CN114277192A - 用于rt-lamp反应的扩增体系组合物、rna病毒的rt-lamp方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及用于RT‑LAMP反应的扩增体系组合物、RNA病毒的RT‑LAMP方法及应用。本发明提供的逆转录酶M‑MLV可以在60℃～65℃条件下依旧保持稳定的逆转录效率，将其用于RNA病毒的RT‑LAMP，与60℃～65℃条件下可恒温高效扩增的Bst酶搭配使用，即可实现在60℃～65℃条件下，仅用一步完成对RNA的高效扩增，解决现有技术中操作繁琐的技术问题。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及用于RT-LAMP反应的扩增体系组合物、RNA病毒的RT-LAMP方法及应用。
背景技术
目前在病原检测领域，基于聚合酶链式反应基因扩增的检测方法(如定量逆转录PCR、逆转录PCR)是病毒检测的标准确认方法，尽管以PCR为核心基础的技术已经被分子诊断委员会和政府有关部门认为是病毒检测的金标准，但是这些方法需要专业训练的人员以及昂贵的仪器设备，因此在资源有限的地方(例如不发达地区、不发达的产业如养殖业等)得不到广泛的应用。基因PCR为基础的方法需要耗时且复杂的方案，这极大的限制了在各种疾病发病率迅速呈指数增涨的大流行情况下的诊断效力，尤其是在全球广泛流行的病毒如SARS-COV-2。因此，需要建立一种简单又可靠的方法进行分子诊断。
LAMP(One step loop-mediated isothermal amplification)环介导等温扩增反应能够在等温的条件下(60度到65度)，在特别的引物设计情况下能够检测到目标核酸序列，甚至在极地的核酸存在的情况下，也可以进行检测。由于该方法操作简单，因此它在各种病毒性疾病的诊断中越来越受欢迎。在RNA病毒的检测过程中，需要一种额外的逆转录酶(M-MLV)，因此该方法叫做逆转录LAMP(RT-LAMP)，与RT-PCR不同，该方法可以在单个任意大小的PCR管中在低资源的环境中进行反应，因此在即时诊断(Point of care testing，PoCT)的场景中，RT-LAMP与RT-PCR相比具有明显的优势。同时已有报道，RT-LAMP的诊断成本也明显的低于RT-PCR。因此越来越多的研发人员投入到针对RT-LAMP的研发和优化工作中，使RT-LAMP在不同的场景中能够广泛的应用。
目前现有的RT-LAMP还是需要两个步骤：第一步，首先在恒温下进行逆转录，最佳常用温度为37℃，然后是进行LAMP反应，最佳的温度为60℃，由于存在不同的温度，因此在实验的过程中，增加了设备的投入，增加了成本。并且由于过程比较繁琐，增大了操作的难度，未经过专业训练的人员操作时，检测的成功率下降。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于，将一种热稳定性高的逆转录酶应用于RT-LAMP中，使得逆转录步骤和LAMP扩增步骤均可在同一较高温度下进行，从而实现一步法进行RT-LAMP反应，显著降低操作难度，从而实现作业人员的快速扩充，以能够应对更加紧急的卫生安全事件，具有极高的社会意义和经济价值。
本发明的另一个目的在于，提供采用上述热稳定性高的逆转录酶进行RT-LAMP的方法，在不需要调整温度的基础上，希望提供种“一步法”即可实现有效扩增的方法，降低对设备的要求，进一步促进推广应用。
为了解决上述技术问题，实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
第一方面，本发明提供氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的逆转录酶M-MLV在RNA病毒RT-LAMP反应中的应用。
在可选的实施方式中，所述RNA病毒包括SARS-COV-2病毒。
第二方面，本发明提供用于RT-LAMP反应的扩增体系组合物，所述扩增体系组合物中的逆转录酶为氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的逆转录酶M-MLV。
在可选的实施方式中，所述扩增体系组合物还包括DNA聚合酶、dNTP、保护剂和引物组。
在可选的实施方式中，所述扩增体系组合物用于SARS-COV-2病毒的RT-LAMP反应，所述扩增体系组合物包括引物F3 50～500nmol，引物B3 50～500nmol，引物BIP 400～800nmol，引物FIP 400～800nmol，引物LB 100～600nmol，引物LF 100～600nmol，MgSO4 1～50mmol，10×Bst-DNA聚合酶buffer 1～20μL，Bst-DNA聚合酶0.2～20U和逆转录酶M-MLV5～200U。
