CN112708619B - Mgi平台的建库用接头、试剂盒及建库方法 - Google Patents

Mgi平台的建库用接头、试剂盒及建库方法 Download PDF

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Abstract

本申请提供了一种MGI平台的建库用接头、试剂盒及建库方法。其中，接头为由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的接头序列组成的单端index接头或由SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的接头序列组成的或者由SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示的接头序列组成的双端index接头。通过将现有的5’泡状接头改为3’泡状接头或Y型接头，同时设置与Y型接头结合使用的单独设置的陪伴序列，既实现PCR‑Free建库，又节省操作。且同时适用于单端index接头和双端index建库两种方式，而且部分还能兼容PCR建库方案。

Description

MGI平台的建库用接头、试剂盒及建库方法
技术领域
本发明涉及MGI测序仪的高通量测序文库构建领域，具体而言，涉及一种MGI平台的建库用接头、试剂盒及建库方法。
背景技术
高通量测序数据的临床意义主要体现在两个方面，一个是可以直接为被检测者诊断服务，另一个是作为大数据的一部分，积少成多为人类解析未认知的疾病做数据积累，这部分起到数据支持作用，也是参考作用。市场对测序的需求是，既要能够解决问题，又要成本低，使更多人受益，因此若测序量少就能解决问题，就不必测更多的数据量。然而要保证测序量更少的情况下还能解决问题，就需要在其他技术环节提高质量，从而降低对更多数据量的依赖。其中，提高建库环节的技术水平，提升建库质量是解决数据量少即可实现测序目的的核心。
随着高通量测序在应用领域重要性的不断提升，如何降低测序成本和保证数据的准确性是两个非常关键的问题。测序成本的降低主要是两个方向，华大智造(MGI)不断推出了更高测序通量的测序仪，从而测序成本不断降低，相继推出的MGI-200、MGI-2000和T7测序仪，其中T7测序仪是目前市场上测序通量最高和测序成本最低的测序仪。此外，还可以通过缩短和简化建库流程，来减少试剂和人力成本。
而在数据准确性方面，也已有些措施来保证。比如，在MGI的建库过程中，需要连接测序接头和PCR对文库进行富集，在MGI的早期建库过程中是单端标签接头建库，为了防止标签跳越问题，双端标签的建库方式应运而生。
然而，在PCR富集的过程在带来放大文库量的同时，也带来了偏差(PCR存在扩增偏好性，且容易积累并放大随机突变)，在全基因组测序的应用过程中也带来一些扩增误差，其中在分析片段重复和缺失时影响尤为严重。比如，在利用高通量测序的方法评估拷贝数变化时，尤其是在利用孕妇的血浆DNA在判断胎儿的拷贝数变化情况时，由于血浆DNA中母体的碎片DNA占大部分，这时评估胎儿的拷贝数就更需要实验过程的偏差比较小才能解决大片段的拷贝数变化，或者染色体层面的缺失或重复等类似问题。通过PCR扩增的方式建库的好处是能够使文库片段放大富集，坏处是带来扩增产生的偏差，这种偏差往往会掩盖真实差异，提升背景噪音，为检测的准确性增加了难度。
因此，建立一种有效的PCR-Free的建库方案就显得尤为重要，既可以减少建库步骤降低成本，也可以提升文库质量，是一种理想的建库方式。由于MGI的接头是泡状接头，有一段陪伴序列，在通过PCR建库时该陪伴序列可以通过PCR过程去掉，但如果通过PCR-Free的方式进行建库，尤其在双端标签的建库过程中，由于双端标签的接头很长，如何在去掉陪伴序列的同时保持双端标签接头的稳定性，便成为MGI测序平台开发PCR-Free建库方法所亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种MGI平台的建库用接头、试剂盒及建库方法，以解决现有技术中的MGI平台建库用接头难以有效进行PCR-Free建库的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种MGI平台的建库用接头，接头为单端index接头或双端index接头，其中，单端index接头由SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2所示的接头序列组成；双端index接头由SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的接头序列组成；或者双端index接头由SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示的接头序列组成；SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9中的10个n形成的序列为index序列，SEQ ID NO：9中的rU表示尿嘧啶核糖核苷酸。
根据本发明的另一方面，提供了一种MGI平台的建库用试剂盒，该试剂盒包括接头，其特征在于，接头为上述MGI平台的建库用接头。
进一步地，试剂盒还包括陪伴序列，陪伴序列与接头序列单独设置。
