CN115820666B - 一种菊叶薯蓣DcW5基因及其在耐干旱胁迫和耐盐胁迫中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种菊叶薯蓣DcW5基因及其在耐干旱胁迫和耐盐胁迫中的应用。本发明在菊叶薯蓣中克隆得到一个耐逆境胁迫的相关基因DcW5，该基因在植物根中表达量最高，受盐胁迫和干旱胁迫表达上调，通过拟南芥转基因表达体系的构建，得到DcW5转基因纯合品系，DcW5的超表达显著提高了拟南芥对盐胁迫和干旱胁迫的耐受性。因此，表明DcW5对植物抗逆境胁迫具有重要作用，可以用于转基因技术调控植物在盐胁迫和干旱胁迫下的适应能力，也有助于培育抗逆境胁迫的转基因植株。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域。更具体地，涉及一种菊叶薯蓣DcW5基因及其在耐干旱胁迫和耐盐胁迫中的应用。
背景技术
非生物胁迫是影响植物生长发育的主要因素之一，包括干旱、极端温度和土壤盐渍化等。非生物胁迫对植物的影响主要来源于自然环境的不利变化，从而引起植物体内在的生理生化状态发生一定改变，导致植物体原有的性状表型如果实结实等遭受严重破坏。其中，由于土壤盐渍化和干旱对植物的影响越来越严重，盐胁迫会破坏植物体细胞膜及其结构，从而影响植物细胞正常的稳定状态，还会影响光合作用和呼吸作用；干旱胁迫不仅会导致植物生长的减缓，还会随干旱胁迫程度的加剧而发生改变，严重影响植物的生长发育。
菊叶薯蓣(Dioscorea composita Hemsl.)是薯蓣科薯蓣属的多年生缠绕性草本植物，原产墨西哥，是生产激素类药物原料薯蓣皂素的栽培品种。由于种植土壤需求和向边际土地推广等原因，干旱胁迫和盐胁迫成为了限制菊叶薯蓣大规模推广应用的两大因素。植物通过内源或外源信号构建复杂的调控网络来抵御外界胁迫。在植物胁迫抗性的复杂网络中，第一反应是转录组的变化。《菊叶薯蓣DcPMK基因克隆及互作蛋白筛选，王宏鹏，2022，南开大学生命科学学院》研究显示，菊叶薯蓣DcPMK基因通过蛋白质-蛋白质相互作用的方式广泛参与胁迫响应等代谢途径；发明专利《抗逆相关蛋白IbMYB48及其编码基因与应用》公开了蛋白IbMYB48及其编码基因可以调控薯蓣科植物抗逆性。从植物响应非生物胁迫的研究中，我们能更进一步的了解有关非生物胁迫对植物的影响及植物自身内在的防御机制，从而利用基因工程手段可以改造出耐盐抗旱的农作物新品种，为培育具有优良遗传性状的作物品种提供理论基础。
因此，在应对菊叶薯蓣干旱胁迫和盐胁迫的问题上，从分子层面探究相关基因，不仅有助于研究其耐盐和耐旱的分子机制，还可有助于培育菊叶薯蓣新品种，具有重要的价值和意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述的缺陷和不足，提供一种菊叶薯蓣基因DcW5及其在耐干旱胁迫和耐盐胁迫中的应用。
本发明的第一个目的是提供一种菊叶薯蓣DcW5基因。
本发明的第二个目的是提供DcW5基因的编码蛋白。
本发明的第三个目的是提供一种重组表达载体。
本发明的第四个目的是提供一种培育抗逆境胁迫的转基因植物的方法。
本发明的第五个目的是提供一种提高植物抗逆境胁迫的产品。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明在菊叶薯蓣的基因组中克隆得到一个长为750bp的DcW5基因，该基因编码249个氨基酸，分子量为27.56kDa，等电点为8.84，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。同时研究显示DcW5在菊叶薯蓣的根中表达量最高，在叶中表达量较低，DcW5蛋白定位于细胞核中。通过DcW5在不同非生物胁迫下的转录表达分析显示，在盐胁迫和干旱胁迫下，菊叶薯蓣的DcW5表达显著提高；通过拟南芥转基因表达体系的构建，得到DcW5转基因纯合品系，DcW5的超表达显著提高了拟南芥对盐和干旱胁迫的耐受性。
因此，本发明提供所述DcW5基因或所述其编码蛋白在提高植物对逆境胁迫抗性、在培育抗逆境胁迫的转基因植株中的应用。
优选地，所述的植物为菊叶薯蓣或拟南芥。
进一步地，所述逆境胁迫为盐胁迫或干旱胁迫。
更进一步地，所述盐胁迫为高盐胁迫。
本发明提供一种重组表达载体，含上述DcW5基因。
本发明提供一种基因工程菌，含有上述重组表达载体。
本发明提供一种培育抗逆境胁迫的转基因植物的方法，将上述重组载体或基因工程菌转化到植物中，培育筛选转基因纯合系植物。
进一步地，所述植物为菊叶薯蓣或拟南芥。
本发明具有以下有益效果：
