CN114645057B

CN114645057B - 一种柠条锦鸡儿耐旱基因Chr8.229及其用于制备耐旱转基因植物的应用

Info

Publication number: CN114645057B
Application number: CN202210169543.0A
Authority: CN
Inventors: 武生聃; 李国婧; 梅峰源; 杨天瑞; 请求不公布姓名
Original assignee: Lanzhou University
Current assignee: Lanzhou University
Priority date: 2022-02-23
Filing date: 2022-02-23
Publication date: 2023-06-09
Anticipated expiration: 2042-02-23
Also published as: CN114645057A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种柠条锦鸡儿耐旱基因Chr8.229及其用于制备耐旱转基因植物的应用，所述的耐旱基因Chr8.229能够显著降低干旱对植物幼苗的损伤，显著提高幼苗的成活率，显著提高幼苗叶绿素含量，将在培育柠条锦鸡儿抗旱新材料中发挥重要作用，同时可以用于培育耐旱转基因豆科作物，还可为其它经济作物抗旱性状的改良提供新方案，可对我国畜牧业、农业、林业等具有实质性的影响，具有广阔的应用前景和研究价值。

Description

一种柠条锦鸡儿耐旱基因Chr8.229及其用于制备耐旱转基因植物的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种柠条锦鸡儿耐旱基因Chr8.229及其用于制备耐旱转基因植物的应用。

背景技术

近年来，在全球气候变化背景下干旱频繁发生且日趋严重，大部分国家和地区都不同程度地受到干旱威胁，干旱胁迫能够对植物的外部形态、内源激素、光合作用等产生多方面的影响。短期或轻度干旱胁迫下植物叶片水势降低、气孔关闭，降低了CO₂的摄取与光合作用；长期而严重的干旱胁迫可抑制植株生长，并引起外观形态和生物量的变化，甚至会致使植物死亡。LEA蛋白(late embryogenesis abundant proteins,LEA)在植物胚胎发育晚期积累，有研究表明在植物处于非生物胁迫下时也会大量积累。在干旱胁迫下，植物通过较高水平地表达保护蛋白，以保证高度脱水细胞内的相对稳态，从而发挥有效的细胞保护机制。目前，已有对多种植物的LEA蛋白的研究，如拟南芥、大豆、蒺藜苜蓿等，但对柠条锦鸡儿中LEA蛋白尚缺少研究。

柠条锦鸡儿(Caragana korshinskii)是豆科锦鸡儿属植物，原产于中国北部和蒙古国，是荒漠生态系统的优势种和建群种，被广泛应用于干旱区的植被恢复。柠条锦鸡儿是研究天然旱生植物抗旱机制的一个理想模式类群，其根系极为发达，有较强的防风固沙及保持水土的作用，还具有耐风蚀、不怕沙埋的特点。因此，研究其抗旱机制，对于提高豆科作物及其他农作物或经济作物的抗旱能力，进而获得更高的经济效益与生态效益有着重要意义。

本领域关于耐旱基因的研究很多，例如专利CN108018292B公开了一种高山离子芥耐旱基因CbDREB2AS及其用于制备耐旱转基因植物的应用；专利CN110387377B公开了油菜耐旱基因BnNAC129及其用于制备耐旱转基因植物的应用；专利CN113388017A 公开了一种紫花苜蓿耐旱蛋白及其编码基因在培育耐旱植物中的应用。目前，只有极少的研究克隆和分析过柠条锦鸡儿的抗旱基因，特别是缺少对柠条锦鸡儿的抗旱基因LEA家族中脱水蛋白(Dehydrin,DHN)亚家族的研究。

发明人在研究过程中，通过基因组测序，结合生物信息学手段，意外的从柠条锦鸡儿基因组中筛选到了一组耐旱基因，共8个基因序列，将其命名为耐旱基因Chr8.225、耐旱基因Chr8.226、耐旱基因Chr8.227、耐旱基因Chr8.228、耐旱基因Chr8.229、耐旱基因Chr8.231、耐旱基因Chr8.233、耐旱基因Chr8.235，发明人将所述的基因通过瞬时表达，实验结果显示其具有耐旱特性。本发明以耐旱基因Chr8.229为主体展开研究。