进一步地，接头为单端index接头，陪伴序列为SEQ ID NO：10所示序列：CCTAAGACCGCTTGGCCn1n2n3TAGCCATGTCGTTC/3’封闭修饰/，其中n1n2n3与单端index接头的序列互补或不互补，3’端的封闭修饰为如下任意一种修饰：SpC3、SpC6、MGB、磷酸化、地高辛、生物素或者为双脱氧碱基。
进一步地，n1n2n3与单端index接头的序列不互补，陪伴序列为SEQ ID NO：3所示的序列。
进一步地，n1n2n3与单端index接头的序列互补，陪伴序列为SEQ ID NO：4所示的序列；或者为SEQ ID NO：4所示的序列从两端缺失1个、2个或3个核苷酸后的序列。
进一步地，接头为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的接头序列组成的双端index接头，陪伴序列为SEQ ID NO：7。
根据本发明的另一方面，提供了一种MGI平台的PCR-Free建库方法，该建库方法包括：将接头及可选的陪伴序列与片段化DNA进行连接，得到带接头DNA片段；对带接头DNA片段进行PCR扩增，得到MGI平台的测序文库；其中，接头和陪伴序列为上述任一种试剂盒中的接头和陪伴序列。
根据本发明的另一方面，提供了一种MGI平台的PCR建库方法，该建库方法包括：将接头及可选的陪伴序列与片段化DNA进行连接，得到带接头DNA片段；对带接头DNA片段回收纯化，得到MGI平台的测序文库；其中，接头和陪伴序列为上述任一种试剂盒中的接头和包含不互补碱基的单端index接头的陪伴序列；或者接头和陪伴序列为SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：6所示的接头序列组成的双端index接头及SEQ ID NO：7所示的陪伴序列。
进一步地，在将接头及可选的陪伴序列与片段化DNA进行连接之前，该建库方法还包括：将接头的两条序列及可选的陪伴序列进行退火的步骤。
应用本发明的技术方案，通过将现有的5’泡状接头改为3’泡状接头或Y型接头，同时设置与Y型接头结合使用的单独设置的陪伴序列，不仅能够实现PCR-Free建库，而且省去PCR扩增及后续去除陪伴序列的操作。更重要的是，单独设置的陪伴序列能够同时适用于单端index接头和双端index建库两种方式，而且部分还能兼容PCR建库方案。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了目前MGI测序平台的单端index(A)和双端Index(B)的接头结构示意图。
图2示出了PCR-Free建库可以选择的接头全长结构，其中A为华大智造提供的单端Index泡状全长接头；B为是华大智造相同方式的双端index泡状全长接头；C为本发明提供的一种单端index辅助全长接头；D为本发明提供的一种双端index辅助全长接头。
图3示出了两种不同的泡状接头示意图，A为华大智造改进思路提供的双端index5’端泡状全长接头，B为本发明提供的一种双端index 3’端泡状全长接头；
图4示出了在互补区域长度不变的情况下，不同长度的泡状区域对接头稳定性的影响；
图5示出了本发明改进的PCR-Free接头连接效率评估；
图6示出了本发明改进的单端index的PCR-Free接头和陪伴序列之间的关系；
图7示出了本发明改进的双端index的PCR-Free接头和陪伴序列之间的关系；
图8示出了单端index的不同陪伴序列对PCR扩增建库方案的兼容性影响；
图9示出了双端index的陪伴序列对PCR扩增建库方案的兼容性影响。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
术语解释：
单端Index接头：高通量测试时需要每个片段末端连接通用的测序街头，接头的非互补区域的一端有一个可变区域序列是Index序列，另一条是通用序列。
双端Index接头：高通量测序时需要每个片段末端连接通用的测序接头，接头的非互补区域各有一个可变序列区域序列是Index序列(即标签序列)，是用来测序时拆分数据用。
PCR-Free建库：高通量文库构建过程中，需要片段破碎，补平加A，接头连接，纯化,PCR扩增和扩增后纯化，PCR-Free建库就是不包含PCR扩征和扩增后纯化。
辅助序列：本发明是指在接头退火中起辅助作用的一段序列，此序列在接头连接完成后其“使命”就完成了。
需要说明的是，本申请中所提及的MGI测序平台用的单端index接头长度是25bp和58bp，单端标签在58bp的序列上是10bp，25bp端没有标签序列；双端index接头长度是72bp和60bp，两端序列大概中部都有10bp的标签序列，标签序列都是10bp的长度。
Illumia的全长型Y型接头，既可以进行PCR扩增建库，也可以进行PCR-Free建库，在接头上并不需要进行任何改进处理就可以实现PCR-Free建库。与Illumina的Y型接头完全不同的是，MGI的测序仪的接头是泡状接头，不论是全长型的泡状接头还是截断型的泡状接头，都需要通过PCR扩增的方式把13bp的陪伴序列去掉，才能形成完整的全长型文库结构。
其中，MGI单端接头结构如图1中A所示，是中间不互补，两端互补的泡状结构(A中泡状结构之前的互补序列即为13bp的陪伴序列)，在连接完接头后，通过PCR扩增的方式把13bp的陪伴序列去除。另一个必须去除陪伴序列的因素是由于MGI测序平台的测序在上机前需要环化成环状的中间体(即DNB，DNA纳米球)才能上机测序，所以末端不能多碱基和少碱基，同时需要末端磷酸化，这些都不允许末端带有陪伴序列。在MGI的双端index的接头中，由于接头两端都带有10bp的标签序列，所以最简单可行的方式是先连接通用接头，再通过PCR扩增的方式把末端的index带到完整的文库上，来实现双端index的完整构建，见图1中B所示。如前述，相对于单端index的建库方式，双端index的存在可以解决由于index的跳越导致的样本之间相互污染。