在可选的实施方式中，所述扩增体系组合物包括引物F3 200nmol，引物B3200nmol，引物BIP 500nmol，引物FIP 500nmol，引物LB 600nmol，引物LF 600nmol，MgSO420mmol，10×Bst-DNA聚合酶buffer 10μL，Bst-DNA聚合酶8U和逆转录酶M-MLV 200U。
第三方面，本发明提供RNA病毒的RT-LAMP方法，将前述实施方式所述的组合物与RNA病毒样本混匀后，于60～65℃任一反应温度下恒温扩增。
在可选的实施方式中，所述RNA病毒包括SARS-COV-2病毒，所述SARS-COV-2病毒N基因的检出限为180copies/ml。
在可选的实施方式中，所述恒温扩增的设备选自实时荧光定量PCR仪或其他恒温反应装置。
第四方面，本发明提供前述实施方式任一项所述组合物或前述实施方式任一项所述RT-LAMP方法在RNA病毒富集、筛选或非诊断目的的检测中的应用。
本发明提供的逆转录酶M-MLV可以在60℃～65℃条件下依旧保持稳定的逆转录效率，将其用于RNA病毒的RT-LAMP，与60℃～65℃条件下可恒温高效扩增的Bst酶搭配使用，即可实现在60℃～65℃条件下，仅用一步完成对RNA的高效扩增，解决现有技术中操作繁琐的技术问题。
基于上述高热稳定性逆转录酶的应用，本发明还以适于推广应用为目的，对RT-LAMP的使用场景进行了改进，目前的RT-PCR反应仅能在PCR仪或者Real-time PCR仪中使用。而本发明提供的扩增体系能够使得RT-LAMP在常规恒温反应装置中进行，例如使用最为常见的水浴锅即可完成实验，极大的降低了实验的成本和操作难度，适合推广。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的不同SARS-COV-2病毒RNA浓度的检出结果；
图2为本发明实施例2通过高灵敏度显色Buffer观察得到扩增结果；
图3为本发明实施例3与实施例1扩增效果对比结果；
图4为本发明对比例1与实施例1扩增效果对比。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。
在具体的实施方式中，第一方面，本发明提供氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的逆转录酶M-MLV在RNA病毒RT-LAMP反应中的应用。
氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的逆转录酶M-MLV是在野生型逆转录酶M-MLV的基础上经过G55A和F189L点突变获得的具有高热稳定性的逆转录酶M-MLV突变体(SEQ IDNo.2)，其在60℃～65℃范围内仍保持较高的逆转录效率。
在可选的实施方式中，所述RNA病毒包括SARS-COV-2病毒。
应当理解的是，本发明的改进点在于，上述高热稳定性逆转录酶的使用，使得RNA病毒的逆转录反应的温度范围得到的很大扩展，扩展到逆转录反应能够与扩增过程等温，因此，基于该原理，凡是能够在60℃～65℃条件下实现高效逆转录和环介导扩增的RNA病毒样本均能够用于本发明，均应当被理解为本发明的保护范围，而在具体的实施方式中，考虑到SARS-COV-2病毒的重要性，本发明以SARS-COV-2病毒作为示例进行了说明，而不应当将SARS-COV-2病毒理解为对RNA病毒的限缩。
基于第一方面，第二方面，本发明提供用于RT-LAMP反应的扩增体系组合物，所述扩增体系组合物中的逆转录酶为氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的逆转录酶M-MLV。
在可选的实施方式中，所述扩增体系组合物还包括DNA聚合酶、dNTP、保护剂和引物组。
基于上述本发明的改进原理，容易理解的是，本发明所述的DNA聚合酶是本领域技术人员能够根据具体DNA聚合酶的反应温度进行常规选择的。而其他的组分如dNTP和保护剂也同样需要针对60℃～65℃的温度条件进行适应性调整。对于所述引物组，本领域技术人员能够根据靶标核酸分子根据LAMP需求进行设计，应当理解的是，能够在60℃～65℃的温度条件成功对靶标核酸分子完成扩增的引物组均应在本发明的保护范围内。
