KR102008454B1 - 평행결합 구조의 이중 혼성화 ｐｎａ 프로브 시스템을 포함하는 ｃ형 간염바이러스(ｈｃｖ) 유전자형 감별용 조성물 및 이를 이용한 감별방법 - Google Patents

평행결합 구조의 이중 혼성화 ｐｎａ 프로브 시스템을 포함하는 ｃ형 간염바이러스(ｈｃｖ) 유전자형 감별용 조성물 및 이를 이용한 감별방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 평행결합 구조의 이중 혼성화 Peptide Nucleic Acid(PNA) 프로브 시스템에 기반한 HCV 유전자 1형 및 유전자 2형 동시 감별용 조성물 및 상기 조성물과 실시간 중합효소 연쇄반응을 이용한 HCV 유전자 1형 및 유전자 2형의 동시 검출 방법에 대한 것이다.
본 발명에 따른 평행 결합 구조의 이중 혼성화 PNA 프로브 시스템을 포함하는 조성물을 이용하여 실시간 다중 중합효소 연쇄반응을 수행하면, 탁월한 민감도로 한 튜브 내에서 HCV 유전자 1형 및 유전자 2형을 동시에 정확하게 감별할 수 있기 때문에, 보다 신속하고 정확한 임상 진단이 가능하다는 장점이 있다.

Description

평행결합 구조의 이중 혼성화 ＰＮＡ 프로브 시스템을 포함하는 Ｃ형 간염바이러스(ＨＣＶ) 유전자형 감별용 조성물 및 이를 이용한 감별방법 {Composition for detecting Hepatitis C Virus(HCV) genotypes comprising parallel binding structured PNA probe system and detection method using thereof}
본 발명은 평행결합 구조의 이중 혼성화 Peptide Nucleic Acid(PNA) 프로브 시스템에 기반한 C형 간염바이러스 유전자형 감별용 조성물 및 상기 조성물과 실시간 중합효소 연쇄반응을 이용한 C형 간염바이러스 유전자형의 동시 감별 방법에 대한 것이다. 또한 본 발명은 평행결합 구조의 이중 혼성화 PNA 프로브 시스템에 기반한 C형 간염바이러스 유전자형 동시 감별용 프라이머, 프로브 조성물 및 감별방법을 제공한다.
본 발명에 따른 평행 결합 구조의 이중 혼성화된 PNA 프로브를 포함하는 조성물을 이용하여 실시간 다중 중합효소 연쇄반응을 수행하면, 탁월한 민감도로 한 튜브내에서 C형 간염바이러스 유전자형을 동시에 정확하게 감별할 수 있기 때문에, 보다 신속하고 정확한 임상 진단이 가능 하다는 장점이 있다.
C형 간염은 C형 간염바이러스에 감염되었을 때 이에 대응하기 위한 신체의 면역반응으로 인해 간에 염증이 생기는 질환으로 급성간염에서 만성간염, 간경변 및 간암으로 진행되는 매우 위험한 질병을 일으키는 요인이다. 전 세계적으로 약 4억명 가량이 감염되어 있으며, 미국, 유럽, 일본 등 선진국을 포함한 전 세계에 널리 분포되어 있다[WHO, Weekly Epidemiological Record 75:17-28, 2000]. 우리나라에서도 전 인구의 1.6%인 80만명 가량이 C형 간염바이러스에 감염되어 있는 것으로 추정된다. 또한, 감염자의 50-85%가 만성간염으로 진행될 정도로 예후가 좋지않은 바이러스이다. C형 간염바이러스와 연관된 만성 간질환 등에 의한 사망자 수는 향후 10-20년간 지속적으로 증가할 것이며 가까운 장래에 AIDS로 인한 사망자 수를 추월할 것으로 전망하고 있다[Centers for Disease Control and Prevention, CDC]. 우리나라의 C형 간염바이러스 감염률은 해마다 증가 추세로 정확한 진단 시약의 수요가 급증할 것으로 기대된다[한국기술거래소, 'HCV 진단키트' 개발].
HCV 유전자형은 HCV 감염의 확인, 감염 경로, 및 인터페론 치료 효과를 예측 및 지역과 민족에 따라 다른 분포를 보이고 있기 때문에 분포도 조사 및 백신 개발에도 이용된다. 치료 전 유전자형이 2형 혹은 3형인 경우는 24주, 유전자형이 1형 및 4, 5, 6형에는 48주의 치료가 권장 치료 전 바이러스 유전자형 검사는 반드시 시행되어 져야 한다. HCV 유전자형 중 1b type은 IFN-a로 치료가 가장 어렵고, 간경화 등으로 발전할 위험성이 높으며 간이식 후 간질환의 발생 빈도가 높다. HCV 유전자형은 지역에 따라 분포에 차이가 있다. 세계적으로 볼 때 1, 2, 3형이 흔하며 4, 5, 6형은 한정된 지역에 국한되는데, 한국인의 HCV 혈청형은 1형과 2형이 대부분을 차지하고 있다[대한임상병리학회지. 18:425-32, 1998].
HCV 유전자형을 감별함으로써 HCV 감염 확인, 감염원 동정 및 감염 경로 파악이 가능하고, 항바이러스 약제의 치료 방침을 제시하여 경제적이고도 효율적인 치료가 가능하다. HCV 유전자 1형, 4형, 5형, 6형은 단독 혹은 인터페론 알파(IFN-a)와 리바비린(Ribavirin) 병합요법을 실시할 경우, 치료효과 좋지 않고(20~25%), 인터페론 치료를 48주(1년)동안 받아야한다. 이와 달리 HCV 유전자 2형, 3형은 인터페론 치료효과가 좋아(60~70%) 인터페론 치료 24주(6개월)동안만 받으면 된다.
HCV 유전자형 종류에 따라 치료 반응 정도와 예후에 차이를 나타내므로, 치료 중 HCV 유전자형 검사를 통해 조기에 약제 내성 및 혼합 감염을 감지하여 효과적인 치료가 가능하다. HCV는 체내에서 약간 다른 아형(subtype)으로 변화하므로, 처음 감염 때와 다른 2종 이상의 혼합감염으로 진행이 용이하므로 혼합감염에 대한 모니터링 및 치료방침 재설정이 중요하다.
C형 간염 바이러스 검사 방법에는 C형 간염 바이러스 감염에 의한 항체의 변화를 보는 간접적인 검사와 직접적으로 HCV의 핵산 및 구성요소를 검사하는 직접검사로 나눌 수 있다. 간접 검사법에는 혈청학적 검사가 속하며, 직접 검사법에는 분자생물학적 검사(핵산 증폭, HCV 정성 및 정량 검사)가 있다. 또한 진단을 위한 검사와 감염환자의 추적 검사로 나눌 수 있다. 진단을 위한 검사로 혈청학적 검사와 핵산증폭, HCV 정성 검사가 해당하며, 감염환자의 추적 검사로 HCV 정량 검사와 유전자형 검사가 있다.
최근에는 분자진단을 이용한 HCV의 검사 방법이 주목을 받고 있다. 분자진단이란 인간의 유전자(DNA 또는 RNA)를 분석해 질병의 감염 여부를 진단하거나 유전자의 염기서열 변이나 돌연변이를 규명하여, 질병의 발병 여부 등을 예측하고 확인하는 데 효과적인 방법이다. 특히 현존하는 질병 진단 방법 중 가장 최고 수준의 기술로 꼽히고 있으며, 현재 의약학 분야에서 관심이 집중되고 있는 기술 중 하나이다.
