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Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Nukleinsäure-Chips zur Diagnose von Sepsis und sepsisähnlichem Syndrom (SIRS).
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Sepsis und deren Folgeerkrankungen septischer Schock und Multiorganversagen gehören zu den häufigsten Todesursachen auf operativen Intensivstationen.
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Sepsis – allgemein auch als Blutvergiftung bezeichnet – ist die aggressivste Form einer Infektion. Grundsätzlich kann jede Infektion zu einer Sepsis führen, falls der Körper nicht in der Lage ist, die Infektion auf den Ort ihres Ursprungs zu begrenzen. Dann können sowohl bakterielle Komponenten als auch endogene Mediatoren verschiedene Organe schädigen, auch wenn sich diese entfernt vom eigentlichen Infektionsherd befinden. Innerhalb weniger Stunden kann sich eine lebensbedrohliche Situation mit Multiorganversagen entwickeln. Die Sterberate bei Sepsis von 40% bis 60% hat sich seit Jahrzehnten nicht verändert. Etwa 5–10% aller Krankenhauspatienten erkranken an einer Infektion. Allein in Deutschland werden jährlich etwa 80.000 Patienten gezählt, bei denen sich aus solchen Infektionen eine Sepsis entwickelt.
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Führende internationale Forscher führen das Versagen von neuen Behandlungsmethoden vor allem auf die verspätete und unspezifische Diagnose einer Sepsis zurück. Eine schnellere und effektivere Behandlung einer Sepsis ist nur durch eine frühere Diagnose und einer verbesserten Charakterisierung der Wirtsantwort der Patienten möglich.
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Es ist insbesondere erforderlich, dass die Diagnose von Sepsis und sepsisähnlichen Zuständen sehr schnell durchführbar ist, um die entsprechende Therapie möglichst schnell zu beginnen. Weiterhin ist es hierfür erforderlich, dass eine möglichst große Zahl von Patientenproben in kurzer Zeit analysiert werden kann.
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Das Dokument Datenbank PubMed, Zusammenfassung zu: TAKAKUWA, T. u. a.: Assessment of inflammatory cytokines, nitrate/nitrite, type II phospholipase A2, and soluble adhesion molecules in systemic inflammatory response syndrome. Res. Commun. Mol. Pathol. Pharmacol. (1997) 98(1) 43–52 beschreibt veränderte Serumspiegel von Endotoxinen und Proteinen, darunter auch Cytokinen, bei SIRS und Sepsis.
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Das Dokument BRUTSCHE, M. H. u. a.: Apoptosis signals in atopy and asthma measured with cDNA arrays. Clin. Exp. Immunol. (Februar 2001) 123(2) 181–187 beschäftigt sich mit Apoptose-Signalen bei Atopie und Asthma mittels cDNA-Arrays.
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Das technische Problem der vorliegenden Erfindung besteht in der Diagnose von Sepsis und sepsisähnlichen Zuständen (SIRS) mit den o. g. Vorteilen. Dieses technische Problem wird durch die Verwendung eines Nukleinsäure-Chips (Biochip) gelöst. Die Lösung des Problems erfolgt durch die Merkmale des Anspruchs 1.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt der Begriff „Diagnose” auch die Überwachung des Verlaufs, die Erkennung der Schwere und die Bestimmung der jeweiligen Einzelprognose für die Sepsis beziehungsweise das sepsisähnliche Syndrom.
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Der Begriff „Nucleinsäuresonden”, wie er gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, bezieht sich auf Nucleinsäure alleine.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff „Nucleinsäuren” allgemein DNA und RNA jeglicher Art und aus jeglicher Quelle. Als DNA-Moleküle kann cDNA verwendet werden, die aus zellulärer oder isolierter mRNA generiert werden kann.
