JP2019205437A - 標的核酸を検出する方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】標的核酸を検出する方法の提供。【解決手段】（１）第一の核酸プローブと試料とを混合し、混合液を調製する工程と、（２）前記混合液の蛍光強度を測定する工程と、（３）前記蛍光強度に基づき、前記標的核酸を検出する工程と、を備える標的核酸を検出する方法の提供。【選択図】図１

Description

本発明は、標的核酸を検出する方法に関する。
核酸の検出方法の一つとして、蛍光標識プローブ法が挙げられる（下記、特許文献１を参照）。この方法に用いるプローブには、例えば、蛍光色素及び蛍光色素による蛍光を消光させる作用（「消光作用」ともいう）を有する消光分子が、隣接するように結合された１本鎖のオリゴヌクレオチドを備える核酸プローブがある。この核酸プローブは、標的である核酸（以下、「標的核酸」という）にハイブリダイズするように設計されている。ポリメラーゼ連鎖反応（以下、「ＰＣＲ」ともいう）において、標的核酸に上記核酸プローブがハイブリダイズし、さらに、核酸プローブがヌクレアーゼ活性を持つポリメラーゼにより分解されると、蛍光色素から消光分子が離れるため、蛍光色素の蛍光強度が増加する。上記１本鎖オリゴヌクレオチドを有する核酸プローブを用いる方法では、核酸プローブの分解前後における蛍光強度又は蛍光波長の変化により、標的核酸を検出する。
蛍光標識プローブ法に用いられるプローブには、また、長さの異なる２本のオリゴヌクレオチドを有する核酸プローブがある（下記、特許文献２−３を参照）。この核酸プローブでは、２本のオリゴヌクレオチドが互いに相補的な塩基配列を有しており、一方のオリゴヌクレオチドには蛍光色素が結合され、もう一方のオリゴヌクレオチドには蛍光色素による蛍光を消光させる作用を有する消光分子が結合されている。ＰＣＲにおいて、高温にすると、上記２本のオリゴヌクレオチドは分離する。これに伴い、蛍光色素から消光分子が離れるため、蛍光強度が増加する。続いて、温度を下げると、長い方のオリゴヌクレオチドが標的核酸にハイブリダイズし、蛍光色素による蛍光が観測され続ける。一方、標的核酸が存在しない場合には、温度を下げると、上記２本のオリゴヌクレオチドが互いにハイブリダイズし、蛍光色素に消光分子が近接するため、蛍光色素による蛍光が消光する。上記２本のオリゴヌクレオチドを有する核酸プローブを用いる方法では、ＰＣＲのアニーリング段階における蛍光強度を測定することにより、標的核酸を検出する。
蛍光標識プローブ法に用いられるプローブには、また、グアニン塩基に近接すると蛍光強度が減少する（「消光」ともいう）蛍光色素で標識されたＱｕｅｎｃｈｉｎｇ Ｐｒｏｂｅ（以下、「ＱＰｒｏｂｅ」という）がある（下記、特許文献４を参照）。このＱＰｒｏｂｅは、上記蛍光色素が結合したシトシン塩基を末端に有しており、ＱＰｒｏｂｅが標的核酸にハイブリダイズすると、シトシン塩基が標的核酸中のグアニン塩基と塩基対を形成し、蛍光色素の近傍にグアニン塩基が配置されるよう設計されている。そのため、ＱＰｒｏｂｅが標的核酸にハイブリダイズすると、蛍光色素はグアニン塩基の近傍に配置されるため消光する。ＱＰｒｏｂｅを用いる核酸の検出方法では、ハイブリダイズ前後における蛍光強度の減少量により標的核酸を定量する。
特表平６−５０００２１号公報 特開平１０−２６２７００号公報 特表２００４−５１１２２７号公報 特開２００１−２８６３００号公報
しかしながら、特許文献１−３に記載の核酸プローブを用いて標的核酸を検出するためには、検出などに高価な精密機器を必要とし、費用がかかる。さらに、特許文献１−３に記載の核酸プローブを用いた標的核酸の検出は工程数が多く複雑であり、検出に熟練を要する。
また、本発明者らの検討によれば、ＱＰｒｏｂｅであっても、標的核酸を高感度に検出することが困難となる場合が生じるなど、感度の観点で更なる改善の余地があることが判明した。
つまり、ＱＰｒｏｂｅは、蛍光色素が結合したシトシン塩基から１〜７塩基以内にグアニン塩基が存在すると、当該グアニン塩基との相互作用により蛍光色素の蛍光強度が低下する。すなわち、ＱＰｒｏｂｅが標的核酸にハイブリダイズしなくても、蛍光色素の蛍光強度が低下する。これにより、ハイブリダイズ前後における蛍光色素の蛍光強度の減少率が小さくなり、感度の低下を招く。
したがって、ＱＰｒｏｂｅの設計の際に、核酸プローブが標的核酸にハイブリダイズする領域（以下、「プローブ結合領域」という）には、ＱＰｒｏｂｅをハイブリダイズさせるのに適した領域、すなわち、高感度を保つために、蛍光色素が結合したシトシン塩基に対向するグアニン塩基から１〜７塩基以内に、シトシン塩基が存在しない領域を選定せざるを得ない。
本発明は、このような実情に鑑みてなされたものであり、プローブ結合領域を自由に選定し、かつ高感度な検出を達成できる手段を提供することを目的とする。より具体的には、本発明は、標的核酸のプローブ結合領域において、プローブ上の蛍光色素が結合したシトシン塩基に対向するグアニン塩基から１〜７塩基以内にシトシン塩基が存在する場合であっても、感度に優れる核酸プローブを提供することを目的とする。本発明はまた、上記核酸プローブを用いた標的核酸を検出する方法を提供することを目的とする。
上記課題を解決するために、本発明は、標的核酸を検出する第一の核酸プローブであって、前記標的核酸は、前記第一の核酸プローブがハイブリダイズするプローブ結合領域を備え、前記プローブ結合領域の少なくとも一方の末端がグアニン塩基であり、かつ、前記グアニン塩基から１〜７塩基以内の前記プローブ結合領域にシトシン塩基が１つ以上存在し、前記第一の核酸プローブは、前記グアニン塩基に対向するシトシン塩基を末端に有するオリゴヌクレオチドと、該シトシン塩基に結合された蛍光色素と、を備え、前記蛍光色素は、グアニン塩基との相互作用により消光する蛍光色素であり、前記オリゴヌクレオチドは、前記末端グアニン塩基から１〜７塩基以内に存在するシトシン塩基を除いて前記プローブ結合領域の核酸と相補的であり、該シトシン塩基に対向する前記オリゴヌクレオチド上の塩基はグアニン塩基又は蛍光の消光作用を持たない塩基であり、ただし、該シトシン塩基のうち前記末端グアニン塩基に最も近接するシトシン塩基に対向する前記オリゴヌクレオチド上の塩基は蛍光の消光作用を持たない塩基である、第一の核酸プローブを提供する。
第一の核酸プローブにおいて、蛍光の消光作用を持たない塩基は、ヒポキサンチン、アデニン、チミン、シトシン及びネブラリンから選ばれるいずれかの塩基であることが好ましく、ヒポキサンチン塩基であることがより好ましい。
本発明はまた、標的核酸を検出する方法であって、第一の核酸プローブと試料とを混合し、混合液を調製する工程と、前記混合液の蛍光強度を測定する工程と、前記蛍光強度に基づき、前記標的核酸を検出する工程と、を備える方法を提供する。
上記標的核酸を検出する方法において、検出は融解曲線分析によって行われてもよい。
