CN101903520B

CN101903520B - 核酸扩增方法以及在该方法中使用的试剂和试剂套件

Info

Publication number: CN101903520B
Application number: CN2008801221502A
Authority: CN
Inventors: 米川俊广; 纳富继宣; 神田秀俊; 保坂宪光
Original assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Current assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Priority date: 2007-10-19
Filing date: 2008-10-17
Publication date: 2013-11-13
Anticipated expiration: 2028-10-17
Also published as: JPWO2009051214A1; CN101903520A; WO2009051214A1; JP2013135696A; ES2433667T3; US8557523B2; EP2218780B1; US20100233715A1; EP2218780A1; US20140308663A1; JP5313157B2; EP2218780A4; HK1146086A1

Abstract

本发明的课题在于提供一种在使用内标物的核酸检测系统中，能够在确保对靶核酸的精确测定值的同时稳定地对内标物进行扩增的方法，以及在该方法中使用的试剂套件。本发明涉及使用内标物的样品中靶核酸的扩增方法，和在该方法中使用的试剂以及试剂套件，在所述方法中，通过提前于靶核酸扩增而使内标物进行扩增，来防止内标物的扩增产物对靶核酸的扩增反应产生影响。

Description

核酸扩增方法以及在该方法中使用的试剂和试剂套件

技术领域

本发明涉及样品中核酸的扩增方法和在该方法中使用的试剂。更具体而言，本发明涉及使用内标物的扩增方法。

背景技术

作为能够检测样品中的微量核酸的方法，多种核酸扩增方法得到了开发。在此之中能够在等温条件下高效率地进行扩增的方法(LAMP法等)，作为使用没有温度控制功能的低成本装置就能够简易而迅速地进行检测的技术，在广范围的检测现场中得到应用。

本发明人等报导了不使用内标物的LAMP法的检测系统，能够对于在10³～10⁹拷贝/测试的浓度范围的核酸进行定量(非专利文献1)。但是因为该方法中不使用内标物，所以得到的结果是靶核酸的相对量。

一方面，在LAMP法中使用内标物的定量法得到了报导(非专利文献2)。这个方法是使用与靶核酸具有类似序列的内标物，将靶核酸和内标物同时进行扩增的方法。该方法能够进行定量的浓度范围窄，为10⁴～10⁸拷贝/测试，因此为了对广泛浓度范围的核酸进行测定，需要将样品稀释进行多次测定。

非专利文献1：Y.Mori，et al.，Journal of Biochemical and BiophysicalMethods，59，145-157，2004

非专利文献2：H.Tani，et al.，Analytical Chemistry，79(15)，5608-5613，2007

发明内容

在使用内标物的检测系统中，因内标物的扩增产物影响靶核酸的扩增反应而无法精确地测定靶核酸，这是在扩增效率高的等温核酸扩增方法中存在的共性问题。本发明的课题是提供解决了所述问题的、在能够确保对靶核酸的精确测定值的同时对内标物稳定进行扩增的方法，以及在该方法中使用的试剂。

本发明人等为了解决所述课题进行了深入探讨的结果，发现了不在相同时期进行内标物和靶核酸的扩增反应，也就是说，提前或滞后于靶核酸扩增反应而进行内标物的扩增反应，能够防止内标物的扩增产物对靶核酸扩增反应的影响，从而完成了本发明。

也就是说，本发明提供了以下的(1)～(9)。

(1)一种核酸扩增方法，其特征在于使内标物提前于靶核酸进行扩增。

(2)所述(1)所记载的核酸扩增方法，其特征在于包括以下工序：

(a)向含有靶核酸的样品中添加溶液的工序，该溶液中含有已知浓度或拷贝数的内标物，

(b)使用扩增反应液进行扩增反应的工序，该扩增反应液含有用于扩增内标物的寡核苷酸引物(以下称为“内标引物”)和用于扩增靶核酸的寡核苷酸引物(以下称为“靶核酸引物”)，所述内标引物能够在一定条件下，使所述内标物在早于靶核酸扩增的时期进行扩增，

(c)通过能够分辨所述内标物的扩增反应和所述靶核酸的扩增反应的方法，进行测定的工序。

(3)所述(1)或(2)所记载的核酸扩增方法，其特征在于进行靶核酸的定量。

(4)所述(1)所记载的核酸扩增方法，其特征在于包括以下工序：

(c)通过能够分辨所述内标物的扩增反应和所述靶核酸的扩增反应的方法，进行实时测定，根据其结果和内标物的添加量，计算样品中的初始靶核酸浓度或拷贝数的工序。

(5)所述(1)至(4)中任意一项所记载的核酸扩增方法，其特征在于内标物至少在引物设计区域内具有与靶核酸不同的碱基序列。

(6)所述(5)所记载的核酸扩增方法，其特征在于内标引物设计为在一定条件下与内标物进行特异性杂交而不与靶核酸杂交；并且，靶核酸引物设计为在所述一定条件下与靶核酸进行特异性杂交而不与内标物杂交。

(7)所述(5)或(6)所记载的核酸扩增方法，其特征在于扩增反应使用LAMP法。

(8)一种测试试剂或试剂套件，其特征在于是用于实施根据(1)至(7)中任意一项所述的核酸扩增方法的。

(9)所述(8)所记载的测试试剂或试剂套件，其特征在于至少含有以下的试剂：

(a)至少在引物设计区域内具有与靶核酸不同的碱基序列，并且浓度或拷贝数已知的内标物，

(b)在一定条件下能够在早于靶核酸扩增的时期使内标物进行扩增的内标引物，

(c)靶核酸引物。

根据本发明，通过提前于靶核酸的反应而进行内标物的扩增反应，能够在确保对靶核酸的精确测定值的同时稳定地进行内标物的扩增。也就是说，在定性方法中，使得监测从各样品中的提取纯化效率和样品中的成分对扩增反应的影响成为可能。此外，在定量方法中，能够在7个数量级以上的广范围内对核酸的绝对量进行测定。

附图说明

图1是使用10¹至10⁷拷贝/测试的各浓度的靶核酸(NG质粒)和内标核酸(CT质粒)进行LAMP反应，对伴随靶核酸扩增的淬灭(Quenching)探针的荧光消光使用Mx3000P进行实时测定时的结果曲线图。

