CN101955955A - 拟南芥基因AtSDH在调控植物抗胁迫方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种拟南芥基因AtSDH的应用，涉及该基因在调控植物抗逆境胁迫方面的应用，以及该基因在培育抗逆境胁迫转基因植物品种方面的应用。本发明通过对超表达转基因植株和缺失突变体对ABA的敏感性和逆境条件下生长分析，确立了AtSDH在拟南芥逆境胁迫中的作用与植物激素ABA有关，为理解植物山梨醇代谢在植物抗逆境胁迫中的作用提供了重要依据。在农业生产上利用该基因可以使幼苗和植株的生长更耐受逆境胁迫，为培育转基因作物新品种奠定理论基础。与野生型拟南芥相比，AtSDH基因超表达的转基因拟南芥对ABA的敏感性下降，幼苗和植株耐受干旱、高盐等逆境胁迫的能力提高。

Description

拟南芥基因AtSDH在调控植物抗胁迫方面的应用

技术领域

本发明涉及一种拟南芥基因AtSDH的应用，尤其涉及该基因在调控植物抗逆境胁迫方面的应用，以及该基因在培育抗逆境胁迫转基因植物品种方面的应用，属于基因工程领域。

背景技术

植物生长发育过程中，不正常的生长条件，如干旱、温度过低或过高、土壤盐离子浓度过高等都会引起植物体内的离子失衡和高渗胁迫，导致植物发育不良、生长缓慢特别是降低农作物产量、甚至导致植物死亡。因此，随着环境的逐步恶化和耕地面积的减少，通过提高作物的抗逆性以提高粮食的产量越来越受到人们的重视。

在逆境条件下，植物通过产生渗透调节物质来减轻胁迫造成的伤害。在苹果等植物中，水分胁迫下更多的葡萄糖转化为山梨醇，且水分胁迫抑制了山梨醇向淀粉的转化，表明山梨醇可能是一种重要的渗透调节物质，但山梨醇参与植物抗逆的机理目前还不清楚。推测山梨醇可能通过保护膜脂过氧化而降低对细胞的伤害作用。已知，山梨醇脱氢酶催化以下可逆反应：

在逆境胁迫条件下，植物体内会积累超氧阴离子自由基，山梨醇脱氢酶催化山梨醇合成的同时生成H⁺，H⁺可以在超氧化物歧化酶的作用下接收超氧阴离子自由基中的高能电子，缓解超氧阴离子自由基对细胞的伤害；另外，山梨醇脱氢酶催化山梨醇合成或分解的同时还涉及NAD⁺和NADH的转化，NAD⁺和NADH的数量和浓度在植物的糖酵解和三羧酸循环中起重要作用，山梨醇脱氢酶可能起到调节NAD⁺和NADH平衡的作用。

ABA是植物体内一种重要的激素，参与干旱等多种胁迫反应，目前我们已经对ABA参与的胁迫反应中的信号转导途径有所了解。并且，ABA还能通过调控糖代谢中如酸性转化酶等多种酶的含量和活性而调控糖代谢。但对于ABA是否能够通过调控山梨醇代谢而提高植物抗逆境胁迫的能力，目前还不清楚。

发明内容

本发明的目的在于提供一种拟南芥基因AtSDH在调控植物抗逆境胁迫方面的应用。

进一步的，本发明的目的还在于提供一种拟南芥基因AtSDH在培育抗逆转基因植物方面的应用。

为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种拟南芥基因AtSDH在调控植物抗逆境胁迫方面的应用。

所述的基因AtSDH在GenBank中的编号为AY133848(At5g51970)，该基因的CDS长度为1095bp，编码364个氨基酸的蛋白。

本发明通过采用GUS组织定位和GFP融合蛋白的细胞定位方法，分析AtSDH基因的组织和细胞表达特性。所述的基因AtSDH表达产物定位于细胞质胞浆内，该基因主要在叶片和根中表达。