在可选的实施方式中，所述扩增体系组合物用于SARS-COV-2病毒的RT-LAMP反应，所述扩增体系组合物包括引物F3 50～500nmol，引物B3 50～500nmol，引物BIP 400～800nmol，引物FIP 400～800nmol，引物LB 100～600nmol，引物LF 100～600nmol，MgSO4 1～50mmol，10×Bst-DNA聚合酶buffer 1～20μL，Bst-DNA聚合酶0.2～20U和逆转录酶M-MLV5～200U。
对于所述引物F3、引物B3、引物BIP、引物FIP、引物LB和引物LF，本领域技术人员能够根据选定的SARS-COV-2病毒的靶标核酸分子涉及成套的用于LAMP的引物组。
在可选的实施方式中，所述扩增体系组合物包括引物F3 200nmol，引物B3200nmol，引物BIP 500nmol，引物FIP 500nmol，引物LB 600nmol，引物LF 600nmol，MgSO420mmol，10×Bst-DNA聚合酶buffer 10μL，Bst-DNA聚合酶8U和逆转录酶M-MLV 200U。
第三方面，本发明提供RNA病毒的RT-LAMP方法，将前述实施方式所述的组合物与RNA病毒样本混匀后，于60～65℃任一反应温度下恒温扩增。
在可选的实施方式中，所述RNA病毒包括SARS-COV-2病毒，所述RNA病毒的检出限为180copies/ml。
在可选的实施方式中，所述恒温扩增的设备选自实时荧光定量PCR仪或其他恒温反应装置。
本发明提供的针对SARS-COV-2病毒的RT-LAMP检测方法具有安全性高、特异性好、灵敏度高，且操作便捷的优势。这主要体现在以下几个方面：(1)扩增反应只有在六条引物完全与识别的靶序列中八个结合区匹配的情况下才能够顺利的进行，所有这些特性都在很大程度上减少了扩增反应的背景，从而使检测特异性得到改善。(2)本发明提供的扩增方法省略了单独的逆转录和巢式PCR的二次扩增步骤，只需一步就可完成实验操作，没有核酸变复性的过程，减少了RNA酶和扩增核酸的污染机会，提高了检测的敏感性和安全性。(3)所有的扩增过程都可在60℃～65℃恒温下完成无需PCR仪，降低了对实验硬件的要求。(4)较RT-PCR缩短了检测所需的时间。
第四方面，本发明提供前述实施方式任一项所述组合物或前述实施方式任一项所述RT-LAMP方法在RNA病毒富集、筛选或非诊断目的的检测中的应用。
下面结合附图，对本发明的一些实施方式作详细说明。在不冲突的情况下，下述的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1
本实施例提供一种用于SARS-COV-2病毒RT-LAMP的扩增体系，所述试剂包括引物F3 200nmol，引物B3 200nmol，引物BIP 800nmol，引物FIP 800nmol，LB 600nmol，LF600nmol，MgSO4 20mmol，10×Bst-DNA聚合酶buffer 10μL，Bst-DNA聚合酶(南京巨匠生物科技有限公司，货号M102)8U和逆转录酶M-MLV(南京巨匠生物科技有限公司，货号R101)200U。
其中逆转录酶M-MLV的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述六条引物是以SARS-COV-2病毒N基因的相对保守区为靶标核酸分子，通过Blast、AlignX和primer5.0程序设计得到的，具体序列如下表所示。
表1实施例1使用的引物组
设备：ABILife7500荧光定量PCR仪。
扩增参数为：以1.8×1010copies/mL SARS-COV-2病毒RNA作为高浓度投入量，进行9个10倍梯度稀释，每组25μL反应体系，60℃一步法反应20min。设置每30sec读取荧光数值荧光定量PCR仪结果如图1，图中曲线由左到右依次对应SARS-COV-2病毒RNA浓度为1.8×1010copies/mL、1.8×109copies/mL、1.8×108copies/mL、1.8×107copies/mL、1.8×106copies/mL、1.8×105copies/mL、1.8×104copies/mL、1.8×103copies/mL和1.8×102copies/mL，循环次数达到40次时，SARS-COV-2病毒RNA浓度为1.8×101copies/mL的样本无法检出，由此可见，最低检出RNA拷贝浓度约为180copies/mL。
实施例2
本实施例给出了提供一种用于SARS-CoV-2病毒RT-LAMP的扩增体系，与实施例1的区别在于，未用荧光定量PCR仪检测荧光值，而是通过高灵敏度显色Buffer反应来观察实验结果，具体如下：
