WO2002079507A2 - Verfahren zur spezifischen detektion, isolation und charakterisierung von zellen aus körperproben durch transfektion von nukleinsäurekonstrukten - Google Patents

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters

Definitions

  • the invention relates to a method for the detection of disease-associated cells
  • Body samples which are characterized in that the cells of the body sample are transfected or infected with nucleic acid constructs contain the following components: a) a promoter element with at least one DNA binding site for transcription factors which have a changed activity due to the pathological change in the cells and b) a reporter gene that enables the detection of the pathological cells and then detects the transfected or infected cells.
  • the mortality rate has been increasingly determined by the metastatic behavior and an early occult tumor cell fixation, which is difficult or impossible to detect due to the insensitive detection methods or conventional histopathological staging methods.
  • the detection of tumor cells in the blood is of great prognostic value.
  • the detection of metastatic cells in the blood or in the lymph nodes is considered an indication of the Malignancy of a cancerous change.
  • a more precise characterization of the tumor cells in the blood is also interesting for an adapted therapy decision.
  • EpCAM epithelial surface antigens
  • HEA epithelial surface antigens
  • Tumor cells is criticized. In addition, tumor types of non-epithelial origin cannot be enriched with this method.
  • Other methods of recognizing carcinoma cells in blood samples include steps to permeabilize and fix the cells so that no living tumor cells can be isolated.
  • the positively selected cells are stained using immunocytochemical methods, mostly using antibodies against cytokeratins for the detection of epithelial cells. Since the corresponding cytokeratins are not present in blood cells, the detection of this protein, which is present in all epithelial cells, is regarded as the detection of metastatic tumor cells.
  • a completely new approach in this area is the exploitation of tumor cell-specific signaling activities by transfection of reporter gene constructs for the specific isolation of living tumor cells from a mixture with healthy cells (e.g.
  • the multiplication of body cells is normally controlled by numerous regulatory mechanisms within the cell, so that each cell only begins to divide when it is needed, depending on the organism as a whole. These processes will regulated by signal molecules which are secreted by "transmitter cells”, bind to specific receptor molecules on the surface in the “receiver cells” and subsequently activate so-called signal transduction pathways which ultimately result in altered gene expression. Activating or inhibiting regulatory molecules that control these signaling activities are often mutated in tumor cells (the oncogenes or tumor suppressor genes correspond to them). Tumor cells therefore have activities in their cell nucleus that otherwise only occur in certain developmental stages of embryonic development or in precisely defined tissue areas.
  • Examples of such signaling activities that are related to cancer growth are the Wnt and Ras signaling pathways, as well as the loss of function of the tumor suppressor p53. In human colon cancer cancer events, these signaling activities play a role in different stages of tumor development (Kinzler, K.W. & Vogelstein, B. (1996). Lessons from hereditary cancer. Cell
  • the Ras proteins are normally processed according to Bi Detection of specific ligands on different cell surface molecules (e.g. receptor tyrosiriniases, integrins, ion channels) via adapto ⁇ roteins (e.g. Shc, Grb2, Crk, ...) and downstream guanine nucleotide exchange factors (e.g. Sos, C3G, ). Due to mutations in the Ras gene, constitutively active Ras proteins are expressed in colon tumor cells, which are also active without the upstream components of the Ras signaling pathway. Ultimately, this causes the activation of downstream
  • Components of the signal path that overactivity of numerous transcription factors (CREB, SRF, cFos, c-Jun, PPAR, ER, ETS, ELK-1, STAT, Myc, Max, DPC4, p53, NFAT4, CHOP, MEF2, ATF-2, ...) in the cell nucleus, which among other things can induce cell division growth.
  • CREB CREB, SRF, cFos, c-Jun, PPAR, ER, ETS, ELK-1, STAT, Myc, Max, DPC4, p53, NFAT4, CHOP, MEF2, ATF-2, .
  • tumor suppressor gene p53 which in healthy cells acts as an active transcription factor when disease-associated changes occur and prevents the division growth of cells or leads to the programmed cell death of the cell binds specific DNA sequences (PuPuC (A / T) (A / T) GpyPyPy) and activates growth-inhibiting genes (eg p21).
  • PPAR ⁇ transcription factor Peroxisome Proliferator Activated Receptor Delta
  • NSAIDS non-steroidal anti-inflammatory Drugs
  • PPARdelta is an APC- regulated target of nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Cell 99: 335-45.). Another example of a secondary induced transcription factor is c-myc, which is also overexpressed, for example, in cells with active Wnt signal activity
  • proto-oncogenes such as ß-catenin, Ras, Myc, Fos
  • tumor suppressor genes such as APC, Rb, p53
  • ß-catenin Activating mutations of the oncogene ß-catenin are found in tumors of the liver, kidney, pancreas, stomach, prostate, thyroid, uterus, skin and medulloblastomas, among others.
  • ⁇ -catenin is found in 75% human skin tumors (Chan, E.F., Gat, TJ., McNiff, J.M. & Fuchs,
  • mutations are found in other components of the Wnt signal transduction cascade that have an identical effect on cancer development (see above; Satoh, S., Daigo, Y., Furukawa, Y., Kato, T., Miwa, N., Nishiwaki, T., Kawasoe, T., Ishiguro, H., Fujita, M., Tokino, T., Sasaki, Y., Imaoka, S., Murata, M., Shimano, T., Yamaoka, Y. & Nakamura, Y. (2000. AXLN1 mutations in hepatocellular carcinomas, and growth suppression in cancer cells by virus-mediated transfer of AXIN1.
  • p53 is the most frequently mutated tumor suppressor gene in human tumors (more than 10,000 mutations have been described in the literature; Hernandez-Boussard, T., Rodriguez-Tome, P., Montesano, R. & Hainaut, P. (1999).
  • IARC p53 mutation database a relational database to compile and analyze p53 mutations in human tumors and cell lines. International Agency for Research on Cancer. Hum Mutat 14: 1-8.).
  • p53 regulates cell cycle control and apoptosis processes in connection with repair mechanisms after DNA damage. Accordingly, p53 is also referred to as the guardian of the genome ("Guardian of the Genome”), the functionality of p53 being of crucial importance as a transcription factor (see above).
  • Mutations of p53 have been found in a large number of tumor types, for example in tumors of the colon, the liver, breast, stomach, pancreas, blood, lungs, thyroid gland
  • the general tumor suppressor function of p53 is also evident in patients with inherited mutations of the p53 gene who develop numerous different tumors (Mazoyer, S. , Lalle, P., Moyret-Lalle, C, Marcais, C, ston, S., Frappaz, D., Sobol, H. & Ozturk, M. (1994) Two germ-line mutations affecting the same nucleotide at codon 257 of p53 gene, a rare site for mutations. Oncogene 9: 1237-1239 // Akashi, M.
  • mutations in p53 are also for Res istenzen to chemotherapeutic agents responsible (Aas, T., Borresen, A.-L., Geisler, S., Smith-Sorenson, B., Johnsen, H., Varhaug, JE, AKSLEN, L. 'A. & Lonning, PE (1996).
  • Specific P53 mutations are associated with de novo resistance to doxorubicin in breast cancer patients. Nature
  • Ras signal transduction cascade which is also referred to as the SOS-Ras-Raf-MAPK cascade
  • SOS-Ras-Raf-MAPK cascade The central importance of the Ras signal transduction cascade, which is also referred to as the SOS-Ras-Raf-MAPK cascade, has been widely described in the literature. Structurally modified Ras proteins were found in approximately 25% of human tumors, which are equivalent to a continuous, growth-promoting signal (Hanahan, D. & Weinberg, RA (2000). The hallmarks of cancer. Cell 100: 57-70.). In colon tumors in particular, the frequency of mutations is very high in certain cancer stages (see above). However, mutations of Ras genes have also been detected in numerous other tissues, for example in tumors of the lungs, stomach, pancreas, gallbladder, breast, uterus, sarcomas.
  • reporter gene constructs consist of a promoter region, to which certain transcription factors can bind, and a reporter gene, which is normally not present in the cells and can be detected relatively easily on expression due to the enzymatic activity or the fluorescence of the gene product.
  • the reporter gene constructs are transiently transfected into the tumor cell line cells using the calcium phosphate precipitation method in order to investigate the effectiveness of gene constructs additionally transfected into the cells, the gene products of which could interact with the signaling activities.
  • the aim of these investigation approaches is to elucidate the molecular mechanism of the signal transduction cascade.
  • the promoter structures are not optimized in such a way that, as a sensitive measuring system, they enable adequate expression of the reporter gene in primary tumor cells even without external stimuli.
  • the experimental approaches always compare the activities of induced and non-induced tumor cell lines, but do not contain any comparison between "healthy" cells and tumor cells.
  • the aim of such reporter gene systems is obviously not the clinical diagnosis of tumor cells, but rather the elucidation of general signal transduction mechanisms in tumor cell systems.
  • the patent describes a methodology for identifying potential therapeutic agents using TCF transcription factor responsive reporter gene constructs.
  • the investigation of cells that have mutations in the signal transduction components APC or ⁇ -catenin is claimed.
  • Such a screening system addresses the specific circumstances of colon carcinogenesis in which APC and ß-catenin are often mutated (see above).
  • substances that influence the Wnt signal cascade due to the interaction with other components of the cascade cannot be found with this system.
  • it would make sense to establish a cellular system eg using breast tumor cells
  • the Wnt signal activity is due, for example, to the overexpression of the extracellular ligand Wnt.
  • the reporter gene constructs claimed in the patent are furthermore neither claimed for the detection or isolation of primary tumor cells, nor is any such application in clinical diagnostics contemplated in this context.
  • the green fluorescent protein GFP lends itself as a reporter gene for isolating living tumor cells from blood samples. Because of its fluorescence behavior when expressed, it leads to the cells lighting up after appropriate exposure. GFP has already been patented in many different ways.
  • the closest patent (US5968738) describes, among other things, the use of two GFP variants and FACS or flow cytometry for the "analysis of signal transduction activities".
  • a GFP variant (“alphaGFPT204I”) was used which, to our knowledge, has not previously been used as a reporter gene.
  • genes can also be used for the isolation of living tumor cells from body samples, which can be detected, for example, on the basis of structural properties.
  • gene sequences that code for products that can be detected extracellularly are particularly suitable Transmembrane proteins that expose antigenic structures on the surface of the cells that are recognized by corresponding antibodies.
  • antigenic sequences of non-human origin are advantageous, the detection of which, owing to the lack of cross-reactivities of the antibodies, enables increased specificity, since no endogenous, human gene expressions are detected.
  • the antigens are particularly suitable Transmembrane proteins that expose antigenic structures on the surface of the cells that are recognized by corresponding antibodies.
  • Structures can be recombined in a wide variety of forms with natural gene sequences by means of molecular biological methods, so that the antigenic structures are preferably presented extracellularly.
  • Reporter genes that mediate enzymatic activities are also suitable for the detection of disease-associated signaling activities, e.g. Luciferases, ⁇ -galactosidases, proteases, glycosidases, acetyls, phosphatases, which may be present intracellularly or are secreted.
  • Luciferases e.g. Luciferases, ⁇ -galactosidases, proteases, glycosidases, acetyls, phosphatases, which may be present intracellularly or are secreted.
  • a detection method that is as sensitive as possible, including amplification systems.
  • Immunocytochemistry such amplification systems are widespread and usually involve the use of secondary antibodies or the biotin streptavidin system in combination with enzymatic detection reactions in order to increase the signal intensity.
  • Tissue thromboplastin is released from the microsomes of injured cells in the event of tissue injuries. It is (in its natural form) a complex of a protein and a phospholipid. liberated
  • tissue thromboplastin gives the single chain factor VJJ zymogen greater activity without proteolytic activity.
  • the tissue thromboplastin factor VE complex forms a complex in the presence of calcium ions on phospholipid particles (platelet factor 3), on which the activation of factors IX and X takes place.
  • platelet factor 3 phospholipid particles
  • tissue thromboplastin is an integral membrane protein that is hidden in intact cells inside the cell (in the endoplasmic reticulum) and is only released when the cell integrity is violated, so that there is no premature activation of the blood coagulation cascade.
  • the thromboplastin time is one of the coagulation analyzes that must be carried out before all surgical interventions in order to reduce the possible factors ⁇ , V, VTI, X and of fibrinogen
  • Fibrin formation was triggered by adding tissue thromboplastin and calcium ions in plasma from whole citrate blood and the clotting times compared to control blood plasma were determined, the thromboplastin time being reduced with the application of heparin. Due to the molecular nature of natural tissue thromboplastin, the extraction and purification of a functional protein / phospholipid particle for determining the thromboplastin time is technically complex. In the meantime, however, a naturally non-occurring, water-soluble variant of thromboplastin has been recombinantly produced in bacteria and other expression systems (review article: Morrissey, JH. (1995).
  • tissue factor modulation of factor VJJa activity use in measuring trace levels of factor VTIa in plasma Thromb Haemost. 74: 185-8.).
  • tissue factor tissue factor
  • sTF tissue thromboplastin
  • active components of the blood coagulation cascade can also be used as reporter genes (eg thrombin, factor Va, factor VIIa, factor IXa, factor Xa or factor XTIa) or components of other biological cascades (eg the complement system, the kinin system) or generally active ones Substances that convert fibrin or other substrates (such as fPA, uPA, plasminogen / plasmin, or derivatives or hybrids thereof).
  • variants of the components that inhibit these biological cascades can also be used.
  • the use of plasmin, the active component of plasminogen, as a secreted reporter gene seems to make sense since it
  • the diagnostic use of components of biological cascades as reporter genes in blood samples is new.
  • the closest US patent 6080575 describes the use of nucleic acid constructs which consist of an active component, a protease-sensitive region and an inhibitory component for a fusion product.
  • the active component of the fusion protein can include also be part of the blood coagulation cascade (i.e. factor X). However, this active component is inhibited in its activity in the context of the intact fusion protein due to the presence of the inhibitory component.
  • This patent makes a therapeutic use of the described method for target cell-specific therapy of tumors and inflammatory regions.
  • the isolation of certain cells from heterogeneous cell mixtures is not only interesting for the detection and characterization of pathologically altered cells.
  • the isolation of healthy cells is also of diagnostic and therapeutic importance.
  • the isolation of adult stem cells which can differentiate into different organ or tissue-specific cells, is of great medical interest.
  • stem cells after their isolation and propagation ex vivo, could be used for the cultivation and autologous transplantation of replacement organs.
  • the stem cells required for this could also come from other organs of origin after appropriate "transdifferentiation”.
  • the medical significance of pluripotent stem cells derives not least from experience with haematopoietic stem cells in the treatment of blood cancer patients.
  • the use of adult stem cells from other organs proved to be Extremely complex because the isolation of the rare stem cells in an undifferentiated state and high purity is very difficult.
  • pluripotent cells have now been demonstrated in numerous organs.
  • stem cells from rapidly regenerating organs (skin, intestine, skeletal muscle) under selective growth conditions.
  • adult stem cells each require specific biochemical activities for the
  • Wnt signaling activity which is mediated in the crypts of the thin microvilli using TCF4, for their persistence in the adult organism. Similar conclusions for other organ systems can be derived from studies in which components of the Wnt signal cascade in the skin were specifically deleted or expressed in an active form. The Wnt signal cascade also appears to be important in progenitor cells of the hematopoietic system. Accordingly, Wnt factors regulate the expansion and maintenance of hematopoietic progenitor cells (Austin, TW, Solar, GP, Ziegler, FC, Liem, L. & Matthews, W. (1997). A role for the Wnt gene family in hematopoiesis: Expansion of multilineage progenitor cells. Blood 89: 3624-3635.). This finding is mainly due to newer ones
  • adult bone marrow tissue contains stem cells of high plasticity or a broad differentiation potential (Krause, DS, Theise, ND, Collector, MI, Henegariu, O., Hwang, S., Gardner, R., Neutzel, S. & Sharkis, SJ (2001) Multi-organ, multi-lineage engraftment by a single bone marrow-derived stem cell
  • X-ray irradiated recipient animals included. This type of isolation of the adult stem cells is not suitable for clinical applications in humans.