本発明はまた、標的核酸を検出する方法であって、上記第二の核酸プローブと被検核酸を含む試料とを混合し、混合液を調製する工程と、前記混合液に含まれる被検核酸を鋳型として核酸増幅反応を行い、増幅産物を得る工程とを備える方法を提供する。前記増幅反応は、変性段階、アニーリング段階及び伸長段階を反復するサイクルを含むポリメラーゼ連鎖反応である。前記アニーリング段階において、前記混合液の蛍光強度を測定する工程と、前記蛍光強度に基づき、前記標的核酸を検出する工程と、を備える。
本発明はまた、標的核酸を検出する第二の核酸プローブであって、前記標的核酸は、前記第二の核酸プローブがハイブリダイズするプローブ結合領域を備え、前記プローブ結合領域の少なくとも一方の末端がグアニン塩基であり、かつ、前記グアニン塩基から１〜７塩基以内の前記プローブ結合領域に一塩基多型が１つ以上存在し、前記第二の核酸プローブは、前記グアニン塩基に対向するシトシン塩基を末端に有するオリゴヌクレオチドと、該シトシン塩基に結合された蛍光色素と、を備え、前記蛍光色素は、グアニン塩基との相互作用により消光する蛍光色素であり、前記オリゴヌクレオチドは、前記末端グアニン塩基から１〜７塩基以内に存在する一塩基多型を除いて前記プローブ結合領域の核酸と相補的であり、該一塩基多型に対向する前記オリゴヌクレオチド上の塩基はグアニン塩基又は蛍光の消光作用を持たない塩基であり、ただし、該一塩基多型のうち前記末端グアニン塩基に最も近接する一塩基多型に対向する前記オリゴヌクレオチド上の塩基は蛍光の消光作用を持たない塩基である、第二の核酸プローブを提供する。
第二の核酸プローブにおいて、蛍光の消光作用を持たない塩基は、ヒポキサンチン、アデニン、チミン、シトシン及びネブラリンから選ばれるいずれかの塩基であることが好ましく、ヒポキサンチン塩基であることがより好ましい。
本発明はまた、標的核酸を検出する方法であって、第二の核酸プローブと試料とを混合し、混合液を調製する工程と、前記混合液の蛍光強度を測定する工程と、前記蛍光強度に基づき、前記標的核酸を検出する工程と、を備える方法を提供する。この検出は、融解曲線分析によって行われてもよく、融解曲線分析によって一塩基多型を検出可能である。
上記試料は、被検核酸を鋳型とした核酸増幅反応により得られる増幅産物を含んでよい。
本発明によれば、標的核酸のプローブ結合領域の少なくとも一方の末端がグアニン塩基であれば、プローブ結合領域は特に制限なく選定されることができ、かつ高感度な検出を達成できるＱＰｒｏｂｅを設計することが可能となる。具体的には、標的核酸のプローブ結合領域に、プローブ上の蛍光色素が結合したシトシン塩基に対向するグアニン塩基から１〜７塩基以内にシトシン塩基が存在する場合であっても、感度に優れる核酸プローブ（第一の核酸プローブ）を本発明は提供することができる。
本発明によれば、また、上記核酸プローブ（第一の核酸プローブ）を用いた標的核酸の検出方法を提供することができる。
本発明によれば、また、一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＳＮＰ）を検出可能な核酸プローブ（第二の核酸プローブ）を提供することができる。
本発明によれば、また、上記核酸プローブ（第二の核酸プローブ）を用いた標的核酸の検出方法を提供することができる。
図１は、本発明の第一の核酸プローブによる核酸検出のメカニズムを表す模式図である。 図２は、オリゴヌクレオチドの末端に存在するシトシン塩基に隣接するグアニン塩基を、ヒポキサンチン塩基に置換した塩基配列を有する、核酸プローブを用いて行った融解曲線分析の結果を示す。 図３は、オリゴヌクレオチドの末端に存在するシトシン塩基に隣接するグアニン塩基を、チミン塩基等の他塩基に置換した塩基配列を有する、核酸プローブを用いて行った融解曲線分析の結果を示す。 図４は、ヒポキサンチン塩基に置換するグアニン塩基と、蛍光色素を結合させたシトシン塩基との距離を段階的に変えたプローブを用いて行った融解曲線分析の結果を示す。 図５は、蛍光色素を結合させたシトシン塩基から１〜７塩基以内に存在する、複数のグアニン塩基をヒポキサンチン塩基に置換したプローブを用いて行った融解曲線分析の結果を示す。 図６は、ＬＡＭＰ法によるMycoplasma pneumoniaeの検出の結果を示す。 図７は、ＰＣＲ法及び融解曲線分析によるヒト型結核菌の検出の結果を示す。 図８は、一塩基多型（ＳＮＰ）の検出の結果を示す。 図９は、ＳＮＰの位置を段階的に変えた標的核酸の検出の結果を示す。
以下、場合により図面を参照しながら、本発明の好適な実施形態を説明する。
本発明でいう「標的核酸」とは、本実施形態に記載のプローブを用いて検出する対象となる核酸のことをいう。
本発明でいう「相補的」とは、アデニン塩基とチミン塩基、グアニン塩基とシトシン塩基のそれぞれが対となり、水素結合を形成できるという意味である。
本発明でいう「一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＳＮＰ）」とは、塩基配列上の一塩基の置換によって起きる多型のことである。
本発明でいう「完全マッチ」とは、標的核酸が有するプローブ結合領域の塩基配列に対して、プローブが有するオリゴヌクレオチドの塩基配列が、すべて相補的であり、標的核酸が有するプローブ結合領域とプローブが有するオリゴヌクレオチドがハイブリダイズすることをいう。
一方、本発明でいう「ミスマッチ」とは、標的核酸が有するプローブ結合領域の塩基配列に対して、プローブが有するオリゴヌクレオチドの塩基配列が、１塩基でも相補的でないため、標的核酸が有するプローブ結合領域とプローブが有するオリゴヌクレオチドがハイブリダイズできないこと、又は、「完全マッチ」と比較して、より低い融解温度を有することをいう。
ここでいう「融解温度」とは、二本鎖核酸の５０％が変性して一本鎖となる温度をいう。
標的核酸の由来は特に制限されることなく、例えば、動物、植物、菌類、微生物又はウイルス由来の核酸を対象とし得る。
本実施形態における核酸は、ＤＮＡ及びＲＮＡの天然に存在する核酸であってもよく、Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）及びＰｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＰＮＡ）などの人工核酸であってもよい。
本実施形態における標的核酸は、第一の核酸プローブがハイブリダイズするプローブ結合領域を備える。
上記標的核酸のプローブ結合領域の少なくとも一方の末端（５’末端でも３’末端でもよい）は、グアニン塩基である。
上記標的核酸のプローブ結合領域の末端に位置するグアニン塩基から１〜７塩基以内の上記プローブ結合領域にシトシン塩基が１つ以上存在する。このシトシン塩基に対向するグアニン塩基を蛍光の消光作用を持たない塩基に置換したときに、本実施形態における第一の核酸プローブの感度がより優れる観点から、シトシン塩基は、プローブ結合領域の末端に位置するグアニン塩基から５塩基以内に存在してよく、３塩基以内に存在してよく、上記末端グアニン塩基に隣接する塩基がシトシン塩基であってよい。
本実施形態における第一の核酸プローブは、上記プローブ結合領域の末端に位置するグアニン塩基に対向するシトシン塩基を、末端に有するオリゴヌクレオチドと、該シトシン塩基に結合され、グアニン塩基により消光する蛍光色素と、を備える。