분자진단을 위해서 다양한 검출 방법이 사용되고 있다. 대표적인 예로는 실시간(real-time) PCR을 이용하는 방법, DNA 기반 프로브를 이용하는 방법, PNA 기반 프로브를 이용하는 방법 등이 있다. 이하 각 방법의 특징을 간략히 살핀다.
실시간 PCR 을 이용한 분자진단 : 실시간 PCR 분석은 중합효소 연쇄반응(PCR:polymerase chain reaction)을 통해 PCR 증폭산물 생성과정을 형광물질로 표지된 프라이머 또는 프로브와의 결합을 통해 형광신호의 세기를 실시간으로 보여주는 방법으로, 보다 정확한 정량적 분석이 가능하다. 실시간 PCR에 사용되는 표적 뉴클레오타이드 검출법은 크게 2가지로 나눌 수 있다. 첫 번째는 프라이머 기반의 검출법으로 이 방법은 디자인의 어려움과 정량분석에 취약하다는 단점이 있다. 두 번째는 프로브 기반의 검출법으로서 디자인이 편리하며 정량 및 정성분석에 모두 적용할 수 있다는 장점을 지닌다. 두 가지 검출방법에 대한 장단점을 표 1에 비교하여 나타내었다[Meti Buh Ga, et al., Anal. Bioanal. Chem. 396, 2023, 2010].
프로브 기반 검출법과 프라이머 기반 검출법 비교
프로브 기반 검출법 프라이머 기반 검출법
TaqMan MGB MB LNA Plexor LUX AmpliFluor
디자인및 합성 용이 용이 보통 용이 보통 어려움 어려움
취급용이성 좋음 좋음 좋음 좋음 보통 보통 보통
정량분석 효율적 효율적 보통 효율적 보통 비효율적 비효율적
정성분석 효율적 효율적 효율적 효율적 효율적 보통 보통
DNA 기반 프로브를 이용한 표적 뉴클레오타이드의 검출 : 보편적으로 널리 이용되는 DNA 기반의 프로브에는 크게 두 가지 형태가 있다. 태크만(TaqMan) 프로브는 표적 뉴클레오타이드와 상보 결합할 수 있는 DNA 서열 말단에 리포터 물질(reporter molecule) 및 소광 물질(quencher molecule)이 결합된 선형 프로브로서 표적 뉴클레오타이드와 결합된 프로브 서열의 효소적 분해 단계에서 이탈되는 형광(리포터) 물질의 신호를 검출하는 방식이다[Holland, P. M., et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 88, 7276-7280, 1991; Livak, K. J., et al., PCR Methods Appl., 4, 357-362].
이 방법은 단일염기서열변이 구별능 저하의 단점을 가지므로, 단일염기서열변이 구별능 향상을 목적으로 3’ 말단에 소광물질과 함께 MGB(minor groove binder)를 도입하여 서열 길이를 짧게 한 MGB 태크만(TaqMan)도 개발되었다 [IgorV. K.,et al, Nucl. Acids Res. 25, 3718-3723, 1997; Igor V. K., et al, Nucl. Acids Res. 28 (2): 655-661, 2000; I. A. Afonina, ea al, BioTechniques, 32, 940-949, 2002; I. A. Afonina, ea al, Nucleic Acids Research, 25, 2657-2660, 1997].
분자 비컨(MB, Molecular Beacon)은 표적 뉴클레오타이드와 상보적인 염기서열의 루프(loop)와 헤어핀(hairpin) 구조를 형성하기 위한 스템(stem) 구조로 구성된 새로운 형태의 프로브이다. 이 방법은 뛰어난 단일염기서열변이 구별능을 나타내는 장점이 있는 반면, 프로브의 설계(design) 및 합성이 어렵다는 단점이 있다[US 20080064033 A; S. Tyagi, et al., Nat. Biotechnol., 16, 49, 1998;Stryer, L., Ann. Rev. Biochem., 47, 819-846, 1987; S. Tyagi, et al., Nat. Biotechnol., 14, 303-308, 1996; Bonnet,G., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 96, 61716176, 1999].
하지만 DNA 프로브를 기반으로 하는 검출법은 DNA는 뉴클레아제(nucleases)나 프로테아제(protease)와 같은 효소들에 의한 손상에 의해 안정성이 떨어지며[Demidov et al., Biochem. Phamacol. 48, 1310-1313, 1994], 또한 DNA 골격의 음전하(negative charge)들 사이의 전하적 반발력에 따른 약한 DNA-DNA 결합력과이를 극복하기 위한 긴 서열의 사용으로 인한 낮은 단일염기서열변이 구별능력 등의 단점이 있다.
PNA 기반의 프로브를 이용한 표적 뉴클레오타이드의 검출 : DNA 프로브를 이용하는 경우의 단점을 보완하기 위해 DNA의 유사체인 PNA를 사용한 방법들이 연구되어지고 있다. PNA는 골격에 전하가 없기 때문에 음전하를 가진 상보적인 DNA 올리고머와의 결합에 있어서 반발력이 적어, DNA 프로브보다 빠르고 강하게 표적 뉴클레오타이드 서열과 결합할 수 있으며, 효소들에 의한 손상이 없어 높은 안정성을 보인다[Egholm et al., Nature 365, 556-568, 1993,; Nielsen et al., Bioconjugate Chem, 5, 3-7, 1994; Demidov, et al., Biochem. Pharmacol. 48, 1310-1313, 1994].
최근에 이중 선형 프로브 구조를 이용한 새로운 방법이 보고되었다. 이 방법은 긴 서열을 갖는 DNA 프로브의 단점인 낮은 단일염기서열변이 구별능력을 향상시키기 위해 짧은 2차 프로브를 사용하였고, 두 개의 프로브가 서로 역평행 결합(anti-parallel binding)을 이루게 디자인 되어 있다[James M. Coull, et al., US 6607889].
근래에 들어 HCV 유전자형을 감별하기 위한 다양한 분자진단 기술 등이 개발되어왔지만, 여전히 특히 높은 민감도 및 특이성을 가지고 짧은 분석시간 안에 HCV 유전자형을 감별할 수 있는 기술개발의 필요성은 절실하다.
비특허문헌 1: Igor V. K., et al, Nucl. Acids Res. 28 (2): 655-661, 2000 비특허문헌 2: Bonnet, G., Proc. Natl Acad. Sci. USA. 96. 61716176, 1999 비특허문헌 3: Demidov et al., Biochem. Pharmacol. 48, 1310-1313, 1994 비특허문헌 4: Nielsen et al., Bioconjugate Chem, 5, 3-7, 1994
본 발명에서는 상기와 같은 분자진단 기술의 단점을 극복하여 시료 내 표적뉴클레오타이드를 정확하게 검출할 수 있는 PNA에 기반한 C형 간염바이러스(Hepatitis C Virus, HCV) 유전자 1형 및 유전자 2형을 동시에 감별할 수 있는 감별용 조성물 및 이를 이용한 HCV 유전자형의 동시 감별 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 감별방법은 HCV 유전자 1형 및 유전자 2형에 특이적으로 결합가능하며, 2중으로 혼성화가 가능한 평행 결합(parallel binding) 구조의 2개의 실시간 핵산 증폭용 PNA 프로브를 이용하여 실시간 PCR 방법을 수행하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 감별방법을 이용하면, 높은 민감도 및 특이도를 가지고 HCV 유전자 1형 및 유전자 2형을 동시 감별할 수 있어, HCV 유전자형 감별에 매우 유용하게 적용가능하다.