所述的基因AtSDH参与干旱、NaCl等逆境胁迫。从拟南芥资源中心(ABRC)获得的AtSDH/基因T-DNA插入的缺失突变体SALK 035903(sdh-1)、SALK 020855(sdh-2)的纯合体比对干旱、NaCl等胁迫的敏感性增强。

所述的基因AtSDH参与激素ABA调控的逆境胁迫反应。本发明利用从ABRC获得的AtSDH基因T-DNA插入的缺失突变体，研究发现缺失突变体sdh-1和sdh-2对ABA的敏感性提高。

同时，本发明的技术方案还采用了一种拟南芥基因AtSDH在培育抗胁迫转基因植物方面的应用。

所述的基因AtSDH在GenBank中的编号为AY133848(At5g51970)，该基因的CDS长度为1095bp，编码364个氨基酸的蛋白。将AtSDH基因编码区序列连接到表达载体上，通过农杆菌介导的转化方法获得转基因植物。超表达AtSDH基因的拟南芥对ABA的敏感性下降，抵抗干旱、NaCl等逆境胁迫的能力提高。

本发明编号为At5g51970的AtSDH(Sorbitol Dehydrogenase)基因编码一个山梨醇脱氢酶，定位于细胞浆内，通过逆境信号分子ABA在植物抵抗逆境胁迫中具有重要作用。缺失该基因降低植物抗逆境胁迫能力，超表达该基因可以提高植物对逆境胁迫的抵抗能力。本发明通过对AtSDH基因的缺失和超表达分析，确立了AtSDH在调控植物抗逆境胁迫中的作用。在农业生产上利用此基因可以使植物的生长更耐受干旱、高盐等不利的环境因素，为培育转基因作物新品种奠定基础。

附图说明

图1是AtSDH基因在拟南芥根细胞(A)和叶片表皮细胞(B)中的亚细胞定位；

图2为超表达AtSDH基因和缺失突变体sdh的拟南芥在MS培养基上萌发、生长(A B)和在培养基质上开花、结实(C)情况；

图3超表达AtSDH基因和缺失突变体sdh拟南芥在含有0.7μMABA的MS培养基上萌发；

图4缺失突变体sdh拟南芥种子在含150mM NaCl的MS培养基上萌发(A)和超表达AtSDH基因及缺失突变体sdh拟南芥在150mM NaCl MS培养基上生长(B)以及在浇灌150mMNaCl的培养基质上生长1-4周的情况(C-F)；

图5超表达AtSDH基因和缺失突变体sdh拟南芥在含375mM甘露醇的MS培养基上萌发(A)、生长(B)和培养基质上停止浇水3周后植株的生长情况(C)；

图1-5中：WT为野生型拟南芥；35S：SDH-2，35S：SDH-8为两个超表达AtSDH基因的拟南芥株系；sdh-1，sdh-2分别为AtSDH基因在启动子区域和编码区区域插入的T-DNA缺失突变体纯合体。

具体发明实施方式

实施例1

缺失突变体纯合体的筛选，表型和遗传学分析

从拟南芥资源中心(Arabidopsis Biological Resource Center)购买的AtSDH基因启动子区域和编码区区域插入的T-DNA缺失突变体SALK 035903(sdh-1)和SALK 020855(sdh-2)，利用PCR法筛选纯合突变体，引物分别为：

SALK_035903

LP：5′-CGAATTGGGTTTTAAAAATTCG-3′

RP：5′-TGGATGGCTTATCGAGTTTTG-3′

SALK_020855

LP：5′-TGAAAGCTGTTGGTATTTGTGG-3′

RP：5′-CTACCTCCCTGTCTCCAAACC-3′

T-DNA(BP)引物：5′-TCAAACAGGATTTTCGCCTGCT-3′

对T-DNA插入纯合突变体sdh-1，sdh-2的进行RT-PCR分析，结果表明在突变体中该基因在转录水平不表达。对缺失纯合突变体植株在正常和胁迫条件下的生长发育进行分析。

