップは、固体支持体の不在下の溶液相プロセスで実施することができる。あるいは、接触させるステップは、固定化した試料核酸を用いて、または固定化したプローブを用いて実施することができる。プローブと核酸のハイブリダイゼーションを可能にするために、プローブと接触させる前またはプローブを添加した後に核酸の混合物を変性ステップに供する。
本明細書に記載のプローブと本明細書に記載の核酸の混合物を、核酸とプローブがハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させる。ハイブリダイゼーションの条件は、本発明では、一般に、当技術分野で公知の高ストリンジェンシー条件であるが、異なるストリンジェンシー条件を使用することができる。ストリンジェンシー条件は、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版(2001年)またはAusubelら、Current Protocols in Molecular Biology(1998年)に記載されている。高ストリンジェンシー条件はハイブリダイゼーションにおける忠実度の増大に有利であり、一方、ストリンジェンシーが低下するとより低い忠実度が許容される。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、異なる状況では異なるものになる。より長い配列はより高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範囲にわたる指針は、Tijssen、「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays」、Techniques in Biochemistry and Molecular Biology 8212; Hybridization with Nucleic Acid Probes(1993年)に見出される。一般に、ストリンジェントな条件は、定義済みのイオン強度およびpHで、特異的な配列の熱的融点(Tm)よりも約5〜10℃低くなるように選択される。Tmとは、標的と相補的なプローブの50%が標的配列と平衡状態でハイブリダイズする温度である(すなわち、標的配列は過剰に存在するので、Tmでは、プローブの50%が平衡状態で占有される)(定義済みのイオン強度、pHおよび核酸濃度の下で)。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどのへリックス不安定化剤の添加を用いて実現することもできる。ストリンジェンシーは、温度またはホルムアミドの濃度、塩、カオトロピック塩、pH、および/または有機溶媒などの熱力学的変数であるステップパラメータを変更することによって制御することができる。これらのパラメータは、米国特許第5,681,697号において概説されている通り、非特異的な結合を制御するためにも使用することができる。したがって、非特異的な結合を減少させるために、ある特定のステップをより高いストリンジェンシー条件で実施することが望ましい場合がある。
一部の実施形態では、プローブは、プローブおよびそれとハイブリダイズした核酸を認識し、分離することを可能にするタグを含む。ある場合では、タグは、リガンドに特異的に結合し、それにより、分離が容易になる。タグ/リガンドの例示的な対としては、これらに限定されないが、抗体/抗原、抗原/抗体、アビジン/ビオチン、ビオチン/アビジン、ストレプトアビジン/ビオチン、ビオチン/ストレプトアビジン、グルタチオン/GST、GST/グルタチオン、マルトース結合性タンパク質/アミロース、アミロース/マルトース結合性タンパク質、セルロース結合性タンパク質/セルロース、セルロース/セルロース結合性タンパク質などが挙げられる。タグを認識するリガンドを支持材料にカップリング(直接的または間接的に)することができ、それにより今度は分離の物理的手段または化学的手段がもたらされる。
一部の実施形態では、プローブを、核酸の混合物と接触させる前または接触させた後に、固体支持体(直接またはタグを介して)に付着させる。次いで、プローブとハイブリダイズしていない核酸は洗浄することによって分離して除くことができ、次いで、プローブとハイブリダイズした核酸は溶出ステップによって回収することができる。
適切な固体支持体としては、これらに限定されないが、プレート、チューブ、ビン、フラスコ、ビーズ、磁気ビーズ、磁気シート、多孔質マトリックス、または任意の固体表面などが挙げられる。例えば、濾過、単離、磁場、遠心分離、洗浄などによって物理的な分離を実施することができる。