上記第一の核酸プローブが有するオリゴヌクレオチドは、上記プローブ結合領域の末端に位置するグアニン塩基から１〜７塩基以内に存在するシトシン塩基を除いて、上記プローブ結合領域の核酸と完全に相補的である。該シトシン塩基に対向する前記オリゴヌクレオチド上の塩基は、グアニン塩基又は蛍光の消光作用を持たない塩基である。ただし、該シトシン塩基のうち上記プローブ結合領域の末端に位置するグアニン塩基の最も近くに位置するシトシン塩基に対向する、上記オリゴヌクレオチド上の塩基は、蛍光の消光作用を持たない塩基である。
末端のシトシン塩基から１〜７塩基以内に、グアニン塩基が２つ以上存在する場合、末端のシトシン塩基の最も近くに位置するグアニン塩基以外は、蛍光の消光作用を持たない塩基に置換してもよく、置換しなくともよい。第一の核酸プローブの感度をより高める観点からは、末端のシトシン塩基から１〜７塩基以内に存在するグアニン塩基のうち、２塩基以上を蛍光の消光作用を持たない塩基に置換することが好ましい。
本発明でいう「蛍光の消光作用を持たない塩基」とは、グアニン塩基との相互作用により消光する蛍光色素の近くに位置したときに、この蛍光色素の蛍光が消光しない塩基又は、グアニン塩基と比べて、蛍光色素の蛍光強度の減少量が小さい塩基のことをいう。
上記蛍光の消光作用を持たない塩基は、感度に優れる観点から、ヒポキサンチン、アデニン、チミン、シトシン及びネブラリンから選ばれるいずれかの塩基であることが好ましい。さらに、上記蛍光の消光作用を持たない塩基は、ヒポキサンチン塩基であることがより好ましい。ヒポキサンチン塩基は、シトシン塩基と水素結合を形成することができるため、上記蛍光の消光作用を持たない塩基がヒポキサンチン塩基であると、第一の核酸プローブが標的核酸のプローブ結合領域に強固に結合することが可能となる。
上記第一の核酸プローブが有する蛍光色素は、グアニン塩基との相互作用により消光する。すなわち、蛍光色素の近傍にグアニン塩基が存在するときは、蛍光共鳴エネルギー移動が起こり、蛍光強度が減少する。このような蛍光色素としては、例えば、フルオレセイン又はその誘導体（フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）など）、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、６−ＪＯＥ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（モレキュラー・プローブ社）、Ｃｙ（登録商標）３（ＧＥヘルスケア社）、Ｃｙ（登録商標）５（ＧＥヘルスケア社）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）−ＦＬ（モレキュラープローブ社）、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）などが挙げられる。
本実施形態における第一の核酸プローブのオリゴヌクレオチドとしては、通常のオリゴヌクレオチドの製造方法により得られたものを用いることができる。例えば、化学合成法により得られたオリゴヌクレオチドが挙げられる。化学合成法では、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ヒポキサンチン、ネブラリン等の任意の塩基を、任意の位置に導入することができる。
蛍光色素は、従来公知の方法に従って、オリゴヌクレオチドに結合させることができる（例えば、上記特許文献４を参照）。
オリゴヌクレオチドの５’末端に蛍光色素を結合させる場合、例えば、オリゴヌクレオチドの５’末端のリン酸基にチオール基を導入し、このチオール基に蛍光色素を共有結合させる方法が挙げられる。
また、オリゴヌクレオチドの３’末端に蛍光色素を結合させる場合、例えば、リボース又はデオキシリボースの３’位の炭素原子に結合しているヒドロキシ基にアミノ基を導入し、このアミノ基に蛍光色素を共有結合させる方法が挙げられる。
本実施形態における第一の核酸プローブは、標的核酸のプローブ結合領域において、蛍光色素が結合するシトシン塩基に対向するグアニン塩基から１〜７塩基以内にシトシン塩基が存在する場合であっても、蛍光強度の変化に基づいて、標的核酸を検出することができる。
標的核酸を検出する方法の実施形態の一つとして、本実施形態の第一の核酸プローブと試料とを混合し、混合液を調製する工程と、前記混合液の蛍光強度を測定する工程と、前記蛍光強度に基づき、前記標的核酸を検出する工程と、を備える方法が挙げられる。
図１は、本実施形態の第一の核酸プローブ及び検出対象である核酸を模式的に表したものである。核酸がプローブ結合領域を有する場合、第一の核酸プローブは核酸のプローブ結合領域にハイブリダイズする。このとき、第一の核酸プローブの末端に存在するシトシン塩基に結合する蛍光色素が、核酸のプローブ結合領域に存在するグアニン塩基に接近することにより、蛍光色素の蛍光が消光する（図１（ａ））。
一方、核酸がプローブ結合領域を有しない場合、第一の核酸プローブは核酸にハイブリダイズすることができず、蛍光色素にグアニン塩基が接近することがないため、蛍光色素の蛍光は消光しない。すなわち、このとき、蛍光色素の蛍光が観測される（図１（ｂ））。
したがって、例えば、本実施形態における第一の核酸プローブと試料とを混合した際に、混合前に比べて、蛍光強度が減少するときは、試料中に標的核酸が存在すると判断できる。
標的核酸を検出する方法の別の実施形態として、融解曲線分析を行う方法が挙げられる。融解曲線分析は、従来公知の方法によって行うことができる（例えば、上記特許文献１を参照）。
融解曲線分析の一つとしては、例えば、次の方法が挙げられる。この方法では、まず、本実施形態における第一の核酸プローブと試料とを混合し、熱処理により試料中の二本鎖核酸を一本鎖核酸へと解離（変性）する。さらに、この方法では、第一の核酸プローブと標的核酸がハイブリダイズする温度（以下、場合により「ハイブリダイズ温度」という）まで、この混合液の温度を下降させながら、混合液の蛍光強度を測定する。
試料中の核酸がプローブ結合領域を有する場合、混合液の温度が所定の温度まで下降すると、第一の核酸プローブは試料中の核酸にハイブリダイズし、蛍光色素にグアニン塩基が接近するため、混合液の蛍光強度が減少する。以下、このときの温度を「消光開始温度」という。
一方、試料中の核酸がプローブ結合領域を有しない場合、消光開始温度まで下降したとしても、第一の核酸プローブは試料中の核酸にハイブリダイズできず、蛍光色素にグアニン塩基が接近しないため、混合液の蛍光強度は減少しない。
したがって、消光開始温度時に観測される蛍光強度に比べて、混合液の温度をハイブリダイズ温度まで下降させたときに観測される、混合液の蛍光強度が減少する場合には、試料中に標的核酸が存在すると判断できる。
上記試料は、被検核酸を鋳型とした核酸増幅反応により得られる増幅産物を含んでよい。
標的核酸を検出する方法の別の実施形態としては、また、本実施形態の第一の核酸プローブと被検核酸を含む試料とを混合し、混合液を調製する工程と、前記混合液に含まれる被検核酸を鋳型として核酸増幅反応を行い、増幅産物を得る工程とを備える方法が挙げられる。前記増幅反応は、変性段階、アニーリング段階及び伸長段階を反復するサイクルを含むポリメラーゼ連鎖反応である。前記アニーリング段階において、前記混合液の蛍光強度を測定する工程と、前記蛍光強度に基づき、前記標的核酸を検出する工程と、を備える。
