DE10208794A1

DE10208794A1 - Verfahren zum Sortieren einsträngiger Nucleinsäuren

Info

Publication number: DE10208794A1
Application number: DE2002108794
Authority: DE
Inventors: Dirk Boekenkamp; Heike Tom Dieck; Hans-Ullrich Hoppe
Original assignee: Degussa Bioactives Deutschland GmbH and Co
Current assignee: Cargill Texturizing Solutions Deutschland GmbH and Co KG
Priority date: 2002-02-28
Filing date: 2002-02-28
Publication date: 2003-09-04
Also published as: WO2003072818A2; WO2003072818A3; AU2003214078A1

Abstract

Bei diesem Verfahren zum Sortieren einsträngiger Nukleinsäuren durch Isolierung und Hybridisierung geeigneter Nukleinsäure-Pools und abschließendes Auslesen werden die einsträngigen Nukleinsäuren mit Hilfe von auf einer festen Matrix-Oberfläche immobilisierten Fängersubstanzen (Capture), die variable und invariable Bereiche aufweisen, selektiv gebunden. Gekennzeichnet ist dieses Verfahren dadurch, dass es sich bei den Fängersubstanzen um Oligonukleotide handelt mit 5'-terminalen invariablen Anker-Sequenzen, die in komplementärer Form mindestens einmal in jeder einsträngigen Nukleinsäure vorkommen, und mit 3'-terminalen variablen Diskriminierungs-Sequenzen, bestehend aus jeder möglichen Abfolge von 10 Nukleotiden, die die Bildung von bestimmten Sorten der einsträngigen Nukleinsäuren ermöglichen. Neben diesem Verfahren wird auch dessen Verwendung zur Analyse einsträngiger Nukleinsäure-Muster, insbesondere in Schleimhaut-, Haarwurzel-, Blut-, Nerven- oder Reproduktionszellen, beansprucht, sowie die Verwendung zur Wirkungsdetektion von pharmazeutisch und/oder ernährungsphysiologisch wirksamen Verbindungen. Mit diesem neuen Verfahren ist es möglich, auf schnelle und preiswerte Art und Weise reproduzierbar, Unterschiede im einsträngigen Nukleinsäure-Pool von Zellen darzustellen.

