CN108085412A - 一种人星状病毒1型核酸检测标准物质及其制备方法和应用 - Google Patents

一种人星状病毒1型核酸检测标准物质及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种人星状病毒1型核酸检测标准物质及其制备方法和应用，本发明人星状病毒1型核酸检测标准物质的RNA序列如SEQ ID No.1所示。本发明还具体公开了所述人星状病毒1型核酸检测标准物质的制备方法以及在人星状病毒1型核酸检测中作为标准物质的应用。本发明人星状病毒1型核酸检测标准物质无生物传染性，容易制备，具有良好的均匀性和足够的稳定性，且该标准物质具有准确、可溯源的特性值；既可作为人星状病毒1型核酸定性检测的阳性对照，又可以作为人星状病毒1型核酸定量检测的外部标准品，还可用于评价新的人星状病毒1型核酸检测方法，为人星状病毒1型核酸检测能力认证认可提供物质基础，可被广泛应用于各实验室。

Description

一种人星状病毒1型核酸检测标准物质及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域。更具体地，涉及一种人星状病毒1型核酸检测标准物质及其制备方法和应用。
背景技术
Appleton等于1975年在胃肠炎患者的粪便中首次发现星状病毒(HumanAstrovirus,HAstV)，各国每年都会出现不同程度地出现星状病毒感染暴发情况。星状病毒属无衣壳的单股正链RNA病毒，直径28～35nm，具有5～6个小角，使整个病毒粒子呈星状结构。病毒基因长6.8kb，包括一个5’非编码区(5’non-coding region,NCR)，三个开放读码框架(open reading frams,ORFs)ORF1a、ORF1b和ORF2，80个核苷酸的3’非编码区和一个大约30个核苷酸的多聚腺苷酸尾)。星状病毒可划分为8个血清型HAstV-1～HAstV-8。目前，人星状病毒1型(Human Astrovirus type1,HAstV-1)已被认为是引起婴幼儿、老年人及免疫力低下者急性病毒性肠炎的重要病原之一。
目前，中国尚无人星状病毒1型相关的标准物质。多数检测实验室采用自行构建的 含有食源性病毒目的片段的重组质粒(Min BS,Noh YJ,Shin JH,et al.Assessment of the quantitative real-time polymerase chain reaction using a cDNA standard for human group A rotavirus[J].J Virol Methods,2006,137(2):280-6；胡秀华,何苗, 刘丽,等.水中轮状病毒实时定量PCR外标准品的构建[J].环境科学,2008(02):2380- 2385.)或含有病毒颗粒的阳性样本，如腹泻患者粪便样品(Schultz AC,Saadbye P, Hoorfar J,et al.Comparison of methods for detection of norovirus in oysters [J].Int J Food Microbiol,2007,114(3):352-6；Butot S,Putallaz T,Sanchez G,et al.Procedure for rapid concentration and detection of enteric viruses from berries and vegetables[J].Appl Environ Microbiol,2007,73(1):186-92.)作为相应 食源性病毒PCR检测的阳性对照。重组质粒构建方法简单，无生物传染性，便于运输，但是无 法对病毒RNA检测的逆转录过程进行控制；而且这些重组质粒没有权威机构认证，无法保证 均匀性性和稳定性，没有统一的使用方案，没有准确的可溯源的量值，因此，在实际应用中， 检测结果的可靠性得不到保证，在定量分析时也很难直观传达病毒含量信息。含有病毒颗 粒的阳性样品有潜在传染性，制备运输困难，且反复冻融后病毒载量会明显降低，因而也不 是理想的标准样品来源。
体外合成RNA无生物传染性，均匀性良好，可对食源性病毒检测的逆转录和PCR进行监控，尤其在理论上可采用物理或者化学方法进行定量，得到准确且具有溯源性的量值。目前，国内外尚没有以人星状病毒1型RNA片段为原料的标准物质。
因此，提供一种体外合成人星状病毒1型RNA片段有效地发挥了实验室内和实验室间质量控制作用，具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种具有良好均匀性，足够稳定性和准确可溯源的特性值等特点的人星状病毒1型核酸检测标准物质。
本发明的第二个目的在于提供一种上述人星状病毒1型核酸检测标准物质的制备方法。
本发明的第三个目的在于提供一种上述人星状病毒1型核酸检测标准物质在人星状病毒1型核酸检测中作为标准物质的应用。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