上記核酸増幅反応では、標的核酸がプローブ結合領域を有する場合、アニーリング段階において、第一の核酸プローブは核酸のプローブ結合領域にハイブリダイズする。このとき、第一の核酸プローブの蛍光色素が、プローブ結合領域の末端グアニン塩基に接近することにより、蛍光色素の蛍光が消光する。
核酸増幅反応の反復サイクル数が増えると、試料中の標的核酸（増幅産物）が増えるため、アニーリング段階において、標的核酸にハイブリダイズする第一の核酸プローブが増える。したがって、核酸増幅反応のアニーリング段階において、混合液の蛍光強度を測定すると、核酸増幅反応の反復サイクル数の増加に伴い、蛍光強度の減少量が増大する。
上記核酸増幅反応は、Loop-mediatedIsothermal Amplification（ＬＡＭＰ）法であってもよい。具体的には、標的核酸を検出する方法の別の実施形態としては、本実施形態の第一の核酸プローブと被検核酸を含む試料とを混合し、混合液を調製する工程と、前記混合液に含まれる被検核酸を鋳型として核酸増幅反応（ＬＡＭＰ法）を行い、増幅産物を得る工程とを備える方法が挙げられる。
第二の核酸プローブについて説明する。第二の核酸プローブでは、プローブ結合領域の末端グアニン塩基から１〜７塩基以内に一塩基多型が１つ以上存在すること、並びに、第二の核酸プローブが有するオリゴヌクレオチドが、前記末端グアニン塩基から１〜７塩基以内に存在する一塩基多型を除いて前記プローブ結合領域の核酸と相補的であること、該一塩基多型に対向する前記オリゴヌクレオチド上の塩基はグアニン塩基又は蛍光の消光作用を持たない塩基であること、及び該一塩基多型のうち前記末端グアニン塩基に最も近接する一塩基多型に対向する前記オリゴヌクレオチド上の塩基が蛍光の消光作用を持たない塩基であること以外は、第一の核酸プローブと同様の構成を有する。すなわち、第二の核酸プローブは、第一の核酸プローブにおいて、末端グアニン塩基から１〜７塩基以内のプローブ結合領域に存在する「一塩基多型」に対向する前記オリゴヌクレオチド上の塩基を蛍光の消光作用を持たない塩基に置き換えたものである。
第二の核酸プローブを用いて上記融解曲線分析により、ＳＮＰの検出が可能である。
プローブが標的核酸にハイブリダイズしたときに、プローブが有する蛍光の消光作用を持たない塩基に対向する、プローブ結合領域の塩基の種類によって、消光開始温度は異なる。
したがって、例えば、以下のようにしてＳＮＰの有無及びＳＮＰを構成する塩基の種類を判断することができる。まず、プローブが有する蛍光の消光作用を持たない塩基に対向する、プローブ結合領域の塩基の種類を他の塩基に変更した場合の消光開始温度をあらかじめ測定しておく。次に、あらかじめ測定した消光開始温度と、別途、測定した試料中の標的核酸における消光開始温度とを照らし合わせることにより、ＳＮＰの有無及びＳＮＰを構成する塩基の種類を判断することができる。
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］ヒポキサンチン塩基に置換したＱＰｒｏｂｅを用いた融解曲線分析
核酸プローブが有するオリゴヌクレオチドにおいて、蛍光色素を結合させたシトシン塩基から１塩基離れて存在するグアニン塩基を、ヒポキサンチン塩基に置換したＱＰｒｏｂｅ（以下、「ＩＱＰ１」という）を用いて融解曲線分析を行った。また、比較例として置換を行っていないＱＰｒｏｂｅ（以下、「ＱＰ１」という）を用いて融解曲線分析を行った。
（材料）
標的核酸：配列番号１の塩基配列を有する合成ＤＮＡ（以下、「モデル１」ともいう） １０μＭ。
ＱＰｒｏｂｅ：配列番号２、３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを備え、オリゴヌクレオチドの末端シトシン塩基にＴＡＭＲＡを結合させたプローブ（ＱＰ１及びＩＱＰ１） ２μＭ。
ハイブリダイズ用バッファー：ＫＣｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及びＴｗｅｅｎ−２０を含むバッファー。
なお、標的核酸及びＱＰｒｏｂｅは、株式会社日本バイオサービスに合成を委託した。
モデル１、ＱＰ１及びＩＱＰ１の特徴を表１に示す。なお、塩基配列において、ヒポキサンチン塩基をＩで表す。
Figure 2019205437
（方法）
モデル１ ３．２μＬ、ＱＰ１又はＩＱＰ１ ０．５μＬ及びハイブリダイズ用バッファー２１．３μＬを混合して、終濃度がそれぞれモデル１ １．２８μＭ、ＱＰ１又はＩＱＰ１ ０．０４μＭ、ＫＣｌ ５０ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１０ｍＭ及びＴｗｅｅｎ−２０ ０．１％である混合液を調製した。また、モデル１を混合せず、ＱＰ１又はＩＱＰ１ ０．５μＬ及びハイブリダイズ用バッファー ２４．５μＬを混合して混合液を調製した。混合液の調製は８連チューブで行なった。混合液の温度を９５℃から２０℃まで下降させながら、蛍光強度を測定し、融解曲線分析を行った。降温速度は、−０．０６℃/秒で行い、測定は、１℃あたり５回行った。なお、測定には、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標） ４８０ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ＩＩ（ロシュ社）を用い、５３３ｎｍの波長で励起し、５８０ｎｍにおける蛍光強度を測定した。
なお、同様の測定を二回行った。
（結果）
ＩＱＰ１は、ＱＰ１と同様、混合液中にモデル１が存在する場合には、一定温度以下になると消光し始めるのに対し、混合液中にモデル１が存在しない場合には、消光は観測されなかった（図２）。
また、ＩＱＰ１は、ＱＰ１と比べて、消光開始時（以下、「ピーク時」ともいう）の蛍光強度が大きかった。すなわち、ＩＱＰ１を用いた場合には、ＱＰ１を用いた場合と比べて、ピーク時の蛍光強度と、混合液の温度低下に伴う蛍光強度の減少が観測されなくなり蛍光強度が一定に達したときの蛍光強度との差（減少量）が大きくなった。
実施例１の結果から、混合液中に標的核酸が存在する場合に、ＩＱＰ１は消光し、標的核酸を検出可能であることが示された。また、ＩＱＰ１は、ＱＰ１に比べて、感度に優れることが示された。
［実施例２］種々の塩基に置換したＱＰｒｏｂｅを用いた融解曲線分析
蛍光色素を結合されたシトシン塩基に隣接するグアニン塩基を、ヒポキサンチン、チミン、シトシン、アデニン、ネブラリン、２−ジメチルアミノメチレンアミノ−６−メトキシアミノプリン及び３−ニトロピロールから選ばれるいずれかの塩基に置換したＱＰｒｏｂｅ（以下、それぞれ「ＩＱＰ１」、「ＴＱＰ」、「ＣＱＰ」、「ＡＱＰ」、「ＮＱＰ」、「ｄＫＱＰ」及び「ＮｉｔＱＰ」という）を用いて融解曲線分析を行った。
（材料）
標的核酸：モデル１ １０μＭ。
ＱＰｒｏｂｅ：配列番号２〜９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを備え、オリゴヌクレオチドの末端シトシン塩基にＴＡＭＲＡを結合させたプローブ（ＱＰ１、ＩＱＰ１、ＴＱＰ、ＣＱＰ、ＡＱＰ、ＮＱＰ、ｄＫＱＰ及びＮｉｔＱＰ） ２μＭ。