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Sortieren einsträngiger Nucleinsäuren sowie dessen Verwendung.
Üblicherweise sind in einer typischen, menschlichen Zelle bis zu ca. 30 000 Gene mit definierter Nucleinsäure-Abfolge aktiv, die immer den momentanen Zustand der Zelle charakterisieren. Der Zustand einer Zelle gibt bspw. eine erhöhte Zellteilungsaktivität (Reproduktionszelle; Krebszelle) oder allgemein veränderte Stoffwechsel-Aktivitäten wieder, wie sie im Krankheitsfall oder üblicherweise bei Alterung auftreten. Der genetische Zellzustand reagiert aber auch auf exogene Ursachen, wie ein verändertes Ernährungsverhalten oder Intoxikationen. Die Aktivität eines speziellen Gens kann bspw. über seine mRNA als Transkriptionsprodukt oder über das resultierende Protein als Translationsprodukt bestimmt werden. Das mRNA- bzw. Proteinmuster einer Zelle spiegelt daher sehr genau deren momentanen Zustand wider.
Die Charakterisierung des Nucleinsäure-Profils von Zellen ist insbesondere auch im Zusammenhang mit dem Screenen pharmakologisch wirksamer Verbindungen in jüngster Zeit in den Vordergrund gerückt. So wurden bereits zahlreiche Methoden für die Charakterisierung des genetischen Zustandes einer Zelle bzw. deren Proteinprofils entwickelt.
Solche Methoden zur Bestimmung spezifischer, unterschiedlicher Nucleinsäure-Profile einer Zelle bedienen sich üblicherweise so genannter Arrays, d. h. spezieller Matrix-Systeme. Arrays sind definiert durch bestimmte Anordnungen immobilisierter Erkennungsspezies, die u. a. in der Diagnostik zwischenzeitlich eine bedeutende Rolle bei der simultanen Bestimmung sogenannter Analyten spielen. Beispiele sind typische Nucleinsäure-Arrays, wie sie in Southern et al., "Genomics" (1992) 13, 1008, oder in den Patenten US 5,631,134 oder US 5,795,714 beschrieben sind.
Aus WO 96/01 836 ist ein Array von DNA-Molekülen unterschiedlicher Sequenz bekannt, das mit Hilfe der Detektion spezieller Genabschnitte zur Diagnose pathogener Bakterien eingesetzt wird.
US 5,795,714 beschreibt ein Verfahren zur Replikation eines Arrays von Nucleinsäure-Proben, das im technischen Maßstab bei der Herstellung von Diagnostika zum Screenen biologischer Proben mit speziellen Zielsequenzen eingesetzt werden kann. Dabei wird im Wesentlichen zur Erstellung eines Arrays von Sonden zuerst ein erster Nucleinsäure-Satz synthetisiert, der am 3'-Ende eine konstante Sequenz bestimmter Länge und am 5'-Ende eine zufällige Sequenz bestimmter Länge aufweist; dann wird ein zweiter Nucleinsäure-Satz mit Sequenzen synthetisiert, die komplementär zur konstanten Sequenz des ersten Nucleinsäure-Satzes sind; abschließend wird der erste Nucleinsäure-Satz mit dem zweiten Nucleinsäure-Satz hybridisiert und so das gewünschte Array von Sonden erhalten, die neben einer doppelsträngigen auch eine einsträngige Region besitzen, die wiederum die zufällige Sequenz aufweist.
Die aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren und Arrays sind zum Teil sehr aufwendig gestaltet und auf die Isolierung und Identifizierung spezieller Nucleinsäuren bzw. Proteine ausgelegt, weshalb sie sich auch überwiegend mehrerer Verfahrensschritte bedienen.
Für die vorliegende Erfindung hat sich deshalb die Aufgabe gestellt, ein Verfahren zum Sortieren einsträngiger Nucleinsäuren durch Isolierung und Hybridisierung geeigneter Nucleinsäure-Pools und abschließendes Auslesen bereitzustellen, bei dem die einsträngigen Nucleinsäuren mit Hilfe von auf einer festen Matrix-Oberfläche immobilisierten Fängersubstanzen (Capture), die variable und invariable Bereiche aufweisen, selektiv gebunden werden. Mit diesem Verfahren sollte es insbesondere möglich sein, unter Zuhilfenahme einer preiswerten und schnellen Methode und auf technisch relativ einfache Art und Weise das gesamte Muster einsträngiger Nucleinsäuren einer Zelle abzubilden.
Gelöst wurde diese Aufgabe mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es sich bei den Fängersubstanzen um Oligonucleotide handelt mit 5'-terminalen, invariablen Anker-Sequenzen, die in komplementärer Form mindestens einmal in jeder einsträngigen Nucleinsäure vorkommen, und mit 3'-terminalen, variablen Diskriminierungs-Sequenzen, bestehend aus jeder möglichen Abfolge von ≤ 10 Nucleotiden, die die Bildung von bestimmten Sorten der einsträngigen Nucleinsäuren ermöglichen.