实施例2

AtSDH基因的克隆，载体的构建，转基因植株的筛选

从拟南芥基因组中利用PCR方法扩增分离得到AtSDH的启动子序列，连接到pCAMBIA1391的GUS报告载体；从拟南芥中提取RNA，反转录成cDNA，从cDNA中扩增AtSDH的CDS序列，分别连接到pBI121的超表达载体和pBI121-GFP亚细胞定位载体；农杆菌介导转化获得转基因阳性植株。

从拟南芥信息资源tair(The Arabidopsis Information Resource)上查找AtSDH整个基因组序列，然后从起始密码子ATG之前取包括TATAbox等序列在内的1551bp，并且包括ATG之后第一个外显子和第一个内含子序列，共计1779bp，然后设计引物，根据pCAMBIA1391-GUS载体的多克隆位点，选择SalI/BamHI酶切位点，设计引物时引入酶切位点序列。以野生型拟南芥基因组DNA为模板，PCR扩增AtSDH启动子序列，连接到pCAMBIA1391-GUS载体，构建重组载体pCAMBIA1391-AtSDHp-GUS。并同时根据拟南芥AtSDHCDS序列设计引物，并在引物两端分别加入酶切位点XbaI/SacI和XbaI/KpnI以引入表达载体pBI121，分别构建重组质粒pBI121-AtSDH和pBI121-AtSDH-GFP，并由PCR、测序和酶切鉴定。

将构建好的载体转入农杆菌GV3101，筛选阳性克隆。常规方法转化拟南芥花蕾。将携带有pCAMBIA1391-AtSDHp-GUS、pBI121-AtSDH和pBI121-AtSDH-GFP重组载体的农杆菌分别转化野生型拟南芥。

对得到的种子进行筛选鉴定。载体pCAMBIA1391和pBI121分别带有潮霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因，将收获的种子用含潮霉素和卡那霉素的MS培养基分别筛选，对得到的抗性苗进行PCR鉴定，收获阳性植株的种子。

对携带有AtSDHp-GUS的转基因植株进行GUS组织化学染色，用于分析AtSDH的时空表达情况；对携带AtSDH-GFP的转基因植株进行亚细胞定位分析；AtSDH超表达植株进行正常和胁迫条件下的表型分析。

实施例3

AtSDH基因的表达分析

对携带有AtSDHP-GUS的转基因植株进行GUS组织化学染色，结果表明AtSDH主要在植物的根部和幼叶表达。利用激光共聚焦显微镜对携带AtSDH-GFP的转基因拟南芥进行GFP融合蛋白定位分析，表明该基因编码的蛋白定位在细胞质中(图1)。分别利用叶绿体的自发荧光、线粒体、过氧化酶体、高尔基体和内质网荧光标记探针检测排除该蛋白在以上细胞器的定位，确定该基因编码的蛋白定位在细胞质的胞质溶胶中。

实施例4

超表达AtSDH因和缺失突变体sdh拟南芥对ABA的敏感性分析

对ABA的敏感性上，超表达和缺失突变体拟南芥与野生型拟南芥相比都发生变化，说明AtSDH基因参与ABA的调控过程。将拟南芥种子消毒后播种于含0.7μMABA的MS固体培养基上，4℃暗处放置24小时，在22℃，16小时光照(100μmol/m²/s)下垂直培养1周后，超表达AtSDH因拟南芥对ABA的敏感性降低，2个超表达AtSDH因的拟南芥株系(35S：SDH-8，35S：SDH-8)的种子都能生根并能长出绿色子叶，野生型拟南芥有60％的子叶为黄色，仅有下胚轴而不能生根(图2，A)。缺失突变体的拟南芥对ABA的敏感性提高，在含0.7μM ABA的MS培养基上，相同条件水平培养1周后，突变体基本不能生根，子叶较小且呈黄色(图2，B)。

实施例5

正常和胁迫条件下超表达AtSDH因和缺失突变体sdh拟南芥的生长分析

正常条件下(温度22℃，光照强度100μmol/m²/s，16小时光照)，超表达AtSDH因和缺失突变体sdh拟南芥在MS培养基上萌发(图3，A)、生长(图2，B)和在培养基质上开花、结实等发育过程与野生型拟南芥无明显差异(图3，C)。