需要说明的是，本申请中的陪伴序列是指对泡状接头起到稳定作用的序列(包括MGI现有泡状接头上的陪伴序列)，其与文库环化过程中的环化陪伴序列不是同一序列。
上述所提到的MGI测序平台在构建好文库后，是需要将接头上的陪伴序列去除的具体原因在于：环化时有一个环化陪伴序列与文库的一条单链形成互补的结构，互补结构是完全互补，文库末端多碱基或少碱基都会影响完全互补。多一个或几个碱基就会有一个或几个碱基翘起来。少一个或几个碱基会缺一个或几个碱基。用于接头稳定的陪伴序列是不在环化范围内的序列，通常在PCR扩增的过程中是去除的。
为了利用MGI的测序接头实现PCR-Free的建库过程，华大智造提出的解决方案是：通过在陪伴序列前端加入一个U碱基的方式，如图2中A所示，在建库构建完文库后通过利用切割U碱基的酶(比如，USER酶，购自NEB)把陪伴序列去除，这是一个很好的方法，在单端index建库过程可以实现PCR-Free建库。但是在双端index建库过程中，如果还是这样的实现过程，由于泡状部分过长，其稳定性是一个很大的问题，如图2中B所示，这种接头结构由于中间不互补的区域过大，很难形成稳定的二级结构。为了突破这种泡状结构的束缚，本发明尝试提出一种可以解决该二级结构稳定性的可行方案，此方案的改进思路是：把现有连接在接头上的13bp的陪伴序列去除，然后用一段单独的陪伴序列来稳定二级结构，这样既实现了稳定的二级结构，又不用到后期切除，其本身只作为陪伴序列，而不是接头的一部分。这样即实现了单端index的PCR-Free建库，如图2中C所示，也解决了双端index的PCR-Free建库问题，如图2中D所示。
这种方案可以起到稳定接头由于前端互补序列过短导致的退火不稳定，通过在不配对区域靠近配对区域引入一段序列来稳定二级结构，这段序列一半和一条接头结合形成互补序列，另一半和另一条接头形成互补序列来达到稳定互补区域过短的Y型接头的结构，这种序列又不需要特别去除，起作用的同时又不需要去除操作，比泡状接头引物的陪伴序列成本低，又可以减少一步除去操作，达到的陪伴效果又明显，如图5所示，辅助Y型单端标签建库和辅助Y型双端标签陪伴建库都可以达到很好的建库效果。
本发明的另一种实现方式，由于双端index两条序列长度不一样，一条是60bp，另一条是72bp，并且index前端的序列一个是32bp，另一个是42bp，所以在用第一种结构设计全长时的陪伴序列只能限定在13bp，由于index可变区域的限制，不能再延长此部分区域，如图3中A所示，但如果把两条序列反向，泡状向上改为泡状向下，其陪伴序列可以由13bp变为23bp，同时泡状结构区域也稍微变小，由64bp变为52bp，如图3中B所示的方案，这样就可以实现稳定的二级结构，完成建库后通过切割U的酶把陪伴序列去除即可。
在测试时发现，陪伴序列和泡状部分的大小与接头稳定的二级结构有严格的关系，当陪伴序列长度不变时，随着泡状结构的变大，稳定的二级结构也受到影响，对后期的建库效果产生严重影响，使得在相同投入量，相同的扩增循环数的文库产出差异明显。如图4所示，由于受泡状接头的限制，泡状部分前后互补的分别是7bp和13bp，当泡状部分是11+17时，接头结构比较稳定，文库产出最高，当互补区域不变，随着泡状部分的逐渐延长，文库产量也逐渐下降，说明互补区域的长度固定时，泡状区域不能无限延长，在固定的接头结构情况下是很难实现稳定的二级结构，所以MGI以前的PCR-Free的方案是不能延伸到双端index的接头上来实现PCR-Free的建库。而经过变换接头结构，使建成的最终文库还是和以前的一样，一样能够环化测序，由以前的分接头反向互补，互补区域可由7+13变成7+23，泡状区域可以由64变成52，变换后的结构就可以实现稳定的二级结构，也可以实现正常的文库构建，如图5所示，变换后的结构同样可以稳定建库产出。
因此，在上述研发结果的基础上，申请人提出了本发明的改进方案。在一种典型的实施方式中，提供了一种MGI平台的建库用接头，该接头为单端index接头或双端index接头，其中，单端index接头包括SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的接头序列组成；双端index接头由SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的接头序列组成；或者双端index接头由SEQ IDNO：8和SEQ ID NO：9所示的接头序列组成；SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQID NO：8和SEQ ID NO：9中的10个n形成的序列为index序列，SEQ ID NO：9中的rU表示尿嘧啶核糖核苷酸。
上述改进的MGI平台的建库用接头，相比现有MGI平台的泡状接头，要么是变成Y型接头，要么是将5’泡状结构改进为3’泡状结构，改进后的上述接头，除SEQ ID NO：8和SEQID NO：9所示的接头序列组成的双端index接头外，接头自身均不含陪伴序列，因而在进行PCR-Free建库时，仅需一段独立设置的序列作为陪伴序列以稳定两条接头序列退火形成的二级结构，而无需切除陪伴序列。或者当接头是双端index建库时，利用3’泡状结构的接头形成稳定的二级结构即可进行PCR-Free文库构建，后续通过能够切割U碱基的酶对接头中的陪伴序列切掉即可。