  • Bone marrow from lethally irradiated mice to establish a complete hematopoietic system This illustrates the function and importance of the Wnt signaling cascade in the maintenance of hematopoietic stem cells and suggests that the isolation of blood cells from the bone marrow due to an active Wnt signaling cascade can be used to enrich adult stem cells, using serial transplants to enrich the stem cells would be avoided.
  • Wnt, hedgehog certain signal cascades that they are necessary for the maintenance and expansion of at least some stem cell populations.
  • the presence of specific signal activities in adult stem cells can be exploited for their isolation.
  • similar nuclear acid constructs to those described for the detection and isolation of tumor cells are used.
  • the respective reporter genes are behind those for cloned the biochemical activities in adult stem cell sensitive promoter structures.
  • Reporter gene constructs are preferably used which code for fluorescent or transmembrane reporter gene products and which are introduced into the cells of the body samples by means of viral expression systems. In principle, however, other reporter genes can also be used.
  • the cells are then preferably isolated by flow cytometry in the presence of differentiation inhibitors.
  • other methods can also be used which are based, for example, on the detection of induced surface structures and are isolated by means of “beads”. In principle, it may also be useful in addition to the reporter genes necessary for cell isolation
  • the isolated, adult stem cells of a patient can be used after surgical or other medical interventions for the new formation or regeneration of the identical or (after appropriate transdifferentiation) for the regeneration of other organs.
  • adult stem cells from the intestine could be used for the regeneration of Langerhans islet cells from the pancreas of diabetes patients.
  • the contact of healthy body cells with pathogenic agents can change the biochemical activities of Cell mixtures result, which facilitates the isolation of certain cells.
  • pathogenic agents e.g. infection by viruses, contact with bacteria or bacterial substances, presence of allergenic substances
  • stimulating or repressing substances growth factors, growth factor antagonists, toxins, chemical substances
  • stimulating or repressing substances growth factors, growth factor antagonists, toxins, chemical substances
  • biochemical activities of Cell mixtures result, which facilitates the isolation of certain cells.
  • contact with growth-inhibiting substances represses certain biochemical activities in certain (eg healthy) cells, but has no effect in other cells (eg pathologically changed).
  • the unrepressed activities in these cells could then be used for cell isolation.
  • the changed uptake of certain substances can also be used to detect specific cells from heterogeneous cell mixtures. This is not only the case that transport proteins in target cells are expressed as reporter genes.
  • the present invention is based on the object of providing a method with which specific cells can be detected and, if appropriate, also isolated from blood samples or other body samples in the living state, so that they are available for subsequent examinations or for therapeutic use.
  • the present invention is based on findings that signal activities in the cell nuclei of certain cells can be exploited for the specific expression of reporter genes by transfection of reporter gene constructs with synthetic promoter structures. After transfection of a heterogeneous cell mixture with synthetic reporter gene constructs, due to the concatenation of optimized transcription factor binding sites or due to the combination of different transcription factor binding sites in specific cells, there is a strong overexpression or secretion of reporter gene products, which enable different detection methods.
  • the signal activities in pathologically altered cells are used for the specific expression of fluorescent proteins. Since the healthy cells in the blood sample do not have these signaling activities, the specificity of the tumor cell detection is high and enables the isolation of living, fluorescent tumor cells by means of flow cytometry. The isolated tumor cells can then be taken in culture and are available for further analysis.
  • the reporter gene constructs can also be used for cell culture systems that measure reporter gene expression before and after contact of transfected cells with potential active substances. This can be used on the one hand for individualized therapy decisions if the cells examined come from patients, and on the other hand also serve screening methods which analyze activities in cell line cells.
  • partial areas of the reporter genes code for a biological activity which has a positive or negative effect on the initiation or progression of biological cascades. Since the healthy cells in the blood sample do not have the signal activities required for the expression of the reporter gene, or do so in significantly different forms, the biological cascades are only induced or inhibited in the presence of pathologically altered cells, so that an extraordinarily high specificity of the tumor cell detection is achieved. In addition, the sensitivity of tumor cell detection is very high due to the use of natural amplification systems or of biological cascades that are at least partially present in the blood. The detection of the tumor cell-specific expression of the reporter genes is then carried out by measuring the activation or activatability of the respective biological cascades, e.g. according to the classic
  • signal activities in healthy cells are used to isolate the cells from heterogeneous cell mixtures.
  • the cells of the respective body samples such as biopsies, are first separated using standard cell biological methods before they are transfected with the nucleic acid constructs.
  • the functionality of the isolated (preferably human) stem cells can optionally be tested in immunosuppressed animal models after corresponding surgical interventions in vivo before they are returned to the patient from whom they originated.
  • the invention relates to nucleic acid constructs for cell-specific expression of reporter genes in body samples, the reporter gene constructs comprising the following components: a) a promoter element with at least one, but preferably several, DNA binding sites for transcription factors which are based on their cell-specific activities or on the basis of the concatenated arrangement or specific combination of DNA binding sites in certain cells are overactive, or else genetically relevant regions which influence the insertion or integration of nucleic acid constructs in target regions b) a reporter gene which the following components: a) a promoter element with at least one, but preferably several, DNA binding sites for transcription factors which are based on their cell-specific activities or on the basis of the concatenated arrangement or specific combination of DNA binding sites in certain cells are overactive, or else genetically relevant regions which influence the insertion or integration of nucleic acid constructs in target regions b) a reporter gene which the following components: a) a promoter element with at least one, but preferably several, DNA binding sites for transcription factors which are based on their cell-
  • the cells are preferably transfected by means of viral expression systems which enable efficient transfection of the cells in the blood with reporter gene constructs.
  • Transfection systems which, owing to their cell type preferences, bring about an additional specificity of reporter gene expression are particularly preferred.
  • the expression levels of the reporter genes can then be determined manually, but also by means of automated processes.
  • promoter structures can be adapted to the signal activity to be detected in each case.
  • transcription factor binding sites of a specific signal activity spatially separated by short DNA sequences (“spacers”), are positioned as concatemers in front of minimal promoters (eg from the c-Fos or thymidine kinase gene promoter).
  • minimal promoters eg from the c-Fos or thymidine kinase gene promoter.
  • signal activities can be measured simultaneously if DNA binding sites for transcription factors of different signal transduction pathways can be combined with each other.
  • a simultaneous and independent measurement of different signal activities in a cell can be achieved by transfection of reporter gene constructs that contain different reporter genes with different promoter structures. These transcription units can consist of the respective promoter and the downstream reporter gene either on one
  • a promoter can also regulate the expression of two different reporter genes at the same time if the reporter genes are separated by an interposed IRES sequence (e.g. the "infernal ribosomal entry site” sequence from the encephalomyocarditis virus).
  • an interposed IRES sequence e.g. the "infernal ribosomal entry site” sequence from the encephalomyocarditis virus.
  • Wnt-sensitive promoters both the expression of a positive effector (e.g. fusion construct from LEF-1 and the transactivating, C-terminal region of ⁇ -catenin; Vlem nckx , K., Kemler, R. & Hecht, A. (1999)
  • a positive effector e.g. fusion construct from LEF-1 and the transactivating, C-terminal region of ⁇ -catenin; Vlem nckx , K., Kemler, R. & Hecht, A. (1999)
  • the C-terminal transactivation domain of beta-catenin is necessary and sufficient for signaling by the LEF-1 / beta-catenin complex in Xenopus laevis. Mech Dev 81 : 65-74.), As well as the expression of the actual reporter gene.
  • the basal activity of the synthetic promoter structures can also be suppressed by adding DNA binding sites for transcriptional repressors.
  • the corresponding transcriptional repressor can be present endogenously or through an additional repressor gene that is constitutive is expressed, provided.
  • Nueinic acid constructs can also be used for this, which for recombinant proteins consisting of a DNA binding domain of any transcription factor (eg the HMG domain of LEF-1 / TCF transcription factors, carboxy-terminal region (the last 90 amino acids) of c- myc) and a heterologous repressor domain (e.g. the Tet repressor,
  • Carboxy-terminal region (amino acid 179-281 of E2F6) exist.
  • the presence of a strong transcriptional activator on the same cis-acting promoter element accordingly activates the downstream reporter gene, while the reporter gene is repressed in the absence of the transcription activator.
  • Systems in which the transcriptional repressors are regulated by endogenous activities are of particular interest in this context, that is to say if a repressor gene is used as a further reporter gene in addition to the actually measurable reporter genes.
  • the expression of the exogenously introduced repressive gene can be regulated by the activity of the p53 transcription factor present in healthy cells. As a result, the repressor is only healthy
  • Promoter region e.g. GFP variants, luciferase, thromboplastin, etc.
  • GFP variants e.g. GFP variants, luciferase, thromboplastin, etc.
  • p53 is a member of a transcription factor family that also contains the p63 and p73 genes. There are different splice variants of these genes, which among other things differentiate in expression pattern, transactivation or repression potential, interaction with other proteins and biochemical properties (Yang, A., Kaghad, M., Wang, Y., Gillett, E., Fleming, MD, Dotsch, V., Andrews, NC .
  • N-terminally truncated p63 occurs specifically in certain basal cell populations (Signoretti, S., Waltregny, D., Dilks, J., Isaac, B., Lin, D., Garraway, L., Yang, A ., Montironi, R., McKeon, F. & Loda, M. (2000) p63 is a prostate basal cell marker and is required for prostate development. Am J Pathol. 157: 1769-75.), Which may contain or contain stem cells is identical to stem cell populations.
  • keratinocyte stem cells Pellegrini, G., Dellambra, E., Golisano, O., Martinelli, E., Fantozzi, L, Bondanza, S., Ponzin, D., McKeon, F. & De Luca, M. (2001).
  • P63 identifies keratinocyte stem cells. Proc Natl Acad Sei US A. 98: 3156-61.).
  • the occurrence of the N-terminally truncated p63 in, for example, the stem cells of the skin can be exploited for their isolation by introducing reporter gene constructs with DNA binding sites for members of the p53 family into skin cell populations. By induced accumulation of p53 (UV, radiation,
  • the reporter genes are then specifically expressed in cells which are a dominant-interfering variant of one of the p53 family members, e.g. ⁇ N-p63, express (or, as in the case of abnormally changed tissue, have a defect (e.g. p53 mutation)).
  • a constitutively expressed reporter gene is coexpressed, stem cells of the skin, for example, can be isolated using the methods described.
  • TCF / LEF-1 interesting transcription factors or families of transcription factors and or respective elements: TCF / LEF-1, jun, fos, myc, max, myb, E2F, DPI, CREB, p53, NFkB, NFAT, PPAR, ETS, ELK1, ATF, DPC, SMAD, CHOP, MEF, MADH4, GR, ER, STAT, SRF, ISRE, SRE, HSE, API, CRE.
  • TCF 5'-CCTTTGAA-3 '; LOVE, JJ et al. (1995). Structural basis for DNA bending by the architectural transcription factor LEF-1. Nature 376: 791-795) are of particular interest.
  • p53 (5 C -
  • reporter genes which code for fluorescent proteins.
  • all genes that code for directly or indirectly fluorescent proteins are suitable for this.
  • Variants of the genes are particularly suitable: GFP, BFP, YFP,
  • genes can also be used which code for fluorescent dye-binding proteins, for example for anti-calines, which bind the fluorescent dye FITC.
  • coding nucleic acid sections can also be used, the translated products of which are exposed on the cell surface and are thus accessible for secondary detection methods.
  • those nucleic acid segments are meant which code for transmembrane proteins or extracellularly presented molecules or which lead to their exposure.
  • antigens, receptors or ligands can be presented on the cell surface for which specific detection molecules (eg antibodies, anticalins, ligands or receptors) are present.
  • Coding nucleic acid segments that are not of human origin are preferred for diagnostic methods.
  • homologous gene segments of transmembrane proteins from the mouse, rat, etc., which are also present in humans can be used to suppress cross-reactivities in immunological detection methodologies which are attributable to endogenous expressions of non-transfected cells.
  • it can also be synthetic
  • Sequences are used for which corresponding detection molecules are produced. For example, almost any synthetic peptide sequences can be recombined with transmembrane proteins using molecular biological methods in order to be presented in isolated or concatemic form on the cell surface. At the same time, highly specific antibodies can be generated against these peptides.
  • the pathologically modified cells can be isolated on account of the specific expression of the exogenous nucleic acid region by applying magnetic fields or centrifugation steps on the basis of their association with the beads.
  • reporter genes which are equivalent to activating or inhibiting components of the biological cascades.
  • sequence regions of the pro / thrombin genes, factor XJJa, factor XIa, factor Xa are equivalent to activating or inhibiting components of the biological cascades.
  • Factor LXa Factor LXa, factor Villa, factor VHa, factor Va, fibrin / fibrinogen, plasmin plas- minogen, pro- / kallikrein, urokinase, tPA, CVF, C3b, protein C, Cl S inhibitor, hirudin, al ⁇ ha-1-antitrypsin, AT-UI, TFPI, PAI-I, PAI-2, PAI-3.
  • enzymatic proteins can also be expressed or corresponding fusion proteins activated by the biological cascades.
  • the DNA constructs have to be introduced into the cells. Numerous commercially available transfection technologies have been developed for this. In addition to the classic calcium-phosphate precipitation, the direct transfer by microprojectiles ("shotgun shot”) and electroporation methodologies, it is possible to use mammalian cells with liposome technologies
  • mammalian cells can be transfected particularly efficiently with viral systems.
  • systems have been established which are based on retroviral, adenoviral or adeno-associated viral (AAV) vectors.
  • AAV adeno-associated viral
  • An interesting approach in this context is the use of transfection systems that achieve a different transfection efficiency with different cell types and are therefore beneficial to the specificity of reporter gene expression.
  • adenoviruses infect most human cells with extremely high efficiency, with the exception of hematopoietic cells. This fact can be selected by choosing appropriate incubation conditions, especially when isolating epithelial cells from the
  • the tumor cells can be enriched.
  • the knowledge of the applicant is used for a method for the diagnosis of disease-associated cells, which comprises the transfection of reporter gene constructs with inducible promoter structures, which enable automated detection and isolation of tumor cells in mixtures with healthy cells.
  • the inventor's findings can also be used for methods which serve to isolate specific, healthy cells (for example stem cells) from heterogeneous cell mixtures.
  • the automated and specific detection of the cells can be ensured by the following procedure:
  • the reporter gene constructs contain, on the one hand, promoter structures with binding sites for transcription factors, which are partly responsible for altered gene expression in pathological cells or different gene expression in healthy cells, and, on the other hand, easily measurable reporter genes which are not normally present in this form or in this amount in the other body cells are.
  • the combination and variety of transcription factor binding sites ensures the specificity and sensitivity of the inducible reporter gene activation.
  • the specific methodology which can be automated by means of flow cytometry, can be measured qualitatively and quantitatively.
  • Flow cytometry also allows isolation of cells with certain reporter gene expression levels by setting thresholds for fluorescence intensities.
  • the simultaneous measurement of two different fluorescent proteins, which can be induced by different biochemical activities, also enables a more precise characterization of individual tumor cells with regard to their degree of degeneracy
  • Staging This applies in particular to those tumor types in which the corresponding biochemical activities occur in different stages of tumor progression (as explained above using the example of colon cancer).
