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Die vorliegende Erfindung betrifft
ein Verfahren zur Identifikation infektionsspezifisch regulierter
Gene der Haut, Test-Kits und Biochips zur Identifikation infektionsspezifisch
regulierter Gene der Haut sowie ein Testverfahren zum Nachweis der
Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen
mikrobielle Infektionen der Haut sowie ein Screening-Verfahren zur
Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen
gegen mikrobielle Infektionen der Haut und ein Verfahren zur Herstellung
einer kosmetischen oder pharmazeutischen Zubereitung gegen mikrobielle
Infektionen der Haut.
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Das menschliche Genom umfasst nach
jüngsten
Schätzungen
mindestens 30.000–50.000
Gene. Von diesem immensen Informationsangebot verwendet jede Zelle
jedoch lediglich einen kleinen, für sie spezifischen Teil für die Synthese
von Proteinen, der sich im Genexpressionsmuster wiederspiegelt.
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Die Haut ist das größte Organ
des menschlichen Körpers.
Sie ist ein sehr komplex aufgebautes Organ, das aus einer Vielzahl
verschiedener Zelltypen besteht und die Grenzfläche des Körpers zur Umwelt bildet. Diese
Tatsache verdeutlicht, dass die Zellen der Haut in besonderem Maße exogenen
Signalen der Umwelt, physikalischer, chemischer und biologischer
Natur ausgesetzt werden. Für
das Verständnis
von Hautreaktionen auf exogene Stimuli ist die Analyse der Genexpression
in der Haut von entscheidender Bedeutung.
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Die Expression der Gene in differenzierten
Zellen der Haut ist nicht konstant, sondern sehr dynamisch. Extrazelluläre Stimuli
wirken über
zum Teil komplexe Signaltransduktionskaskaden auf die Transkription
lebender Zellen. Die Regulation der Transkription als Antwort auf
extrazelluläre
Signale wird als Stimulus-Transkriptions-Kopplung
bezeichnet.
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Ein Umweltreiz, mit dem die Haut
ständig
konfrontiert wird, ist der Kontakt mit Mikroorganismen. Darunter
fallen sowohl harmlose bzw. nützliche
als auch potenziell pathogene Keime, die für Infektionen der Haut verantwortlich
sind. Wie die Haut auf die Besiedlung mit Mikroorganismen reagiert
und wie sie zwischen "harmlosen" und pathogenen Keimen
differenziert, ist weitgehend unbekannt.
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Jeder Zelltyp der Haut exprimiert
ca. 15 000 verschiedene Gene und synthetisiert daraus entsprechend
viele Proteine. Welche Gene davon für die Interaktion mit hautrelevanten
Mikroorganismen von Bedeutung sind, ist kaum erforscht.
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Aus Kagnoff MF und Eckmann L, Curr
Opin Microbiol 2001, 4: 246–250,
ist bekannt, Gen-Expressionsprofile zur Erforschung der Interaktion
zwischen Wirtsorganismus und mikrobiellem Pathogen einzusetzen. Unter
anderem wird der Einsatz von SAGE, TOGA und DNA-Microarrays vorgeschlagen.
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Weitgehend ähnliche Ansätze sind den Publikationen
Kellam P, Genome Biology 2000, 1 (2): reviews 1009.1–1009.4;
Manger ID und Relman DA, Curr Opin Immunol 2000, 12: 215–218 und
Yowe D et al., Microbes and Infection 2001, 3: 813–821 zu
entnehmen.
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Der Stand der Technik erschöpft sich
allerdings in der nur mit enormem Aufwand umsetzbaren Anregung,
die Expressionsprofile mikrobiell infizierter Zellen mit denen nicht
infizierter Zellen eines Gewebetyps zu vergleichen. Die bislang
vorliegenden Studien werden als "proof-of-concept
experiments" bezeichnet,
beispielsweise in Manger ID und Relman DA, Curr Opin Immunol 2000,
12:216, rechte Spalte, letzter Absatz.
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Ein praktisch durchführbares
Verfahren zur Identifikation der Gene, die in Folge einer mikrobiellen
Infektion der Haut einer spezifischen Regulation unterworfen werden,
ist bislang nicht beschrieben worden.
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Der vorliegenden Erfindung liegt
daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Identifikation der Gene
bereitzustellen, die in Folge einer mikrobiellen Infektion der Haut
einer spezifischen Regulation unterworfen werden, das die genannten
Nachteile des Standes der Technik überwindet.