또한 본 발명은 상기 HCV 유전자 1형 및 유전자 2형에 특이적으로 결합가능하며, 2중으로 혼성화가 가능한 평행 결합(parallel binding) 구조의 2개의 실시간 핵산 증폭용 PNA 프로브 시스템을 포함하는 HCV 유전자형 감별용 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 목적 및 장점은 하기의 과제의 해결 수단 및 효과, 발명의 상세한 설명에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명에서는, 기존 DNA 기반의 실시간 PCR 프로브들이 가지고 있는 안정성의 한계를 극복하기 위하여 열 및 생물학적 안정성을 가지며, DNA 보다 표적 뉴클레오타이드에 대한 인식능력 및 결합능력이 뛰어난 PNA를 활용하여 높은 민감도 및 특이도로 HCV 유전자 1형 및 유전자 2형을 동시에 감별할 수 있는 조성물, 그러한 조성물을 포함하는 HCV 유전자형 감별 키트 및 상기 조성물 또는 키트를 이용하여 실시간 PCR 방법을 통한 HCV 유전자 1형 및 유전자 2형을 동시에 감별하는 방법을 개발하였다.
이미 알려진 바와 같이, 일반적으로 표적 뉴클레오타이드를 검출함에 있어서 프로브 기반의 검출법이 프라이머 기반의 검출법에 비해 많은 장점을 가지고 있다. 이 때 사용되는 프로브는 크게 두 가지 형태로 구분되며, 각 프로브의 장단점을 표2에 비교하였다.
Figure 112012069293949-pat00001
상기 표 2에서 구조적(Structured) 프로브는 단일염기서열변이에 대한 검출특이성이 뛰어난 것으로 알려져 있으나, 스템의 결합력에 의해 안정한 헤어핀 구조를 갖도록 설계하지 않으면 소광(quenching)이 불완전하게 되어 비특이적 형광을 발생시킬 수 있다. 따라서 스템의 결합에너지와 표적 뉴클레오타이드와의 결합에너지 차이를 고려하여 프로브를 제작하여야 하므로 디자인 및 합성이 어렵다. 이에 반해 선형 프로브는 제작의 편리성을 비롯하여 여러 가지 장점을 가지고 있으나, 스템의 부재로 인해 단일염기서열변이에 대한 검출 능력이 떨어지는 단점이 있다.
이에 본 발명자들은 디자인과 합성이 용이한 선형 프로브와 단일염기서열변이에 대한 높은 검출능을 나타내는 분자 비컨(Molecular Beacon)의 장점을 모두 갖춘 PNA 프로브 시스템을 제작하고자 하였다.
PNA는 상보적 염기서열을 갖는 PNA와 역평행 결합(anti-parallel binding)및 평행 결합(parallel binding)의 두 가지 형태로 혼성화 할 수 있으며[도 1], 이들 간의 결합에너지 크기는 아래의 [도 2]에 나타낸 바와 같다[Stefano Sforza, Eur. J. Org. Chem., 197-204, 1999]. 이러한 결합에너지의 차이에 따라 시료 내에 표적 뉴클레오타이드 부재시 평행 결합 서열을 갖는 이중 선형 PNA 프로브는 서로 상보 결합을 통해 형광을 발생하지 않으나, 표적 뉴클레오타이드가 존재하면 검출 프로브는 표적 뉴클레오타이드와 보다 안정한 상보 결합을 이루게 되고 기존의 PNA-PNA 프로브 간 결합이 해리되면서 형광을 발생하게 된다.
따라서 본 발명에서는 목표 Tm에 맞춰 제 1 PNA 프로브를 합성하고, 상대적으로 결합력이 약하여 그 조절이 용이한 평행 결합을 이용하여 두 PNA 프로브간 결합세기를 PNA-DNA의 모든 서열이 일치하는 완전한 상보 결합(perfect-match)와 PNA-DNA의 서열 중 일부가 상이한 불완전한 상보 결합(mismatch)의 중간이 되도록 제 2 PNA 프로브를 설계 및 합성하였다. 이러한 2개의 PNA 선형(linear) 프로브를 사용하여 스템의 기능을 갖게 함으로써 단일염기서열변이 검출능을 향상시키면서 서열(sequence)에 제한적이지 않아 디자인 및 합성이 편리한 검출 시스템을 개발 하였다(도 3 참조).
본 발명에 따른 PNA 프로브는 일정 염기서열의 PNA 올리고머 한쪽 또는 양쪽
말단에 리포터 물질 및 소광 물질이 결합된 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 PNA 프로브는 하기 화학식 1의 구조와 같이 양 말단에 물성조절용 부위 및/또는 리포터 물질 및 소광 물질이 결합된 형태인 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 것이라면 어떠한 구조를 가지는 PNA 프로브 구조라도 사용가능함은 통상의 기술자에게는 자명한 것이다.
Figure 112012069293949-pat00002
상기 화학식 1에서, P는 표적 뉴클레오타이드에 상보적인 서열을 가지는 PNA 염기부분으로 아래 첨자로 표시된 N은 PNA 염기의 개수로서, 바람직하게는 7~25의정수, 보다 바람직하게는 8~18의 정수를 의미하며 표적 뉴클레오타이드에 평행 결합(parallel binding) 또는 역평행 결합(anti-parallel binding)을 이루는 부분이다. A 및 A'은 리포터 물질(reporter molecule) 또는 소광 물질(quencher molecule)로서 서로 같거나 다른 물질일 수 있고, 둘 중 하나만 존재할 수도 있다. X 및 X'는 물성조절 부위로서 서로 같거나 다른 물질일 수 있고, 어느 것도 포함되지 않을 수도 있으며, 하나 이상이 포함될 수도 있다. N’ 및 C’은 각각 N-말단 및 C-말단을 의미한다.
리포터 물질은 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), FAM, JOE, ROX, HEX, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 염료로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으며, 소광물질은 답실(Dabcyl), TAMRA, Eclipse, DDQ, QSY, 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 블랙홀 퀸처(Black Hole Quencher), Qxl, 아이오와 블랙(Iowa black) FQ, 아이오와 블랙 RQ, IRDye QC-1 군으로부터 하나 이상 선택될 수 있다.
또한 물성조절 부위는 친수성 잔기, 소수성 잔기, 이온성 잔기 및 수소 결합 잔기로 구성된 군으로부터 하나 이상 선택될 수 있으며, 이온성 잔기는 양전하, 음전하 또는 쯔비터 이온을 포함할 수 있다.
특히 PNA 염기 부분인 P는 하기 화학식 2와 같은 구조를 가질 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 것이라면 어떠한 구조를 가지는 PNA 염기라도 사용가능함은 통상의 기술자에게는 자명한 것이다.
Figure 112012069293949-pat00003

상기 화학식 2에서 B는 핵산염기로서 아데닌, 싸이민, 구아닌, 싸이토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산염기나 비천연 핵산염기 중에서 선택되며, R 또는 S는 가장 간단한 경우 수소(H)로서 이성질체가 존재하지 않을 수 있으나, 이성질성 치환체로 변형될 수 있다. 또한 R 또는 S는 리포터 물질(reporter molecule) 또는 소광 물질(quencher molecule)이 표지된 이성질성 치환체로 변형된 형태일 수 있다[Ethan A. et al., Organic Lett. 7(16), 3465-3467, 2005].