ハイブリダイズ用バッファー：ＫＣｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及びＴｗｅｅｎ−２０を含むバッファー。
なお、標的核酸及びＱＰｒｏｂｅは、株式会社日本バイオサービスに合成を委託した。
モデル１、ＱＰ１、ＩＱＰ１、ＴＱＰ、ＣＱＰ、ＡＱＰ、ＮＱＰ、ｄＫＱＰ及びＮｉｔＱＰの特徴を表２に示す。以下、場合により、蛍光色素を結合させたシトシン塩基に隣接するグアニン塩基を、チミン、シトシン、アデニン、ネブラリン、２−ジメチルアミノメチレンアミノ−６−メトキシアミノプリン及び３−ニトロピロールに置換した塩基をそれぞれ、Ｔ、Ｃ、Ａ、Ｎ、ｄＫ及びＮｉｔで表す。
Figure 2019205437
（方法）
ＴＱＰ、ＣＱＰ、ＡＱＰ、ＮＱＰ、ｄＫＱＰ及びＮitＱＰを用いたこと、並びに各ＱＰｒｏｂｅとハイブリダイズ用バッファーとからなる混合液の調製を行わなかったことを除いて、実施例１と同様の方法により、融解曲線分析を行った。
（結果）
ＩＱＰ１、ＴＱＰ、ＣＱＰ、ＡＱＰ及びＮＱＰから選ばれるいずれかのＱＰｒｏｂｅを用いた場合、ピーク時の蛍光強度が、ＱＰ１を用いた場合と比べて、上昇した（図３（ａ）〜（ｄ））。すなわち、ＩＱＰ１、ＴＱＰ、ＣＱＰ、ＡＱＰ及びＮＱＰから選ばれるいずれかのＱＰｒｏｂｅを用いた場合に、ＱＰ１を用いた場合に対して、ピーク時の蛍光強度と、混合液の温度低下に伴う蛍光強度の減少が観測されなくなり蛍光強度が一定に達したときの蛍光強度との差（減少量）が大きくなった。
実施例２の結果から、ＩＱＰ１、ＴＱＰ、ＣＱＰ、ＡＱＰ及びＮＱＰは、ＱＰ１に対して、感度に優れることが示された。
［実施例３］置換位置の選定
ヒポキサンチン塩基に置換するグアニン塩基と、蛍光色素を結合させたシトシン塩基との距離を段階的に変えたＱＰｒｏｂｅを用いて、融解曲線分析を行った。具体的には、配列番号１、１０〜１２の塩基配列を有する合成ＤＮＡ（以下、それぞれ「モデル１」、「モデル２」、「モデル３」及び「モデル４」という）を標的核酸とし、蛍光色素を結合させたシトシン塩基から１、３、５又は７塩基離れて存在するグアニン塩基をヒポキサンチン塩基に置換したＱＰｒｏｂｅ（以下、それぞれ「ＩＱＰ１」、「ＩＱＰ３」、「ＩＱＰ５」及び「ＩＱＰ７」という）を用いて、融解曲線分析を行った。また、比較例として置換を行なっていないＱＰｒｏｂｅ（以下、それぞれ「ＱＰ１」、「ＱＰ３」、「ＱＰ５」及び「ＱＰ７」という）を用いて融解曲線分析を行なった。
（材料）
標的核酸：配列番号１、１０〜１２の塩基配列を有するＤＮＡ（モデル１〜４） １０μＭ。
ＱＰｒｏｂｅ：配列番号２、３、１３〜１８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを備え、オリゴヌクレオチドの末端シトシン塩基にＴＡＭＲＡを結合させたプローブ（ＱＰ１、ＱＰ３、ＱＰ５、ＱＰ７、ＩＱＰ１、ＩＱＰ３、ＩＱＰ５及びＩＱＰ７） ２μＭ。
ハイブリダイズ用バッファー：ＫＣｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及びＴｗｅｅｎ−２０を含むバッファー。
なお、標的核酸及びＱＰｒｏｂｅは、株式会社日本バイオサービスに合成を委託した。
モデル１〜４、ＱＰ１、ＱＰ３、ＱＰ５、ＱＰ７、ＩＱＰ１、ＩＱＰ３、ＩＱＰ５及びＩＱＰ７の特徴を表３に示す。
Figure 2019205437
（方法）
モデル２〜４、ＱＰ３、ＱＰ５、ＱＰ７、ＩＱＰ３、ＩＱＰ５及びＩＱＰ７を用いたことを除いて、実施例２と同様の方法により、融解曲線分析を行った。
（結果）
ＩＱＰ１、ＩＱＰ３、ＩＱＰ５及びＩＱＰ７から選ばれるいずれかの置換を行ったＱＰｒｏｂｅを用いた場合に、置換を行っていないＱＰｒｏｂｅを用いた場合と比べて、消光開始時の蛍光強度が上昇した（図４）。すなわち、ＩＱＰ１、ＩＱＰ３、ＩＱＰ５及びＩＱＰ７から選ばれるいずれかの置換を行ったＱＰｒｏｂｅを用いた場合に、置換を行っていないＱＰｒｏｂｅを用いた場合に対して、ピーク時の蛍光強度と、混合液の温度低下に伴う蛍光強度の減少が観測されなくなり蛍光強度が一定に達したときの蛍光強度との差（減少量）が大きくなった。
実施例３の結果から、ＩＱＰ１、ＩＱＰ３、ＩＱＰ５及びＩＱＰ７は、置換を行っていないＱＰｒｏｂｅに対して、感度が改善された。
［実施例４］複数塩基を置換したＱＰｒｏｂｅを用いた融解曲線分析
蛍光色素を結合させたシトシン塩基から１〜７塩基以内に存在する、複数のグアニン塩基をヒポキサンチン塩基に置換したＱＰｒｏｂｅを用いて融解曲線分析を行った。具体的には、配列番号１９の塩基配列を有する合成ＤＮＡ（以下、「モデル５」という）を標的核酸とし、ヒポキサンチン塩基に置換されたグアニン塩基の個数が１又は２塩基であるＱＰｒｏｂｅ（以下、それぞれ「Ｉ１ＱＰ」及び「Ｉ２ＱＰ」という）を用いて、融解曲線分析を行った。なお、配列番号２０の塩基配列を有するＱＰｒｏｂｅを、以下「２ＱＰ」という。
（材料）
標的核酸：配列番号１９の塩基配列を有する合成ＤＮＡ（モデル５） １０μＭ。
ＱＰｒｏｂｅ：配列番号２０〜２２を有するオリゴヌクレオチドを備え、オリゴヌクレオチドの末端シトシン塩基にＴＡＭＲＡを結合させたプローブ（２ＱＰ、Ｉ１ＱＰ及びＩ２ＱＰ） ２μＭ。
ハイブリダイズ用バッファー：ＫＣｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及びＴｗｅｅｎ−２０を含むバッファー。
なお、標的核酸及びＱＰｒｏｂｅは、株式会社日本バイオサービスに合成を委託した。
モデル５並びに２ＱＰ、Ｉ１ＱＰ及びＩ２ＱＰの特徴を表４に示す。
Figure 2019205437
（方法）
２ＱＰ、Ｉ１ＱＰ及びＩ２ＱＰを用いたことを除いて、実施例２と同様の方法により、融解曲線分析を行った。
（結果）
Ｉ２ＱＰを用いた場合に、Ｉ１ＱＰを用いた場合と比べて、ピーク時の蛍光強度が上昇した（図５）。すなわち、Ｉ２ＱＰを用いた場合に、Ｉ１ＱＰを用いた場合に対して、ピーク時の蛍光強度と、混合液の温度低下に伴う蛍光強度の減少が観測されなくなり蛍光強度が一定に達したときの蛍光強度との差（減少量）が大きくなった。
実施例４の結果から、蛍光色素を結合させたシトシン塩基から１〜７塩基以内に存在する複数のグアニン塩基をヒポキサンチン塩基に置換することにより、プローブの感度が改善することが示された。
［実施例５］ＬＡＭＰ法によるMycoplasmapneumoniaeの検出
蛍光色素を結合させたシトシン塩基から１〜７塩基以内に存在するグアニン塩基をヒポキサンチン塩基に置換したＱＰｒｏｂｅを用い、ＬＡＭＰ法によってMycoplasma pneumoniaeを検出した。具体的には、配列番号２３の塩基配列を有するMycoplasma pneumoniae ＦＨ株の精製ゲノムＤＮＡ（以下、「ＭｙｃＰゲノム」という）を標的核酸とし、蛍光色素を結合させたシトシン塩基から２塩基離れて存在するグアニン塩基をヒポキサンチン塩基に置換したＱＰｒｏｂｅ（以下、「ＭｙｃＰ−ＩＱＰ」という）を用い、ＬＡＭＰ法によってリアルタイムにＭｙｃＰゲノムを検出した。なお、比較例として置換を行なっていないＱＰｒｏｂｅ（以下、「ＭｙｃＰ−ＱＰ」という）を用いてＭｙｃＰゲノムを検出した。