图2是使用了NG质粒的标准曲线图。

图3是使用10¹至10⁷拷贝/测试的各浓度的靶核酸(NG质粒)和内标核酸(CT质粒)进行LAMP反应，对伴随内标核酸扩增的淬灭探针的荧光消光使用Mx3000P进行实时测定时的结果曲线图。

图4是使用10¹至10⁸拷贝/测试的各浓度的靶核酸(HBV质粒)和内标核酸(Arita2质粒)进行LAMP反应，对伴随靶核酸扩增的淬灭探针的荧光消光使用Mx3000P进行实时测定时的结果曲线图。

图5是使用了HBV质粒的标准曲线图。

图6是使用10¹至10⁸拷贝/测试的各浓度的靶核酸(HBV质粒)和内标核酸(Arita2质粒)进行LAMP反应，对伴随内标核酸扩增的淬灭探针的荧光消光使用Mx3000P进行实时测定时的结果曲线图。

图7是显示当内标物的模板浓度为10²、10⁴、10⁶拷贝/测试时，靶核酸(HBV质粒)以及内标核酸(Arita2质粒)的扩增时间变化的曲线图。

图8是显示在内标引物浓度为×1和在低浓度引物(×0.25、×0.3、×0.5)条件下靶核酸(HBV质粒)和内标核酸(Arita2质粒)的扩增时间变化的曲线图。

图9是显示试剂成分A×1和高浓度试剂成分A×1.2时，靶核酸(HBV质粒)和内标核酸(Arita2质粒)的扩增时间变化的曲线图。

图10是显示使内标核酸(CT质粒；I.C.)和NG质粒的高浓度模板(NG_H)在同一反应液中进行扩增的曲线图。

图11是显示使内标核酸(CT质粒；I.C.)和NG质粒的低浓度模板(NG_L)在同一反应液中进行扩增的曲线图。

本说明书包括在本申请的优先权基础文件日本专利申请2007-271902号说明书中所记载的内容。

具体实施方式

本发明的核酸扩增方法，其特征在于使内标物提前或滞后于靶核酸而进行扩增。提前进行扩增，指的是比靶核酸模板的扩增开始更早地，使来源于内标物的扩增反应开始进行。因此，需要设计出在早的时期(提前)进行扩增的内标引物。内标引物，是指用于扩增内标物的寡核苷酸引物。一般来讲，用于设计在早的时期进行扩增的引物的、特殊的设计条件还没有被确立。因此，在使用专用软件等采用通常方法设计的引物中选择在早的时期进行扩增的引物，作为内标引物。

滞后进行扩增，指的是比靶核酸模板的扩增开始更晚地，使来源于内标物的扩增反应开始进行。因此，需要设计在晚的时期(滞后)进行扩增的内标引物。为此，在使用专用软件等采用常规方法设计的引物中选择在晚的时期进行扩增的引物，作为内标引物。

此外，在等温核酸扩增方法中，一般来讲存在随着靶核酸浓度的升高扩增时期变早的倾向。因此，为了使内标物在早的时期进行扩增，需要使内标物为高浓度。另一方面，为了使内标物在晚的时期进行扩增，需要使内标物为低浓度。

也就是说，在本发明中为了使内标物在早的时期(提前)进行扩增，和与靶核酸同时扩增而进行测定时的扩增反应液相比，将内标物浓度设定得高，优选设定为10倍以上，进一步优选设定为100倍以上。另一方面，为了使内标物在晚的时期(滞后)进行扩增，和与靶核酸同时扩增而进行测定时的扩增反应液相比，将内标物浓度设定得低，优选设定为0.1倍以下，进一步优选设定为0.01倍以下。

在本发明中使用的内标物，只要是至少在引物设计区域内与靶核酸具有不同碱基序列的核酸即可，没有特殊限制。作为这样的核酸，可以列举天然来源的核酸，以及部分地或完全由人工合成的核酸等。

通过使本发明的内标引物浓度低于通常情况(单一核酸的检测系统)，能够抑制内标物扩增产物量而提高靶核酸的检测精度。此外，通过使核酸合成的底物核苷酸浓度高于通常情况，在内标物的扩增反应中消耗的底物得以补偿，靶核酸的扩增滞后得以消除，从而能够更加高灵敏度地、在更短时间内进行检测。

也就是说，在本发明中，为了使内标物在早的时期(提前)进行扩增，与使内标物与靶核酸同时扩增而进行测定时的扩增反应液相比，内标引物浓度设定得低，优选设定为不到1倍，进一步优选设定为0.5倍以下。通过这样能够控制内标物的扩增产物量，提高靶核酸的测定精度。

此外，在本发明中，为了使内标物在早的时期(提前)进行扩增，和不使用内标物而使相同的靶核酸扩增来进行测定时的扩增反应液相比，核酸合成的底物核苷酸浓度设定得高，优选设定为超过1倍，进一步优选设定为1.1倍以上。通过这样能够使在内标物的扩增反应中消耗的底物得以补偿，靶核酸的扩增滞后得以消除，从而能够更加高灵敏度地、在更短时间内进行检测。

本领域技术人员可以对以上记载的反应试剂成分的条件进行适当调节，使内标物得以提前扩增。

此外，本发明的内标引物设计为在严格条件下与内标物进行特异性杂交而与靶核酸不发生杂交；并且，靶核酸引物设计为在与所述相同的严格条件下与靶核酸进行特异性杂交而与内标物不发生杂交。

严格条件，指的是形成特异性杂交体而不形成非特异性杂交体的条件，也就是与各核酸具有高度同源性(同源性为80％以上，优选为90％以上，进一步优选为95％以上)的寡核苷酸发生杂交的条件。更加具体地说，这样的条件可以举例为：在0.5～1M的NaCl存在下42～68℃、或在50％甲酰胺存在下42℃、或在水溶液中65～68℃进行杂交后，使用0.1～2倍浓度的SSC溶液在室温～68℃条件下进行清洗的条件。

在一个实施方式中，本发明的核酸扩增方法包括以下工序：

(b)使用扩增反应液进行扩增反应的工序，该扩增反应液含有用于使内标物扩增的寡核苷酸引物和用于使靶核酸扩增的寡核苷酸引物，所述用于使内标物扩增的寡核苷酸引物能够在早于靶核酸扩增的时期(提前)使所述内标物进行扩增，

