JP2018500937A - Ｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ系タンパク質を使用する核酸の標的化枯渇、富化および分割のための組成物および方法 - Google Patents

Ｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ系タンパク質を使用する核酸の標的化枯渇、富化および分割のための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

試料から標的化核酸配列を枯渇し、試料から目的の配列について富化し、かつ／または試料から配列を分割するための方法および組成物が本明細書に提供されている。一態様では、試料を目的の配列について富化する方法であって、（ａ）目的の配列および枯渇のための標的化配列を含む試料を準備するステップであって、目的の配列は、試料の３０％未満を構成する、ステップと；（ｂ）試料を複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させるステップであって、ｇＲＮＡは、標的化配列に相補的であり、それによって標的化配列が切断される、ステップとを含む、方法が本明細書に提供されている。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、試料から目的の配列および枯渇のための標的化配列を抽出するステップをさらに含む。

Description

関連出願の引用
本願は、２０１４年１２月２０日に出願した米国仮出願第６２／０９４，９８０号および２０１５年７月２８日に出願した米国仮出願第６２／１９８，０９７号の優先権の利益を主張する。これらの出願の内容は、その全体がこれにより、本明細書中に参考として援用される。
多くのヒト臨床ＤＮＡ試料、またはＲＮＡに由来するｃＤＮＡライブラリーなどの試料ライブラリー、または組織、体液、もしくは他の宿主材料試料から採取される抽出ＤＮＡ試料は、有益な価値をほとんど有さず、配列決定のコストを増大させる高度に豊富な配列を含有する。これらの配列を枯渇させる（例えば、ハイブリダイゼーションキャプチャーを介して）方法が開発されているが、これらの方法は、時間のかかることが多く、非効率であり得る。さらにハイブリダイゼーションキャプチャーは、残りの配列を廃棄しながら目的のＤＮＡ配列を捕捉するように見えることが多い。結果として、ハイブリダイゼーションキャプチャーによる枯渇は、目的のＤＮＡ配列が前もって分かっていないとき、例えば、すべての微生物または非宿主ＤＮＡ配列を研究するために試料をスクリーニングするとき、実行可能な選択肢ではない。
微生物ＤＮＡを研究するためにヒト試料のショットガン配列決定を行うことができるが、多くの試料中の低レベルの微生物ＤＮＡが、コストに起因して多くの複雑なかつ／または興味深い試料のショットガンシークエンシングを妨げている。これは、例えば、試料が１つを超える種の生物（真核生物、原核生物、またはウイルス生物）を含有する、試料のメタゲノム解析に当てはまる。例えば、ヒト全血に由来するＤＮＡライブラリーは、９９％超のヒトＤＮＡを含有することが多い。したがって、ショットガンシークエンシングからヒト血液中に循環する感染因子を検出するのに、十分なカバレッジを保証するために非常に高いカバレッジまで配列決定する必要がある。よって、高いヒトＤＮＡ試料の配列決定に関連したコストの多くは、相対的に少ないメタゲノムデータをもたらす。結果として、多くのヒト組織ＤＮＡ試料は、単にデータ収量が要求されるリソースに比較して低いために、メタゲノム配列決定に不適当であると考えられている。よって、高宿主ＤＮＡ試料中の微生物ＤＮＡ収量を増大させる、具体的には、高宿主内因性（ＨＨＥ）ＤＮＡ試料を配列決定するとき配列決定される微生物ＤＮＡのパーセントを増大させる必要性が当技術分野において存在する。
ＤＮＡ抽出における最近の発展は、メタゲノミクスの分野がＰＣＲ増幅された１６ＳリボソームＲＮＡマーカーに焦点を当てることから全メタゲノムのショットガンシークエンシングに移行しているところまで、いくつかの配列決定技法をもたらした。しかし、ショットガンシークエンシングは、全試料材料中の微生物ＤＮＡの低パーセンテージに起因して、ＨＨＥ ＤＮＡ試料を配列決定するとき望ましいとはいえない結果を生じ得る。さらに、ショットガンシークエンシングは、特に、選択された分子（例えば、１６ＳリボソームＲＮＡ）が単一系統のみを代表するとき、メタゲノム解析において正確な分解をするのに十分な情報を提供することに失敗することが多い。さらに、１６ＳリボソームＲＮＡ系統はしばしば、臨床メタゲノム解析の重要な目標である、密接に関連した細菌の非病原性株から病原性株を識別することができない。
代わりに、全ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡ配列の使用は、メタ遺伝子解析（metagenetic analysis）に好適であり、その理由は、それがメタゲノム全体からの情報を提供するためである。よって、改善された分解を引き出すために、メタゲノム解析のためのＤＮＡおよびＲＮＡ配列決定技法を提供する必要性が当技術分野において存在する。例えば、肥満および正常体重患者の糞便材料からのメタゲノムの全ゲノム解析は、微生物群構造における高度に再現可能な差異を明らかにした。これらの材料は、非常に高い微生物ＤＮＡ含有量（９９％超の微生物および１％未満のヒト）を有する傾向がある。
対照的に、ヒト血液、膣、鼻粘膜、および肺を含めた多くの他の組織に由来するシークエンシングライブラリーは、典型的には９０％超のヒトおよび１０％未満の微生物ＤＮＡを含有する。１０％未満の微生物ＤＮＡを含む試料は、依然として、十分な配列決定で、メタゲノム解析のための十分な情報を生じ得るが、標的ＤＮＡがより少ない検体の配列決定に必要な量は高価であり、よって多くの研究者にとって支持できない。
よって、メタゲノム解析のための低コストの効率的な方法および組成物を達成する必要性が当技術分野において存在する。このような方法および組成物が本明細書に提供されている。
本明細書に引用されるすべての特許、特許出願、刊行物、文書、ウェブリンク、および論文は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
試料から標的化核酸配列を枯渇させ、試料から目的の配列について富化し、かつ／または試料から配列を分割するための方法および組成物が本明細書に提供されている。この方法および組成物は、生体試料、臨床試料、法医学試料、および環境試料に適用可能である。
一態様では、試料を目的の配列について富化する方法であって、（ａ）目的の配列および枯渇のための標的化配列を含む試料を準備するステップであって、目的の配列は、試料の３０％未満を構成する、ステップと；（ｂ）試料を複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させるステップであって、ｇＲＮＡは、標的化配列に相補的であり、それによって標的化配列が切断される、ステップとを含む、方法が本明細書に提供されている。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、試料から目的の配列および枯渇のための標的化配列を抽出するステップをさらに含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、抽出された配列を断片化するステップをさらに含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、抽出され断片化された配列の５’および３’末端をアダプターライゲーションするステップをさらに含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、切断された標的化配列は、サイズ排除によって除去される。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、切断された標的化配列は、ビオチンを使用して除去される。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、目的の配列を増幅するステップをさらに含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、枯渇のための標的化配列の後にプロトスペーサー隣接モチーフまたは（ＰＡＭ）配列が続く。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、試料を少なくとも１０２のユニークなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させるステップを含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、試料は、生体試料、臨床試料、法医学試料、または環境試料のいずれか１つである。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、試料は、枯渇のために標的にされる宿主核酸配列および目的の非宿主核酸配列を含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、非宿主核酸配列は、微生物核酸配列を含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、微生物核酸配列は、細菌核酸配列、ウイルス核酸配列、または真核生物寄生虫核酸配列である。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、試料をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させ、ｇＲＮＡは、リボソームＲＮＡ配列に対応するＤＮＡに相補的である。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、試料をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させ、ｇＲＮＡは、ミトコンドリアＤＮＡに相補的である。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、試料をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させ、ｇＲＮＡは、グロビンタンパク質をコードする配列、トランスポゾンをコードする配列、レトロウイルス配列をコードする配列、テロメア配列を含む配列、サブテロメアリピートを含む配列、動原体配列を含む配列、イントロン配列を含む配列、Ａｌｕリピートを含む配列、ＳＩＮＥリピートを含む配列、ＬＩＮＥリピートを含む配列、二核酸（dinucleic acid）リピートを含む配列、三核酸（trinucleic acid）リピートを含む配列、四核酸（tetranucleic acid）リピートを含む配列、ポリ−Ａリピートを含む配列、ポリ−Ｔリピートを含む配列、ポリ−Ｃリピートを含む配列、ポリ−Ｇリピートを含む配列、ＡＴリッチ配列を含む配列、またはＧＣリッチ配列を含む配列に相補的である。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、抽出された核酸は、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、人工ＤＮＡ、およびＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのいずれか１つを含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、目的の配列は、抽出された核酸の１０％未満を構成する。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、目的の配列は、抽出された核酸の５％未満を構成する。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ−ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２、またはＣｍ５である。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、Ｃａｓ９である。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、触媒不活性（catalytically dead）であり、例えば、触媒不活性であるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、ｄＣａｓ９である。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質ニッカーゼ、例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼである。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、熱安定性である。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、方法は、アダプター特異的ＰＣＲを使用してステップ（ｂ）の生成物を増幅するステップをさらに含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、方法は、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素でステップ（ｂ）の生成物を処理するステップをさらに含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、酵素は、エキソヌクレアーゼＩＩＩまたはＢＡＬ−３１である。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、方法は、陽性対照標的配列の使用を含めるステップをさらに含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、方法は、陰性対照ｇＲＮＡの使用を含めるステップをさらに含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、試料は、全血、血漿、血清、涙、唾液、粘液、脳脊髄液、歯、骨、指の爪、糞便、尿、組織、および生検から選択される。
別の態様では、試料を富化する方法であって、（ａ）ミトコンドリアＤＮＡおよび非ミトコンドリアＤＮＡを含む試料を準備するステップであって、ミトコンドリアＤＮＡおよび非ミトコンドリアＤＮＡは、アダプターライゲーションされており、アダプターは、ミトコンドリアＤＮＡおよび非ミトコンドリアＤＮＡの５’および３’末端にライゲーションされている、ステップと；（ｂ）試料を複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させるステップであって、ｇＲＮＡは、ミトコンドリアＤＮＡに相補的であり、それによって、一端のみでアダプターライゲーションされたミトコンドリアＤＮＡならびに５’および３’末端の両方でアダプターライゲーションされた非ミトコンドリアＤＮＡを生成する、ステップと；（ｃ）試料を非ミトコンドリアＤＮＡについて富化するステップとを含む、方法が本明細書に提供されている。本明細書に開示の実施形態のいずれか１つにおいて、ステップ（ｃ）は、アダプター特異的ＰＣＲを使用してステップ（ｂ）の生成物を増幅することを含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、ステップ（ｃ）は、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素でステップ（ｂ）の生成物を処理することを含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、酵素は、エキソヌクレアーゼＩＩＩまたはＢＡＬ−３１である。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、ゲノムＤＮＡを解析するための方法であって、細胞の集団から単離されたＤＮＡを挿入酵素で処理して、非ミトコンドリアゲノムＤＮＡの複数のタグ付き断片を生成し、それによって残留量のタグ付きミトコンドリアＤＮＡも生成するステップを含む、方法に従って実行される。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、試料からミトコンドリアＤＮＡおよび非ミトコンドリアＤＮＡを抽出するステップをさらに含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、抽出された配列を断片化するステップをさらに含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、ミトコンドリアＤＮＡは、サイズ排除によって除去される。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、ミトコンドリアＤＮＡは、ビオチンを使用して除去される。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、試料を富化するステップは、非ミトコンドリアＤＮＡを増幅することを含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、試料を少なくとも１０２のユニークなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させるステップを含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ−ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２、またはＣｍ５である。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、Ｃａｓ９である。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、触媒不活性である、例えば、ｄＣａｓ９である。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質ニッカーゼ、例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼである。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、熱安定性である。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、富化するステップは、アダプター特異的ＰＣＲを使用してステップ（ｂ）の生成物を増幅することを含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、富化するステップは、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素でステップ（ｂ）の生成物を処理することを含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、酵素は、エキソヌクレアーゼＩＩＩまたはＢＡＬ−３１である。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、陽性対照標的配列の使用を含めるステップをさらに含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、陰性対照ｇＲＮＡの使用を含めるステップをさらに含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、試料は、全血、血漿、血清、涙、唾液、粘液、脳脊髄液、歯、骨、指の爪、糞便、尿、組織、および生検から選択される。
別の態様では、試料を富化する方法であって、（ａ）第１のゲノム由来の核酸および第２のゲノム由来の核酸を含む試料を準備するステップであって、第１のゲノム由来の核酸は、これらの５’および３’末端でアダプターライゲーションされており、第２のゲノム由来の核酸は、これらの５’および３’末端でアダプターライゲーションされている、ステップと；（ｂ）試料を複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させるステップであって、ｇＲＮＡは、第１のゲノム由来の核酸中の標的にされた部位に相補的であり、それによって一端でのみアダプターライゲーションされた第１のゲノム由来の核酸ならびに５’および３’末端の両方でアダプターライゲーションされた第２のゲノム由来の核酸を生成する、ステップと；（ｃ）試料を第２のゲノム由来の核酸について富化するステップとを含む、方法が本明細書に提供されている。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、試料は、追加のゲノム由来の核酸をさらに含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、第１のゲノムは、宿主ゲノムであり、第２のゲノムは、非宿主ゲノムである。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、試料を少なくとも１０２のユニークなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させるステップを含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、核酸は、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、および人工ＤＮＡからなる群から選択される。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、核酸は、二本鎖ＤＮＡである。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、核酸は、ＤＮＡであり、ステップ（ｂ）の接触により、５’末端でアダプターライゲーションされているが、３’末端でアダプターライゲーションされていない第１のゲノムＤＮＡ、ならびに５’および３’末端の両方でアダプターライゲーションされた第２のゲノムＤＮＡが生成される。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、核酸は、ＤＮＡである。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡである。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ−ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２、またはＣｍ５である。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、Ｃａｓ９である。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、第１のゲノム核酸中の標的化部位の後に、Ｃａｓ９によって結合され得るプロトスペーサー隣接モチーフまたは（ＰＡＭ）配列が続く。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、触媒不活性である、例えば、ｄＣａｓ９である。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質ニッカーゼ、例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼである。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、熱安定性である。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、第１のゲノムは、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、サル、イヌ、ネコ、アレチネズミ、トリ、マウス、およびラットからなる群から選択される生物由来である。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、第２のゲノムは、原核生物由来である。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、第２のゲノムは、真核生物由来である。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、第２のゲノムは、寄生虫由来である。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、第２のゲノムは、ウイルス、細菌、真菌、または原生動物由来である。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、アダプターライゲーションされた第１のゲノム核酸およびアダプターライゲーションされた第２のゲノム核酸は、５０〜１０００ｂｐの範囲である。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、第２のゲノム核酸は、試料中の全核酸の５０％未満を構成する。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、第２のゲノム核酸は、試料中の全核酸の５％未満を構成する。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、試料は、生体試料、臨床試料、法医学試料、または環境試料のいずれか１つである。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、ステップ（ｃ）は、アダプター特異的ＰＣＲを使用してステップ（ｂ）の生成物を増幅することを含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、ステップ（ｃ）は、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素でステップ（ｂ）の生成物を処理することを含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、酵素は、エキソヌクレアーゼＩＩＩまたはＢＡＬ−３１である。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、ステップ（ｃ）は、サイズ排除によって第１のゲノム核酸を除去することを含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、ステップ（ｃ）は、ビオチンを使用して第１のゲノム核酸を除去することを含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、アダプター特異的ＰＣＲを使用してステップ（ｂ）の生成物を増幅するステップをさらに含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素でステップ（ｂ）の生成物を処理するステップをさらに含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、酵素は、エキソヌクレアーゼＩＩＩまたはＢＡＬ−３１である。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、陽性対照標的配列の使用を含めるステップをさらに含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、陰性対照ｇＲＮＡの使用を含めるステップをさらに含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、試料は、全血、血漿、血清、涙、唾液、粘液、脳脊髄液、歯、骨、指の爪、糞便、尿、組織、および生検から選択される。