PNA 프로브는 평행 결합을 이루는 이중 선형 구조로서 설계와 합성이 쉽고, 비특이 신호 없이 표적 뉴클레오타이드와 신속한 상보 결합을 이루어 높은 민감도 및 특이도를 가지고 있다. 따라서, 본 발명의 HCV 유전자 1형 및 유전자 2형에 특이적인 PNA 프로브를 포함하는 조성물 또는 이를 포함하는 키트는 높은 민감도 및 특이도를 가지고 HCV 유전자 1형 및 유전자 2형의 동시 감별이 가능하여, 정확하고 신속한 HCV 감염여부, 즉 C형 간염바이러스의 진단에 이용될 수 있다.
HCV 유전자 1형 및 유전자 2형을 검출하는데 있어 제 1 프로브만을 사용하여도 C형 간염바이러스의 동시 감별이 가능하나, 제 2 프로브를 함께 사용할 경우 민감도와 특이도가 향상됨을 확인할 수 있다.
도 1은 PNA-PNA 사이의 평행 결합(parallel binding)과 역평행 결합 (antiparalle binding) 구조를 나타내는 도면.
도 2는 PNA-PNA 및 PNA-DNA의 상대적 결합력 세기를 나타내는 도면.
도 3은 이중 혼성화 PNA 프로브 시스템을 이용한 표적 뉴클레오티드 검출방법을 나타내는 도면.
(a) 평행 결합 구조의 이중 혼성화 PNA 프로브 시스템을 이용한 표적 뉴클레오타이드의 검출방법 중 제1 PNA 프로브를 검출용 프로브로 사용한 경우.
(b) 평행 결합 구조의 이중 혼성화 PNA 프로브 시스템을 이용한 표적 뉴클레오타이드의 검출방법 중 제 2 PNA 프로브를 검출용 프로브로 사용한 경우.
도 4는 프로브의 안정성을 나타내는 도면.
(a) 제 1 프로브와 제 2 프로브를 혼합한 직후 수행한 PCR 결과.
(b) 제 1 프로브와 제 2 프로브를 혼합한 상태로 6개월간 상온보관 후 수행한 PCR 결과.
도 5는 이중 형광 표지를 통한 형광 세기 증가를 나타내는 도면.
(a) 형광표지되지 않은 제 2 프로브와 제 1 프로브를 혼합하여 PCR을 수행한 결과.
(b) 형광표지된 제 2 프로브와 제 1 프로브를 혼합하여 PCR을 수행한 결과.
도 6은 본 발명의 방법을 이용한 실시예 8과 관련하여, 와파린 단일염기서열변이 검출 민감도 확인 및 정량법 적용 가능성 확인을 위해 PCR을 수행한 결과 및 검량선을 나타내는 도면.
도 7은 본 발명의 방법을 이용한 실시예 9와 관련하여, HCV 검출 민감도 확인 및 정량법 적용 가능성 결과를 나타내는 도면.
(a) HCV 유전자 1형 검출 민감도 확인 및 정량법 적용 가능성 확인을 위해 PCR을 수행한 결과 및 검량선.
(b) HCV 유전자 2형 검출 민감도 확인 및 정량법 적용 가능성 확인을 위해 PCR을 수행한 결과 및 검량선.
도 8은 DNA 프로브를 이용한 PCR 결과를 나타내는 도면.
(a) DNA 프로브를 이용하여 와파린 대사관련 유전자 CYP2C9 430 유전자의 야생형과 단일 염기서열 변이체를 이용한 PCR 결과 (○는 야생형 유전자 검출선이고, ×는 단일염기서열변이체의 검출선을 의미).
(b) DNA 프로브를 이용하여 와파린 대사관련 유전자 VKORC1 3730 유전자의 야생형과 단일 염기서열 변이체를 이용한 PCR 결과 (○는 야생형 유전자 검출선이 고, ×는 단일염기서열변이체의 검출선을 의미).
(c) PNA 프로브를 이용하여 와파린 대사관련 유전자 CYP2C9 430 유전자의 야생형과 단일 염기서열 변이체를 이용한 PCR 결과 (○는 야생형 유전자 검출선이고, 직선은 단일염기서열변이체의 검출선을 의미).
(d) PNA 프로브를 이용하여 와파린 대사관련 유전자 VKORC1 3730 유전자의 야생형과 단일염기서열변이체를 이용한 PCR 결과 (○는 야생형 유전자 검출선이고, 직선은 단일염기서열변이체의 검출선을 의미).
도 9는 서로 다른 형광으로 표지된 PNA 프로브를 이용하여 HCV 유전자 1형 과 유전자 2형을 각각 특이적으로 동시에 검출한 PCR 결과를 나타내는 도면(○는 HCV 유전자 1형 검출선이고, △는 HCV 유전자 2형의 검출선을 의미).
도 10은 제 2 프로브에 의한 단일 염기서열 변이체에 대한 용융온도의 변화를 나타내는 도면 (오른쪽 봉우리는 야생형의 용융온도를 나타내고, 왼쪽 봉우리는 단일 염기서열 변이체의 용융온도를 의미).
본 발명은 PNA 기반의 실시간 PCR 프로브를 이용하여, 목적 샘플 속에 존재하는 표적 뉴클레오타이드의 존재 유무, 양 또는 서열 변이의 검출 및 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 사용된 용어 및 약어의 정의는 다음과 같다.
혼성화 : 상보적 관계의 염기쌍이 수소결합을 통해 이중나선구조를 형성한 상태를 의미한다.
평행 결합(parallel binding) : 한 쌍의 PNA가 혼성화될 때 N-말단(N-term)이 같은 방향으로 상보적 관계를 이루고 있는 형태로서, DNA의 경우 5’-말단(5’-end)이 같은 방향으로 상보 결합을 이루고 있는 형태를 의미하며, PNA와 DNA가 혼성화 될 때 PNA의 N-말단과 DNA의 5’-말단이 같은 방향으로 상보적 관계를 이루고있는 형태를 의미한다.
역평행 결합(anti-parallel binding) : 한 쌍의 PNA가 혼성화될 때 N-말단이 서로 반대 방향으로 상보 결합을 이루고 있는 형태로서, DNA의 경우 5’-말단이 서로 반대 방향으로 상보적 관계를 이루고 있는 형태를 의미하며, PNA와 DNA가 혼성화 될 때 PNA의 N-말단과 DNA의 3’-말단(3’-end)이 서로 같은 방향으로 상보 결합을 이루고 있는 형태를 의미한다.
상보 결합 : 염기(A, T, G, C)가 수소결합을 통해 이중가닥(double strand) 구조를 형성하는 결합을 의미하며, 본 발명에서는 이중가닥을 형성하는 단일가닥(single strand)의 5’-말단은 서로 반대 방향을 향하는 상태에서 상보적 관계에 있는 염기가 수소 결합하는 역평행결합 뿐 아니라, 5‘-말단이 서로 같은 방향을 향하는 상태에서 상보적 관계에 있는 염기가 수소 결합하는 평행결합도 의미한다.
이중 혼성화 : 두 개의 PNA 프로브가 센스(sense) 및 안티-센스(anti-sense)DNA에 각각 결합하여 두 개의 이중나선 구조를 형성하는 것을 의미한다.
리포터 물질(reporter molecule) : 특정 파장의 빛을 흡수, 방출하여 형광을 발하는 물질로써, 프로브에 표지하여 표적 핵산과 프로브 사이의 혼성화가 이루어 졌는지 확인할 수 있는 물질을 의미한다.
소광 물질(quencher molecule) : 리포터 물질이 발생시킨 빛을 흡수하여 형광세기를 감소시키는 물질을 의미한다.