超表达AtSDH因的拟南芥抵抗NaCl胁迫的能力增强，缺失突变体拟南芥的萌发和生长都受到显著抑制。将野生型和缺失突变体拟南芥种子消毒后播种于含150mM NaCl的MS固体培养基上，4℃暗处放置24小时，在常规条件下(温度22℃，光照强度100μmol/m²/s，16小时光照)生长1周后，缺失突变体种子萌发和幼苗生长受到显著抑制(图4，A)。将MS培养基上常规条件下生长1周的拟南芥移到含有150mM NaCl的MS固体培养基上培养，1周后超表达AtSDH因拟南芥幼苗长出两片较大的真叶，野生型拟南芥长出的真叶较小，而缺失突变体sdh幼苗无真叶长出，且超表达拟南芥幼苗的根较野生型拟南芥长，缺失突变体的根比野生型拟南芥短(图4，B)。将以上3种拟南芥种子播于培养基质中，常规条件下培养4周后，开始浇灌150mM NaCl。浇灌1-4周后观察到植株生长情况如图4C-F所示。浇灌1周后，缺失突变体、超表达和野生型拟南芥无明显差异(图4，C)。2周后缺失突变体sdh和野生型拟南芥部分叶片开始干枯变黄，超表达植株叶片仍呈绿色、部分叶片变成褐色(图4，D)。浇灌3周后超表达AtSDH因的拟南芥株系8(35S：SDH-8)部分叶片开始发黄干枯，株系2(35S：SDH-2)叶片仍呈绿色或褐色，而缺失突变体和野生型拟南芥大部分植株已经干枯死亡(图4，E)。浇灌4周后缺失突变体基本全部死亡，野生型拟南芥绝大部分植株干枯死亡，而超表达拟南芥株系8约一半植株死亡，株系2仅有少数植株干枯死亡(图4，F)。

在干旱和渗透胁迫条件下，超表达AtSDH因的拟南芥幼苗和植株的抵抗和忍耐能力提高，缺失突变体sdh拟南芥的抵抗能力降低。将种子播于含有375mM的MS培养基上，4℃暗处放置24小时后，常规条件下培养10天后，突变体sdh-1和sdh-2的子叶呈黄色，仅有下胚轴无根长出。野生型拟南芥有40％种子能生根并长出绿色子叶。超表达AtSDH因的拟南芥两个株系分别有为86％和72％的种子能生根和长出绿色子叶(图5，A)。将相同条件下于MS培养基上生长1周的幼苗移到含375mM甘露醇的MS培养基上垂直培养，1周后超表达的拟南芥幼苗与野生型和突变体相比，根系较长，且有真叶长出(图5，B)。将以上3种类型的拟南芥种子播于培养基质中，常规条件下培养3周后，以不浇水作为干旱胁迫处理。处理3周后，超表达植株仍能生长正常，野生型拟南芥叶片开始轻度萎焉，而缺失突变体植株叶片已经严重萎焉(图5，C)。

Claims (6)

1.拟南芥基因AtSDH在调控植物抵抗逆境胁迫中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的基因AtSDH(Arabidopsis sorbitol dehydrogenase)在GenBank中的编号为At5g51970，该基因的CDS全长为1095bp，编码364个氨基酸的蛋白。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的基因AtSDH参与逆境胁迫激素ABA调控的植物生长发育观察。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的基因AtSDH编码一种定位于细胞质溶胶的山梨醇脱氢酶。

5.一种拟南芥基因AtSDH在培育抗胁迫转基因植物方面的应用。

6.根据权利要求5所述的拟南芥基因AtSDH在培育抗逆境胁迫转基因植物方面的应用，其特征在于：将AtSDH基因或其中部分片段连接到不同种类的载体上，通过不同的表达载体转化获得抗逆相关的转基因植物。

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