別の態様では、試料を富化する方法であって、（ａ）宿主核酸および非宿主核酸を含む試料を準備するステップであって、宿主核酸および非宿主核酸は、アダプターライゲーションされており、アダプターは、宿主核酸および非宿主核酸の５’および３’末端にライゲーションされている、ステップと；（ｂ）試料を複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させるステップであって、ｇＲＮＡは、宿主核酸中の標的化部位に相補的であり、それによって一端のみでアダプターライゲーションされた宿主核酸ならびに５’および３’末端の両方でアダプターライゲーションされた非宿主核酸を生成する、ステップと；（ｃ）試料を非宿主核酸について富化するステップとを含む、方法が本明細書に提供されている。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、試料を少なくとも１０２のユニークなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させるステップを含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、核酸は、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、および人工ＤＮＡからなる群から選択される。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、核酸は、二本鎖ＤＮＡである。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、核酸は、ＤＮＡであり、ステップ（ｂ）の接触により、５’末端でアダプターライゲーションされているが、３’末端でアダプターライゲーションされていない宿主ＤＮＡ、ならびに５’および３’末端の両方でアダプターライゲーションされた非宿主ＤＮＡが生成される。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、核酸は、ＤＮＡである。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡである。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ−ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２、またはＣｍ５である。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、Ｃａｓ９である。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、宿主核酸中の標的化部位の後に、Ｃａｓ９によって結合され得るプロトスペーサー隣接モチーフまたは（ＰＡＭ）配列が続く。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、触媒不活性である、例えば、ｄＣａｓ９である。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質ニッカーゼ、例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼである。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、熱安定性である。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、宿主は、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、サル、イヌ、ネコ、アレチネズミ、トリ、マウス、およびラットからなる群から選択される。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、非宿主は、原核生物である。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、非宿主は、真核生物である。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、非宿主は、寄生虫である。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、非宿主は、ウイルス、細菌、真菌、および原生動物からなる群から選択される。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、アダプターライゲーションされた宿主核酸および非宿主核酸は、５０〜１０００ｂｐの範囲である。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、非宿主核酸は、試料中の全核酸の５０％未満を構成する。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、非宿主核酸は、試料中の全核酸の５％未満を構成する。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、試料は、生体試料、臨床試料、法医学試料、または環境試料のいずれか１つである。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、ステップ（ｃ）は、アダプター特異的ＰＣＲを使用してステップ（ｂ）の生成物を増幅することを含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、ステップ（ｃ）は、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素でステップ（ｂ）の生成物を処理することを含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、酵素は、エキソヌクレアーゼＩＩＩまたはＢＡＬ−３１である。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、ステップ（ｃ）は、サイズ排除によって宿主核酸を除去することを含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、ステップ（ｃ）は、ビオチンを使用して宿主核酸を除去することを含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、アダプター特異的ＰＣＲを使用してステップ（ｂ）の生成物を増幅するステップをさらに含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素でステップ（ｂ）の生成物を処理するステップをさらに含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、酵素は、エキソヌクレアーゼＩＩＩまたはＢＡＬ−３１である。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、陽性対照標的配列の使用を含めるステップをさらに含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、陰性対照ｇＲＮＡの使用を含めるステップをさらに含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、試料は、全血、血漿、血清、涙、唾液、粘液、脳脊髄液、歯、骨、指の爪、糞便、尿、組織、および生検から選択される。
別の態様では、試料中の標的化配列を枯渇させる方法であって、（ａ）目的の配列および枯渇のための標的化配列を含む試料を準備するステップと；（ｂ）試料を複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させるステップであって、ｇＲＮＡは、標的化配列に相補的であり、それによって切断された標的化配列を生成する、ステップと、；（ｃ）ステップ（ｂ）の生成物を、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素と接触させるステップを含む、方法が本明細書に提供されている。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、酵素は、エキソヌクレアーゼＩＩＩまたはＢＡＬ−３１である。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、Ｃａｓ９である。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、枯渇のための標的化配列は、グロビンタンパク質をコードする配列、トランスポゾンをコードする配列、レトロウイルス配列をコードする配列、テロメア配列を含む配列、サブテロメアリピートを含む配列、動原体配列を含む配列、イントロン配列を含む配列、Ａｌｕリピートを含む配列、ＳＩＮＥリピートを含む配列、ＬＩＮＥリピートを含む配列、二核酸リピートを含む配列、三核酸リピートを含む配列、四核酸リピートを含む配列、ポリ−Ａリピートを含む配列、ポリ−Ｔリピートを含む配列、ポリ−Ｃリピートを含む配列、ポリ−Ｇリピートを含む配列、ＡＴリッチ配列を含む配列、またはＧＣリッチ配列を含む配列を含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、試料を少なくとも１０２のユニークなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させるステップを含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、試料は、全血、血漿、血清、涙、唾液、粘液、脳脊髄液、歯、骨、指の爪、糞便、尿、組織、および生検から選択される。
別の態様では、試料中の切断された標的化配列を生成する方法であって、（ａ）目的の配列および切断のための標的化配列を含む試料を準備するステップと；（ｂ）試料を複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させるステップであって、ｇＲＮＡは、標的化配列に相補的であり、それによって切断された標的化配列を生成する、ステップと；（ｃ）切断された標的化配列からＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質を解離させるステップと；（ｄ）追加の切断された標的化配列を生成するステップと；（ｅ）カットされなかった目的の配列を回収するステップとを含む、方法が本明細書に提供されている。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、熱安定性である。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、熱安定性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、熱安定性Ｃａｓ９である。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、切断された標的化配列からのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質の解離は、ステップ（ｂ）の混合物の温度を少なくとも７５°に上昇させることによって達成される。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、追加の切断された標的化配列の生成は、ステップ（ｂ）の混合物の温度を少なくとも５０°に下げることによって達成される。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、ステップ（ｅ）は、アダプター特異的ＰＣＲを使用してステップ（ｄ）の生成物を増幅することを含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、ステップ（ｅ）は、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素でステップ（ｄ）の生成物を処理することを含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、酵素は、エキソヌクレアーゼＩＩＩまたはＢＡＬ−３１である。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、Ｃａｓ９である。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、切断のための標的化配列は、グロビンタンパク質をコードする配列、トランスポゾンをコードする配列、レトロウイルス配列をコードする配列、テロメア配列を含む配列、サブテロメアリピートを含む配列、動原体配列を含む配列、イントロン配列を含む配列、Ａｌｕリピートを含む配列、ＳＩＮＥリピートを含む配列、ＬＩＮＥリピートを含む配列、二核酸リピートを含む配列、三核酸リピートを含む配列、四核酸リピートを含む配列、ポリ−Ａリピートを含む配列、ポリ−Ｔリピートを含む配列、ポリ−Ｃリピートを含む配列、ポリ−Ｇリピートを含む配列、ＡＴリッチ配列を含む配列、またはＧＣリッチ配列を含む配列を含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、試料を少なくとも１０２のユニークなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させるステップを含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、試料は、全血、血漿、血清、涙、唾液、粘液、脳脊髄液、歯、骨、指の爪、糞便、尿、組織、および生検から選択される。
別の態様では、試料中の標的化配列を枯渇させる方法であって、（ａ）目的の配列および切断のための標的化配列を含む試料を準備するステップと；（ｂ）試料を複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させるステップであって、ｇＲＮＡは、標的化配列に相補的であり、それによって切断された標的化配列を生成し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、熱安定性である、ステップと；（ｃ）ステップ（ｂ）の混合物の温度を少なくとも７５°に上昇させるステップと；（ｄ）ステップ（ｂ）の混合物の温度を少なくとも５０°に下げるステップと；（ｅ）ステップ（ｃ）および（ｄ）を少なくとも１回繰り返すステップと；（ｆ）カットされなかった目的の配列を回収するステップとを含む、方法が本明細書に提供されている。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、ステップ（ｆ）は、アダプター特異的ＰＣＲを使用してステップ（ｅ）の生成物を増幅することを含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、ステップ（ｆ）は、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素でステップ（ｅ）の生成物を処理することを含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、酵素は、エキソヌクレアーゼＩＩＩまたはＢＡＬ−３１である。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、Ｃａｓ９である。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、切断のための標的化配列は、グロビンタンパク質をコードする配列、トランスポゾンをコードする配列、レトロウイルス配列をコードする配列、テロメア配列を含む配列、サブテロメアリピートを含む配列、動原体配列を含む配列、イントロン配列を含む配列、Ａｌｕリピートを含む配列、ＳＩＮＥリピートを含む配列、ＬＩＮＥリピートを含む配列、二核酸リピートを含む配列、三核酸リピートを含む配列、四核酸リピートを含む配列、ポリ−Ａリピートを含む配列、ポリ−Ｔリピートを含む配列、ポリ−Ｃリピートを含む配列、ポリ−Ｇリピートを含む配列、ＡＴリッチ配列を含む配列、またはＧＣリッチ配列を含む配列を含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、試料を少なくとも１０２のユニークなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させるステップを含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、試料は、全血、血漿、血清、涙、唾液、粘液、脳脊髄液、歯、骨、指の爪、糞便、尿、組織、および生検から選択される。
別の態様では、試料中の標的化核酸を連続的に枯渇させるための方法であって、（ａ）宿主核酸および非宿主核酸を含む試料を準備するステップであって、非宿主核酸は、少なくとも１種の既知の非宿主生物由来の核酸および少なくとも１種の未知の非宿主生物由来の核酸を含む、ステップと；（ｂ）試料を複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させるステップであって、ｇＲＮＡは、宿主核酸中の標的化配列にハイブリダイズするように配置されており、それによって宿主核酸の一部が切断される、ステップと；（ｃ）試料を複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させるステップであって、ｇＲＮＡは、少なくとも１種の既知の非宿主核酸中の標的化配列にハイブリダイズするように配置されており、それによって少なくとも１種の既知の非宿主核酸の一部が切断される、ステップと；（ｄ）未知の非宿主生物から核酸を単離するステップとを含む、方法が本明細書に提供されている。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、試料を、宿主核酸中の標的化配列にハイブリダイズするように配置された少なくとも１０２のユニークなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させるステップを含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、試料を、少なくとも１種の既知の非宿主核酸中の標的化配列にハイブリダイズするように配置された少なくとも１０２のユニークなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させるステップを含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、試料は、全血、血漿、血清、涙、唾液、粘液、脳脊髄液、歯、骨、指の爪、糞便、尿、組織、および生検から選択される。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、未知の非宿主生物由来の核酸は、試料中の全核酸の５％未満を構成する。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、宿主は、ヒトである。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、少なくとも１つの既知の非宿主生物は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの種である。
別の態様では、ゲノムＤＮＡを解析するための方法であって、（ａ）試料由来の細胞の集団から単離されたＤＮＡを挿入酵素で処理して、非ミトコンドリアゲノムＤＮＡの複数のタグ付き断片を生成し、それによって残留量のタグ付きミトコンドリアＤＮＡも生成する、ステップと；（ｂ）本明細書に提供する関連した方法のいずれかに従って、ステップ（ａ）の生成物を非ミトコンドリアＤＮＡについて富化するステップとを含む、方法が本明細書に提供されている。例えば、試料を富化するかかる方法は、（ａ）ミトコンドリアＤＮＡおよび非ミトコンドリアＤＮＡを含む試料を準備するステップであって、ミトコンドリアＤＮＡおよび非ミトコンドリアＤＮＡは、アダプターライゲーションされており、アダプターは、ミトコンドリアＤＮＡおよび非ミトコンドリアＤＮＡの５’および３’末端にライゲーションされている、ステップと；（ｂ）試料を複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させるステップであって、ｇＲＮＡは、ミトコンドリアＤＮＡに相補的であり、それによって、一端のみでアダプターライゲーションされたミトコンドリアＤＮＡならびに５’および３’末端の両方でアダプターライゲーションされた非ミトコンドリアＤＮＡを生成する、ステップと；（ｃ）試料を非ミトコンドリアＤＮＡについて富化するステップとを含み得る。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、（ａ）タグ付き断片の少なくとも一部を配列決定して複数の配列リードを生成するステップと；（ｂ）配列リードから得た情報を領域にマッピングすることによって前記細胞のゲノムの領域のエピジェネティックマップを作製するステップとをさらに含む。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、試料は、全血、血漿、血清、涙、唾液、粘液、脳脊髄液、歯、骨、指の爪、糞便、尿、組織、および生検から選択される。
別の態様では、第１のゲノム由来のＤＮＡおよび第２のゲノム由来のＤＮＡの混合物を含む組成物であって、第１のゲノムＤＮＡおよび第２のゲノムＤＮＡは、アダプターライゲーションされており、第１のゲノムＤＮＡは、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質複合体に複合体形成されている、組成物が本明細書に提供されている。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、第１のゲノムは、宿主生物由来であり、第２のゲノムは、非宿主生物由来である。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、Ｃａｓ９である。本明細書に開示の実施形態のいずれかにおいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、熱安定性である。
別の態様では、キットが本明細書に提供されている。別の態様では、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質；および（ｂ）ミトコンドリアＤＮＡに相補的であるｇＲＮＡを含むキットが本明細書に提供されている。別の態様では、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質；（ｂ）目的の標的に相補的であるｇＲＮＡ；および（ｃ）エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を含むキットが本明細書に提供されている。別の態様では、（ａ）熱安定性であるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質；および（ｂ）目的の標的に相補的であるｇＲＮＡを含むキットが本明細書に提供されている。別の態様では、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質；および（ｂ）目的の標的配列に相補的であるｇＲＮＡの第１のセット；および（ｃ）試薬の対照セットを含むキットが本明細書に提供されている。別の態様では、（ａ）細胞の集団からＤＮＡを単離するための試薬；（ｂ）挿入酵素；（ｃ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質；および（ｄ）ミトコンドリアＤＮＡに相補的である複数のｇＲＮＡを含むキットが本明細書に提供されている。本明細書に開示のキットのいずれかにおいて、キットは、Ｙ形アダプターまたはポリ−Ｇアダプターのコレクションをさらに含む。本明細書に開示のキットのいずれかにおいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、Ｃａｓ９である。本明細書に開示のキットのいずれかにおいて、キットは、試薬の陽性対照セットをさらに含み、例えば、試薬の陽性対照セットは、核酸断片のコレクションを含み、断片は、ｇＲＮＡが少なくとも８５％相補的である目的の標的配列を含む。本明細書に開示のキットのいずれかにおいて、キットは、試薬の陰性対照セットをさらに含み、例えば、試薬の陰性対照セットは、ｇＲＮＡの第２のセットを含み、ｇＲＮＡの第２のセットは、ｇＲＮＡの第１のセットと比較して、目的の標的配列への結合の低減を呈し、または例えば、試薬の陰性対照セットは、核酸断片のコレクションを含み得、断片は、ｇＲＮＡの第１のセットに９０％以下、相補的である。本明細書に開示のキットのいずれか１つにおいて、キットは、少なくとも１０２のユニークｇＲＮＡ（unique gRNA）をさらに含む。
別の態様では、本発明は、試料中の標的化配列を枯渇させる方法であって、目的の配列および枯渇のための標的化配列を含む試料を準備するステップと；試料を複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させるステップであって、ｇＲＮＡは、標的化配列に相補的であり、それによって切断された標的化配列を生成する、ステップとを含む、方法を提供する。関連した態様では、本発明は、試料中の標的化配列の枯渇および分割の一方のための方法であって、試料から抽出された核酸を準備するステップであって、抽出された核酸配列は、目的の配列、ならびに枯渇および分割の一方のための標的化配列を含む、ステップと；複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）−ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質複合体を準備するステップであって、ｇＲＮＡは、異なる標的化配列にハイブリダイズするように配置されている、ステップと；核酸をｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質複合体と混合するステップであって、複数のｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質複合体の少なくとも一部は、標的化配列にハイブリダイズする、ステップとを含む、方法を提供する。本明細書に開示の実施形態のいずれか１つにおいて、本方法は、試料から核酸配列を抽出するステップをさらに含む。本明細書に開示の実施形態のいずれか１つにおいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、Ｃａｓ９である。本明細書に開示の実施形態のいずれか１つにおいて、本方法は、抽出された核酸を断片化するステップをさらに含む。本明細書に開示の実施形態のいずれか１つにおいて、本方法は、抽出され断片化された核酸の５’および３’末端をアダプターライゲーションするステップをさらに含む。本明細書に開示の実施形態のいずれか１つにおいて、本方法は、混合物をインキュベートして標的化配列を切断するステップをさらに含む。本明細書に開示の実施形態のいずれか１つにおいて、枯渇のために標的にされるそれぞれの配列の後に、細菌種に由来するＣａｓ９タンパク質が結合し得るプロトスペーサー隣接モチーフまたは（ＰＡＭ）配列が続くが、目的の配列（富化のための）は、ｇＲＮＡによって標的にされない。本明細書に開示の実施形態のいずれか１つにおいて、Ｃａｓ９タンパク質は、自己に先に結合させた親和性タグを含む触媒不活性であるＣａｓ９を含み、混合物を、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体を含む混合物中に存在する相補的な標的特異的核配列を含む第１の部分、およびガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体が結合していない抽出され断片化された核酸配列を含む第２の部分に分割するステップをさらに含み、分割は、親和性タグを使用して実施される。本明細書に開示の実施形態のいずれか１つにおいて、切断された抽出された核酸配列は、切断されなかった抽出され断片化された核酸配列より小さく、本方法は、サイズ選択的排除によって混合物から切断された抽出された核酸配列を除去するステップをさらに含む。本明細書に開示の実施形態のいずれか１つにおいて、本方法は、切断されなかった抽出され断片化された核酸配列を増幅するステップをさらに含む。本明細書に開示の実施形態のいずれか１つにおいて、本方法は、増幅および配列決定によって第１および第２の部分のそれぞれを解析するステップをさらに含む。本明細書に開示の実施形態のいずれか１つにおいて、試料は、生体試料、臨床試料、法医学試料、または環境試料のいずれか１つである。本明細書に開示の実施形態のいずれか１つにおいて、抽出された核酸は、宿主核酸配列および非宿主核酸配列を含む。本明細書に開示の実施形態のいずれか１つにおいて、非宿主核酸配列は、微生物核酸配列を含む。本明細書に開示の実施形態のいずれか１つにおいて、微生物核酸配列は、細菌核酸配列、ウイルス核酸配列、および真核生物寄生虫核酸配列のいずれか１つを含む。本明細書に開示の実施形態のいずれか１つにおいて、宿主核酸配列の少なくとも一部は、枯渇および分割の一方のために標的にされている配列中に含まれている。本明細書に開示の実施形態のいずれか１つにおいて、宿主核酸配列の実質的にすべてが、枯渇および分割の一方のために標的にされている配列中に含まれている。本明細書に開示の実施形態のいずれか１つにおいて、抽出された核酸は、複数の異なるリボソームＲＮＡ配列を含み、複数の異なる標的特異的ｇＲＮＡは、複数の異なるリボソームＲＮＡ配列の一部にハイブリダイズするように配置された標的核酸配列の少なくとも一部を含む。本明細書に開示の実施形態のいずれか１つにおいて、抽出された核酸配列は、複数の異なるミトコンドリア核酸配列を含み、複数の異なる標的特異的ｇＲＮＡは、複数の異なるミトコンドリア核酸配列の一部にハイブリダイズするように配置された１つまたは複数の標的核酸配列を含む。本明細書に開示の実施形態のいずれか１つにおいて、抽出された核酸配列は、枯渇のために標的にされる核酸配列中に複数の異なる反復核酸配列を含み、複数の異なる標的特異的ｇＲＮＡは、複数の異なる反復核酸配列の一部にハイブリダイズし得る少なくとも１つの標的核酸配列を含む。本明細書に開示の実施形態のいずれか１つにおいて、抽出された核酸は、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、人工ＤＮＡ、およびＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのいずれか１つを含む。本明細書に開示の実施形態のいずれか１つにおいて、目的の配列は、抽出された核酸の５０％未満を構成する。本明細書に開示の実施形態のいずれか１つにおいて、目的の配列は、抽出された核酸の５％未満を構成する。
別の態様では、本発明は、それぞれが選択された標的核酸配列にハイブリダイズするように配置された複数の標的特異的ガイドＲＮＡを含むガイドＲＮＡライブラリーであって、各ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質によって結合され得る配列を含む、ガイドＲＮＡライブラリーを提供する。本明細書に開示の実施形態のいずれか１つにおいて、それぞれの選択された標的核酸配列の直後にプロトスペーサー隣接モチーフが続く。本明細書に開示の実施形態のいずれか１つにおいて、標的特異的ｇＲＮＡは、ヒトゲノム中の選択された標的核酸配列とハイブリダイズするのに適したｇＲＮＡを含む。本明細書に開示の実施形態のいずれか１つにおいて、ヒトゲノムは、複数の異なる反復核酸配列を含む核酸配列を含み、標的特異的ｇＲＮＡは、複数の異なる反復核酸配列のそれぞれとハイブリダイズするのに適したガイドエレメントを含む。
別の態様では、本明細書に開示の技術は、Ｃａｓ９−酵素媒介法を使用する核酸試料の選択的もしくは標的化枯渇および／または選択的もしくは標的化分割のための方法およびシステムに関する。
別の態様では、本明細書に開示の技術は、ｇＲＮＡのライブラリーを形成することであって、それぞれのｇＲＮＡは、全核酸試料からの除去のために標的にされている核酸配列にハイブリダイズするのに適しており、標的にされている配列の後にプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が続く、形成することに関する。ｇＲＮＡを核酸試料および細菌種に由来するＣａｓ９タンパク質と混合することによって、ｇＲＮＡは、除去のために標的にされている核酸配列にハイブリダイズし、Ｃａｓ９酵素は、除去のために標的にされている核酸配列に結合するガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体を形成する。その後、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体をインキュベートして標的化核酸配列をカットすることができ、その結果、カットされた配列をカットされなかった核酸配列から分離することができ、またはその結果、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体が結合している標的化配列を、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体が結合していないＤＮＡ配列から分割することができる。
別の態様では、本明細書に開示の技術は、低レベル（例えば、５０％未満）の非宿主核酸を含有する核酸試料から宿主分子を枯渇させるのにも有用である。