물성조절 부위 : 링커(linker) 또는 스페이서(spacer) 등, 프로브의 용해도를 조절하거나 리포터 물질 또는 소광 물질을 표지하는데 이용하기 위한 물질을 의미하며, 그러한 물질로는 PNA와 형광물질 또는 소광물질 사이에 연결을 용이하게 하기 위한 링커, 거리를 조절하기 위한 스페이서, 당업계에 공지된 용해도 향상 및 표적 뉴클레오타이드와의 결합력 향상을 위한 물질 등이 포함된다. 링커는 Akira Kishimoto, Chem. Commun., 742743, 2003; Peter E. Nielsen, ChemBioChem, 6668, 2005; Vladimir Guelev, JACS, 2864-2865, 2002; Ethan A. Englund and Daniel H. Appella, Organic Lett., 3465-3467, 2005 등에 기재된 것들이 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니고, 스페이서는 OlafKchler, ChemBioChem, 6977, 2005; Liisa D., J. Med. Chem., 2326-2340, 2007 등에 기재된 것들이 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 용해도 및 결합력 조절을 위해 사용되는 물질은 Irina V. Smolina, Vadim V. Demidov, Nucleic Acids Research, e146, 2005; I.S. Blagbrough, Biochemical Society Transactions part 2, 397-406, 2003; Nathalie Berthet, J. Med. Chem., 3346-3352, 1997 등에 기재된 물질 등이 가능하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 특징을 만족하는 경우 그 어떤 물질도 사용될 수 있음은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 자명할 것이다.
이성질성 치환체 : 분자식 및 구성원자의 연결 방법은 같으나 원자 사이의 공간적 배치가 서로 다른 화합물을 이성질체라 일컫는데, 주로 탄소에 연결된 4개의 원자단이 모두 다른 비대칭 탄소를 가진 탄소화합물의 경우에 존재하게 된다. 즉, 치환체의 입체적 배치에 따라 서로 다른 두 종류의 이성질체를 형성하며, 본 발명에서의 이성질성 치환체는 한쪽 방향의 이성질체만을 형성하게 하는 치환체를 의미한다. 본 발명의 화학식 2에서 R 또는 S는 수소(H)인 것을 기본으로 하나 천연 아미노산이나 비천연 아미노산 잔기(Anca Dragulescu-Andrasi, JACS, 10258-10267, 2006; Filbert Totsingan, Chirality, 245253, 2009; Stefano Sforza, Eur. J. Org. Chem., 1056-1063, 2003), 및 알킬기, 아민, 알코올, 카르복시산(Shabih Shakeel, Sajjad Karim, J. Chem. Technol. Biotechnol., 892899, 2006) 등이 이성질성 치환체로서 사용될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
단일염기서열변이(SNP) : 특정 유전자의 DNA 염기서열 하나가 다른 것을 의미하며, 생식세포 돌연변이(germline mutation)와 체세포 돌연변이(somatic mutation)를 모두 포함한다.
구조적 프로브(structured probe) : 2차 구조를 형성하는 프로브를 의미한다.
선형 프로브(linear probe) : 5’ 말단을 형광 물질로, 3’ 말단을 소광 물질로 표지한 올리고뉴클레오타이드로, 스템이 없어 2차 구조를 형성하지 않는 프로브를 의미한다.
이중 선형 프로브 : 리포터 물질과 소광 물질이 각각 결합된 두 개의 선형 올리고뉴클레오타이드가 서로 상보 결합을 이루는 형태의 프로브를 의미한다.
완전 상보 결합(perfect match) : 두 가닥의 DNA 또는 PNA가 혼성화 될 때 상보적 관계에 있는 염기쌍이 완벽하게 맞는 상태를 의미한다.
불완전 상보 결합( mis - match ) : 두 가닥의 DNA 또는 PNA가 혼성화 될 때 상보적 관계에 있는 염기쌍이 하나 이상 맞지 않는 상태를 의미한다.
FAM : 6 - Carboxyfluorescein
Dabcyl : 4,4 - Dimethylamino-azobenzene-4'-carboxylic acid
블랙 홀 소광물질 ( Black Hole Quencher , BHQ TM ) : Biosearch TechnologiesInc.(미국)에서 판매하는 소광 물질로서, 구조 및 파장 차이에 따라 BHQ1, BHQ2, BHQ3로 구분된다.
블랙베리 퀸처 ( Blackberry Quencher ) : 미국 Berry & Associates에서 판매하
는 소광 물질로서, 다음의 구조를 갖는 화합물.
Figure 112012069293949-pat00004
본 발명에 따른 C형 간염바이러스 유전자 1형 및 유전자 2형 동시 감별용 조성물은 C형 간염바이러스 유전자 1형에 특이적으로 결합하는 PNA 프로브 및 C형 간염바이러스 유전자 1형에 특이적으로 결합하는 PNA 프로브와 평행 결합하는 PNA 프로브 및 C형 간염바이러스 유전자 2형 특이적으로 결합하는 PNA 프로브 및 C형 간염바이러스 유전자 2형에 특이적으로 결합하는 PNA 프로브와 평행 결합하는 PNA 프로브를 포함한다.
상기 C형 간염바이러스 유전자 1형에 특이적으로 결합하는 PNA 프로브는 서열번호 10의 서열을 포함할 수 있으며, 바람직한 것은 서열번호 10의 서열로 이루어지는 것이다. 그리고 상기 C형 간염바이러스 유전자 2형에 특이적으로 결합하는 PNA 프로브는 서열번호 11의 서열을 포함할 수 있으며, 서열번호 11의 서열로 이루어지는 것이 바람직하다.
또한 상기 C형 간염바이러스 유전자 1형에 특이적 PNA 프로브 및 이와 평행 결합하는 PNA 프로브는 각각 서열번호 10 및 서열번호 12의 서열을 포함할 수 있으며, 각각 서열번호 10 및 서열번호 12의 서열로 이루어지는 것이 바람직하다. 그리고 C형 간염바이러스 유전자 2형에 특이적 PNA 프로브 및 이와 평행 결합하는 PNA 프로브는 서열 번호 11 및 서열번호 13의 서열을 포함할 수 있으며, 각각 서열번호 11 및 서열번호 13로 이루어지는 것이 바람직하다.
본 발명에서 사용한 PNA 프로브의 서열
서열 번호 서열이름 서열 (N' -> C') 서열 길이
1 IMB-3 ACACGGTCCTCAA 13
2 IMB-1 ACACGGTCCTCAA 13
3 DFP-0207-26 ACACGGTCCTCAA 13
4 DFP-0207-22 ACACGGTCCTCAA 13
5 Q-β-13 TGTGCCAGGAGTT 13
6 IMB-0125-2 TGTGCCAGGAGTT 13
7 DFP-0208-10 TGTGCCAGGAGTT 13
8 Warfarin-W-4 AACACGGTCCTC 12
9 3730-M1-2 ATGTGTGGGT 10
10 HCV(G1)-1 CCAGGACGAC 10
11 HCV(G2)-8 TAAACCCACTCTATG 15
12 HCV(G1)-5 GGTCCTGCTG 10
13 HCV(G2)-16 ATTTGGGTGAGATAC 15
본 발명은 상기의 조성물을 포함하는 C형 간염바이러스 유전자 1형 및 유전자 2형 동시 감별용 키트를 제공한다. 이러한 키트는 서열번호 18 및 19의 서열을 가지는 프라이머 세트를 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 상기의 조성물 또는 그러한 조성물을 포함하는 키트를 이용한 C형 간염바이러스 유전자 1형 및 유전자 2형 동시 감별 방법을 제공한다. 상기 감별방법은 제 1형 및 제 2형 유전자의 표적핵산 증폭을 위한 프라이머 세트 제작단계, 표적핵산에 특이적인 프로브 제작단계 및 이들을 이용하여 실시간 다중중합효소 반응을 수행하는 단계를 포함할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 아래의 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위는 실시예에 한정되는 것이 아님은 명확한 것이다.