本发明提供了一种人星状病毒1型核酸检测标准物质，所述标准物质的RNA序列如SEQ ID No.1所示。
进一步，所述标准物质的特性值为(5.52±0.88)×106拷贝/μL。
本发明进一步提供了上述人星状病毒1型核酸检测标准物质的制备方法，包括以下步骤：
1)筛选人星状病毒1型阳性样品，提取病毒RNA，逆转录后，扩增出如SEQ ID No.5所示的DNA片段；
2)将步骤1)中所述DNA片段与质粒载体连接构建重组质粒；
3)将步骤2)获得的重组质粒转化到感受态细胞内，增殖，提取重组质粒；
4)采用限制性内切酶对步骤3)提取得到的重组质粒进行单酶切，得到线性化重组质粒；
5)以线性化重组质粒为模板，体外转录合成获得人星状病毒1型核酸检测标准物质候选物，稀释，经均匀性、稳定性检测后，进行定值和不确定度评估，即可。
本发明通过以上方法制备的人星状病毒1型核酸检测标准物质无生物感染性，避免了生物安全的问题，经均匀性、稳定性检测表明，具有良好的均匀性和足够的稳定性；经定值研究和不确定度评估，其特性值为(5.52±0.88)×106拷贝/μL，准确可溯源，保证满足病毒核酸检测时的质控和定量需求。
进一步，步骤1)中扩增出如SEQ ID No.5所示的DNA片段所用的引物如SEQ IDNo.2和SEQ ID No.3所示。
进一步，所述限制性内切酶为HamHⅠ限制性内切酶。
进一步，步骤5)中所述体外转录的启动子为T7启动子，其序列为SEQ ID No.6所示，转录是从序列最后三个G中的第一个G开始。
在本发明中所述质粒载体和感受态细胞没有特别的要求，只要能满足本发明的需要即可。在本发明具体的实施方式中，所述质粒载体为pcDNAII载体；所述感受态细胞为大肠杆菌TOP10菌株。
本发明进一步还提供了上述人星状病毒1型核酸检测标准物质在人星状病毒1型核酸检测中作为标准物质的应用。例如可以为人星状病毒1型核酸定性检测的阳性对照，人星状病毒1型核酸定量检测的外部标准物质等等。
本发明还提供了一种包含上述人星状病毒1型核酸检测标准物质的试剂盒。
进一步，所述试剂盒还包括用于检测人星状病毒1型核酸的RT-ddPCR引物和探针组合，所述RT-ddPCR引物和探针组合包含如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的引物和如SEQ ID No.4所示的探针。
其中，所述探针5’端标记FAM，3’端标记BHQ。
本发明的有益效果如下：
本发明人星状病毒1型核酸检测标准物质1)无生物传染性，容易制备，具有良好的均匀性和足够的稳定性，且该标准物质具有准确、可溯源的特性值；2)既可作为人星状病毒1型核酸定性检测的阳性对照，又可以作为人星状病毒1型核酸定量检测的外部标准品，还可用于评价新的人星状病毒1型核酸检测方法，为人星状病毒1型核酸检测能力认证认可提供物质基础，可被广泛应用于各实验室。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示出人星状病毒1型核酸检测标准物质候选物制备方案。
图2示出星状病毒阳性样本的TEM观察结果。
图3示出粪便样本星状病毒RNA的实时荧光RT-PCR检测结果。
图4示出pcDNAII载体图谱。
图5示出重组质粒结构示意图。
图6示出重组质粒普通PCR鉴定结果。
图7示出线性化重组质粒大小与纯度；其中，M：DNA Marker；1，2：人星状病毒1型线性化的重组质粒。
图8示出体外转录RNA的荧光PCR鉴定结果。
图9示出体外转录RNA大小与纯度；其中，M：RNA Marker；1，2：人星状病毒1型体外转录RNA。
图10示出人星状病毒1型核酸检测标准物质的均匀性。
图11示出人星状病毒1型核酸检测标准物质的长期稳定性。
图12示出人星状病毒1型核酸检测标准物质的联合定值结果。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1用于研制星状病毒1型核酸检测标准物质的特异性引物和探针
选取人星状病毒1型开放阅读框2(Open Reading Frame,ORF2)编码caspidprotein的靶序列，通过NCBI在线工具进行序列分析和比对，利用Prime Express软件V4.0(ABI,Foster City,CA,USA)设计出10余对引物和探针组合，经过筛选，最终获得特异性强、用于制备人星状病毒1型核酸检测标准物质和后续逆转录微滴式数字聚合酶链式反应(Reverse Transcript-droplet digital Polymerase Chain Reaction，RT-ddPCR)检测方法的引物和探针组合各1套，序列见表1。其中探针5’端标记FAM，3’端标记BHQ。引物和探针均由北京六合通经贸有限公司合成。
表1引物探针序列
实施例2人星状病毒1型核酸检测标准物质候选物的制备