別の態様では、本明細書に開示の技術は、１）ゲノムＤＮＡ試料またはシークエンシングライブラリーをＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の混合物と組み合わせるステップであって、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体は、Ｃａｓ９タンパク質およびゲノム中の所定の部位に相補的であるＣａｓ９関連ｇＲＮＡを含む、ステップと；ｂ）反応混合物をインキュベートして標的領域のみをカットするステップとを含む。シークエンシングライブラリーが標的にされる実施形態では、Ｃａｓ９カッティングは、２つのシークエンシングアダプターを分離し、したがってこれらの断片を増幅することができないようにするはずである。ゲノムＤＮＡが標的にされる実施形態では、Ｃａｓ９カッティングは、これらの断片をサイズ選択によって除去されるのに十分小さくするはずである。
図１は、Ｃａｓ９を用いてライブラリーにおける標的配列を選択的に切断する枯渇法の一般的な概略図を示す。
図２は、触媒不活性であるＣａｓ９を用いてライブラリーを標的配列および非標的配列に分割する枯渇法の一般的な概略図を示す。
図３は、シークエンシングライブラリーからミトコンドリアＤＮＡを枯渇し、非ミトコンドリアＤＮＡのみを配列決定のために残す例示的な戦略を示す。
図４は、ミトコンドリアＤＮＡが約４４％枯渇された（ｑＰＣＲによって測定）、枯渇実験の結果を示す。
図５は、多数のガイドＲＮＡが使用され、ミトコンドリアＤＮＡが約７０％枯渇された（ｑＰＣＲによって測定）、第２の実験の結果を示す。
図６Ａは、ミトコンドリアＤＮＡの枯渇の前後でのライブラリーの配列決定の結果を示す。 図６Ｂは、異なる数のｇＲＮＡを用いるミトコンドリアＤＮＡの枯渇を示す。
図７は、ＤＮＡのＣａｓ９ニッカーゼ媒介性枯渇を示す。
図８は、Ｃａｓ９媒介性枯渇、次いでエキソヌクレアーゼＩＩＩ処理を示す。
図９は、Ｃａｓ９媒介性枯渇、次いでエキソヌクレアーゼＢａｌ−３１処理を示す。
図１０は、Ｃａｓ９媒介性枯渇の間のビオチン標識を示す。
図１１は、Ｃａｓ９媒介性枯渇の効率を増加させるため熱安定性Ｃａｓ９を用いることを示す。
定義
本明細書で別段に定義されていない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様のまたは等価な任意の方法および材料を、本発明を実践または試験するのに使用することができるが、好適な方法および材料が記載されている。
本明細書に提供する表題は、本発明の様々な態様または実施形態の限定ではない。したがって、すぐ下に定義される用語は、全体として本明細書を参照することによってより完全に定義される。
別段に定義されていない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。Singletonら、DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY、第２版、John Wiley and Sons、New York（１９９４年）、ならびにHaleおよびMarkham、THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY、Harper Perennial、N.Y.（１９９１年）には、当業者に本明細書で使用する用語の多くの一般的な意味が提供されている。それでもなお、ある特定の用語を参照の明確さおよび容易さの目的で以下に定義する。
数値範囲は、範囲を規定する数値を含む。
用語「試料」は、本明細書で使用する場合、典型的には、しかし必ずしもではなく、１種または複数の目的の分析物を含有する液体形態での材料または材料の混合物を指す。
用語「核酸試料」は、本明細書で使用する場合、核酸を含有する試料を表す。本明細書で使用する核酸試料は、これらが配列を含有する複数の異なる分子を含有する点で複合体であり得る。哺乳動物（例えば、マウスまたはヒト）由来のゲノムＤＮＡは、諸タイプの複合試料である。複合試料は、１０４、１０５、１０６、または１０７超の（more then）異なる核酸分子を有し得る。ＤＮＡ標的は、任意の源、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、または人工ＤＮＡコンストラクトなどに由来し得る。核酸を含有する任意の試料、例えば、組織培養細胞または組織の試料から作製されるゲノムＤＮＡを本明細書で用いることができる。
用語「ヌクレオチド」は、既知のプリンおよびピリミジン塩基だけでなく、修飾された他の複素環式塩基も含有する部分を含むように意図されている。このような修飾としては、メチル化プリンまたはピリミジン、アシル化プリンまたはピリミジン、アルキル化リボースまたは他の複素環が挙げられる。さらに、用語「ヌクレオチド」は、ハプテンまたは蛍光標識を含有する部分を含み、慣例的なリボースおよびデオキシリボース糖だけでなく、他の糖も同様に含有し得る。修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、例えば、水酸基の１個または複数が、ハロゲン原子もしくは脂肪族基で置き換えられている、またはエーテル、アミンなどとして官能化されている、糖部分上の修飾も含む。
用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書で互換的に使用される。ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドから構成される任意の長さ、例えば、約２塩基超、約１０塩基超、約１００塩基超、約５００塩基超、１０００塩基超、最大で約１０，０００またはそれ超の塩基の核酸ポリマーを記載するのに使用され、酵素的または合成的に生成することができ（例えば、米国特許第５，９４８，９０２号およびその中に引用されている参考文献に記載のＰＮＡ）、これらは、２つの天然に存在する核酸のものと類似の配列特異的様式で天然に存在する核酸とハイブリダイズすることができ、例えば、ワトソン−クリック塩基対合相互作用に関与することができる。天然に存在するヌクレオチドとしては、グアニン、シトシン、アデニン、およびチミン（それぞれＧ、Ｃ、Ａ、およびＴ）が挙げられる。ＤＮＡおよびＲＮＡは、それぞれデオキシリボースおよびリボース糖骨格を有し、一方、ＰＮＡの骨格は、ペプチド結合によって連結された繰り返しのＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位から構成されている。ＰＮＡでは、様々なプリンおよびピリミジン塩基がメチレンカルボニル結合によって骨格に連結されている。ロックされた核酸（ＬＮＡ）は、アクセスできないＲＮＡと呼ばれることが多く、修飾ＲＮＡヌクレオチドである。ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は、２’酸素および４’炭素を接続している追加の架橋で修飾されている。この架橋は、Ａ型二重鎖中に見つかることが多い３’−ｅｎｄｏ（Ｎｏｒｔｈ）高次構造中のリボースを「ロックする」。ＬＮＡヌクレオチドは、望まれるときはいつでもオリゴヌクレオチド中のＤＮＡ残基またはＲＮＡ残基と混合することができる。用語「非構造化核酸」または「ＵＮＡ」は、安定性が低減されて互いに結合する非天然ヌクレオチドを含有する核酸である。例えば、非構造化核酸は、Ｇ’残基およびＣ’残基を含有することができ、これらの残基は、非天然起源形態、すなわち、安定性が低減されて互いに塩基対合するＧおよびＣの類似体に対応するが、それぞれ、天然に存在するＣ残基およびＧ残基と塩基対合する能力を保持する。非構造化核酸は、ＵＳ２００５０２３３３４０に記載されており、これは、ＵＮＡの開示に関して本明細書に参照により組み込まれている。
用語「オリゴヌクレオチド」は、本明細書で使用する場合、ヌクレオチドの一本鎖多量体を表す。
別段に示されていない限り、それぞれ、核酸は、５’から３’方向に左から右に書かれ、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシ方向に左から右に書かれる。
用語「切断すること（cleaving）」は、本明細書で使用する場合、二本鎖ＤＮＡ分子の両方の鎖中の２つの隣接するヌクレオチド間のホスホジエステル結合を切断し（break）、それによってＤＮＡ分子中で二本鎖切断をもたらす反応を指す。
用語「切断部位」は、本明細書で使用する場合、二本鎖ＤＮＡ分子が切断された部位を指す。
用語「ハイブリダイゼーション」は、核酸の鎖が当技術分野で公知の塩基対合によって相補鎖と結合するプロセスを指す。核酸は、２つの配列が中程度から高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件および洗浄条件下で互いに特異的にハイブリダイズする場合、参照核酸配列に「選択的にハイブリダイズ可能」であると見なされる。中程度および高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、公知である（例えば、Ausubelら、Short Protocols in Molecular Biology、第３版、Wiley & Sons、１９９５年、およびSambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第３版、２００１年、Cold Spring Harbor、N.Y.を参照）。高ストリンジェンシー条件の一例は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、および１００μｇ／ｍｌ変性キャリアＤＮＡ中の約４２℃でのハイブリダイゼーション、その後の室温で２×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中の２回ならびに４２℃で０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中の追加の２回の洗浄を含む。
用語「二重鎖」、または「二重鎖の」は、本明細書で使用する場合、塩基対合した、すなわち、互いにハイブリダイズした２つの相補的ポリヌクレオチドを表す。
用語「増幅すること」は、本明細書で使用する場合、鋳型として標的核酸を使用して標的核酸の１つまたは複数のコピーを生成することを指す。
用語「枯渇させること」は、ゲノムに関して、ゲノムの一部分をゲノムの残りか除去してゲノムの残りから単離された生成物を生成することを指す。用語「枯渇させること」は、別の種由来のＤＮＡを保持しながら１つの種由来のＤＮＡを除去することも包含する。
用語「ゲノム領域」は、本明細書で使用する場合、ゲノム、例えば、ヒト、サル、ラット、魚、もしくは昆虫、または植物のゲノムなどの動物または植物ゲノムの領域を指す。ある特定の場合では、本明細書に記載の方法で使用するオリゴヌクレオチドは、参照ゲノム領域、すなわち、公知のヌクレオチド配列のゲノム領域、例えば、配列が、例えば、ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋデータベースまたは他のデータベースに寄託された染色体領域を使用して設計することができる。
用語「ゲノム配列」は、本明細書で使用する場合、ゲノム中に存在する配列を指す。ＲＮＡは、ゲノムから転写されるので、この用語は、生物の核ゲノム中に存在する配列、およびかかるゲノムから転写されるＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）のｃＤＮＡコピー中に存在する配列を包含する。
用語「ゲノム断片」は、本明細書で使用する場合、ゲノム、例えば、ヒト、サル、ラット、魚、もしくは昆虫、または植物のゲノムなどの動物または植物ゲノムの領域を指す。ゲノム断片は、染色体全体または染色体の断片であり得る。ゲノム断片は、アダプターライゲーションされていてもよく（この場合、それは、断片の一方もしくは両方の末端に、または分子の少なくとも５’末端にアダプターライゲーションされる）、アダプターライゲーションされていなくともよい。
ある特定の場合では、本明細書に記載の方法で使用するオリゴヌクレオチドは、参照ゲノム領域、すなわち、公知のヌクレオチド配列のゲノム領域、例えば、配列が、例えば、ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋデータベースまたは他のデータベースに寄託された染色体領域を使用して設計することができる。このようなオリゴヌクレオチドは、試験ゲノムを含有する試料を使用するアッセイで用いることができ、この場合、試験ゲノムは、オリゴヌクレオチドの結合部位を含有する。
用語「ライゲーションすること」は、本明細書で使用する場合、第１のＤＮＡ分子の５’末端の末端ヌクレオチドの、第２のＤＮＡ分子の３’末端の末端ヌクレオチドへの酵素的に触媒された結合を指す。
２つの核酸が「相補的」である場合、核酸の一方のそれぞれの塩基は、他方の核酸中の対応するヌクレオチドと塩基対合する。用語「相補的」および「完全に相補的」は、本明細書で同義的に使用される。
用語「分離すること」は、本明細書で使用する場合、２つのエレメントの物理的な分離（例えば、サイズまたは親和性などによる）および他方をインタクトなままにした一方のエレメントの分解を指す。
細胞内で、ＤＮＡは通常、二本鎖形態で存在し、したがって、「トップ」および「ボトム」鎖と本明細書で呼ばれる核酸の２本の相補鎖を有する。ある特定の場合では、染色体領域の相補鎖は、「プラス」および「マイナス」鎖、「第１」および「第２」の鎖、「コード」および「非コード」鎖、「ワトソン」および「クリック」鎖、または「センス」および「アンチセンス」鎖と呼ばれる場合がある。トップまたはボトム鎖であるとして鎖を割り当てることは、自由裁量によるものであり、任意の特定の方向、機能、または構造を暗示しない。これらが共有結合によって連結された状態になるまで、第１および第２の鎖は、別個の分子である。記載の容易さのために、トップ鎖およびボトム鎖が共有結合によって連結された二本鎖核酸の「トップ」および「ボトム」鎖は、依然として「トップ」および「ボトム」鎖として記載される。言い換えれば、本開示の目的に関して、二本鎖ＤＮＡのトップ鎖およびボトム鎖は、別個の分子である必要はない。いくつかの例示的な哺乳動物染色体領域（例えば、ＢＡＣ、アセンブリー、染色体など）の第１の鎖のヌクレオチド配列は、公知であり、例えば、ＮＣＢＩ’ｓ Ｇｅｎｂａｎｋデータベース中に見つけることができる。
用語「トップ鎖」は、本明細書で使用する場合、核酸のいずれかの鎖を指すが、核酸の両方の鎖を指さない。オリゴヌクレオチドまたはプライマーが「トップ鎖のみに」結合またはアニールするとき、それは、一方の鎖のみに結合するが、他方の鎖に結合しない。用語「ボトム鎖」は、本明細書で使用する場合、「トップ鎖」に相補的である鎖を指す。オリゴヌクレオチドが「一方の鎖のみに」結合またはアニールするとき、それは、一方の鎖、例えば、第１または第２の鎖のみに結合するが、他方の鎖に結合しない。オリゴヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡの両方の鎖に結合またはアニールする場合、オリゴヌクレオチドは、２つの領域、二本鎖ＤＮＡのトップ鎖とハイブリダイズする第１の領域、および二本鎖ＤＮＡのボトム鎖とハイブリダイズする第２の領域を有し得る。
用語「二本鎖ＤＮＡ分子」は、トップ鎖およびボトム鎖が共有結合によって連結されていない両方の二本鎖ＤＮＡ分子、ならびにトップ鎖およびボトム鎖が共有結合によって連結された二本鎖ＤＮＡ分子を指す。二本鎖ＤＮＡのトップ鎖およびボトム鎖は、ワトソン−クリック相互作用によって互いに塩基対合される。
用語「変性させること」は、本明細書で使用する場合、適当な変性条件下に二重鎖を配置することによる核酸二重鎖の塩基対の少なくとも一部の分離を指す。変性条件は、当技術分野で周知である。一実施形態では、核酸二重鎖を変性させるために、二重鎖を二重鎖のＴｍよりも高い温度に曝露し、それによって二重鎖の一方の鎖を他方の鎖から放すことができる。ある特定の実施形態では、核酸は、適当な時間の長さ（amount of time）にわたって（例えば、少なくとも３０秒、最大で３０分）少なくとも９０℃の温度にそれを曝露することによって変性させることができる。ある特定の実施形態では、完全変性条件を使用して二重鎖の塩基対を完全に分離することができる。他の実施形態では、部分変性条件（例えば、完全変性条件より低い温度を伴う）を使用して、二重鎖のある特定の部分の塩基対を分離することができる（例えば、Ａ−Ｔ塩基対に富む領域を分離することができ、一方、Ｇ−Ｃ塩基対に富む領域を対合したままにすることができる）。核酸は、化学的に（例えば、尿素またはＮａＯＨを使用して）変性させることもできる。
用語「遺伝子型判定」は、本明細書で使用する場合、任意のタイプの核酸配列の解析を指し、配列決定、多型（ＳＮＰ）解析、および再配列を同定するための解析を含む。
用語「配列決定」は、本明細書で使用する場合、ポリヌクレオチドの連続したヌクレオチドの実体（identity）が得られる方法を指す。
用語「次世代シークエンシング」は、いわゆる並列化された合成による配列決定（sequencing-by-synthesis）プラットフォームまたはライゲーションによる配列決定（sequencing-by-ligation）プラットフォーム、例えば、現在、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、およびＲｏｃｈｅなどによって用いられているものを指す。次世代シークエンシング法として、ナノ細孔シークエンシング法、またはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓが商品化したイオントレント技術などの電子検出ベース法も挙げることができる。
用語「宿主核酸」は、試料が得られた多細胞真核生物被験体に由来する核酸を指す。宿主核酸は、例えば、植物、または哺乳動物、特にヒトを含めた動物であり得る。用語「宿主核酸」は、核の核酸、ならびに他の小器官、例えば、ミトコンドリアおよび葉緑体（宿主が植物である場合）中に存在する核酸を含むが、被験体上または被験体中で成長することが多い微生物由来の核酸を含まない。
用語「非宿主核酸」は、試料が得られた宿主に属さない核酸を指す。非宿主核酸は、ウイルスＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、または他の微生物ＤＮＡであり得る。
用語「微生物核酸」は、試料中に存在する、起源において微生物（例えば、細菌もしくはウイルス、または真核生物寄生虫由来）である核酸を指す。
用語「宿主ＤＮＡ」は、試料が得られた多細胞真核生物被験体に由来するＤＮＡを指す。宿主ＤＮＡは、例えば、植物、または哺乳動物、特にヒトを含めた動物であり得る。用語「宿主ＤＮＡ」は、核ＤＮＡ、ならびに他の小器官、例えば、ミトコンドリアおよび葉緑体（宿主が植物である場合）中に存在するＤＮＡを含むが、被験体上または被験体中で成長することが多い微生物由来のＤＮＡを含まない。
用語「非宿主ＤＮＡ」は、試料が得られた宿主に属さないＤＮＡを指す。非宿主ＤＮＡは、ウイルスＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、または他の微生物ＤＮＡであり得る。
用語「微生物ＤＮＡ」は、試料中に存在する、微生物（例えば、細菌もしくはウイルス、または真核生物寄生虫由来）を起源とするゲノムＤＮＡを指す。
用語「相補的ＤＮＡ」またはｃＤＮＡは、ＲＮＡの逆転写（ランダム六量体またはオリゴ−ｄＴプライマーなどのプライマーを使用する）、その後のＲＮａｓｅＨを用いたＲＮＡの消化およびＤＮＡポリメラーゼによる合成による第２の鎖の合成によってＲＮＡ試料から生成された二本鎖ＤＮＡ試料を指す。
用語「ＲＮＡプロモーターアダプター」は、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ、例えば、バクテリオファージＴ３、Ｔ７、ＳＰ６など由来のＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含有するアダプターである。
用語「メタゲノミクス試料」は、１つを超える種の生物（真核生物、原核生物、またはウイルス生物）を含有する試料を指す。
用語「メタゲノミクス解析」は、メタゲノミクス試料の解析を指す。
用語の他の定義は、明細書全体にわたって出現し得る。
本発明の目的
上記に示した従来の方法および装置に関連した問題を考慮して、本発明の目的は、酵素媒介カッティング機構を使用して核酸試料から選択された核酸を枯渇させることである。
本発明の別の目的は、それだけに限らないが、増幅、配列決定、クローニングなどを含めた下流用途を追究する目的で非宿主核酸断片の割合を増大させるための、宿主核酸および非宿主核酸を含むシークエンシングライブラリーから、選択された宿主細胞を枯渇させる方法を提供することである。
本発明の別の目的は、メタゲノミクス試料から特定の種のゲノムの一部またはすべてを選択的に枯渇させることによる、特定の種のゲノムにわたる断片に対して公平なメタゲノム解析法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、配列決定の量を増大させることなく、一部の事例ではそれを減少させながら、種のメタゲノムにマッピングする試料リードの数を増加させることによってメタゲノム解析のより良好な分解能を獲得することである。
本発明のさらなる目的は、ミトコンドリアＤＮＡおよび非ミトコンドリアＤＮＡを含む試料からミトコンドリアＤＮＡを枯渇させる方法および組成物を提供することである。
核酸、試料
本発明の核酸（富化、分割、または枯渇のために標的にされる）は、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、人工ＤＮＡ、人工ＲＮＡ、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ、およびＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドであり得る。
本発明の核酸は、ゲノムの領域を含むゲノム断片、または全ゲノム自体であり得る。一実施形態では、ゲノムは、ＤＮＡゲノムである。別の実施形態では、ゲノムは、ＲＮＡゲノムである。
本発明の核酸は、真核生物もしくは原核生物から；哺乳動物生物もしくは非哺乳動物生物から；動物もしくは植物から；細菌もしくはウイルスから；動物寄生虫から；または病原体から得ることができる。
本発明の核酸は、任意の哺乳動物生物から得ることができる。一実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。別の実施形態では、哺乳動物は、家畜動物、例えば、ウマ、ヒツジ、ウシ、ブタ、またはロバである。別の実施形態では、哺乳動物生物は、家庭用愛玩動物、例えば、ネコ、イヌ、アレチネズミ、マウス、ラットである。別の実施形態では、哺乳動物は、サルの一種である。
本発明の核酸は、任意のトリまたは鳥類生物から得ることができる。鳥類生物としては、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、およびガチョウが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の核酸は、植物から得ることができる。一実施形態では、植物は、イネ、トウモロコシ、コムギ、バラ、ブドウ、コーヒー、果実、トマト、ジャガイモ、または綿である。
一部の実施形態では、本発明の核酸は、細菌の種から得られる。一実施形態では、細菌は、結核を引き起こす細菌である。
一部の実施形態では、本発明の核酸は、ウイルスから得られる。
一部の実施形態では、本発明の核酸は、真菌の種から得られる。
一部の実施形態では、本発明の核酸は、藻類の種から得られる。
一部の実施形態では、本発明の核酸は、任意の哺乳動物寄生虫から得られる。
一部の実施形態では、本発明の核酸は、任意の哺乳動物寄生虫から得られる。一実施形態では、寄生虫は、蠕虫である。別の実施形態では、寄生虫は、マラリアを引き起こす寄生虫である。別の実施形態では、寄生虫は、リーシュマニア症を引き起こす寄生虫である。別の実施形態では、寄生虫は、アメーバである。
一実施形態では、本発明の核酸は、同じ試料中でｇＲＮＡ（ｇＲＮＡエレメントとも本明細書で互換的に呼ばれる）の標的である核酸およびｇＲＮＡの標的でない核酸を含む。
一実施形態では、試料中の核酸は、標的核酸／標的化配列（ｇＲＮＡの標的）および目的の核酸／目的の配列（ｇＲＮＡによって標的にされない）を含む。
一実施形態では、核酸はすべて、同じ生物に属するが、サブセットが枯渇または分割のために標的にされる。例えば、有益な価値をほとんど有さない核酸を標的にすることができる。
有益な価値をほとんど有さない核酸の例としては、それだけに限らないが、ミトコンドリアＤＮＡ、ミトコンドリアＲＮＡ、ミトコンドリアｒＲＮＡ、反復配列、マルチコピー配列、グロビンタンパク質をコードする配列、トランスポゾンをコードする配列、レトロウイルス配列をコードする配列、テロメア配列を含む配列、サブテロメアリピートを含む配列、動原体配列を含む配列、イントロン配列を含む配列、Ａｌｕリピート、ＳＩＮＥリピート、ＬＩＮＥリピート、二核酸リピート、三核酸リピート、四核酸リピート、ポリ−Ａリピート、ポリ−Ｔリピート、ポリ−Ｃリピート、ポリ−Ｇリピート、ＡＴリッチ配列、またはＧＣリッチ配列を含む配列が挙げられる。
一実施形態では、試料をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させ、ｇＲＮＡは、枯渇のための標的配列、グロビンタンパク質をコードする標的配列、トランスポゾンをコードする配列、レトロウイルス配列をコードする配列、テロメア配列を含む配列、サブテロメアリピートを含む配列、動原体配列を含む配列、イントロン配列を含む配列、Ａｌｕリピートを含む配列、ＳＩＮＥリピートを含む配列、ＬＩＮＥリピートを含む配列、二核酸リピートを含む配列、三核酸リピートを含む配列、四核酸リピートを含む配列、ポリ−Ａリピートを含む配列、ポリ−Ｔリピートを含む配列、ポリ−Ｃリピートを含む配列、ポリ−Ｇリピートを含む配列、ＡＴリッチ配列を含む配列、またはＧＣリッチ配列を含む配列に相補的である。
例示的な一実施形態では、リボソームＲＮＡを枯渇または分割のために標的にすることができる。別の例示的な実施形態では、反復ＤＮＡを枯渇または分割のために標的にすることができる。このような実施形態では、本方法は、有益な価値をほとんど有さないリボソームＤＮＡもしくは反復ＤＮＡまたは他の任意のＤＮＡを枯渇させ、ＤＮＡ抽出物のこれらのエレメントを配列決定するコストを低減し、データ収量を改善するのに使用可能である。
一実施形態では、標的ＤＮＡは、非ミトコンドリアＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）であり得、目的のＤＮＡは、ミトコンドリアＤＮＡであり得、ミトコンドリアＤＮＡは、非ミトコンドリアヒトＤＮＡを標的にし、かつ枯渇させることによって富化される。
一実施形態では、枯渇のための標的ＤＮＡは、ミトコンドリアＤＮＡであり得、目的のＤＮＡは、非ミトコンドリアＤＮＡであり得、非ミトコンドリアＤＮＡは、ミトコンドリアヒトＤＮＡを標的にし、かつ枯渇させることによって富化される。例示的な実施形態では、ＡＴＡＣ−Ｓｅｑ手順（例えば、ＷＯ２０１４／１８９９５７を参照）が実行され、不要な残留するミトコンドリアＤＮＡがもたらされ、本発明の方法を試料から不要なミトコンドリアＤＮＡを枯渇させるのに使用することができる。
一実施形態では、枯渇または分割される核酸は、ゲノムの非マッピング可能領域であり得、さらなる解析／配列決定／クローニングのために保持される核酸は、ゲノムのマッピング可能領域であり得る。一実施形態では、枯渇または分割される核酸は、ゲノムのマッピング可能領域であり得、さらなる解析／配列決定／クローニングのために保持される核酸は、ゲノムの非マッピング可能領域であり得る。非マッピング可能領域の例としては、テロメア、動原体、反復領域、またはマッピングすることがより困難な特徴を含有する他のゲノム領域が挙げられる。
一部の実施形態では、本発明の方法は、宿主核酸および非宿主核酸を含む試料に対して実行される。一実施形態では、宿主核酸は、哺乳動物核酸であり、非宿主核酸は、非哺乳動物（例えば、細菌、ウイルス、真菌、原生動物）核酸である。一実施形態では、宿主核酸は、ヒト核酸であり、非宿主核酸は、細菌核酸である。一実施形態では、宿主核酸は、ヒト核酸であり、非宿主核酸は、ウイルス核酸である。一実施形態では、宿主核酸は、ヒト核酸であり、非宿主核酸は、真菌核酸である。一実施形態では、宿主核酸は、ヒト核酸であり、非宿主核酸は、原生動物核酸である。一実施形態では、宿主核酸は、家畜の一種由来である。一実施形態では、宿主核酸は、サル由来である。特定の一実施形態では、宿主核酸は、ヒト核酸であり、非宿主核酸は、未同定病原体、例えば、公知もしくは未知のウイルス、または公知もしくは未知の細菌、または公知もしくは未知の動物寄生虫由来である。特定の一実施形態では、宿主核酸は、ウシ由来であり、非宿主核酸は、ウイルス核酸、細菌核酸、真菌核酸、または原生動物核酸である。
宿主核酸および非宿主核酸の両方を含有する試料では、宿主核酸および非宿主核酸は、例えば、宿主−病原体関係または共生関係を有する場合がある。一部の実施形態では、宿主から得られる全核酸試料の非宿主画分は、宿主に関連するマイクロバイオームに由来し得る。
一実施形態では、宿主生物（例えば、ヒト宿主）から得られる試料は、１種を超える非宿主生物、例えば、同定される少なくとも１種の未知の非宿主生物を含む複数の非宿主生物由来の核酸を含有する。本発明の組成物および方法を利用して、試料中の核酸を連続的に処理して、宿主ＤＮＡを最初に枯渇／分割し、次いで目的のものでない他の既知の非宿主核酸を引き続いて枯渇／分割することによって、目的の特定の非宿主核酸を代表する核酸の残りのプールに達することができる。例えば、このような実施形態は、宿主が、例えば、共生の方法で（symbiotically）存在している１種を超える既知の細菌を宿していると予期される状況において適用可能であるはずである。例えば、このような実施形態は、数種の細菌、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの種を宿すことが分かっている、個体由来の唾液試料中の未知の病原体を検出するのに適用可能である。別の例では、試料は、既知および未知の非宿主核酸を含む哺乳動物宿主由来の糞試料であり得る。
一実施形態では、既知の宿主生物（例えば、ヒト宿主）から得られる試料は、非宿主核酸を含有するが、非宿主は、宿主核酸が枯渇または分割され、その結果非宿主核酸が富化され、さらに下流解析に付されるまで未知である（例えば、ヒト血液中の未知の病原性細菌、ウイルス、または他の病原体）。
例示的な実施形態では、ＤＮＡが宿主ＤＮＡおよび非宿主ＤＮＡを含む場合、本方法は、さらなる解析のための非宿主ＤＮＡのライブラリーを構築するために宿主ＤＮＡの実質的にすべてを枯渇させるのに使用可能である。ＤＮＡが核ＤＮＡおよびミトコンドリアＤＮＡを含む場合では、本方法は、さらなる解析のための核ＤＮＡのライブラリーを構築するためにミトコンドリアＤＮＡを枯渇させるのに、またはさらなる解析のためのミトコンドリアＤＮＡのライブラリーを構築するために核ＤＮＡを枯渇させるのに使用可能である。ＤＮＡが、有益な価値をほとんど有し得ないリボソームＲＮＡまたは反復ＤＮＡの豊富な配列を含む場合では、本方法は、有益な価値をほとんど有さないリボソームＤＮＡもしくは反復ＤＮＡまたは他の任意のＤＮＡを枯渇させ、ＤＮＡ抽出物のこれらのエレメントを配列決定するコストを低減し、データ収量を改善するのに使用可能である。それぞれの用途において、得られるＤＮＡは、有意により少ない配列決定するためのＤＮＡ断片を有し、それによって配列決定コストおよび複雑性を低減する。さらに、本発明の方法によれば、枯渇された試料は、実効的に枯渇されなかった生体試料中に存在するＤＮＡ材料のすべてを依然として提供し、それは、より少ない多様なＤＮＡ試料を配列決定することによって、配列決定コストを低減し、かつデータ収量を改善する利点をもたらす。