（材料）
標的核酸：配列番号２３の塩基配列を有するMycoplasma pneumoniae ＦＨ株の精製ゲノムＤＮＡ（ＭｙｃＰゲノム）。
ＱＰｒｏｂｅ：配列番号２４〜２５を有するオリゴヌクレオチドを備え、オリゴヌクレオチドの末端シトシン塩基にＴＡＭＲＡを結合させたプローブ（ＭｙｃＰ−ＱＰ及びＭｙｃＰ−ＩＱＰ） ２μＭ。
Loopamp（登録商標）マイコプラズマＰ検出試薬キット（リアクションミックスＭｙｃＰ（ＲＭ ＭｙｃＰ）、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素（Ｂｓｔ Ｐｏｌ））
なお、ＭｙｃＰゲノムとして、９５℃で５分間熱処理し、急冷したものを測定に用いた。ＱＰｒｏｂｅは、株式会社日本バイオサービスに合成を委託した。
ＭｙｃＰゲノム並びにＭｙｃＰ−ＱＰ及びＭｙｃＰ−ＩＱＰの特徴を表５に示す。
Figure 2019205437
（方法）
ＲＭ ＭｙｃＰ ２０．００μＬとＢｓｔ Ｐｏｌ １．００μＬとを混合して混合溶液を得た。この混合溶液 ２０．００μＬ、ＭｙｃＰ−ＱＰ又はＭｙｃＰ−ＩＱＰ ０．５０μＬ、及びＭｙｃＰゲノム ４．５０μＬを混合して、ＭｙｃＰ−ＱＰ又はＭｙｃＰ−ＩＱＰの終濃度が０．０４μＭである混合液２５．００μＬを得た。前記混合液を６５℃、６０分間インキュベートし、混合液中の蛍光強度をリアルタイムに測定した。また、ＭｙｃＰゲノムの代わりに精製水を混合して得た混合液についても、ＭｙｃＰゲノムを用いた場合と同様にして混合液中の蛍光強度をリアルタイムに測定した。なお、測定には、Ｍｘ３００５Ｐ（アジレント・テクノロジー株式会社製）を用い、５５６ｎｍの波長で励起し、５８０ｎｍにおける蛍光強度を測定した。解析には、ＭｘＰｒｏソフトフェアを用いた。同様の測定を二回行った。
（結果）
ＭｙｃＰ−ＩＱＰを用いた場合とＭｙｃＰ−ＱＰを用いた場合とを対比すると、混合液中にＭｙｃＰゲノムが存在する場合の蛍光強度と混合液中にＭｙｃゲノムが存在しない場合の蛍光強度との差は、前者の方が後者より大きかった（図６）。
実施例５の結果から、蛍光色素を結合させたシトシン塩基から１〜７塩基以内に存在する複数のグアニン塩基をヒポキサンチン塩基に置換したＱＰｒｏｂｅを用いた場合、当該置換を行っていないＱＰｒｏｂｅを用いた場合に比べて、ＬＡＭＰ法によるMycoplasma pneumoniaeの検出をより高感度に行えることがわかった。
［実施例６］ＰＣＲ法及び融解曲線分析によるヒト型結核菌の検出
蛍光色素を結合させたシトシン塩基から１〜７塩基以内に存在するグアニン塩基をヒポキサンチン塩基に置換したＱＰｒｏｂｅを用い、ＰＣＲ法及び融解曲線分析によってヒト型結核菌Mycobacterium tuberculosisを検出した。具体的には、配列番号２６の塩基配列を有するMycobacterium tuberculosis Ｈ３７Ｒｖ株の精製ゲノムＤＮＡ（以下、「ＴＢゲノム」という）を標的核酸とし、蛍光色素を結合させたシトシン塩基から１塩基又は２塩基離れて存在するグアニン塩基をヒポキサンチン塩基に置換したＱＰｒｏｂｅ（以下、それぞれ「ＴＢ−ＩＱＰ１」及び「ＴＢ−ＩＱＰ２」という）を用い、ＰＣＲ法によって増幅したＴＢゲノムを融解曲線分析で検出した。なお、比較例として置換を行なっていないＱＰｒｏｂｅ（以下、「ＴＢ−ＱＰ」という）を用いてＴＢゲノムを検出した。
（材料）
標的核酸：配列番号２６の塩基配列を有するMycobacterium tuberculosis Ｈ３７Ｒｖ株の精製ゲノムＤＮＡ（ＴＢゲノム）。
ＰＣＲ用プライマー：配列番号２７〜２８の塩基配列を有するプライマー（ＴＢ−ｄｎａＪ１−ＰＣＲ２６及びＴＢ−ｄｎａＪ１−ＰＣＲ１１） １０μＭ。
１０×ＰＣＲ用バッファー
ｄＮＴＰｓ ２ｍＭ
ＭｇＳＯ４ ２５ｍＭ
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １Ｕ
ＱＰｒｏｂｅ：配列番号２７〜２９を有するオリゴヌクレオチドを備え、オリゴヌクレオチドの末端シトシン塩基にＢＯＤＩＰＹ（登録商標）−ＦＬを結合させたプローブ（ＴＢ−ＱＰ、ＴＢ−ＩＱＰ１及びＴＢ−ＩＱＰ２） ２μＭ。
ＴＢ−ｄｎａＪ１−ＰＣＲ２６及びＴＢ−ｄｎａＪ１−ＰＣＲ１１、並びにＴＢ−ＱＰ、ＴＢ−ＩＱＰ１及びＴＢ−ＩＱＰ２の特徴を以下の表６に示す。
Figure 2019205437
（方法）
以下の試薬を含むＰＣＲ反応液を調製した。
［ＰＣＲ反応液（１０．００μＬ）］
蒸留水 ２．２０μＬ
ＴＢ−ｄｎａＪ１−ＰＣＲ２６Ｖ２ ０．２５０μＭ ０．２５μＬ
ＴＢ−ｄｎａＪ１−ＰＣＲ１１ １．５００μＭ １．５０μＬ
ＱＰｒｏｂｅ（ＴＢ−ＱＰ、ＴＢ−ＩＱＰ１又はＴＢ−ＩＱＰ２） ０．２５０μＭ １．２５μＬ
緩衝液 １× １．００μＬ
ｄＮＴＰｓ ０．２ｍＭ １．００μＬ
ＭｇＳＯ４ ４．０ｍＭ １．６０μＬ
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．２Ｕ ０．２０μＬ
ＴＢゲノム ２０．０ｎｇ １．００μＬ
以下の条件で、ＰＣＲ反応及び融解曲線分析を行った。融解曲線分析（以下の６））では、反応液の温度を４０℃から７５℃まで上昇させながら、蛍光強度を測定した。上温速度は、０．５℃/秒であり、測定は、１℃あたり５回行った。測定した蛍光強度に基づいて、蛍光強度の変化量（−（ｄ／ｄｔ）蛍光強度）を求めた。なお、測定には、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標） ４８０ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ＩＩ（ロシュ社）を用い、４６５ｎｍの波長で励起し、５１０ｎｍにおける蛍光強度を測定した。同様の測定を二回行った。
［ＰＣＲ反応及び融解曲線分析の条件］
１）９４℃ ２分間
２）９８℃ １秒間
３）６５℃ ５秒間
４）９４℃ １分間
５）４０℃ １分間
６）４０℃〜７５℃
ＰＣＲ反応では、２）〜４）の工程を５０サイクル繰り返した。
（結果）
蛍光色素を結合させたシトシン塩基から１〜７塩基以内に存在するグアニン塩基をヒポキサンチン塩基に置換したプローブ（ＴＢ−ＩＱＰ１又はＴＢ−ＩＱＰ２）を用いた場合、蛍光色素を結合させたシトシン塩基から１〜７塩基以内に存在するグアニン塩基をヒポキサンチン塩基に置換していないプローブ（ＴＢ−ＱＰ）を用いた場合に比べて、蛍光強度の変化量が増加した（図７）。すなわち、ＴＢ−ＩＱＰ１又はＴＢ−ＩＱＰ２を用いた場合に、ＴＢ−ＱＰを用いた場合に対して、標的核酸へのハイブリダイズによる蛍光強度の変化量が大きくなった。また、蛍光色素を結合させたシトシン塩基から１〜７塩基以内に存在する複数のグアニン塩基をヒポキサンチン塩基に置換したプローブ（ＴＢ−ＩＱＰ２）を用いた場合、蛍光色素を結合させたシトシン塩基から１〜７塩基以内に存在する１つのグアニン塩基をヒポキサンチン塩基に置換したプローブ（ＴＢ−ＩＱＰ１）を用いた場合に比べて、蛍光強度の変化量が増加した（図７）。すなわち、ＴＢ−ＩＱＰ２を用いた場合に、ＴＢ−ＩＱＰ１を用いた場合に対して、標的核酸へのハイブリダイズによる蛍光強度の変化量がさらに大きくなった。