上述优选实施例中，本发明根据MGI现有单端Index的接头，提供了改进的单端index接头，其中通用接头序列1为SEQ ID NO：1：
/5’Phos/GAACGACATGGCTACGATCCGACTT；其中/5Phos/为磷酸化修饰；
单端index带标签序列2为SEQ ID NO:2：
/5’Phos/AGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAANNNNNNNNNNCAACTCCTTGGCTCACA：其中/5Phos/为磷酸化修饰，10个N是一端的index序列，该部分index序列可以采用申请号为202010838955.x的专利申请中的4平衡或8平衡的序列。
上述优选实施例中，本发明根据MGI现有双端Index的接头，提供了改进的双端index的接头序列1为SEQ ID NO:5：
/5’Phos/CTCTCAGTACGTCAGCAGTTNNNNNNNNNNCAACTCCTTGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTT；其中/5’Phos/为磷酸化修饰；
双端index的接头序列2为SEQ ID NO:6：
/5’Phos/AGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAANNNNNNNNNNCTGATAAGGTCGCCATGC：其中/5’Phos/为磷酸化修饰，10个N时单端index序列，该部分index序列可以采用申请号为202010838955.x的专利申请中的4平衡或8平衡的序列。
另一种优选方式，根据MGI双端Index的接头，将5’泡状结构改进为3’泡状结构，双端index通用接头序列1为SEQ ID NO:8(本处和SEQ ID NO:6一样的)：
/5Phos/CTCTCAGTACGTCAGCAGTTNNNNNNNNNNCAACTCCTTGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTT；其中/5Phos/为磷酸化修饰，10个N时单端index序列，该部分index序列可以采用申请号为202010838955.x的专利申请中的4平衡或8平衡的序列；
双端index的接头序列2为SEQ ID NO:9：
/5Phos/AGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAANNNNNNNNNNCTGATAAGGTCGCCATGC/rU/CGTTCTGTGAGCCAAGGAGTTG；其中/5Phos/为磷酸化修饰，/rU/是U碱基，10个N时单端index序列，该部分index序列可以采用申请号为202010838955.x的专利申请中的4平衡或8平衡的序列。
该优选实施例中，由接头的5‘泡状改为3’泡状，就是两个接头序列反向互补，由以前的72bp的序列是泡状长端部分，变为60bp的序列变成泡状长端部分，这样的好处是一个是减少泡状部分的长度，由64bp变为52bp，另一个好处是可选的陪伴序列区域变大，由13bp可以延长到23bp，这样可以保证接头结构的稳定性，如图3中A和B所示，A是5‘泡状，B是3’泡状接头，接头连接完成后可以通过U碱基切割酶把陪伴序列切掉，变成全长接头从而实现PCR-Free建库，这种方法得到的最终文库可以进行环化和测序。由于5‘泡状的泡状结构变大后，陪伴互补区域是7+13bpb并不能形成稳定的二级结构，如图4所示，当互补序列是7+13时，随着泡状部分增加长度，接头的稳定性下降，最终导致文库产出降低。
根据上述接头结构的改进及其相应的效果，可知新的接头及其配合使用的陪伴序列，可以组合在一起制备成文库构建试剂盒。因此，在第二种典型的实施方式中，提供了一种MGI平台的建库用试剂盒，该试剂盒包括上述任一方案的MGI平台的建库用接头。
需要说明的是，上述试剂盒根据其中的接头是单独index接头，还是双端index接头，都可以采用前述的一段单独设计的序列作为陪伴序列。对于双端index接头，且为具有3’泡状结构的双端index接头，其陪伴序列设置在接头序列上，因而无需单独设置的陪伴序列即可实现PCR-Free建库。
当接头为其他情况时，则需要陪伴序列来稳定接头的二级结构，提高文库建库效率的同时，提高文库质量。在一种优选实施例中，该试剂盒还包括陪伴序列，陪伴序列与接头序列单独设置。通过单独设置陪伴序列，既能实现结构二级结构的稳定，又不会对后续的环化上机测序产生不利影响。
上述单端index接头的陪伴序列可以有多种，比如，该陪伴序列的两端可以与两条接头序列完全互补、结合某条接头序列的一端存在3碱基的不互补，或者在远离接头互补区域的一端上可以有0～3个核苷酸的缺失，只要保证陪伴序列与接头两条序列的上下游有各有13-17bp的互补区域即可。
在一种优选实施例中，上述接头为单端index接头，陪伴序列为SEQ ID NO：10所示序列：CCTAAGACCGCTTGGCCn1n2n3TAGCCATGTCGTTC/3’SpC3/，其中n1n2n3与单端index接头的序列互补或不互补。
此处的不互补包括多种情况，可以是1个、2个或3个碱基不互补，3个碱基不互补的情形又包括缺失3个碱基或有3个碱基但各不互补的情形。