一実施形態では、本発明の核酸は、生体試料から得られる。核酸が得られる生体試料としては、それだけに限らないが、全血、血漿、血清、涙、唾液、粘液、脳脊髄液、歯、骨、指の爪、糞便、尿、組織、生検などが挙げられる。生体試料は、法医学試料、例えば、歯、骨、指の爪などを含み得る。生体試料は、組織、組織生検、例えば、切除された肺組織を含み得る。生体試料は、臨床試料を含み得、臨床試料は、臨床現場において、例えば、病院または診療所において得られる試料を指す。
一実施形態では、本発明の核酸は、環境試料、例えば、水、土壌、空気、または岩から得られる。
一実施形態では、本発明の核酸は、法医学試料、例えば、進行中の調査などの一部として、犯罪現場における個体から、証拠の一片、検死から得られる試料から得られる。
一実施形態では、本発明の核酸は、ライブラリーで提供される。
本発明の核酸は、試料から提供または抽出される。抽出により、検体から実質的にすべての核酸配列を抽出することができる。これは、例えば、検体中に存在する宿主の核酸配列および任意の非ヒト生物または非宿主生物の核酸配列であり得る。
抽出により、９９．９９９：０．００１〜０．００１：９９．９９９の間のいずれかの比で宿主核酸および非宿主核酸が生じ得る。抽出により、９９．９９９：０．００１〜０．００１：９９．９９９の間のいずれかの比で標的化核酸および目的の核酸が生じ得る。抽出により、９９．９９９：０．００１〜０．００１：９９．９９９の間のいずれかの比で枯渇される核酸と保持／解析／配列決定される核酸が生じ得る。抽出により、９９．９９９：０．００１〜０．００１：９９．９９９の間のいずれかの比で分割される核酸と保持／解析／配列決定される核酸が生じ得る。生体試料からの抽出により、９９．９９９：０．００１〜０．００１：９９．９９９の間のいずれかの比で枯渇される宿主核酸と保持／解析／配列決定される１種を超える非宿主由来の核酸が生じ得る。これらの実施形態では、比は、９９．９９９：０．００１〜０．００１：９９．９９９の間のいずれかに等しい、またはそれに入ることができ、例えば、比は、９９：１、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５、７０：３０、６５：３５、６０：４０、５５：４５、５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５、および１：９９であり得る。
抽出後、抽出された核配列を断片化して、それぞれの抽出された核酸の長さを増幅、配列決定などのためにより管理できる長さに低減することができる。
本明細書に提供するように、出発核酸材料の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の枯渇を、枯渇または分割することができる。この枯渇または分割は、１０分、１５分、２０分、３０分、４５分、６０分、７５分、９０分、１０５分、１２０分、１５０分、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、または１２時間以下で達成することができる。
一実施形態では、本発明の核酸は、アダプターライゲーションされる。アダプターライゲーションされる本発明の核酸は、１０ｂｐ〜１０００ｂｐの範囲であり得る。例えば、アダプターライゲーションされる核酸は、少なくとも１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、または１０００ｂｐであり得る。特定の一実施形態では、アダプターライゲーションされる核酸は、１００ｂｐである。特定の一実施形態では、アダプターライゲーションされる核酸は、２００ｂｐである。特定の一実施形態では、アダプターライゲーションされる核酸は、３００ｂｐである。特定の一実施形態では、アダプターライゲーションされる核酸は、４００ｂｐである。特定の一実施形態では、アダプターライゲーションされる核酸は、５００ｂｐである。
一部の実施形態では、試料は、核酸断片のライブラリーを含み、核酸断片は、これらの５’および３’末端でアダプターライゲーションされている。このような実施形態では、アダプターは、５’および３’末端で、核酸断片のそれぞれの各末端にライゲーションされている。他の実施形態では、アダプターは、断片のそれぞれの一端のみにライゲーションされ得る。一部の実施形態では、アダプターは、５’終端および／または３’終端との間に介在配列をさらに含む。例えば、アダプターは、バーコード配列をさらに含み得る。
一部の実施形態では、アダプターは、二本鎖ＤＮＡ分子の両方の鎖にライゲーション可能である核酸である。
一部の実施形態では、アダプターは、枯渇／富化の前にライゲーションされる。他の実施形態では、アダプターは、後のステップでライゲーションされる。
一部の実施形態では、アダプターは、線状である。一部の実施形態では、アダプターは、線状Ｙ形である。一部の実施形態では、アダプターは、線状円形である。一部の実施形態では、アダプターは、ヘアピンアダプターである。
様々な実施形態では、アダプターは、ヘアピンアダプター、すなわち、それ自体と塩基対合して二本鎖ステムおよびループを有する構造を形成する一分子であり得、分子の３’および５’末端は、それぞれ断片の二本鎖ＤＮＡ分子の５’および３’末端にライゲーションする。
あるいは、アダプターは、ユニバーサルアダプターとも呼ばれる、断片の一端または両端にライゲーションされたＹアダプターであり得る。あるいは、アダプターは、互いに塩基対合される２つの別個のオリゴヌクレオチド分子からそれ自体構成され得る。その上、アダプターのライゲーション可能末端は、制限酵素による切断によって作製されるオーバーハングに適合するように設計することができ、またはそれは、平滑末端もしくは５’Ｔオーバーハングを有し得る。
アダプターは、二本鎖および一本鎖分子を含み得る。よって、アダプターは、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または２つの混合物であり得る。ＲＮＡを含有するアダプターは、ＲＮａｓｅ処理またはアルカリ加水分解によって切断可能であり得る。
アダプターは、長さが１０〜１００ｂｐであり得るが、この範囲の外側のアダプターも、本発明から逸脱することなく使用可能である。具体的な実施形態では、アダプターは、長さが少なくとも１０ｂｐ、少なくとも１５ｂｐ、少なくとも２０ｂｐ、少なくとも２５ｂｐ、少なくとも３０ｂｐ、少なくとも３５ｂｐ、少なくとも４０ｂｐ、少なくとも４５ｂｐ、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも５５ｂｐ、少なくとも６０ｂｐ、少なくとも６５ｂｐ、少なくとも７０ｂｐ、少なくとも７５ｂｐ、少なくとも８０ｂｐ、少なくとも８５ｂｐ、少なくとも９０ｂｐ、または少なくとも９５ｂｐである。
ある特定の場合では、アダプターは、宿主ゲノムの特定の領域、例えば、配列がＮＣＢＩ’ｓ Ｇｅｎｂａｎｋデータベースまたは他のデータベースに寄託されている染色体領域のヌクレオチド配列にマッチするように設計されたオリゴヌクレオチドを含み得る。このようなオリゴヌクレオチドは、試験ゲノムを含有する試料を使用するアッセイで用いることができ、この場合、試験ゲノムは、オリゴヌクレオチドの結合部位を含有する。さらなる例では、断片化された核酸配列は、１つまたは複数のＤＮＡシークエンシングライブラリーに由来し得る。アダプターは、次世代シークエンシングプラットフォームのため、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングプラットフォームで使用するため、またはＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔｓプラットフォームで使用するため、またはナノ細孔技術で使用するために配置することができる。
ガイドＲＮＡ
核酸中の、例えば、宿主由来のゲノムＤＮＡ中の標的化部位または標的化配列に相補的である（それに選択的である、それとハイブリダイズすることができる）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が本明細書に提供されている。一実施形態では、本発明は、枯渇または分割のために標的にされる核酸配列とハイブリダイズするように配置されたｇＲＮＡのコレクションを含むガイドＲＮＡライブラリーを提供する。
一実施形態では、ｇＲＮＡは、試料中の標的核酸（または標的化配列）に選択的であるが、試料中の目的の配列に選択的でない。
一実施形態では、ｇＲＮＡは、宿主由来の生体試料中の宿主核酸に選択的であるが、宿主由来の試料中の非宿主核酸に選択的でない。一実施形態では、ｇＲＮＡは、宿主由来の生体試料由来の非宿主核酸に選択的であるが、試料中の宿主核酸に選択的でない。一実施形態では、ｇＲＮＡは、宿主由来の生体試料中の宿主核酸、および非宿主核酸のサブセットの両方に選択である。例えば、複合生体試料が宿主核酸および１種を超える非宿主生物由来の核酸を含む場合、ｇＲＮＡは、１種を超える非宿主種に選択的であり得る。このような実施形態では、ｇＲＮＡは、目的のものでない配列を連続的に枯渇または分割するのに使用される。例えば、ヒト由来の唾液は、ヒトＤＮＡおよび１種を超える細菌種のＤＮＡを含有するが、未知の病原生物のゲノム材料も含有し得る。このような実施形態では、ヒトＤＮＡおよび既知の細菌に向けられたｇＲＮＡを使用してヒトＤＮＡおよび既知の細菌のＤＮＡを連続的に枯渇し、こうして未知の病原生物のゲノム材料を含む試料をもたらすことができる。
例示的な実施形態では、ｇＲＮＡは、宿主由来の生体試料から得られるヒト宿主ＤＮＡに選択的であるが、やはり試料中の未知の生物（例えば、病原体（複数可））由来のＤＮＡとハイブリダイズしない。
一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９によって結合され得るプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が後に続く標的核酸配列に選択的である。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの配列は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質タイプによって決定される。例えば、様々な実施形態では、ｇＲＮＡは、異なるＣａｓ９タイプに適合させることができ、その理由は、ＰＡＭ配列は、Ｃａｓ９が由来する細菌の種によって変動し得るためである。
ｇＲＮＡは、例えば、５０〜２５０塩基対のサイズの範囲であり得る。例えば、ｇＲＮＡは、少なくとも５０ｂｐ、５５ｂｐ、６０ｂｐ、６５ｂｐ、７０ｂｐ、７５ｂｐ、８０ｂｐ、８５ｂｐ、９０ｂｐ、９５ｂｐ、１００ｂｐ、１１０ｂｐ、１２０ｂｐ、１２５ｂｐ、１３０ｂｐ、１４０ｂｐ、１５０ｂｐ、１６０ｂｐ、１７０ｂｐ、１７５ｂｐ、１８０ｂｐ、１９０ｂｐ、または１９５ｂｐであり得る。具体的な実施形態では、ｇＲＮＡは、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、または１１０ｂｐである。それぞれの標的特異的ｇＲＮＡは、標的核酸中の所定の部位に相補的な塩基対配列を含む。その所定の部位の後には細菌種に由来するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質によって結合され得るプロトスペーサー隣接モチーフまたは（ＰＡＭ）配列が続く。具体的な実施形態では、標的核酸中の所定の部位に相補的であるｇＲＮＡの塩基対配列は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０塩基対である。
本発明は、ｇＲＮＡライブラリーも提供する。ｇＲＮＡライブラリーは、それぞれ枯渇または分割のために標的にされている核酸配列とハイブリダイズする（それに選択的である）ように配置された、いくつかの異なる種特異的ｇＲＮＡを含み得る。各ｇＲＮＡは、標的特異的ガイド配列およびステムループ結合部位を含み、ステムループ結合部位は、特定のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質と結合するように形成されている。ライブラリーは、それぞれ、標的にされている核酸中の異なる所定の部位に相補的である異なる１５〜２０塩基対配列を有する複数の異なるガイドＲＮＡを含み得る。この所定の部位の後にはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質によって結合され得る適切なＰＡＭ配列が続く。それぞれのガイドＲＮＡに関して、ＰＡＭ配列は、目的の核酸の所定のＤＮＡ標的配列中に存在するが、対応する標的特異的ガイド配列中に存在しない。
一般に本発明によれば、適切なＰＡＭ配列が後に続く所定の標的配列を含む目的のゲノム中の任意の核酸配列は、ガイドＲＮＡライブラリーに提供されている対応するガイドＲＮＡによってハイブリダイズされ得、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質、例えば、Ｃａｓ９によって結合され得る。様々な実施形態では、ｇＲＮＡライブラリーは、異なるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質、例えば、異なるＣａｓ９タイプに適合させることができ、その理由は、ＰＡＭ配列は、タンパク質が由来する細菌の種によって変動し得るためである。
ｇＲＮＡ中の異なる標的特異的配列を生成することができる。これは、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ、例えば、バクテリオファージＴ３、Ｔ７、ＳＰ６など由来のＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを使用することによって行うことができる。したがって、それぞれの異なるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、異なる標的核酸配列にハイブリダイズするのに適した異なる標的特異的配列をもたらす。アニーリングおよび後続のＰＣＲ反応の両方に使用可能な順方向プライマーの限定されない例示的なセットを、以下に提供する実施例１の表１および２に列挙する。
理論に制限されることなく、標的核酸の９５％超の切断に達するｇＲＮＡ間の距離は、ｇＲＮＡが約１００％の有効性を示す場合、算出することができる。これは、ライブラリーサイズの分布を測定し、平均、Ｎ、および標準偏差ＳＤ；Ｎ−２ＳＤ＝ライブラリーの９５％超についての最低サイズ、を決定し、９５％超の枯渇を確実なものにするためにこのサイズの断片１つ当たり１つのガイドＲＮＡが存在することを保証することによって算出することができる。これは、ガイドＲＮＡ間の最大距離＝ライブラリーサイズの平均−２×（ライブラリーサイズの標準偏差）として記載することもできる。
本明細書に提供する実施形態では、ｇＲＮＡライブラリーを、それぞれの異なるｇＲＮＡの多数のコピーおよび所望の枯渇結果に適し得る場合の多数の異なるｇＲＮＡを含むように増幅することができる。所与のガイドＲＮＡライブラリー中のユニークｇＲＮＡの数は、１つのユニークｇＲＮＡから１０１０もの多くのユニークｇＲＮＡまたはヒトゲノム中の２塩基対毎におよそ１つのユニークガイドＲＮＡ配列の範囲であり得る。一部の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０２のユニークｇＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０２、少なくとも１０３、少なくとも１０４、少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９、少なくとも１０１０のユニークｇＲＮＡを含む。例示的な一実施形態では、ライブラリーは、約１０３のユニークｇＲＮＡを含む。
本明細書に提供する実施形態では、本方法は、核酸を含む試料を複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させるステップを含み、ｇＲＮＡは、標的配列に相補的であり、このような配列は、枯渇のために標的にされる。一部の実施形態では、本方法は、標的化部位と塩基対合することができるｇＲＮＡを使用するステップを含み、試料を少なくとも１０２のユニークｇＲＮＡと接触させる。一部の実施形態では、試料を少なくとも１０２、少なくとも１０３、少なくとも１０４、少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９、少なくとも１０１０のユニークｇＲＮＡと接触させる。例示的な一実施形態では、試料を約１０３のユニークｇＲＮＡと接触させる。
本明細書に提供する実施形態では、本方法は、試料を少なくとも１０２のユニークなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させるステップを含み、複合体のユニークな特質は、ｇＲＮＡ自体のユニークな特質によって決定される。例えば、２つのユニークなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体は、同じＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質を共有し得るが、ｇＲＮＡは、わずか１ヌクレオチドによってであっても異なる。よって、一部の実施形態では、本方法は、試料を少なくとも１０２のユニークなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、試料を、少なくとも１０２、少なくとも１０３、少なくとも１０４、少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９、少なくとも１０１０のユニークなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させる。例示的な一実施形態では、試料を約１０３のユニークなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させる。
本明細書に提供する実施形態では、本方法は、ゲノムＤＮＡを含む試料を複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させるステップを含み、ｇＲＮＡは、枯渇のためのゲノム中の標的にされた部位に相補的である。一部の実施形態では、本方法は、標的化ＤＮＡと塩基対合することができるｇＲＮＡを使用するステップを含み、目的の標的部位は、目的のゲノムにわたって少なくとも１ｂｐ毎、少なくとも２ｂｐ毎、少なくとも３ｂｐ毎、少なくとも４ｂｐ毎、少なくとも５ｂｐ毎、少なくとも６ｂｐ毎、少なくとも７ｂｐ毎、少なくとも８ｂｐ毎、少なくとも９ｂｐ毎、少なくとも１０ｂｐ毎、少なくとも１１ｂｐ毎、少なくとも１２ｂｐ毎、少なくとも１３ｂｐ毎、少なくとも１４ｂｐ毎、少なくとも１５ｂｐ毎、少なくとも１６ｂｐ毎、少なくとも１７ｂｐ毎、少なくとも１８ｂｐ毎、少なくとも１９ｂｐ毎、２０ｂｐ、少なくとも２５ｂｐ毎、少なくとも３０ｂｐ毎、少なくとも４０ｂｐ毎、少なくとも５０ｂｐ毎、少なくとも１００ｂｐ毎、少なくとも２００ｂｐ毎、少なくとも３００ｂｐ毎、少なくとも４００ｂｐ毎、少なくとも５００ｂｐ毎、少なくとも６００ｂｐ毎、少なくとも７００ｂｐ毎、少なくとも８００ｂｐ毎、少なくとも９００ｂｐ毎、少なくとも１０００ｂｐ毎、少なくとも２５００ｂｐ毎、少なくとも５０００ｂｐ毎、少なくとも１０，０００ｂｐ毎、少なくとも１５，０００ｂｐ毎、少なくとも２０，０００ｂｐ毎、少なくとも２５，０００ｂｐ毎、少なくとも５０，０００ｂｐ毎、少なくとも１００，０００ｂｐ毎、少なくとも２５０，０００ｂｐ毎、少なくとも５００，０００ｂｐ毎、少なくとも７５０，０００ｂｐ毎、またはさらには少なくとも１，０００，０００ｂｐ毎に間隔をあけられている。
本明細書に提供する実施形態では、本方法は、枯渇のために標的にされる核酸を含む試料を複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させるステップを含み、ｇＲＮＡは、枯渇のために標的にされる核酸に相補的である。一部の実施形態では、ｇＲＮＡ：枯渇のために標的にされる核酸のモル比は、１：１、５：１、１０：１、５０：１、１００：１、１５０：１、２５０：１、５００：１、７５０：１、１０００：１、１５００：１、２０００：１、２５００：１、５０００：１、７５００：１、またはさらには１０，０００：１である。例示的な実施形態では、ｇＲＮＡ：枯渇のために標的にされる核酸のモル比は、５００：１である。
本明細書に提供する実施形態では、本方法は、枯渇のために標的にされる核酸を含む試料を複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させるステップを含み、ｇＲＮＡは、枯渇のために標的にされる核酸に相補的である。一部の実施形態では、ｇＲＮＡ：枯渇のために標的にされる核酸の重量対重量比は、１：１、５：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、１５０：１、２５０：１、５００：１、７５０：１、１０００：１、１５００：１、２０００：１、２５００：１、５０００：１、７５００：１、またはさらには１０，０００：１である。例示的な実施形態では、ｇＲＮＡ：枯渇のために標的にされる核酸の重量対重量比は、５０：１から１００：１の間の範囲である。
以下の記載は、例示的な実施形態として図１を参照する。図１では、ガイドＲＮＡライブラリー（１０５０）は、それぞれが、ＤＮＡ抽出断片（１０２５）または任意の他のＤＮＡ断片であって、これらが目的のものでないために枯渇され得る、任意の他のＤＮＡ断片のコレクションから枯渇のために標的にされるヒトＤＮＡまたは核酸配列とハイブリダイズするようにそれぞれ配置されている多数の異なるヒト特異的ｇＲＮＡ（１０５５）を含む。本実施形態では、枯渇のために標的にされる核酸配列は、さらに解析されるための目的のものである非ヒト遺伝子断片（１０３０）中に存在する配列でない。各ガイドＲＮＡ（１０５５）は、標的特異的ガイド配列（１０６０）およびＣａｓ９タンパク質と結合するように形成されているステムループ結合部位（１０６５）を含む。それぞれの標的特異的ガイド配列（１０６０）はヒトゲノム中の所定の部位に相補的な１５〜２０塩基対配列であり、該所定の部位の後には細菌種に由来するＣａｓ９タンパク質によって結合され得るプロトスペーサー隣接モチーフまたは（ＰＡＭ）配列が続く。約８〜１００塩基対に及ぶ他の塩基対長も、本発明から逸脱することなく使用可能である。
図１において、異なる標的特異的配列（１０６０）は、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ、例えば、バクテリオファージＴ３、Ｔ７、ＳＰ６など由来のＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含有する異なるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列（１０７０）によって生成される。したがって、それぞれの異なるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（１０７０）は、異なるヒトＤＮＡ配列にハイブリダイズするのに適した異なる標的特異的配列（１０６０）をもたらす。
図１において、ガイドＲＮＡライブラリー（１０５０）は、それぞれの異なるｇＲＮＡ（１０５５）の多数のコピーおよび所望の枯渇結果に適し得る場合の多数の異なるｇＲＮＡ、例えば、（１０５５ａ）（１０５５ｂ）（１０５５ｎ）を含むように増幅される。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質
試料中の、不要な核酸の枯渇および／または目的の配列の富化のための組成物および方法が本明細書に提供されている。これらの組成物および方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質を利用する。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質としては、ＣＲＩＳＰＲ Ｉ型系、ＣＲＩＳＰＲ ＩＩ型系、およびＣＲＩＳＰＲ ＩＩＩ型系由来のタンパク質が挙げられる。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、任意の細菌種または古細菌種由来であり得る。
一部の実施形態では、ＣＲＩＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ ｇｌｏｂｕｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｏｌｕｍｎａｒｅ、Ｆｌｕｖｉｉｃｏｌａ ｔａｆｆｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｃｏｐｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｏｂｉｌｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ ａｌｏｃｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｓｕｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ、またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ由来であり、またはそれ由来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質に由来する。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質の例は、天然に存在するまたは操作されたバージョンであり得る。
一部の実施形態では、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質としては、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ−ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２、およびＣｍ５が挙げられる。例示的な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、Ｃａｓ９を含む。
「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体」は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質およびガイドＲＮＡを含む複合体を指す。ガイドＲＮＡは、２種の分子、すなわち、標的にハイブリダイズし、配列特異性をもたらす１つのＲＮＡ（「ｃｒＲＮＡ」）、およびｃｒＲＮＡにハイブリダイズすることができる１つのＲＮＡ、「ｔｒａｃｒＲＮＡ」から構成され得る。代わりに、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ配列およびｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含有する単一分子（すなわち、ｇＲＮＡ）であり得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質と少なくとも６０％同一（例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または９０％同一、少なくとも９５％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一）であり得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、結合活性、ヌクレアーゼ活性、およびヌクレアーゼ活性を含めた野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質の機能のすべて、または機能の１つのみもしくは一部を有し得る。
用語「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質関連ガイドＲＮＡ」は、上述したガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ分子およびｔｒａｃｒＲＮＡ分子を含む、またはｃｒＲＮＡ配列およびｔｒａｃｒＲＮＡ配列の両方を含む単一ＲＮＡ分子を含む）を指す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質関連ガイドＲＮＡは、単離ＲＮＡとして、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体の一部として存在し得る。
Ｃａｓ９
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、Ｃａｓ９を含む。本発明のＣａｓ９は、単離することができ、組換えで生成することができ、または合成で生成し得る。
本明細書の実施形態において使用され得るＣａｓ９タンパク質は、http://www.nature.com/nature/journal/v520/n7546/full/nature14299.htmlに見出すことができる。
一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ ｇｌｏｂｕｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｏｌｕｍｎａｒｅ、Ｆｌｕｖｉｉｃｏｌａ ｔａｆｆｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｃｏｐｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｏｂｉｌｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ ａｌｏｃｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｓｕｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ、またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａに由来するＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系である。