所述扩增体系，包括试剂：引物F3 200nmol，引物B3 200nmol，引物BIP 800nmol，引物FIP 800nmol，LB 600nmol，LF 600nmol，MgSO4 20mmol，10×Bst-DNA聚合酶buffer 10μL，10×显色Buffer 10μL，10×Bst-DNA聚合酶(南京巨匠生物科技有限公司，货号M102)8U和逆转录酶M-MLV(南京巨匠生物科技有限公司，货号R101)200U。金属浴或水浴60℃，30min，进行等温扩增反应，结果如图2，图2中最右侧深色样本(实际液体颜色为紫色)为未添加RNA模板的对照组，左侧四个浅色样本(实际液体颜色为浅黄色)为添加RNA模板的实验组。实验结果表明，整个反应体系能够在60℃一步法反应30min，金属浴或水浴能够恒温控制条件下能够进行有效反应。
实施例3
本实施例给出了提供一种用于SARS-CoV-2病毒RT-LAMP的扩增体系组合物，与实施例1的区别在于，各组分的用量不同，具体如下：
引物F3 50nmol，引物B3 50nmol，引物BIP 400nmol，引物FIP 400nmol，引物LB100nmol，引物LF 100nmol，MgSO4 1mmol，10×Bst-DNA聚合酶buffer 1μL，Bst-DNA聚合酶2U和逆转录酶M-MLV 50U。
设备：ABI Life7500荧光定量PCR仪。
以1.8×104～1.8×108copies/mL SARS-COV-2病毒RNA作为模板，进行60℃一步法反应20min，每组25μL反应体系。设置每30sec读取荧光数值荧光定量PCR仪结果如图3，实施例1的荧光定量Ct值结果要小于实施例3的荧光定量Ct值，结果表明实施例1组分配比结果要优于实施例3。
对比例1
本实施例给出了提供一种用于SARS-CoV-2病毒RT-LAMP的扩增体系，与实施例1的区别在于，逆转录酶不一样，具体如下：
逆转录酶M-MLV 200U(宝生物，最适反应温度42℃)。
以1.8×104～1.8×107copies/mL SARS-COV-2病毒RNA作为模板，进行60℃一步法反应20min，每组25μL反应体系。设置每30sec读取荧光数值荧光定量PCR仪结果如图4，实施例4组分实验组Ct值均远大于实施例1，常规最适反应温度42℃逆转录酶M-MLV不适用于60℃一步法反应，而本发明中所使用的转录酶M-MLV能够进行有效的扩增。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京巨匠生物科技有限公司
<120> 用于RT-LAMP反应的扩增体系组合物、RNA病毒的RT-LAMP方法及应用
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 716
<212> PRT
<213> Moloney murine Leukemia virus
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<223> SEQ ID No.1 经G55A和F189L获得
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Leu Leu Gln Glu Gly Gln Arg Lys Ala Gly Ala Ala Val Thr Thr Glu
565 570 575
Thr Glu Val Ile Trp Ala Lys Ala Leu Pro Ala Gly Thr Ser Ala Gln
580 585 590
Arg Ala Gln Leu Ile Ala Leu Thr Gln Ala Leu Arg Met Ala Glu Gly
595 600 605
Lys Lys Leu Asn Val Tyr Thr Asn Ser Arg Tyr Ala Phe Ala Thr Ala
610 615 620
His Ile His Gly Glu Ile Tyr Arg Arg Arg Gly Leu Leu Thr Ser Glu
625 630 635 640
Gly Lys Glu Ile Lys Asn Lys Asp Glu Ile Leu Ala Leu Leu Lys Ala
645 650 655
Leu Phe Leu Pro Lys Arg Leu Ser Ile Ile His Cys Pro Gly His Gln
660 665 670
Lys Gly His Ser Ala Glu Ala Arg Gly Asn Arg Met Ala Asp Gln Ala