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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Nucleinsäure-Chip-Technologie, die ein sehr neues Forschungsfeld ist, wobei die Nucleinsäure-Chips, die bis zu mehrere 1000 Nucleinsäure-Spots aufweisen, verwendet werden können. Zu diesem Zweck werden Nucleinsäuren auf einem Träger in einem regelmäßigen Rastermuster immobilisiert. Die DNA oder RNA, die zu untersuchen ist (Target-Nucleinsäuren oder Probe), ist allgemein markiert, z. B. unter Verwendung eines Floureszenz-Farbstoffs, und wird auf den Chip aufgebracht. Im Falle der Hybridisierung von Target-Nucleinsäuren an die Nucleinsäuresonden, die an den Träger gebunden sind und komplementäre Sequenzen zur zu untersuchenden DNA oder RNA aufweisen, wird ein Signal an einer entsprechenden Position innerhalb des Rastermusters, zum Beispiel durch eine CCD-Kamera oder durch einen Laser-Scanner, in üblicher Weise detektiert.
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Mit anderen Worten, die zuvor beschriebene Chip-Technologie beruht auf der Erkenntnis, daß die Expression einer Gruppe von Molekülen gleichzeitig analysiert werden kann, in dem RNA- oder DNA-Moleküle an Nucleinsäuresonden hybridisiert werden, die auf einem Träger in einem regelmäßigen Rastermuster immobilisiert sind.
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Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf Nucleinsäure-Chips näher beschrieben; es versteht sich jedoch, daß sie nicht auf diese beschränkt ist.
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Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Nucleinsäuresonden ein Gen, ein Genprodukt, eine Splice-Variante des Gens und/oder ein Fragment des Gens, ausgewählt unter Immunmediatoren, Transkriptionsfaktoren, Akutphaseproteinen, Komplementkomponenten, Adhäsionsmolekülen, zellspezifischen Markern, Apoptose, Housekeeping-Genen oder Molekülen, die im Zusammenhang mit der Wirtsantwort auf eine Infektion stehen. Mit diesen Nucleinsäuresonden kann die Diagnose von Sepsis und sepsisähnlichen Zuständen vorteilhaft mit den oben genannten Erfordernissen durchgeführt werden.
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Der hier benutzte Begriff „Fragment” bezieht sich auf Nucleinsäuresequenzen, welche kurzer als das Gen sind, aber dennoch die Eigenschaften des Gens besitzen, und die zu einem Protein führen, das im wesentlichen die gleichen chemischen und/oder physikalischen Eigenschaften und insbesondere die funktionellen Eigenschaften des Wildtyp-Proteins besitzt.
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Für die Diagnose von Sepsis und sepsisähnlichem Zustand ist es unter Berücksichtigung der o. g. Anforderungen besonders vorteilhaft, ein Gen, ein Genprodukt, Splice-Varianten des Gens und/oder ein Fragment des Gens, ausgewählt unter Immunmediatoren, Transkriptionsfaktoren, Akutphaseproteinen, Komplementkomponenten, Adhäsionsmolekülen, zellspezifischen Markern, Apoptose, Housekeeping-Genen sowie Molekülen, die mit der Immunantwort des Körpers auf eine Infektion und Sepsis assoziiert sind, zu verwenden.
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In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt der Biochip mindestens ein Gen, ein Genprodukt, eine Splice-Variante des Gens und/oder ein Fragment des Gens, ausgewählt unter Molekülen des Koagulationssysstems und/oder infektiösen Erregern.
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Beispiele für Immunmediatoren sind Wachstumsfaktoren, wie PDGF-α, -β, Insuline wie Wachstumsfaktor (ILGF), pro- und antiinflammatorische Zytokine, wie die Interleukine IL-1 bis IL-18, Chemokine wie Plateletfaktor-4 (PF-4), γ-Interferon induziertes Protein 10 (IP 10), Wachstumsproteine Gro-α, -β, -γ, Eotaxin, Mip-1α, Mip-1β, RANTES, Wachstumsfaktor-Rezeptoren, Zytokinrezeptoren, Zytokin-induzierte Moleküle, Chemokinrezeptoren and andere Antigene des Zellwachstums.