本发明公开了一种菊叶薯蓣DcW5基因及其在耐干旱胁迫和耐盐胁迫中的应用。本发明从菊叶薯蓣基因组中克隆得到一个与抗逆境胁迫相关的DcW5基因，该基因被NaCl、PEG-6000高度诱导，在植物根中表达量高，受盐胁迫和干旱胁迫表达上调；通过拟南芥转基因表达体系的构建，得到DcW5转基因纯合品系，DcW5的超表达显著提高了拟南芥对盐和干旱胁迫的耐受性。因此，DcW5对植物抗逆境胁迫具有重要作用，可用于转基因技术调控植物在盐胁迫和干旱胁迫下的适应能力，有助于培育菊叶薯蓣新品种。
附图说明
图1为DcW5蛋白的亚细胞定位分析结果图(A为重组载体示意图；B为蛋白亚细胞定位结果图)；
图2为DcW5在不同非生物胁迫下的表达模式分析结果图(A为组织特异性表达；B为对照组；C为NaCl处理；D为PEG-6000处理)；
图3为DcW5提高了拟南芥对盐胁迫和干旱胁迫的耐受性结果图(A为盐胁迫和干旱胁迫处理后野生型和DcW5超表达拟南芥的生长状态；B为盐胁迫和干旱胁迫处理后野生型和DcW5超表达拟南芥的失水率；C为盐胁迫和干旱胁迫处理后野生型和DcW5超表达拟南芥的株高；D为盐胁迫和干旱胁迫处理后野生型和DcW5超表达拟南芥的鲜重)。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 DcW5基因克隆分析
本发明在D.composita的转录组数据库中，根据其碱基序列设计特异性引物(F：5’-CAGATGAATGTATTAGAAGCGGAATTG-3’；R：5’-CCTTCATGGTGATATTTGAAGGTTAA-3’)，与TransStart KD plus DNA聚合酶通过逆转录PCR(RT-PCR)进行克隆。再用Eastep Super总RNA提取试剂盒(Promega，北京)提取菊叶薯蓣总RNA。PCR产物通过HiPure GelPure DNA试剂盒(Magen，德国)回收，并通过EZ-TTM快速连接试剂盒(GenStar，中国)连接到EZ-TTM载体中。重组载体随后转化入大肠杆菌DH5α，阳性转化体由Sangon Biotech Co.，Ltd(上海，中国)进行测序分析，使用美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库来搜索其同源基因和蛋白质。使用DANMAN(6.0版)软件进行氨基酸序列比对。系统发育树由MEGA(6.0版)软件构建。
利用上述菊叶薯蓣的特异性引物，进行RT-PCR扩增，从菊叶薯蓣cDNA中扩增出一个750bp的基因，命名为DcW5基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；该基因编码249个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，分子量为27.56kDa，等电点为8.84。
实施例2 DcW5蛋白的亚细胞定位
为了研究DcW5蛋白的亚细胞定位，将DcW5的全长cDNA插入pGBKT7-eGFP中构建pGBKT7-eGFP-DcW5融合质粒。通过特异性引物(F：5’-gacgcgtcttaattaactagtATGAATGTATTAGAAGCGGAATTGAC-3’；R：5’-gggaaattcgagctcactagtTCATGGTGATATTTGAAGGTTAATCC-3’)克隆DcW5的完整编码序列，并将其插入由CaMV 35S启动子控制的pCanG-eGFP载体中。随后通过根癌农杆菌GV3101分别将pCanG-eGFP-DcW5和pCanG-eGFP质粒转入烟草叶中。用徕卡TCS-SP8 STED 3X共聚焦显微镜在10x物镜下观察感染72小时后烟草叶中绿色荧光蛋白(GFP)和DcW5-GFP的瞬时表达情况。DAPI和绿色荧光蛋白的激发光谱分别为405nm和488nm，发射光谱分别为415-418nm和528-575nm。
构建的pGBKT7-eGFP-DcW5融合质粒的重组载体结构图如图1A所示，在激光共聚焦显微镜下，在烟草的细胞膜和细胞核中都观察到GFP蛋白的绿色荧光信号，而eGFP-DcW5蛋白仅在细胞核中表达，如图1B所示，表明DcW5蛋白定位于细胞核中。
实施例3 DcW5的qRT-PCR表达分析
为了研究DcW5在菊叶薯蓣生长发育中的作用，采用qRT-PCR方法检测了DcW5在菊叶薯蓣不同组织中的转录水平。通过Eastep Super RNA Kit(Lab Biotech，中国)提取菊叶薯蓣的总RNA，采用PrimeScriptTM RT试剂盒(Takara，日本)用于合成第一条cDNA链。逆转录实时定量PCR(qRT-PCR)分析在LightCycler 480ll(ROCHE，瑞士)上用TB Green PremixEX TaqTM(Takara，日本)进行；对每个样品进行三次独立的重复，通过2-△△CT方法检测基因表达的相对变化。以菊叶薯蓣基因DcTUB7(F：5’-AGACAACATCAACCCTGGACT-3’；R：5’-GAGGCTGAGAGCAACATGAAT-3’)用作内参基因。