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Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch
ein Verfahren zur Identifikation infektionsspezifisch regulierter
Gene der Haut in vitro, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
- a) ein erstes Gemisch von in mikrobiell infizierter
Haut exprimierten genetisch codierten Faktoren gewinnt,
- b) ein zweites Gemisch von in nicht infizierter Haut exprimierten
genetisch codierten Faktoren gewinnt,
- c) die in a) und b) gewonnenen Gemische mit Hilfe eines hautspezifische
Sonden enthaltenden Biochips analysiert und
- d) die Analyseergebnisse miteinander vergleicht und dadurch
die in mikrobiell infizierter Haut bzw. in nicht infizierter Haut
exprimierten Gene identifiziert und ihre Expression quantifiziert.
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Unter "exprimierten genetisch codierten Faktoren" werden erfindungsgemäß Proteine,
mRNA-Moleküle
oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen verstanden.
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Im Rahmen der vorliegenden Erfindung
umfaßt
der Begriff "Haut" natürliche Haut
von Menschen oder Tieren, die gentechnisch humanisierte Haut eines
Tieres und auch ein sogenanntes Hautmodell auf der Basis menschlicher
und/oder tierischer Hautzellen. Außerdem umfaßt der Begriff "Haut" alle epithelialen
Deckgewebe bei Mensch und Tier, einschließlich der Kopfhaut und der
Schleimhäute,
z. B. der Mundschleimhaut oder der Vaginalschleimhaut.
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Ein erfindungsgemäß besonders geeignetes Hautmodell
ist unter der Bezeichnung "SkinEthic® reconstituted
human epithelial tissue" (Fa.
SkinEthic, Frankreich) bekannt. Hierbei handelt es sich um ein dreidimensionales
rekonstruiertes humanes Epithelialmodell. Das Modell wird aus transformierten
humanen Keratinozyten (TR146) aus Plattenepithelkarzinom hergestellt.
Die Keratinozyten werden auf einem inerten Polycarbonatfilter in
einem definierten Medium kultiviert. Dabei bildet sich ein Epithel
ohne Stratum Corneum aus, das die Eigenschaften des epithelialen
Teils der humanen Cornea besitzt.
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Erfindungsgemäß geeignete hautspezifische
Sonden sind insbesondere die in den zum Anmeldetag der vorliegenden
Patentanmeldung noch unveröffentlichten
Patentanmeldungen PCT/EP01/15179 und
DE-A-101 00 127.4-41 genannten
Sonden, die zur spezifischen Bindung an mindestens eines der Proteine, mRNA-Moleküle oder
Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen befähigt sind, die in Haut stärker oder schwächer (d.
h. differentiell) exprimiert werden als in anderen Geweben.
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Das erfindungsgemäße Verfahren ist bei Infektion
mit jedem Erreger anwendbar, der Haut befallen kann. Bevorzugt sind
jedoch mikrobielle Erreger, die ausgewählt sind unter Pilzen und Bakterien;
insbesondere unter den Pilzen Candida albicans, Candida glabrata,
Candida dubliniensis, Candida tropicalis, Trichophyton mentagrophytes,
Trichophyton rubrum, Microsporum canis, Epidermophyton floccosum
und Malassezia furfur sowie unter den Bakterien Staphylococcus aureus,
Staphylococcus epidermis, Propionibacterium acnes, Streptococcus
mutans und Corynebacterium xerosis.
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Vorzugsweise gewinnt man in den Schritten
a) und b) des Verfahrens zur Identifikation infektionsspezifisch
regulierter Gene der Haut die jeweiligen Gemische aus einer Hautprobe,
insbesondere aus einer Vollhautprobe oder aus einer Epidermisprobe.
Hierbei liefert die Vollhautprobe Exemplare aller in der Haut repräsentierten
Zelltypen. Die Epidermisprobe ist hingegen leichter zu gewinnen,
beispielsweise durch Aufbringen eines Klebebandes auf die Haut und Abreißen desselben,
wie in der WO 00/10579 beschrieben, auf die hiermit in vollem Umfang
Bezug genommen wird.
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In einer weiteren Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
zur Identifikation infektionsspezifisch regulierter Gene der Haut
gewinnt man in den Schritten a) und b) die jeweiligen Gemische mittels Mikrodialyse.