在另一实施方式中，本发明的核酸扩增方法包括以下工序：

在本发明中所用的样品，只要是有可能含有核酸的样品即可，没有特殊限制。作为样品，可以举例为来源于人类或其它动物的活体或来源于植物、食品、环境的待测样品，含有部分或完全由人工合成的核酸的样品，以及它们的培养液等。这些样品可以进行分离、提取、浓缩、纯化等预处理。

本发明中的靶核酸，指的是用于扩增的需要检测的核酸；靶序列指的是靶核酸上的作为靶的碱基序列。靶核酸只要是用于扩增的任意核酸即可，没有特殊限制。动植物的各种基因、各种病毒的基因、细菌、霉菌、酵母等的各种微生物基因等，无论DNA或RNA均可以作为靶核酸。靶核酸可以是天然的，也可以是人工合成的，也包括PNA等。此外，靶核酸包括单链核酸和双链核酸这二者。本发明中的模板核酸指本来的检测对象，其分子中含有靶序列，是引物设计的基础。

通过在进行分离、提取、浓缩、纯化等预处理之前在样品中添加内标物，并在预处理之后实施本发明的方法来进行靶核酸的检测，能够监测预处理法的效率。此外，在预处理后的样品中添加内标物而进行靶核酸的定性检测时，可以查出样品中的成分对于扩增反应的影响，从而能够分辨假阴性。此外，使用各种已知浓度的靶核酸实施本发明的方法来预先绘制标准曲线，再将未知的待测样品的测定结果与该标准曲线相比较，能够对未知的待测样品中的靶核酸进行定量。

本发明中检测核酸的方法，只要能够分辨内标物和靶核酸的扩增反应即可，没有特殊限制。例如，可以采用使用荧光标记探针、放射性标记探针等的方法。

本发明中的核酸扩增方法，只要是扩增效率高的等温核酸扩增方法即可，没有特殊限制，例如适合采用使用具有X1c+X2结构的引物的扩增方法或LAMP(Loop-mediated isothermal amplification，环介导等温扩增)法。

对使用具有X1c+X2结构的引物的扩增方法说明如下。具有X1c+X2结构的引物，具体来讲是如下设计的。

(a)当从模板核酸链上的靶序列的3’侧起向着该模板核酸链上的3′末端方向，依次选择了第1任意序列F1c和第2任意序列F2c时，按照从5’侧到3’侧的顺序，含有与该F1c相同的序列和与该F2c互补的序列F2的引物；

(b)当从模板核酸链上的靶序列的5’侧起向着该模板核酸链上的5′末端方向，依次选择了第3任意序列R1和第4任意序列R2时，按照从5’侧到3’侧的顺序，含有与该R1互补的序列R1c和与该R2相同的序列R2的引物。

此外，所述引物(a)(b)可以成对使用，也可以将(a)(b)中的任意一个与通常的引物成对使用。

扩增反应可以使用链置换型DNA聚合酶作为聚合酶在等温条件下进行。因为引物具有X1c+X2的结构，始于该引物的延伸产物包括X1c+(X2+)X1，其中下划线部分为互补序列，进一步进行链内退火而在合成的双链核酸上生成单链部分。也就是说，即使不使双链在高温条件下发生解离，在延伸产物上也会有链内退火而形成的新的链置换反应起点。此反应的概况可以参考后述的LAMP法。

此外，作为所述的链置换型DNA聚合酶，例如可以举例为Bst DNA聚合酶、Bca(exo-)DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶I的克列诺片段(KlenowFragment)、Vent DNA聚合酶、Vent(Exo-)DNA聚合酶(从Vent DNA聚合酶除去核酸外切酶活性的产物)、DeepVent DNA聚合酶、DeepVent(Exo-)DNA聚合酶(从DeepVent DNA聚合酶除去核酸外切酶活性的产物)、Φ29噬菌体DNA聚合酶、MS-2噬菌体DNA聚合酶、Z-Taq DNA聚合酶(厂商：日本宝酒造)、KOD DNA聚合酶(厂商：日本东洋纺)等。

以下对LAMP法进行说明。所谓“LAMP法”是纳富等人开发的技术(Nucleic Acids Research，28(12)，e63，2000)，是通过使作为模板的核苷酸与自身的3′末端退火而作为互补链合成的起点的同时，使此时形成的环和与之退火的引物相组合，从而能在等温下进行互补链合成的核酸扩增方法。此外，在LAMP法中，引物的3′末端始终与来源于样品的区域退火，因此碱基序列的互补性结合的检查机制反复产生作用。其结果，能够使高特异性的基因序列的扩增反应成为可能。

在LAMP法中，作为引物至少要使用能够分辨模板核酸的碱基序列上的共计6个区域的碱基序列的，由寡核苷酸所构成的4种引物(内部引物F(以下称为FIP)、内部引物B(以下称为BIP)、外部引物F(以下称为F3)以及外部引物B(以下称为B3)，但伴随着扩增反应的进行，形成以自己为模板而具有成为合成起点的3′末端，并在其两端各具有环状结构的哑铃型核苷酸。并且，在进一步使用具有与该哑铃结构5′末端侧的环结构的单链部分的碱基序列的互补序列的引物(环引物F(以下称为LF)以及/或者环引物B(以下称为LB)时，核酸合成的起点增加，从而能够缩短反应时间和使检测灵敏度提高。

内部引物是LAMP法中所必需的引物，其是当在模板DNA的各链中，选定了存在于3’侧的任意序列X2c，和与其相比靠近5’侧的任意序列X1c的情况下，按照从3’侧到5’侧的顺序含有该X2c的互补序列X2和该X1c的相同序列X1c(具有X1c+X2结构)的引物。从功能上讲，内部引物上的X2是与模板发生特异性退火而提供互补链合成起点的部分，而X1c提供扩增(延伸)产物形成环所需的互补序列。于是，该环成为新的互补链的合成起点。

外部引物是具有与比内部引物位于更外侧(也就是模板的3’侧)的任意序列X3c互补的序列，能够与此退火的2种引物(与2条链各自互补的各1种)。

此外，为了使引物容易与模板核酸退火，所述X1(X1c)、X2(X2c)、X3(X3c)的长度优选为5～100个碱基，进一步优选为10～50个碱基。

所述内部引物和外部引物是2条链(F和R)分别需要的，因此分别设计两种内部引物(F1c+F2和R1c+R2)以及两种外部引物(F3和R3)。

优选对各任意序列进行选择，使得由LAMP法所得到的扩增产物不是优先进行分子间退火，而是优先进行分子内退火，从而在末端形成发夹结构。例如，为了优先在分子内退火，在选择任意序列时考虑F1c序列和F2c序列之间的距离以及R1序列和R1c序列之间的距离是很重要的。具体来讲，优选进行选择，使得两序列间隔0～500个碱基，进一步优选0～100个碱基，最优选10～70个碱基的距离存在。这里的数值是指分别不包括F1c序列和F2c序列本身以及R1序列和R2序列本身的碱基数。