从被鉴定为人星状病毒1型阳性的生物样品(多为粪便样品)中提取病毒RNA，利用筛选出的SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的特异性引物扩增出如SEQ ID No.5所示的DNA片段；然后将该DNA片段与质粒载体连接构建重组质粒，并将该重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞内，构建含有重组质粒的大肠杆菌；通过大肠杆菌的增殖，可实现上述DNA片段的重组质粒的大量制备；提取重组质粒，继而采用HamHⅠ限制性内切酶对重组质粒进行单酶切，形成体外转录模板，通过T7启动子体外转录合成获得人星状病毒1型核酸检测标准物质候选物。其中，T7的序列(TAATACGACTCACTATA(GGG))如SEQ ID No.6所示，转录是从(GGG)中的第一个G开始的，因此，得到的人星状病毒1型核酸检测标准物质候选物的序列如SEQ IDNo.1所示。具体制备方案见图1，包括制备程序和质控程序两个方面，详细步骤如下：
1.星状病毒阳性样本鉴定
星状病毒阳性粪便从北京儿童医院获得，取10μL粪便样品滴于200目的喷碳铜网上，1min后用滤纸吸弃多余液体，用2％(w/v)乙酸铀染色20s，置空气中干燥后，于透射电镜(TEM)下观察可见，样品中多见散在的病毒颗粒，病毒颗粒呈球形，无包膜，直径为28nm～32nm，具有5～6个小角，使整个粒子呈星状结构，是典型的星状病毒颗粒形态(图2)。
2.星状病毒RNA的提取、逆转录与鉴定
用TRIzol提取鉴定为星状病毒阳性的样本中的RNA，继而使用SuperscriptTMfirst-strand synthesis system for RT-PCR试剂盒进行对提取RNA的逆转录反应生成cDNA；采用qRT-PCR方法对逆转录产生的cDNA进行鉴定。结果发现阳性粪便样品提取的RNA出现特异性荧光扩增信号，其检测Ct值为21.5，说明提取的RNA中分别含有较高浓度的人星状病毒1型核酸(图3)。
3.人星状病毒1型病毒重组质粒的制备
3.1目的片段的RT-PCR扩增
利用SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的引物，从星状病毒的阳性粪便样品中扩增出如SEQ ID No.5长度为73bp的所示的特异性DNA片段，该特异性片段为人星状病毒1型特异性目的片段。
25μL反应体系中含有10×PCR缓冲液5μL、dNTP(2.5mmol/L)4μL、上游引物和下游引物(10μmol/L)各2μL、pyrobest酶(5U/μL)0.5μL以及cDNA模板5μL。于ABI 9700PCR仪中按以下条件进行反应：94℃预变性5min；94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环，72℃，8min，4℃保存。3.2PCR产物的回收
PCR产物用SV Gel and PCR Clean-Up System(promega)回收。取PCR产物2μL进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，切下含目的片段的琼脂糖块(尽可能小)，放入1.5mL离心管中，按10μL/10mg琼脂糖胶加入膜结合缓冲液，置50℃～65℃水浴孵育10min，每2min颠倒混匀一次，直至琼脂糖胶块完全融化。将融化的胶液移入吸附柱，室温下放置1min，16000g离心1min，弃去收集管中的液体，将吸附柱放回同一收集管中。吸附柱内加入700μL洗涤缓冲液，16000g离心1min，弃去收集管中的液体，将吸附柱重新放回收集管中，500μL洗涤缓冲液重复洗涤一次，16000g离心5min，弃去收集管中的液体，吸附柱放回收集管中，开盖状态下离心1min，以去除残留的乙醇。将吸附柱放入干净的1.5mL离心管中，50μL DEPC水加入到吸附膜中央，静置1min，室温16000g离心1min，将洗脱下来的液体(DNA)置-20℃保存备用。3.3连接反应
选择含有T7启动子的pcDNAII载体作为重组质粒的载体，质粒图谱见图4。首先将pcDNAII载体利用EcoRV进行单酶切，形成带有两个平末端的线性化载体，继而将RT-PCR扩增出的目的片段通过平端连接插入到pcDNAII载体上。具体连接体系包括PCR胶回收产物6μL、连接缓冲液1μL、pcDNAII载体1μL、连接酶1μL、以水补足反应体系至10μL。置于14℃连接过夜。
将RT-PCR扩增所得到的人星状病毒1型靶基因DNA片段插入到载体EcoRV酶切位点处，构建出含有病毒靶基因的重组质粒，重组质粒的结构示意图见图5。
3.4连接产物的转化