実施例６の結果から、蛍光色素を結合させたシトシン塩基から１〜７塩基以内に存在するグアニン塩基をヒポキサンチン塩基に置換することにより、ＰＣＲ反応及び融解曲線分析によるMycobacterium tuberculosisの検出をより高感度に行えることがわかった。また、蛍光色素を結合させたシトシン塩基から１〜７塩基以内に存在する複数のグアニン塩基をヒポキサンチン塩基に置換することにより、上記検出をより高感度に行えることがわかった。
［実施例７］ＳＮＰの検出
蛍光色素を結合させたシトシン塩基から１塩基離れて存在する、「一塩基多型」に対向するオリゴヌクレオチド上の塩基をヒポキサンチン、チミン、シトシン及びアデニンから選ばれるいずれかの塩基に置換したＱＰｒｏｂｅを用い、ＳＮＰを有する標的核酸を融解曲線分析により検出した。
（材料）
標的核酸：配列番号３２〜３５の塩基配列を有する合成ＤＮＡ（以下、それぞれ「モデルＡ」、「モデルＧ」、「モデルＴ」及び「モデルＣ」ともいう）。
ＱＰｒｏｂｅ：配列番号３６〜４０を有するオリゴヌクレオチドを備え、オリゴヌクレオチドの末端シトシン塩基にＴＡＭＲＡを結合させたプローブ（以下、それぞれ「ＳＮＰ−ＧＱＰ」、「ＳＮＰ−ＩＱＰ」、「ＳＮＰ−ＡＱＰ」、「ＳＮＰ−ＴＱＰ」及び「ＡＮＰ−ＣＱＰ」ともいう） ２μＭ。
ハイブリダイズ用バッファー：ＫＣｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及びＴｗｅｅｎ−２０を含むバッファー。
なお、標的核酸及びＱＰｒｏｂｅは、株式会社日本バイオサービスに合成を委託した。
標的核酸及びＱＰｒｏｂｅの特徴を表７に示す。
Figure 2019205437
（方法）
標的核酸（モデルＡ、モデルＧ、モデルＴ又はモデルＣ） ３．２μＬ、ＳＮＰ−ＧＱＰ ０．５μＬ及びハイブリダイズ用バッファー２１．３μＬを混合して、終濃度がそれぞれ標的核酸（モデルＡ、モデルＧ、モデルＴ又はモデルＣ） １．２８μＭ、ＳＮＰ−ＧＱＰ ０．０４μＭ、ＫＣｌ ５０ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１０ｍＭ及びＴｗｅｅｎ−２０ ０．１％である混合液を調製した。混合液の温度を９５℃から２０℃まで下降させながら、蛍光強度を測定し、融解曲線分析を行った。降温速度は、−０．０６℃/秒であり、測定は、１℃あたり５回行った。測定した蛍光強度に基づいて、蛍光強度の変化量（−（ｄ／ｄｔ）蛍光強度）を求めた。なお、測定には、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標） ４８０ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ＩＩ（ロシュ社）を用い、５３３ｎｍの波長で励起し、５８０ｎｍにおける蛍光強度を測定した。同様の測定を二回行った。ＳＮＰ−ＧＱＰの代わりに、ＳＮＰ−ＩＱＰ、ＳＮＰ−ＡＱＰ、ＳＮＰ−ＴＱＰ及びＳＮＰ−ＣＱＰのいずれかを用いた以外は、ＳＮＰ−ＧＱＰを用いた場合と同様にして、融解曲線分析を行った。
（結果）
蛍光色素を結合させたシトシン塩基から１〜７塩基以内に存在する、「一塩基多型」に対向するオリゴヌクレオチド上の塩基をヒポキサンチン塩基に置換したプローブ（ＳＮＰ−ＩＱＰ）を用いた場合、モデルＣ、モデルＡ、モデルＧ及びモデルＴの順に消光開始温度が低くなった（図８（ａ））。したがって、モデルＣ、モデルＡ、モデルＧ及びモデルＴにおける消光開始温度はそれぞれ異なっていることから、ＳＮＰ−ＩＱＰを用いることにより、変異塩基の種類ごとにＳＮＰを検出可能であることがわかった。蛍光色素を結合させたシトシン塩基から１〜７塩基以内に存在する、「一塩基多型」に対向するオリゴヌクレオチド上の塩基をチミン塩基に置換したプローブ（ＳＮＰ−ＴＱＰ）を用いた場合も、モデルＣ、モデルＡ、モデルＧ及びモデルＴにおける消光開始温度はそれぞれ異なっていることから、ＳＮＰ−ＴＱＰを用いることにより、変異塩基の種類ごとにＳＮＰを検出可能であることがわかった（図８（ｂ））。
［実施例８］ＳＮＰの位置を段階的に変えた標的核酸の検出
蛍光色素を結合させたシトシン塩基から１〜７塩基以内に存在する、「一塩基多型」に対向するオリゴヌクレオチド上の塩基をヒポキサンチン塩基に置換したＱＰｒｏｂｅを用い、ＳＮＰの位置を段階的に変えた標的核酸を融解曲線分析により検出した。
（材料）
標的核酸：配列番号３２〜３５、４１〜４４及び４６〜４９の塩基配列を有する合成ＤＮＡ（４１〜４４、４６〜４９の塩基配列を有する合成ＤＮＡのことを、以下それぞれ「モデルＡ３」、「モデルＧ３」、「モデルＴ３」及び「モデルＣ３」、並びに「モデルＡ５」、「モデルＧ５」、「モデルＴ５」及び「モデルＣ５」ともいう）。
ＱＰｒｏｂｅ：配列番号３７、４５及び５０を有するオリゴヌクレオチドを備え、オリゴヌクレオチドの末端シトシン塩基にＴＡＭＲＡを結合させたプローブ（配列番号４５及び５０を有するオリゴヌクレオチドを備え、オリゴヌクレオチドの末端シトシン塩基にＴＡＭＲＡを結合させたプローブのことを、以下それぞれ「ＳＮＰ−ＩＱＰ３」及び「ＳＮＰ−ＩＱＰ５」ともいう） ２μＭ。
ハイブリダイズ用バッファー：ＫＣｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及びＴｗｅｅｎ−２０を含むバッファー。
なお、標的核酸及びＱＰｒｏｂｅは、株式会社日本バイオサービスに合成を委託した。
標的核酸及びＱＰｒｏｂｅの特徴を表８に示す。
Figure 2019205437
（方法）
実施例７においてＳＮＰ−ＩＱＰを用いた場合と同様にして、モデルＡ、モデルＧ、モデルＴ及びモデルＣを標的核酸として融解曲線分析を行った。また、標的核酸としてモデルＡ、モデルＧ、モデルＴ及びモデルＣの代わりに、モデルＡ３、モデルＧ３、モデルＴ３及びモデルＣ３を用いたこと、並びにＱｐｒｏｂｅとしてＳＮＰ−ＧＱＰ、ＳＮＰ−ＩＱＰ、ＳＮＰ−ＡＱＰ、ＳＮＰ−ＴＱＰ及びＡＮＰ−ＣＱＰの代わりに、ＳＮＰ−ＩＱＰ３を用いたこと以外は、実施例７と同様にして融解曲線分析を行った。また、標的核酸としてモデルＡ、モデルＧ、モデルＴ及びモデルＣの代わりに、モデルＡ５、モデルＧ５、モデルＴ５及びモデルＣ５を用いたこと、並びにＱｐｒｏｂｅとしてＳＮＰ−ＧＱＰ、ＳＮＰ−ＩＱＰ、ＳＮＰ−ＡＱＰ、ＳＮＰ−ＴＱＰ及びＡＮＰ−ＣＱＰの代わりにＳＮＰ−ＩＱＰ５を用いたこと以外は、実施例７と同様にして融解曲線分析を行った。
（結果）
ＳＮＰの位置を段階的に変えた標的核酸についてＳＮＰ−ＩＱＰ３を用いて検出した場合、モデルＡ３、モデルＣ３、及びモデルＴ３（又はモデルＧ３）における消光開始温度はそれぞれ異なっていることから、変異塩基の種類（Ａ、Ｃ及びＴ（又はＧ））の判別は可能であることがわかった（図９（ｂ））。具体的には、モデルＡ３、モデルＧ３、モデルＴ３及びモデルＣ３をＳＮＰ−ＩＱＰ３を用いて検出した場合、モデルＣ３、モデルＡ３、及びモデルＴ３（又はモデルＧ３）の順に消光開始温度が低くなった（図９（ｂ））。また、モデルＡ５、モデルＧ５、モデルＴ５及びモデルＣ５をＳＮＰ−ＩＱＰ５を用いて検出した場合、モデルＡ５、モデルＣ５、及びモデルＴ５（又はモデルＧ５）における消光開始温度はそれぞれ異なっていることから、変異塩基の種類（Ａ、Ｃ及びＴ（又はＧ））の判別は可能であることがわかった（図９（ｃ））。具体的には、モデルＣ５、モデルＡ５、及びモデルＧ５（又はモデルＴ５）の順に消光開始温度が低くなった（図９（ｃ））。