Die Technik der Mikrodialyse wird beispielsweise in "Microdialysis: A
method for measurement of local tissue metabolism", Nielsen PS, Winge
K, Petersen LM; Ugeskr Laeger 1999 Mar 22 161: 12 1735–8; sowie
in "Cutaneous microdialysis
for human in vivo dermal absorption studies", Anderson, C. et al.; Drugs Pharm.
Sci., 1998, 91, 231–244;
und auch im Internet unter http://www.microdialysis.se/techniqu.htm
beschrieben, worauf hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
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Bei der Anwendung der Mikrodialyse
führt man
typischerweise eine Sonde in die Haut ein und beginnt mit einer
geeigneten Trägerlösung die
Sonde langsam zu spülen.
Nach dem Abklingen der akuten Reaktionen nach dem Einstich liefert
die Mikrodialyse Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen
oder mRNA-Molekülen,
die im extrazellulären
Raum vorkommen und die, beispielsweise durch Fraktionierung der Trägerflüssigkeit,
dann in vitro isoliert und analysiert werden können. Die Mikrodialyse ist
weniger invasiv, als die Entnahme einer Vollhautprobe; sie ist aber
nachteiligerweise auf die Gewinnung im extrazelulären Raum vorkommender
Verbindungen beschränkt.
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Ein in Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens
einsetzbarer Biochip umfasst
- i. einen festen,
d. h. starren oder flexiblen Träger
und
- ii. auf diesem immobilisierte hautspezifische Sonden, wie in
den zum Anmeldetag der vorliegenden Patentanmeldung noch unveröffentlichten
Patentanmeldungen PCT/EP01/15179 und DE-A-101 00 127.4-41 genannt,
die zur spezifischen Bindung an mindestens eines der Proteine, mRNA-Moleküle oder
Fragmente von Proteinen oder mRNA- Molekülen befähigt sind, die in Haut stärker oder
schwächer
(d. h. differentiell) exprimiert werden als in anderen Geweben.
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Erfindungsgemäß bevorzugt einsetzbar ist
ein Biochip zur Identifikation von durch eine Infektion mit Candida,
insbesondere Candida albicans, infektionsspezifisch regulierten
Genen der menschlichen Haut in vitro, umfassend
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- i. einen Träger
und
- ii. auf diesem immobilisierte hautspezifische Sonden, die zur
spezifischen Bindung an mindestens eines der Proteine, mRNA-Moleküle oder
Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen befähigt sind, die in in Tabelle
1, Gruppen 1 bis 5, insbesondere Gruppen 3 bis 5, vorzugsweise Gruppen
4 und 5, besonders bevorzugt in Gruppe 5 aufgeführt und durch ihre UniGene
Accession Number definiert sind; ganz besonders bevorzugt, die in
den Tabellen 2 bis 8 aufgeführt
sind.
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Erfindungsgemäß besonders bevorzugt einsetzbar
ist ein Biochip, der zusätzlich
zu den obengenannten Sonden weitere Sonden umfaßt, die zur spezifischen Bindung
an mindestens eines der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen
oder mRNA-Molekülen
befähigt
sind, die durch Transkription und/oder Translation in dem Fachmann
bekannter Weise aus den Genen abgeleitet werden können, die
in Liste 1 aufgeführt
sind.
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Bei einem Biochip handelt es sich
um ein miniaturisiertes Funktionselement mit auf einer Oberfläche immobilisierten
Molekülen,
insbesondere Biomolekülen,
die als spezifische Interaktionspartner dienen können.
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Häufig
weist die Struktur dieser Funktionselemente Reihen und Spalten auf;
man spricht dann von Chip-"Arrays". Da tausende von
biologischen bzw. biochemischen Funktionselementen auf einem Chip
angeordnet sein können,
müssen
diese in der Regel mit mikrotechnischen Methoden angefertigt werden.
Als biologische und biochemische Funktionselemente kommen insbesondere
in Frage: DNA, RNA, PNA, (bei Nukleinsäuren und ihren chemischen Derivaten können z.
B. Einzelstränge,
Triplex-Strukturen oder Kombinationen hiervon vorliegen), Saccharide,
Peptide, Proteine (z. B. Antikörper,
Antigene, Rezeptoren) und Derivate der kombinatorischen Chemie (z.
B. organische Moleküle).
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Im allgemeinen haben Biochips eine
2D-Basisfläche
für das
Beschichten mit biologisch oder biochemisch funktionellen Materialien.