TOP10感受态细胞是大肠杆菌TOP10菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞，可用于DNA的热击转化，是一种常用于质粒克隆的菌株。-80℃冰箱取出冷冻的TOP10感受态细胞(50μL/管)于冰上融化，轻弹管壁使其混匀。吸取5μL连接液加入上述盛有感受态细胞的离心管中；轻弹管外壁使其混匀，冰浴30min；42℃热击40s，加入250μL SOC培养液，37℃温育1h。在含50μg/mL Ampicillin的LB平板上加入40μL X-gal(20mg/mL)和4μL IPTG(200mg/mL)，用无菌玻璃涂布器均匀涂布于整个平板表面，在超净工作台上吹干后，取100μL菌悬液涂布于LB平板上，37℃培养12h直至长出单菌落待用。3.5重组质粒的提取
无菌接种环在转化平板上随机挑取白色单菌落，接种到装有3mL含50μg/mLAmpicillin的LB培养液的试管中，220rpm、37℃振荡培养过夜增菌。采用Wizard Plus SVMinipreps DNA Purification System(promega)提取，具体操作按试剂盒说明书进行。最后将重组质粒DNA溶于50μL TE，得重组质粒，保存于-20℃中。
3.6重组质粒的鉴定
3.6.1PCR鉴定
利用SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的引物对提取的重组质粒进行PCR扩增，电泳鉴定扩增产物。电泳结果显示重组质粒pcDNAII–Ast经PCR扩增后在73bp处出现特异性扩增条带(见图6)，提示重组质粒中包含了病毒的目的基因片段，进一步通过测序加以验证。
3.6.2测序鉴定
取经PCR鉴定为阳性的重组质粒送于上海生工生物技术服务有限公司进行测序鉴定，根据图5所示的重组质粒的结构，目的片段插入到pcDNAⅡ载体EcoRV酶切位点处，EcoRV的酶切位点为“GAT！ATC”，故在目的片段上游和下游应包含EcoRV酶切位点部分序列；方框中为插入的目的片段，将该目的片段测序结果与GenBank中星状病毒的基因序列进行同源性分析，与人星状病毒1型分离株的基因同源性可达100％，说明重组质粒(具体序列为CGAGCGGCCGCCAGTGTGATGGAT ATCTGCAGAAT)中含有序列如SEQ ID No.5所示的人星状病毒1型的目的片段。
4.体外转录模板的制备
4.1重组质粒的线性化
通常进行体外转录之前需要将DNA模板线性化，从而保证不会对病毒靶基因下游的序列进行过度转录。选择位与病毒靶基因下游的BamHI限制性内切酶对重组质粒进行单酶切，该酶切后产生5’突出的粘末端，可有效避免对非靶基因的转录。
4.2线性化的重组质粒的纯化与电泳鉴定
高效的体外转录依赖于高质量的转录模板，要求线性化DNA模板不含RNase，不掺杂其他DNA结构及其他对转录反应可能产生干扰的成分。因此我们选择美国promega公司的Wizard DNA Clean-Up System试剂盒对线性化DNA进行提纯，浓缩。纯化后的线性化的重组质粒进行琼脂糖凝胶电泳，判断其大小和纯度。
重组质粒pcDNAⅡ-Ast中插入的目的片段大小为73bp，pcDNAⅡ载体大小为2971bp，故重组质粒的大小应该为3044bp。1％琼脂糖凝胶电泳显示纯化后的线性重组质粒的大小和纯度符合预期，线性化完全，不存在环状和超螺旋质粒结构，且没有发现DNA降解，可作为体外转录模板(图7)。
5.含人星状病毒1型目的片段的RNA的制备
5.1RNA的体外转录
用Promega公司的Ribo MAXTM Large Scale RNA Production system-T7试剂盒(货号：P1300)进行体外转录(按试剂盒操作说明书进行)。体外转录制得的cRNA用RNeasyMiniElute Cleanup kit(购自QIAGEN公司，货号74204)进行纯化，具体操作按照试剂盒说明进行。
5.2体外转录RNA的鉴定
5.2.1荧光PCR鉴定
体外转录RNA不经逆转录过程，直接进行荧光PCR扩增，鉴定是否有残留的DNA分子；同时将RNA进行逆转录后再行荧光PCR检测，鉴定转录RNA是否包含了病毒的特异性序列。体外转录的cRNA未经反转录直接进行荧光PCR扩增检测，结果均未出现扩增信号，说明转录cRNA中不含DNA。进一步将RNA反转录后经荧光PCR检测，结果均出现特异性扩增曲线，证明转录的cRNA包含有病毒的特异性序列(图8)。
5.2.2紫外分光光度法纯度鉴定
紫外分光光度仪测定体外转录的RNA在260nm和280nm处的吸光值，计算A260和A280的比值。紫外分光光度法测吸光度值260/A280＝2.04，表明体外转录产物RNA纯度较高。
5.2.3RNA序列测定