[ 실시예 1] PNA 프로브의 설계 및 제작
본 발명의 PNA 프로브(제1 프로브)는 C형 간염바이러스의 5’-UTR 지역에서 HCV 유전자 1형과 유전자 2형에 각각 특이적으로 결합할 수 있도록 제작되었다 (서열번호 10 및 11). 또한 서열번호 10 및 서열번호 11에 평행결합하는 제 2프로브를 각각 제작하였다(서열번호 12 및 서열번호 13). 또한 와파린 대사관련 유전자인 CYP2C9 430 및 VKORC1 3730 야생형 유전자와 단일염기서열변이체 유전자에 각각 완벽하게 결합할 수 있도록 설계 및 제작되었다.
본 발명의 PNA 프로브는 표 3에 기재한 서열번호 1 내지 13 중 어느 하나의 염기서열로 구성될 수 있다(표 4 참조). 상기 염기서열로부터 당업자가 통상의 지식을 이용하여 용이하게 변형할 수 있는 범위 내의 PNA 프로브 서열은 모두 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 보아야 할 것이다. 평행 결합을 할 수 있는 PNA 프로브 시스템으로서 본 발명에 따른 PNA 실시간 PCR을 이용하여 표적 뉴클레오타이드를 검출해 낼 수 있는 것인 한, 본 발명의 권리범위 내에 포함되는 것이다.
본 발명에서 사용한 PNA 프로브의 특성
프로브
번호		 서열이름 서열 (N' -> C') 서열
길이
프로브 1 IMB-3 FAM-O- AC ACGGTCCTC AA -O-K-Dabcyl 13
프로브 2 IMB-1 FAM-O-ACACGGTCCTCAA-O-K-Dabcyl 13
프로브 3 DFP-0207-26 FAM-ACACGGTCCTCAA-K-Dabcyl 13
프로브 4 DFP-0207-22 FAM-KK-ACACGGTCCTCAA-KK-K-Dabcyl 13
프로브 5 Q-β-13 Dabcyl-O-TGTGCCAGGAGTT 13
프로브 6 IMB-0125-2 Dabcyl-KK-TGTGCCAGGAGTT-KK-K-FAM 13
프로브 7 DFP-0208-10 Dabcyl-TGTGCCAGGAGTT-K-Dabcyl 13
프로브 8 Warfarin-W-4 FAM-O-AACACGGTCCTC-O-Dabcyl 12
프로브 9 3730-M1-2 Texas red-O-ATGTGTGGGT-O-Dabcyl 10
프로브 10 HCV(G1)-1 Dabcyl-CCAGGACGAC-O-K-Cy5 10
프로브 11 HCV(G2)-8 Dabcyl-TAAACCCACTCTATG-O-K-Texas red 15
프로브 12 HCV(G1)-5 GGTCCTGCTG-K-Dabcyl 10
프로브 13 HCV(G2)-16 ATTTGGGTGAGATAC-K-Dabcyl 15
상기 표 4에서 O는 링커, 굵은 글씨체 및 밑줄로 표시된 문자는 γ-라이신(lysine) 또는 γ-글루탐산(glutamic acid)-PNA 모노머(monomer), K는 라이신(lysine)을 의미한다.
PNA 프로브는 한국등록특허 제 464,261호에 기재된 방법에 따라 PNA 올리고머를 벤조티아졸설포닐(Bts : Benzothiazolesulfonyl)기로 보호된 PNA 단량체와 기능화된 레진으로부터 고체상 합성법(solid phase synthesis)으로 합성하였다[Lee et al., Org. Lett., 2007, 9, 3291-3293]. 이 방법 이외에도 알려진 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc : 9-flourenylmethloxycarbonyl) 또는 t-Boc(tbutoxycarbonyl) 합성법을 사용하여 PNA를 합성할 수도 있다[Kim L. et al., J. Org. Chem. 59, 5767-5773, 1994; Stephen A. et al., Tetrahedron, 51, 6179-6194, 1995]. 리포터 물질 및 소광 물질은 당업계에 널리 공지된 방법에 따라 PNA 프로브에 표지하였다.
[ 실시예 2]: CYP2C9 430, VKORC1 3730 및 HCV 유전자 1형, 유전자 2형의 표적핵산을 증폭하기 위한 프라이머 합성 및 사용
본 발명에서는 와파린 대사관련 유전자 CYP2C9 430, VKORC1 3730 및 C형 간염바이러스의 5‘-UTR 지역에서 HCV 유전자 1형과 유전자 2형의 표적핵산 증폭을 위하여 각 유전자의 부위를 분석하여 특이적인 증폭이 이루어지도록 프라이머를 제작하였다. CYP2C9 430 유전자 확인을 위하여 서열번호 14, 15 프라이머 세트와 VKORC1 3730 유전자 확인을 위하여 서열번호 16, 17 프라이머 세트를 디자인 하였다. 또한 HCV 유전자 1형과 유전자 2형의 확인을 위하여 서열번호 18, 19 프라이머 세트를 디자인하였다. 디자인된 프라이머는 ㈜바이오니아(한국)에 합성 의뢰하여 사용하였다.
본 발명에서 사용한 프라이머의 서열 및 특성
서열
번호		 대상유전자 서열 (5’ -> 3’) 방향 길이
14 CYP2C9 GCTGCGGAATTTTGGGATGG 정방향 20
15 CYP2C9 AGTAAGGTCAGTGATATGGAGTAGGG 역방향 26
16 VKORC1-F GATGTGGGGCTTCTAGATTACC 정방향 22
17 VKORC1-R TGTAAAAAAGAGCGAGCGTGTG 역방향 22
18 HCV-F3 AGCCATAGTGGTCTGCGGAA 정방향 20
19 HCV-R2 AGTACCACAAGGCCTTTCGC 역방향 20
20 2C9430-F GAAGCCTGTGTGGCTGAATA 정방향 20
21 2C9430-R CCATTCCCACCATGTTGACT 역방향 20
22 VKORC1-3F GCAAGGCTAAGAGGCACTGA 정방향 20
23 VKORC1-3R ACCACAGTCCATGGCAGAC 역방향 19
24 HCV-F1 CACTCCCCTGTGAGGAACT 정방향 19
25 HCV-R1 CCCTATCAGGCAGTACC 역방향 17
[ 실시예 3] 와파린 대사관련 유전자 CYP2C9 430 및 VKORC1 3730 클론 확보
CYP2C9 430 및 VKORC1 3730의 클론 확보를 위하여 각각 서열번호 20, 21번의 조합, 22, 23번의 조합으로 증폭산물을 LabopassTM PCR 정제 키트(코스모진텍, 한국)을 사용하여 정제한 다음, pGEM-T 이지 벡터(프로메가, 미국)에 결합시키고 대장균(E.coli) JM109세포에 형질 전환하여 DNA를 대량 확보하였다. 단일 염기 서열 변이체를 확보하기 위하여 상기의 방법으로 제조된 정상 클론을 이용하고 부위 특이적 돌연변이유발 키트(스트라타진, 미국)를 사용하여 변이 유전자를 가진 클론을 확보하고 염기서열 분석으로 변이 여부를 확인하였다. 유전자형이 확인된 클론은 본 발명의 유전자 증폭 시에 표준물질로 사용하였다.