一部の実施形態では、固体支持体は、ビーズ、膜、カートリッジ、フィルター、マイクロタイタープレート、試験管、固体粉末、流し込み成形または押出成形されたモジュール、メッシュ、繊維、磁気粒子複合物、または任意の他の固体材料である。固体支持体は、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ(4−メチルブテン(methulbutene))、ポリスチレン、ポリアクリレート、ポリエチレンテレフタレート、レーヨン、ナイロン、ポリ(ビニルブチレート)、ポリフッ化ビニリデン(PCDF)、シリコーン、ポリホルムアルデヒド、セルロース、酢酸セルロース、ニトロセルロースなどの物質でコーティングされていてよい。一部の実施形態では、固体支持体は、リガンドでコーティングされたものであってもよく、リガンドを浸透させたものであってもよい。
本明細書に記載の方法において使用することができる他の固体支持体としては、これらに限定されないが、ゼラチン、ガラス、セファロースマクロビーズ、CYTODES(登録商標)(Pharmacia、Uppsala、Sweden)などのデキストランマイクロキャリアが挙げられる。多糖、例えばアガロース、アルギン酸、カラギーナン、キチン、セルロース、デキストランもしくはデンプンなど、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリアクロレイン、ポリビニルアルコール、ポリメチルアクリレート、パーフルオロカーボン、無機化合物、例えばシリカ、ガラス、珪藻土(kieselquhr)、アルミナ、酸化鉄もしくは他の金属酸化物など、または2つもしくはそれ超の天然に存在するポリマー、合成ポリマーもしくは無機化合物の任意の組合せからなる共重合体も意図されている。一部の実施形態では、固体支持体は、カラム(例えば、セファロースカラムなど)である。
プローブは、当技術分野で公知のいくつかの方法によって固体支持体に付着させることができる。そのような方法としては、例えば、固体支持体上での直接化学合成による付着、化学的付着、光化学的付着、熱による付着、酵素による付着、および/または吸収が挙げられる。一部の実施形態では、プローブを、共有結合的に固体支持体に付着させる。一部の実施形態では、プローブを、共有結合によって固体支持体に付着させる。一部の実施形態では、プローブを、非共有結合的に、例えば、リガンド/タグ相互作用によって固体支持体に付着させる。
濃縮方法によって得られる複雑さのレベルの低下により、最初の核酸プールの複雑さを10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、99.5%、99.9%、99.99%、99.999%、またはそれ超低下させることが可能になり得る、または、必要な選択が核酸のほんの数パーセント、さらには数千の塩基対になり得る。例えば、核酸の複雑さは、最初のゲノムおよびトランスクリプトームのサイズならびに必要な低下のレベルに応じて、30億塩基対から10百万塩基対またはそれ未満までに低下し得る。この方法を使用して、例えばヒトゲノムDNAの40%を含む高度に反復性のDNA配列を複雑な集団から迅速かつ効率的に取り出すことができる。
一部の実施形態では、当該方法は、分析前に、例えばPCRによって目的の核酸を増幅するステップをさらに含む。そのような増幅は、例えば、目的の核酸を上記の固体支持体から溶出させる前またはその後に行うことができる。
核酸の分析
本明細書に記載のゲノムDNA配列およびcDNA配列を含む核酸混合物をさらに分析に供することができる。当該分析は、核酸混合物に対して直接行うことができ、または本明細書に記載の濃縮方法の後に目的の核酸が濃縮された集団に対して行う。
本明細書に記載のゲノムDNA配列およびcDNA配列を含む核酸混合物をさらに分析に供することができる。当該分析は、核酸混合物に対して直接行うことができ、または本明細書に記載の濃縮方法の後に目的の核酸が濃縮された集団に対して行う。
分析としては、これらに限定されないが、核酸配列決定、突然変異分析、多型の決定などを挙げることができる。本明細書に記載の方法は、核酸試料における突然変異を同定するため、薬物に対する個体の応答性を予測するため;個体における薬物の薬物動態学を予測するため、個体における治療の治療転帰を予測するために特に有用である。当該方法は、出生前スクリーニングのための遺伝子検査などの遺伝子検査にも有用であり得る。