Die Basisflächen
können
beispielweise auch von Wänden
einer oder mehrerer Kapillaren oder von Kanälen gebildet sein.
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Zum Stand der Technik kann z. B.
auf folgende Publikationen hingewiesen werden: Nature Genetics, Vol.
21, supplement (Gesamt), Jan. 1999 (Biochips); Nature Biotechnology,
Vol. 16, S. 981–983,
Okt. 1998 (Biochips); Trends in Biotechnology, Vol. 16, S. 301–306, Jul.
1998 (Biochips) sowie die bereits genannten Übersichtsartikel von Akhilesh
Pandey und Matthias Mann: "Proteomics
to study genes and genomes",
Nature, Volume 405, Number 6788, 837–846 (2000), und "Genomics, gene expression
and DNA arrays",
Nature, Volume 405, Number 6788, 827–836 (2000), und die dort angegebenen
Referenzen, worauf hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
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Eine übersichtliche Darstellung der
praktischen Anwendungsverfahren der DNA-Chiptechnologie liefern
die Bücher "DNA Microarrays:
A Practical Approach" (Editor:
Mark Schena, 1999, Oxford University Press) und "Microarray Biochip Technology" (Editor: Mark Schena,
2000, Eaton Publishing), auf die hiermit in vollem Umfang Bezug
genommen wird.
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Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung
besonders bevorzugte DNA-Chiptechnologie
beruht auf der Fähigkeit
von Nukleinsäuren
komplementäre
Basenpaarungen einzugehen. Dieses als Hybridisierung bezeichnete
technische Prinzip wird bereits seit Jahren bei der Southern-Blot-
und Northern-Blot-Analyse
eingesetzt. Im Vergleich zu diesen herkömmlichen Methoden, bei denen
lediglich einige wenige Gene analysiert werden, gestattet es die
DNA-Chiptechnologie
einige hundert bis zu mehreren zehntausend Genen parallel zu untersuchen.
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Ein DNA-Chip besteht im wesentlichen
aus einem Trägermaterial
(z.B. Glas oder Kunststoff), auf dem einzelsträngige, genspezifische Sonden
in hoher Dichte an einer definierten Stelle (Spot) immobilisiert
werden. Als problematisch wird dabei die Technik der Sonden-Applikation
und die Chemie der Sonden-Immobilisierung eingeschätzt.
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Nach dem derzeitigen Stand der Technik
sind mehrere Wege der Sonden-Immobilisierung
realisiert:
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E.M. Southern (E.M. Southern et al.
(1992), Nucleic Acid Research 20, 1679–1684 und E.M. Southern et
al. (1997), Nucleic Acid Research 25, 1155–1161) beschreibt die Herstellung
von Oligonukleotidanordnungen durch direkte Synthese an einer Glasoberfläche, die
mit 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan und anschließend mit
einem Glycol derivatisiert wurde.
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Ein ähnliches Verfahren realisiert
die in situ Synthese von Oligonukleotiden mittels einer photosensitiven,
kombinatorischen Chemie, die mit photolithographischen Techniken
verglichen werden kann (Pease, A.C. et al. (1994), Proc. Natl Acad
Sci USA 91, 5022–5026).
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Neben diesen auf der in situ-Synthese
von Oligonukleotiden beruhenden Techniken können ebenso bereits vorhandene
DNA-Moleküle
an Oberflächen
von Trägermaterial
gebunden werden.
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P.O. Brown (DeRisi et al. (1997),
Science 278, 680–686)
beschreibt die Immobilisierung von DNA an mit Polylysin beschichteten
Glasoberflächen.
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Die Veröffentlichung von L.M. Smith
(Guo, Z. et al. (1994), Nucleic Acid Research 22, 5456–5465) legt ein ähnliches
Verfahren offen: Oligonukleotide, die eine 5'terminale Aminogruppe tragen, können an
eine Glasoberfläche
gebunden werden, die mit 3-Aminopropyltrimethoxysilan und anschließend mit
1,4-Phenyldiisothiocyanat
behandelt wurde.
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Die Applikation der DNA-Sonden auf
einem Träger
kann mit einem sogenannten "Pin-Spotter" erfolgen. Dazu tauchen
dünne Metallnadeln
mit z.B. einem Durchmesser von 250 μm, in Sondenlösungen ein
und überführen anschließend das
anhängende
Probenmaterial mit definierten Volumina auf das Trägermaterial des
DNA-Chips.