在一种优选实施例中，n1n2n3与单端index接头序列的一端不互补，陪伴序列为SEQ ID NO：3所示的序列：CCTAAGACCGCTTGGCCTAGCCATGTCGTTC/3SpC3/；其中/3’SpC3/为3’端的封闭修饰。
在一种优选实施例中，n1n2n3与单端index接头序列的一端互补，陪伴序列为SEQID NO：4所示的序列：CCTAAGACCGCTTGGCCTCGTAGCCATGTCGTTC/3’SpC3/；其中/3’SpC3/为3’端的封闭修饰；或者为从SEQ ID NO：4所示序列的两端3bp以内的核苷酸任意缺少1个、2个或3个核苷酸后的序列(比如，缺少5’端的C、CC或CCT，或者缺少3’端的C、CT或CTT；再或者从5’端和3’端同时缺少1个、2个或3个核苷酸；还可以是一端缺少1个，另一端缺失2个或3个等各种组合的形式)。
上述单端index接头的陪伴序列的3’端进行了封闭修饰，修饰的目的只让陪伴序列起陪伴作用，不能在后期的任何环节转化成引物起作用。需要说明的是，本发明中的封闭修饰并不局限于SpC3，还可以采用其他的封闭修饰，比如SpC6、MGB、磷酸化、地高辛、生物素或者为双脱氧碱基。
上述陪伴序列中，更优选SEQ ID NO:3所示的陪伴序列，该陪伴序列的特点是：如图6所示(图中的序列即为SEQ ID NO：1至3所示)，与接头一端有三个碱基不互补，这样处理的目的是使该接头能够兼容PCR建库方案，在PCR扩增或者PCR扩增评估时不被扩增引物当成模板识别，从而带来不必要的麻烦。
上述陪伴序列也可以是SEQ ID NO:4，该陪伴序列和接头完全互补，这种方案仅用于PCR-Free建库，不能兼容PCR建库和用PCR方法评估。对于完全互补的这种情况，还可以是在SEQ ID NO：4上下游缺少1、2或3个核苷酸的情况，只要保证陪伴序列和上下游有各有13-17bp的互补都可以实现上述功能。
当接头为双端index接头时，可以采用与上述单端index类似的策略，单端设置泡状结构之前的陪伴序列。在一种优选实施例中，接头为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的接头序列组成的双端index接头，陪伴序列为SEQ ID NO：7。
与前述单端index的陪伴序列的作用类似，此处双端index接头的陪伴序列的3’端进行了封闭修饰，修饰的目的只让陪伴序列起陪伴作用，不能在后期的任何环节转化成引物起作用。其中SEQ ID NO:7所示的陪伴序列，与接头两端完全互补，此处与单端index的方案不同，这样处理的好处是可以兼容PCR建库方案，因为PCR扩增引物不在这个结合区域，并不会当作模板扩增，因此，拐角处可以有1-3个碱基互补并不影响PCR建库应用(如图7所示)，只要保证陪伴序列和上下游有各有13-17bp的互补就可以实现上述稳定的功能。
当接头为双端index接头时，还可以将MGI双端Index的接头的5’泡状结构改成3’泡状结构。如图3中A和B所示，将A中5‘泡状的接头改为B中的3’泡状的接头(也即两个接头序列反向互补，由以前的72bp的序列是泡状长端部分，变为60bp的序列变成泡状长端部分)。这样一方面减少泡状部分的长度，由64bp变为52bp，另一方面使陪伴序列的可选区域变大，由13bp可以延长到23bp，这样可以保证接头结构的稳定性，连完接头可以通过U碱基切割酶把陪伴序列切掉，变成全长接头从而实现PCR-Free建库，进而能够实现后续的环化和测序。
在本申请第三种典型的实施方式中，提供了一种MGI平台的PCR-Free建库方法，该建库方法包括：将接头及可选的陪伴序列与片段化DNA进行连接，得到带接头DNA片段；对待接头DNA片段回收纯化，得到MGI平台的测序文库；其中，接头和陪伴序列为上述任一种试剂盒中的接头和陪伴序列。
利用本申请改进的接头结构，或者结合单独设置的陪伴序列，不仅能够实现PCR-Free建库，而且省去PCR扩增及后续去除陪伴序列的操作。更重要的是，单独设置的陪伴序列能够同时适用于单端index接头和双端index建库两种方式。而且部分还能兼容PCR建库方案。
在本申请第四种典型的实施方式中，提供了一种MGI平台的PCR建库方法，该建库方法包括：将接头及可选的陪伴序列与片段化DNA进行连接，得到带接头DNA片段；对待接头DNA片段进行PCR扩增，得到MGI平台的测序文库；其中，接头和陪伴序列为上述试剂盒中的接头和包含不互补碱基的单端index接头的陪伴序列；或者接头和陪伴序列为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的接头序列组成的双端index接头及SEQ ID NO：7所示的陪伴序列。
为了维持接头稳定的二级结构，提高接头连接效率，上述接头和陪伴序列在与片段化DNA连接之前，先将组成接头的两条序列及可选的陪伴序列进行退火处理。
下面将结合具体的实施例来进一步说明本申请的有益效果。
需要说明的是，以下实施例采用NadPrepTMDNA文库构建试剂盒(for MGI)(201909Version2.0)(纳昂达(南京)生物科技有限公司)所提供的文库构建流程进行。还需要说明的是，以下实施例仅是示例性说明，并不限定本申请的方法仅能采用如下方法。具体流程简述如下：
血浆片段化DNA或gDNA经过超声打断/酶切片段化---末端修复和加A---接头连接---文库纯化---定量和环化---使用MGI平台测序。
实施例1单端index的Y型全长接头，有一条陪伴序列增加接头的稳定性的PCR-Free方案