核酸は、これらに限定されないが、例えば、DNA配列決定(Roche/454、Helicos、Illumina/Solexa、およびABI(SOLID)のSanger、パイロシークエンシングまたはシークエンシングシステムを使用する)、Life Technology(Ion Torrent)、ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ、ビーズアレイアッセイ、プライマー伸長アッセイ、酵素ミスマッチ切断アッセイ、分枝ハイブリダイゼーションアッセイ、NASBAアッセイ、分子ビーコンアッセイ、サイクリングプローブアッセイ、リガーゼ連鎖反応アッセイ、侵入型切断構造アッセイ、ARMSアッセイ、またはサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイを含めた任意の分析方法によって分析することができる。核酸分子の配列決定を行うこと、またはSNPもしくは参照配列と比較した他の差異の存在について分析することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法によって作製された核酸を、2つまたはそれ超のSNPSを含有する染色体領域のNPハプロタイプ決定のため、ペアエンド配列決定方法のためにDNA配列を濃縮するため、長い読み取り配列、隔離性逆位、欠失、および転座切断点に対する標的断片を作製するため、遺伝子領域全体(エクソンおよびイントロン)の配列決定を行って異常なスプライシングまたは調節を引き起こす突然変異を明らかにするために使用することができる。
一塩基多型(「SNP」)などの多型は、基本的にゲノム全体を通してランダムに分布している。多型は、一塩基の欠失、挿入、または塩基変化を含めた、任意の長さの配列の挿入、欠失、重複、または再編成であってよい。多型は、天然に存在するものであってもよく、変異表現型に関連するものであってもよい。本明細書に記載の方法の使用により、例えば、目的の配列の濃縮を通じて、集団内の異なる個体における、さらには単一の個体由来の異なる試料における実質的に類似した、複雑さが低下した亜集団の実質的に再現性のある利用が可能になる。多型は基本的にゲノム全体を通してランダムに分布しているので、核酸配列の複雑さが低下した集団にはいくつかの多型配列が存在する。そのような複雑さが低下した亜集団を分析して、多型を同定することもでき、その亜集団における多型遺伝子座の遺伝子型を決定することもできる。
本明細書に記載の方法は、例えば、多型遺伝子座の特定の対立遺伝子に関する知見と、集団内の個体の特定の薬物に対する応答の仕方の相互関係を明らかにしようとするものである薬理ゲノミクスの分野においても有用であり得る。あらゆる薬物について、個体の10%から40%までの間が最適に応答しないことが広く推定される。所与の薬物に対する応答プロファイルを作成するために、当該薬物を受けている個体の多型遺伝子座に関する遺伝子型と当該薬物の治療転帰の相互関係を明らかにしなければならない。これは、多数の多型遺伝子座の分析を用いて実施されることが多い。集団における多型遺伝子座を分析することにより遺伝学的な薬物応答プロファイルが推定されたら、特定の薬物に対する応答に関連する遺伝子座に関する臨床的な患者の遺伝子型を決定しなければならない。したがって、臨床的適用のための、薬物応答プロファイルの確立と個体の遺伝子型の同定の両方のために、多数の個体における多数の多型遺伝子座の配列を同定できることが重要である。
本明細書に記載の方法を使用して作製された核酸(例えば、アダプター(複数可)を含む一本鎖核酸およびプローブによって濃縮された核酸など)を、Illuminaシークエンシング法を使用した配列決定分析に供す。Illuminaシークエンシング法は、SBS前の液相一本鎖核酸の伸長および増幅において固相に結合したプライマーを使用する橋増幅技術を含む。(例えば、Mercierら(2005年)「Solid Phase DNA Amplification: A Brownian Dynamics Study of Crowding Effects.」Biophysical Journal 89巻:32〜42頁;Bingら(1996年)「Bridge Amplification: A Solid Phase PCR System for the Amplification and Detection of Allelic Differences in Single Copy Genes.」Proceedings of the Seventh International Symposium on Human Identification、Promega Corporation Madison、WI.を参照されたい)。
Illuminaシークエンシング技術には、ペアエンドアダプター配列が隣接した一本鎖核酸を調製することが伴う。ペアエンドアダプターのそれぞれは、独特のプライマーハイブリダイゼーション配列を含有する。核酸を、一本鎖核酸に隣接したアダプター上に存在するプライマーハイブリダイゼーション配列に対応する一本鎖オリゴヌクレオチドでコーティングされたフローセル表面上に分布させる。アダプターとライゲーションした一本鎖核酸はフローセルの表面に結合し、ポリメラーゼに基づく伸長のために試薬に曝露される。ライゲーションした断片の遊離/遠位末端が表面上の相補的なオリゴヌクレオチドと「架橋する」と刺激が起こり、アニーリングステップの間に、結合したプライマーの1つからの伸長産物が他の結合したプライマーと第2の橋鎖を形成する。変性および伸長の繰り返しにより、数百万の独特の位置に局在化した単一分子の増幅がもたらされ、フローセル表面にわたってクローンの「クラスター」が創製される。