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Bevorzugterweise erfolgt die Sondenapplikation
jedoch mittels eines piezogesteuerten Nanodispensers, der ähnlich einem
Tintenstrahldrucker, Sondenlösungen
mit einem Volumen von 100 Picolitern kontaktfrei auf die Oberfläche des
Trägermaterials
aufbringt.
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Die Immobilisierung der Sonden erfolgt
z.B. wie in der EP-A-0 965 647 beschrieben: Die Generierung von
DNA-Sonden erfolgt hierbei mittels PCR unter Verwendung eines sequenzspezifischen
Primerpaares, wobei ein Primen am 5'-Ende
modifiziert ist und einen Linker mit einer freien Aminogruppe trägt. Damit
ist sichergestellt, dass ein definierter Strang der PCR-Produkte
an einer Glasoberfläche
gebunden werden kann, welche mit 3-Aminopropyltrimethoxysilan und
anschließend
mit 1,4-Phenyldiisothiocyanat behandelt wurde. Die genspezifischen
PCR-Produkte sollen idealerweise eine definierte Nukleinsäuresequenz
in einer Länge
von 200–400
by haben und nicht redundante Sequenzen beinhalten. Nach der Immobilisierung
der PCR-Produkte über
den derivatisierten Primer wird der Gegenstrang des PCR-Produkts
durch eine Inkubation bei 96°C
für 10
Min entfernt.
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In einer für DNA-Chips typischen Anwendung
wird mRNA aus zwei zu vergleichenden Zellpopulationen isoliert.
Die isolierten mRNAs werden mittels reverser Transkription unter
Verwendung von z.B. fluoreszenzmarkierten Nukleotiden in cDNA umgewandelt.
Dabei werden die zu vergleichenden Proben mit z.B. rot bzw. grün fluoreszierenden
Nukleotiden markiert. Die cDNAs werden dann mit den auf dem DNA-Chip
immobilisierten Gensonden hybridisiert und anschließend die
gebundenen Fluoreszenzen quantifiziert.
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Der erfindungsgemäße Biochip umfasst bevorzugt
1 bis etwa 5000, bevorzugtermaßen
1 bis etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 500, vorzugsweise etwa
10 bis etwa 250, besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 100 und ganz
besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 50 voneinander verschiedene
Sonden. Die voneinander verschiedenen Sonden können jeweils in mehrfacher
Kopie auf dem Chip vorhanden sein.
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Der Erfindungsgemäße Biochip umfasst bevorzugt
Nukleinsäuresonden,
insbesondere RNA- oder PNA-Sonden, besonders bevorzugt DNA-Sonden.
Die Nukleinsäuresonden
weisen bevorzugt eine Länge
von etwa 10 bis etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 800, vorzugsweise
etwa 100 bis etwa 600, besonders bevorzugt etwa 200 bis etwa 400
Nukleotiden auf.
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In einer weiteren bevorzugten Form
umfasst der Erfindungsgemäße Biochip
Peptid- oder Proteinsonden, insbesondere Antikörper.
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Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden
Erfindung ist ein Testverfahren zum Nachweis der Wirksamkeit von
kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen mikrobielle
Infektionen der Haut in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man
- a) den Hautstatus mikrobiell infizierter Haut
durch ein Erfindungsgemäßes Verfahren
zur Identifikation infektionsspezifisch regulierter Gene der Haut
bestimmt,
- b) einen Wirkstoff gegen mikrobielle Infektionen der Haut einmal
oder mehrmals auf die Haut aufbringt,
- c) erneut den Hautstatus durch ein erfindungsgemäßes Verfahren
zur Identifikation infektionsspezifisch regulierter Gene der Haut
bestimmt, und
- d) die Wirksamkeit des Wirkstoffs durch den Vergleich der Ergebnisse
aus a) und c) bestimmt.
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Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden
Erfindung ist ein Test-Kit zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen
oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen mikrobielle Infektionen
der Haut in vitro, umfassend Mittel zur Durchführung des erfindungsgemäßen Testverfahrens.