此外，环引物指的是，当在LAMP法的扩增产物的同一链上生成的互补序列相互退火而形成环时，在其3′末端含有与该环内的序列互补的碱基序列的2种引物(与2条链各自互补的各1种)。所述外部引物和环引物在LAMP法中不是必须的引物，但有这些时能够使扩增(延伸)反应更加高效率地进行。

这一系列反应，优选在用于给予酶反应适合的pH值的缓冲剂、用于维持酶活性和退火所必须的盐类、酶的保护剂、如需要还可以在解链温度(Tm)的调整剂共存的条件下进行。缓冲剂可以使用Tris-HCl等具有从中性到弱碱性的缓冲作用的缓冲剂。pH根据使用的DNA聚合酶进行调整即可。可以适当添加例如KCl、NaCl、MgCl₂或(NH₄)₂SO₄等盐类，用于维持酶活性和调整DNA的解链温度(Tm)。酶的保护剂可以使用牛血清白蛋白(albumin)和糖类等。此外，解链温度(Tm)调整剂一般可以使用甜菜碱(betaine)、脯氨酸(proline)、二甲基亚砜或甲酰胺等。

LAMP法中的反应是通过对于模板核酸添加以下的成分(i)(ii)(iii)，并且在使得内部引物能够与模板核酸上的互补序列形成稳定的碱基对结合、且链置换型聚合酶能够维持酶活性的温度下进行温育而进行。温育温度为50～75℃，优选为55～70℃，温育时间为1分钟～10小时，优选为5分钟～4小时。

(i)2种内部引物，或进一步包括2种外部引物，或进一步包括2种环引物

(ii)链置换型聚合酶

(iii)底物核苷酸

从外部引物开始的核苷酸链合成，需要在从内部引物开始的核苷酸链合成之后开始。达到这个目的的方法，可以举例为将内部引物的浓度设定得高于外部引物的浓度等。具体来讲，可以通过将内部引物的浓度设定得比外部引物的浓度高2～50倍，优选设定为4～25倍来进行实施。

在实施本发明的方法时需要的各种试剂，可以预先包装而使其套件化。例如，可以将内标物、内标引物、靶核酸引物、作为核酸合成底物的4种dNTPs、DNA聚合酶、逆转录酶、缓冲液、盐类、保护剂、标记探针等必要试剂作为套件来供应。

具体来讲，本发明的测试试剂或试剂套件，至少包括以下试剂：

(b)能够在早于靶核酸扩增的时期使内标物进行扩增的，用于扩增内标物的寡核苷酸引物，

(c)用于扩增靶核酸的寡核苷酸引物。

本发明的测试试剂或试剂套件，可以进一步含有以下试剂：

(a)用于检测内标物的寡核苷酸探针，和

(b)用于检测靶核酸的寡核苷酸探针。

实施例

以下给出本发明的实施例，但本发明不局限于这些实施例。

实施例1.使用LAMP法进行淋菌(淋菌)的定量

(1)检测模板

作为内标物模板，制作了将沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)的隐蔽性质粒区域的一部分进行了亚克隆而得到的质粒DNA(以下称为CT质粒)。此外，作为靶核酸模板，制作了将淋菌mtrA区域的一部分进行了亚克隆而得到的质粒DNA(以下称为NG质粒)。

内标模板序列(CT质粒)：(序列号1)

CTCGAGAAGA TTTATCGTAC GCAAATATCA TCTTTGCGGTTGCGTGTCCT GTGACCTTCA 60

TTATGTCGGA GTCTGAGCAC CCTAGGCGTT TGTACTCCGTCACAGCGGTT GCTCGAAGCA 120

CGTGCGGGGT TATCTTAAAA GGGATTGCAG CTTGTAGTCCTGCTTGAGAG AACGTGCGGG 180

CGATTTGCCT TAACCCCACC ATTTTTCCGG AGCGAGTTACGAAGACAAAA CCTCTTCGTT 240

GACCGATGTA CTCTTGTAGA AAGTGCATAA ACTTCTGAGGATAAGTTATA ATAATCCTCT 300

TTTCTGTCTG ACGGTTCTTA AGCTGGGAGA AAGAAATGGTAGCTTGTTGG AAACAAATCT 360

GACTAATCTC CAAGCTTAAG ACTTCAGAGG AGCGTTTACCTCCTTGGAGC ATTGTCTGGG 420

CGATCAAC 428

(2)内标引物和淬灭探针的合成

将沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)的隐蔽性质粒区域作为靶，设计了与近缘菌没有交叉性的引物。引物的合成是委托Operon生物技术公司进行的。此外，淬灭探针的合成是委托J-Bio21公司进行的。

CT-FIP：(序列号2)

5′-CAAGCAGGACTACAAGCTGCAGCGTTTGTACTCCGTCAC-3′

CT-BIP：(序列号3)

5′-GCGGGCGATTTGCCTTAACTCGGTCAACGAAGAGGTT-3′

CT-F3：(序列号4)5′-ATGTCGGAGTCTGAGCAC-3′

CT-B3：(序列号5)5′-CCTCAGAAGTTTATGCACTTTC-3′

CT-LF：(序列号6)5′-AAGATAACCCCGCACGT-3′

CT-LB：(序列号7)5′-GGAGCGAGTTACGAAGACA-3′

CT-Pr(TAMRA标记)：(序列号8)

5′-ATAACCCCGCACGTGCTTCGAGCAACC-3′

(3)靶核酸引物和淬灭探针的合成

将淋菌的mtrA区域作为靶，设计了与近缘菌没有交叉性的引物。引物的合成是委托Operon生物技术公司进行的。此外，淬灭探针的合成，是委托J-Bio21公司进行的。

NG-FIP：(序列号9)

5′-CGTGGCTCAACACATGACCCAAGCGTCCGGTCGGCA-3′

NG-BIP：(序列号10)