Überraschenderweise hat sich bei der routinemäßigen Anwendung dieses Verfahrens herausgestellt, dass damit nicht nur wunschgemäß das gesamte und somit vollständige Muster aller einsträngigen Nucleinsäuren einer Zelle abgebildet werden kann, sondern dass dies tatsächlich reproduzierbar möglich ist. Dadurch kann dieses Verfahren mit Hilfe eines sogenannten "Sortier-Chips" nicht nur zum Screenen von pharmazeutisch und/oder bioaktiven Verbindungen benutzt werden, sondern es können auch im medizinischen Bereich feinste Veränderungen im Nucleinsäure-Pool von Zellen mit bevorzugt hoher Teilungsrate dargestellt werden. Die Vielfalt dieser Möglichkeiten war so nicht vorherzusehen.
Ein wesentliches Ziel des Verfahrens gemäß vorliegender Erfindung ist die Bildung von bestimmten Sorten der einsträngigen Nucleinsäuren. Dabei soll gemäß Definition der Begriff "Sorte" ein bestimmtes Muster von einsträngigen Nucleinsäuren umfassen, das auf dem jeweiligen Matrix- System (bspw. einem Chip) einen definierten Verteilungsplatz einnimmt. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sollen somit nicht bestimmte Gene eines Zelltranskriptoms identifiziert und dargestellt werden, die einer Regulierung unterliegen, sondern es sollen vielmehr sich unterscheidende Muster gebildet werden, die einen bestimmten (momentanen) Zustand des Transkriptoms einer Zelle wiedergeben. Im Vordergrund des erfindungsgemäßen Verfahrens steht daher eine Zuordnung von Nucleinsäure-Mustern und nicht die Abbildung einzelner Gene, weshalb auch eine Matrix-Miniaturisierung möglich ist.
Mit dieser speziellen Array-Technik wird also im Rahmen einer Expressions-Analyse eine komplette Verteilung der einsträngigen Nucleinsäuren auf einem Array erreicht. Dazu werden Fängersubstanzen (Capture) in Form von Oligonucleotiden eingesetzt, welche alle möglichen Sequenzen abdecken. Nach Fertigstellung des Arrays werden dann die sich unterscheidenden Nucleinsäure-Pools auf verschiedenen Matrix- Plattformen (Chips) hybridisiert und die entstehenden Muster miteinander verglichen. Über geeignete Detektionssysteme (bspw. Fluoreszenz) kann das sich ergebende Muster des Nucleinsäure-Hybridisierungsereignisses angezeigt werden.
Das vorliegende Verfahren bedient sich als bevorzugte Vertreter der einsträngigen Nucleinsäuren, die in einem Ausgangspool (Analyt) sortiert werden sollen, eines Transkriptoms, bei dem es sich insbesondere um RNA und/oder DNA handelt. Dabei kommen selbstverständlich alle Möglichkeiten einsträngiger Sequenzen in Frage, wie bspw. RNA allgemein oder mRNA, cRNA, pRNA, cDNA, PNA, CNA oder Kombinationen daraus.
Auch bei den Fängersubstanzen (Capture) ist innerhalb der beanspruchten Merkmale eine breite Variation möglich. Prinzipiell müssen diese Fängermoleküle jedoch zwei Teilabschnitte aufweisen, um als solche geeignet zu sein: Sie müssen einen invariablen, bindungsbedingenden Abschnitt aufweisen, mit dem sämtliche im Analyten (Pool) vorkommenden, einsträngigen Nucleinsäuren "gefangen" werden, und sie müssen darüber hinaus einen variablen und auf der Matrix verteilungsbedingenden Abschnitt aufweisen, der gegenüber den einsträngigen Nucleinsäuren diskriminierend wirkt.
Unter dem Begriff "invariable Sequenz" versteht man gemäß vorliegender Erfindung einen einsträngigen Oligonucleotid-Abschnitt, aber auch eine einsträngige Sequenz von Olionucleotid-Analoga, jeweils mit festgelegter Nucleotid-Abfolge.
Unter dem Begriff "variable Sequenz" versteht man im Sinne der Erfindung Nucleinsäure-Sequenzen, deren Abfolge in komplementärer Form alle möglichen Sequenzen der einsträngigen, zu sortierenden Nucleinsäuren abdeckt.
Dabei hat es sich für die vorliegende Erfindung als besonders günstig gezeigt, wenn als Anker-Sequenzen der Fängersubstanzen jeweils Nucleinbase-Abfolgen mit einer Länge von 10 bis 50 Nucleotiden und insbesondere von 15 bis 25 Nucleotiden eingesetzt werden.
Für bestimmte Anwendungsfälle kann es vorteilhaft sein, wenn die Fängersubstanzen in bevorzugt regelmäßiger Verteilung sogenannte "Locked Nucleic Acids" (LNA) aufweisen, wobei sonst normale Nucleotid- Abfolgen an meist bestimmten Stellen (z. B. jede dritte Position) ein spezielles Nucleotid beinhalten, welches der Fängersubstanz hochaffine Eigenschaften verleiht. Die Bindungsfähigkeit gegenüber den einsträngigen Nucleinsäuren kann dadurch gesteigert werden.
Wie bereits beschrieben, kommt den 3'-terminalen Sequenzen zur Sortenbildung die eigentliche Diskriminierungsfunktion zu. Um sämtliche Nucleinsäuren eines Analyten einem Sortiermuster zuzuführen, sieht die Erfindung vor, dass als bevorzugte 3'-Diskriminierungs-Sequenzen Kombinationen der Nucleinbasen Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin, Uracil, Inosin und deren Analoga verwendet werden und/oder 3'-Diskriminierungs-Sequenzen mit einer Länge von 3 bis 8 Nucleotiden.