发明内容

本发明的首要目的是提供一种柠条锦鸡儿耐旱基因Chr8.229，所述的耐旱基因Chr8.229的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明的第二目的是提供一种由所述的耐旱基因Chr8.229编码的蛋白Chr8.229，所述的蛋白Chr8.229的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明的第三目的是提供一种含有所述耐旱基因Chr8.229的表达载体。

本发明的第四目的是提供一种含有所述耐旱基因Chr8.229的细胞系。

本发明的第五目的是提供一种含有所述耐旱基因Chr8.229的宿主菌。

本发明的第六目的是提供一种如所述的耐旱基因Chr8.229在转化植物以产生耐旱转基因植物种的应用。

优选的，所述的植物包括双子叶植物和单子叶植物。

本发明的第七目的是提供一种含有所述耐旱基因Chr8.229的植物的制备方法，所述的方法包括如下步骤：S1.过表达载体的构建；S2.农杆菌介导的转化；S3.转基因株系的筛选。

本发明的有益效果是：本发明提供了一种柠条锦鸡儿耐旱基因Chr8.229，所述的耐旱基因Chr8.229能够显著降低干旱对植物幼苗的损伤，显著提高幼苗的成活率，显著提高幼苗叶绿素含量，将在培育柠条锦鸡儿抗旱新材料中发挥重要作用，同时可以用于培育耐旱转基因豆科作物，还可为其它经济作物抗旱性状的改良提供新方案，可对我国畜牧业、农业、林业等具有实质性的影响，具有广阔的应用前景和研究价值。

附图说明

图1耐旱基因Chr8.229的进化树

图2转基因柠条锦鸡儿和野生型柠条锦鸡儿的抗旱性比较

图3转基因柠条锦鸡儿和野生型柠条锦鸡儿干旱处理后的幼苗成活率比较

图4转基因柠条锦鸡儿和野生型柠条锦鸡儿干旱处理后的总叶绿素含量比较

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的描述说明，但以下实例仅用来详细说明本发明，并不是对本发明范围的限制。以下实例中所涉及的仪器设备、试剂、试验方法，如无特别说明，均为常规方法。

本发明所述的柠条锦鸡儿，采自甘肃省兰州市榆中县兰州大学榆中校区。

本发明所述的克隆载体pCanG-HA，来自于中国科学院遗传与发育生物学研究所谢旗研究员赠与。

本发明所述的农杆菌GV3101，来自于内蒙古自治区植物逆境生理与分子生物学重点实验室。

以下实施例所述的OD600指的是某种溶液在600nm波长处的吸光值。吸光值正比于溶液中的吸光物质的浓度，相应地与样品的透过率T值成反比，在数值上来说，它们之间是对数关系。

以下实施例所述的acetosyringone，即乙酰丁香酮，是一种酚类化合物,可诱发根瘤农杆菌细胞内Ti质粒DNA上Vir区基因的活化和高效表达，被广泛应用于农杆菌介导的遗传转化中。

以下实施例所述的CDS，Sequence coding for amino acids in protein蛋白质编码区；CDS是Coding sequence的缩写，是编码一段蛋白产物的核苷酸序列，为结构基因组学术语。

以下实施例所述的Silwet L-77，高效有机硅表面活性剂，能够极大的降低水的表面张力(水的表面张力为72.4mN/m，0.1％的Silwet L-77系列有机硅溶液的表面张力约为21mN/m)，这使Silwet L-77有机硅溶液可轻易湿润几乎所有种类的叶面，相对于传统助剂，显著提高了在靶标生物的覆盖面。同时，Silwet L-77有机硅助剂具有极强的耐水冲刷及渗透能力。Silwet L-77是拟南芥及其它作物常用的转基因用表面活性剂。

另外，本领域技术人员公知的是，干旱胁迫下，作物会启动多种生理、代谢机制以应对水分亏缺，研究显示，干旱条件下的叶片叶绿素含量会降低。

实施例一、耐旱基因Chr8.229的筛选

以柠条锦鸡儿为材料，通过转录组和生物信息学进行分析，发现了其中的一组基因在干旱处理时发生显著变化，共8个基因，通过瞬时表达实验进行了验证，发现8个基因均具有不同程度的耐旱性能，并发现所述的基因属于柠条锦鸡儿LEA家族的DHN亚家族中的基因，其进化树关系如图1所示。本专利请求保护耐旱基因Chr8.229，所述的耐旱基因Chr8.229的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