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Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden
Erfindung ist ein Screening-Verfahren
zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen
gegen mikrobielle Infektionen der Haut in vitro, dadurch gekennzeichnet,
daß man
- a) den Hautstatus mikrobiell infizierter Haut
durch ein erfindungsgemäßes Verfahren
zur Identifikation infektionsspezifisch regulierter Gene der Haut
oder mittels eines erfindungsgemäßen Test-Kits
zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen
Wirkstoffen gegen mikrobielle Infektionen der Haut in vitro bestimmt,
- b) einen potentiellen Wirkstoff gegen mikrobielle Infektionen
der Haut einmal oder mehrmals auf die Haut aufbringt,
- c) erneut den Hautstatus durch ein erfindungsgemäßes Verfahren
zur Identifikation infektionsspezifisch regulierter Gene der Haut
oder mittels eines erfindungsgemäßen Test-Kits
zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen
Wirkstoffen gegen mikrobielle Infektionen der Haut in vitro bestimmt,
und
- d) die Wirksamkeit des Wirkstoffs durch den Vergleich der Ergebnisse
aus a) und c) bestimmt.
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Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden
Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer kosmetischen oder
pharmazeutischen Zubereitung gegen mikrobielle Infektionen der Haut,
dadurch gekennzeichnet, daß man
- a) wirksame Wirkstoffe mit Hilfe des erfindungsgemäßen Screening-Verfahrens bestimmt
und
- b) als wirksam befundene Wirkstoffe mit kosmetisch und pharmakologisch
geeigneten und verträglichen Trägern vermischt.
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Ein weiterer Gegenstand der Erfindung
ist die Verwendung von Biochips nach einem der Ansprüche 7 bis
13 zur Durchführung
von in vitro Maßnahmen
zur Identifikation, Prophylaxe, Therapie und Therapiekontrolle von
mikrobiellen Hauterkrankungen.
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Das folgende Beispiel erläutert die
Erfindung, ohne sie jedoch darauf einzuschränken:
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Ermittlung von differenziell
exprimierten Hautgenen infolge einer Infektion mit C. albicans
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Zellen von C. albicans (SC5314) wurden über Nacht
bei 30°C
in Minimalmedium (0,67% Yeast Nitrogen Base, 2% Glukose) angezogen,
abzentrifugiert und in PBS resuspendiert, so dass sich eine Zelldichte
von 4 × 107 ergab. Mit 50 μl dieser
Suspension wurden Hautmodelle (Fa. Skinethics) überschichtet und 6h bzw. 24h
inkubiert (37°C,
100% rLF, 5% CO2). Als Kontrolle wurden
mit PBS überschichtete
Hautmodelle mitinkubiert. Die entsprechenden Hautmodelle wurden
entweder für
histologische Schnitte in Formalin eingelegt, oder für die spätere Präparation
der RNA bei –20°C gelagert.
Die Durchführung
der histologischen Untersuchungen und der RNA-Präparation erfolgte nach Standardmethoden.
Aus der RNA synthetisierte cDNA wurde verwendet, um DNA-Microarrays zu hybridisieren,
so dass eine differenzielle Expression von Hautgenen infolge der Candida-Infektion
ermitttelt werden konnte.
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Wie die histologischen Schnitte zeigen,
befinden sich nach 6h zahlreiche hyphale Candida-Zellen an der Oberfläche des
Hautmodells, das histologisch weitgehend unversehrt erscheint. Nach
24h haben die Hyphen die Zellschicht jedoch vollständig durchdrungen.
(1)
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Die DNA-Array Daten zeigen eine differenzielle
Expression zahlreicher Gene bereits nach 6h Inkubation. Die exakten
Werte der Repression bzw. Induktion sind der Tabelle 9 zu entnehmen.
Der Variationskoeffizient gibt die Streuung aus den Parallelmessungen
an (Alle Versuche wurden in Doppelbestimmungen durchgeführt).
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Abb.
1.: in vitro Infektion von Hautmodellen mit C. albicans
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Tabellen und Listen:
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Tabelle 1 zeigt die Expressionsprofile
infektionsspezifisch regulierter Gene der Haut nach einer Infektion
mit Candida albicans (nach 6 bzw. 24 Stunden nach der Infektion),
eingeteilt nach dem Grad der differentiellen Expression in 5 Gruppen,
wobei Gruppe 1 schwach differentiell exprimierte und Gruppe 5 besonders stark
differentiell exprimierte Gene beinhaltet, d.h. ein nach dem Betrag
niedriger Wert steht in Gruppe 1, ein hoher in 5.