步骤：文库构建参考NadPrepTMDNA文库构建试剂盒(for MGI)(201909Version2.0)说明书进行。其中接头是下列3条序列组成，退火在一起当全长接头利用，此处的接头不同于普通的建库接头，陪伴序列并不是任何接头序列的一部分，而是单独的，只起陪伴作用。
接头退火的序列如下表：
表1：
Figure GDA0003517567200000091
Figure GDA0003517567200000101
1.接头退火反应体系如下：
表2：
10mM Tris，50mMNaCL和1mM EDTA 20μl
SEQ ID NO:1(100μM) 15μl
SEQ ID NO:2(100μM) 15μl
SEQ ID NO:4(100μM) 15μl
H<sub>2</sub>O 35μl
总体积 100μl
2.退火条件如下表进行
表3：
步骤 温度 时间 说明
1 95度 2分钟 变性
2 每30秒下降0.5度降至25度 约80分钟 退火
3 4度 长时间保持 暂停存放
3.退火后的接头浓度是15μM，不同于NadPrepTMDNA文库构建试剂盒(for MGI)(201909Version2.0)(纳昂达(南京)生物科技有限公司)的标准操作(接头连接后进行PCR扩增)之处在于：本发明的接头连接后直接回收纯化，回收时为了增加文库浓度，洗脱体积可以是10μL。
4.文库可以用定量PCR的方法对文库进行定量后，环化准备上机测序。
实施例2单端index的Y型全长接头，由一条一段有3个碱基不互补的陪伴序列增加接头的稳定性的PCR-Free方案
此方案和实施例1类似，与实施例1的区别点在于陪伴序列和接头一端的互补序列有3个碱基不互补，此改变的目的是使这个PCR-Free的建库方案能够兼容PCR扩增建库方案。
表4：
Figure GDA0003517567200000111
此方案的目的是既可以做PCR-Free，陪伴序列可以起到稳定接头的作用，同时由于陪伴序列和接头之间的一侧有3个碱基的不互补配对，可以在用于PCR扩增的过程中陪伴序列不被PCR扩增引物识别扩增，如图6所示的结构，经过PCR扩增，陪伴序列是不能被扩增引物识别，所以看不到前面有干扰带出现，如图8中B所示；如果是用实施例1，用PCR扩增就会有69bp的杂带产生，如图8中A所示。因此实施例2的改进方案既适用于PCR-Free建库，也适用于PCR建库。
实施例3双端index的Y型全长接头，有一条陪伴序列增加接头的稳定性的PCR-Free方案
步骤：文库构建参考NadPrepTMDNA文库构建试剂盒(for MGI)(201909Version2.0)说明书进行。其中接头是下列3条序列组成，退火在一起当全长接头利用，此处的接头不同于普通的PCR建库接头，陪伴序列并不是任何接头序列的一部分，而是单独的，只起陪伴作用。
接头退火的序列如下表：
表5：
Figure GDA0003517567200000112
Figure GDA0003517567200000121
表6：
1.接头退火反应体系如下：
10mM Tris，50mMNaCL和1mM EDTA 20μl
SEQ ID NO:5(100μM) 15μl
SEQ ID NO:6(100μM) 15μl
SEQ ID NO:7(100μM) 15μl
H<sub>2</sub>O 35μl
总体积 100μl
由于双端index的接头比较长，陪伴序列只在接头里面，并不会和扩增引物重叠，所以此方案既可以是PCR-Free方案，也可以是进行PCR扩增的兼容方案，如图7所示，陪伴序列可以是和接头拐角处完全互补配对不影响后期PCR扩增，如图9所示，文库没有干扰的杂带产生，说明此方案可兼容PCR-Free建库和PCR建库。
实施例4双端index的泡状型全长接头，通过延长陪伴序列的方式达到稳定的接头结构，连接后，通过酶切的方式去除陪伴序列
接头退火的序列如下表：
表7：
Figure GDA0003517567200000131
1.接头退火反应体系如下：
表8：
10mM Tris，50mMNaCL和1mM EDTA 20μl
SEQ ID NO:8(100uM) 15μl
SEQ ID NO:9(100uM) 15μl
H<sub>2</sub>O 50μl
总体积 100μl
步骤：文库构建参考NadPrepTMDNA文库构建试剂盒(for MGI)(201909Version2.0)说明书进行。连接用上述退火的接头，连接后的产物直接加入切割U碱基的酶，NEB公司(货号：M5505L)去除U碱基的酶。
从上述实施例可以看出，本发明中的接头的设计构思与华大智造的接头设计构思是不一样的，华大智造的单端index接头的PCR-Free建库思路，不能延伸到双端index接头的PCR-Free建库方案中。具体如下：
华大智造PCR-Free建库的核心内容如图2中A(单端index接头PCR-Free建库)所示，在延伸到图2中B(双端index接头的PCR-Free建库)时，本发明在测试中发现互补区域是7bp+13bp的互补，随着泡状部分变大稳定性会降低。如图4所示，泡状部分由21bp+11bp到64bp+11bp，稳定性逐渐降低，所以华大智造的PCR-Free建库方法不能由单端index方案延续到双端index的方案。