将体外转录的RNA送往宝生物工程(大连)有限公司进行RNA测序鉴定。星状病毒核酸标准物质候选物是由体外转录获的人工合成的RNA制备的，应该含有人星状病毒1型目的片段。根据图5所示的重组质粒的结构，由于T7转录子的序列为：TAATACGACTCACTATA(GGG)，转录是从(GGG)中的第一个G开始的，因此，体外转录RNA片段序列中除了人星状病毒1型检测目的序列外，还含有在目的序列上游的T7启动子部分序列和目的基因下游从EcoRV酶切位点到BamHI酶切位点的序列。体外转录生成的RNA测序结果如SEQ ID No.1所示：(GGGCGAAUUGGGCCCUCUAGAUGCAUGCUCGAGCGGCCGCCAGUGUGAUGGAU AUCUGCAGAAUUCCAGCACACUGGCGGCCGUUACUAGUG)，为一段165bp的RNA片段，其中方框中为人星状病毒1型核酸检测目的片段，将该目的片段测序结果与GenBank中人星状病毒1型的基因序列进行同源性分析，同源性可达100％，与重组质粒pcDNAII-Ast测序结果中插入的目的片段一致，说明制备的RNA中含有序列如SEQ ID No.5所示的对应的人星状病毒1型的目的片段。
5.2.4 0.7％-2.0％非变性琼脂糖凝胶电泳鉴定
一方面辅助分析RNA的纯度，另一方面根据RNA片段的大小鉴定转录RNA的完整性。电泳结果发现在100bp-200bp处出现特异性条带，与测序得出的RNA序列大小相符，且无其他非特异性转录产物出现(图9)。
通过以上方案制备的人星状病毒1型核酸检测标准物质候选物无生物感染性，避免了生物安全的问题，保证满足病毒核酸检测时的质控和定量需求。
实施例3RT-ddPCR方法的建立
RT-ddPCR方法主要用于人星状病毒核酸检测标准物质制备过程中的均匀性、稳定性和定值研究。RT-ddPCR的最佳检测范围是20-2000拷贝/μL，采用天平称重法，将RNA标准物质进行梯度稀释，参考One-Step RT-ddPCR Kit for Probes试剂盒方法，对上述制备的标准物质进行RT-ddPCR检测，所采用的引物探针同见表1，参考试剂盒方法，具体操作方法如下：
1.PCR反应体系
2×one-step RT-ddPCR supermix 10μL，25mM manganese acetate solution0.8μL，正向引物和反向引物(如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示)各1.0-1.8μL，荧光探针(如SEQ ID No.4所示)0.5μL，RNA模板2.0μL，DEPC水补齐至20μL。引物探针序列见表1。
2.微滴生成
将20μL的RT-ddPCR反应体系和65μL微滴生成油分别加入到8孔微滴生成卡中，置于微滴生成仪(QX200,Bio-Rad,Pleasanton,CA)中生成微滴。
3.PCR反应
将生成的油包水的微滴(40μL)缓慢转移至96孔板中，铝箔热封膜封膜后置于普通PCR仪上进行扩增反应，反应参数：60℃30min；95℃5min；94℃30s，Tm 60s，40个循环；98℃10min；4℃Hold。升降温速度≤2.5℃/秒。4.结果判定
PCR反应结束后，QX100/200droplet reader检测后，得到20μL反应体系中RNA的拷贝浓度值，样品中的RNA拷贝浓度为：样品RNA浓度(拷贝/μL)＝20μL反应体系中RNA的拷贝浓度(拷贝/μL)×20μL÷2μL(RNA模板加样量)×稀释倍数。
实施例4人星状病毒1型核酸检测标准物质的制备
1.人星状病毒1型核酸检测标准物质候选物的稀释、均匀性初检与分装
应用不含RNase的DEPC处理水将制备的人星状病毒1型核酸检测标准物质候选物稀释到10-4，其紫外分光光度法测吸光度值A260/A280＝2.04，表明制备的人星状病毒1型核酸检测标准物质候选物RNA纯度较高。为了检验人星状病毒1型核酸检测标准物质候选物稀释溶液内RNA分子的分布是否均匀，通过对尖底离心管中部表层、中层、底层三个不同取样点吸取30μL RNA溶液，采用荧光RT-PCR方法进行检测，每个采样点重复检测5次，采用单因素方差分析方法比较不同采样点的检测Ct值。均匀性初检显示，稀释后的人星状病毒1型核酸检测标准物质候选物RNA分子分布均匀(表2)。稀释后的人星状病毒1型核酸检测标准物质候选物分装入无菌无酶的1.2mL有密封圈的螺口冻存管(Corning)，每支0.1mL，共制备200个包装单元。
表2人星状病毒1型核酸检测标准物质候选物均匀性初检结果
2.人星状病毒1型核酸检测标准物质的均匀性研究
2.1标准物质抽取单元数和取样方式
从200个标准物质样品单元内抽取16个单元，用于均匀性检验。取样方式为分层随机抽样，具体为：按照分装的初始、中前期、中后期和终结阶段，将200个单元平均分为4层，每层50个单元，对每层内单元按1～50分别进行编码，采用随机数表决定每层抽取样品的号码，每层随机抽取4个单元。
2.2均匀性研究检测方法
采用实施例1中RT-ddPCR方法进行均匀性检验，每支样品重复检测3次。
2.3均匀性检验评估统计模式
得到检测数据后，首先进行甁间趋势检验，甁间趋势不显著时，分别计算甁间均匀性与瓶内均匀性，采用单因素方差分析方法进行统计分析，计算均匀性引入的不确定度
2.4均匀性检验数据结果判断
人星状病毒1型核酸检测标准物质的均匀性研究结果见图10和表3，表3列出人星状病毒1型核酸检测标准物质的均匀性分析数据。