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Transkriptionsfaktoren können EGR, NFAT- und NFκB-Proteine und Mitglieder der AP-1 und CREB Proteinfamilie sowie Transkriptionsmodulatoren sein.
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Andere Akutphaseproteine sind C-reaktive Proteine und Tissuefaktor 1 sowie Zytokine, Zytokinrezeptoren, Zytokin-induzierte Moleküle, Chemokine, Chemokinrezeptoren, Kinasen, Phosphatasen, Transkriptionsfaktoren und Transkriptionsmodulatoren.
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Beispiele für Komplementkomponenten sind Faktor H, FHL-1 und FHR codierende Gene.
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Marker für die Zellspezifität umfassen CD und Adhäsionsmoleküle, T-Zellrezeptorgene und mit dem T-Zellrezeptor assoziierte Gene, wie z. B. CD3, CD14, CD11e/CD18, CD28, CD143-Proteine, Gene, die für zellspezifische Marker kodieren, wie z. B. CD4 und CD8 für T Zellsubtypen, CD14 für Makrophagen, IgM für B-Zellen, Gene des Zellzyklus, Gene des eikosanoiden Signalweges und Wachstumsfaktorrezeptoren.
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Vertreter der Housekeeping-Gene sind Glukose-6-phosphatdehydrogenase, Aktin und Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase.
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Die zusätzlichen Moleküle, die mit der Wirtsantwort auf eine Infektion und Sepsis assoziiert sind, umfassen Gene des Zellzyklus, Kinosen, Phosphatasen und Transkriptionsfaktoren, z. B. die verschiedenen Transkripte der menschlichen Calc-Gene, die Transkripte repräsentieren, welche für Procalcitonin, Katatalcin-N-terminales Peptid, Katatalcin sowie das Calcitonin-Gen, das mit Peptid und Produkten desselben zusammenhängt, kodieren.
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Eine Endzündung wird häufig durch infektiöse Agenzien wie Mikroben verursacht. Für eine geeignete Therapie, die gegen die Ursache der Endzündung gerichtet ist, z. B. gegen die Mikroben, ist es erwünscht, möglichst viel Informationen über die Mikroben zu erhalten. Dabei können Proteine oder Gene der Mikroben auf dem Träger des Biochips, der gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, immobilisiert werden, um solche Informationen zu erhalten.
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Der Biochip der vorliegenden Erfindung kann eine der vorgenannten Sonden oder jede Kombination derselben bis hin zu allen genannten Sonden umfassen. Die Wahl der Sonden kann von einem Fachmann abhängig von der Art der zu bewertenden Erkrankung ohne weiteres bestimmt werden.
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Der Nucleinsäurechip der zuvor beschriebenen Art, insbesondere mit den vorgenannten spezifischen Nucleinsäuresonden, weist viele Vorteile bei der Diagnose von Sepsis und sepsisähnlichem Syndrom auf. Ein Vorteil besteht darin, daß die Diagnose sehr einfach und schnell durchzuführen ist, insbesondere unter Verwendung der zuvor ausdrücklich genannten Nucleinsäuresonden. Die Bestimmung kann sehr genau durchgeführt werden. Ferner können das infektiöse Agens und/oder die Reaktionen des Körpers, die durch ein infektiöses Agens verursacht werden, durch Detektionen von Genen, Genfragmenten und/oder Proteinen direkt bestimmt werden. Unter Verwendung der zuvor beschriebenen Biochips kann die Diagnose von Sepsis und sepsisähnlichem Syndrom standardisiert werden. Das Muster der exprimierten oder definierten Gene ist nicht nur für die Diagnose nützlich, sondern auch für die Früherkennung, für eine Überwachung während der Behandlung und für die Bestimmung der Schwere. Zusätzlich gestattet der bei der vorliegenden Erfindung verwendete Biochip eine Überprüfung des Fortschreitens der Erkrankung, des Fortschreitens der Sepsis und des sepsisähnlichen Syndroms und des Erfolgs der Behandlung.