而本发明的一个改进思路是，接头反向互补，由偏长的一段在泡状区域改为偏短的一段在泡状区域。这样的改变有两点改进：一个是互补区域由13bp+7bp变为23bp+7bp，泡状环部分由64bp+11bp变为52bp+11bp，如图3所示的两种。后经过验证确定本发明的改进方案是能够稳定的进行建库得到所需要的文库，如图5所示的建库质控结果。本发明的在连接接头后可以用U碱基的酶把陪伴序列切除，不用PCR扩增就可以进行下面的环化处理进行上机测序。
综上所述，本发明针对MGI平台的单端和双端Index文库的PCR-Free构建方案提出了两种主要的解决方案，第一种解决方案的主要发明点在于通过一段独立设计的非接头组成序列的陪伴序列来提升接头的稳定性，由于接头前端的互补序列只有7bp，通过一条26-34bp的陪伴序列实现和两条接头各13-17bp的互补结构来稳定接头的二级空间结构，能够使连接顺利进行，连接后陪伴序列不用特殊处理即可进行后续的文库质控和环化上机测序。第二种方案，主要是针对双端index进行改进设计，由双端index的接头一条为60bp，另一条是70bp，如果和华大智造相同的方案是不能由单端index的方案延伸到双端应用，由互补区是13+7bp稳定环状64+11bp的接头不能形成稳定的二级结构，导致连接效率减低。而本发明通过两条接头反向互补的方式，改进成互补区是23+7bp稳定环状52bp+11bp，这样增加了接头的二级结构的稳定性，促进了连接的进行，连接后通过U碱基切割酶去除陪伴序列的方式实现PCR-Free建库。由此可见，本发明的两种方案都能实现PCR-Free建库，进而降低由于PCR扩增导致的偏差，使MGI测序平台的测序准确性得到提升。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 纳昂达（南京）生物科技有限公司
<120> MGI平台的建库用接头、试剂盒及建库方法
<130> PN146798SZGQ
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<223> MGI单端index接头序列1,5'端磷酸化修饰
<400> 1
gaacgacatg gctacgatcc gactt 25
<210> 2
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(58)
<223> MGI 单端index接头序列，5'磷酸化修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(41)
<223> 单端index序列
<400> 2
agtcggaggc caagcggtct taggaagaca annnnnnnnn ncaactcctt ggctcaca 58
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(31)
<223> 包含不互补碱基的陪伴序列，3'端封闭修饰
<400> 3
cctaagaccg cttggcctag ccatgtcgtt c 31
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(34)
<223> 单端index陪伴序列，3’端封闭修饰
<400> 4
cctaagaccg cttggcctcg tagccatgtc gttc 34
<210> 5
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(72)
<223> MGI 双端index接头序列，5'端磷酸化修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(30)
<223> 双端中的一端的index序列
<400> 5
ctctcagtac gtcagcagtt nnnnnnnnnn caactccttg gctcacagaa cgacatggct 60
acgatccgac tt 72
<210> 6
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(59)
<223> MGI 双端index接头序列，5'端磷酸化修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(41)
<223> 双端中的一端的index序列
<400> 6
agtcggaggc caagcggtct taggaagaca annnnnnnnn nctgataagg tcgccatgc 59
<210> 7
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(34)
<223> MGI双端index陪伴序列，3'端封闭修饰
<400> 7
cctaagaccg cttggcctcg tagccatgtc gttc 34
<210> 8
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(30)
<223> MGI双端中的一端的index序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(72)
<223> MGI双端index 3'泡状结构接头序列，5’端磷酸化修饰
<400> 8
ctctcagtac gtcagcagtt nnnnnnnnnn caactccttg gctcacagaa cgacatggct 60
acgatccgac tt 72
<210> 9
<211> 82