实施例二、耐旱基因Chr8.229的克隆及转化

(1)播种健康柠条锦鸡儿种子，干旱处理前幼苗正常生长，干旱处理时停止浇水。

(2)利用

HS DNA聚合酶(TaKaRa,Japan)扩增得到耐旱基因Chr8.229的全长CDS，并连接到pCanG-HA表达载体上。测序及酶切验证无误后，将验证正确的重组质粒电转化到农杆菌GV3101。

(3)对含有pCanG-HA空载体及耐旱基因Chr8.229重组质粒的农杆菌GV3101进行扩大培养，当OD600达到1.3～1.5时，于4℃、5000～6000rpm离心10分钟，收集菌体，并使用1/2MS培养基(100μmol/L acetosyringone)，将OD600稀释至0.7～0.8，，室温静置3～4h，每半小时混匀一次。并在注射前于1/2MS培养基中添加终浓度0.001％的Silwet L-77。

(4)将含有pCanG-HA空载体及耐旱基因Chr8.229重组质粒的农杆菌GV3101分别注射至对照及处理组3周龄的柠条锦鸡儿幼苗叶片中。使用1mL一次性注射器，无需针头注射到叶片背面，注射完成后植物黑暗培养2d。之后进行干旱处理，以pCanG-HA空载体注射的植株为对照。当幼苗在干旱条件下出现明显的萎蔫、黄变和致死效应时，立即拍照，计算各株系的成活率，测定总叶绿素含量。试验采用3次生物重复。

转基因瞬时表达柠条锦鸡儿和对照柠条锦鸡儿的抗旱性比较实验结果如图2所示，干旱处理12天后，空载体注射的对照幼苗大部分萎蔫倒伏，叶片全部有损伤，其中部分叶片整体呈黄色，干枯；表达耐旱基因Chr8.229的转基因柠条锦鸡儿的幼苗生长良好，叶片浓绿，仅有很少的一分部叶片尖部呈黄色；说明干旱胁迫对转基因柠条锦鸡儿的幼苗的伤害较小。

转基因瞬时表达柠条锦鸡儿和对照柠条锦鸡儿干旱处理后的幼苗成活率比较如图3所示，干旱处理12天后，野生型柠条锦鸡儿(对照组)的幼苗成活率为26.7％，转基因柠条锦鸡儿的幼苗成活率为74.4％，相较于对照组显著提升，具有统计学意义。

转基因瞬时表达柠条锦鸡儿和对照柠条锦鸡儿干旱处理后的总叶绿素含量比较如图4所示，干旱处理12天后，野生型柠条锦鸡儿(对照组)的幼苗叶绿素含量为1.30mg/gFW，转基因柠条锦鸡儿的幼苗叶绿素含量为1.71mg/g FW，相较于对照组有提高。

综上所述，本发明提供了一种柠条锦鸡儿耐旱基因Chr8.229，所述的耐旱基因Chr8.229能够降低干旱对植物幼苗的损伤，提高幼苗的成活率，提高幼苗叶绿素含量，将在培育柠条锦鸡儿抗旱新材料中发挥重要作用，同时可以用于培育耐旱转基因豆科作物，还可为其它经济作物抗旱性状的改良提供新方案，可对我国畜牧业、农业、林业等具有实质性的影响。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 兰州大学

<120> 一种柠条锦鸡儿耐旱基因Chr8.229及其用于制备耐旱转基因植物的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 783

<212> DNA

<213> 柠条锦鸡儿(Caragana korshinskii)