次いで、フローセルを配列決定モジュール内のフルイディクスカセットに入れ、そこで、プライマー、DNAポリメラーゼ、および蛍光標識した可逆的に終結したヌクレオチド、例えば、A、C、G、およびTを添加して、各クラスター内の各クローンDNAへの一塩基の組み入れを可能にする。各組み入れステップの後に、フローセル全体の高分解能イメージングを行って、フローセル上の各クラスター位置に組み入れられたヌクレオチドを同定する。イメージングステップの後、化学的なステップを実施して、組み入れられたヌクレオチドの3’末端を遮断解除してその後の別のヌクレオチドの組み入れを可能にする。反復サイクルを実施して、それぞれが特異的なクラスターにおける一塩基伸長を示す一連の画像を作製する。このシステムにより、一般には、20〜50ヌクレオチドまでの配列読み取りが生じる。このシークエンシングシステムに関するさらなる詳細は、例えば、Bennettら(2005年)「Toward the 1,000 dollars human genome.」Pharmacogenomics 6巻:373〜382頁;Bennett, S.(2004年)「Solexa Ltd.」Pharmacogenomics 5巻:433〜438頁;およびBentley, D. R.(2006年)「Whole genome re-sequencing.」Curr Opin Genet Dev 16巻:545〜52頁において考察されている。
Illuminaシステムのための鋳型の調製の第1段階は、音エネルギー断片化(sound energy fragmentation)(Covaris)によるものなどのDNA断片化である。
本明細書において提供される方法は、Illuminaプラットフォームを用いた使用に容易に適合させることができる。具体的には、本明細書に記載のアダプター配列は、Illuminaシークエンシング法の目的に合うことが理想的である。
一部の実施形態では、配列決定は、ハイスループットな計器でのマルチプレックスシークエンシングにより、多数の試験試料(および対照試料)を同時に用いて行うことができる。これは、例えば、各試料について個々のバーコード配列を使用することによって実現することができ、したがって、これらをデータ解析の間に弁別することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法によって作製された核酸を、単一分子リアルタイムシークエンシングを使用して分析する。単一分子リアルタイムシークエンシング(SMRT)は、環状化一本鎖核酸についてハイスループットな様式で配列決定するために使用することができる別の大規模並列処理のシークエンシング技術である。Pacific Biosciencesにより開発され、市販されているSMRT技術は、例えば、何千もの配列決定反応を同時に行うことができる多重化ゼロモード導波管(ZMW)のアレイに依拠する。ZMWは、例えば、単一のDNAポリメラーゼによる一本鎖DNA分子の鋳型依存性の合成を観察するのに十分に小さな、照らされた観察体積を創製する構造である(例えば、Leveneら(2003年)「Zero Mode Waveguides for Single Molecule Analysis at High Concentrations」、Science 299巻:682〜686頁を参照されたい)。DNAポリメラーゼにより、相補的な蛍光標識されたヌクレオチドが合成されているDNA鎖に組み入れられると、当該酵素により検出体積内に各ヌクレオチドが数十ミリ秒、例えば、組み入れられなかったヌクレオチドが検出体積を出入りして拡散するのにかかる時間の量よりも長い桁にわたって保持される。この時間の間に、フルオロフォアにより蛍光が放出され、その色がヌクレオチド塩基の同一性に対応する。次いで、ヌクレオチドの組み入れサイクルの一部として、ポリメラーゼにより、定位置に予め保持されたフルオロフォアの結合が切断され、色素が検出体積の外に拡散する。組み入れ後、シグナルはすぐにベースラインに戻り、プロセスが繰り返される。ZMWの追加的な説明およびSMRTシークエンシングなどの単一分子分析へのそれらの適用は、例えば、そのそれぞれの全体があらゆる目的について参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2003/0044781号、および米国特許第6,917,726号に見出すことができる。Leveneら(2003年)「Zero Mode Waveguides for single Molecule Analysis at High Concentrations」、Science 299巻:682〜686頁およびEidら(2009年)「Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules.」Science 323巻:133〜138頁も参照されたい。