Die Anzahl der diskriminierenden Nucleotide (x) und die Anzahl der zur Verfügung stehenden Basen (meist 4, nämlich A, G, C, T) bedingen dabei die Größe der Matrix, die am Ende des Sortiezvorganges das Abbildungsmuster trägt. Ist bspw. die diskriminierende Sequenz x = 3 Nucleotide lang, ergibt sich mit den 4 üblichen Basen Adenin, Guanin, Cytosin und Thymin eine maximal mögliche Fängersubstanz-Anzahl von 64 (4³).
Steht also auf einer entsprechenden Matrix eine große Anzahl von Besetzungsplätzen zur Verfügung, kann die Länge der diskriminierenden Sequenz auch länger sein, woraus natürlich auch eine höhere Auflösung des Verteilungsmusters resultiert.
Unter dem Begriff "Matrix" versteht man im Sinne der vorliegenden Erfindung Materialien in fester oder auch gelartiger Form. Dabei sind als Matrix gemäß Erfindung insbesondere Kunststoffe, Keramiken, Gläser, Metalle, wie z. B. Edelmetalle, kristalline Materialien und/oder Membranen, jeweils mit Halbleiter-Eigenschaften, geeignet. Diese können dabei auch als dünne Schichten vorliegen.
Als besonders bevorzugt ist eine Matrix in Chipform anzusehen.
Wie ebenfalls bereits beschrieben, werden die einsträngigen Nucleinsäuren mit Hilfe der Fängersubstanz selektiv gebunden, die selbst auf der Matrix-Oberfläche immobilisiert, also gebunden sind.
Die Fängersubstanzen werden zu diesem Zweck gemäß Erfindung bevorzugt in biotinylierter Form mittels Streptavidin an die Matrix- Oberfläche gebunden, die vorzugsweise eine Schicht aus (bio-)molekularen Filamenten, wie Cellulose und Agarose, Gerüstproteinen, Hydrogelen oder Polyacrylamid darstellt.
Die Fängersubstanzen (Capture) werden dabei üblicherweise mittels Spannung an den für sie vorgesehenen Positionen des Arrays konzentriert und immobilisiert. Diese Festlegung geschieht auf bekannte Weise durch Bindung der Biotinreste, die sich am 5'-Ende befinden, mit Streptavidin, das in der Matrix-Oberfläche festgelegt ist.
Trägersysteme in Form von Halbleiterchips sind bekanntermaßen sehr gut geeignet, um elektronisch kontrollierbar spezifische Bindereaktionen von Nucleinsäuren an festgelegten, addressierbaren Stellen in Form eines Arrays durchzuführen.
Aus diesem Grund sieht die vorliegende Erfindung auch vor, dass die Bindung der Fängersubstanzen auf der Matrix-Oberfläche kovalent, quasikovalent, supramolekular, physikalisch, im elektrischen Feld, oder durch ein Molekularsieb erfolgt.
Hierdurch kann in besonders vorteilhafter Weise der zu sortierende Nucleinsäure-Pool (Analyt) einer Probe an einem Nucleinsäure-Array, bspw. auf einen Halbleiter-Chip, mit Hilfe eines elektrischen Feldes hybridisiert und anschließend die gebundenen Nucleinsäuren durch eine einfache Umkehrung der Polarität des elektrischen Feldes entfernt werden. Besonders geeignet sind deshalb elektronische Chip-Varianten.
Das für das vorliegende Verfahren vorgesehene, abschließende Auslesen ("Read Out") der festgelegten, einsträngigen Nucleinsäuren erfolgt in einer bevorzugten Verfahrensvariante durch Darstellen der nun sortierten Nucleinsäure-Fraktionen als reproduzierbare Muster.
Unterschiedliche Muster, die aus verschiedenen Ausgangs-Analyten erhalten werden, können somit in reproduzierbarer Weise miteinander verglichen werden.
Aus diesem Grund sieht die vorliegende Erfindung neben dem eigentlichen Verfahren zum Sortieren einsträngiger Nucleinsäuren auch die Verwendung dieses Verfahrens vor, wobei die Analyse einsträngiger Nucleinsäure-Muster, insbesondere in Schleimhaut-, Haarwurzel-, Blut-, Nerven- oder Reproduktionszellen, als bevorzugt anzusehen ist.
Diese Zelltypen sind vor allem deshalb geeignet, da sie hohe Teilungsraten aufweisen und auch relativ rasch auf exogene Einflüsse reagieren.
Schließlich sieht die vorliegende Erfindung noch die Verwendung des beanspruchten Verfahrens zur Wirkungsdetektion von pharmazeutisch und/oder ernährungsphysiologisch wirksamen Verbindungen, wie Nahrungszusatz- oder -ergänzungsmittel, insbesondere von Mineralstoffen, Spurenelementen, organischen Säuren, wie Aminosäuren, Carbonsäuren und Fettsäuren, sowie deren Derivaten, Salzen und Mischungen vor.
Mit diesem neuen Verfahren ist es möglich, auf schnelle und preiswerte Art und Weise reproduzierbar Unterschiede im einsträngigen Nucleinsäure- Pool unterschiedlicher Zellen innerhalb eines Individuums oder vergleichbarer Zellen verschiedener Individuen darzustellen, die auf Krankheiten, Mangel- oder Fehlernährung oder sonstige exogene Faktoren (Stress, Medikation) zurückzuführen sind und die sich das Ausprägungsbild (Phenotyp) betreffend bspw. im körperlichen und geistigen Zustand, im Verhalten und in der Psyche wiederspiegeln.
Die nachfolgenden Beispiele veranschaulichen die genannten Vorteile des beanspruchen Verfahrens zum Sortieren einsträngiger Nucleinsäuren.