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Für die Verwendung des Biochips entsprechend der vorliegenden Erfindung, kann die zu untersuchende DNA oder RNA markiert werden, beispielsweise mit Fluoreszenzfarbstoffen, und auf den Biochip aufgebracht werden. Die Hybridisierung der zu untersuchenden DNA oder RNA an die Sondenmoleküle, die an den Träger mit komplementären Sequenzen gebunden sind, kann an der entsprechenden Position innerhalb des Rasters mit üblichen Mitteln, wie beispielsweise einer CCD-Kamera oder einem Laserscanner, detektiert werden.
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Der entsprechend der vorliegenden Erfindung verwendete Biochip erlaubt eine automatisierte Analyse sowie die quantitative Bestimmung der zu untersuchenden Proben. Hiermit wird eine präzisere Information über den Verlauf der Sepsis oder des sepsisähnlichen Syndroms und insbesondere über den Behandlungserfolg ermöglicht.
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Wie bereits oben erwähnt, sind Nucleinsäuresonden und/oder Sondenproteine mit den o. g. Angaben an einem Träger immobilisiert. Das bedeutet, daß entweder nur Nucleinsäuren, nur Proteine oder Nucleinsäuren zusammen mit Proteinen an dem Träger gebunden sind.
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Auf dem entsprechend der vorliegenden Erfindung verwendeten Biochip sind die Sonden in der üblichen Art und Weise der Chiptechnologie, wie zuvor beschrieben, in einem geordneten Raster auf dem Chip immobilisiert. Ein geordnetes Raster umfaßt Bereiche auf dem Träger, in welchen die Sonden als Spots aufgebracht sind. Nucleinsäure-Chips sind üblicherweise mit einer Vielzahl solcher Bereiche ausgestattet. In diesem Fall können alle Bereiche die gleichen oder verschiedene Sonden, beispielsweise Nucleinsäuren, aufweisen.
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In einer bevorzugten Ausführungsform des gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Biochips sind die Nucleinsäuresonden auf vorbestimmten Bereichen des Trägers immobilisiert. Das bedeutet, daß die Bereiche, auf welchen die Sonden immobilisiert werden, vorher bekannt sind. Dies bedeutet auch, daß die Stelle, an der die Sonden auf dem Träger immobilisiert sind, bereits vor Benutzung des Chips bekannt ist, beispielsweise bei Behandlung mit der zu untersuchenden Probe. Damit wird eine vorteilhafte Standardisierung und Automatisierung der Diagnose von Sepsis und sepsisähnlichem Syndrom ermöglicht. Weiterhin wird die Bestimmung in einfacher und schneller Weise durchgeführt.
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In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Biochips sind die Bereiche räumlich voneinander getrennt. Damit werden in sehr vorteilhafter Weise bessere und genauere Ergebnisse, verbunden mit einer Standardisierung und Automatisierung der Diagnose von Sepsis und sepsisähnlichem Syndrom, ermöglicht.
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Das geordnete Raster der Sonden ist bevorzugt in Form von parallelen Reihen der Bereiche angeordnet. Beispiele solcher Anordnungen sind Mikrotiterplatten, bei denen die Vertiefungen die Bereiche für die Sonden repräsentieren und welche prinzipiell in parallelen Reihen angeordnet sind. Entsprechend dieser Ausführungsform wird eine standardisierte und automatisierte Bestimmung der Entzündung in vorteilhafter Weise erreicht.
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In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Träger ein Objektträger aus Glas. Zusätzlich zu seinen günstigen optischen Eigenschaften hat er die Vorteile, daß er fest ist und keine Eigenfluoreszenz aufweist, so daß er für eine schnelle und präzise Bestimmung der Entzündung besonders nützlich ist.
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Ein Verfahren zur Herstellung des Biochips gemäß der vorliegenden Erfindung ist nachfolgend beschrieben.
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Für die Herstellung des Biochips können Sonden, insbesondere Nucleinsäuren, in Spotting-Lösungen gelöst und anschließend auf den Träger mit den üblichen Spotting-Prozessen aufgebracht werden. Als Spotting-Lösung wird üblicherweise sedinischer Natriumcitrat(SSC)-Puffer benutzt, der mit 50% Dimethylsulfoxid ergänzt werden kann.