表3人星状病毒1型核酸检测标准物质的均匀性检验分析数据(×106拷贝/μL)
表中数据计算可得：
组间差方和
组内方差和
v1＝m-1＝15
v2＝N-m＝32
组间标准偏差
组内标准偏差
计算统计量F
根据自由度(15，32)及给定的显著性水平0.05，由F分布临界值表查得Fα，与计算得到的F值比较得F＜Fα，认为组间和组内标准偏差之间无明显差异，且说明组内测量偏差小于组间测量偏差，微滴式数字RT-PCR方法的重复性比较理想。
各组数据间标准偏差：
各ni均相同，均匀性研究中，sl即为标准物质的均匀性引入的偏差sbb，则公式可简化为：
故均匀性引入的不确定度ubb为：
ubb＝sbb＝0.18(×106拷贝/μL)
均匀性引入的相对不确定度ubb(rel)为：
3.人星状病毒1型核酸检测标准物质的稳定性研究
3.1短期稳定性和长期稳定性研究方案
短期稳定性研究方案：采用40℃、室温(RT，20～25℃)、4℃和-20℃，考察星状病毒核酸标准物质在不同运输条件下运输过程的稳定性；长期稳定性稳定的研究方案：将样品保存在-80℃温度下连续考察至少6个月，具体方案见表4。
表4人星状病毒1型核酸检测标准物质的稳定性研究方案
3.2稳定性研究检测方法的选择
采用RT-ddPCR方法进行稳定性性考察，每个考察时间点随机抽取3个标
3.3稳定性评估数据结果判断
3.3.1短期稳定性研究结果
采用方差分析方法对短期稳定性考察数据进行统计检验，分析人星状病毒1型核酸检测标准物质在不同保存条件下的稳定性，确定最长运输期限和运输条件。结果表明该标准物质在40℃环境中迅速降解，室温下仅稳定保存3d，4℃能稳定保存14d，-20℃可稳定保存28d(表5)。
表5人星状病毒1型核酸检测标准物质的短期稳定性
*：室温是指温度在(20～25)℃之间；#：与第0天的测量值相比，p＜0.05
3.3.2长期稳定性研究结果
长期稳定性研究结果见图11，采用线性模型进行趋势性检验，观测长期稳定性数据是否有显著变化趋势，确定标准物质在给定保存时间内的稳定性，计算稳定性引入的不确定度。表6中给出了人星状病毒1型核酸检测标准物质的稳定性数据。
表6人星状病毒1型核酸检测标准物质长期稳定性考察结果
长期稳定性的评价是通过在不同时间测定标准物质的特性值，在潜在动力学机理未知的情况下，通常采用(经典)线性模型，Y＝b0+b1X来描绘出特性量值与时间的关系，式中：b0，b1为回归系数，X为时间，Y为标准物质的特征值。
由表6稳定性检测测量数据拟合线性方程的斜率为：
式中：
拟合线性方程的截距为：
直线之中的点的标准偏差：
斜率的标准偏差为：
在自由度为n-2＝5，置信水平p＝0.95(95％的显著水平)下，检验斜率与0相比是否有显著性差异，t–检验的临界值为2.571，因为
|b1|＜t0.95,5×s(b1)＝2.571×0.012＝0.031
所以斜率不显著，因此没有观察到不稳定性。此时，标准物质的有效期为6个月，不稳定性引入的不确定度分量为us＝s(b1)×X＝0.012×6＝0.072(×106拷贝/μL)
不稳定性引入的相对不确定度us(rel)为
4.人星状病毒1型核酸检测标准物质的联合定值方案
采用RT-ddPCR进行多家实验室合作定值的模式对制备的人星状病毒1型核酸检测标准物质进行定值，以含有人星状病毒1型目的片段RNA的拷贝浓度，即每μL溶液中所含的RNA拷贝数作为标准值。
4.1联合定值方案
选取具有一定技术权威性的具备进行数字PCR检测的9家独立实验室进行协作定值研究，向每家独立实验室随机发放四种RM，每种各3份平行包装单元，同时发放特异性引物/探针(见表1)、及标准化操作程序(Standard Operating Procedure，SOP)及结果报告范本。各联合定值实验室在开始检测之前，被要求将收到的RM样品保存于-80℃或液氮中，引物/探针保存于-20℃。4.2SOP概述
采用天平称重法对人星状病毒1型核酸检测标准物质进行10倍梯度稀释，在18μLPCR反应体系中加入2.0μL稀释后的RNA模板，再将含有RNA模板的20μL PCR反应体系转入微滴生成卡内，将微滴生成卡在QX100/200微滴发生器内生成近20000个微滴，用移液器将微滴转到96孔板内，在普通PCR仪上进行逆转录PCR反应。PCR反应结束后，使用QX100/200分析仪微滴逐个检测每个微滴是否有荧光信号，得到20μL反应体系中RNA的拷贝浓度值，样品中的RNA拷贝浓度为：标准物质样品RNA浓度(拷贝/μL)＝20μL反应体系中RNA的拷贝浓度(拷贝/μL)×20μL÷2μL(RNA模板加样量)×稀释倍数。报告检测结果，并对所用检测方法进行概括性描述。
4.3联合定值实验室检测数据的收集与技术分析
共有9家独立实验室参加人星状病毒1型核酸检测标准物质的联合定值研究。9家实验室按1#～9#的顺序，依次编号。
收到9家实验室的结果报告后，首先对测量结果和所用检测方法的概括性描述按以下几个方面进行技术分析：
(1)各联合定值实验室在开始检测之前，是否将收到的RM样品保存于-80℃或液氮中，引物/探针保存在-20℃中；