5′-ACGGAGAAAGTTTACAACCGGACACAAAACAGGCTCATATCCAGC-3′

NG-F3：(序列号11)5′-GCGGTTATCTCTGCATCG-3′

NG-B3：(序列号12)5′-GGTGTCGTAGCGGAAAC-3′

NG-LF：(序列号13)5′-CGGGAAAAATACAATATCGCCC-3′

NG-LB：(序列号14)5′-CGACAAAACGGCACATTTATGG-3′

NG-Pr(BODIPY-FL标记)：(序列号15)

5′-CACATTTATGGTCAAACAGTG CGGCAAC-3′

(4)LAMP反应试剂的成分和浓度

调制LAMP最终反应溶液30μL，其中各试剂浓度如下。

·30mM Tris-HCl(pH8.8)

·15mM KCl

·15mM(NH₄)₂SO₄

·12mM MgSO₄

·0.15％ Tween20

·2.1mM dATP

·2.1mM dCTP

·2.1mM dGTP

·2.1mM dTTP

·38.4U Bst DNA聚合酶(New England Biolab公司)

·10⁷拷贝CT质粒

·内标引物

0.8μM CT-FIP(序列号2)和CT-BIP(序列号3)

0.1μM CT-F3(序列号4)和CT-B3(序列号5)

0.4μM CT-LF(序列号6)和CT-LB(序列号7)

·0.067μM内标探针CT-Pr(序列号8)

·靶核酸引物

0.8μM NG-FIP(序列号9)和NG-BIP(序列号10)

0.1μM NG-F3(序列号11)和NG-B3(序列号12)

0.4μM NG-LF(序列号13)和NG-LB(序列号14)

·0.067μM靶核酸探针NG-Pr(序列号15)

(5)检测和计算定量值

检测是使用淬灭探针(Quenching Probe)法进行的。使用Mx3000P(STRATAGENE公司)，对伴随内标物和靶核酸的扩增的荧光消光进行了实时测定。定量值是根据Tt值(荧光强度随扩增变化而达到特定数值的时间)依赖于初始模板量而进行计算的。

(6)靶核酸的定量评价

将NG质粒10¹至10⁷拷贝的稀释系列作为靶核酸，添加到所述LAMP反应试剂中。在63℃进行60分钟LAMP反应，使用淬灭探针法对荧光消光进行实时测定，绘制了标准曲线。

其结果，最低检测灵敏度为NG质粒10拷贝/测试(图1)，定量测定范围为10¹至10⁷拷贝/测试(标准曲线的相关系数为R＝0.9994)(图2)。NG质粒和CT质粒均具有良好的再现性(图1，3)，此外，NG质粒的10¹至10⁷拷贝/测试的所有的扩增均在60分钟以内结束。

实施例2.使用LAMP法进行HBV的定量

(1)检测模板

作为内标物模板，制作了将人工核酸进行了亚克隆而得到的质粒DNA(以下称为Arita2质粒)。此外，作为靶核酸模板，制作了将HBV S区域的一部分进行了亚克隆而得到的质粒DNA(以下称为HBV质粒)。

内标模板序列(Arita2质粒)：(序列号16)

ATTCGAAGGG TGATTGGATC GGAGATAGGA TGGGTCAATCGTAGGGACAA TCGAAGCCAG 60

AATGCAAGGG TCAATGGTAC GCAGAATGGA TGGCACTTAGCTAGCCAGTT AGGATCCGAC 120

TATCCAAGCG TGTATCGTAC GGTGTATGCT TCGGAGTAACGATCGCACTA AGCATGGCTC 180

AATCCTAGGC TGATAGGTTC GCACATAGCA TGCCACATACGATCCGTGAT TGCTAGCGTG 240

ATTCGTACCG AGAACTCACG CCTTATGACT GCCCTTATGTCACCGCTTAT GTCTCCCGAT 300

ATCACACCCG TTATCTCAGC CCTAATCTCT GCGGTTTAGTCTGGCCTTAA TCCATGCCTC 360

ATAGCTACCC TCATACCATC GCTCATACCT TCCGACATTGCATCCGTCAT TCCAACCCTG 420

ATTCCTACGG TCTAACCTAG CCTCTATCCT ACCCAGTTAGGTTGCCTCTT AGCATCCCTG 480

TTACGTACGC TCTTACCATG CGTCTTACCT TGGCACTATCGATGGGAGTA TGGTAGCGAG 540

TATGGAACGG ACTAACGTAG GCAGTAAGCT AGGGTGTAAGGTTGGGACTA AGGATGCCAG 600

(2)内标引物和淬灭探针的合成

将人工核酸Arita2作为靶设计了引物。引物的合成是委托Operon生物技术公司进行的。此外，淬灭探针的合成是委托J-Bio21公司进行的。

淬灭探针(QP)是日本独立行政法人产业技术综合研究所开发的荧光标记探针，其原理在于通过与靶序列进行杂交，靶序列中存在的鸟嘌呤使荧光消光(参考日本专利第3437816号，日本专利第3985959号)。

Arita2-FIP：(序列号17)

5′-CGCTTGGATAGTCGGATGCAAGGGTCAATGGTAC-3′

Arita2-BIP：(序列号18)

5′-ACGGTGTATGCTTCGGTGTGCGAACCTATCAGC-3′

Arita2-F3：(序列号19)5′-GGACAATCGAAGCCAGAA-3′

Arita2-B3：(序列号20)5′-ATCACGGATCGTATGTGG-3′

Arita2-LF：(序列号21)5′-GCTAGCTAAGTGCCATCC-3′

Arita2-LB：(序列号22)5′-AACGATCGCACTAAGCAT-3′

Arita2-Pr(TAMRA标记)：(序列号23)

5′-GCTAGCTAAGTGCCATCCATTCTGCGTACC-3′

(2)靶核酸引物和淬灭探针的合成

将HBV的S区域作为靶设计了引物。引物的合成，是委托Operon生物技术公司进行的。此外，淬灭探针的合成是委托J-Bio21公司进行的。

HBV-FIP：(序列号24)

5′-CCGCAGACACATCCAGCGATAAACCTCCAATCACTCACCAA-3′

HBV-BIP：(序列号25)