[ 실시예 4] HCV 5’- UTR 영역에서 HCV 유전자 1형, 유전자 2형의 클론 확보
표적 핵산을 위한 클론을 확보하기 위하여 HCV RNA Genotype Performance Panel PHW202(BBI DIAGNOSTICS, 미국)을 구매하였다. 구매한 HCV RNA Genotype Performance Panel PHW202로부터 InstaGene Matrix(바이오라드, 미국)를 이용하여 RNA를 추출하였고, 서열번호 24, 25번의 조합으로 각각 HCV 유전자 1형, 유전자 2형의 5’-UTR 영역을 증폭하였다. 증폭산물을 LabopassTM PCR 정제 키트(코스모진텍, 한국)을 사용하여 정제한 다음, pGEM-T 이지벡터(프로메가, 미국)에 결합시키고 대장균(E. coli) JM109에 형질 전환하여 DNA를 대량 확보하였다.
[ 실시예 5] 실시간 PCR 반응
상기의 실시예 3, 4의 방법으로 확보된 클론을 사용하여 PNA 프로브를 사용한 실시간 검출 방법을 확립하였다. 주형 DNA(105 copies/㎕) 2 ㎕, 제 1 프로브 (5 pmoles/㎕)와 제 2 프로브 (10 pmoles/㎕)의 혼합 용액 10 ㎕, 프라이머 세트(서열번호 14, 15 세트 또는 16, 17 세트 또는 18, 19 세트, 정방향 프라이머 50 pmoles/㎕, 역방향 프라이머 6.25 pmoles/㎕) 2 ㎕, 10X Taq 중합효소 완충용액(솔젠트, 한국) 5 ㎕, 10mM dNTP 혼합용액(솔젠트, 한국) 1 ㎕, Taq 중합효소 (5 U/㎕, 솔젠트, 한국) 0.4 ㎕, 증류수 27.6 ㎕를 혼합한 뒤 실시간 유전자증폭기(Real-time PCR machine, CFX96TM Real-time PCR System, 바이오라드, 미국)를 이용하여 95℃ 에서 3분 동안 반응 후, 95℃ 10초, 그리고 프라이머와 함께 제 1 프로브 및 제 2 프로브가 혼성화 되도록 60℃ 30초, 72℃ 15초 반응과정을 반복하였다. 형광 세기는 60℃ 혼성화 반응 뒤에 측정하였다.
[ 실시예 6] 평행 결합 PNA 기반 실시간 PCR 프로브의 안정성
제 1 프로브(서열번호 2)와 제 2 프로브(서열번호 5)의 보관 안정성을 시험하기 위하여, 상기 실시예 5의 방법대로 제 1 프로브와 제 2 프로브 혼합 용액을 각각 이용하여 실시간 검출 PCR을 수행하였고, 6 개월간 상온에 보관한 뒤에 동일한 방법으로 실시간 검출 PCR을 수행하고 그 효과를 비교하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다. 그 결과 상온에서 6개월간 보관하여도 형광 세기가 감소하지 않음을 확인하였다.
[ 실시예 7] 제 2 프로브에 추가 리포터 물질 도입을 통한 신호세기 증가
제 1 프로브뿐만 아니라 제 2 프로브에도 리포터 물질을 도입한 경우의 형광 세기의 변화를 측정하기 위하여 서열번호 4의 제 1 프로브와 서열번호 6의 제 2 프로브 혼합 용액을 사용하고 상기 실시예 5의 방법을 이용하여 실시간 검출 PCR을 수행하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다. 제 2 프로브에 리포터 물질을 도입한 경우, 제 1 프로브에만 리포터 물질을 도입한 경우에 비해 형광 세기가 약 50% 증가함을 확인할 수 있었다.
[ 실시예 8] 제 1 프로브의 단일염기서열변이 검출에 대한 민감도 확인 및 정량법 적용 가능성 확인
제 1 PNA 프로브(서열번호 1)과 제 2 PNA 프로브(서열번호 5)를 이용하여 단일염기서열변이 검출에 대한 민감도 및 정량법 적용 가능성을 확인하기 위한 테스트를 실시하였다. CYP2C9 430 야생형과 단일 염기서열 변이체 클론을 각각 109 copies/㎕에서 101 copies/㎕까지 10배씩 순차적으로 희석하여 검출 한계를 측정하였으며, 101 copies/㎕까지 검출이 가능함을 확인하였다. 또한 단일염기서열변이 유전자의 카피(copy) 수에 따른 Ct(cycle threshold) 사이의 상관관계를 분석한 결과 표준물질의 농도가 감소함에 따라 검출 Ct 값이 증가함을 나타내어 본 발명은 핵산의 정량에도 적용할 수 있음을 확인하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
[ 실시예 9] 제 1 프로브의 표적 뉴클레오타이드 검출에 대한 민감도 확인 및 정량법 적용 가능성 확인
제 1 PNA 프로브(서열번호 10, 12)와 제 2 PNA 프로브(서열번호 11, 13)을 이용하여 표적 뉴클레오타이드 검출에 대한 민감도 및 정량법 적용 가능성을 확인하기 위한 테스트를 실시하였다. HCV 유전자 1형 및 유전자 2형 클론을 각각 108 copies/㎕에서 101 copies/㎕ 까지 10배씩 순차적으로 희석하여 검출 한계를 측정하였으며, 101 copies/㎕까지 검출이 가능함을 확인하였다. 또한 표적 뉴클레오타이드의 카피 수에 따른 Ct 사이의 상관관계를 분석한 결과, 표준물질의 농도가 감소함에 따라 검출 Ct 값이 증가함을 보이므로, 본 발명은 핵산의 정량에도 적용할 수 있음을 확인하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
[ 실시예 10] PNA 프로브 및 DNA 프로브의 단일염기서열변이 검출능 비교
PNA 프로브와 마찬가지로 DNA 프로브(태크만 프로브)을 이용할 경우 단일염기서열변이의 검출이 가능한지를 확인하기 위하여 서열번호 26 및 27의 와파린 대사관련 유전자 CYP2C9 430, VKORC1 3730의 단일염기서열변이 검출용 DNA 프로브를㈜ 바이오니아(한국)에 합성 의뢰하여 사용하였으며(표 5 참조). 이에 상응하는 PNA 프로브는 서열번호 8, 9를 사용하였다. 각 프로브를 이용하여 단일염기서열변이 검출능을 비교한 결과를 도 8에 나타내었다. 두 가지 표적 유전자 검출용 DNA 프로브는 모두 단일염기서열변이를 검출하지 못한 반면, PNA 프로브는 서로 다른 두 가지 표적 유전자의 단일염기서열변이를 확실하게 검출할 수 있었다.
본 발명에서 사용한 DNA 프로브의 서열 및 특성
서열
번호		 이름 서열 (5’ -> 3’) 서열
길이
26 CYP2C9-430W FAM-CCTCTTGAACACGGTCCTCAATGCT-Dabcyl 25
27 VKORC1-3730M FAM-CATTGTCATGTGTGGGTATGGCAGG-Dabcyl 25
상기 표 6에서 굵은 글씨체는 단일 염기서열 변이 위치를 나타낸다.
[ 실시예 11] 서로 다른 리포터 물질을 사용한 HCV 유전자 1형과 HCV 유전자 2형의 동시검출 방법
서로 다른 리포터 물질을 표지한 PNA 프로브를 이용하여 서로 다른 두 종류의 표적 핵산을 동시에 검출할 수 있는지를 확인하였다.