一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系であり、ＰＡＭ配列は、標的特異的ガイド配列の３’末端のすぐ隣に位置したＮＧＧである。例示的な細菌種由来のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のＰＡＭ配列として、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＮＧＧ）、Ｓｔａｐｈ ａｕｒｅｕｓ（ＮＮＧＲＲＴ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ＮＮＮＮＧＡＴＴ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＮＮＡＧＡＡ）、およびＴｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ（ＮＡＡＡＡＣ）も挙げることができ、これらはすべて、本発明から逸脱することなく使用可能である（（http://www.nature.com/nature/journal/v520/n7546/full/nature14299.html））。
例示的な一実施形態では、Ｃａｓ９配列は、例えば、ｐＸ３３０プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅから入手可能）から得て、ＰＣＲによって再増幅し、次いでｐＥＴ３０（ＥＭＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）中にクローニングして細菌内で発現させ、組換え６Ｈｉｓタグ付きタンパク質を精製することができる。
「Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体」は、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡを含む複合体を指す。ガイドＲＮＡは、２種の分子、すなわち、標的にハイブリダイズし、配列特異性をもたらす１つのＲＮＡ（「ｃｒＲＮＡ」）、およびｃｒＲＮＡにハイブリダイズすることができる１つのＲＮＡ、「ｔｒａｃｒＲＮＡ」から構成され得る。代わりに、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ配列およびｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含有する単一分子（すなわち、ｇＲＮＡ）であり得る。Ｃａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９タンパク質、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質と少なくとも６０％同一（例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または９０％同一、少なくとも９５％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一）であり得る。Ｃａｓ９タンパク質は、結合活性、ヌクレアーゼ活性、およびヌクレアーゼ活性を含めた野生型Ｃａｓ９タンパク質の機能のすべて、または機能の１つのみもしくは一部を有し得る。
用語「Ｃａｓ９関連ガイドＲＮＡ」は、上述したガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ分子およびｔｒａｃｒＲＮＡ分子を含む、またはｃｒＲＮＡ配列およびｔｒａｃｒＲＮＡ配列の両方を含むＲＮＡ分子を含む）を指す。Ｃａｓ９関連ガイドＲＮＡは、単離ＲＮＡとして、またはＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の一部として存在し得る。
触媒不活性であるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質の操作された例には、触媒不活性であるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が含まれる。用語「触媒不活性である」は一般に、不活化されたＨＮＨヌクレアーゼおよびＲｕｖＣヌクレアーゼを有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質を指す。このようなタンパク質は、任意の核酸中の標的部位（標的部位は、ガイドＲＮＡによって決定される）に結合することができるが、このタンパク質は、二本鎖ＤＮＡを切断またはニックすることができない。
一部の実施形態では、触媒不活性であるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、ｄＣａｓ９、ｄＣｐｆ１、ｄＣａｓ３、ｄＣａｓ８ａ−ｃ、ｄＣａｓ１０、ｄＣｓｅ１、ｄＣｓｙ１、ｄＣｓｎ２、ｄＣａｓ４、ｄＣｓｍ２、またはｄＣｍ５である。
一実施形態では、触媒不活性であるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、ｄＣａｓ９である。したがって、ｄＣａｓ９は、混合物の非結合核酸および分割のために標的にされるｄＣａｓ９結合断片への分割を可能にする。一実施形態では、ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体は、ｇＲＮＡ配列によって決定される標的に結合する。結合したｄＣａｓ９は、他の操作が進行しながらＣａｓ９によるカッティングを防止することができる。これは、図２に表されている。一実施形態では、ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体は、ｇＲＮＡ配列によって決定される標的に結合し、標的核酸試料の結合した部分は、ｄＣａｓ９タンパク質に先に結合させた親和性タグ（例えば、ビオチン）の結合によって取り出すことができる。結合した核酸配列は、変性条件によってＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体から溶出し、次いで増幅および配列決定することができる。反対に、別の実施形態では、これらのｄＣａｓ９標的化核酸を廃棄することができ、残りの核酸を増幅および配列決定によって解析することができる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質ニッカーゼ
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質の操作された例には、Ｃａｓニッカーゼも含まれる。Ｃａｓニッカーゼは、単一の不活性な触媒ドメインを含有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質の修飾バージョンを指す。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質ニッカーゼは、Ｃａｓ９ニッカーゼ、Ｃｐｆ１ニッカーゼ、Ｃａｓ３ニッカーゼ、Ｃａｓ８ａ−ｃニッカーゼ、Ｃａｓ１０ニッカーゼ、Ｃｓｅ１ニッカーゼ、Ｃｓｙ１ニッカーゼ、Ｃｓｎ２ニッカーゼ、Ｃａｓ４ニッカーゼ、Ｃｓｍ２ニッカーゼ、またはＣｍ５ニッカーゼである。
一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質ニッカーゼは、Ｃａｓ９ニッカーゼである。
一部の実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、標的配列に結合するのに使用することができる。用語「Ｃａｓ９ニッカーゼ」は、単一の不活性な触媒ドメイン、例えば、ＲｕｖＣ−ドメインまたはＨＮＨ−ドメインのいずれかを含有するＣａｓ９タンパク質の修飾バージョンを指す。ただ１つの活性ヌクレアーゼドメインを有するので、Ｃａｓ９ニッカーゼは、標的ＤＮＡの１本の鎖のみをカットし、単鎖切断または「ニック」を生じる。どの変異体が使用されるかに応じて、ガイドＲＮＡがハイブリダイズした鎖またはハイブリダイズしていない鎖が切断され得る。反対鎖を標的にする２つのｇＲＮＡに結合したＣａｓ９ニッカーゼは、ＤＮＡ中に二本鎖切断を生じることができる。この「二重ニッカーゼ」ストラテジーは、カッティングの特異性を増大させ、その理由は、それが、二本鎖切断が形成される前に両方のＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体が１つの部位で特異的に結合されることを要求するためである。
例示的な実施形態では、ＤＮＡの枯渇は、Ｃａｓ９ニッカーゼを使用して実行することができる。一実施形態では、本方法は、除去されるＤＮＡ（例えば、目的のものでないヒトＤＮＡ）および目的のＤＮＡ（例えば、未知の病原体由来のＤＮＡ）を含むＤＮＡシークエンシングライブラリーを作製するステップと；枯渇されるすべてのＤＮＡが反対のＤＮＡ鎖上で近接して（例えば、１５塩基未満離れて）２つのガイドＲＮＡ結合部位を有するようにガイドＲＮＡを設計するステップと；Ｃａｓ９ニッカーゼおよびガイドＲＮＡをＤＮＡライブラリーに加えるステップとを含む。本実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、除去されるＤＮＡ上のその標的部位を認識し、１本の鎖のみをカットする。枯渇されるＤＮＡに関して、２つの別個のＣａｓ９ニッカーゼは、近接している除去されるＤＮＡ（例えば、ヒトＤＮＡ）の両方の鎖をカットすることができ、除去されるＤＮＡ（例えば、ヒトＤＮＡ）のみが、近接して２つのＣａｓ９ニッカーゼ部位を有し、それが二本鎖切断を生じる。Ｃａｓ９ニッカーゼが目的のＤＮＡ（例えば、病原体ＤＮＡ）上の部位を非特異的にまたは低親和性で認識する場合、これは１本の鎖のみをカットし、それは、ＤＮＡ分子の後続のＰＣＲ増幅または下流のプロセシングを防止しない。これは、図７に図解で表されている。本実施形態では、２つのガイドＲＮＡが十分近接している２つの部位を非特異的に認識する見込みは、無視できる（＜１×１０−１４）。本実施形態は、標準のＣａｓ９媒介切断が目的のＤＮＡをあまりにも多くカットする場合、特に有用であろう。
解離性および熱安定性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質をガイドＲＮＡのライブラリーと組み合わせて使用して標的ＤＮＡのコレクションを効率的に枯渇させることができるが、大量（例えば、３０ｐｍｏｌｅ超）のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質およびガイドＲＮＡが必要であり得る。標的ＤＮＡを上回るこの通常１００倍超の過剰量についての１つの理由は、切断後にこれらの標的ＤＮＡから完全に脱離するＥｃｏＲＩなどの古典的制限酵素と異なり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、カッティング反応の完了後に完全に再利用されないことである。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質、例えば、Ｃａｓ９は、２つの娘ＤＮＡ生成物分子の一方に結合したままであり得る（図１１、左の白丸を参照）。結果として、より多くのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質およびｇＲＮＡが、不要なＤＮＡの完全な枯渇を達成するために提供されることが必要であり得る。
一部の実施形態では、この問題を克服するために、解離性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が本明細書に提供されている。例えば、標的化配列の切断の際に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質をｇＲＮＡまたは標的から解離させるようにすることができる。一部の実施形態では、解離は、反応の温度を上昇させることによって誘導される。これは、酵素を利用可能なｇＲＮＡと複合体形成させることによって酵素の処理能力を増大させ、追加の標的配列と再会合し、追加の切断された標的配列を生成するように作用することができる。
一部の実施形態では、この問題を克服するために、熱安定性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が本明細書に提供されている。このような実施形態では、反応温度が上昇され、タンパク質の解離を誘導し、反応温度が下げられ、追加の切断された標的配列の生成を可能にする。一部の実施形態では、熱安定性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、少なくとも７５℃で少なくとも１分間維持されるとき、少なくとも５０％の活性、少なくとも５５％の活性、少なくとも６０％の活性、少なくとも６５％の活性、少なくとも７０％の活性、少なくとも７５％の活性、少なくとも８０％の活性、少なくとも８５％の活性、少なくとも９０％の活性、少なくとも９５％の活性、少なくとも９６％の活性、少なくとも９７％の活性、少なくとも９８％の活性、少なくとも９９％の活性、または１００％の活性を維持する。一部の実施形態では、熱安定性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、少なくとも７５℃で、少なくとも８０℃で、少なくとも８５℃で、少なくとも９０℃で、少なくとも９１℃で、少なくとも９２℃で、少なくとも９３℃で、少なくとも９４℃で、少なくとも９５℃で、９６℃、少なくとも９７℃で、少なくとも９８℃で、少なくとも９９℃で、または少なくとも１００℃で少なくとも１分間維持されるとき、少なくとも５０％の活性を維持する。一部の実施形態では、熱安定性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、少なくとも１分、２分、３分、４分、または５分間少なくとも７５℃で維持されるとき、少なくとも５０％の活性を維持する。一部の実施形態では、熱安定性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、温度が上昇され、２５℃〜５０℃に下げられるとき、少なくとも５０％の活性を維持する。一部の実施形態では、温度は、２５℃に、３０℃に、３５℃に、４０℃に、４５℃に、または５０℃に下げられる。例示的な一実施形態では、熱安定性酵素は、９５℃で１分後に少なくとも９０％の活性を保持する。
一部の実施形態では、熱安定性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、熱安定性Ｃａｓ９、熱安定性Ｃｐｆ１、熱安定性Ｃａｓ３、熱安定性Ｃａｓ８ａ−ｃ、熱安定性Ｃａｓ１０、熱安定性Ｃｓｅ１、熱安定性Ｃｓｙ１、熱安定性Ｃｓｎ２、熱安定性Ｃａｓ４、熱安定性Ｃｓｍ２、または熱安定性Ｃｍ５である。
一部の実施形態では、熱安定性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、熱安定性Ｃａｓ９である。
例示的な一実施形態では、ガイドＲＮＡ（例えば、ヒトＤＮＡに対するｇＲＮＡライブラリー）と複合体形成されている熱安定性Ｃａｓ９をＤＮＡ混合物（例えば、９５％のヒトＤＮＡおよび５％のウイルスＤＮＡを含有する）のシークエンシングライブラリーに適用することができる。図１１に表したように（右の灰色円）、Ｃａｓ９がある期間にわたって消化することを可能にした後、試料混合物の温度を、例えば、最大で９５℃またはそれ超に上昇させることができ、それにより、ＤＮＡ変性ならびにＤＮＡ標的からのｇＲＮＡおよびＣａｓ９の解離を引き起こすことができる。Ｃａｓ９のｇＲＮＡへの結合は、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡがＤＮＡ変性にもかかわらずインタクトな複合体としてＤＮＡ標的から解離するように増大させることができる。ジメチルスルホキシドを添加して、ＤＮＡ変性に要求される温度を低減することができ、その結果、Ｃａｓ９タンパク質構造は影響されない。Ｃａｓ９は、カットされなかった標的部位に優先的に結合し、熱安定性Ｃａｓ９は、煮沸後に活性を保持することができる。これらの特徴のために、温度を例えば最大で１００℃に上昇させ、反応物を例えば３７℃に冷却することによって、熱安定性Ｃａｓ９は、依然としてそのｇＲＮＡに結合し、より多くのその基質をカットすることができる。Ｃａｓ９の再利用を可能にすることによって、枯渇効率を増大させることができ、より少ないＣａｓ９が反応において必要とされ、オフターゲット（非特異的）切断確率を減少させることもできる。
熱安定性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質を単離する、例えば、好熱性細菌Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓのゲノム中の配列相同性によって同定することができる。次いでＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系遺伝子を発現ベクター中にクローニングすることができる。例示的な一実施形態では、熱安定性Ｃａｓ９タンパク質が単離される。
別の実施形態では、熱安定性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、非熱安定性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ進化によって得ることができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質の配列を変異誘発させてその熱安定性を改善することができる。一部の実施形態では、これは、部位特異的変異誘発により過剰のループ配列を除去し、タンパク質ドメイン間のイオン架橋（ionic bridge）の数を増やすことによって、または希釈して液滴にし、ＰＣＲを行って潜在的な変異体のプールを作製することによって達成することができる。例示的な一実施形態では、熱安定性Ｃａｓ９は、非熱安定性Ｃａｓ９のｉｎ ｖｉｔｒｏ進化によって生成することができる。
本発明の方法
目的の配列の富化／標的化配列の枯渇
目的のものでない標的化配列（標的配列は、枯渇のために標的にされる配列である）を枯渇させることによって試料を目的の配列について富化する方法が本明細書に提供されている。
一実施形態では、試料を目的の配列について富化する方法は、目的の配列および枯渇のための標的化配列を含む試料を準備するステップであって、目的の配列は、試料の５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．１％未満、０．０５％未満、０．０１％未満、０．００５％未満、またはさらには０．００１％未満を構成する、ステップと；試料を複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させるステップであって、ｇＲＮＡは、標的化配列に相補的であり、それによって標的化配列が切断される、ステップとを含む。例示的な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、Ｃａｓ９である。
一実施形態では、試料を非ミトコンドリアＤＮＡについて富化する方法は、（ａ）ミトコンドリアＤＮＡおよび非ミトコンドリアＤＮＡを含む試料を準備するステップであって、ミトコンドリアＤＮＡおよび非ミトコンドリアＤＮＡは、アダプターライゲーションされており、アダプターは、ミトコンドリアＤＮＡおよび非ミトコンドリアＤＮＡの５’および３’末端にライゲーションされている、ステップと；（ｂ）試料を複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させるステップであって、ｇＲＮＡは、ミトコンドリアＤＮＡに相補的であり、それによって、一端のみでアダプターライゲーションされたミトコンドリアＤＮＡならびに５’および３’末端の両方でアダプターライゲーションされた非ミトコンドリアＤＮＡを生成する、ステップと；（ｃ）試料を非ミトコンドリアＤＮＡについて富化するステップとを含む。一部の実施形態では、試料は、アダプター特異的ＰＣＲを使用して富化される。一部の実施形態では、富化するステップは、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素、例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩまたはＢＡＬ−３１でステップ（ｂ）の生成物を処理することを含む。例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩが利用される場合、アダプターは、Ｙ形であり得る。ＢＡＬ−３１が利用される場合、アダプターは、ポリ−Ｇテールを含み得る。一部の実施形態では、試料は、目的の配列の精製によって富化される。
別の実施形態では、試料を富化する方法は、（ａ）第１のゲノム由来の核酸および第２のゲノム由来の核酸を含む試料を準備するステップであって、第１のゲノム由来の核酸は、これらの５’および３’末端でアダプターライゲーションされており、第２のゲノム由来の核酸は、これらの５’および３’末端でアダプターライゲーションされている、ステップと；（ｂ）試料を複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させるステップであって、ｇＲＮＡは、第１のゲノム由来の核酸上の部位に相補的であり、それによって一端でのみアダプターライゲーションされた第１のゲノム由来の核酸ならびに５’および３’末端の両方でアダプターライゲーションされた第２のゲノム由来の核酸を生成する、ステップと；（ｃ）試料を第１のゲノム由来の核酸について富化するステップとを含む。一部の実施形態では、試料は、アダプター特異的ＰＣＲを使用して富化される。一部の実施形態では、富化するステップは、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素、例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩまたはＢＡＬ−３１でステップ（ｂ）の生成物を処理することを含む。例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩが利用される場合、アダプターは、Ｙ形であり得る。ＢＡＬ−３１が利用される場合、アダプターは、ポリ−Ｇテールを含み得る。一部の実施形態では、試料は、目的の配列の精製によって富化される。
別の実施形態では、試料を非宿主核酸について富化する方法は、宿主核酸および非宿主核酸を含む試料を準備するステップであって、宿主核酸および非宿主核酸は、アダプターライゲーションされており、アダプターは、宿主核酸および非宿主核酸の５’および３’末端にライゲーションされている、ステップと；試料を複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させるステップであって、ｇＲＮＡは、宿主核酸中の標的化部位に相補的であり、それによって一端のみでアダプターライゲーションされた宿主核酸、ならびに５’および３’末端の両方でアダプターライゲーションされた非宿主核酸を生成する、ステップと；アダプター特異的ＰＣＲを使用して生成物を増幅するもしくは精製する、またはエキソヌクレアーゼを用いて処理するステップとを含む。
別の実施形態では、試料中の標的化核酸を連続的に枯渇させるための方法であって、（ａ）宿主核酸および非宿主核酸を含む試料を準備するステップであって、非宿主核酸は、少なくとも１種の既知の非宿主生物由来の核酸および少なくとも１種の未知の非宿主生物由来の核酸を含む、ステップと；（ｂ）試料を複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させるステップであって、ｇＲＮＡは、宿主核酸中の標的化配列にハイブリダイズするように配置されており、それによって宿主核酸の一部が切断される、ステップと；（ｃ）試料を複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させるステップであって、ｇＲＮＡは、少なくとも１種の既知の非宿主核酸中の標的化配列にハイブリダイズするように配置されており、それによって少なくとも１種の既知の非宿主核酸の一部が切断される、ステップと；（ｄ）未知の非宿主生物から核酸を単離するステップとを含む、方法が本明細書に提供されている。
図１は、ヒト組織検体（１０００）を処理することに関する第１の限定されない例示的方法を提供する。第１のステップ（１００５）では、ＤＮＡ抽出により、検体（１０００）中に存在するヒト宿主の核酸配列および任意の非ヒトまたは非宿主生物の核酸配列を含む検体（１０００）から実質的にすべての核酸配列が抽出される。ＤＮＡ抽出ステップ（１００５）は、約９５％のヒトＤＮＡ（１０１０）および約５％の非ヒトＤＮＡ（１０１５）を生じさせることができ、非ヒトＤＮＡ（１０１５）は、微生物ＤＮＡを豊富に含み、本例示的方法の実施形態では、微生物ＤＮＡまたは非ヒトＤＮＡ（１０１５）は、さらなるＤＮＡ解析のための主要な目的のものである。ＤＮＡ抽出ステップ（１００５）後に、抽出された核酸配列（１０１０）および（１０１５）は断片化されて、それぞれの抽出された核酸配列の長さが、増幅、配列決定などのためにより扱いやすい長さに短縮される。断片のそれぞれの各末端にアダプター（１０２０）がライゲーションされる。それぞれの抽出された核酸配列断片またはゲノム断片はゲノムの領域を含み、例えば、各断片（１０２５）は、２つのアダプター（１０２０）間に破線で示した、ヒトゲノムの領域に由来する核酸配列を含み、一方、各断片（１０３０）は、２つのアダプター（１０２０）間に実線で示した、組織試料から抽出された非宿主生物のうちの１つの領域に由来する核酸配列を含む。それぞれの抽出された核酸またはゲノム断片はゲノムの領域を含み、例えば、各断片（１０２５）は、２つのアダプター（１０２０）間に破線で示した、ヒトゲノムの領域に由来する核酸配列を含み、一方、各断片（１０３０）は、２つのアダプター（１０２０）間に実線で示した、組織試料から抽出された非宿主生物のうちの１つの領域に由来する核酸配列を含む。しかし、配列は、さらなる解析なしで区別不能であることが認識される。
本明細書に記載の組成物および方法の例示的な用途が図１に提供されている。図は、生体試料のＤＮＡ抽出物を枯渇させるための枯渇法を含む本発明の限定されない例示的な実施形態を表す。図１において、全部の断片化されたＤＮＡ抽出物（１０２５）および（１０３０）ならびに全部のガイドＲＮＡライブラリー（１０５０）がＣａｓ９タンパク質と混合されて混合物（１０８０）となっている。混合物（１０８０）中にある間、各標的特異的ガイド配列（１０６０）は、ヒトＤＮＡ断片（１０２５）に見つかるマッチングする核酸配列にハイブリダイズし、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡステム結合部位（１０６５）は、ガイドＲＮＡ（１０５５）をヒトＤＮＡ断片（１０２５）に結合させるガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体（１０８５）を形成する。ガイドＲＮＡライブラリー（１０５０）が適切に設計されている場合、実質的にすべてのヒトＤＮＡ断片（１０２５）にガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体が結合する。その後、混合物（１０８０）は、Ｃａｓ９タンパク質が、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体が結合している各ヒトＤＮＡ断片（１０２５）の両方の鎖をカットまたは切断するようにインキュベートされる。カットした後、ヒトＤＮＡ断片（１０２５）は、２つのピース（１０９０）と（１０９５）になり、カットされなかったＤＮＡ断片（１０３０）はいずれもインタクトなままであり、アダプター（１０２０）が依然として各末端に結合しており、増幅およびさらなる研究のために準備が整っている。
枯渇標的がカットまたは切断された後に行われる様々なさらなる処理ステップでは、混合物（１０８０）をサイズ選択的にろ過してカットされた断片（１０９０）および（１０９５）からカットされなかった断片（１０３０）を分離することができる。その後、カットされなかった断片（１０３０）を増幅および配列決定することができる。代わりに、増幅プロセスを使用してカットされなかったセグメントからカットされたものを選別することができ、その理由は、一部の増幅系では、断片の各末端でアダプター（１０２０）を有するセグメントのみが増幅されるためである。
本明細書に記載の組成物および方法の別の例示的用途が図２に提供されている。図２は、分割を伴うが、枯渇を伴わない検体またはシークエンシングライブラリー（２０００）を処理することに関する第２の限定されない例示的方法を表す。第１のステップ（２００５）では、ＤＮＡ抽出により、検体（２０００）中に存在するヒト宿主の核酸配列および任意の他の非宿主生物の核酸配列を含む検体（２０００）から実質的にすべての核酸配列が抽出される。本実施例では、ＤＮＡ抽出ステップ（２００５）は、約５〜４０％のヒトＤＮＡおよび約９５〜６０％の非ヒトＤＮＡを生じさせることができる。上記図１に関して記載したように、ＤＮＡ抽出試料は、断片化およびアダプターライゲーションされる。上記図１に関してさらに記載したように、ｇＲＮＡのガイドＲＮＡライブラリー（２０５０）が、それぞれがＣａｓ９複合体による結合のために標的にされているヒトＤＮＡまたは核酸配列とハイブリダイズするように配置された多数の異なるヒト特異的ｇＲＮＡ（２０５５）とハイブリダイズするように開発される。しかし、標的化配列をカットする代わりに、図２に示した方法が使用されて、断片化された核酸試料が分割されてそれぞれ別個に増幅され得る２つの画分にされる。上述の通り、ガイドライブラリー（２０５０）および断片化されたＤＮＡ抽出試料は、混合物（２０８０）中のＣａｓ９と組み合わされる。しかし、本実施例の実施形態では、Ｃａｓ９は、触媒不活性であるＣａｓ９（ｄＣａｓ９）を含む。用語「触媒不活性である」は、不活化されたＨＮＨヌクレアーゼおよびＲｕｖＣヌクレアーゼを有するＣａｓタンパク質を指す。このようなタンパク質は、二本鎖ＤＮＡ中の標的部位（標的部位は、ガイドＲＮＡによって決定される）に結合することができるが、このタンパク質は、二本鎖ＤＮＡを切断またはニックすることができない。したがって、ｄＣａｓ９は、混合物（２０８０）を分割して非結合非ヒトＤＮＡ断片（２０３０）およびｄＣａｓ９結合ヒトＤＮＡ断片（２０９０）にする。ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体は、ｇＲＮＡ配列によって決定される標的のみに結合し、標的核酸試料の結合した部分は、ｄＣａｓ９タンパク質に先に結合させた親和性タグ（例えば、ビオチン）の結合によって取り出される。結合した核酸配列（２０９０）は、変性条件によってＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体から溶出し、次いで増幅および配列決定することができる。同様に、非結合核酸配列（２０３０）を増幅および配列決定することができる。
アダプターを用いないＤＮＡの大きい断片の枯渇