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Das Binden der Sonden, wie Nucleinsäuren, auf dem Träger kann durch kovalente oder elektrostatische (ionische) Bindung erreicht werden.
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Für eine kovalente Bindung der Sonden wird die Oberfläche der Träger zum Beispiel mit Verbindungen mit Aldehydgruppen beschichtet. Da Nucleinsäuren primäre Aminogruppen besitzen, können diese mit der Aldehydgruppe reagieren und eine Schiffsche Base bilden, welche eine kovalente Bindung darstellt.
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Für die elektrostatische Bindung von Nucleinsäuren im Besonderen wird die Tatsache genutzt, daß Nucleinsäuren prinzipiell negativ geladen sind. Durch das Vorhandensein von positiven Ladungen auf der Trägeroberfläche kann eine Bindung mit den negativ geladenen Nucleinsäuren durch Wechselwirkung zwischen den Ladungen erreicht werden. Zu diesem Zweck ist es erforderlich, die Glasoberfläche mit positiv geladenen Verbindungen zu beschichten, zum Beispiel durch eine Beschichtung mit Poly-L-Lysin und/oder Aminosilanen. Solche aktivierten Objektträger sind dem Fachmann bekannt.
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Falls erforderlich, kann durch UV-Bestrahlung eine Vernetzung der Nucleinsäuren mit dem Träger erreicht werden.
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Für die Benutzung des Biochips für die Diagnose von Sepsis und sepsisähnlichen Zuständen können die zu untersuchende, von Mensch oder Tier abgeleitete, markierte, mRNA, cDNA oder mit den Nucleinsäuresonden des Biochips hybridisiert werden und das Hybridisierungsmuster, wie bereits oben beschrieben, bestimmt werden. Die zu untersuchenden Proben können von peripheren Blutzellen aus Blutproben, insbesondere aus venösem Blut, Gewebeproben, Organen oder Organismen stammen. Die Proben können entweder direkt verwendet oder weiter gereinigt werden, um Untergruppen hämatologischer Zellpopulationen zu erhalten. Die Blutzellen können lysiert und die RNA auf übliche Weise isoliert werden. Die mRNA kann weiter gereinigt und die cDNA mittels Standardverfahren aus der mRNA synthetisiert werden.
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Die cDNA ist vorteilhafterweise von fraktionierten Zellen und gereinigter mRNA abgeleitet. Weiterhin kann die Proben-Nucleinsäure von durch PCR erzeugten Fragmenten abgeleitet werden. Der Vorteil solcher Proben besteht darin, daß besonders starke Signale erhalten werden.
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Die als Proben verwendete cDNA oder mRNA kann mit einem Marker markiert werden. Als Marker kann jede Substanz verwendet werden, die nach der Hybridisierung der Proben mit den Sonden des Biochips detektierbar ist. Beispiele für solche Marker sind Fluoreszenzfarbstoffe. Die markierte cDNA oder die markierte mRNA kann auf übliche Weise mit den Sonden des Biochips hybridisiert werden.
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Nachfolgend ist die Verwendung des Biochips gemäß der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf Nucleinsäuren näher beschrieben.
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Die zu untersuchenden menschlichen oder tierischen Zellen können von Blutproben und peripheren mononukleären Zellen des Blutes mit Standardverfahren wie Ficoll Hypaque Zentrifugation oder Lymphoprep isoliert werden. Zusätzlich können Gewebe, Organe oder Organismen, wie infektiöse Erreger, aus Patientenplasma und aus anderen biologischen Quellen verwendet werden. Die isolierten Zellen können zur Anreicherung spezifischer Subtypen, wie Monozyten, T-Zell Subtypen oder B-Zell Subtypen, verwendet werden.