(2)各RM样品是否采用天平称重法进行梯度稀释；
(3)加入RT-ddPCR反应体系中是否为2μL稀释后的RM样品；
(4)检测数据是否报告为拷贝浓度的形式，即每μL溶液的RNA拷贝数；
(5)是否存在数据换算错误。
经过技术分析，9家实验室中，5#实验对的检测值明显偏离其他实验室的检测值，故剔除这组数据，各数据合格实验室的检测结果平均值和标准偏差见表7。
表7多家实验室联合定值结果
4.3.1有无界外值判定
用Dixon检验判断RM的各组检测数据有无界外值。
4.3.1.1方法
将各实验室定值平均值按从小到大排列：x(1)≤x(2)≤…≤x(n-1)≤x(n)，分别计算和值。f(α,n)为临界值，与显著性水平α和测量次数n有关。若r1>f(α,n)，x(1)为异常值，若rn>r1，且rn>f(α,n)，则x(n)为异常值；若r1和rn均小于f(α,n)，则保留所有数据。
4.3.1.2结果
统计检验结果显示：r1＝0.661，rn＝0.127，均小于f(α，n)＝0.717，检验判定无界外值。
4.3.2正态分布检验
采用偏态系数和峰态系数检验定值结果数据的正态性。
4.3.2.1方法
定值测量数据按从小到大排列，记为x1，x2，…，xn(x1≤x2≤…，≤xn)， 计算则偏态系数用于检测数据的不对称性，峰态系数B＝m4/(m2)3，用于峰态检验。
4.3.2.2结果
根据置信水平p＝0.95和检测次数n，该标准物质的A值为0.369，小于临界值A1＝0.46，B值为2.810，落入临界区间B1-B1′(2.27-3.87)中，该标准物质的定值数据服从正态分布。
4.3.3数据等精度判断
采用科克论法检验各实验室平均值间是否等精度。
4.3.3.1方法
其中为m个实验室测量值标准偏差中的最大值，为m家实验室中第i家实验室的测量值的标准偏差。
4.3.3.2结果
人星状病毒1型核酸检测标准物质的C值为0.1841根据显著性水平α＝0.05，实验室组数m＝8，多数实验室重复测量次数n＝9，得临界值C(0.05,8,9)＝0.2926；可见该标准物质定值结果的C值小于临界值C，可以认为各实验室的定值结果的平均值是等精度的。
4.4人星状病毒1型核酸检测标准物质的标准值确定
星状病毒1型核酸检测标准物质的定值结果见图12，综合技术分析判断剔除异常值与界外值判定、正态分布检验和等精度检验，该标准物质定值检测数据均服从正态分布，且各实验室定值结果的平均值是等精度的，故采用各实验室定值结果的平均值的总平均值作为该标准物质的标准值，即(×106拷贝/μL)，其中为总平均值，即标准物质的标准值，为第i家实验室定值结果的平均值，m为参加标准物质定值研究的实验室个数，将各实验室数据标准偏差的平方和除以实验室个数，开方得到总平均值的标准偏差，即为标准值的不确定度A类分量uA，即：
实施例5人星状病毒1型核酸检测标准物质的不确定度评估及其特性值的确定
人星状病毒1型核酸检测标准物质的不确定度来源包括三个方面：不均匀性引入的不确定度(ubb)、不稳定性引入的不确定度(us)和定值引入的不确定度(uchar)。标准物质的定值结果应该有两个方面的含义：(1)被测特性量值的最佳估计值，即标准物质的标准值y；(2)标准值的不确定度UCRM。因此该标准物质的定值结果可表示为y±UCRM。
1.评估方法
扩展不确定度UCRM是不确定度分量合成标准不确定度后，根据置信概率，选择相应的扩展因子，采用公式UCRM＝k×UCRM计算而来的。UCRM为合成标准不确定度，Uchar是标准物质定值过程引入的不确定度，由A类分量uA和B类分量uB两部分组成，ubb为标准物质的均匀性引入的不确定度，us为标准物质的稳定性引入的不确定度。正态分布式，包含因子k可根据置信水平从t分布分位数中查得。
2.不确定度评估结果
各不确定度分量见表8。
2.1均匀性引入的不确定度
见实施例4人星状病毒1型核酸检测标准物质的制备中2.4均匀性检验数据结果判断。均匀性引入的不确定度ubb为：
ubb＝sbb＝0.18(×106拷贝/μL)
相对不确定度为：
2.2稳定性引入的不确定度
见实施例4人星状病毒1型核酸检测标准物质的制备中3.3.2长期稳定性研究结果。稳定性引入的不确定度分量为：
us＝s(b1)×X＝0.0125×6＝0.072(×106拷贝/μL)
相对不确定为：
2.3定值引入的不确定度
定值的不确定度(uchar)主要由多家实验室联合定值结果的A类不确定度(uA)和定值方法的B类不确定度(uB)组成。由于采用的是多家独立实验室联合定值模式，测量过程中B类分量被随机体现在定值结果中，故不再进行B类不确定度评定。定值引入的不确定度为：
相对不确定度为：
2.4扩展不确定度
合成各不确定度分量，得到合成标准不确定度，取扩展因子k＝2，计算得到各RM的扩展不确定度。扩展不确定度一般最多给出两位有效数字，标准值y的位数要与不确定度的小数点后位数对齐，由此定出人星状病毒1型核酸检测标准物质的标准值保留的小数点后位数。