一部の実施形態では、本明細書に提供する方法は、枯渇のために使用される。しかし、アダプターを含有するライブラリーを切断する代わりに、ガイドＲＮＡが、大きいサイズ（例えば、１００ｂｐ〜１０ｋｂのいずれか）の断片化されたＤＮＡのプール中で複数回切断するのに選択される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体を用いて切断された後、ＤＮＡは、サイズ選択に付されて小さい断片（例えば、インタクトな断片の平均サイズの少なくとも１／２または１／３）が除去される。これは、例えば、５’リン酸特異的エキソヌクレアーゼであるラムダエキソヌクレアーゼでの処理によって補助される。５’リン酸特異的エキソヌクレアーゼは、５’から３’方向に進行し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質で先にカットされた任意の断片を攻撃する。次いで得られるライブラリーを、シークエンシングアダプターを要求しない単一分子シーケンサーによる配列決定に付すことができるか、またはアダプターを下流解析のためにライゲーションすることができる。
熱安定性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質を使用する枯渇
別の実施形態では、試料中の切断された標的化配列を生成する方法は、（ａ）目的の配列および切断のための標的化配列を含む試料を準備するステップと；（ｂ）試料を複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させるステップであって、ｇＲＮＡは、標的化配列に相補的であり、それによって切断された標的化配列を生成する、ステップと；（ｃ）切断された標的化配列からＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質を解離させるステップと；（ｄ）追加の切断された標的化配列を生成するステップと；（ｃ）カットされなかった目的の配列を回収するステップとを含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、熱安定性である。一部の実施形態では、切断された標的化配列からのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質の解離は、ステップ（ｂ）の混合物の温度を少なくとも７５°に上昇させることによって達成される。一部の実施形態では、追加の切断された標的化配列の生成は、ステップ（ｂ）の混合物の温度を少なくとも５０°に下げることによって達成される。
別の実施形態では、試料中の標的化配列を枯渇させる方法は、（ａ）目的の配列および枯渇のための標的化配列を含む試料を準備するステップと；（ｂ）試料を複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させるステップであって、ｇＲＮＡは、標的化配列に相補的であり、それによって切断された標的化配列を生成し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は熱安定性である、ステップと、；（ｃ）ステップ（ｂ）の混合物の温度を少なくとも７５°に上昇させるステップと；（ｄ）ステップ（ｂ）の混合物の温度を少なくとも５０°に下げるステップと；ステップ（ｃ）および（ｄ）を少なくとも１回繰り返すステップと；（ｆ）カットされなかった目的の配列を回収するステップとを含む。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質ニッカーゼの存在下でのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質媒介枯渇
一部の実施形態では、不要な標的化核酸の枯渇は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質ニッカーゼを使用して実行することができる。一実施形態では、本方法は、除去されるＤＮＡ（例えば、目的のものでないヒトＤＮＡ）および目的のＤＮＡ（例えば、未知の病原体由来のＤＮＡ）を含むＤＮＡシークエンシングライブラリーを作製するステップと；枯渇されるすべてのＤＮＡが、反対のＤＮＡ鎖上で近接して（例えば、１５塩基未満離れて）２つのガイドＲＮＡ結合部位を有するようにガイドＲＮＡを設計するステップと；ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質ニッカーゼおよびガイドＲＮＡをＤＮＡライブラリーに加えるステップとを含む。本実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質ニッカーゼは、除去されるＤＮＡ上のその標的部位を認識することができ、１本の鎖のみをカットする。枯渇されるＤＮＡに関して、２つの別個のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質ニッカーゼは、近接している除去されるＤＮＡ（例えば、ヒトＤＮＡ）の両方の鎖をカットすることができ、除去されるＤＮＡ（例えば、ヒトＤＮＡ）のみが、近接して２つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質ニッカーゼ部位を有し、それが二本鎖切断を生じる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質ニッカーゼが目的のＤＮＡ（例えば、病原体ＤＮＡ）上の部位を非特異的にまたは低親和性で認識する場合、これは１本の鎖のみをカットすることができ、それは、ＤＮＡ分子の後続のＰＣＲ増幅または下流のプロセシングを防止しない。これは、図７に図解で表されている。本実施形態では、２つのガイドＲＮＡが十分に近接している２つの部位を非特異的に認識する見込みは、無視できる（＜１×１０−１４）。本実施形態は、標準のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質媒介切断が目的のＤＮＡをあまりにも多くカットする場合、特に有用である。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質媒介枯渇およびビオチン標識
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質切断生成物は、ビオチンを使用して排除される。例えば、５％未満の目的のＤＮＡおよび枯渇のために標的にされる９５％超のＤＮＡを最初に含む試料では、９５％超のＤＮＡは、断片化および枯渇され、ビオチン標識を含むカットされなかった（５％未満の目的のＤＮＡ）ＤＮＡは、ストレプトアビジンビーズへの結合によって精製される。本実施例は、エキソヌクレアーゼを使用しないＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質媒介切断後に不要なＤＮＡ（枯渇された断片化されたＤＮＡ）を除去する方法を例示する。
例示的な実施形態を図１０に表す。この例示的な実施形態では、ＤＮＡ混合物（９５％超の不要なヒトＤＮＡおよび５％未満の目的の他のＤＮＡを含有する）は、標準のプロトコールに従って断片化され、末端修復され、アダプターにライゲーションされ、次いでビオチン−Ｐ５（例えば、５’ビオチン−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ）およびＰ７（例えば、５’−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡ）のプライマーを使用するＰＣＲによって増幅される。これは、シークエンシングライブラリー全体がＤＮＡ分子の一端のみに５’ビオチン標識を有することを保証する。次いでＤＮＡ混合物は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質（例えば、Ｃａｓ９）消化に付され、例えば、この場合に関して、ミトコンドリアＤＮＡ（不要なＤＮＡ）に対するガイドＲＮＡライブラリーと複合体形成される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質によって切断されたＤＮＡ分子（例えば、この場合、ミトコンドリアＤＮＡ）は、ビオチン標識アダプターを失い、よって配列決定またはＰＣＲ増幅され得ず、一方、Ｃａｓ９によってカットされなかったインタクトなＤＮＡライブラリー（例えば、この場合、目的の非ミトコンドリアＤＮＡ）は、ビオチン標識を依然として担持する。結果として、次いでＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質によってカットされなかったインタクトなＤＮＡを、ストレプトアビジンビーズを加えることによって回収することができる。次いで試料をさらなる富化のためにさらなる下流用途、例えば、配列決定、クローニングに付すことができる。
枯渇後のエキソヌクレアーゼ処理
一部の実施形態では、ＰＣＲ増幅または配列決定の前にカットされた断片を除去することが望ましい。
一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質媒介枯渇の後にエキソヌクレアーゼ処理が続く。エキソヌクレアーゼ処理は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質切断核酸をさらに分解する一方、目的の配列を含むカットされなかった核酸をインタクトのままにすることができる。
一実施形態では、試料中の標的化配列を枯渇させる方法は、目的の配列および枯渇のための標的化配列を含む試料を準備するステップと；試料を複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させるステップであって、ｇＲＮＡは、標的化配列に相補的であり、それによって切断された標的化配列を生成する、ステップと；ステップ（ｂ）の生成物をエキソヌクレアーゼと接触させるステップとを含む。一実施形態では、エキソヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼＩＩＩである。別の実施形態では、エキソヌクレアーゼは、ＢＡＬ−３１である。
例示的な一実施形態では、ＤＮＡが生体試料から抽出され、断片化され、こうしてＤＮＡの断片を含むライブラリー、例えば、シークエンシングライブラリーが作製される。Ｙ形アダプターまたは円形アダプターがＤＮＡ断片にライゲーションされる。ＤＮＡ断片は、目的のＤＮＡ配列および標的化配列（目的のものでないＤＮＡ）を含む。ライブラリーを複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、目的のものでない標的ＤＮＡをカットし、目的の他のＤＮＡ配列をインタクトなままにする。得られる生成物をエキソヌクレアーゼＩＩＩと接触させる。エキソヌクレアーゼＩＩＩは、平滑末端または５’オーバーハングを使用することによって１本のＤＮＡ鎖の単方向３’＞５’分解を開始し、一本鎖ＤＮＡおよびヌクレオチドを生じさせることができる。これは、一本鎖ＤＮＡ上で活性でなく、よってＹ形アダプター末端などの３’オーバーハングは、分解に抵抗性である。結果として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質によってカットされなかったインタクトな二本鎖ＤＮＡライブラリーは、エキソヌクレアーゼＩＩＩによって消化されず、一方、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質によって切断されたＤＮＡ分子は、Ｃａｓ９によってカットされた平滑末端からアダプターに向かうその３’＞５’活性でエキソヌクレアーゼＩＩＩによって分解される。図８は、例示的な実施形態を例示する。ＤＮＡ混合物（９５％超の不要なヒトＤＮＡおよび５％未満の目的の他のＤＮＡを含有する）は、標準のプロトコールに従って断片化され、末端修復され、Ｙ形アダプター（または円形アダプター）にライゲーションされるが、ＰＣＲによって増幅されない。次いでＤＮＡ混合物は、Ｃａｓ９消化に付され、例えば、この場合に関して、ミトコンドリアＤＮＡに対するガイドＲＮＡライブラリーと複合体形成される。エキソヌクレアーゼＩＩＩが添加される。不要なミトコンドリアＤＮＡは、消化される。次いで残っているインタクトな二本鎖ＤＮＡライブラリーは、カラム精製によって回収され、かつ／またはＰＣＲ増幅される。
別の例示的な実施形態では、エキソヌクレアーゼＢＡＬ−３１が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質切断ＤＮＡを分解し、一方カットされなかった目的のＤＮＡをインタクトなままにするのに使用される。例示的な一実施形態では、ＤＮＡが生体試料から抽出され、断片化され、こうしてＤＮＡの断片を含むライブラリー、例えば、シークエンシングライブラリーが作製される。ＤＮＡ断片は、目的のＤＮＡ配列および標的化配列（目的のものでないＤＮＡ）を含む。断片の３’末端は、ターミナルトランスフェラーゼを使用してポリ−ｄＧをテール付加される。ライブラリーを複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、目的のものでない標的ＤＮＡをカットし、目的の他のＤＮＡ配列をインタクトなままにする。得られる生成物をエキソヌクレアーゼＢＡＬ−３１と接触させる。エキソヌクレアーゼＢＡＬ−３１は、２つの活性：二本鎖ＤＮＡエキソヌクレアーゼ活性および一本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する。二本鎖ＤＮＡエキソヌクレアーゼ活性は、ＢＡＬ−３１が両方の鎖の開放端からＤＮＡを分解することを可能にし、こうして二本鎖ＤＮＡのサイズを低減する。インキュベーションが長いほど、二本鎖ＤＮＡのサイズの低減が大きくなり、中程度から大型のＤＮＡ（＞２００ｂｐ）を枯渇させるのに有用になる。ＢＡＬ−３１の一本鎖エンドヌクレアーゼ活性は、それがポリ−Ａ、−Ｃ、または−Ｔを非常に急速に消化することを可能にするが、ポリ−Ｇの消化は極めて弱いことが注目された（MarroneおよびBallantyne、２００８年）。この特質のために、ライブラリーの３’末端で一本鎖ポリ−ｄＧを付加することは、ＢＡＬ−３１によって分解されることからの保護として機能を果たす。結果として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質によって切断されたＤＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質によってカットされた二本鎖平滑末端からポリ−ｄＧを担持する他方の末端に向かうその二本鎖ＤＮＡエキソヌクレアーゼ活性でＢＡＬ−３１によって分解され、枯渇を行うことができ、一方、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質によってカットされなかったインタクトなＤＮＡライブラリーは、これらの３’末端ポリ−ｄＧ保護に起因してＢＡＬ−３１によって消化されない。図９は、この手法の例示的な実施形態を表す。シークエンシングライブラリー（例えば、９５％超のヒトＤＮＡおよび５％未満の他のものを含有する）が調製される。ライブラリーは、ターミナルトランスフェラーゼを使用して３’末端でポリ−ｄＧをテール付加される。次いでポリ−ｄＧテール付加ライブラリーは、Ｃａｓ９消化に付され、ガイドＲＮＡライブラリー、例えば、ミトコンドリアＤＮＡに対するガイドＲＮＡライブラリーと複合体形成される。次いで生成物は、エキソヌクレアーゼＢＡＬ−３１とともにインキュベートされ、それにより、ポリ−ｄＧによってキャッピングされていない末端の消化が開始される。次いで生成物は、さらなるＰＣＲに付され、またはＤＮＡ精製カラムで精製される。次いで残っているインタクトな二本鎖ＤＮＡライブラリーをカラム精製によって回収し、またはＰＣＲ増幅することができる。
枯渇をモニターするための対照
論じた実施形態では、陽性対照および／または陰性対照を提供することが望ましい。陽性対照は、標的核酸の枯渇が忠実に進行することを保証することができる。
一部の実施形態では、試薬の対照セットは、試薬の陽性対照セット、陽性対照標的配列である。例示的な実施形態では、試薬の陽性対照セットは、核酸断片のコレクションを含み、断片は、ｇＲＮＡが少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％相補的である標的配列を含む。この対照は、ユーザーの反応と並行してランさせてすべてのコンポーネントが適切に働いているのを保証することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質で枯渇させた後、陽性対照標的配列の排除をゲル電気泳動またはｑＰＣＲによって測定することができる。
一部の実施形態では、試薬の対照セットは、試薬の陰性対照セットである。一部の実施形態では、陰性対照は、オフターゲットカッティングが最小限または非存在であることを保証する。例示的な実施形態では、試薬の陰性対照セットは、ｇＲＮＡの第２のセットを含み、ｇＲＮＡの第２のセットは、ｇＲＮＡの第１のセットと比較して標的配列への結合の低減を呈する。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの第２のセットは、ＲＮＡの第１のセットと比較して５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、または８５％の標的配列への結合の低減を呈する。別の例示的な実施形態では、試薬の陰性対照セットは、ｇＲＮＡの第２のセットを含み、ｇＲＮＡの第２のセットは、標的配列と５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％以下、相補的である。陰性対照は、使用されるｇＲＮＡと１００％未満の同一性を伴った、例えば、標的特異的配列に対して１、２、３、４、５、またはそれ超のミスマッチを伴った一連のｇＲＮＡであり得る。一部の実施形態では、試薬の陰性対照セットは、核酸断片のコレクションを含み、断片は、ｇＲＮＡの第１のセットと５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％以下、相補的である。ＤＮＡライブラリーは、例えば、ｇＲＮＡの相補配列に対して１、２、３、４、５、またはそれ超のミスマッチを伴って、キットにおいて使用されるｇＲＮＡの標的化配列と１００％未満の同一性を有し得る。この対照は、ユーザーの反応と並行してランさせて、すべてのコンポーネントが適切に働いているのを保証し、酵素の任意のオフターゲット活性を測定することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質で枯渇させた後、オフターゲット枯渇の量をゲル電気泳動またはｑＰＣＲによって測定することができる。
本明細書で企図する陽性および陰性対照に関して、ｇＲＮＡの、本明細書に提供するその標的に対する相補性は、標的の全長に沿ったｇＲＮＡの相補性を指すことができる。しかし一部の実施形態では、相補性は、ＰＡＭ配列に最も近く結合するエリアで、ｇＲＮＡの終端における核酸のミスマッチによってより影響を受け得る。この領域中のミスマッチは、ｇＲＮＡに沿った他の場所の核酸のミスマッチより大きい様式で標的を結合させる能力に影響を与え得る。同様に、ＰＡＭ配列からさらに離れたｇＲＮＡ中のミスマッチは、ｇＲＮＡに沿った他の場所の核酸のミスマッチより小さく、標的を結合させる能力に影響を与え得る。一部の実施形態では、陰性対照ｇＲＮＡは、ＰＡＭ配列の近くでより低い相補性（complimentarily）を有するが、ＰＡＭ配列からさらに遠く離れたところでより高い相補性を有する。例えば、一部の実施形態では、陰性対照ｇＲＮＡは、ＰＡＭ配列の近くで５０％〜７０％の相補性を有するが、ＰＡＭ配列から遠く離れたところで７０％〜１００％の相補性を有する。一部の実施形態では、陰性対照ｇＲＮＡは、標的の全長に沿って５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の相補性を有する。
ＡＴＡＣ−ｓｅｑ後のミトコンドリアＤＮＡの枯渇
配列決定を使用するトランスポサーゼアクセス可能クロマチンのアッセイ（ＡＴＡＣ−ｓｅｑ）技法が、クロマチン、すなわちそのアクセス可能な部位を研究するのに分子生物学において使用されている。この方法は、オープンクロマチン領域をトランスポサーゼによってシークエンシングアダプターでタグ付けすることに基づき、その結果これらのオープンクロマチン領域由来のＤＮＡ断片を増幅し、ハイスループットシークエンシングに付すことができる（ＷＯ２０１４／１８９９５７；Buenrostroら、Nature Methods、１０巻、１２号、２０１３年１２月、１２１３頁）。ＡＴＡＣ−ｓｅｑは、ゲノムワイドクロマチンアクセシビリティについての他のアッセイと比較してはるかに少ない出発材料を必要とするが、主な欠点の１つは、シークエンシングライブラリーは、高いパーセンテージのミトコンドリアＤＮＡ（これもオープンＤＮＡである）が混入していることが多く、ヒトゲノムの標準的なアクセシビリティ研究、例えば、ＤＮａｓｅ−ｓｅｑおよびＦＡＩＲＥ−ｓｅｑについてはるかに多くのシークエンシングリードを要求することである（M. TsompanaおよびMJ. Buck、２０１４年）。したがって、配列決定コストを減少させるために、ＡＴＡＣ−Ｓｅｑ手順後にシークエンシングライブラリーから不要なミトコンドリアＤＮＡ汚染を除去する必要性が当技術分野において存在する。本開示は、ＡＴＡＣ−Ｓｅｑを受けた試料からミトコンドリアＤＮＡを選択的に枯渇させる方法を提供する。
ゲノムＤＮＡを解析するための方法であって、（ａ）細胞の集団から単離されたＤＮＡを挿入酵素で処理して、非ミトコンドリアゲノムＤＮＡの複数のタグ付き断片を生成し、それによって残留量のタグ付きミトコンドリアＤＮＡも生成する、ステップと；（ｂ）本明細書に提供する富化または枯渇法のいずれかに従って、ステップ（ａ）の生成物を非ミトコンドリアＤＮＡについて富化するステップとを含む、方法が本明細書に提供されている。一部の実施形態では、本方法は、タグ付き断片の少なくとも一部を配列決定して複数の配列リードを生成するステップと；配列リードから得た情報を前記細胞のゲノムの領域にマッピングすることによって該領域のエピジェネティックマップを作製するステップとをさらに含む。
別の態様では、本開示は、一部位における、細胞試料由来であるポリヌクレオチドのアクセシビリティの決定を補助するための方法であって、挿入酵素によりポリヌクレオチド中に複数の分子タグを挿入し、分子タグを使用してその部位におけるアクセシビリティを決定するステップと、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ベース枯渇法を使用して不要なＤＮＡ汚染物質を除去するステップとを含む、方法を提供する。細胞試料は、プライマリソース由来であり得る。細胞試料は、単一細胞からなり得る。細胞試料は、有限の数の細胞（例えば、約５００，０００細胞未満）からなり得る。
挿入酵素は、ポリヌクレオチド中に核酸配列を挿入することができる任意の酵素であり得る。一部の場合では、挿入酵素は、実質的に配列非依存性の様式でポリヌクレオチド中に核酸配列を挿入することができる。挿入酵素は、原核生物の挿入酵素または真核生物の挿入酵素であり得る。挿入酵素の例としては、それだけに限らないが、トランスポサーゼ、ＨＥＲＭＥＳ、およびＨＩＶインテグラーゼが挙げられる。トランスポサーゼは、Ｔｎトランスポサーゼ（例えば、Ｔｎ３、Ｔｎ５、Ｔｎ７、Ｔｎ１０、Ｔｎ５５２、Ｔｎ９０３）、ＭｕＡトランスポサーゼ、Ｖｉｂｈａｒトランスポサーゼ（例えば、Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ由来）、Ａｃ−Ｄｓ、Ａｓｃｏｔ−Ｉ、ＢｓＩ、Ｃｉｎ４、Ｃｏｐｉａ、Ｅｎ／Ｓｐｍ、Ｆエレメント、ｈｏｂｏ、Ｈｓｍａｒｌ、Ｈｓｍａｒ２、ＩＮ（ＨＩＶ）、ＩＳＩ、ＩＳ２、ＩＳ３、ＩＳ４、ＩＳ５、ＩＳ６、ＩＳＩＯ、ＩＳ２Ｉ、ＩＳ３０、ＩＳ５０、ＩＳＳＩ、ＩＳＩ５０、ＩＳ２５６、ＩＳ４０７、ＩＳ４２７、ＩＳ６３０、ＩＳ９０３、ＩＳ９１１、ＩＳ９８２、ＩＳ１０３Ｉ、ＩＳＬ２、ＬＩ、マリナー、Ｐエレメント、Ｔａｍ３、Ｔｅｌ、Ｔｃ３、Ｔｅｌ、ＴＨＥ−Ｉ、Ｔｎ／Ｏ、ＴｎＡ、Ｔｎ３、Ｔｎ５、Ｔｎ７、ＴｎｌＯ、Ｔｎ５５２、Ｔｎ９０３、Ｔｏｌｌ、Ｔｏｌ２、ＴｎｌＯ、Ｔｙｌ、任意の原核生物トランスポサーゼ、または上記に列挙したものに関連した、および／もしくはそれに由来する任意のトランスポサーゼであり得る。ある特定の場合では、親トランスポサーゼに関連した、および／またはそれに由来するトランスポサーゼは、親トランスポサーゼの対応するペプチド断片と少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％のアミノ酸配列相同性を有するペプチド断片を含み得る。ペプチド断片は、長さが少なくとも約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約４００、または約５００アミノ酸であり得る。例えば、Ｔｎ５に由来するトランスポサーゼは、長さが５０アミノ酸であり、親Ｔｎ５トランスポサーゼ中の対応する断片と約８０％相同であるペプチド断片を含み得る。一部の場合では、挿入は、１種または複数種のカチオンの添加によって促進および／または誘発され得る。カチオンは、二価カチオン、例えば、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、およびＭｎ２＋などであり得る。
分子タグは、シークエンシングアダプター、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、ｚｉｐ核酸（ＺＮＡ）、ＲＮＡ、親和性反応性分子（affinity reactive molecule）（例えば、ビオチン、ｄｉｇ）、自己相補的分子、ホスホロチオエート修飾、アジド基またはアルキン基を含み得る。一部の場合では、シークエンシングアダプターは、バーコード標識をさらに含み得る。さらに、バーコード標識は、ユニーク配列を含み得る。ユニーク配列は、個々の挿入事象を同定するのに使用することができる。タグのいずれも、蛍光タグ（例えば、フルオレセイン、ローダミン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、チアゾールオレンジなど）をさらに含み得る。
キットおよび製造品
本願は、アダプター、ｇＲＮＡ、ｇＲＮＡライブラリーなどに限定されない、本明細書に記載の組成物のいずれか１つまたは複数を含むキットを提供する。
一実施形態では、キットは、ｇＲＮＡのコレクションまたはライブラリーを含み、ｇＲＮＡは、ヒトＤＮＡ配列を標的にしている。別の実施形態では、キットは、ｇＲＮＡのコレクションまたはライブラリーを含み、ｇＲＮＡは、ウシＤＮＡ配列を標的にしている。別の実施形態では、キットは、ｇＲＮＡのコレクションまたはライブラリーを含み、ｇＲＮＡは、ヒトリボソームＲＮＡ配列を標的にしている。別の実施形態では、キットは、ｇＲＮＡのコレクションまたはライブラリーを含み、ｇＲＮＡは、ヒトミトコンドリアＤＮＡ配列を標的にしている。
一部の実施形態では、キットは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質およびｇＲＮＡを含み、ｇＲＮＡは、ミトコンドリアＤＮＡに相補的であり；またはｇＲＮＡは、ゲノム全体に相補的であり；またはｇＲＮＡは、全トランスクリプトームから作製されるｃＤＮＡに相補的であり；またはｇＲＮＡは、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２５０、少なくとも５００、少なくとも７５０、少なくとも１０２、少なくとも１０３、少なくとも１０４、少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９、少なくとも１０１０のユニーク転写物から作製されるｃＤＮＡに相補的であり；またはｇＲＮＡは、トランスクリプトームにおける最も豊富な転写物、例えば、トランスクリプトームにおける最も豊富な１００、７５、５０、２５、２０、１５、もしくは１０の転写物から作製されるｃＤＮＡに相補的であり；またはｇＲＮＡは、トランスクリプトームにおける最も豊富な１００、７５、５０、２５、２０、１５、もしくは１０の転写物のサブセットから作製されるｃＤＮＡに相補的である。
一部の実施形態では、キットは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質およびｇＲＮＡを含み、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、異なる細菌由来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質の混合物を含み；またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、操作されており；ｇＲＮＡは、ミトコンドリアＤＮＡに相補的であり；またはｇＲＮＡは、ゲノム全体を代表するゲノムＤＮＡに相補的であり；またはｇＲＮＡは、全トランスクリプトームに由来するｃＤＮＡライブラリーに相補的であり；またはｇＲＮＡは、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２５０、少なくとも５００、少なくとも７５０、少なくとも１０２、少なくとも１０３、少なくとも１０４、少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９、少なくとも１０１０のユニーク転写物に由来するｃＤＮＡライブラリーに相補的であり；またはｇＲＮＡは、トランスクリプトームにおける最も豊富な１００、７５、５０、２５、２０、１５、もしくは１０の転写物に由来するｃＤＮＡライブラリーに相補的であり；またはｇＲＮＡは、トランスクリプトームにおける最も豊富な１００、７５、５０、２５、２０、１５、もしくは１０の転写物のサブセットに由来するｃＤＮＡライブラリーに相補的であり；またはｇＲＮＡは、異なる細菌種由来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質を標的配列に向けることができるｇＲＮＡの混合物を含む。
一部の実施形態では、キットは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質；目的の標的に相補的であるｇＲＮＡ；およびエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を含む。一実施形態では、エキソヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼＩＩＩである。一実施形態では、エキソヌクレアーゼは、ＢＡＬ−３１である。
一部の実施形態では、キットは、熱安定性であるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質；および目的の標的に相補的であるｇＲＮＡを含む。