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In Gruppe 1 der Tabelle 1 sind alle
Gene aufgelistet, die nach 6-stündiger
oder 24-stündiger
Inkubationmindestens 1,5-fach und weniger als 2,6-fach differentiell
exprimiert sind.
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In Gruppe 2 der Tabelle 1 sind alle
Gene aufgelistet, die nach 24-stündiger
Inkubation mindestens 2,6-fach differentiell exprimiert sind.
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In Gruppe 3 der Tabelle 1 sind alle
Gene aufgelistet, die nach 6-stündiger
Inkubation mindestens 2,6-fach und weniger als 7,0-fach differentiell
exprimiert sind. In Gruppe 4 der Tabelle 1 sind alle Gene aufgelistet,
die die nach 6-stündiger
Inkubation mindestens 7,1-fach und weniger als 10,0-fach differentiell
exprimiert sind.
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In Gruppe 5 der Tabelle 1 sind alle
Gene aufgelistet, die die nach 6-stündiger Inkubation mindestens 10,1-fach
oder nach 24-stündiger
Inkubation mindestens 100-fach differentiell exprimiert sind.
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Die Quotienten in Spalte 5 und 6
der Tabelle 1 geben die Stärke
der differentiellen Expression an, d. h., um welchen Faktor das
jeweilige Gen in infizierter Haut stärker exprimiert wird, als in
nicht infizierter Haut, oder umgekehrt.
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Unter ihrer UniGene-Accession-Number
sind die jeweiligen Gene bzw. Genprodukte in der Datenbank des National
Center for Biotechnology Information (NCBI) offenbart. Diese Datenbank
ist im Internet unter folgender Adresse zugänglich: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.
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Die Gene bzw. Genprodukte sind außerdem unter
den Internet-Adressen http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/Hs.Home.html
oder http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide direkt zugänglich.
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Die Tabellen 2 bis 8 stellen Untermengen
der Tabelle 1 dar und erläutern
die Bedeutung einiger differentiell exprimierter Gene nach einer
Candida-Infektion. Die in den Tabellen 2 bis 8 beschriebenen Effekte
sind als besonders wichtig einzuordnen, da sie in keiner Weise vorhersehbar
waren. Diese sind im einzelnen:
Tabelle 2: Candida induziert
die Expression von Rezeptoren, die zur Anheftung an die Wirtszelloberfläche dienen
können
Tabelle
3: Candida reguliert die Sekretion herab
Tabelle 4: Candida
reguliert die Fettsäureoxidation
herab
Tabelle 5: Candida induziert/reprimiert Stressantworten,
die sonst durch andere Faktoren induziert werden
Tabelle 6:
Candida-Infektionen führen
zu gleichen Expressionsveränderungen
wie Tumoren
Tabelle 7: Candida reguliert unbekannte Gene/nicht
charakterisierte Proteine
Tabelle 8: weitere überraschende
Effekte
Tabelle 9 zeigt die differenzielle Expression zahlreicher
Gene aus dem obengenannten Ausführungsbeispiel. Der
Variationskoeffizient gibt hierbei die Streuung aus den Parallelmessungen
an (Alle Versuche wurden in Doppelbestimmungen durchgeführt).
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Liste 1 gibt die eindeutigen und
in der Literatur verwendeten Bezeichnungen der bislang bekannten Virulenzgene
von Candida albicans an, wie in Calderone und Fonzi, Vol 9, No.
7, 2001, Trends in Microbiology, 327 ff, sowie den in diesem Übersichtsartikel
zitierten Referenzen beschrieben, auf die hiermit vollumfänglich Bezug
genommen wird.
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Liste 1:
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ADE2, ALS1, ALS3, ALS5, ALS8, CEK1,
CHS2, CHT2, CLA4, COS1, CPH1, CPH2, CPP1, CRK1, CST20, CZF1, DDR48,
EBP1, ECE1, ECE99, EFG1, EFH1, FLO11, HK1, HOG1, HSP12, HST7, HWP1, HYR1,
INT1, MCM1, MIG1, MKC1, MNT1, NRG1, PDE1, PHR1, PHR2, PKC1, PLB1,
PLC1, PMT1, PMT4, PMT6, PRR1, PRR2, RAD6, RAS1, RBT1, RBT4, RBT5,
RIM101, SAP1, SAP2, SAP3, SAP4, SAPS, SAP6, SAP7, SAP8, SLN1, TEC1,
TPK1, TPK2, TUP1, URA3, WAP1, WH11