表8人星状病毒1型核酸检测标准物质的不确定度(×106拷贝/μL)
2.5人星状病毒1型核酸检测标准物质的特性值
根据标准值及其不确定度，确定人星状病毒1型核酸检测标准物质的特性值为：5.52±0.88(×106拷贝/μL)。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
序列表
<110> 北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120> 一种人星状病毒1型核酸检测标准物质及其制备方法和应用
<130> JLC17I0608E
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 165
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gggcgaauug ggcccucuag augcaugcuc gagcggccgc cagugugaug gaugucaauu 60
caagaagcag agcuaggaga cagcccggac gcgacaaacg ucaaucuucu caacgugucc 120
guaacaaucu gcagaauucc agcacacugg cggccguuac uagug 165
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtcaattcaa gaagcagagc tagga 25
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgttacggac acgttgagaa gatt 24
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cagcccggac gcgacaaacg 20
<210> 5
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtcaattcaa gaagcagagc taggagacag cccggacgcg acaaacgtca atcttctcaa 60
cgtgtccgta aca 73
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
taatacgact cactataggg 20

Claims (9)

1.一种人星状病毒1型核酸检测标准物质，其特征在于，所述标准物质的RNA序列如SEQID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的人星状病毒1型核酸检测标准物质，其特征在于，所述标准物质的特性值为(5.52±0.88)×106拷贝/μL。
3.一种如权利要求1或2所述的人星状病毒1型核酸检测标准物质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)筛选人星状病毒1型阳性样品，提取病毒RNA，逆转录后，扩增出如SEQ ID No.5所示的DNA片段；
2)将步骤1)中所述DNA片段与质粒载体连接构建重组质粒；
3)将步骤2)获得的重组质粒转化到感受态细胞内，增殖，提取重组质粒；
4)采用限制性内切酶对步骤3)提取得到的重组质粒进行单酶切，得到线性化重组质粒；
5)以线性化重组质粒为模板，体外转录合成获得人星状病毒1型核酸检测标准物质候选物，稀释，经均匀性、稳定性检测后，进行定值和不确定度评估，即可。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中扩增出如SEQ ID No.5所示的DNA片段所用的引物如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述限制性内切酶为HamHⅠ限制性内切酶。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤5)中所述体外转录的启动子为T7启动子，其序列为SEQ ID No.6所示，转录是从序列最后三个G中的第一个G开始。
7.一种如权利要求1或2所述的人星状病毒1型核酸检测标准物质在人星状病毒1型核酸检测中作为标准物质的应用。
8.一种包含权利要求1或2所述的人星状病毒1型核酸检测标准物质的试剂盒。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于检测人星状病毒1型核酸的RT-ddPCR引物和探针组合，所述RT-ddPCR引物和探针组合包含如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的引物和如SEQ ID No.4所示的探针；优选的，所述探针5’端标记FAM，3’端标记BHQ。
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