一部の実施形態では、キットは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質；および目的の標的配列に相補的であるｇＲＮＡの第１のセット；および試薬の対照セットを含む。一実施形態では、試薬の対照セットは、試薬の陽性対照セットである。例示的な実施形態では、試薬の陽性対照セットは、核酸断片のコレクション、陽性対照標的配列を含み、断片は、ｇＲＮＡが相補的である標的配列を含む。一実施形態では、試薬の対照セットは、試薬の陰性対照セットである。例示的な実施形態では、試薬の陰性対照セットは、ｇＲＮＡの第２のセットを含み、ｇＲＮＡの第２のセットは、ｇＲＮＡの第１のセットと比較して標的配列への結合の低減を呈する。別の例示的な実施形態では、試薬の陰性対照セットは、核酸断片のコレクションを含み、断片は、ｇＲＮＡの第１のセットに９０％以下、相補的である。
一部の実施形態では、キットは、細胞の集団からＤＮＡを単離するための試薬；挿入酵素；ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質；および複数のｇＲＮＡを含み、ｇＲＮＡは、ミトコンドリアＤＮＡに相補的であり；またはｇＲＮＡは、ゲノム全体に相補的であり；またはｇＲＮＡは、全トランスクリプトームに相補的であり；またはｇＲＮＡは、トランスクリプトームにおける上位１００、７５、５０、２５、２０、１５、もしくは１０の遺伝子に相補的である。
本願は、本明細書に記載のキットのいずれか１つを含む製造品も提供する。製造品の例には、バイアル（密封バイアルを含む）が含まれる。
以下の実施例は、例示的な目的で含められており、本発明の範囲を限定するように意図されていない。
（実施例１）ＡＴＡＣ−ｓｅｑライブラリー、ライブラリー１からのミトコンドリアＤＮＡの枯渇
概要
図４で図示されるように、枯渇法を、先に配列決定され、９４％ヒト核ＤＮＡおよび６％ミトコンドリアＤＮＡからなることが示されている、ヒトＤＮＡライブラリー（ライブラリー１）において検査した。枯渇を、組換えＣａｓ９およびミトコンドリアＤＮＡに関して特異的に設計された２５種のガイドＲＮＡのライブラリーを用いて実施した。対照の枯渇を、ミトコンドリアＤＮＡを標的にしない無関係のガイドＲＮＡを用いて実施した。約４０％のヒトミトコンドリアＤＮＡを枯渇させた。枯渇を、２０分間で完了し、次いでＰＣＲでライブラリーを増幅させた。
Ｃａｓ９の発現
Ｃａｓ９（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来）を、ｐＥＴ３０発現ベクター（ＥＭＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にクローニングして、Ｃａｓ９開始コドンのすぐ上流にヘキサヒスチジンタグを挿入した。生じたプラスミドを、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ＢＬ２１細菌株（ＥＭＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に形質転換し、１ＬのＬＢ培地で激しく通気しながら、培養物の光学密度（６００ｎｍでのＯＤ）が０．４に達するまで成長させた。温度を２５℃に低下させ、０．２ｍＭ ＩＰＴＧを加え、培養物をさらに４時間成長させた。細胞を、次に遠心分離（１，０００×ｇ、２０分間、４℃）によって採集し、１０ｍｌ結合緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール、０．０５％ＮＰ４０）に再懸濁し、超音波処理（３０％パワーで７×１０秒のバースト、Ｓｏｎｉｆｉｅｒ２５０、Ｂｒａｎｓｏｎ）によって溶解させた。不溶性の細胞残屑を、１０，０００×ｇ、２０分間での遠心分離によって除去し；可溶性タンパク質を含有する上清を、次に０．４ｍｌのＮＴＡビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）と混合し、カラムにロードした。ビーズを、４ｍｌ結合緩衝液で３回洗浄し、次に２５０ｍＭイミダゾールを補充した３ｘ０．５ｍｌの結合緩衝液で溶出した。溶出した画分を次に濃縮し、緩衝液を３０，０００ＭＷＣＯタンパク質濃縮器（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて貯蔵緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、５０％グリセロール）で交換し、ＳＤＳ ＰＡＧＥによって検証し、次いでＣｏｌｌｏｉｄａｌ Ｂｌｕｅ染色（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）し、定量し、次に−２０℃で後に使用するまで貯蔵した。
変異体Ｃａｓ９ニッカーゼ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９のＤ１０Ａ変異体）を産生し、上記の通りＣａｓ９を産生させるために使用した同じ手順を用いて精製した。
ガイドＲＮＡライブラリーの調製
２５の構築物を、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、２０塩基対のミトコンドリアＤＮＡ特異的配列、およびＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のガイドＲＮＡ足場を各自含有させて設計した。各構築物について、２種のオリゴヌクレオチドを注文し（配列については表１および表２を参照されたい）、５μｌ中に１μＭの最終濃度で組み合わせ、次に９８℃、３分間加熱し、次に５℃／分の割合で５５℃に冷却し、最終的に５５℃で５分間インキュベートした。
アニーリングしたオリゴを、次にゴールデンゲートクローニングによりガイドＲＮＡ足場を含有する、Ｔ７ＧＲＮＥベクターにライゲーションした；アニーリングしたオリゴを、総容積２０μｌ中の５００ｎｇのＴ７ＧＲＮＥプラスミド、１μｌのＢｓａＩ制限酵素および１μｌのＴ７ ＤＮＡリガーゼに組み合わせた。反応物を、３７℃で１５分間、次いで２０℃で１０分間の１０サイクル、次いで８０℃で１５分間の１サイクルにわたり、サーマルサイクラーでインキュベートした。生成物を、次に特異的なフォワードプライマー（表１および表２を参照されたい）およびリバースプライマー（５’−ＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＴＡＴＧＴＡＧＧ−３’）を用いてＰＣＲ増幅した。サイクリング条件は、９５℃で１分間、５７℃で３０秒間、および７２℃で９０秒間の３０サイクルであった。反応の成功を、アガロースゲル電気泳動およびＳＹＢＲセーフ染色による１．６ｋｂ断片の存在によって確認した。成功した反応物を一緒にプールし、ＰＣＲクリーンアップキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて精製した。
ガイドＲＮＡを、以下の規則を用いて設計した：
規則１： 任意の鎖における目的のゲノム領域（例えば、全エクソームまたはミトコンドリアゲノム）において以下の配列（５’＞３’方向）を見出した：ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＧ
規則２： 下線を引いた配列（２０マー）は、注文したオリゴヌクレオチドに含まれるガイドＲＮＡのターゲティング部分である。
ａ． ５５％超のＧＣ含量を有する任意の２０マーを排除した。
ｂ． 塩基対を形成する１３超のステムループ（例えば、ＭｆｏｌｄまたはＶｉｅｎｎａソフトウェアのいずれかにより予測される）を有する任意の２０マーを排除した。
ｃ． ２０マーの第１のヌクレオチドがＡ／Ｇではない場合、１つのＧ残基を５’末端に付加して２１マーを得た。
ｄ． 規則３： Ｔ７プロモーターおよびプライマー結合部位を付加して以下のプライマー（５’＞３’）を得た：ＧＣＣＴＣＧＡＧＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ（Ｇ）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ
（Ｇ）は、２０マーがプリンを５’末端に有していない場合に、Ｇが付加されることを示す。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写
ガイドライブラリーをガイドＲＮＡに転写するため、本発明者らは、１０μｌ精製ライブラリー（約５００ｎｇ）、６．５μｌのＨ２Ｏ、２．２５μｌのＡＴＰ、２．２５μｌのＣＴＰ、２．２５μｌのＧＴＰ、２．２５μｌのＵＴＰ、２．２５μｌ １０×反応緩衝液（ＮＥＢ）および２．２５μｌのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼミックスのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応混合物を作製した。反応物を３７℃で２４時間インキュベートし、次にＨ２Ｏ中で１０倍希釈した。単一反応により、約４０μｇのＲＮＡを生成した。ＲＮＡ（約１５０塩基対）の収量およびサイズを、１μｌの反応物を５％ＴＢＥ／尿素ゲルで泳動し、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色することによって確認した。
ＤＮＡ特異的なＣａｓ９媒介性枯渇
希釈したガイドＲＮＡ（１μｌ、２ｐｍｏｌと等価）を、３μｌ １０×Ｃａｓ９反応緩衝液（ＮＥＢ）、２０μｌ Ｈ２Ｏおよび１μｌの組換えＣａｓ９酵素（ＮＥＢ、１ｐｍｏｌ／μｌ）と組み合わせた。以下の配列（５’−ＧＧＡＴＴＴＡＴＡＣＡＧＣＡＣＴＴＴＡＡ−３’）を標的にする対照ガイドＲＮＡを用いる対照反応を、同じパラメータを用いて別々に実施した。この配列は、ヒト染色体ＤＮＡまたはミトコンドリアＤＮＡのいずれかに非存在である。反応物を３７℃で１５分間インキュベートし、次に５μｌの希釈したＤＮＡライブラリー（５０ｐｇ／μｌ）を補充し、３７℃で連続的に９０分間インキュベーションした。１：１００希釈のＲＮａｓｅＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、９８℃に５分間加熱し、次に室温に冷却し、１００μｌ Ｈ２Ｏを添加して、反応を終結させた。反応物を、次に−２０℃で使用まで貯蔵した。
枯渇後のミトコンドリアＤＮＡの定量
各反応（各検査条件および対照ガイドＲＮＡを用いる反応）について、２つの別々の５μｌ試料を、対照プライマーおよび検査プライマーの両方を用いてリアルタイムＰＣＲによって解析した。対照プライマー反応について、試料を、２μｌ Ｈ２Ｏ、０．２５μｌの１０μＭプライマーＰ５（５’−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ−３’）、および０．２５μｌの１０μＭ Ｐ７、（５’−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡ−３’）および７．５μｌの２×Ｍａｘｉｍａ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とインキュベートした。検査プライマー反応について、試料を、１．７５μｌ Ｈ２Ｏ、０．５μｌの１０μＭミトコンドリアプライマー（表１および表２を参照されたい）、および０．２５μｌの１０μＭ Ｐ７（５’−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡ−３’）および７．５μｌの２×Ｍａｘｉｍａ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とインキュベートした。反応物を、９５℃で３分間、次いで９５℃で１０秒間、５５℃で４５秒間の４０サイクルの２ステップサイクリング条件を用いてｉＣｙｃｌｅｒリアルタイムＰＣＲサーマルサイクラー（ＢｉｏＲａｄ）中でインキュベートした。
２つのリアルタイムＰＣＲ条件について、対照プライマーおよび検査プライマーを用いて、較正曲線を作成した。希釈したＤＮＡライブラリー（５０ｐｇ／μｌ）を１：１０、１：１００、１：１０００、１：１０，０００にさらに希釈し、これらの希釈物を上記の同じ反応条件、機器およびサイクリング条件を用いるリアルタイムＰＣＲによって解析した。
全ＤＮＡおよびミトコンドリアＤＮＡの量を、それぞれ対照プライマーおよび検査プライマー反応の結果から導き出した。各ＤＮＡライブラリー枯渇実験について、ミトコンドリアＤＮＡ：全ＤＮＡの比を決定し、対照ガイドＲＮＡを用いる実験に対して正規化し、次に図４に示される棒グラフとしてプロットした。
（実施例２）ＡＴＡＣ−ｓｅｑライブラリー、ライブラリー２からのミトコンドリアＤＮＡの枯渇
概要
図５および図６で図示されるように、枯渇法を、先に配列決定され、５５％ヒト核ＤＮＡおよび４５％ミトコンドリアＤＮＡからなることが示されている、ヒトＤＮＡライブラリー（ライブラリー２）において検査した。枯渇を、組換えＣａｓ９およびミトコンドリアＤＮＡに関して特異的に設計された９０種のガイドＲＮＡのライブラリーを用いて実施したところ、ミトコンドリアゲノム中のギャップは残っていなかった。対照の枯渇を、ミトコンドリアＤＮＡを標的としない無関係のガイドＲＮＡを用いて実施した。
プレおよびポスト捕獲ライブラリーを、２つの異なるプライマーのセットＰ５とＰ７（これは全てのＤＮＡライブラリー断片を増幅する）またはミトコンドリアＤＮＡのみを増幅するミトコンドリアＤＮＡ特異的プライマーを用いるリアルタイムＰＣＲによって定量した。これらの２つの別々の反応物の比を使用して、ミトコンドリアＤＮＡの枯渇を定量した。
プレおよびポスト捕獲ライブラリーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑプラットフォームでも配列決定を行い、生じたリードをヒトゲノムにマッピングしてミトコンドリアＤＮＡ含量を決定した。
Ｃａｓ９の発現
Ｃａｓ９（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来）を、ｐＥＴ３０発現ベクター（ＥＭＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にクローニングして、Ｃａｓ９開始コドンのすぐ上流にヘキサヒスチジンタグを挿入した。生じたプラスミドを、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ＢＬ２１細菌株（ＥＭＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に形質転換し、１ＬのＬＢ培地で激しく通気しながら、培養物の光学密度（６００ｎｍでのＯＤ）が０．４に達するまで成長させた。温度を２５℃に低下させ、０．２ｍＭ ＩＰＴＧを加え、培養物をさらに４時間成長させた。細胞を、次に遠心分離（１，０００×ｇ、２０分間、４℃）によって採集し、１０ｍｌ結合緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール、０．０５％ＮＰ４０）に再懸濁し、超音波処理（３０％パワーで７×１０秒のバースト、Ｓｏｎｉｆｉｅｒ２５０、Ｂｒａｎｓｏｎ）によって溶解させた。不溶性の細胞残屑を、１０，０００×ｇ、２０分間での遠心分離によって除去し；可溶性タンパク質を含有する上清を、次に０．４ｍｌのＮＴＡビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）と混合し、カラムにロードした。ビーズを、４ｍｌ結合緩衝液で３回洗浄し、次に２５０ｍＭイミダゾールを補充した３×０．５ｍｌの結合緩衝液で溶出した。溶出した画分を次に濃縮し、緩衝液を３０，０００ＭＷＣＯタンパク質濃縮器（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて貯蔵緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、５０％グリセロール）で交換し、ＳＤＳ ＰＡＧＥによって検証し、次いでＣｏｌｌｏｉｄａｌ Ｂｌｕｅ染色（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）し、定量し、次に−２０℃で後に使用するまで貯蔵した。
変異体Ｃａｓ９ニッカーゼ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９のＤ１０Ａ変異体）を産生し、上記の通りＣａｓ９を産生させるために使用した同じ手順を用いて精製した。
ガイドＲＮＡライブラリーの調製
Ｔ７−ガイドＲＮＡオリゴヌクレオチド（表３）および別々のオリゴヌクレオチド、ｓｔｌｇＲ（配列、GT TTT AGA GCT AGA AAT AGC AAG TTA AAA TAA GGC TAG TCC GTT ATC AAC TTG AAA AAG TGG CAC CGA GTC GGT GCT TTT TTT GGA TCC GAT GC）を、注文し、合成した（ＩＤＴ）。
ｓｔｌｇＲオリゴヌクレオチド（３００ｐｍｏｌ）を、製造者の指示に従って、逐次的にＴ４ ＰＮＫ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて５’リン酸化し、次に５’アデニル化キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて（sing）５’アデニル化した。Ｔ７−ガイドＲＮＡオリゴヌクレオチド（５ｐｍｏｌ）および５’アデニル化ｓｔｌｇＲ（１０ｐｍｏｌ）を、次に熱安定性５’Ａｐｐ ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を６５Ｃで１時間用いてライゲーションした。ライゲーション反応物を、９０℃で５分間熱不活化し、次にプライマーＦｏｒＴ７（配列GCC TCG AGC TAA TAC GAC TCA C）およびｇＲＵ（配列AAAAAAAGCACCGACTCGGTG）を用いるＰＣＲ（ＯｎｅＴａｑ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓを用いて、９５℃ ３０秒、５７℃ ２０秒、７２℃ ２０秒の３０サイクル）によって増幅した。ＰＣＲ生成物を、ＰＣＲクリーンアップキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて精製し、アガロースゲル電気泳動および配列決定によって検証した。
検証された生成物を、次にＨｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７転写キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応のための鋳型として使用した。５００〜１０００ｎｇの鋳型を、製造者の指示に従って、一晩３７℃でインキュベートした。生じたガイドＲＮＡ（複数可）を、ＲＮＡクリーンアップキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて精製し、１００μｌのＲＮａｓｅ不含水に溶出し、定量し、−２０℃で使用まで貯蔵した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写
ガイドライブラリーをガイドＲＮＡに転写するため、本発明者らは、１０μｌ精製ライブラリー（約５００ｎｇ）、６．５μｌのＨ２Ｏ、２．２５μｌのＡＴＰ、２．２５μｌのＣＴＰ、２．２５μｌのＧＴＰ、２．２５μｌのＵＴＰ、２．２５μｌ １０×反応緩衝液（ＮＥＢ）および２．２５μｌのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼミックスのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応混合物を作製した。反応物を３７℃で２４時間インキュベートし、次にＨ２Ｏ中で１０倍希釈した。単一反応により、約４０μｇのＲＮＡを生成した。ＲＮＡ（約１５０塩基対）の収量およびサイズを、１μｌの反応物を５％ＴＢＥ／尿素ゲルで泳動し、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色することによって確認した。
ＤＮＡ特異的Ｃａｓ９媒介性枯渇
複数のガイドＲＮＡ（単一のまたは複数のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応から）を選択して、枯渇される９５％超の標的ＤＮＡが、少なくとも１つのガイドＲＮＡ標的配列を含有することを確実にした。これは、ライブラリーサイズの分布を測定し、平均（Ｎおよび標準偏差ＳＤ；Ｎ−２ＳＤ＝９５％超のライブラリーに関して最小サイズ）を決定することによって計算し、このサイズ当たり１つのガイドＲＮＡが存在することを確実にして９５％超の枯渇を保証することができる。これは、ガイドＲＮＡの間の最大距離＝ライブラリーサイズの平均−２×（ライブラリーサイズの標準偏差）として記載することもできる。ミトコンドリアライブラリーのケースでは、ライブラリーは、４５０塩基対の平均長で、標準偏差１００である、ＤＮＡ断片を含有する。これにより、ガイドＲＮＡ間で最大２５０ｂｐがもたらされる。ここで、これらのライブラリー中のＤＮＡ断片は、４５０ｂｐの平均長（１００ｂｐの推定標準偏差を有する）であり、５％未満のＤＮＡは２５０ｂｐよりも小さく、正規分布すると想定される。ガイドＲＮＡがそれらの割り当てられた標的の１００％を標的にすると想定すると、９５％超の標的ＤＮＡは、少なくとも１つのガイドＲＮＡ部位を含有し、枯渇されるはずである。
本実施例では、実施例１において構築されたものに加えて、実施例２において構築された全てのガイドを使用した。これらの複数のガイドＲＮＡを、等モル量に混合して８０ｐｍｏｌトータルまで加え、次に６０μｌ Ｃａｓ９反応緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ６．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）中の４０ｐｍｏｌ精製Ｃａｓ９タンパク質と組み合わせ、３７℃で１０分間インキュベートした。５ｎｇのＤＮＡ混合物（所望のＤＮＡおよび枯渇される標的ＤＮＡを含有）を加え、さらに２０分間インキュベーションを続けた。反応を、２μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅＡを含有する１４０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を加えることによって停止させ、３７℃で２０分間インキュベートした。ＤＮＡを、カラム結合の前にイソプロパノールを加えることなく、ＰＣＲクリーンアップキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）用いて回収し、２０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８中に溶出させた。溶出させたＤＮＡを、製造者の指示に従って、ＨｉＦｉｄｅｌｉｔｙマスターミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用し、適切なプライマー（例えば、Ｐ５およびＰ７をＩｌｌｕｍｉｎａに基づくＤＮＡシークエンシングライブラリーの再増幅に関して）を用いて８〜１３サイクルのＰＣＲで再増幅した。
配列決定およびバイオインフォマティクス
ＰＣＲ生成物を、ＰＣＲクリーンアップキットを用いて精製し、ハイスループットＤＮＡ配列決定（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑまたはＮｅｘｔＳｅｑ）のための鋳型として使用した。
Ｆａｓｔｑファイルをｂｗａまたはｂｏｗｔｉｅを用いてヒトゲノム参照（ｈｇ２０）に対して整列させて、核ゲノム対ミトコンドリアゲノムにマッピングされるリードの割合を決定した。
（実施例３）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を用いるＤＮＡライブラリー（トランスクリプトームまたは全ゲノムＤＮＡ）からの全ヒト配列の枯渇
トランスクリプトームワイドｇＲＮＡライブラリー：
ガイドＲＮＡが生成され、これは全体のトランスクリプトームにわたってタイルされる。設計は、血液トランスクリプトームに基づく。各転写物にわたって約１００〜２００ｂｐごとに間隔をあけたガイドＲＮＡの計算による選択についてのパイプラインは、平均でヒトゲノム中に約１０〜２０ｂｐごとにＮＧＧ部位があるとの予想が存在するとの知識に基づいて開発される。この様式では、約２００〜５００ｂｐの典型的なＲＮＡ−ｓｅｑライブラリー挿入サイズを考慮して、各挿入物が標的部位を含有すると予想される。設計の完了に続いて、ガイドＲＮＡ標的配列および周辺モチーフ（surrounding motif）を含有するオリゴプールを、注文し、Ｔ７プロモーターおよびガイドＲＮＡ配列のインバリアント部分を引き続き付加させる。このアプローチにより、新しいプールの注文を必要とする前、一定期間にライブラリーの再生が可能となる。９０，０００エレメントのアレイサイズに基づいて、トランスクリプトームにわたって約２００ｂｐごとに間隔をあけたガイドＲＮＡが、２つのアレイ（約３０Ｍベースのトランスクリプトームサイズと想定される）で、生成されることが予想される。次いで、これらのガイドＲＮＡをＣａｓ９と一緒に使用して、先の実施例に記載された通りＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーから全てのヒトＤＮＡを枯渇させる。枯渇および配列決定データ解析は、先の実施例に記載されている通り行われる。
検証：
記載されたアプローチは、検査ＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーで検査される。これらのＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーは、標的化される配列のタイプをシミュレートするために、ヒトとＥ．ｃｏｌｉのＲＮＡの混合物から作製される。ライブラリーの枯渇に続いて、配列決定を実施して、トランスクリプトームの約１０倍のカバレッジを得る。上記の通り、枯渇の前後でヒトにマッピングされる全ての配列の比率が、測定される；クラスカル・ウォリス一元配置ＡＮＯＶＡ検定を使用して枯渇の統計学的有意性を決定することができる。
この方法が、最適なｇＲＮＡ設計で、反応においてＣａｓ９のレベルを調整することによって、ＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーからの非リボソームヒト配列の９０％枯渇を達成し、非ヒト配列の５％未満が枯渇されることが予想される。
（実施例４）ウイルスまたは他の病原体由来配列についてのヒト血液試料の富化
既知の病原体（例えば、エボラ）または未知の病原体を保持するヒト血液試料を得、ＲＮＡを抽出し（例えば、ＰＡＸｇｅｎｅ血液ＲＮＡ抽出キット、Ｑｉａｇｅｎを用いて）、標準方法（例えば、ＫＡＰＡ ＲＮＡ−ｓｅｑライブラリー調製キットを用いて）を用いてシークエンシングライブラリーに変換する。ｃＤＮＡ作製およびアダプターライゲーションの後、ライブラリーを、次にＣａｓ９およびヒトトランスクリプトームにおいて約２００塩基ごとに標的にするガイドＲＮＡプールと混合する。反応物を、３７Ｃで２０分間インキュベートして、標的配列を含有する任意の断片をＣａｓ９によって切断する。次いで、ライブラリーを精製し、アダプター特異的プライマーを用いて増幅する。ヒト配列を、効果的に枯渇させる。未切断配列のみを増幅し、生じたライブラリーをウイルスまたは他の病原体由来配列について富化する。
（実施例５）ウイルスおよび他の病原体についてモニターするための家畜からの試料の富化
この実施例では、本方法を使用してミルクおよび家畜におけるウイルスおよび他の病原体をモニターする。
雌ウシのミルクまたはウシ（雌ウシ）血液からＲＮＡを抽出し、上記実施例に記載されている通りシークエンシングライブラリーに変換する。ｃＤＮＡ作製およびアダプターライゲーションの後、ライブラリーを、Ｃａｓ９およびウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）トランスクリプトームにおいて約２００塩基を標的にするガイドＲＮＡプールと混合する。反応物を、３７Ｃで２０分間インキュベートして、標的配列を含有する任意の断片をＣａｓ９によって切断する。次いで、ライブラリーを精製し、アダプター特異的プライマーを用いて増幅する。ウシ配列を効果的に枯渇させる。未切断配列のみを増幅し、生じたライブラリーをウイルスまたは他の病原体由来配列について富化する。このシナリオでは、雌ウシ枯渇シークエンシングライブラリー（cow-depleted sequencing library）を配列決定し、ミルクおよび家畜におけるウイルスおよび他の病原体をモニターするために使用することができる。
（実施例６）アダプターなしのＤＮＡの大きい断片の枯渇
この実施例は、アダプターを必要としない枯渇を支持する方法を示す。この実施例では、本方法は、上記実施例に記載されている通り、枯渇実験のために使用される。しかし、アダプターを含有するライブラリーを切断する代わりに、ガイドＲＮＡが選択されて大きいサイズ（例えば、１００ｂｐ〜１０ｋｂあたり）の断片化されたＤＮＡのプールにおいて複数回切断する。Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体での切断に続いて、ＤＮＡをサイズ選択に付し、小さい断片（例えば、インタクトな断片の平均サイズの少なくとも１／２または１／３）を除去する。これを、例えば、Ｌａｍｂｄａエキソヌクレアーゼによる処理によって支援することができる。Ｌａｍｂｄａエキソヌクレアーゼは５’リン酸特異的エキソヌクレアーゼであり、５’から３’方向に進行し、Ｃａｓ９で前にカットされていた任意の断片を攻撃する。生じたライブラリーは次にシークエンシングアダプターを必要としない一分子シーケンサーでの配列決定に付されてもよい；またはアダプターを下流解析のためにライゲーションしてもよい。
（実施例７）枯渇、次いでエキソヌクレアーゼＩＩＩ処理
一部の実施形態では、ＰＣＲ増幅または配列決定の前にカットされた断片を除去することが望ましい。この実施例は、エキソヌクレアーゼＩＩＩを使用して、切断されたＤＮＡを分解するが、カットされなかった目的のＤＮＡをインタクトなままにすることによる、Ｃａｓ９媒介性切断後の不要なＤＮＡを除去する方法を例示する。
図８で図示されるように、ＤＮＡ混合物（枯渇のため標的化される９５％超のヒトＤＮＡ、および目的の５％未満の他のＤＮＡを含有）は、標準のプロトコールに従い、断片化され、末端修復され、およびＹ形アダプター（または円形アダプター、例えば、ＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標））にライゲーションされるが、ＰＣＲによって増幅されない。ＤＮＡ混合物を、次に、前に記載されている通り、例えば、このケースでは、ミトコンドリアＤＮＡに対するガイドＲＮＡライブラリーと複合体形成させ、Ｃａｓ９消化に付す。Ｃａｓ９反応物を、０．５％ＲＮａｓｅＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充したＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ８、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で１：３に希釈し、３７℃で５分間インキュベートする。プロテイナーゼＫ（ＮＥＢ）を、次に８単位／ｍｌの最終濃度で加え、３７℃で５分間インキュベートする。次いで、ＧｅｎｅＪＥＴ ＰＣＲ精製キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＤＮＡを回収し、２０μｌの１Ｘ ＣｕｔＳｍａｒｔ（登録商標）緩衝液（ＮＥＢ）中に溶出させる。次いで、エキソヌクレアーゼＩＩＩ（ＮＥＢ）を加え（５０単位）、３７℃で２０分間インキュベートし、次いで６５℃で３０分間熱不活化させる。