5′-CATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTCCTGGAATTAGAGGACA-3′

HBV-F3：(序列号26)5′-CAAAATTCGCAGTCCC-3′

HBV-B3：(序列号27)5′-GCAGGTCTTGCATGGTCC-3′

HBV-LF：(序列号28)5′-CAGCGATAGCCAGGACA-3′

HBV-LB：(序列号29)5′-TCTGGACTATCAAGGTATGTTGC-3′

HBV-Pr(BODIPY-FL标记)：(序列号30)

5′-GTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCC-3′

(4)LAMP反应试剂的成分和浓度

调制LAMP最终反应溶液30μL，其中各试剂浓度如下。

·25mM Tris-HCl(pH8.8)

·12.8mM KCl

·12.8mM (NH₄)₂SO₄

·9.7mM MgSO₄

·0.10％ Tween20

·1.79mM dATP

·1.79mM dCTP

·1.79mM dGTP

·1.79mM dTTP

·28.8U Bst DNA聚合酶(New England Biolab公司)

·10⁶拷贝Arita2质粒

·内标引物

0.4μM Arita2-FIP(序列号17)和Arita2-BIP(序列号18)

0.05μM Arita2-F3(序列号19)和Arita2-B3(序列号20)

0.4μM Arita2-LF(序列号21)和Arita2-LB(序列号22)

·0.067μM内标探针Arita2-Pr(序列号23)

·靶核酸引物

1.6μM HBV-FIP(序列号24)和HBV-BIP(序列号25)

0.2μM HBV-F3(序列号26)和HBV-B3(序列号27)

0.8μM HBV-LF(序列号28)和HBV-LB(序列号29)

·0.067μM靶核酸探针HBV-Pr(序列号30)

(5)检测和计算定量值

检测是使用淬灭探针法进行的。使用Mx3000P(STRATAGENE公司)，对伴随内标物和靶核酸的扩增的荧光消光进行了实时测定。定量值是根据Tt值依赖于初始模板量而进行计算的。

(6)靶核酸的定量评价

将HBV质粒10¹至10⁸拷贝的稀释系列作为靶核酸，添加到所述LAMP反应试剂中。在63℃进行60分钟LAMP反应，使用淬灭探针法对荧光消光进行实时测定，绘制了标准曲线。

其结果，最低检测灵敏度为HBV质粒10拷贝/测试(图4)，定量测定范围为10¹至10⁸拷贝/测试(标准曲线的相关系数为R＝0.9996)(图5)。HBV质粒和Arita2质粒均具有良好的再现性(图4，6)，此外，HBV质粒的10¹至10⁸拷贝/测试的所有的扩增均在60分钟以内结束。

实施例3.HBV检测中内标物浓度变化的影响

为了调查提前扩增所需要的内标物的浓度，对HBV检测中内标物(Arita2质粒)的模板量为每测试10²拷贝、10⁴拷贝、和10⁶拷贝时进行了研究。

(1)LAMP反应试剂的成分和浓度

内标物的模板量以外的反应试剂成分和浓度，与实施例2相同。

(2)HBV质粒模板量和检测

将每次测试的HBV质粒模板量设为10¹拷贝、10⁸拷贝这两种浓度，在63℃条件下进行了60分钟LAMP反应。使用Mx3000P(STRATAGENE公司)对各模板量时随着HBV质粒和内标物(Arita2质粒)扩增引起的荧光消光进行了实时检测，计算了Tt值。

(3)结果

将在(2)中求得的Tt值作为扩增时间，显示在表1和图7中。内标物为低浓度(10²拷贝/测试)时，高浓度(10⁸拷贝/测试)的HBV质粒模板提前于内标物进行扩增，受其影响内标物的扩增反应大幅度滞后。此外，HBV质粒模板的两个浓度间的内标物的扩增时间差很大，是5.67分钟。一方面，内标物为高浓度(10⁶拷贝)时内标物的扩增没有滞后，并且内标物的扩增时间与HBV质粒模板浓度无关，是基本一定的。也就是说，为了使内标物更早地，并且与靶核酸模板量无关地在一定时间内扩增，需要将内标物模板量设定得高，在本研究中选择10⁶拷贝/测试是适当的。

表1

内标物模板量变化时的靶核酸和内标物的扩增时间(分钟)

实施例4 HBV检测中内标引物浓度变化的影响

为了调查适合提前扩增的内标引物浓度，在HBV检测中将内标引物浓度设定为×1(在不使内标物提前扩增的体系中使用的浓度)、×0.25、×0.3、×0.5而进行了研究。

(1)LAMP反应试剂的成分和浓度

×1内标引物

1.3μM Arita2-FIP(序列号17)和Arita2-BIP(序列号18)

0.17μM Arita2-F3(序列号19)和Arita2-B3(序列号20)

1.3μM Arita2-LF(序列号21)和Arita2-LB(序列号22)

此外，内标引物量以外的反应试剂的成分和浓度与实施例2相同。

(2)HBV质粒模板量和检测

将HBV质粒模板量设定为每次测试10¹拷贝、10⁸拷贝这2种浓度，在63℃进行60分钟的LAMP反应。使用Mx3000P(STRATAGENE公司)对于各模板量中伴随着HBV质粒、内标物的扩增的荧光消光进行实时检测，计算了Tt值。

(3)结果

将在(2)中求得的Tt值作为扩增时间显示在表2和图8中。内标引物量多时(×1)，HBV质粒的扩增时间整体变慢，灵敏度附近的扩增时间滞后明显。此外，内标引物量过于低时(×0.25)，某些HBV质粒浓度时内标物的扩增时间发生背离，难于在一定时间内进行扩增。因此，在本研究中选择×0.3作为内标引物浓度是适当的。

表2

内标引物量变化时的靶核酸和内标物的扩增时间(分钟)

实施例5.HBV检测中反应试剂成分浓度的影响

为了调查适合内标物提前扩增的反应试剂成分浓度，在HBV检测中，改变含有底物核苷酸的反应试剂成分，对其影响进行了探讨。

(1)LAMP反应试剂的成分和浓度

调制了含有底物核苷酸的试剂成分A×1(在单一的靶核酸检测系统中通常使用的浓度)和其1.2倍浓度的试剂成分×1.2。

试剂成分A×1

LAMP最终反应溶液30μL中各试剂浓度如下。

25mM Tris-HCl(pH8.8)

10mM KCl

10mM (NH₄)₂SO₄

8mM MgSO₄

0.10％ Tween20

1.4mM dATP

1.4mM dCTP

1.4mM dGTP

1.4mM dTTP

28.8U Bst DNA聚合酶(New England Biolab公司)