  • the simultaneous use of two similar but not identical reporter genes can also be the The promoters with intact or mutated transcription factor binding sites can regulate, for example, the expression of different fluorescent reporter genes or enzymes with different substrate specificities. The comparison of the expression levels therefore allows conclusions to be drawn about the activity of specific signal activities. In addition, it can be useful too inducible
  • Promoters also use constitutively active promoters, which regulate different reporter genes, in order to be able to control transfection efficiencies or cytotoxicity.
  • signal activity encompasses biochemical activities in cells that ultimately regulate the expression of genes in the cell nucleus.
  • the biochemical Activities that lead to changes in gene expression can take place at a wide variety of locations in the cell and are usually part of the complex network of so-called signal transduction pathways.
  • receptors on the cell surface can be overactive due to excessive presence of ligands, by mutation in coding gene areas or by mutations in gene regulatory areas.
  • proteins in the cytoplasm can also have a modified activity due to mutations of the corresponding genes, so that there are changed post-translational modifications (eg phosphorylation, dephosphorylation, acetylation, deacetylation, ubiquitinylation) and the resulting regulatory events (eg stabilization, Destabilization, increased or decreased enzymatic activity, reduced or increased binding affinities) of components of the signal transduction process.
  • post-translational modifications eg phosphorylation, dephosphorylation, acetylation, deacetylation, ubiquitinylation
  • the resulting regulatory events eg stabilization, Destabilization, increased or decreased enzymatic activity, reduced or increased binding affinities
  • reporter gene construct encompasses nucleic acid constructs which consist of at least one gene regulatory or genetically functional sequence and a coding sequence region.
  • DNA constructs are meant which contain a gene regulatory sequence which contain the expression of the coding region directly (on the basis of the transcription factor binding sites contained) or indirectly (for example by enabling targeted integration, insertion or recombination of the reporter gene into genomic DNA sections).
  • the gene regulatory sequences which directly influence the expression of the reporter gene are mostly promoter, enhancer or silencers -Regions that, due to the interaction with protein molecules, encode the transcription
  • Nucleic acid areas can influence both positive and negative.
  • Methods in which gene regulatory sequences indirectly influence the expression of reporter genes include the targeted integration of the reporter gene in stem cell populations in which the target regions for the integrations are specifically marked beforehand by recombination steps (such as, for example, with loxP recombination sequences for the Cre recombinase) and the endogenous target genes may be in addition to the Recombination sequences are supplemented by one or more IRES sequences or the reporter genes contain IRES sequences, so that when the expression of the endogenous gene locus is induced, reporter gene sequences are additionally transcribed.
  • embryonic or partially differentiated stem cells from mammals are used for this purpose, it is possible to visualize the presence of specific signaling activities by means of synthetic or endogenous gene regulatory sequences or to make them measurable.
  • synthetic or endogenous gene regulatory sequences or to make them measurable.
  • very early stages of pathological changes but also healthy physiological processes (such as differentiation processes, apoptotic or proliferative processes in tissue areas) can be detected. organoid
  • Model systems up to whole genetically modified organisms can be exposed to test substances, whereby pathological changes due to reporter gene expression can be recognized early, pathologically changed cells can be isolated at different times or the effect of the active substances can be analyzed.
  • cell-specific expression encompasses the transcription and / or translation of coding sequence regions in specific cells of a given cell population. For example, it may be pathologically altered cells that are present in a body sample with healthy cells. In particular, the specific one
  • the reporter gene expression can achieve specificity by cell-specific transcription, translation or degradation of the reporter gene product or else by cell-specific transfection of the nucleic acid construct.
  • reporter gene encodes coding nucleic acid segments that have to be introduced into cells, since they do not naturally endogenously occur in the target cells to be analyzed in this form. Partial sections or entire regions of originally endogenously occurring sequences are also included
  • Kö ⁇ robe encompasses any Kö ⁇ robe in which vital cells for the transfection of nucleic acid constructs are contained. Examples of such
  • Body samples are blood, lymphatic fluid, stool, organ punctates and biopsies.
  • blood samples are meant in which pathologically altered cells are suspected.
  • biopsies are also included, since after the cells have been separated from the tissue, they are removed using standard standard methods (cutting, resuspending with ever narrowing cannulas,
  • Protease treatment are suitable for the transfection of nucleic acid constructs.
  • pathological change encompasses biochemical activities in cells which are not present in comparable cells of the same tissue at this time or which are active in other areas of the tissue or in other differentiation phases or development stages.
  • transcription factor encompasses protein molecules which directly or indirectly associate with the nucleic acid regions and thereby cause changes in the activities of the nucleic acid regions.
  • level of expression includes transcriptional or translational changes that affect nucleic acid regions that code for a sequence of amino acids or that are complementary to a coding nucleic acid sequence. However, what is also meant is changes that are post-translational
  • automated method encompasses methodologies which replace the manual labor force of human personnel entirely or only in partial steps and in particular in the steps of transfection, detection, isolation, documentation or Find information processing.
  • the detection depends on the properties of the reporter gene used.
  • Wnt-responsive reporter gene constructs are produced in a first step.
  • the promoter regions contain three functional or three non-functional binding sites for LEF-1 / TCF transcription factors
  • TCF-1 T lymphocyte specific transcription factor containing a sequence-specific HMG box.
  • EMBO J 10 123-32.
  • Experiments complement the promoter region by ligation of specially synthesized, double-stranded oligonucleotides with the binding sites for LEF-1, PPAR ⁇ , myc, etc. (see below).
  • the luciferase gene is cut out by digestion with the restriction enzymes NCO1 and NOT1 and the vectors are then dephosphorylated by incubation with alkaline phosphatase.
  • the reaction products are then separated by gel electrophoresis in agarose gels containing ethidium bromide, the approximately 3.8 kb vector band is cut out of the gel and the DNA is obtained using the “Qiaex R II Gel Extraction Kit” from
  • the alphaGFPT204I gene is generated by means of a PCR reaction with the introduction of the appropriate restriction sites for NCO1 (for the 5 '-lying primer (5'-CCC GGG CC ATG GCT AGC AAA GGA GAA GAA CTT TTC AC -3') and NOTI for the 3rd located primer (5'- GGC CGC GGC CGC TTA TTT GTA GAG CTC ATC CAT GCC - 3 ')) from the pKU23 vector or the alpha + GFPcycle3 vector from Maxygen (see (Crameri, A., Whitehorn , EA, Tusche, E. & Stemmer, WPC (1996).
  • DH5 ⁇ TM Competent Cells from GibcoBRL Life Technologies transformed, spread on ampicillin-containing LB aga plates, grown, ampicillin-resistant individual colonies were used to inoculate 5 ml LB liquid cultures, the plasmid DNA was isolated from grown individual colonies ("Concert TM Rapid Plasmid Mini Prep System” from GibcoBRL Life Technologies)
  • the reporter gene constructs are transfected either with "Lipofectin R Reagent", “Lipofectamine Plus TM Reagent” or “Lipofectamine TM 2000 Reagent” according to the manufacturer's instructions from GibcoBRL Life Technologies, the SW480
  • SW480 cells overexpress the transcription factor PPAR ⁇ (HE TC, CHAN TA, VOGELSTEIN B. & KINZLER KW (1999) due to Wnt signal activity.
  • PPARdelta is an APC-regulated target of nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Cell 99: 335-45. ).
  • PPARdelta responsive elements are cloned into the TOP-alphaGFPT204I and FOP-al ⁇ haGFPT204I vector. For this, the oligonucleotides 5'-
  • the plasmid DNA of the desired sequence is then produced in larger quantities and purified and used for the transfection of SW480 colon carcinoma cells with lipofectin or lipofectamine in the manner described above.
  • the measurement of the fluorescence intensities in the flow cytometer results in a measurable synergistic effect with regard to an increased alphaGFPT204I expression or fluorescence intensity in the presence of functional LEF-1 / TCF and PPAR ⁇ -DNA binding sites.
  • the SW480 cells are detached from the surface by adding trypsin solution (0.5mM EDTA and 2 ° / 00 trypsin in PBS) and resuspended in DMEM + 10% FCS. The cells are then either taken up in ISOTON II (Coulter) or measured directly in a flow cytometer (FACSscan, Becton Dickinson). Fluorescent cells from a defined signal intensity are isolated and mixed in a defined number ratio with cell suspensions of transfected or non-transfected cells of other origin tissues (ie not colon; e.g. HAI .6 B cells, C57MG breast tumor cells, Jurkat cells, BW5147 T cells) that do not have any Wnt - Have signal activity and therefore in experiments
  • HeLa cervical carcinoma cells, 3T3 fibroblasts or SV40-transformed COS cells are mixed in different proportions with SW480 colon carcinoma cells or left as a homogeneous cell population for control purposes. Then 300,000 cells of the heterogeneous cell mixture or of the homogeneous cell populations are seeded into the wells of 6-well plates and overnight in DMEM,
  • adenoviral reporter gene constructs are made using the "Adeno-X TM Expression System" from Clontech (Cat. No. Kl 650-
  • the promoter region including the alphaGFPT204I sequence are amplified by means of a PCR reaction from the vectors TOP and FOP-alphaGFPT204I.
  • primers are used which introduce into the restriction sites for the enzymes I-CEU I and NOT1 at the 5 'and 3' end of the reaction product (5'-located "sense" primer: 5'-CCC GGG TAA CTA TAA CGG TCC
  • reaction products are then digested with the restriction endonucleases I-CEU I and NOT1, by phenol / Chloroform treatment purified, precipitated (addition of 1/10 vol 3M NaAc and
  • the reaction product is isolated from the agarose gel.
  • the pShuttle vector provided by Clontech is digested accordingly with the enzymes I-CEU I and NOT1, dephosphorylated, separated by gel electrophoresis and the vector (as described in Example 1) is extracted from the gel.
  • the ligation of the pShuttle vector with the ampli- Defected TOP or FOP-alphaGFPT204I sequence is carried out using T4-DNA ligase in a corresponding Mg 2+ and ATP-containing buffer.
  • the ligation batches are then transformed into bacteria, spread on ampicillin-containing LB aga plates, the plasmid DNA isolated from grown individual colonies by restriction digestion and sequencing with several "sense" and "anti-sense"
  • the subsequent steps follow the manufacturer's instructions from Clontech (see “Adeno-XTM Expression System User Manual”).
  • the TOP or FOP-alphaGFPT204I sequence is cut out of the pShuttle vector using the restriction enzymes I-CEUI and PI-SCEI and ligated with the appropriately digested Adeno-X virus DNA (following the usual molecular biological intermediate steps as described above), the in vitro ligation is then digested with the restriction enzyme SWAI and the appropriate approach for transforming bacteria is used. DNA preparations of ampicillin-resistant transformants are analyzed and verified by means of suitable restriction digests and sequencing with several “sense” and “anti-sense” primers.
  • the recombinant adenoviral plasmid DNA of the desired sequence is then prepared on a small scale in accordance with the information in the Clontech manual and with the NucleoBond R Plasmid Maxi Kit according to An gave the company Clontech produced and cleaned on a larger scale.
  • the purified plasmid DNA is digested with the restriction enzyme PACI and, after purification of the restriction mixture, is used to transfect HEK 293 cells using lipofectamine or lipofectin.
  • the supernatant which contains recombinant adenoviruses with the Die TOP or FOP-alphaGFPT204I sequence, can be used to infect the target cells after centrifugation.
  • SW480 cells incubated with the recombinant adenoviruses. 5x10 5 SW480 cells are sown in 100 mm cell culture dishes so that they can adhere to the cell culture dish bottom overnight (or for up to 48 hours). Then 1 ml of the virus-containing medium is added to the cells for about 1 hour. The cells are then washed once with DMEM + 10% FCS and incubated in the incubator for up to 48 hours. After 2, 4, 8, 16, 24 and 48 hours the
  • GFP expression using fluorescence microscopy and flow cytometry.
  • the number of GFP-expressing cells after infection with the TOP- alphaGFPT204I sequence is extremely high (70-95% after 24 hours), while cells infected with the FOP-alphaGFPT204I sequence have no significant GFP expression.
  • the infection of heterogeneous cell mixtures leads to the specific overexpression of the GFP gene, after infection with the TOP-alphaGFPT204I sequence, in the colon carcinoma cells which have active Wnt signaling activity.
  • SW480 cells are added in different amounts to 1 ml of human whole blood samples from healthy people and the cell suspension is mixed with 1 ml of virus-containing medium for 1 hour.
  • Wnt-responsive reporter gerstructor constructs are produced in a first step.
  • the promoter regions contain three functional or three target-functional binding sites for LEF-1 / TCF transcription factors (CCTTTGATC or CCTTTGGCC), or variants of these binding sites (CCTTTGAA or CCATTGAA or CCTTTGGA or CCATTGGA).
  • the luciferase gene is cut out by digestion with the restriction enzymes NCO1 and NOT1 and the vectors are then dephosphorylated by incubation with alkaline phosphatase.
  • the reaction products are then separated by gel electrophoresis in agarose gels containing ethidium bromide, the approximately 3.8 kb vector band is cut out of the gel and the DNA is isolated using the “Qiaex R LT Gel Extraction Kit” from Qiagen.
  • the cDNA of the leucine zipper domain is generated by polymerase chain reaction (PCR) from genomic yeast DNA using the Prime ⁇ aare 5 '-ATC GGC GGC GCC GCC ATG AAA CAA CTT GAA GAC AAG -3' (coding sense
  • the coding sense primer contains a Narl-RestriMorisenzyme interface and also codes for a short linker sequence Gly-Gly-Ala-Ala, which is upstream of the leucine zipper sequence Met-Lys-Asn-Leu ...
  • the anti-sense primer contains interfaces for the restriction enzymes Hind3 and Notl, for later cloning steps.
  • the cDNA for soluble thromboplastin (amino acid 1 - 220 with and without signal sequence) is PCR by means of the coding sequence primer 5 '-GAA GAA GGG ATC CTG GTG CCT CGT GGT TCT GCC ATG GGC ACT ACA AAT ACT GTG GCA GC-3', 5 '-GAA GAA GGG ATC CTG GTG CCT CGT GGT TCT GCC ATG GAG ACC
  • the anti-sense primers contain a Narl interface for the fusion with the leucine zipper domain of GCN4 (see above).
  • the PCR fragments were digested with the appropriate restriction enzymes, purified by phenol / chloroform treatment, precipitation (addition of 1/10 vol 3M NaAc and 2.5 vol 100% ethanol) and washing with 70% ethanol, dried and taken up in 1 x Tris / EDTA buffer.
  • reaction products are then separated by gel electrophoresis and isolated from the agarose gels (see above).
  • Products are made using T4 DNA ligase in a corresponding Mg 94- and ATP-containing buffer.
  • the ligation batches are transformed into bacteria (“DH5 ⁇ TM Competent Cells” from GibcoBRL Life Technologies), streaked on ampicillin-containing LB aga plates, grown, ampicillin-resistant individual colonies are used to inoculate 5 ml LB liquid cultures, the plasmid DNA from grown individual colonies isolated ("Concert TM Rapid Plasmid Mini Prep System” from GibcoBRL Life Technologies) by restriction digestion and sequencing ("Big Dye TM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction” from PE Applied Biosystems) with several "sense” and "anti” Sense "primers are analyzed and verified.
  • the plasmid DNA of the desired sequence is then produced in large quantities, purified (“ QIAfilter Plasmid Maxi Kit “from Qiagen) and used to express the fusion protein in Escherichia coli.
  • Bacterially expressed protein is extracted from the bacteria using guanidium hydrochloride (GuHCl) and after purification by Ni-chelate columns (Ni-NTA from Qiagen) using a linear gradient of buffer A (6M GuHCl; 0.5M NaCl; 20mM sodium phosphate; pH 8 ) and buffer B (0.8M GuHCl; 0.3M NaCl; 50mM Tris
  • the protein After intensive washing with 10MM Tris / 20mM NaCl / pH7.5, the protein is eluted in the same buffer, which also contains 50mM hnidazole, and serves to demonstrate the functionality of the fusion protein or as a positive control in blood coagulation assays.