Beispiel

Eingesetzt wurden als Analyt je 250 ng PolyA-RNA aus Rattenleber unbehandelter und behandelter Tiere.
Bei den Tieren handelte es sich um 24 männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem durchschnittlichen Gewicht von 121 g (±9,5), die in zwei Gruppen mit jeweils 12 Tieren eingeteilt waren. Alle Tiere erhielten per Schlundsonde viermal täglich eine halbsynthetische Diät (AIN 93 G) verabreicht. Die Diät der Kontrollgruppe ("unbehandelt") enthielt 25 mg Zn/kg Diät, die der Mangelgruppe ("behandelt") 1,3 mg Zn/kg Diät. Nach 11 Tagen wurden die Tiere nach leichter Narkose dekapitiert und das Blut für biochemische Analysen in heparinisierten Röhren aufgefangen und konserviert. Die entnommenen Gewebeproben wurden schockgefroren und bei -80°C gelagert. Die Gesamt-RNA aus der Leber wurde mit Hilfe einer modifizierten Guanidinothiocyanat/Phenol-/Chloroform-Extraktion isoliert. Als Micro-Array wurde ein NanoChip™ Cartridge der Firma Nanogen, San Diego (USA) verwendet, dessen elektronischer Halbleiter- Chip 100 (10 × 10) besetzbare Plätze und 100 einzeln ansteuerbare Elektroden aufweist (maximale Ladungsdichte: ca. 10⁹ Fragmente pro Fläche; Chipgröße: 0,7 cm²; Array-Ausdehnung: 2 mm²).
Zum Auslesen der Nucleinsäure-Muster wurde eine NanoChip™-Molecular- Biology-Workstation der Firma Nanogen, San Diego (USA) verwendet, die über einen hochsensitiven, Laser-basierten Fluoreszenz-Scanner verfügt. Sie weist zwei Laser auf, mit Anregungswellenlängen von 635 nm (Laser I) und 532 nm (Laser II).
Die Detektion erfolgte mit Hilfe einer Photomultiplier-Methode (Strahlungswellenlänge I: 660 bis 720 nm (Cy 5); Emissionswellenlänge II: 550 bis 600 nm (Cy 3)).

Verfahrensbeschreibung

Die 64 Fängersubstanzen (Capture) in Form von Oligonucleotiden, bestehend aus 18mer dT und 3 diskriminierenden Basen (siehe Abb. 1), die an jeder dritten T-Basenstelle anstelle eines normalen Desoxyribonucleotids eine sogenannte Locked Nucleic Acid (LNA) aufwiesen, wurden mittels Spannung (2,0 Volt) an den vorhergesehenen Positionen des Arrays 1 min lang konzentriert und immobilisiert (Verteilung siehe Abb. 2). Die Immobilisierung der biotinylierten Fägersubstanzen erfolgte durch Bindung über Streptavidin in der Agarose- Schicht von 2 Chips als Trägermatrix. Nach Immobilisierung der Capture erfolgte die elektronische Hybridisierung. Dazu wurden die unmarkierten PolyA-RNA-Proben der behandelten und unbehandelten Tiere für 2 Minuten und unter 2,1 Volt auf den beiden Chips hybridisiert. Nach der Hybridisierung erfolgte im Gerät eine Diskriminierungsreihe mittels Gegenspannung von -0,5 bis -1,08 Volt, um unspezifisch gebundene Moleküle zu entfernen. Nach der Diskriminierung wurde zur Markierung ein sogenanntes Enzymatic Reporting unter Einbau Fluoreszenz-markierter Nucleotide (Cy 5-CTP) durchgeführt. Mittels Laseranregung im Lesegerät wurde anschließend das Muster Fluoreszenz-optisch dargestellt (siehe Abb. 3).
Aufgrund der dargestellten Fluoreszenz-Signale lassen sich unterschiedliche Muster der einsträngigen Nucleinsäure (RNA) von unbehandelten Tieren (Kontrollgruppe A) und behandelten Mangeltieren (Testgruppe B) reproduzierbar optisch darstellen. Abb. 1 Sequenzen der 64 Capture-Oligonucleotide