结果如图2A所示，表明DcW5在菊叶薯蓣不同组织中的表达差异较大，在根中表达量最高，在叶中表达量较低。
实施例4 DcW5在不同非生物胁迫下的转录表达分析
为了研究DcW5在菊叶薯蓣胁迫反应中的潜在作用，采用qRT-PCR检测了DcW5在不同非生物胁迫处理下的转录水平。将构建的重组质粒pCanG-DcW5转入根癌农杆菌GV3101中，然后通过浸花法转移进拟南芥中。用30mg/L卡那霉素选择DcW5转基因纯合系，将获得的拟南芥转基因植物进行T1、T2、T3代纯合株系的筛选，最终得到T3代转基因纯合系(DcW5-OEs)。
首先采用实施例1中特异性引物通过RT-PCR进行证实，提取拟南芥的总RNA(提取检测采用试剂盒及方法同实施例3)，以拟南芥基因AtUBQ1(F：5’-GGCCAAGATCCAAGACAAAG-3’；R：5’-GTTGACAGCTCTTGGGTGAA-3’)作内参基因。再分别采用200mM NaCl和20％PEG-6000处理(采用PEG-6000溶液处理模拟干旱胁迫)转基因植株0、3、6、9、12和24h，设置是三个重复，并通过qRT-PCR测量T3代转基因纯合系(DcW5-OEs)中DcW5(F：5’-GCGAAATGCTAAGCGCGATGAAC-3’；R:5’-ATGGCGATGGCGATGACAAGC-3’)的表达水平，其中选择三个独立的DcW5转基因纯合品系为OE-1、OE-4和OE-5。
结果表明，在没有任何处理的情况下，DcW5的转录水平有一些波动，但没有观察到显著差异(图2B)。当用NaCl处理时，DcW5的表达显著高于对照，并在24h达到峰值，比0小时高282倍(图2C)。类似地，在PEG-6000处理下，DcW5的表达在9小时达到峰值，显著高于对照(图2D)。这些结果表明DcW5在盐和干旱胁迫中起重要作用。
实施例5 DcW5对转基因拟南芥耐盐性
为了检测DcW5转基因拟南芥在盐和干旱胁迫下的表型。以野生型WT和转基因DcW5-OEs(采用实施4中得到的DcW5转基因纯合品系)幼苗为实验材料，设置200mM NaCl浇灌为盐胁迫处理组，以相同体积的水溶液浇灌设为盐胁迫对照组，以不浇水为干旱胁迫处理组，正常浇水为干旱对照组。对于2周龄的WT(野生型)和DcW5-OEs幼苗采用上述处理组进浇灌15天。在盐处理期间，通过每3天用盐水浇水来保持土壤湿润。对于干旱胁迫实验，2周大的WT和DcW5-OEs幼苗用水或无水分别浇灌10天。然后拍照以监测植物的胁迫表型。
结果表明，显示DcW5-OEs和WT的幼苗在没有任何处理的情况下生长一致。然而，在NaCl或干旱处理下，WT幼苗的生长被显著抑制(图3A)。与WT相比，DcW5-OEs幼苗的水丧失较少且显著低于WT(图3B)。当用200mM NaCl或干旱处理时，DcW5-OEs幼苗的苗高和鲜重显著高于WT(图3C-D)。这些结果表明DcW5提高了拟南芥对盐和干旱胁迫的耐受性。
综上，本发明研究显示菊叶薯蓣DcW5基因在植物根中表达量最高，受盐胁迫和干旱胁迫表达上调，通过拟南芥转基因表达体系的构建，得到DcW5转基因纯合品系，DcW5的超表达显著提高了拟南芥对盐和干旱胁迫的耐受性。因此，DcW5对植物抗逆境胁迫具有重要作用，可以用于转基因技术调控植物在盐胁迫和干旱胁迫下的适应能力，有助于培育菊叶薯蓣新品种。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1. 一种菊叶薯蓣DcW5基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2. 权利要求 1 所述DcW5基因编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如 SEQ IDNO.2 所示。
3.权利要求1所述DcW5基因或权利要求2所述蛋白在提高植物对逆境胁迫抗性中的应用，其特征在于，所述植物为菊叶薯蓣或拟南芥；所述逆境胁迫为盐胁迫和/或干旱胁迫。
4.权利要求1所述DcW5基因或权利要求2所述蛋白在培育抗逆境胁迫的转基因植株中的应用，其特征在于，所述植物为菊叶薯蓣或拟南芥；所述逆境胁迫为盐胁迫和/或干旱胁迫。
5.一种重组表达载体，其特征在于，含有权利要求1所述DcW5基因。
6.一种基因工程菌，其特征在于，含有权利要求5所述重组表达载体。
7.一种培育抗逆境胁迫的转基因植物的方法，其特征在于，将权利要求5所述重组载体或权利要求6所述基因工程菌转化到菊叶薯蓣或拟南芥中，培育筛选转基因纯合系植物。
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