  • the fusion gene is cut out of the pTrcHisC-sTF-LZ expression vector by digestion with the restriction endonucleases Ncol and Notl and ligated into the correspondingly digested TOP / FOP vectors (see above).
  • the reporter gene constructs can be transfected either with “Lipofectin R
  • Supernatants containing sTF 217 -LZ, sTF 220 -LZ or sTF 226 -LZ are added to aliquots of pooled human blood samples (whole citrate blood) which some additional factor VUa and 28 ⁇ M of a phosphatidyl-serm phosphatidylcholine mixture (40% PS to 60% PC in TBS with 0.1% BSA). The time until the different blood sample batches clot after recalcification is measured manually.
  • SW480 cells are cotransfected with the plasmids Al ⁇ ha + GFPcycle3 and TOP-sTF-LZ or FOP-sTF-LZ in the manner described in Example 1. Thereafter, the SW480 cells by the addition of trypsin solution (0.5 mM EDTA and 2% 0 trypsin in PBS) are detached from the surface and resuspended in DMEM + 10% FCS. Fluorescent cells above a defined signal intensity are isolated using flow cytometry (see above) and added in a defined number ratio to aliquots of pooled human blood samples. The periods until the different blood sample batches clot after recalcification are measured manually.
  • trypsin solution 0.5 mM EDTA and 2% 0 trypsin in PBS

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion krankheits-assoziierter Zellen aus Körperproben das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Zellen der Körperprobe mit Nukleinsäurekonstrukten transfiziert oder infiziert werden die folgende Komponenten beinhalten: a) ein Promoter-Element mit mindestens einer DNA-Bindungsstelle für Transkriptionsfaktoren, die auf Grund der krankhaften Veränderung der Zellen eine veränderte Aktivität aufweisen und b) ein Reportergen, das die Detektion der krankhaften Zellen ermöglicht und anschliessend die transfizierten oder infizierten Zellen detektiert.

Description

Verfahren zur spezifischen Detektion, Isolation und Charakterisierung von Zellen aus Körperproben durch Transfektion von Nukleinsäurekonstrukten
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion krankheits-assoziierter Zellen aus
Körperproben das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Zellen der Körpeφrobe mit Nukleinsäurekonstrukten transfiziert oder infiziert werden die folgende Komponenten beinhalten: a) ein Promoter-Element mit mindestens einer DNA-Bindungsstelle für Transkriptionsfaktoren, die auf Grund der krankhaften Veränderung der Zellen eine veränderte Aktivität aufweisen und b) ein Reportergen, das die Detektion der krankhaften Zellen ermöglicht und anschliessend die transfizierten oder infizierten Zellen detektiert.
Krebs und bösartige Neoplasien sind nach Herz- und Kreislauferkrankungen mit deutlichem Abstand die zweithäufigste Todesursache in Deutschland und anderen
Industriestaaten dieser Welt. Die Mehrzahl aller Krebsneuerkrankungen sowie der malignombedingten Todesfälle in den westlichen Industrieländern wird durch maligne epitheliale Tumore verursacht. In der EU erkranken jährlich ca. 577.000 Menschen an Krebs und ca. 376.000 Menschen sterben jedes Jahr an den häufigsten soliden Tumorarten (Brust-, Prostata-, Lunge- und Kolonkarzinom). Sollte sich die rasante
Verringerung der Mortalität bei Herz- und Kreislauferkrankungen fortsetzen, so ist damit zu rechnen, dass in etwa 15 - 20 Jahren Krebs zur häufigsten Todesursache in Deutschland wird.
Auf Grund der verbesserten Resektabilitätsmöglichkeiten im Laufe der letzten
Jahrzehnte wird die Mortalitätsrate zunehmend durch das Metastasierungsverhalten sowie eine frühzeitige okkulte Tumorzel fesernination bestimmt, welche auf Grund der insensitiven Nachweismethodiken bzw. konventionellen histopathologischen Stagingmethoden schwer oder nicht nachzuweisen ist. Dabei ist speziell die Detektion von Tumorzellen im Blut von großer prognostischer Aussagekraft. So gilt der Nachweis von metastatischen Zellen im Blut bzw. in Lymphknoten als Hinweis auf die Bösartigkeit einer krebsartigen Veränderung. Darüber hinaus ist eine genauere Charakterisierung der im Blut befindlichen Tumorzellen auch für eine angepasste Therapieentscheidung interessant.
Allerdings ist die Identifizierung, Charakterisierung und Isolierung von Tumorzellen durch Detektion tumorspezifisch exprimierter Gene auf Grund von Spezifitäts- problemen herkömmlicher Nachweismethodiken (i.e. Immuncytochemie, in situ Hybridisierung, PCR) überaus schwierig. Dies liegt unter anderem daran, dass die Expression spezifischer Tumormarker häufig auf bestimmte Tumorarten begrenzt ist oder in den heterogenen Zellpopulationen eines Tumors variiert, so dass nur ein Teil der Tumorzellen erkannt werden kann. Ebenso stößt die Detektion seltener Ereignisse im Blut (z.B. von metastatischen Zellen) auf technische Schwierigkeiten (zu geringe Sensitivität, Spezifitätsprobleme von Antikörpern, technischer Aufwand, Kosten). Eine möglichst effiziente Detektion abnormaler Zellen bzw. die Trennung lebender Tumor- zellen von normalen Zellen aus einem Gemisch beider Zelltypen wäre dabei nicht nur für diagnostische, sondern auch für therapeutische Zwecke von hohem Wert. So ist es wichtig möglichst genau bestimmen zu können zu welchem Zeitpunkt beispielsweise Chemotherapien begonnen oder beendet werden sollten. Andererseits ist es auch von hohem Interessse die Wirksamkeit von Medikamenten im Therapieverlauf zu ermitteln. Hierzu ist es notwendig ein möglichst sensitives und schnelles Verfahren zur Verfügung zu haben mit dem die Anwesenheit selbst sehr geringer Mengen metastatischer Zellen qualitativ nachzuweisen.
Besonders sinnvoll wäre darüber hinaus die routinemäßige Isolierung von lebenden Tumorzellen aus dem Blut mit anschließenden Analysemethodiken, um zu untersuchen ob die in Frage kommenden Therapeutika tatsächlich die Tumorzellen abtöten können. Einfache Verfahren, die dies routinemäßig und mit hoher Sensitivität ermöglichen können, existieren in der klinischen Diagnostik jedoch noch nicht.
Am weitesten fortgeschritten auf diesem Gebiet sind die Verfahren der Firmen
Immunicon und Miltenyi Biotec, die für ihre magnetischen Zellseparierungs- verfahren Antikörper gegen epitheliale Oberflächenantigene (EpCAM bzw. HEA) verwenden. Diese Antigene werden von allen epithelialen Zellen, also sowohl von gesunden als auch von malignen Zellen, in einem unterschiedlichem Expressionsgrad auf den Zelloberflächen exprimiert. Da Blutzellen diese Antigene nicht besitzen ermöglichen diese Verfahren eine circa 5 bis lOfache Anreicherung von Epithelzellen aus dem Blut. Auf Grund der geringen Zahl an malignen Zellen in der Tumoφrobe besteht der Großteil der Zellen nach magnetischer Separierung immer noch aus peripheren Blutzellen. So beschreiben Krüger et al. (1999; Cytotherapy 1: 135-139.) eine Anreicherung epithelialer Zellen mittels der HEA-immunobead-Methodik von 2,6 pro 10 Zellen auf 10,6 pro 10 Zellen, wobei ein signifikanter Verlust an
Tumorzellen bemängelt wird. Darüber hinaus können Tumorarten nicht epithelialen Ursprungs mit dieser Methodik nicht angereichert werden. Andere Verfahren zur Erkennung von Karzinomzellen in Blutproben beinhalten Schritte zur Permeabil- isierung und Fixierung der Zellen, so dass keine lebenden Tumorzellen isoliert werden können. Dabei werden die positiv selektionierten Zellen mittels immun- cytochemischer Verfahren gefärbt, wobei zumeist Antiköφer gegen Cytokeratine für den Nachweis von epithelialen Zellen verwendet werden. Da die entsprechenden Cytokeratine in Blutzellen nicht vorhanden sind, gilt der Nachweis dieses Proteins, das in sämtlichen epithelialen Zellen vorhanden ist, als Nachweis von metastatischen Tumorzellen. Diese Verfahren stoßen nicht nur auf technische Schwierigkeiten, sondern sind zudem auch kostenaufwendig, personal- und zeitintensiv.
Ein vollkommen neuer Ansatz in diesem Gebiet ist die Ausnutzung tumorzellspezi- fischer Signalaktivitäten durch Transfektion von Reportergenkonstrukten zur spezi- fischen Isolierung lebender Tumorzellen aus einem Gemisch mit gesunden Zellen (z.B.
Blutzellen). Dabei wird die vielfach beschriebene Tatsache ausgenutzt, dass Tumorzellen Signalaktivitäten aufweisen, die in gesunden Zellen nicht vorhanden sind.
Die Vermehrung von Köφerzellen wird normalerweise durch zahlreiche Regulations- mechanismen innerhalb der Zelle kontrolliert, so dass sich jede Zelle abgestimmt auf den Gesamtorganismus nur im Bedarfsfall zu teilen beginnt. Diese Prozesse werden durch Signalmoleküle reguliert, die von „Senderzellen" sezerniert werden, bei den „Empfängerzellen" an spezifische Rezeptormoleküle an der Oberfläche binden und nachfolgend sogenannte Signaltransduktionswege aktivieren, die letztendlich veränderte Genexpressionen zur Folge haben. In Tumorzellen sind dabei häufig aktivierende oder aber hemmende Regulationsmoleküle mutiert, die diese Signalaktivitäten kontrollieren (ihnen entsprechen die Onkogene bzw. Tumorsuppressorgene). Tumorzellen besitzen demzufolge Aktivitäten in ihrem Zellkern, die sonst nur in bestimmten Entwicklungsstadien der Embryonalentwicklung oder aber in genau definierten Gewebebereichen vorkommen.
Beispiele für solche Signalaktivitäten, die mit dem Krebswachstum in Verbindung stehen, sind der Wnt- und Ras-Signaltransduktionsweg, sowie der Funktionsverlust des Tumorsuppressors p53. Im Krebsgeschehen humaner Kolontumore spielen diese Signalaktivitäten in unterschiedlichen Stadien der Tumorentstehung eine Rolle (Kinzler, K.W. & Vogelstein, B. (1996). Lessons from hereditary cancer. Cell
87:159-70.), so dass sie sich diagnostisch für ein Staging der Tumorzellen bzw. für die simultane Analyse mehrerer krebsassoziierter Signalaktivitäten (auch bei therapeutischen Ansätzen) eignen. Komponenten der Wnt-Signaltransduktionsweges sind in nahezu allen Kolonkarzinomzellen bereits in einem sehr frühen Stadium mutiert, wobei das Tumorsuppressorgen APC (= „Adenomatöse Polyposis Coli") in 80 % der spontanen Tumore durch Mutationen inaktiviert ist, während das Onkogen ß-Catenin in 10 % der Tumore durch Mutation aktiviert ist. Die restlichen 10 % der Tumore besitzen aller Wahrscheinlichkeit nach Mutationen in anderen Komponenten des Wnt-Signaltransduktionsweges, so dass allgemein davon ausgegangen wird, dass diese Mutationen als frühes Ereignis bei der Initiation der Tumorgenese auftreten. Demzufolge ist in allen Kolonkarzinomzellen Wnt-Signalaktivität vorhanden, die letztendlich auf die Wechselwirkung des Onkogens ß-Catenin an TCF/LEF-Transkriptionsfaktoren im Zellkern zurückzuführen ist. In fortgeschritteneren Stadien der Kolonkarzinogenese ist auch das Onkogen K-ras in ca. 70 % der Fälle durch Mutation aktiviert. Normaler- weise werden die Ras-Proteine nach Bindung von spezifischen Liganden an unterschiedliche Zelloberflächenmoleküle (z.B. Rezeptor-tyrosiri inasen, Integrine, Ionen- kanäle) über Adaptoφroteine (z.B. Shc, Grb2, Crk, ...) und nachgeschaltete Guanin- Nukleotid-Austausch-Faktoren (z.B. Sos, C3G, ...) stimuliert. In Kolontumorzellen werden auf Grund von Mutationen des Ras-Gens konstitutiv aktive Ras-Proteine expremiert, die auch ohne die vorgeschalteten Komponenten des Ras-Signaltrans- duktionsweges aktiv sind. Dies bewirkt letztendlich die Aktivierung nachgeschalteter
Komponenten des Signalweges, die die Überaktivität zahlreicher Transkriptionsfaktoren (CREB, SRF, cFos, c-Jun, PPAR, ER, ETS, ELK-1, STAT, Myc, Max, DPC4, p53, NFAT4, CHOP, MEF2, ATF-2, ...) im Zellkern zur Folge hat, die daraufhin u.a. das Teilungswachstum der Zellen induzieren können. In einem noch weiter fortgeschrittenen Kolontumorstadium kommt es in mehr als 80 % der Tumore zur Mutation des Tumorsuppressorgens p53, das in gesunden Zellen als aktiver Transkriptionsfaktor bei Auftreten von krankheitsassoziierten Veränderungen das Teilungswachstum von Zellen verhindert bzw. zum prograrnmierten Zelltod der Zelle führt, indem es an spezifische DNA-Sequenzen (PuPuC(A/T)(A/T)GpyPyPy) bindet und wachsumsinhibitorische Gene (z.B. p21 ) aktiviert.
Diese Tumor-assoziierten Signalaktivitäten fuhren neben einer direkten Aktivierung von Transkriptionsfaktoren auch häufig zur verstärkten Expression von Transkriptionsfaktoren, die ihrerseits andere Gene aktivieren oder repremieren können und somit erst sekundär bzw. indirekt aktiviert werden. Ein hervorragendes Beispiel hierfür ist der PPARδ Transkriptionsfaktor („Peroxisome Proliferator Activated Receptor Delta"), der in Kolonkarzinomzellen auf Grund der Überaktivität der Wnt- Signaltransduktionskaskade expremiert wird. Es konnte gezeigt werden, dass Inhibitoren dieses Transkriptionsfaktors, sogenannte „Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drugs" (=NSAIDS), wie zum Beispiel Sulindac oder Aspirin, durch Hemmung dieses Transkriptionsfaktors das Wachstum von Tumorzellen hemmen können (He, T.C., Chan, T.A., Vogelstein, B. & Kinzler, K.W. (1999). PPARdelta is an APC- regulated target of nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Cell 99:335-45.). Ein weiteres Beispiel für einen sekundär induzierten Transkriptionsfaktor ist c-myc, der beispielsweise auch in Zellen mit aktiver Wnt-Signalaktivität überexprimiert wird
(He, T.C. et al. (1998). Identification of c-myc as a target of the APC pathway. Science 281:1509-12). Der Synergismus unterschiedlicher Signalaktivitäten bei der Progression von Tumoren wurde am Beispiel der Onkogene myc und ras bereits 1987 von Sinn et al. beschrieben (Sinn, E., Muller, W., Pattengale, P., Tepler, L, Wallace, R. & Leder, P. (1987). Coexpression of MMTV/v-Ha-ras and MMTV/c- myc Genes in transgenic mice: Synergistic action of oncogenes in vivo. Cell 49:465- 475.). Das Zusammenwirken von Proto-Onkogenen (wie z.B. ß-Catenin, Ras, Myc, Fos) und Tumorsuppressorgenen (wie z.B. APC, Rb, p53) wird in dem Übersichtsartikel von Hanahan et al. anschaulich beschrieben (Hanahan, D. & Weinberg, R.A. (2000). The hallmarks of cancer. Cell 100:57-70.).