此外，试剂成分A之外的内标物(Arita2质粒)、内标引物、内部标准探针、靶核酸引物、靶核酸探针以及这些物质的浓度与实施例2相同。

(3)HBV质粒模板量和检测

将HBV质粒模板量设定为每次测试10¹拷贝、10⁴拷贝、10⁸拷贝这3种浓度，在63℃进行60分钟的LAMP反应。使用Mx3000P(STRATAGENE公司)对于各模板量中伴随着HBV质粒、内标物的扩增的荧光消光进行实时检测，计算了Tt值。

(3)结果

将在(2)中求得的Tt值作为扩增时间显示在表3和图9中。在试剂成分A×1反应液中，高浓度的HBV质粒模板(10⁸拷贝/测试)优先于内标物进行扩增，而在×1.2反应液中，内标物的扩增在先，并且与HBV质粒模板的浓度无关，能够在一定时间内使内标物进行扩增。

因此，为了使内标物提前扩增，应将含有底物核苷酸的反应试剂成分浓度设得较高，在本探讨中研究×1.2是适当的。

表3

反应试剂成分量变化时的靶核酸和内标物的扩增时间(分钟)

实施例6.使用LAMP法进行淋菌的检测

(1)LAMP反应试剂成分和浓度

反应试剂成分和浓度与实施例1中相同。

(2)检测

以高浓度的NG质粒或低浓度的NG质粒作为靶核酸，在63℃下进行LAMP反应60分钟，使用淬灭探针法对于荧光消光进行了实时测定。

(3)结果

如图10，11所示，能够在同一反应系中进行内标物(CT质粒)和靶核酸(NG质粒)的扩增，与靶核酸的模板浓度无关，内标物的扩增时间是一定的。

本说明书中引用的所有的出版物、专利和专利申请，作为参考直接包括于本说明书中。

序列表

<110>荣研化学株式会社(Eiken Kagaku Kabushiki Kaisya)