Abb. 2 Verteilung der Fängersubstanzen (Capture)
Dargestellt ist die Verteilung der Fängersubstanzen auf einem Chip mit 10 × 10 Besetzungsplätzen; die Spalten 1 und 2 enthalten sequenzspezifische Kontrollgen-Oligonucleotide; leere Felder bedeuten unbesetzte Chipplätze. Abb. 3 Read-Out-Muster: (A) Kontroll- und (B) Mangeltier-RNA

Claims

1. Verfahren zum Sortieren einsträngiger Nucleinsäuren durch Isolierung und Hybridisierung geeigneter Nucleinsäure-Pools und abschließendes Auslesen, wobei die einsträngigen Nucleinsäuren mit Hilfe von auf einer festen Matrix-Oberfläche immobilisierten Fängersubstanzen (Capture), die variable und invariable Bereiche aufweisen, selektiv gebunden werden, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Fängersubstanzen um Oligonucleotide handelt mit 5'-terminalen, invariablen Anker-Sequenzen, die in komplementärer Form mindestens einmal in jeder einsträngigen Nucleinsäure vorkommen, und mit 3'-terminalen, variablen Diskriminierungs- Sequenzen, bestehend aus jeder möglichen Abfolge von ≤ 10 Nucleotiden, die die Bildung von bestimmten Sorten der einsträngigen Nucleinsäuren ermöglichen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den einsträngigen Nucleinsäuren um ein Transkriptom, insbesondere um RNA und/oder DNA handelt.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Anker-Sequenzen jeweils Nucleinbase- T-Abfolgen mit einer Länge von 10 bis 50 Nucleotiden und insbesondere von 15 bis 25 Nucleotiden eingesetzt werden.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Fängersubstanzen in bevorzugt regelmäßiger Verteilung "Locked Nucleic Acids" (LNA) aufweisen.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass 3'-Diskriminierungs-Sequenzen verwendet werden, die Kombinationen der Nucleinbasen Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin, Uracil und Inosin und/oder deren Analoga enthalten.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die 3'-Diskriminierungs-Sequenz eine Länge von 3 bis 8 Nucleotiden aufweist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass als Matrix Kunststoffe, Keramik, Gläser, Metalle, Harze, Gele, kristalline Materialien und/oder Membranen, jeweils mit Halbleiter-Eigenschaften, und bevorzugt in Chipform, eingesetzt werden.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Fängersubstanzen, bevorzugt in biotinylierter Form, mittels Streptavidin an die Matrix-Oberfläche gebunden werden, die vorzugsweise eine Schicht aus (bio-)molekularen Filamenten, wie Cellulose und Agarose, Gerüstproteinen, Hydrogelen oder Polyacrylamid darstellt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Bindung der Fängersubstanzen auf der Matrix-Oberfläche kovalent, quasikovalent, supramolekular, physikalisch, im elektrischen Feld oder durch ein Molekularsieb erfolgt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das abschließende Auslesen durch Darstellen der sortierten Nucleinsäure-Fraktionen als reproduzierbare Muster erfolgt.

11. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Analyse einsträngiger Nucleinsäure-Muster, insbesondere in Schleimhaut-, Haarwurzel-, Blut-, Nerven- oder Reproduktionszellen.

12. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Wirkungsdetektion von pharmazeutisch und/oder ernährungsphysiologisch wirksamen Verbindungen, wie Nahrungszusatz- oder -ergänzungsmittel, insbesondere von Mineralstoffen, Spurenelementen, organischen Säuren, wie Aminosäuren, Carbonsäuren und Fettsäuren, sowie deren Derivaten, Salzen und Mischungen.