<400> 1

atggcacaac atcagcaggg tggtcaattc ggtgatcaac ttcgcaacac cgatgagtat 60

ggaaacccta tgagccaagt tgaccaatat gggaacccag ttcatcaaac tgatactggt 120

ggtgggttaa ccggaaccac tggtcatggt catggtcatg gatctgatca tcaggtcact 180

ggccatggaa cccacactgg cggtgccact ggttatggtg gtgccccggg agagcaactt 240

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agtaccgctg gtggtgacac tggttatgga accactgctg gaggaggcac gggaacaggt 360

tatggtgaaa ccgcagggca acactatggt ggtgagcaac accatgagaa gacaggggta 420

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accggcgccg gcgccggcac ggggtatgga acaactactg ggggtacagg tggaaccgca 540

gggcaacact atggtggtgc accgggagag catcatcatg agaagaaggg ggtagtggat 600

cagatcaagg agaagattcc aggaacgaac accactggta ctggcacagg cacggggcat 660

ggaaccacta ctgggggaac tggtcatcat caaaaatctc atggtgagta tggtggtgaa 720

cagcaacaag agaagaaagg gatcatggaa aagatcaagg ataaacttcc aggaggacac 780

taa 783

<210> 2

<211> 260

<212> PRT

<213> 柠条锦鸡儿(Caragana korshinskii)

<400> 2

Met Ala Gln His Gln Gln Gly Gly Gln Phe Gly Asp Gln Leu Arg Asn

1 5 10 15

Thr Asp Glu Tyr Gly Asn Pro Met Ser Gln Val Asp Gln Tyr Gly Asn

20 25 30

Pro Val His Gln Thr Asp Thr Gly Gly Gly Leu Thr Gly Thr Thr Gly

35 40 45

His Gly His Gly His Gly Ser Asp His Gln Val Thr Gly His Gly Thr

50 55 60

His Thr Gly Gly Ala Thr Gly Tyr Gly Gly Ala Pro Gly Glu Gln Leu

65 70 75 80

Gln Gly Lys Lys Gly Val Met Asp Gln Ile Lys Glu Gln Ile Pro Arg

85 90 95

Thr Asn Thr Thr Ser Thr Ala Gly Gly Asp Thr Gly Tyr Gly Thr Thr

100 105 110

Ala Gly Gly Gly Thr Gly Thr Gly Tyr Gly Glu Thr Ala Gly Gln His

115 120 125

Tyr Gly Gly Glu Gln His His Glu Lys Thr Gly Val Val Asp Gln Phe

130 135 140

Lys Glu Lys Ile Pro Gly Ser Gly Gly Gly Thr Gly Tyr Gly Thr Thr

145 150 155 160

Thr Gly Ala Gly Ala Gly Thr Gly Tyr Gly Thr Thr Thr Gly Gly Thr

165 170 175

Gly Gly Thr Ala Gly Gln His Tyr Gly Gly Ala Pro Gly Glu His His

180 185 190

His Glu Lys Lys Gly Val Val Asp Gln Ile Lys Glu Lys Ile Pro Gly

195 200 205

Thr Asn Thr Thr Gly Thr Gly Thr Gly Thr Gly His Gly Thr Thr Thr

210 215 220

Gly Gly Thr Gly His His Gln Lys Ser His Gly Glu Tyr Gly Gly Glu

225 230 235 240

Gln Gln Gln Glu Lys Lys Gly Ile Met Glu Lys Ile Lys Asp Lys Leu

245 250 255

Pro Gly Gly His

260

Claims

1.一种柠条锦鸡儿耐旱基因Chr8.229，其特征在于，所述的耐旱基因Chr8.229的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种由权利要求1所述的耐旱基因Chr8.229编码的蛋白Chr8.229，其特征在于，所述的蛋白Chr8.229的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.一种含有权利要求1所述耐旱基因Chr8.229的表达载体，其特征在于，所述的表达载体为pCanG-HA。

4.一种含有权利要求3所述表达载体的细胞系。

5.一种含有权利要求1所述耐旱基因Chr8.229的宿主菌，其特征在于，所述的宿主菌为农杆菌GV3101。

6.一种如权利要求1所述的耐旱基因Chr8.229在转化植物以产生耐旱转基因植物中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的植物包括双子叶植物和单子叶植物。

8.一种含有权利要求1所述耐旱基因Chr8.229的植物的制备方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：S1.过表达载体的构建；S2.农杆菌介导的转化；S3.转基因株系的筛选。