エキソヌクレアーゼＩＩＩは、平滑末端または５’オーバーハングを用いることによって一方のＤＮＡ鎖の一方向性の３’＞５’分解を開始することができ、一本鎖ＤＮＡおよびヌクレオチドが得られる；それは一本鎖ＤＮＡにおいて活性ではないことから、３’オーバーハング（例えば、Ｙ形アダプター末端）は、分解に対して抵抗性である。その結果、Ｃａｓ９によってカットされなかったインタクトな二本鎖ＤＮＡライブラリー（例えば、このケースでは、非ミトコンドリアＤＮＡ）は、エキソヌクレアーゼＩＩＩによって消化されない、一方、Ｃａｓ９によって切断されているＤＮＡ分子（例えば、このケースでは、ミトコンドリアＤＮＡ）は、Ｃａｓ９によってカットされた平滑末端からアダプターに向かって、エキソヌクレアーゼＩＩＩによってその３’＞５’活性で分解される。
したがって、不要なＤＮＡが消化される。残存するインタクトな二本鎖ＤＮＡライブラリーは、次にＧｅｎｅＪＥＴ ＰＣＲ精製キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて回収され、２０μｌ １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ８中に溶出される。試料は、次にＱｕｂｉｔ蛍光光度計（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて定量され、ＭｉＳｅｑシステム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）において配列決定される。
あるいは、不要なＤＮＡを、上記の通り、消化することができる、一方、インタクトなＤＮＡは、例えば、カラム精製またはＰＣＲ増幅によって回収される。
（実施例８）枯渇、次いでエキソヌクレアーゼＢａｌ−３１処置
一部の実施形態では、ＰＣＲ増幅または配列決定の前にカットされた断片を除去することが望ましい。この実施例は、エキソヌクレアーゼＢａｌ−３１を用いることにより、切断されたＤＮＡを分解するが、カットされなかった目的のＤＮＡをインタクトなままにする、Ｃａｓ９媒介性切断後の不要なＤＮＡを除去する代替法を例示する。
図９で図示されるように、シークエンシングライブラリー（例えば、枯渇のため標的化される９５％超のヒトＤＮＡ（例えば、ミトコンドリアＤＮＡ）および目的の５％未満のＤＮＡを含有）は、ＰＣＲ増幅ステップを含む、従来の方法に従って、調製される。ライブラリー（５００ｎＭ）は、次に製造者の指示に従って、ターミナルトランスフェラーゼ（ＮＥＢ）および３ｍＭ ｄＧＴＰを用いて３’末端にポリ−ｄＧでテール付加し、３７℃で３０分間インキュベートし、次に７５℃、２０分間、熱不活化する。３’ポリ−ｄＧテール付加ライブラリーは、次に、前に記載されている通り、例えば、このケースでは、ミトコンドリアＤＮＡに対するガイドＲＮＡライブラリーと複合体形成させ、Ｃａｓ９消化に付し、次に７５℃、２０分間、熱不活化する。反応物を、次に１０単位のエキソヌクレアーゼＢａｌ−３１（ＮＥＢ）を補充した１×エキソヌクレアーゼＢａｌ−３１反応緩衝液（ＮＥＢ）に１：５に希釈し、３７℃で３０分間インキュベートした。
エキソヌクレアーゼＢａｌ−３１は、二本鎖ＤＮＡエキソヌクレアーゼ活性および一本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡエンドヌクレアーゼ活性の２つの活性を有している。二本鎖ＤＮＡエキソヌクレアーゼ活性により、ＢＡＬ−３１が両方の鎖におけるオープンエンドからＤＮＡを分解することが可能になり、したがって、二本鎖ＤＮＡのサイズが減少する。インキュベーションが長いほど、二本鎖ＤＮＡのサイズの減少はより大きくなり、中程度から大型のＤＮＡ（２００ｂｐ超）を枯渇させるのに有用となる。ＢＡＬ−３１の一本鎖エンドヌクレアーゼ活性により、ポリ−Ａ、−Ｃまたは−Ｔを非常に迅速に消化することが可能になるが、ポリ−Ｇの消化は極度に弱いことが留意される（MarroneおよびBallantyne、２００８年）。この性質が理由で、一本鎖ポリ−ｄＧをライブラリーの３’末端に付加することにより、ＢＡＬ−３１による分解からの保護に働くことができ、このことは、本発明者らがＰＣＲ生成物を用いて検証した。その結果、Ｃａｓ９によって切断されているＤＮＡ分子（例えば、このケースでは、ミトコンドリアＤＮＡ）は、ＢＡＬ−３１によって、枯渇に影響する、Ｃａｓ９によってカットされた二本鎖平滑末端からポリ−ｄＧを保持する他の末端に向かって、その二本鎖ＤＮＡエキソヌクレアーゼ活性で分解され；一方、Ｃａｓ９によってカットされなかったインタクトなＤＮＡライブラリー（例えば、このケースでは、非ミトコンドリアＤＮＡ）は、それらの３’末端ポリ−ｄＧ保護に起因してＢＡＬ−３１によって消化されない。
エキソヌクレアーゼＢａｌ−３１インキュベーションの後、反応混合物は７５℃、２０分間、熱不活化され、ＤＮＡはＧｅｎｅＪＥＴ ＰＣＲ精製キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて回収される。試料は、次にＱｕｂｉｔ蛍光光度計（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて定量され、ＭｉＳｅｑシステム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）において配列決定される。
あるいは、不要なＤＮＡを、上記の通り、消化することができる、一方、インタクトなＤＮＡは、例えば、カラム精製によって回収される。
（実施例９）Ｃａｓ９枯渇およびビオチン標識
一部の実施形態では、Ｃａｓ９切断生成物は、排除（例えば、９５％超のミトコンドリアＤＮＡが、排除される）され、ビオチン標識を含むカットされなかった（目的の５％未満のＤＮＡ）のＤＮＡは、ストレプトアビジンビーズに結合させることによって精製される。この実施例は、エキソヌクレアーゼを用いることなく、Ｃａｓ９媒介性切断後の不要なＤＮＡを除去する方法を例示し、図１０に図示される。
ＤＮＡ混合物（９５％超の不要なヒトＤＮＡ、および目的の５％未満の他のＤＮＡを含有）は、標準のプロトコールに従い、断片化され、末端修復され、およびアダプターにライゲーションされ、次にビオチン−Ｐ５（５’ビオチン−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ）およびＰ７（５’−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡ）のプライマーを用いるＰＣＲによって増幅される。これにより、全体のシークエンシングライブラリーが、そのＤＮＡ分子の１つの末端のみに５’ビオチン標識を有することが保証される。ＤＮＡ混合物は、次に、前に記載されている通り、例えば、このケースでは、ミトコンドリアＤＮＡ（不要なＤＮＡ）に対するガイドＲＮＡライブラリーと複合体形成させて、Ｃａｓ９消化に付す。Ｃａｓ９反応物は、０．５％ ＲＮａｓｅＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充したＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ８、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で１：３に希釈され、３７℃で５分間インキュベートされる。プロテイナーゼＫ（ＮＥＢ）が、次に８単位／ｍｌの最終濃度で加えられ、３７℃で５分間インキュベートされる。Ｃａｓ９によって切断されるＤＮＡ分子（例えば、このケースでは、ミトコンドリアＤＮＡ）は、ビオチン標識アダプターを失い、したがって、配列決定またはＰＣＲ増幅することはできない；一方、Ｃａｓ９によってカットされなかったインタクトなＤＮＡライブラリー（例えば、このケースでは、目的の非ミトコンドリアＤＮＡ）は、なおもビオチン標識を保持する。その結果、Ｃａｓ９によってカットされなかったインタクトなＤＮＡは、次にストレプトアビジンビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を２％の最終濃度で加えることによって回収され得る。ビーズは、磁気スタンドを用いて捕獲され、ＴＥ緩衝液で４回洗浄される。ＤＮＡを、９５℃で３分間加熱することによってビーズから放出させ、次いでＰ５およびＰ７プライマー（非ビオチン化）を用いる６サイクルのＰＣＲを行う。ＤＮＡは、次にＧｅｎｅＪＥＴ ＰＣＲ精製キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて精製される。試料は、次にＱｕｂｉｔ蛍光光度計（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて定量され、ＭｉＳｅｑシステム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）において配列決定される。
（実施例１０）熱安定性Ｃａｓ９を用いるＣａｓ９媒介性枯渇の効率の増加
Ｃａｓ９は、標的ＤＮＡのコレクションを効率的に枯渇させるためガイドＲＮＡのライブラリーと組み合わせて使用することができるが、大量（＞３０ｐｍｏｌ）のＣａｓ９およびガイドＲＮＡが必要とされる。この標的ＤＮＡに対して通常＞１００倍過剰量である理由は、切断後それらの標的ＤＮＡから完全に脱離する、ＥｃｏＲＩなどの古典的な制限酵素とは異なり、Ｃａｓ９は、カット反応の完了後に再利用されないからである。Ｃａｓ９は、２つの娘ＤＮＡ生成物分子の１つと密接に結合したままで残ることができる（図１１を参照されたい、左の白丸）。その結果、不要なＤＮＡの完全な枯渇を達成するために、より多くのＣａｓ９およびｇＲＮＡが提供されることが要求される。この問題を克服するため、ガイドＲＮＡ（例えば、ヒトＤＮＡに対するｇＲＮＡライブラリー）と複合体形成された熱安定性Ｃａｓ９（９５℃で１分後に＞９０％活性を保持するものとして定義される）が、ＤＮＡ混合物（例えば、９５％のヒトＤＮＡおよび５％のウイルスＤＮＡを含有）のシークエンシングライブラリーに適用され得る。図１１（右の灰色の丸）で図示されるように、Ｃａｓ９により一定期間消化させた後に、試料混合物は、煮沸されてもよく、これがＤＮＡ変性ならびにｇＲＮＡおよびＣａｓ９のＤＮＡ標的からの解離を引き起こす。ＤＮＡ変性にもかかわらず、Ｃａｓ９とｇＲＮＡの結合は増加することができ、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡがインタクトな複合体としてＤＮＡ標的から解離する。Ｃａｓ９タンパク質構造が影響されないように、ＤＮＡ変性に必要とされる温度を減少させるため、ジメチルスルホキシドが加えられ得る。Ｃａｓ９はカットされていない標的部位に優先的に結合し、熱安定性Ｃａｓ９は煮沸後に活性を保持する。これらの特性が理由で、反応物を煮沸し３７℃に冷却することによって、熱安定性Ｃａｓ９は、依然としてそのｇＲＮＡに結合し、より多くのその基質をカットすることができる。Ｃａｓ９の再利用が可能となることによって、枯渇効率が増加し、より少ないＣａｓ９が、反応に必要とされるので、オフターゲットの（非特異的な）切断確率も減少する。
熱安定性Ｃａｓ９を作製するための２つの例示的な方法が、提供される。
第１の方法は、熱安定性Ｃａｓ９の単離である。熱安定性Ｃａｓ９に関する遺伝子およびその対応するガイドＲＮＡは、好熱性の細菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓのゲノムにおける配列相同性によって同定される。Ｃａｓ９遺伝子は、次に、前の項に記載されている通りＣａｓ９を発現させるため発現ベクターｐＥＴ３０（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングされる。ガイドＲＮＡ配列は、オリゴヌクレオチドに組み立てられ、合成される（ＩＤＴ）。Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡの活性な組合せは、配列決定されたＤＮＡ鋳型の３７℃（対照）での、および９５℃で３Ｘ５分の処理後の３７℃での消化によって評価される。第２の方法は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９のｉｎ ｖｉｔｒｏ進化である。Ｃａｓ９の配列を変異誘発させて、その熱安定性を改善する。簡単に述べると、これは、過剰なループ配列を除去しタンパク質ドメイン間のイオン架橋の数を増加させる、部位特異的変異誘発によって、または液滴へと希釈してＰＣＲで潜在的な変異体のプールを生じさせることによって行われる。全ての変異体は、上記の通り活性および熱安定性に関して評価される。
（実施例１１）不要なＤＮＡの枯渇およびオフターゲット事象をモニターするための対照
論じられた実施形態では、陽性対照および／または陰性対照を提供することが望ましい。陽性対照は、不要なＤＮＡの枯渇が忠実度および効率性を伴って進行することを保証する。陰性対照は、オフターゲット切断が、最小または非存在であることを保証する。
陽性対照は、キットに含まれるｇＲＮＡの標的配列の全てまたは大部分を含有する挿入物を有するシークエンシングライブラリーからなり得る。この対照は利用者の反応と並行して処理され、全てのコンポーネントが正しく機能していることを保証する。Ｃａｓ９での枯渇後、標的配列の排除は、ゲル電気泳動またはｑＰＣＲによって測定され得る。
陰性対照は、１）標的特異的配列に対して、例えば１、２、３、４、５、またはそれ超のミスマッチを有する、キットに使用されるｇＲＮＡに対して１００％未満の同一性を有するｇＲＮＡのセット；または２）ｇＲＮＡの相補的な配列に対して、例えば１、２、３、４、５、またはそれ超のミスマッチを有する、キットに使用されるｇＲＮＡの標的化配列に対して１００％未満の同一性を有する挿入物を有するＤＮＡライブラリーからなり得る。この対照は利用者の反応と並行して処理され、全てのコンポーネントが正しく機能していることおよび酵素の任意のオフターゲット活性が測定されることを保証する。Ｃａｓ９での枯渇後、オフターゲット枯渇の量は、ゲル電気泳動またはｑＰＣＲによって測定され得る。

Claims (70)

  1. 試料を目的の配列について富化する方法であって、
    ａ．目的の配列および枯渇のための標的化配列を含む試料を準備するステップであって、該目的の配列は、該試料の３０％未満を構成する、ステップと；
    ｂ．該試料を複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させるステップであって、該ｇＲＮＡは、該標的化配列に相補的であり、それによって該標的化配列が切断される、ステップと
    を含む、方法。
  2. 前記試料から前記目的の配列および前記枯渇のための標的化配列を抽出するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記抽出された配列を断片化するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
  4. 前記抽出され断片化された配列の５’および３’末端をアダプターライゲーションするステップをさらに含む、請求項３に記載の方法。
  5. 前記切断された標的化配列が、サイズ排除によって、またはビオチンを使用して除去される、請求項１に記載の方法。
  6. 前記目的の配列を増幅するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  7. 前記試料を少なくとも１０２のユニークなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させるステップを含む、請求項１に記載の方法。
  8. 前記試料が、生体試料、臨床試料、法医学試料、または環境試料のいずれか１つである、請求項１に記載の方法。
  9. 前記試料が、枯渇のために標的にされる宿主核酸配列および目的の非宿主核酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
  10. 前記非宿主核酸配列が、微生物核酸配列を含む、請求項９に記載の方法。
  11. 前記微生物核酸配列が、細菌核酸配列、ウイルス核酸配列、または真核生物寄生虫核酸配列である、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記試料をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させ、該ｇＲＮＡが、ミトコンドリアＤＮＡに相補的である、請求項１に記載の方法。
  13. 前記試料をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させ、該ｇＲＮＡが、リボソームＲＮＡ配列、グロビンタンパク質をコードする配列、トランスポゾンをコードする配列、レトロウイルス配列をコードする配列、テロメア配列を含む配列、サブテロメアリピートを含む配列、動原体配列を含む配列、イントロン配列を含む配列、Ａｌｕリピートを含む配列、ＳＩＮＥリピートを含む配列、ＬＩＮＥリピートを含む配列、二核酸リピートを含む配列、三核酸リピートを含む配列、四核酸リピートを含む配列、ポリ−Ａリピートを含む配列、ポリ−Ｔリピートを含む配列、ポリ−Ｃリピートを含む配列、ポリ−Ｇリピートを含む配列、ＡＴリッチ配列を含む配列、またはＧＣリッチ配列を含む配列に対応するＤＮＡに相補的である、請求項１に記載の方法。
  14. 抽出された核酸が、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、人工ＤＮＡ、およびＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのいずれか１つを含む、請求項２に記載の方法。
  15. 前記目的の配列が、抽出された核酸の１０％未満を構成する、請求項１に記載の方法。
  16. 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｃａｓ９である、請求項１に記載の方法。
  17. 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、触媒不活性である、請求項１に記載の方法。
  18. 前記触媒不活性であるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、ｄＣａｓ９である、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質ニッカーゼである、請求項１に記載の方法。
  20. 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質ニッカーゼが、Ｃａｓ９ニッカーゼである、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、熱安定性である、請求項１に記載の方法。
  22. アダプター特異的ＰＣＲを使用してステップ（ｂ）の生成物を増幅するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  23. エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素でステップ（ｂ）の生成物を処理するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  24. 前記酵素が、エキソヌクレアーゼＩＩＩまたはＢＡＬ−３１である、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記試料が、全血、血漿、血清、涙、唾液、粘液、脳脊髄液、歯、骨、指の爪、糞便、尿、組織、および生検から選択される、請求項１に記載の方法。
  26. 試料を富化する方法であって、
    ａ．宿主核酸および非宿主核酸を含む試料を準備するステップであって、該宿主核酸および非宿主核酸は、アダプターライゲーションされており、該アダプターは、該宿主核酸および該非宿主核酸の５’および３’末端にライゲーションされている、ステップと；
    ｂ．該試料を複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させるステップであって、該ｇＲＮＡは、該宿主核酸中の標的化部位に相補的であり、それによって一端のみでアダプターライゲーションされた宿主核酸、ならびに５’および３’末端の両方でアダプターライゲーションされた非宿主核酸を生成する、ステップと；
    ｃ．該試料を非宿主核酸について富化するステップと
    を含む、方法。
  27. 前記試料を少なくとも１０２のユニークなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させるステップを含む、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記核酸は、ＤＮＡであり、ステップ（ｂ）の前記接触させるステップにより、５’末端でアダプターライゲーションされているが、３’末端でアダプターライゲーションされていない宿主ＤＮＡ、ならびに５’および３’末端の両方でアダプターライゲーションされた非宿主ＤＮＡが生成される、請求項２６に記載の方法。
  29. 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ−ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２、またはＣｍ５である、請求項２６に記載の方法。
  30. 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｃａｓ９である、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、ｄＣａｓ９である、請求項２６に記載の方法。
  32. 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｃａｓ９ニッカーゼである、請求項２６に記載の方法。
  33. 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、熱安定性である、請求項２６に記載の方法。
  34. 前記宿主が、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、サル、イヌ、ネコ、アレチネズミ、トリ、マウス、およびラットからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
  35. 前記非宿主が、原核生物である、請求項２６に記載の方法。
  36. 前記非宿主が、真核生物、ウイルス、細菌、真菌、および原生動物からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
  37. 前記アダプターライゲーションされた宿主核酸および非宿主核酸が、５０〜１０００ｂｐの範囲である、請求項２６に記載の方法。
  38. 前記非宿主核酸が、前記試料中の全核酸の５０％未満を構成する、請求項２６に記載の方法。
  39. 前記試料が、生体試料、臨床試料、法医学試料、または環境試料のいずれか１つである、請求項２６に記載の方法。
  40. ステップ（ｃ）が、アダプター特異的ＰＣＲを使用してステップ（ｂ）の生成物を増幅することを含む、請求項２６に記載の方法。
  41. ステップ（ｃ）が、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素でステップ（ｂ）の生成物を処理することを含む、請求項２６に記載の方法。
  42. 前記酵素が、エキソヌクレアーゼＩＩＩまたはＢＡＬ−３１である、請求項４１に記載の方法。
  43. ステップ（ｃ）が、サイズ排除によって前記宿主核酸を除去することを含む、請求項２６に記載の方法。
  44. ステップ（ｃ）が、ビオチンを使用して前記宿主核酸を除去することを含む、請求項２６に記載の方法。
  45. アダプター特異的ＰＣＲを使用してステップ（ｂ）の生成物を増幅するステップをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
  46. エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素でステップ（ｂ）の生成物を処理するステップをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
  47. 前記酵素が、エキソヌクレアーゼＩＩＩまたはＢＡＬ−３１である、請求項４６に記載の方法。
  48. 陽性対照標的配列の使用を含めるステップをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
  49. 陰性対照ｇＲＮＡの使用を含めるステップをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
  50. 前記試料が、全血、血漿、血清、涙、唾液、粘液、脳脊髄液、歯、骨、指の爪、糞便、尿、組織、および生検から選択される、請求項２６に記載の方法。
  51. 試料中の標的化核酸を連続的に枯渇させるための方法であって、
    ａ．宿主核酸および非宿主核酸を含む試料を準備するステップであって、該非宿主核酸は、少なくとも１種の既知の非宿主生物由来の核酸および少なくとも１種の未知の非宿主生物由来の核酸を含む、ステップと；
    ｂ．該試料を複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させるステップであって、該ｇＲＮＡは、該宿主核酸中の標的化配列にハイブリダイズするように配置されており、それによって該宿主核酸の一部が切断される、ステップと；
    ｃ．該試料を複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させるステップであって、該ｇＲＮＡは、該少なくとも１種の既知の非宿主核酸中の標的化配列にハイブリダイズするように配置されており、それによって該少なくとも１種の既知の非宿主核酸の一部が切断される、ステップと；
    ｄ．該未知の非宿主生物から該核酸を単離するステップと
    を含む、方法。
  52. 前記試料を、前記宿主核酸中の標的化配列にハイブリダイズするように配置された少なくとも１０２のユニークなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させるステップを含む、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記試料を、前記少なくとも１種の既知の非宿主核酸中の標的化配列にハイブリダイズするように配置された少なくとも１０２のユニークなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＲＮＡ複合体と接触させるステップを含む、請求項５１に記載の方法。
  54. 前記試料が、全血、血漿、血清、涙、唾液、粘液、脳脊髄液、歯、骨、指の爪、糞便、尿、組織、および生検から選択される、請求項５１に記載の方法。
  55. 未知の非宿主生物由来の核酸が、前記試料中の全核酸の５％未満を構成する、請求項５１に記載の方法。
  56. 前記宿主がヒトである、請求項５１に記載の方法。
  57. 第１のゲノム由来のＤＮＡおよび第２のゲノム由来のＤＮＡの混合物を含む組成物であって、該第１のゲノムＤＮＡおよび該第２のゲノムＤＮＡは、アダプターライゲーションされており、該第１のゲノムＤＮＡは、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質複合体に複合体形成されている、組成物。
  58. 前記第１のゲノムが、宿主生物由来であり、前記第２のゲノムが、非宿主生物由来である、請求項５７に記載の組成物。
  59. 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｃａｓ９である、請求項５７に記載の組成物。
  60. 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、熱安定性である、請求項５７に記載の組成物。
  61. ａ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質；および
    ｂ．ミトコンドリアＤＮＡに相補的であるｇＲＮＡ
    を含むキット。
  62. ａ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質；
    ｂ．目的の標的に相補的であるｇＲＮＡ；および
    ｃ．エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素
    を含むキット。
  63. ａ．熱安定性であるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質；および
    ｂ．目的の標的に相補的であるｇＲＮＡ
    を含むキット。
  64. ａ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質；および
    ｂ．目的の標的配列に相補的であるｇＲＮＡの第１のセット；および
    ｃ．試薬の対照セット
    を含むキット。
  65. 試薬の陽性対照セットをさらに含む、請求項６４に記載のキット。
  66. 試薬の陰性対照セットをさらに含む、請求項６４に記載のキット。
  67. ａ．細胞の集団からＤＮＡを単離するための試薬；
    ｂ．挿入酵素；
    ｃ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質；および
    ｄ．ミトコンドリアＤＮＡに相補的である複数のｇＲＮＡ
    を含むキット。
  68. 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｃａｓ９である、請求項６１から６７のいずれか一項に記載のキット。
  69. 少なくとも１０２のユニークｇＲＮＡを含む、請求項６１から６７のいずれか一項に記載のキット。
  70. Ｙ形アダプターまたはポリ−Ｇアダプターのコレクションをさらに含む、請求項６１から６７のいずれか一項に記載のキット。
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