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(82)
<223> MGI双端index3'泡状结构接头，5'磷酸化修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(41)
<223> MGI双端中一端的index序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(59)
<223> U核苷酸用于后续切掉陪伴序列
<400> 9
agtcggaggc caagcggtct taggaagaca annnnnnnnn nctgataagg tcgccatgcu 60
cgttctgtga gccaaggagt tg 82
<210> 10
<211> 34
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(34)
<223> MGI单端index接头陪伴序列，3'端封闭修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(21)
<223> 与接头序列互补或不互补区
<400> 10
cctaagaccg cttggccnnn tagccatgtc gttc 34

Claims (5)

1.一种MGI平台的建库用试剂盒，所述试剂盒包括接头，其特征在于，所述接头为单端index接头或双端index接头，其中，
所述单端index接头由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的接头序列组成；
所述双端index接头由SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的接头序列组成；或者所述双端index接头由SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示的接头序列组成；
所述SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9中的10个n形成的序列为index序列，所述SEQ ID NO：9中的rU表示尿嘧啶核糖核苷酸，
当所述接头为所述单端index接头或所述接头为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的接头序列组成的双端index接头时，所述试剂盒还包括陪伴序列，所述陪伴序列与所述接头序列单独设置；
所述接头为所述单端index接头时，所述陪伴序列为SEQ ID NO：10所示序列：
CCTAAGACCGCTTGGCCn1n2n3TAGCCATGTCGTTC/3’封闭修饰/，其中n1n2n3与所述单端index接头的序列互补或不互补，3’端的所述封闭修饰为如下任意一种修饰：SpC3、SpC6、MGB、磷酸化、地高辛、生物素或者为双脱氧碱基；
所述接头为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的接头序列组成的双端index接头时，所述陪伴序列为SEQ ID NO：7。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，n1n2n3与所述单端index接头的序列不互补，所述陪伴序列为SEQ ID NO：3所示的序列。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，n1n2n3与所述单端index接头的序列互补，所述陪伴序列为SEQ ID NO：4所示的序列；或者
所述陪伴序列为SEQ ID NO：4所示的序列从两端缺失1个、2个或3个核苷酸后的序列。
4.一种MGI平台的PCR建库方法，其特征在于，所述建库方法采用权利要求1或2所述的试剂盒中配套单独设置有陪伴序列的单端index接头或双端index接头进行构建，所述建库方法包括：
将所述单端index接头或所述双端index接头与各自对应的所述陪伴序列进行退火，得到退火产物；
将所述退火产物与片段化DNA进行连接，得到带接头DNA片段；
对所述带接头DNA片段进行PCR扩增，得到MGI平台的测序文库；
当所述陪伴序列为SEQ ID NO：10，其中n1n2n3与所述单端index接头的序列互补时，所述陪伴序列为SEQ ID NO：4所示的序列从两端缺失1个、2个或3个核苷酸后的序列。
5.一种MGI平台的PCR-Free建库方法，其特征在于，所述建库方法采用权利要求1-3中任一项所述的试剂盒中的接头进行构建，
当所述接头为所述试剂盒中配套独立设置有陪伴序列的单端index接头或双端index接头时，所述建库方法包括：
将所述单端index接头或所述双端index接头与各自对应的所述陪伴序列进行退火，得到退火产物；
将所述退火产物与片段化DNA进行连接，得到带接头DNA片段；
对所述带接头DNA片段回收纯化，得到MGI平台的测序文库；
当所述接头为由SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示的接头序列组成的所述双端index接头时，所述建库方法为：
将所述双端index接头与片段化DNA进行连接，得到带接头DNA片段；
对所述带接头DNA片段回收纯化，得到MGI平台的测序文库。
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