675 680 685
Ala Arg Lys Ala Ala Ile Thr Glu Asn Pro Asp Thr Ser Thr Leu Leu
690 695 700
Ile Glu Asn Ser Ser Pro Asn Ser Arg Leu Ile Asn
705 710 715
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> COVID-19病毒N基因 LAMP的F3引物
<400> 3
cgtggtccag aacaaac 17
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> COVID-19病毒N基因 LAMP的B3引物
<400> 4
attcagcaaa atgacttgat ct 22
<210> 5
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> COVID-19病毒N基因 LAMP的BIP引物
<400> 5
caaattgtgc aatttgcgga ggaactaatc agacaagg 38
<210> 6
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> COVID-19病毒N基因 LAMP的FIP引物
<400> 6
gggaacgtgg ttgacctaga aatttggatc tttgtcat 38
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> COVID-19病毒N基因 LAMP的LF引物
<400> 7
ccaatgtttg taatcagt 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> COVID-19病毒N基因 LAMP的LB引物
<400> 8
cacaggtgcc atcaaatt 18
Claims (10)
1.氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的逆转录酶M-MLV在RNA病毒RT-LAMP反应中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述RNA病毒包括SARS-COV-2病毒。
3.用于RT-LAMP反应的扩增体系组合物，其特征在于，所述扩增体系组合物中的逆转录酶为氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的逆转录酶M-MLV。
4.根据权利要求3所述的扩增体系组合物，其特征在于，所述扩增体系组合物还包括DNA聚合酶、dNTP、保护剂和引物组。
5.根据权利要求4所述的扩增体系组合物，其特征在于，所述扩增体系组合物用于SARS-COV-2病毒的RT-LAMP反应，所述扩增体系组合物包括引物F3 50～500nmol，引物B350～500nmol，引物BIP 400～800nmol，引物FIP 400～800nmol，引物LB100～600nmol，引物LF 100～600nmol，MgSO41～50mmol，10×Bst-DNA聚合酶buffer 1～20μL，Bst-DNA聚合酶0.2～20U和逆转录酶M-MLV 5～200U。
6.根据权利要求5所述的扩增体系组合物，其特征在于，所述扩增体系组合物包括引物F3 200nmol，引物B3 200nmol，引物BIP 500nmol，引物FIP 500nmol，引物LB 600nmol，引物LF 600nmol，MgSO4 20mmol，10×Bst-DNA聚合酶buffer 10μL，Bst-DNA聚合酶8U和逆转录酶M-MLV200U。
7.RNA病毒的RT-LAMP方法，其特征在于，将权利要求3或4所述的组合物与RNA病毒样本混匀后，于60～65℃任一反应温度下恒温扩增。
8.根据权利要求7所述的RT-LAMP方法，其特征在于，所述RNA病毒包括SARS-COV-2病毒，所述RNA病毒的检出限为180copies/ml。
9.根据权利要求7或8所述的RT-LAMP方法，其特征在于，所述恒温扩增的设备选自实时荧光定量PCR仪或其他恒温反应装置。
10.权利要求3～6任一项所述组合物或权利要求7～9任一项所述RT-LAMP方法在RNA病毒富集、筛选或非诊断目的的检测中的应用。
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