本明細書に記載の方法によって作製された核酸は、SMRTシークエンシングプラットフォームを用いた使用に適合させることができる。例えば、合成後、一本鎖DNA断片の分子内のライゲーションを触媒する酵素、例えば、CircLigaseTm、CircLigaseTm II、またはThermoPhageTmを使用して一本鎖核酸を環状化し、ZMWに分布させることができる。あるいは、娘鎖を、環状化する前に断片化することができる。場合によって、断片化された娘鎖の集団から、例えば、上記の通り、環状化前に目的の配列を濃縮することができる。
一部の実施形態では、当該方法は、データ解析をさらに含む。例えば、新規の配列決定には、配列決定読み取りの集合が必要である。全ゲノム/トランスクリプトーム解析には、参照データベースと比較することが必要である。RNA発現レベルの決定には、読み取り数を数量化するアルゴリズムが必要である。一塩基変異の決定には、参照配列と比較することが必要である。データ解析のためのツールおよびソフトウェアが当技術分野で公知である。
キットおよび製造品
本出願は、さらに、本明細書に記載の方法のいずれか1つのためのキットおよび製造品を提供する。方法の実行に使用される構成成分または物品はいずれも、キット内に、役立つように包装することができる。
本出願は、さらに、本明細書に記載の方法のいずれか1つのためのキットおよび製造品を提供する。方法の実行に使用される構成成分または物品はいずれも、キット内に、役立つように包装することができる。
例えば、キットは、逆転写酵素、プライマー、アダプター、ライブラリー構築用の試薬などを含めた、核酸混合物を作製するために有用な構成成分を含んでよい。一部の実施形態では、キットは、これらに限定されないが、プローブのセット、ハイブリダイゼーション試薬、固体支持体、増幅用試薬などを含めた、目的の核酸を濃縮するために有用な構成成分を含むまたはそれをさらに含む。一部の実施形態では、キットは、例えば、配列決定分析用試薬を含めた、混合物中の核酸を分析する(濃縮を伴うまたは伴わない)ために有用な構成成分を含むまたはそれをさらに含む。一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載の方法のいずれか1つまたは複数を実行するための説明書をさらに含む。一部の実施形態では、キットは、データを解析し、報告するためのソフトウェアをさらに含む。
Claims (32)
- 試験試料から、目的の核酸が濃縮された集団を得る方法であって、
(a)前記試験試料から得たゲノムDNA配列およびcDNA配列を含む核酸の混合物を提供するステップ;
(b)前記核酸の混合物を、前記核酸の混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸が前記プローブにハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;および
(c)前記プローブがハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ
を含む方法。 - 前記核酸の混合物が、前記試験試料から作製されたゲノムDNAライブラリーおよびcDNAライブラリーを混合することによって得られる、請求項1に記載の方法。
- 前記核酸の混合物が、(i)前記試験試料中のRNAをcDNAに逆転写するステップ、および(ii)ゲノムDNA配列およびcDNA配列を含むDNAライブラリーを作製して核酸の混合物を提供するステップによって得られる、請求項1に記載の方法。
- 前記プローブの少なくとも1つが、ゲノムDNA配列中に存在する目的の核酸およびcDNA配列中に存在する目的の核酸と相補的である、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ゲノムDNA配列およびcDNA配列が前記混合物中に所定の比率で存在する、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試験試料がヒト試料である、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記目的の核酸が、複数のエクソン配列、複数のイントロン配列、複数のイントロン−エクソン接合部、または非コード領域中の複数の配列を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プローブのセットが、少なくとも約100種の異なるプローブを含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