<120>核酸扩增方法以及在该方法中使用的试剂和试剂套件

<130>PH-3716-PCT

<140>PCT/JP2008/068829

<141>2008-10-17

<150>JP 2007-271902

<151>2007-10-19

<160>30

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>428

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：合成的DNA

<400>1

ctcgagaaga tttatcgtac gcaaatatca tctttgcggt tgcgtgtcct gtgaccttca 60

ttatgtcgga gtctgagcac cctaggcgtt tgtactccgt cacagcggtt gctcgaagca 120

cgtgcggggt tatcttaaaa gggattgcag cttgtagtcc tgcttgagag aacgtgcggg 180

cgatttgcct taaccccacc atttttccgg agcgagttac gaagacaaaa cctcttcgtt 240

gaccgatgta ctcttgtaga aagtgcataa acttctgagg ataagttata ataatcctct 300

tttctgtctg acggttctta agctgggaga aagaaatggt agcttgttgg aaacaaatct 360

gactaatctc caagcttaag acttcagagg agcgtttacc tccttggagc attgtctggg 420

cgatcaac 428

<210>2

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：合成的DNA

<400>2

caagcaggac tacaagctgc agcgtttgta ctccgtcac 39

<210>3

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：合成的DNA

<400>3

gcgggcgatt tgccttaact cggtcaacga agaggtt 37

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：合成的DNA

<400>4

atgtcggagt ctgagcac 18

<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：合成的DNA

<400>5

cctcagaagt ttatgcactt tc 22

<210>6

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：合成的DNA

<400>6

aagataaccc cgcacgt 17

<210>7

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：合成的DNA

<400>7

ggagcgagtt acgaagaca 19

<210>8

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：合成的DNA

<400>8

ataaccccgc acgtgcttcg agcaacc 27

<210>9

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：合成的DNA

<400>9

cgtggctcaa cacatgaccc aagcgtccgg tcggca 36

<210>10

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：合成的DNA

<400>10

acggagaaag tttacaaccg gacacaaaac aggctcatat ccagc 45

<210>11

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：合成的DNA

<400>11

gcggttatct ctgcatcg 18

<210>12

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：合成的DNA

<400>12

ggtgtcgtag cggaaac 17

<210>13

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：合成的DNA

<400>13

cgggaaaaat acaatatcgc cc 22

<210>14

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：合成的DNA

<400>14

cgacaaaacg gcacatttat gg 22

<210>15

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：合成的DNA

<400>15

cacatttatg gtcaaacagt gcggcaac 28

<210>16

<211>600

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：合成的DNA

<400>16

attcgaaggg tgattggatc ggagatagga tgggtcaatc gtagggacaa tcgaagccag 60

aatgcaaggg tcaatggtac gcagaatgga tggcacttag ctagccagtt aggatccgac 120

tatccaagcg tgtatcgtac ggtgtatgct tcggagtaac gatcgcacta agcatggctc 180

aatcctaggc tgataggttc gcacatagca tgccacatac gatccgtgat tgctagcgtg 240

attcgtaccg agaactcacg ccttatgact gcccttatgt caccgcttat gtctcccgat 300

atcacacccg ttatctcagc cctaatctct gcggtttagt ctggccttaa tccatgcctc 360

atagctaccc tcataccatc gctcatacct tccgacattg catccgtcat tccaaccctg 420

attcctacgg tctaacctag cctctatcct acccagttag gttgcctctt agcatccctg 480

ttacgtacgc tcttaccatg cgtcttacct tggcactatc gatgggagta tggtagcgag 540

tatggaacgg actaacgtag gcagtaagct agggtgtaag gttgggacta aggatgccag 600

<210>17

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：合成的DNA

<400>17

cgcttggata gtcggatgca agggtcaatg gtac 34

<210>18

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：合成的DNA

<400>18

acggtgtatg cttcggtgtg cgaacctatc agc 33

<210>19

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：合成的DNA

<400>19

ggacaatcga agccagaa 18

<210>20

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：合成的DNA

<400>20

atcacggatc gtatgtgg 18

<210>21

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：合成的DNA

<400>21

gctagctaag tgccatcc 18

<210>22

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：合成的DNA

<400>22

aacgatcgca ctaagcat 18

<210>23

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：合成的DNA

<400>23

gc tagc taag tgccatccat tctgcgtacc 30

<210>24

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：合成的DNA

<400>24

ccgcagacac atccagcgat aaacctccaa tcactcacca a 41

<210>25

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：合成的DNA

<400>25

catcctgctg ctatgcctca tcttcttgtt cctggaatta gaggaca 47

<210>26

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：合成的DNA

<400>26

caaaattcgc agtccc 16

<210>27

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：合成的DNA

<400>27

gcaggtcttg catggtcc 18

<210>28

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：合成的DNA

<400>28

cagcgatagc caggaca 17

<210>29

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：合成的DNA

<400>29

tctggactat caaggtatgt tgc 23

<210>30

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：合成的DNA

<400>30

gttggttctt ctggactatc aaggtatgtt gccc 34

Claims

1.一种核酸扩增方法，该核酸扩增方法中使用内标物，其中，在等温条件下通过LAMP法在同一反应液中扩增靶核酸和内标物；

且其中通过在扩增每个检测系统的测定范围内的靶核酸之前与靶核酸模板的浓度无关地进行内标物的扩增而避免内标物扩增产物对靶核酸的扩增反应的影响；

内标物在一定时间内与靶核酸模板的浓度无关地进行扩增；

内标物至少在引物设计区域内具有与靶核酸不同的碱基序列；

用于扩增内标物的寡核苷酸引物设计为与内标物特异性杂交而不与靶核酸杂交；并且用于扩增靶核酸的寡核苷酸引物设计为与靶核酸特异性杂交而不与内标物杂交；

使用下述用于扩增内标物的寡核苷酸引物，所述用于扩增内标物的寡核苷酸引物设计为使得在早于靶核酸扩增的时期发生内标物扩增；

在扩增靶核酸之前在下述条件下扩增内标物：

(a)与使内标物和靶核酸同时扩增来进行测定时的扩增反应液相比，将内标物设定为10倍或更高浓度，并将用于扩增内标物的寡核苷酸引物设定为更低浓度；且

(b)与不使用内标物而使相同的靶核酸扩增来进行测定时的扩增反应液相比，将底物核苷酸设定为更高浓度，并且

在检测靶核酸的扩增之前进行内标物的扩增的检测，

其中，扩增反应使用下述引物(1)和引物(2)：

(1)当从模板核酸上的靶序列的3’侧起朝着该模板核酸上的3′末端方向依次选定第1任意序列F1c和第2任意序列F2c时，按照从5’侧到3’侧的顺序含有与该F1c相同的序列和与该F2c互补的序列F2的引物；

(2)当从模板核酸上的靶序列的5’侧起朝着该模板核酸上的5′末端方向依次选定第3任意序列R1和第4任意序列R2时，按照从5’侧到3’侧的顺序含有与该R1互补的序列R1c和与该R2相同的序列R2的引物。

2.根据权利要求1所述的核酸扩增方法，其中在扩增靶核酸之前在7个数量级或更多拷贝的靶核酸浓度范围内进行内标物的扩增。

3.根据权利要求1或2所述的核酸扩增方法，其包括以下工序：

(a)向含有靶核酸的样品中添加溶液的工序，该溶液中含有已知浓度或拷贝数的内标物；

(b)使用扩增反应液进行扩增反应的工序，该扩增反应液含有用于扩增内标物的寡核苷酸引物和用于扩增靶核酸的寡核苷酸引物，所述用于扩增内标物的寡核苷酸引物能够在早于靶核酸扩增的时期使所述内标物进行扩增；

(c)通过能够分辨所述内标物的扩增反应和所述靶核酸的扩增反应的方法进行测定的工序。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的核酸扩增方法，其包括以下工序：

向含有靶核酸的样品中添加溶液的工序，该溶液中含有已知浓度或拷贝数的内标物；

使用扩增反应液进行扩增反应的工序，该扩增反应液含有用于扩增内标物的寡核苷酸引物和用于扩增靶核酸的寡核苷酸引物，所述用于扩增内标物的寡核苷酸引物能够在早于靶核酸扩增的时期使所述内标物进行扩增；

通过能够分辨所述内标物的扩增反应和所述靶核酸的扩增反应的方法，进行实时测定，根据其结果和内标物的添加量，计算出样品中的初始靶核酸浓度或拷贝数的工序。

5.根据权利要求1至4中任意一项所述的核酸扩增方法，其中，进行靶核酸的定量。

6.根据权利要求1至4中任意一项所述的核酸扩增方法，其中，检测靶核酸的有无。

7.一种测试试剂或试剂套件，其用于实施根据权利要求1至6中任意一项所述的核酸扩增方法，其中所述测试试剂或试剂套件至少包含下述的试剂：

(a)内标物，其至少在引物设计区域内具有与靶核酸不同的碱基序列，并且浓度或拷贝数已知；

(b)用于扩增内标物的寡核苷酸引物，其能够在早于靶核酸扩增的时期使内标物进行扩增，其中所述寡核苷酸引物是用于扩增内标物的正向内部引物(FIP)(b1)和反向内部引物(BIP)(b2)：

(b1)当从内标物中的模板核酸上的靶序列的3’侧起朝着该模板核酸上的3’末端方向依次选定第1任意序列F1c和第二任意序列F2c时，按照从5’侧到3’侧的顺序含有与该F1c相同的序列和与该F2c互补的序列F2的引物；

(b2)当从内标物中的模板核酸上的靶序列的5’侧起朝着该模板核酸上的5’末端方向依次选定第3任意序列R1和第4任意序列R2时，按照从5’侧到3’侧的顺序含有与该R1互补的序列R1c和与该R2相同的序列R2的引物；和

(c)用于扩增靶核酸的寡核苷酸引物，其中所述寡核苷酸引物是用于扩增靶核酸的FIP(c1)和BIP(c2)：

(c1)当从靶核酸中的模板核酸上的靶序列的3’侧起朝着该模板核酸上的3’末端方向依次选定第1任意序列F1c和第二任意序列F2c时，按照从5’侧到3’侧的顺序含有与该F1c相同的序列和与该F2c互补的序列F2的引物；

(c2)当从靶核酸中的模板核酸上的靶序列的5’侧起朝着该模板核酸上的5’末端方向依次选定第3任意序列R1和第4任意序列R2时，按照从5’侧到3’侧的顺序含有与该R1互补的序列R1c和与该R2相同的序列R2的引物。

8.根据权利要求7所述的测试试剂或试剂套件，其还含有如下的试剂：

(a)用于检测内标物的寡核苷酸探针；和

(b)用于检测靶核酸的寡核苷酸探针。