Die oben beschriebenen Signalaktivitäten spielen in zahlreichen anderen Tumorarten eine wichtige Rolle. So ist die Zahl der Befunde, nach denen Komponenten der Wnt- Signaltransduktionskaskade in vielen Tumoren mutiert sind bzw. kernlokalisiertes ß- Catenin immunhistochemisch in Tumorgeweben nachweisbar ist, in den letzten Jahren exponentiell angewachsen. Dies unterstreicht die zentrale und generelle
Bedeutung dieser Signalaktivitäten im Krebsgeschehen humaner Tumore. So werden aktivierende Mutationen des Onkogens ß-Catenin unter anderem in Tumoren der Leber, der Niere, des Pankreas, des Magens, der Prostata, der Schilddrüse, der Gebärmutter, der Haut und Medulloblastomen gefunden. Beispielsweise ist ß- Catenin in 75 % humaner Hauttumore (Chan, E.F., Gat, TJ., McNiff, J.M. & Fuchs,
E.(1999). A common human skin tumour is caused by activating mutations in beta- catenin. Nat Genet 21:410-3.) und in 89% humaner Lebertumore (Jeng, Y.M., Wu, M.Z., Mao, T.L., Chang, M.H. & Hsu, H.C. (2000). Somatic mutations of beta- catenin play a crucial role in the tumorigenesis of sporadic hepatoblastoma. Cancer Lett. 152:45-51.) mutiert. Darüber hinaus werden Mutationen in anderen Komponenten der Wnt-Signaltransduktionskaskade gefunden, die einen identischen Effekt hinsichtlich der Krebsentstehung haben (siehe oben; Satoh, S., Daigo, Y., Furukawa, Y., Kato, T., Miwa, N., Nishiwaki, T., Kawasoe, T., Ishiguro, H., Fujita, M., Tokino, T., Sasaki, Y., Imaoka, S., Murata, M., Shimano, T., Yamaoka, Y. & Nakamura, Y. (2000). AXLN1 mutations in hepatocellular carcinomas, and growth suppression in cancer cells by virus-mediated transfer of AXIN1. Nat Genet 24:245-50.). Auch in Tumoren der Brust spielt die Aktivierung der Wnt-Signaltransduktionskaskade eine zentrale Rolle und ist darüber hinaus von prognostischer Aussagekraft (Lin, S.Y., Xia, W., Wang, J.C., Kwong, K.Y., Spohn, B., Wen, Y., Pestell, R.G. & Hung, MC.(2000). Beta-catenin, a novel prognostic marker for breast cancer: its roles in cyclin Dl expression and cancer progression. Proc Natl Acad Sei USA 97:4262-6.).
Die zentrale Bedeutung von p53 bei der Entstehung zahlreicher Tumore ist vielfach beschrieben. p53 ist das am häufigsten mutierte Tumorsuppressorgen in humanen Tumoren (mehr als 10.000 Mutationen sind in der Literatur beschrieben worden; Hernandez-Boussard, T., Rodriguez-Tome, P., Montesano, R. & Hainaut, P. (1999).
IARC p53 mutation database: a relational database to compile and analyze p53 mutations in human tumors and cell lines. International Agency for Research on Cancer. Hum Mutat 14:1-8.). p53 reguliert Zellzykluskontrolle und Apoptosevor- gänge im Zusammenhang mit Reparaturmechanismen nach DNA-Schädigungen. Demzufolge wird p53 auch als Wächter des Genoms („Guardian of the Genome") bezeichnet, wobei die Funktionalität von p53 als Transkriptionsfaktor von entscheidender Bedeutung ist (siehe oben). Mutationen von p53 wurden in sehr vielen Tumorarten gefunden, z.B. in Tumoren des Kolons, der Leber, der Brust, des Magens, des Pankreas, des Blutes, der Lunge, der Schilddrüse. Die generelle Tumor- suppressorfunktion von p53 zeigt sich auch bei Patienten mit vererbten Mutationen des p53 Gens, die zahlreiche unterschiedliche Tumore entwickeln (Mazoyer, S., Lalle, P., Moyret-Lalle, C, Marcais, C, Schraub, S., Frappaz, D., Sobol, H. & Ozturk, M. (1994). Two germ-line mutations affecting the same nucleotide at codon 257 of p53 gene, a rare site for mutations. Oncogene 9: 1237-1239 // Akashi, M. & Koeffler, H.P. (1998). Li-Fraumeni syndrome and the role of the p53 rumor suppres- sor gene in cancer suseeptibility. Clin Obstet Gynecol 41:172-99.). Darüber hinaus sind Mutationen in p53 u.a. auch für Resistenzen gegenüber Chemotherapeutika verantwortlich (Aas, T., Borresen, A.-L., Geisler, S., Smith-Sorenson, B., Johnsen, H., Varhaug, J.E., Akslen, L.' A. & Lonning, P.E. (1996). Specific P53 mutations are associated with de novo resistance to doxorubicin in breast cancer patients. Nature
Med 2: 811-814.). Die zentrale Bedeutung der Ras-Signaltransduktionskaskade, die auch als SOS-Ras- Raf-MAPK-Kaskade bezeichnet wird, ist in der Literatur vielfältig beschrieben worden. In circa 25 % humaner Tumore konnten strukturell veränderte Ras-Proteine nachgewiesen werden, die einem andauernden, wachstumsfordernden Signal gleichkommen (Hanahan, D. & Weinberg, R.A. (2000). The hallmarks of cancer. Cell 100:57-70.). Speziell in Kolontumoren ist Mutationshäufigkeit in bestimmten Krebsstadien sehr hoch (siehe oben). Es wurden jedoch auch in zahlreichen anderen Geweben Mutationen von Ras-Genen nachgewiesen, z.B. in Tumoren der Lunge, des Magens, des Pankreas, der Gallenblase, der Brust, der Gebärmutter, Sarkome.
Der Nachweis der Signalaktivitäten von aktivierten Transkriptionsfaktoren bzw. sekundär induzierten Transkriptionsfaktoren unter Verwendung sogenannter Reporter- genkonstrukte wird in der Grundlagenforschung dazu verwendet, um biochemische Prozesse in etablierten Tumorzellinien zu untersuchen. Die Reportergenkonstrukte bestehen dabei aus einer Promotorregion, an die bestimmte Transkriptionsfaktoren binden können, und einem Reportergen, das in den Zellen normalerweise nicht vorhanden ist und bei Expression relativ leicht auf Grund der enzymatischen Aktivität bzw. der Fluoreszenz des Genprodukts nachgewiesen werden kann. So bietet die Firma Clontech in ihrem Katalog für das Jahr 2001 auf den Seiten 210 bis 212 ein sogenanntes „Mercury ™ Pathway Profiling System" an, mit dem die Aktivitäten der Transkriptionsfaktoren NFAT, API, NFKB, CREB, ATF, c-Jun, c-Fos und ELK nachgewiesen werden können. Mit diesem System sollen Signalaktivitäten in etablierten Tumorzellinien untersucht und quantifiziert werden. Dabei werden die Signalaktivitäten durch Zugabe von externen Stimuli wie z.B. PMA, Ionomycin und Forskolin induziert und mittels der Reportergene Luciferase, SEAP (= sezemierte Form der Alkalischen Phosphatase) oder d2EGFP (= destabilisierte Form des „Enhanced Green Fluorescent Protein") gemessen. In diesen Assays werden die Reportergenkonstrukte mittels der Kalzium-Phosphat-Präzipitationsmethodik transient in die Tumorzellinienzellen trans- fiziert, um die Wirksamkeit von zusätzlich in die Zellen transfizierten Genkonstrukten, deren Genprodukte mit den Signalaktivitäten wechselwirken könnten, zu untersuchen. Diese Untersuchungsansätze haben demnach das Ziel den molekularen Mechanismus der Signaltransduktionskaskaden aufzuklären.
Auffällig ist, dass ein solcher Ansatz bisher nicht zur Detektion primärer Tumor- zellen, wie sie z.B. aus Tumoren und vor allem zur Detektion von metastatischen
Zellen aus dem Blut von Tumoφatienten beschrieben wurde. Darüber hinaus fällt auf, dass meist nur die biochemische Aktivität eines spezifischen Signalweges durch ein Reportergenkonstrukt abgefragt wird. Eine simultane Analyse mehrerer Signalaktivitäten in einer einzelnen Zelle, die für die klinische Diagnostik von großer Bedeutung wäre, wird bei den Zellinienexperimenten nicht adressiert.
Eine Anwendung solcher Reportergensysteme in der klinischen Diagnostik ist mit derartigen Systemen weder beabsichtigt noch möglich, da die Transfektionseffizien- zen dieses Systems für die Transfektion (= DNA-vermittelter Gentransfer) von pri- mären Tumorzellen unzureichend sind. Die Promotorstrukturen sind darüber hinaus nicht dergestalt optimiert, dass sie als sensitives Meßsystem auch ohne externe Stimuli eine ausreichende Expression des Reportergens in primären Tumorzellen ermöglichen. Ebenso vergleichen die experimentellen Ansätze stets Aktivitäten von induzierten und nicht-induzierten Tumorzellinien, enthalten jedoch keinen Vergleich zwischen „gesunden" Zellen und Tumorzellen. Die Zielrichtung derartiger Reportergensysteme ist ganz offensichtlich nicht die klinische Diagnostik von Tumorzellen, sondern vielmehr die Aufklärung von generellen Signaltransduktions-mechanismen in Tumorzelliniensystemen.
Der elementare Mangel der bisherigen Reportergensysteme wird auch in dem Patent von Hans Clevers und Bert Vogelstein (US5851775; Anmeldung 20/031997) evident. Diese Arbeitsgruppe weist die tumor-assoziierte Wnt-Signalaktivität in Kolonkarzinomzellinien mittels eines Luciferase-Reportersystems in Zellkultursystemen nach (Korinek, V. et al. (1997). Constitutive Transcriptional Activation by a beta-catenin-Tcf complex in APC-/- Colon Carcinoma. Science 275: 1784-1787.).
Das Patent beschreibt eine Methodik zur Identifizierung potentieller Therapeutika unter Verwendung von TCF-Transkriptionsfaktor-responsiven Reportergenkon- strukten. Dabei wird die Untersuchung von Zellen beansprucht, die Mutationen in den Signaltransduktionskomponenten APC oder ß-Catenin aufweisen. Ein derartiges Screening-System geht auf die spezifischen Gegebenheiten der Kolonkarzinogenese ein, in denen APC und ß-Catenin häufig mutiert sind (siehe oben). Substanzen, die die Wnt-Signalkaskade auf Grund der Wechselwirkung mit anderen Komponenten der Kaskade beeinflussen, können mit diesem System jedoch nicht gefunden werden. Hierfür wäre es sinnvoll ein zelluläres System (z.B. unter Verwendung von Brusttumorzellen) zu etablieren, bei der die Wnt-Signalaktivität z.B. auf die Überex- pression des extrazellulären Liganden Wnt zurückzuführen ist. Die in dem Patent beanspruchten Reportergenkonstrukte werden darüber hinaus weder zur Detektion noch Isolierung von primären Tumorzellen beansprucht, noch wird an eine derartige Anwendung in der klinischen Diagnostik in diesem Zusammenhang gedacht.
In einem Patent von Bert Vogelstein und Kenneth Kinzler (US6140052; Anmeldung
20/08/1998) wird ein Reportergenkonstrukt zur Bestimmung der Wnt-Signalaktivität beansprucht, das eine genau festgelegte Basenabfolge der Bindungsstelle von TCF- Transkriptionsfaktoren in den Promotorstrukturen enthält (CTTTGAT und ATCAAAG), die sich aus dem von ihnen entdeckten c-myc-Zielgenpromotor ablei- tet. Dies steht im augenscheinlichen Widerspruch zu der Tatsache, dass die hier untersuchten TCF-Faktoren gegenüber Veränderungen in der Basenabfolge ihrer DNA-Bindungsstellen unempfindlich sind. So wird die DNA-Bindungsaktivität des sehr nah verwandten LEF-1 -Transkriptionsfaktors bereits 1995 von Love et al. (Love, J.J. et al. (1995). Structural basis for DNA bending by the architectural transcription factor LEF-1. Nature 376: 791-795) durch Kokristallisierungsexperi- mente beschrieben, wobei die Basenabfolge der verwendeten DNA-Bindungsstelle (CCTTTGAA) intensive Kontakte mit der DNA-Bindungsdomäne des Transkriptionsfaktors macht. Dabei wird beschrieben, dass die Position des mittleren Thymidins für die Bindungsaffinität kritisch ist, während die Transversion ("T -> A") des benachbarten Thymidins keinen Einfluss auf die Bindungsaktivität hat. Demnach wären auch andere Basenabfolgen ähnlich effizient in ihren B dungsaffinitäten (z.B. CCATTGAA). Da LEF-1 und TCF-Faktoren einander nicht nur strukturell sehr verwandt sind sondern sich auch funktioneil gegenseitig ersetzen können, macht es wenig Sinn eine spezifische Basenabfolge für LEF-1/TCF-Faktoren, wie im US- Patent US6140052 geschehen, zu beanspruchen. Darüber hinaus diskutierten die Patentinhaber bereits im Oktober 1996 die Bedeutung dieser Faktoren in der Kolon- karzinogenese (Kinzler, K.W. & Vogelstein, B. (1996). Lessons from hereditary cancer. Cell 87:159-70.).
Als Reportergen zur Isolierung lebender Tumorzellen aus Blutproben bietet sich das Grün-Fluoreszinierende-Protein GFP an, das auf Grund seines Fluoreszenzverhaltens bei Expression zu einem Aufleuchten der Zellen nach entsprechender Belichtung führt. GFP ist in vielfaltiger Form bereits patentiert worden. Das nächstliegende Patent (US5968738) beschreibt unter anderem die Verwendung von zwei GFP Varianten und FACS bzw. Durchflusszytometrie zur "Analyse von Signaltransduktionsaktivitäten". Ein spezifisches Patent zur Diagnostik von metastatischen Zellen aus dem Blut existiert jedoch nicht. Fast alle Patente befassen sich bisher mit therapeutischer Nutzanwendung oder beschreiben die Zellsortierung von Zelliniengemischen in vitro. Für die diesem Patent zu Grunde liegenden Experimente wurde eine GFP-Variante verwendet („alphaGFPT204I"), die unseres Wissens nach bisher nicht für eine Verwendung als Reportergen beansprucht wurde. Das erhöhte Fluoreszenzverhalten dieser GFP-Variante wurde bereits 1996 veröffentlicht (Crameri, A., Whitehorn, E.A., Täte, E. & Stemmer, W.P.C. (1996). Improved Green Fluorescent Protein by molecular evolu- tion using DNA shuffling. Nature Biotechnology 14:315-319). Darüber hinaus wurde als Transfektionskontrolle ein konstitutiv expremiertes, rot fluoreszinierendes Protein aus Discosoma sp. (=„DsRed") der Firma Clontech verwendet (Kat. Nr. 6921-1).