서열번호 10 및 12에 따른 HCV 유전자 1형 특이적 PNA 프로브와 서열번호 11 및 13에 따른 HCV 유전자 2형 특이적 PNA 프로브를 이용하여, HCV 유전자 1형과 2형을 각각 특이적으로 동시에 검출하였고, 그 결과는 도 9에 나타내었다.
[ 실시예 12] 단일염기서열변이에 대한 검출 특이성 확인
제 1 프로브와 제 2 프로브를 혼합하여 사용할 경우 단일염기서열변이에 대한 검출 특이성을 높일 수 있음을 확인하기 위하여 와파린 대사관련 유전자 CYP2C9 430을 타겟 유전자로 한 제 1 프로브(서열번호 3), 제 2 프로브(서열번호 7)을 이용하여 상기 실시예 5의 방법대로 실시간 PCR 반응을 수행한 뒤, 25℃부터 95℃까지 0.5℃씩 상승시키며 형광을 측정하는 용융곡선 분석을 수행하였다. 그 결과는 도 10에 나타내었다. 제 2 프로브를 함께 사용한 경우와 그렇지 않은 경우 모두 야생형에 대한 용융온도에는 변화가 없었다. 하지만 제 2 프로브를 함께 혼합한 경우 단일염기서열변이에 대한 용융 온도가 4~6℃ 가량 하강하는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 단일염기서열변이에 대한 용융 온도 하강으로 인하여 제 2 프로브를 함께 사용한 경우 단일염기서열변이에 대한 검출 특이성이 향상되는 결과를 확인 되었다.
<110> Panagene Inc. <120> Composition for detecting Hepatitis C Virus(HCV) genotypes comprising parallel binding structured PNA probe system and detection method using thereof <130> P12080231001 <160> 27 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMB-3 (probe) <400> 1 acacggtcct caa 13 <210> 2 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMB-1 (probe) <400> 2 acacggtcct caa 13 <210> 3 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DFP-0207-26 (probe) <400> 3 acacggtcct caa 13 <210> 4 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DFP-0207-22 (probe) <400> 4 acacggtcct caa 13 <210> 5 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Q-beta-13 (probe) <400> 5 tgtgccagga gtt 13 <210> 6 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMB-0125-2 (probe) <400> 6 tgtgccagga gtt 13 <210> 7 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DFP-0208-10 (probe) <400> 7 tgtgccagga gtt 13 <210> 8 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Warfarin-W-4 (probe) <400> 8 aacacggtcc tc 12 <210> 9 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3730-M1-2 (probe) <400> 9 atgtgtgggt 10 <210> 10 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV(G1)-1 (probe) <400> 10 ccaggacgac 10 <210> 11 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV(G2)-8 (probe) <400> 11 taaacccact ctatg 15 <210> 12 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV(G1)-5 (probe) <400> 12 ggtcctgctg 10 <210> 13 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV(G2)-16 (probe) <400> 13 atttgggtga gatac 15 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2C9 (forward primer) <400> 14 gctgcggaat tttgggatgg 20 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2C9 (reverse primer) <400> 15 agtaaggtca gtgatatgga gtaggg 26 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VKORC1-F (forward primer) <400> 16 gatgtggggc ttctagatta cc 22 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VKORC1-R (reverse primer) <400> 17 tgtaaaaaag agcgagcgtg tg 22 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV-F3 (forward primer) <400> 18 agccatagtg gtctgcggaa 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV-R2 (reverse primer) <400> 19 agtaccacaa ggcctttcgc 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2C9430-F (forward primer) <400> 20 gaagcctgtg tggctgaata 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2C9430-R (reverse primer) <400> 21 ccattcccac catgttgact 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VKORC1-3F (forward primer) <400> 22 gcaaggctaa gaggcactga 20 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VKORC1-3R (reverse primer) <400> 23 accacagtcc atggcagac 19 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV-F1 (forward primer) <400> 24 cactcccctg tgaggaact 19 <210> 25 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV-R1 (forward primer) <400> 25 ccctatcagg cagtacc 17 <210> 26 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2C9-430W (probe) <400> 26 cctcttgaac acggtcctca atgct 25 <210> 27 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VKORC1-3730M (probe) <400> 27 cattgtcatg tgtgggtatg gcagg 25

Claims (11)

  1. C형 간염바이러스 유전자 1형에 특이적으로 결합하는 PNA 프로브 및 이와 평행 결합하는 PNA 프로브; 및
    C형 간염바이러스 유전자 2형에 특이적으로 결합하는 PNA 프로브 및 이와 평행 결합하는 PNA 프로브;를 포함하고,
    상기 각 PNA 프로브는 리포터 물질(reporter molecule) 및 소광물질(quencher molecule)에서 선택된 하나 이상의 물질을 포함하고,
    상기 C형 간염바이러스 유전자 1형에 특이적으로 결합하는 PNA 프로브와 평행 결합하는 PNA 프로브는,
    i) 상기 C형 간염바이러스 유전자 1형에 특이적으로 결합하는 PNA 프로브가 리포터 물질을 포함하는 경우 소광물질을 포함하고,
    ii) 상기 C형 간염바이러스 유전자 1형에 특이적으로 결합하는 PNA 프로브가 소광물질을 포함하는 경우 리포터 물질을 포함하고,
    상기 C형 간염바이러스 유전자 2형에 특이적으로 결합하는 PNA 프로브와 평행 결합하는 PNA 프로브는,
    i) 상기 C형 간염바이러스 유전자 2형에 특이적으로 결합하는 PNA 프로브가 리포터 물질을 포함하는 경우 소광물질을 포함하고,
    ii) 상기 C형 간염바이러스 유전자 2형에 특이적으로 결합하는 PNA 프로브가 소광물질을 포함하는 경우 리포터 물질을 포함하는,
    C형 간염바이러스 유전자 1형 및 유전자 2형 동시 감별용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 C형 간염바이러스 유전자 1형에 특이적으로 결합하는 PNA 프로브는 서열번호 10의 서열을 포함하고, 상기 C형 간염바이러스 유전자 2형에 특이적으로 결합하는 PNA 프로브는 서열번호 11의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 C형 간염바이러스 유전자 1형에 특이적 PNA 프로브 및 이와 평행 결합하는 PNA 프로브는 서열번호 10 및 서열번호 12의 서열을 포함하고,
    상기 C형 간염바이러스 유전자 2형에 특이적 PNA 프로브 및 이와 평행 결합하는 PNA 프로브는 서열 번호 11 및 서열번호 13의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    상기 각 PNA 프로브는 하나 이상의 말단에 물성조절 부위를 더 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 PNA 프로브 말단에 결합되어 있는 물성조절 부위는 친수성 잔기, 소수성 잔기, 이온성 잔기 및 수소 결합 잔기로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물.
  6. 삭제
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 리포터 물질 또는 소광물질은 PNA 말단에 직접 결합되거나, PNA 말단에연결된 물성조절 부위를 통해 결합된 것임을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 리포터 물질은 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), FAM, JOE, ROX, HEX, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 염료로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 형광물질임을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 소광물질은 답실(Dabcyl), TAMRA, Eclipse, DDQ, QSY, 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 블랙홀 퀸처(Black Hole Quencher), Qxl, 아이오와 블랙(Iowa black) FQ, 아이오와 블랙 RQ 및 IRDye QC-1로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상임을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 하나의 항에 따른 조성물을 포함하는 C형 간염바이러스 유전자 1형 및 유전자 2형 동시 감별용 키트.
  11. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 하나의 항에 따른 조성물, 또는 그러한 조성물을 포함하는 키트를 이용한 C형 간염바이러스 유전자 1형 및 유전자 2형 동시 감별 방법.
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