実施例８の結果から、ＳＮＰの位置を段階的に変えた標的核酸についても、蛍光色素を結合させたシトシン塩基から１〜７塩基以内に存在する、「一塩基多型」に対向するオリゴヌクレオチド上の塩基をヒポキサンチン塩基に置換したプローブを用いて、ＳＮＰを検出可能であることがわかった。

Claims (8)

  1. 標的核酸を検出する方法であって、
    （１）第一の核酸プローブと試料とを混合し、混合液を調製する工程と、
    （２）前記混合液の蛍光強度を測定する工程と、
    （３）前記蛍光強度に基づき、前記標的核酸を検出する工程と、
    を備え、
    ここで、
    （ｉ）前記標的核酸は、前記第一の核酸プローブがハイブリダイズするプローブ結合領域を備え、
    前記プローブ結合領域の少なくとも一方の末端がグアニン塩基であり、かつ、前記グアニン塩基から１〜７塩基以内の前記プローブ結合領域にシトシン塩基が１つ以上存在し；
    （ｉｉ）前記第一の核酸プローブは、前記グアニン塩基に対向するシトシン塩基を末端に有するオリゴヌクレオチドと、該シトシン塩基に結合された蛍光色素と、を備え、
    前記蛍光色素は、グアニン塩基との相互作用により消光する蛍光色素であり、
    前記オリゴヌクレオチドは、前記末端グアニン塩基から１〜７塩基以内に存在するシトシン塩基を除いて前記プローブ結合領域の核酸と相補的であり、該シトシン塩基に対向する前記オリゴヌクレオチドの塩基はグアニン塩基又は前記蛍光色素の蛍光の消光作用を持たない塩基であり、ただし、該シトシン塩基のうち前記末端グアニン塩基に最も接近するシトシン塩基に対向する前記オリゴヌクレオチド上の塩基は、前記蛍光色素の蛍光の消光作用を持たない塩基であり；
    （ｉｉｉ）前記末端グアニン塩基に最も接近するシトシン塩基に対向する前記オリゴヌクレオチド上の塩基が前記蛍光色素の蛍光の消光作用を持たない塩基であることによって、前記末端グアニン塩基に最も接近するシトシン塩基に対向する前記オリゴヌクレオチド上の塩基がグアニン塩基である場合と比べて、前記標的核酸とハイブリダイズしないときの蛍光強度の低下が小さい、
    方法。
  2. 前記検出が、融解曲線分析によって行われる、請求項１に記載の方法。
  3. 前記試料が、被検核酸を鋳型とした核酸増幅反応により得られる増幅産物を含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 標的核酸を検出する方法であって、
    （１）第一の核酸プローブと被験核酸を含む試料とを混合し、混合液を調製する工程と、
    （２）前記混合液に含まれる被検核酸を鋳型として核酸増幅反応を行い、増幅産物を得る工程であって、前記増幅反応が、変性段階、アニーリング段階及び伸長段階を反復するサイクルを含むポリメラーゼ連鎖反応である、工程と、
    （３）前記アニーリング段階において、前記混合液の蛍光強度を測定する工程と、
    （４）前記蛍光強度に基づき、前記標的核酸を検出する工程と、
    を備え、
    ここで、
    （ｉ）前記標的核酸は、前記第一の核酸プローブがハイブリダイズするプローブ結合領域を備え、
    前記プローブ結合領域の少なくとも一方の末端がグアニン塩基であり、かつ、前記グアニン塩基から１〜７塩基以内の前記プローブ結合領域にシトシン塩基が１つ以上存在し；
    （ｉｉ）前記第一の核酸プローブは、前記グアニン塩基に対向するシトシン塩基を末端に有するオリゴヌクレオチドと、該シトシン塩基に結合された蛍光色素と、を備え、
    前記蛍光色素は、グアニン塩基との相互作用により消光する蛍光色素であり、
    前記オリゴヌクレオチドは、前記末端グアニン塩基から１〜７塩基以内に存在するシトシン塩基を除いて前記プローブ結合領域の核酸と相補的であり、該シトシン塩基に対向する前記オリゴヌクレオチドの塩基はグアニン塩基又は前記蛍光色素の蛍光の消光作用を持たない塩基であり、ただし、該シトシン塩基のうち前記末端グアニン塩基に最も接近するシトシン塩基に対向する前記オリゴヌクレオチド上の塩基は、前記蛍光色素の蛍光の消光作用を持たない塩基であり；
    （ｉｉｉ）前記末端グアニン塩基に最も接近するシトシン塩基に対向する前記オリゴヌクレオチド上の塩基が前記蛍光色素の蛍光の消光作用を持たない塩基であることによって、前記末端グアニン塩基に最も接近するシトシン塩基に対向する前記オリゴヌクレオチド上の塩基がグアニン塩基である場合と比べて、前記標的核酸とハイブリダイズしないときの蛍光強度の低下が小さい、
    方法。
  5. 標的核酸を検出する方法であって、
    （１）第二の核酸プローブと試料とを混合し、混合液を調製する工程と、
    （２）前記混合液の蛍光強度を測定する工程と、
    （３）前記蛍光強度に基づき、前記標的核酸を検出する工程と、
    を備え、
    ここで、
    （ｉ）前記標的核酸は、前記第二の核酸プローブがハイブリダイズするプローブ結合領域を備え、
    前記プローブ結合領域の少なくとも一方の末端がグアニン塩基であり、かつ、前記グアニン塩基から１〜７塩基以内の前記プローブ結合領域に一塩基多形が１つ以上存在し；
    （ｉｉ）前記第二の核酸プローブは、前記グアニン塩基に対向するシトシン塩基を末端に有するオリゴヌクレオチドと、該シトシン塩基に結合された蛍光色素と、を備え、
    前記蛍光色素は、グアニン塩基との相互作用により消光する蛍光色素であり、
    前記オリゴヌクレオチドは、前記末端グアニン塩基から１〜７塩基以内に存在する一塩基多型を除いて前記プローブ結合領域の核酸と相補的であり、該一塩基多型に対向する前記オリゴヌクレオチドの塩基はグアニン塩基又は前記蛍光色素の蛍光の消光作用を持たない塩基であり、ただし、該一塩基多型のうち前記末端グアニン塩基に最も接近する一塩基多型に対向する前記オリゴヌクレオチド上の塩基は、前記蛍光色素の蛍光の消光作用を持たない塩基であり；
    （ｉｉｉ）前記末端グアニン塩基に最も接近する一塩基多型に対向する前記オリゴヌクレオチド上の塩基が前記蛍光色素の蛍光の消光作用を持たない塩基であることによって、前記末端グアニン塩基に最も接近する一塩基多型に対向する前記オリゴヌクレオチド上の塩基がグアニン塩基である場合と比べて、前記標的核酸とハイブリダイズしないときの蛍光強度の低下が小さい、
    方法。
  6. 前記検出が、融解曲線分析によって行われる、請求項５に記載の方法。
  7. 前記融解曲線分析によって一塩基多型を検出する、請求項６に記載の方法。
  8. 前記試料が、被検核酸を鋳型とした核酸増幅反応により得られる増幅産物を含む、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
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