Für die Isolierung lebender Tumorzellen aus Köφβφroben können neben fluores- zenten Reportergenprodukten jedoch auch zahlreiche andere Gene verwendet werden, die zum Beispiel auf Grund von strukturellen Eigenschaften nachgewiesen wer- den können. Von besonderem Interesse sind dabei Gensequenzen, die für Produkte kodieren, die extrazellulär nachweisbar sind. Ganz besonders geeignet sind dabei Transmembranproteine, die antigene Strukturen auf der Oberfläche der Zellen exponieren, die von entsprechenden Antiköφern erkannt werden. Dabei sind antigene Sequenzen nicht-humanen Ursprungs von Vorteil, deren Nachweis auf Grund der fehlenden Kreuzreaktivitäten der Antiköφer eine erhöhte Spezifität ermöglicht, da keine endogenen, humanen Genexpressionen detektiert werden. Die antigenen
Strukturen können dabei mittels molekularbiologischer Verfahren in unterschiedlichster Form mit natürlichen Gensequenzen rekombiniert werden, so dass die antigenen Strukturen vorzugsweise extrazellulär präsentiert werden.
Für die Detektion krankheits-assoziierter Signalaktivitäten eignen sich darüber hinaus auch Reportergene, die enzymatische Aktivitäten vermitteln, wie z.B. Luciferasen, ß-Galaktosidasen, Proteasen, Glykosidasen, Acety lasen, Phosphatasen, die intrazellulär vorliegen können oder sekretiert werden. Zur Detektion seltener Ereignisse ist es dabei von Vorteil ein möglichst sensitives Nachweisverfahren unter Einbeziehung von Verstärkungssystemen zu verwenden. In der Immunhisto- und
Immuncytochemie sind solche Verstärkungssysteme weit verbreitet und beinhalten in der Regel die Verwendung von Sekundärantiköφern oder des Biotin-Streptavidin- systems in Kombination mit enzymatischen Nachweisreaktionen um die Signalintensität zu erhöhen.
Bei der Detektion seltener Ereignisse im Blut (z.B. metastatischer Zellen) bietet es sich an ein natürliche Verstärkungssysteme zu verwenden, die im Blut natürlicherweise vorhanden sind. Insbesondere wäre es interessant aktive Komponenten der Blutgerinnungskaskade spezifisch von metastatischen Tumorzellen in Patientenblutproben sekretieren zu lassen, die zur Gerinnung tumorzellhaltiger Blutproben führen würde.
Normalerweise schützt sich der Organismus durch den Vorgang der Blutstillung (Hämostase) bei Verletzungen gegen Blutverluste. Dabei wird in Anwesenheit unterschiedlicher aktivierender Substanzen eine Kaskade enzymatischer Reaktionen in Gang gesetzt. Von besonderer Bedeutung für dieses Patent ist die beschriebene exogene Aktivierung des Gerinnungssystems durch Faktor VII mit Gewebsthromboplastin als
Protein-Cofaktor. Das im Blut zirkulierende Zymogen des Faktors VII hat im Gegen- satz zu allen anderen inaktiven Vorstufen Gerinnungsfaktoren bereits proteolytische Aktivität, die jedoch nicht zu einer Gerinnungsaktivierung führt, wenn kein Gewebsthromboplastin vorhanden ist. Gewebsthromboplastin wird bei Gewebeverletzungen aus den Mikrosomen verletzter Zellen freigesetzt. Es ist (in der natürlichen Form) ein Komplex aus einem Protein und einem Phospholipid. Freigesetztes
Gewebsthromboplastin verleiht dem einkettigen Faktor- VJJ-Zymogen ohne proteolytische Aktivität eine größere Aktivität. Der Gewebsthromboplastin-Faktor- VE-Komplex bildet in Gegenwart von Kalzium-Ionen an Phospholipidpartikeln (Plättchenfaktor 3) einen Komplex, an dem die Aktivierung der Faktoren IX und X erfolgt. Im Zuge der fortschreitenden Aktivierung des plasmatischen Gerinnungssystems kommt es bei der
Aktivierung jeder nachfolgenden Enzymreaktion zu einer enormen Verstärkung des Ausgangssignals. Am Ende dieser lawinenartigen Reaktionskaskade, die auch als plasmatische Gerinnung bezeichnet wird, steht die Umwandlung von Fibrinogen zu Fibrin, dessen dreidimensionales Netzwerk den losen Thrombozytenpfropf an der ver- letzten Stelle durchdringt und ihn verfestigt. Entscheidend bei der exogenen Aktivierung der Gerinnungskaskade ist die Bindung von Anteilen der extrazellulären Domäne des Gewebsthromboplastins mit dem Zymogen des Faktors VJJ. Natürlich vorkommendes Gewebsthromboplastin ist ein integrales Membranprotein, das in intakten Zellen im Zellinnern (im Endoplasmatische Retikulum) verborgen vorliegt und erst bei Verletzung der Zellintegrität freigesetzt wird, so dass es zu keiner vorzeitigen Aktivierung der Blutgerinnungskaskade kommen kann. Von klinischer Relevanz ist Bestimmung der klinisch-chemischen Kenngröße der Thromboplastinzeit (= „Qick-Wert", TPZ, Prothrombinzeit). Die Thromboplastinzeit gehört zu den Gerinnungsanalysen, die vor allen operativen Eingriffen durchgeführt werden müssen, um eine mögliche Ver- minderung der Faktoren π, V, VTI, X und von Fibrinogen zu ermitteln. Hierzu wird die
Fibrinbildung durch Zugabe von Gewebsthromboplastin und Kalzium-Ionen in Plasma aus Citrat- Vollblut ausgelöst und die Gerinnungszeiten gegenüber Kontrollblutplasma bestimmt, wobei die Thromboplastinzeit unter der Applikation von Heparin vermindert ist. Auf Grund der molekularen Beschaffenheit von natürlichem Gewebsthromboplastin ist die Gewinnung und Aufreinigung eines funktioneilen Protein/Phospholipidpartikels zur Bestimmung der Thromboplastinzeit technisch aufwendig. Inzwischen ist es jedoch gelungen eine natürlicherweise nicht vorkommende, wasserlösliche Variante von Thromboplastin rekombinant in Bakterien und anderen Expressionssystemen herzustellen (Übersichtsartikel: Morrissey, JH. (1995). Tissue factor modulation of factor VJJa activity: use in measuring trace levels of factor VTIa in plasma. Thromb Haemost. 74:185-8.). Diese wasserlöslichen Formen des Gewebsthromboplastins („soluble Tissue Factor" = sTF) bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 219 sind kommerziell erhältlich (z.B. als Bestandteil eines Kits zur Bestimmung der Faktor VTIa Menge der
Firma Diagnostica Stago Kat. # 00281)) und können in Anwesenheit von Phopholipid- Vesikeln und Faktor Ntla die Aktivierung von Faktot X bewirken (Ruf ,W., Rehem- tulla, A., Morrissey, J.H., Edgington T.S. (1991). Phospholipid-independent and - dependent interactions required for tissue factor receptor and cofactor function. J Biol Chem. 266:16256.). Für diese Experimente wurde die isolierte extrazelluläre Domäne von Thromboplastin in Säugerzellen expremiert und ähnlich wie in Experimenten von Νeuenschwander et al. als sezeniertes Protein aus Zellkulturüberständen isoliert. Dabei zeigte sich, dass der Verlust der Transmembranregion für die Autoaktivierung von Faktor VJJ von Bedeutung ist, was eine stark verlängerte Gerinnungsdauer in Standart Blutgerinnungsassays zur Folge hat (Νeuenschwander, P.F. & Morrissey, J.H. (1992).
Deletion of the membrane anchoring region of tissue factor abolishes autoactivation of factor VII but not cofactor function. Analysis of a mutant with a selective deficiency in activity. J Biol Chem 267:14477-82.). Inzwischen ist es jedoch durch Fusion einer synthetischen Leucm-Reißverschluss-Dimerisierungsdomäne gelungen, eine rekom- binante Form der isolierten extrazellulären Domäne von Thromboplastin zu generieren, die auch in Abwesenheit von Phospholipiden zur Autoaktivierung von Faktor VTJ befähigt ist und ähnliche biochemische Aktivitätn wie das aufgereinigte Wild-Typ Thromboplastin bei der Aktivierung von Faktor X besitzt (Donate, F., Kelly, C.R., Ruf, W & Edgington, T.S. (2000). Dimerization of tissue factor supports solution-phase autoactivation of factor VQ without influencing proteolytic activation of factor X.
Biochemistry 39: 11467-76.). Erfindungsgemäß können jedoch auch andere aktive Komponenten der Blutgerinnungskaskade als Reportergen verwendet werden (z.B. Thrombin, Faktor Va, Faktor Vlla, Faktor IXa, Faktor Xa oder Faktor XTIa) oder Komponenten anderer biologischer Kaskaden (z.B. des Komplement Systems, des Kinin Systems) oder generell aktive Substanzen, die Fibrin oder andere Substrate umsetzen (wie z.B. fPA, uPA, Plasminogen /Plasmin, oder Derivate bzw. Hybride derselben). Umgekehrt können auch Varianten der Komponenten verwendet werden, die diese biologischen Kaskaden inhibieren. So erscheint z.B. die Verwendung von Plasmin, der aktiven Komponente von Plasminogen, als skretiertes Reportergen sinnvoll zu sein, da es
(durch Veränderung der FaktorX-Aktivität) die Blutgerinnung hemmt und gleichzeitig die Fibrinolyse stimuliert (Pryzdial, E.L., Lavigne, N., Dupuis, N. & Kessler, G.E.(1999). Plasmin converts factor X from coagulation zymogen to fibrinolysis cofactor. J Biol Chem 274:8500-5.) und somit unter entsprechenden, experimentellen Bedingungen meßbar ist (Blutgerinnungsassays, Umsatz chromogener bzw. fluores- zenter Substrate).
Die diagnostische Verwendung von Komponenten biologischer Kaskaden als Reportergen in Blutproben ist neu. In dem nächstliegenden US Patent 6080575 wird die Verwendung von Nukleinsäurekonstrukten beschrieben, die für ein Fusionsprodukt aus einer aktiven Komponente, einem Protease-sensitiven Bereich und einer inhibitorischen Komponente bestehen. Dabei kann die aktive Komponente des Fusionsproteins u.a. auch Bestandteil der Blutgerinnungskaskade (i.e. Faktor X) sein. Diese aktive Komponente ist jedoch im Kontext des intakten Fusionsproteins auf Grund der Anwesenheit der inhibitorischen Komponente in ihrer Aktivität gehemmt.
Erst die Anwesenheit bestimmter Proteasen im umgebenden Milieu, z.B. durch Zugabe von PSA zu Zellkulturüberständen von Zellen, die mit dem Nukleinsäure- konstrukt stabil transfiziert wurden, setzt die aktive Komponente frei, und führt in Blutgerinnungsassays zu kürzeren Blutgerinnungszeiten nach Rekalzifikation. Ziel dieses Patentes ist es die Sekretion von Proteasen durch Tumorzellen oder durch
Zellen, die an entzündlichen Prozessen beteiligt sind, auszunutzen. Dabei beabsich- tigt dieses Patents eine therapeutische Nutzanwendung des beschriebenen Verfahrens zur Zielzell-spezifischen Therapie von Tumoren und entzündlichen Regionen.
In dem US Patent 4784950 wird die Expression von Proteinen in Säugerzellen patentiert, die biologische Aktivität im Sinne der Aktivierung der Blutgerinnung haben. Dabei dient das beschriebene Verfahren der Produktion großer und hochreiner Mengen von Faktor VTIa und Faktor IX zur Behandlung von Patienten, die entsprechende Defizienzen aufweisen. Wiederum handelt es sich bei diesem Patent also um eine rein therapeutische Nutzanwendung.
Die Isolierung bestimmter Zellen aus heterogenen Zellgemischen ist nicht nur für die Detektion und Charakterisierung von krankhaft veränderten Zellen interessant. Auch die Isolierung von gesunden Zellen ist von diagnostischer und therapeutischer Bedeutung. Beispielsweise ist die Isolierung adulter Stammzellen, die zu unterschied- liehen organ- oder gewebsspezifischen Zellen ausdifferenzieren können, von großem medizinischem Interesse. So könnten Stammzellen, nach ihrer Isolation und Vermehrung ex vivo, zur Heranzüchtung und autologen Transplantation von Ersatzorganen verwendet werden. Die hierzu benötigten Stammzellen könnten dabei nach entsprechender „Transdifferenzierung" auch aus anderen Ursprungsorganen stammen. Die medizinische Bedeutung pluripotenter Stammzellen geht nicht zuletzt aus den Erfahrungen mit hämatopoetischen Stammzellen bei der Behandlung von Blutkrebspatienten hervor. Die Verwendung von adulten Stammzellen aus anderen Organen erwies sich jedoch als äusserst komplex, da die Isolation der seltenen Stammzellen in nicht-differenziertem Zustand und hoher Reinheit sehr schwierig ist.
Das Vorhandensein derartiger, pluripotenter Zellen konnte jedoch inzwischen in zahlreichen Organen nachgewiesen werden. So konnten Stammzellen z.B. aus schnell regenerierenden Organen (Haut, Darm, Skelettmuskel) unter selektiven Wachstumsbedingungen angereichert werden. Neueren Untersuchungen zufolge benötigen adulte Stammzellen jeweils spezifische biochemische Aktivitäten für die
Aufrechterhaltung ihres dedifferenzierten Zustandes. Besonders eindrucksvoll zeigt sich dies am Beispiel der Dünndarmepithel-Stammzellen, die bei Deletion des Transkriptionsfaktors TCF4 verloren gehen (Korinek, V., Barker, N, Moerer, P., van Donselaar, E., Hüls, G., Peters, P.J. & Clevers, H. (1998). Depletion of epithelial stem-cell compartments in the small intestine of mice lacking Tcf-4. Nat Genet 19:379-83). Dieser Untersuchung zufolge benötigen die Stammzellen des Dünndarms
Wnt-Signalaktivität, die in den Krypten der Dünndar mikrovilli mittels TCF4 vermittelt wird, für ihr Fortbestehen im adulten Organismus. Ähnliche Schlussfolgerungen für andere Organsysteme lassen sich aus Untersuchungen ableiten, bei denen Komponenten der Wnt-Signalkaskade in der Haut spezifisch deletiert oder in aktiver Form expremiert wurden. Auch bei Vorläuferzellen des hämatopoetischen Systems scheint die Wnt-Signalkaskade von Bedeutung zu sein. Demnach regulieren Wnt- Faktoren die Expansion und Aufrechterhaltung von hämatopoietischen Vorläuferzellen (Austin, T.W., Solar, G.P., Ziegler, F.C., Liem, L. & Matthews, W. (1997). A role for the Wnt gene family in hematopoiesis: Expansion of multilineage progenitor cells. Blood 89:3624-3635.). Dieser Befund ist vor allem auch auf Grund neuerer
Untersuchungen von großem therapeutischen Interesse. So konnte gezeigt werden, dass adultes Knochenmarksgewebe Stammzellen hoher Plastizität bzw. eines breiten Differenzierungspotentials enthält (Krause, D.S., Theise, N.D., Collector, M.I., Henegariu, O., Hwang, S., Gardner, R., Neutzel, S. & Sharkis, S.J. (2001). Multi- Organ, multi-lineage engraftment by a Single bone marrow-derived stem cell. Cell
105:369-77.). Bestimmte Knochenmarksstammzellen übernahmen nach Transplan- tatiom im Empfängerorganismus die Funktion von Stammzellen der Lunge, der Haut, der Leber und des Verdauungstraktes. Zur Anreicherung der entsprechenden Stammzellen verwendeten die Autoren einen sogenannten „Homing Assay", der eine serielle Tansplantation von aufgereinigten und markierten Knochenmarkszellen in
Röntgen-bestrahlte Empfängertiere beinhaltet. Diese Art der Isolierung der adulten Stammzellen ist für eine klinische Anwendungen beim Menschen nicht geeignet.