プローブが、前記核酸混合物内の相補領域と比較して少なくとも約10×モル過剰で存在する、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プローブが、癌遺伝子、腫瘍抑制因子、チロシンキナーゼ、ホスファターゼ、または血管遺伝子と相補的な配列を含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プローブを、前記核酸の混合物と接触させる前または接触させた後に固体支持体に付着させる、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プローブおよび前記プローブにハイブリダイズした目的の核酸を前記固体支持体から溶出させるステップをさらに含む、請求項11に記載の方法。
- 前記目的の核酸を増幅するステップをさらに含む、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記濃縮された核酸を分析するステップをさらに含む、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記分析が、目的の前記濃縮された核酸の配列決定を行うステップを含む、請求項14に記載の方法。
- 試験試料中の核酸を特徴付ける方法であって、(a)前記試験試料から得たゲノムDNA配列およびcDNA配列を含む核酸の混合物を提供するステップ;および(b)前記混合物中の前記ゲノムDNA配列およびcDNA配列の配列決定を同時に行うステップを含む方法。
- 前記核酸の混合物が前記試験試料から作製されたゲノムDNAライブラリーおよびcDNAライブラリーを混合することによって得られる、請求項16に記載の方法。
- 前記核酸の混合物が、(i)前記試験試料中のRNAをcDNAに逆転写するステップ、および(ii)ゲノムDNA配列およびcDNA配列を含むDNAライブラリーを作製して核酸の混合物を提供するステップによって得られる、請求項16に記載の方法。
- 前記特徴付けが、前記試験試料中の前記ゲノムDNA配列における変異の決定を含む、請求項16から18に記載の方法。
- 前記ゲノムDNA配列における前記変異が、染色体再編成、一塩基変異(SNV)、またはコピー数変異(CNV)を含む、請求項19に記載の方法。
- 前記染色体再編成が、DNA配列の欠失、挿入、および転座を含む、請求項20に記載の方法。
- 前記特徴付けが、前記試験試料中のRNA転写物における変異の決定を含む、請求項16から21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記RNA転写物における前記変異が、欠失、挿入、転座、SNV、または示差的な遺伝子発現を含む、請求項22に記載の方法。
- 前記配列決定ステップの前に、前記核酸混合物を目的の核酸について濃縮するステップを含む、請求項16から23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記濃縮が、
(a)前記核酸の混合物を、前記核酸混合物中に存在する目的の核酸と相補的であるプローブのセットと、前記核酸が前記プローブにハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させるステップ;および
(b)前記プローブにハイブリダイズした核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離し、それにより、目的の核酸が濃縮された集団を得るステップ
を含む、請求項24に記載の方法。 - 前記配列決定ステップの前に、前記核酸が濃縮された集団に最初の核酸の混合物を添加するステップをさらに含む、請求項24または25に記載の方法。
- 前記配列決定ステップの前に、前記核酸が濃縮された集団にゲノムDNA配列を添加するステップをさらに含む、請求項24または25に記載の方法。
- 前記配列決定ステップの前に、前記核酸が濃縮された集団にcDNA配列を添加するステップをさらに含む、請求項24または25に記載の方法。
- 前記核酸混合物が、対照試料由来のゲノムDNA配列をさらに含む、請求項1から28のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸混合物が、対照試料由来のcDNA配列をさらに含む、請求項1から29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対照試料と前記試験試料が同じ個体由来である、請求項29または30に記載の方法。
- 前記対照試料と前記試験試料が異なる個体由来である、請求項29または30に記載の方法。
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