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Zur Reinigung der Zellen können diese mit üblichen Verfahren wie FACS, magnetische Sortierung oder Lyse spezifischer Subtypen von Zellen weiter angereichert werden. Die gesamte RNA oder Fraktionen der gesamten RNA von Zellen, Geweben oder Organismen kann/können mittels Standardverfahren wie Extraktion mit Phenol/Chloroform, RNAzol oder Trizol isoliert werden.
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Um die Zahl der kodierenden Moleküle zu erhöhen, kann die isolierte RNA weiter zu mRNA gereinigt werden. Dies kann beispielsweise durch Oligo-dT-Selektion mittels magnetischer Beads oder durch andere Verfahren durchgeführt werden.
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Die Synthese der cDNA kann ebenfalls durch Standardverfahren erreicht werden. Die konvertierte cDNA kann durch Temperaturwechsel des biologischen Materials mittels der Polymerasekettenreaktion unter Verwendung von genspezifischen Primern in Kombination mit oder in Abwesenheit von Oligo-dT-Primern weiter angereichert werden.
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Zur Herstellung eines DNA-Arrays kann ein Träger wie z. B. ein Borofloat-33-Glasobjektträger, mit einer dünnen Polymerschicht beschichtet werden, die zum Immobilisieren der DNA brauchbar ist, wie zum Beispiel ein Silan, das reaktive Gruppen für die Immobilisierung der DNA enthält.
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Die Hybridisierung der markierten komplementären RNA oder einer markierten komplementären cDNA an die Nucleinsäuren, die auf dem Träger immobilisiert sind, kann gemäß üblichen Verfahren durchgeführt werden.
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Die Markierung der Nucleinsäuren, die in der zu untersuchenden Probe enthalten sind, kann in üblicher Weise durchgeführt werden, wie zum Beispiel durch Einbaureaktionen, zum Beispiel der Einbau von Cy3- oder Cy5- markierten Desoxynucleotiden in cDNA mittels RTPCR oder ähnlichen Reaktionen.
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Die Signaldetektion kann mittels Scannen, zum Beispiel mit einem ScanArray 2000, durchgeführt werden.
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Die Daten und das quantitative Expressionsmuster des Gens oder der Sammlung von Genen kann weiter analysiert und ausgewertet werden, zum Beispiel elektronisch durch Biocomputing unter Verwendung der geeigneten Software. Für diesen Zweck kann ein Computerprogramm verwendet werden, um eine Korellation der Expression oder der Größe der Expression eines spezifischen Gens oder einer Gruppe von Genen mit der Schwere der entzündlichen Reaktionen zu definieren, wie dies durch Bestimmung von Laborparametern oder hämodynamischen Parametern bestimmt werden kann. Ein solches Programm kann dazu verwendet werden, den Verlauf der Schwere oder das Fortschreiten der Erkrankung zu bestimmen und vorherzusagen. Zusätzlich gestattet es, den Fortschritt und die Wirkungen eines therapeutischen Ansatzes und eines Eingriffs zu verfolgen.
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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Verwendung nach der vorliegenden Erfindung wird die Konzentration an hybridisierter, markierter mRNA oder cDNA bestimmt. Mit anderen Worten bedeutet dies, daß die Menge an Nucleinsäure in der zu untersuchenden Probe quantitativ bestimmt wird, was es wiederum gestattet, den Verlauf der Sepsis oder des sepsisähnlichen Syndroms leicht zu verfolgen, zum Beispiel, um zu sehen, ob deren Behandlung erfolgreich ist oder nicht. Wenn diese erfolgreich ist, verringert sich die Menge an exprimierten Nucleinsäuren in der Probe und das detektierte Signal wird entsprechend abgeschwächt.
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Die Detektion der hybridisierten Nucleinsäure kann zum Beispiel mittels Laser-Scanning oder CCD-Geräten durchgeführt werden, und es kann eine multifraktionelle Bioinformationsanalyse miteinbezogen werden, um eine Assoziation bestimmter Gene oder den Expresionssgrad bestimmter Gene oder Proteine mit der Schwere der Erkrankung zu definieren. Die Schwere akuter und entzündlicher Reaktionen, wie zum Beispiel Sepsis, kann beispielsweise durch klinische Auswertung definiert werden, etwa durch APACHE II-Scoring.