Neueren Untersuchungen zufolge scheinen sich zahlreiche Tumore aus adulten bzw. „somatischen" Stammzellen zu entwickeln. Dies ergibt sich zum einem aus dem
Befund, dass die aberrante Aktivierung bestimmter Signalkaskaden (Wnt, Hedgehog) nicht nur zu einem sehr hohen Prozentsatz zur Enstehung bestimmter Tumore beiträgt, sondern in denselben Geweben auch für die Aufrechterhaltung von Stammzellpopulationen benötigt wird (Taipale, J. & Beachy, P.A. (2001). The Hedgehog and Wnt signalling pathways in cancer. Nature 411:349-354.). Die Tatsache, dass in einer einzelnen somatischen Zelle zwischen 4 und sieben Mutationen stattfinden müssen, damit sich ein Tumor bildet, deutet ebenfalls daraufhin, dass die entstandenen Tumorzellen selbst in sich rasch erneuernden Geweben(Darm Haut, Blut) längere Zeit vorhanden gewesen ein müssen. Signalaktivitäten, die an der Tumorentstehung ursächlich mitwirken (und in diesem Patent beispielhaft aufgeführt wer- den), sind demnach potentiell auch in Stammzellen aktiv. Verfahren zur Isolierung von Tumorzellen können auch für die Isolierung bestimmter Stammzellen verwendet werden.
In diesem Zusammenhang sind die Arbeiten von Tannishtha Reya interessant, die sie auf dem Wnt Meeting 2001 in New York vorstellte. Sie konnte zeigen, dass die retrovirale Expression von ß-Catenin hämatopoietische Stammzellen langfristig in einem undifferenzierten Zustand konserviert und ihre Fähigkeit steigert sich im
Knochenmark letal-bestrahlter Mäuse anzusiedeln um ein vollständiges hämato- poietisches System aufzubauen. Dies verdeutlicht die Funktion und Bedeutung der Wnt-Signalkaskade bei der Aufrechterhaltung hämatopoietischer Stammzellen und legt nahe, dass die Isolierung von Blutzellen aus dem Knochenmark auf Grund einer aktiven Wnt-Signalkaskade zur Anreicherung von adulten Stammzellen verwendet werden kann, wobei serielle Transplantationen zur Anreicherung der Stammzellen umgangen würden. Zusammenfassend lässt sich für bestimmte Signalkaskaden (Wnt, hedgehog) festhalten, dass sie für die Aufrechterhaltung sowie Expansion von zumindest einigen Stamzellpopulationen notwendig sind.
Erfindungsgemäß lässt sich das Vorhandensein spezifischer Signalaktivitäten in adulten Stammzellen zu deren Isolation ausnutzen. Prinzipiell werden dabei ähnliche Nuklemsäurekonstrukte wie die zur Detektion und Isolation von Tumorzellen beschriebenen verwendet. Hierzu werden die jeweiligen Reportergene hinter die für die biochemischen Aktivitäten in adulten Stammzellen sensitiven Promotorstukturen kloniert. Vorzugsweise werden Reportergenkonstrukte verwendet, die für fluores- zinierende oder transmembrane Reportergenprodukte kodieren und mittels viraler Expressionssysteme in die Zellen der Köφeφroben eingeschleust werden. Prinzipiell können jedoch auch andere Reportergene verwendet werden. Die Isolation der Zellen erfolgt anschliessend vorzugsweise mittels Durchfϊusszytometrie in Anwesenheit von Differenzierungsinhibitoren. Es können jedoch auch andere Verfahren Anwendung finden, die beispielsweise auf der Detektion induzierter Oberflächenstrukturen basieren und mittels „Beads" isoliert werden. Prinzipiell kann es auch sinnvoll sein zusätzlich zu den für die Zellisolation notwendigen Reportergenen Inhibitoren von
Differenzierungs Vorgängen (z.B. Transkriptionsfaktoren mit entsprechender Wirkung auf die Genexpressionen der jeweiligen Stammzellen) konstitutiv, induziert oder zelltyp-spezifisch expremieren zu lassen. Die isolierten, adulten Stammzellen eines Patienten können nach operativen bzw. anderen medizinischen Eingriffen für die Neubildung oder Regeneration des identischen oder (nach entsprechender Transdifferenzierung) zur Regeneration anderer Organe verwendet werden. Beispielsweise könnten adulte Stammzellen des Darms für die Regeneration der Langerhansschen Inselzellen des Pankreas von Diabetes-Patienten verwendet werden.
Auch der Kontakt von gesunden Köφerzellen mit pathohenen Agentien (z.B. Infektion durch Viren, Kontakt mit Bakterien oder bakteriellen Substanzen, Anwesenheit von allergenen Stoffen) oder mit stimulierenden oder reprimierenden Substanzen (Wachstumsfaktoren, Wachstumsfaktorantagonisten, Toxine, chemische Substanzen) kann Veränderungen in den biochemischen Aktivitäten von Zellgemischen fuhren, die die Isolierung bestimmter Zellen erleichtert. So ist es beispielsweise denkbar, dass der Kontakt mit wachstumshemmenden Stoffen bestimmte biochemische Aktivitäten in bestimmten (z.B. gesunden) Zellen reprimiert, in anderen Zellen (z.B. krankhaft veränderten) jedoch ohne Wirkung bleibt. Die nicht-repremierten Aktivitäten in diesen Zellen könnten dann zur Zellisolation ausgenutzt werden. Auch die veränderte Aufnahme von bestimmten Stoffen kann zur Detektion spezifischer Zellen aus heterogenen Zellgemischen verwendet werden. Dies gilt nicht nur für den Fall, dass Transportproteine in Zielzellen als Reportergene expremiert werden. So ist es beispielsweise auch denkbar die vermehrte Expression von Glutamat-Transportern in Lebertumorzellen für die Isolation der Zellen auszunutzen. So könnte der vermehrte Transport von detektierbaren (z.B. fluoreszinierenden) Transportsubstratanaloga zur Markierung der veränderten Zellen verwendet werden.
Aufgabe
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, ein Verfahren bereit- zustellen, mit dem spezifische Zellen detektiert und ggf. auch aus Blutproben oder anderen Köφβφroben in lebendem Zustand isoliert werden können, so dass sie nachfolgenden Untersuchungen oder für therapeutische Nutzanwendungen zur Verfügung stehen.
Summarische Beschreibung / Lösung
Die vorliegende Erfindung beruht auf Erkenntnissen, dass sich Signalaktivitäten in den Zellkernen von bestimmten Zellen durch Transfektion von Reportergen- konstrukten mit synthetischen Promotorstrukturen zur spezifischen Expression von Reportergenen ausnutzen lassen. Nach Transfektion eines heterogenen Zellgemisches mit synthetischen Reportergenkonstrukten kommt es auf Grund der konkatemeren Aneinanderreihung optimierter Transkriptionsfaktorbindungsstellen bzw. auf Grund der Kombination von unterschiedlichen Transkriptionsfaktorbindungsstellen in spezifischen Zellen zu einer starken Überexpression bzw. Sekretion von Reportergenpro- dukten, die unterschiedliche Nachweisverfahren ermöglichen.
In einem Verfahren werden die Signalaktivitäten in krankhaft veränderten Zellen (z.B. Tumorzellen) zur spezifischen Expression von fluoreszinierenden Proteinen ausgenutzt. Da die gesunden Zellen in der Blutprobe diese Signalaktivitäten nicht besitzen, ist die Spezifität des Tumorzellnachweises hoch und ermöglicht die Isolierung lebender, fluoreszinierender Tumorzellen mittels Durchflusszytometrie. Die isolierten Tumorzellen können anschließend in Kultur genommen werden und stehen weiteren Analysen zur Verfügung. Die Reportergenkonstrukte lassen sich dabei auch für Zellkultursysteme verwenden, die die Reportergenexpression vor und nach Kontakt von transfizierten Zellen mit potentiellen Wirksubstanzen messen. Dies kann einerseits für individualisierte Therapieentscheidungen verwendet werden, wenn die untersuchten Zellen aus Patienten stammen, andererseits auch Screening- Verfahren dienen, die Aktivitäten in Zellinienzellen analysieren.
In einem anderen Verfahren kodieren Teilbereiche der Reportergene für eine biolo- gische Aktivität, die die Initiation bzw. Progression von biologischen Kaskaden positiv oder negativ beeinflusst. Da die gesunden Zellen in der Blutprobe die zur Expression des Reportergens benötigten Signalaktivitäten nicht oder in signifikant unterschiedlicher Ausprägung besitzen, werden die biologischen Kaskaden nur in Anwesenheit krankhaft-veränderter Zellen induziert bzw. gehemmt, so dass eine außerordentlich hohe Spezifität des Tumorzellnachweises erzielt wird. Darüber hinaus ist die Sensitivität des Tumorzellnachweises auf Grund der Ausnutzung natürlicher Verstärkungssysteme bzw. von im Blut zumindest partiell vorhandenen, biologischen Kaskaden sehr hoch. Der Nachweis der tumorzellspezifischen Expression der Reportergene erfolgt anschließend durch Messung der Aktivierung bzw. Aktivierbarkeit der jeweiligen biologischen Kaskaden, z.B. nach Art der klassischen
Blutgerinnungsassays („quick-test", TPZ).
In einem weiteren Verfahren werden Signalaktivitäten in gesunden Zellen (z.B. adulten Stammzellen) zur Isolation der Zellen aus heterogenen Zellgemischen ausge- nutzt. Dabei werden die Zellen der jeweiligen Köφβφroben, wie z.B. Biopsien, zunächst mittels zellbiologischer Standartmethodiken vereinzelt, bevor sie mit den Nukleinsäurekonstrukten transfiziert werden. Die Funktionalität der isolierten (vorzugsweise humanen) Stammzellen kann ggf. in immunsuppremierten Tiermodellen nach entsprechenden operativen Eingriffen in vivo getestet werden, bevor sie in den Patienten, aus denen sie ursprünglich stammten, zurückgeführt werden. Detaillierte Beschreibung:
Die Erfindung bezieht sich auf NuMeinsäurekonstrukte zur zellspezifischen Expression von Reportergenen in Köφeφroben, wobei die Reportergenkonstrukte folgende Komponenten beinhalten: a) ein Promoter-Element mit mindestens einer, bevorzugt jedoch mehreren DNA-Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren, die auf Grund ihrer zellspezifischen Aktivitäten oder aber auf Grund der konkatemeren Anordnung oder spezifischen Kombination von DNA-Bindungsstellen in bestimmten Zellen überaktiv sind, oder aber gentechnisch relevante Regionen, die die Insertion bzw. Integration von NuMeinsäurekonstrukten in Zielregionen beeinflussen b) ein Reportergen, das die
Detektion der spezifischen Zellen ermöglicht. Die Transfektion der Zellen erfolgt vorzugsweise mittels viraler Expressionssysteme, die eine effiziente Transfektion der im Blut befindlichen Zellen mit Reportergenkonstrukten ermöglichen. Besonders bevorzugt sind dabei solche Transfektionssysteme, die auf Grund ihrer Zelltyp-Präferenzen eine zusätzliche Spezifität der Reportergenexpression bewirken. Die Expressionslevel der Reportergene können anschließend manuell, aber auch mittels automatisierbarer Verfahren ermittelt werden.
Die Beschaffenheit der Promotorstrukturen lässt sich auf die jeweils zu detektierende Signalaktivität anpassen. In der Regel werden Transkriptionsfaktorbindungsstellen einer spezifischen Signalaktivität, räumlich durch kurze DNA-Sequenzen getrennt („Spacer"), als Konkatemere vor Minimalpromotoren (z.B. aus dem c-Fos oder Thymi- dinkinasegenpromotor) positioniert. Darüber hinaus können gleichzeitig mehrere Signalaktivitäten gemessen werden, wenn DNA-Bindungsstellen für Trans- kriptionsfaktoren unterschiedlicher Signaltransduktionswege miteinander kombiniert werden. Eine gleichzeitige und voneinander unabhängige Messung verschiedener Signalaktivitäten in einer Zelle lässt sich durch Transfektion von Reportergenkonstrukten erreichen, die unterschiedliche Reportergene mit jeweils verschiedenen Promotorstrukturen enthalten. Dabei können diese Transkriptionseinheiten aus dem jeweiligen Promotor und dem nachgeschaltetem Reportergen entweder auf einem
DNA-Konstrukt oder auf getrennten DNA-Konstrukten enthalten sein. Besonders sinnvoll erscheint dabei auch die gleichzeitige Verwendung von induzierbaren (mit Wildtyp-Transkriptionsfaktorbindungsstellen) und nicht-induzierbaren (mit mutierten Transkriptionsfaktorbindungsstellen) bzw. konstitutiv aktiven Reportergenkonstrukten, da hiermit die spezifische Aktivierung des Reportergens durch bestimmte Transkriptionsfaktoren analysiert werden kann, bzw. Transfektionseffizienzen und
Zytotoxizitäten erfasst werden. Andererseits kann ein Promotor auch gleichzeitig die Expression von zwei verschiedenen Reportergenen regulieren, wenn die Reportergene durch ein zwischengeschaltete IRES-Sequenz (z.B. der „Infernal Ribosomal Entry Site"-Sequenz aus dem Encephalomyocarditis Virus) getrennt vorliegen.
Unter Umständen ist es sinnvoll die Promotoren zusätzlich durch Bindungsstellen von basalen Transkriptionsaktivatoren zu ergänzen, deren Transaktivierungspotential erst bei Anwesenheit der spezifischen, krankheits-assoziierten Transkriptionsfaktoren ihre volle Aktivität entfalten. Dieses Prinzip der Kooperativität von Transkriptionsfaktoren bei der Aktivierung von Promotoren beruht auf Erkenntnissen, die bei der Untersuchung des MMTV-Promotors erzielt wurden. So konnte gezeigt werden, dass die maximale Stimulierung des Promotors nach Bindung des Liganden-stimulierten Glucocorticoidrezeptors erst durch die Bindung des basalen Transkriptionsaktivatoren NFl erzielt wird. Die Aktivierung der Reportergenexpression kann durch Etablierung eines positiven Rückkopplungsmechanismusses verstärkt werden. Beispielsweise ist es sinnvoll, wenn zur Messung der Wnt-Signaltransduktionsaktivität Nuklemsäurekonstrukte verwendet werden, bei denen Wnt-sensitive Promotoren sowohl die Expression eines positiven Effektors (z.B. Fusionskonstrukt aus LEF-1 und der transaktivierenden, C-terminalen Region von ß-Catenin; Vlem nckx, K., Kemler, R. & Hecht, A.(1999). The C-terminal transactivation domain of beta-catenin is necessary and sufficient for signaling by the LEF-1/beta-catenin complex in Xenopus laevis. Mech Dev 81:65-74.), als auch die Expression des eigentlichen Reportergens bedingen. Darüber hinaus kann die basale Aktivität der synthetischen Promotorstrukturen auch durch Ergänzung von DNA-Bindungsstellen für transkriptioneile Repressoren unter- drückt werden. Dabei kann der entsprechende transkriptioneile Repressor endogen vorhanden sein oder durch ein zusätzlich eingebrachtes Repressorgen, das konstitutiv expremiert wird, bereitgestellt werden. Hierfür können auch NuHeinsäurekonstrukte verwendet werden, die für rekombinante Proteine bestehend aus einer DNA- Bindungsdomäne eines beliebigen Transkriptionsfaktors (z.B. der HMG-Domäne von LEF-1/TCF-Transkriptionsfaktoren, Carboxy-terminale Region (die letzten 90 Arnino- säuren) von c-myc) und einer heterologen Repressordomäne (z.B. des Tet Repressors,
Carboxy-terminale Region (Aminosäure 179 - 281) von E2F6) bestehen. Erst in Anwesenheit eines starken transkriptioneilen Aktivators auf demselben cis-wirkenden Promotorelement kommt es demnach zur Aktivierung des nachgeschalteten Reportergens, während das Reportergen in Abwesenheit des Transkriptionsaktivators reprimiert ist. Besonders interessant sind in diesem Zusammenhang Systeme, bei denen die transkriptioneilen Repressoren durch endogene Aktivitäten reguliert sind, wenn also neben den eigentlich meßbaren Reportergenen ein Repressorgen als weiteres Reportergen verwendet wird. So kann die Expression des exogen eingebrachten Repressorgens durch die Aktivität des in gesunden Zellen vorhandenen p53-Trans- kriptionsfaktors reguliert werden. Demzufolge wird der Repressor nur in gesunden
Zellen, nicht aber in Zellen mit mutiertem p53 expremiert, wozu unter Umständen zusätzlich eine Induktion der p53-Aktivität durch entsprechende Behandlungen der Zellen (UV-Bestrahlung oder Verwendung von DNA-schädigenden Substanzen) benötigt wird. In Zellen mit mutierten p53 wird demnach die Expression eines z.B. Wnt-regulierten Reportergens mit Transkriptionsrepressorbindungsstellen in der
Promotorregion (z.B. GFP- Varianten, Luciferase, Thromboplastin, etc.) auf Grund der Abwesenheit der p53-regulierten Repressorgenexpression nicht repremiert, so dass die synergistische Wirkung von Wnt-Signalaktivität und p53-Defizienz gleichzeitig oder aufeinanderfolgend meßbar wird.