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In einer bevorzugten Ausführungsform kann der gemäß der vorliegenden Erfindung verwendete Biochip im Zusammenhang mit akuten und chronischen Entzündungen und noch bevorzugter für die Bestimmung von durch Sepsis oder sepsisähnliche Zustände verursachten Entzündungen verwendet werden. Zum Nachweis dieser Erkrankungen ist der erfindungsgemäße Biochip besonders nützlich und ermöglicht eine schnelle und genaue Bestimmung.
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Insbesondere kann die Schwere der Entzündungsantwort in einer ausgewählten Patientengruppe durch Beurteilung der bekannten Labor- und Hämodynamik-Parameter zur Beurteilung des Verlaufs, der Schwere oder des Fortschritts der Erkrankung bestimmt werden. Die Analyse kann beispielsweise durch entsprechende Score-Systeme wie den APACHE II Score durchgeführt werden.
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Die Erfindung wird nachfolgend anhand eines Beispiels detaillierter beschrieben. Es versteht sich jedoch, daß das Beispiel die Erfindung lediglich veranschaulichen, nicht aber einschränken soll.
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Beispiel 1: Verwendung eines Biochips gemäß der vorliegenden Erfindung
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Das Gesamtblut nach APACHE II Score gruppierter Sepsis-Patienten wurde durch Venenpunktion gesammelt. Zusätzlich wurde Blut von gesunden Probanden gesammelt. Diese Proben wurden in kommerziell erhältlichen Vakutainem, die eine Lösung zur Stabilisierung der RNA enthalten, mittels entsprechender Standardverfahren gesammelt. Die RNA wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers isoliert und anschließend wurde die mRNA gemäß Standardprotokollen isoliert (http://www.microarrays.org/pdfs/YeastPolyAIsolation.pdf). Die cDNA wunde durch Einbau von Cy3- und Cy5- markierten Nucleotiden unter Nutzung von reverser Transkriptase markiert (http://www.microarrays.org/pdfs/HumanRNALabel.pdf).
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Etwa 1000 Klone wurden aus einer 75000 humane Klone enthaltenden cDNA-Bibliothek (RZPD, Berlin) entsprechend ihrer Relevanz für Sepsis und sepsisähnliche Zustände ausgewählt. Die PCR-Produkte dieser 1000 Klone wurden auf Poly-L-Lysin beschichteten Glas-Objektträgern (Telechem) mittels der Omnigrid-Spotting-Maschine (Genemachines) aufgebracht.
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Die oben beschriebenen, zu untersuchenden markierten Moleküle wurden für die Hybridisierung mit den auf den aktiviertem Träger aufgebrachten cDNAs, wie unter (http://www.microarrays.org/pdfs/Hybridization.pdf) beschrieben, verwendet. Anschließend wurde exakt gemäß dem Protokoll (http://www.microarrays.org/pdfs/ArrayWashing.pdf) gewaschen. Für das Auslesen der mit Fluoreszenzfarbstoffen markierten hybridisierten Moleküle wurde der Scanner Genepix 4000 (Axon) entsprechend der Bedienungsanleitung des Herstellers verwendet. Im Anschluß daran wurden die Daten zwischen Material, das von Sepsis-Patienten erhalten wurde, und dem gesunder Probanden verglichen und mittels der Software AIDA Array Evaluation (raytest) zur Datenanalyse die über- oder unterregulierten Gene bestimmt. Mittels der folgenden Data Mining-Verfahren wurde die Korrelation der differentiell exprimierten Gene und die Schwere der Sepsis oder des sepsisähnlichen Syndroms bestimmt. Durch Verwendung des oben beschriebenen Biochips konnte gezeigt werden, daß die Analyse der differentiellen Genexpression die Diagnose, die Quantifizierung der Schwere von Sepsis oder sepsisähnlichen Zuständen und die Messung der Therapieantwort ermöglicht.