p53 ist Mitglied einer Transkriptionsfaktorfamilie, die auch das p63- und p73-Gen enthält. Es gibt unterschiedliche Spleißvarianten dieser Gene, die sich u.a. in Expressionsmuster, Transaktivierungs- bzw. Repressionspotential, Interaktion mit weiteren Proteinen und biochemischen Eigenschaften unterscheiden (Yang, A., Kaghad, M., Wang, Y., Gillett, E., Fleming, M.D., Dotsch, V., Andrews, N.C.,
Caput, D. & McKeon, F. (1998) ρ63, a p53 homolog at 3q27-29, encodes multiple products with transactivating, death-inducing, and dominant-negative activities. Mol Cell. 2:305-16.). Von Bedeutung sind Isoformen, denen die N-terminale Transaktivierungsdomäne fehlt. Diese Proteine können als dominant-negative Agentien das Transaktivierungspotential der übrigen Isoformen an Promotorstrukturen bzw. durch Komplexbildung negativ beeinflussen. Von besonderem Interesse ist das natürliche, aber auch das technologisch herbeigeführte Vorkommen dieser Isoformen in gemischten Zellpopulationen. So ist bekannt, daß beispielsweise N-terminal verkürztes p63 spezifisch in bestimmten Basalzellpopulationen vorkommt (Signoretti, S., Waltregny, D., Dilks, J., Isaac, B., Lin, D., Garraway, L., Yang, A., Montironi, R., McKeon, F. & Loda, M. (2000) p63 is a prostate basal cell marker and is required for prostate development. Am J Pathol. 157:1769-75.), die möglicherweise Stammzellen enthalten bzw. mit Stammzellpopulationen identisch ist. Von besonderem Interesse ist zum Beispiel das beschriebene Vorkommen von p63 in Keratinozyten-Stammzellen (Pellegrini, G., Dellambra, E., Golisano, O., Martinelli, E., Fantozzi, L, Bondanza, S., Ponzin, D., McKeon, F. & De Luca, M. (2001). p63 identifies keratinocyte stem cells. Proc Natl Acad Sei U S A. 98:3156-61.). Das Vorkommen der N-terminal verkürzten p63 in z.B. den Stammzellen der Haut kann zu deren Isolation ausgenutzt werden, indem Reportergenkonstrukte mit DNA- Bindungsstellen für Mitglieder der p53-Familie in Hautzellpopulationen eingeschleust werden. Durch induzierte Akkumulation von p53 (UV, Bestrahlung,
Nuklemsäureschädigende Agentien, etc.) werden die Reportergene daraufhin spezifisch in Zellen expremiert die eine dominant-interferierende Variante eines der p53-Familienmitglieder, wie z.B. ΔN-p63, expremieren (oder aber wie im Fall von abnormal verändertem Gewebe einen Defekt (z.B. p53-Mutation) aufweisen). Bei Koexpression eines konstitutiv expremierten Reportergens lassen sich so beispielsweise Stammzellen der Haut mit den beschriebenen Verfahren isolieren.
Für die Messung von Signalaktivitäten in Zellen sind unter anderem folgende
Transkriptionsfäktoren bzw. Familien von Transkriptionsfaktoren und oder respon- siven Elemente interessant: TCF/LEF-1, jun, fos, myc, max, myb, E2F, DPI, CREB, p53, NFkB, NFAT, PPAR, ETS, ELK1, ATF, DPC, SMAD, CHOP, MEF, MADH4, GR, ER, STAT, SRF, ISRE, SRE, HSE, API, CRE. Die DNA-Bindungsstellen der Transkriptionsfaktoren sind vielfach beschrieben und öffentlich zugänglich. Von besonderem Interesse sind dabei Bindungsstellen für die Transkriptionsfaktoren TCF (5'-CCTTTGAA-3'; LOVE, J.J. et al. (1995). Structural basis for DNA bending by the architectural transcription factor LEF-1. Nature 376: 791-795), p53 (5C-
PuPuPuC(A/T)(T/A)GpyPyPy-3'; el-Deiry, W.S., Kern, S.E., Pietenpol, J.A., Kinzler, K.W. & Vogelstein, B. (1992). Definition of a consensus binding site for p53. Nat Genet 1:45-49.), PPARδ (5'-CGCTCAC-3'; He, T.C., Chan, T.A., Vogelstein, B. & Kinzler, K.W. (1999). PPARdelta is an APC-regulated target of nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Cell 99:335-45.), myc (5'-CACGTG-3' oder
5'-TCTCTTA-3'; Blackwell, T.K., Kretzner, L., Blackwood, E.M., Eisenman, R.N. & Weintraub, H. (1990). Sequence-specific DNA binding by the c-Myc protein. Science 250:1149-1151), E2F (5'-TTTTSSCGS-3' bzw. 5'-TTTCGCGC-3'; Mudryj, M., Hiebert, S.W. & Nevins, J.R. (1990). A role for the adenovirus inducible E2F transcription factor in a proliferation dependent signal transduction pathway. EMBO
J 9:2179-84.), API (5'-TGA(C/G)TCA; Fisch, T.M., Prywes, R. & Roeder, R.G. (1989). An APl-binding site in the c-fos gene can mediate induction by epidermal growth factor and 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate. Mol Cell Biol 9:1327-31.), SMAD (5'-CAGACA-3'; Jonk, L.J., Itoh, S., Heldin, C.H., ten Dijke, P. & Kruijer, W. (1989). Identification and functional characterization of a Smad binding element
(SBE) in the JunB promoter that acts as a transforming growth factor-beta, activin, and bone moφhogenetic protein-inducible enhancer. J Biol Chem 273:21145-52.), SRE und ATF (Fisch, T.M., Prywes, R., Simon, M.C. & Roeder, R.G. (1989). Multiple sequence elements in the c-fos promoter mediate induction by cAMP. Genes Dev 3:198-211.)
Zur Detektion bzw. Isolierung von fluoreszinierenden Zellen ist es notwendig Reportergene zu verwenden, die für fluoreszinierende Proteine kodieren. Prinzipiell eignen sich hierfür sämtliche Gene, die für direkt oder indirekt fluoreszinierende Proteine kodieren. Insbesondere geeignet sind Varianten der Gene: GFP, BFP, YFP,
CFP, DS-Red, Obilin, Aequorin. Darüber hinaus können auch Gene verwendet werden, die für Fluoreszenzfarbstoff-bindende Proteine kodieren, z.B. für Anti-Caline, die den Fluoreszenzfarbstoff FITC binden. Alternativ hierzu können jedoch auch kodierende Nukleinsäureabschnitte verwendet werden, deren translatierte Produkte an der Zelloberfläche exponiert vorliegen, und somit für sekundäre Nachweisverfahren zugänglich sind. Insbesondere sind solche Nukleinsäureabschnitte gemeint, die für Transmembranproteine oder extrazellulär präsentierte Moleküle kodieren oder zu deren Exposition führen. Beispielsweise können auf Grund der Signalaktivitäten Antigene, Rezeptoren oder Liganden auf der Zelloberfäche präsentiert werden, für die spezifische Nachweismoleküle (z.B. Antiköφer, Anticaline, Liganden oder Rezeptoren) vorhanden sind. Für diagnostische Verfahren sind dabei solche kodierenden Nukleinsäureabschnitte bevorzugt, die nicht humanen Ursprungs sind. Beispielsweise können homologe Genabschnitte von auch im Menschen vorkommenden Transmembranproteinen aus der Maus, Ratte, etc verwendet werden, um Kreuzreaktivitäten bei immunologischen Nachweismethodiken zu unterdrücken, die auf endogene Expressionen nicht- transfizierter Zellen zurückzuführen sind. Es können jedoch auch synthetische
Sequenzen verwendet werden, für die entsprechende Nachweismoleküle hergestellt werden. Zum Beispiel können mittels molekularbiologischer Methoden nahezu beliebige, synthetische Peptidsequenzen mit Transmembranproteinen rekombiniert werden, um so in isolierter oder konkatemerer Form auf der Zelloberfläche präsentiert zu werden. Gleichzeitig können gegen diese Peptide hochspezifische Antiköφer generiert werden. Durch Kopplung solcher Nachweismoleküle an unterschiedliche, magnetische oder nicht-magnetische Beads können die krankhaft veränderten Zellen auf Grund der spezifischen Expression des exogenen Nukleinsäurebereichs durch Anlegen magnetischer Felder oder Zentrifugationsschritte auf Grund ihrer Assoziation mit den Beads isoliert werden.
Zur Detektion der spezifischen Signalaktivitäten unter Ausnutzung biologischer Kaskaden ist es notwendig Reportergene zu verwenden, die aktivierenden oder inhibierenden Komponenten der biologischen Kaskaden gleichkommen. Prinzipiell können hierfür Sequenzbereiche der Gene Pro-/Thrombin, Faktor XJJa, Faktor XIa, Faktor Xa,
Faktor LXa, Faktor Villa, Faktor VHa, Faktor Va, Fibrin/Fibrinogen, Plasmin Plas- minogen, Pro-/Kallikrein, Urokinase, tPA, CVF, C3b, Protein C, C-l S Inhibitor, Hirudin, alρha-1-antitrypsin, AT-UI, TFPI, PAI-I, PAI-2, PAI-3. Darüber hinaus können auch enzymatische Proteine expremiert oder entsprechende Fusionsproteine durch die biologischen Kaskaden aktiviert werden.
Zur zellspezifischen Expression von Reportergenen müssen die DNA-Konstrukte in die Zellen eingeschleust werden. Hierzu sind zahlreiche, kommerziell erhältliche Trans- fektionstechnologien entwickelt worden. Neben der klassischen Kalzium-Phosphat- Präzipitation, dem direkten Transfer durch Mikroprojektile ("Schrotschuss") und Elektroporationsmethodiken ist es möglich Säugerzellen mit Liposomentechnologien
(z.B. Lipofectin und Lipofectamin der Firma GibcoBRL) zu transfizieren. Besonders effizient lassen sich Säugerzellen jedoch mit viralen Systemen transfizieren. Insbesondere sind Systeme etabliert, die auf retroviralen, adenoviralen oder Adeno-Asso- ziierten-viralen (AAV) Vektoren basieren. Ein interessanter Ansatz in diesem Zusammenhang ist die Verwendung von Transfektionssystemen, die eine unterschiedliche Transfektionseffizienz bei unterschiedlichen Zelltypen erzielen und somit der Spezifität der Reportergenexpression zuträglich sind. Beispielsweise infizieren Adenoviren die meisten humanen Zellen mit der Ausnahme hämatopoietischer Zellen mit einer extrem hohen Effizienz. Diese Tatsache lässt sich durch Wahl entsprechender Inkubationsbedingungen gerade bei der Isolierung von epithelialen Zellen aus dem
Blut ausnutzen, so dass selbst bei Verwendung konstitutiver Reportergenexpressionen eine Anreicherung der Tumorzellen ermöglicht wird.
Erfindungsgemäß werden die Erkenntnisse des Anmelders für ein Verfahren zur Diagnose krankheits-assoziierter Zellen genutzt, das die Transfektion von Reporter- genkonstrukten mit induzierbaren Promotorstrukturen umfasst, die eine automatisierbare Detektion und Isolation von Tumorzellen in Gemischen mit gesunden Zellen ermöglichen. Darüber hinaus können die Erkenntnisse des Erfinders auch für Verfahren eingesetzt werden, die der Isolation spezifischer, gesunder Zellen (z.B. Stammzellen) aus heterogenen Zellgemischen dienen. Die automatisierbare und spezifische Detektion der Zellen kann durch folgendes Verfahren gewährleistet werden: Die Reportergenkonstrukte beinhalten zum einen Promotorstrukturen mit Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren, die für veränderte Genexpressionen in krankhaften Zellen bzw. differierende Genexpression in gesunden Zellen mitverantwortlich sind, zum anderen leicht meßbare Reportergene, die in den anderen Köφerzellen in dieser Form bzw. in dieser Menge normalerweise nicht vorhanden sind. Durch die Kombination und Vielzahl der Transkriptionsfaktorbindungsstellen wird die Spezifität und Sensitivität der induzierbaren Reportergenaktivierung gewährleistet. Durch die Expression eines in humanen Zellen endogen nicht vorhandenen Fluoreszenzproteins wird die spezifische und mittels Durchflusszytometrie automatisierbare Methodik qualitativ und quantitativ meßbar. Die Durchflusszytometrie erlaubt darüber hinaus durch Festlegen von Schwellwerten für Fluoreszenzintensitäten die Isolierung von Zellen mit bestimmten Reportergenexpressionsleveln. Die gleichzeitige Messung von zwei verschiedenen Fluoreszenzproteinen, die durch jeweils unterschiedliche biochemische Aktivitäten induziert werden können, ermöglicht zudem eine genauere Charakterisierung einzelner Tumorzellen hinsichtlich ihres Entartungsgrades
(„Staging"). Dies trifft insbesondere auf solche Tumorarten zu, bei denen die entsprechenden biochemischen Aktivitäten in unterschiedlichen Stadien der Tumoφrogression auftreten (wie oben am Beispiel des Kolonkarzinoms erläutert). Die gleichzeitige Verwendung von zwei ähnlichen, aber nicht identischen Reportergenen kann auch der Bestimmung der Spezifität der Reportergenexpression dienen. So können Promotoren mit intakten oder mutierten Transkriptionsfaktorbindungsstellen z.B. die Expression von unterschiedlich fluoreszinierenden Reportergenen oder Enzymen mit unterschiedlicher Substratspezifität regulieren. Der Vergleich der Expressionslevel lässt demnach Rückschlüsse auf die Aktivität spezifischer Signalaktivitäten zu. Darüber hinaus kann es sinnvoll sein zusätzlich zu induzierbaren
Promotoren auch konstitutiv aktive Promotoren, die unterschiedliche Reportergene regulieren, zu verwenden, um Transfektionseffizienzen oder Zytotoxizitäten kontrollieren zu können.
Der Ausdruck „Signalaktivität" umfasst biochemische Aktivitäten in Zellen, die letztendlich die Expression von Genen im Zellkern regulieren. Die biochemischen Aktivitäten die zu veränderten Genexpressionen führen, können dabei an unterschiedlichsten Stellen in der Zelle stattfinden und sind meist Teil des komplexen Netzwerkgeschehens sogenannter Signaltransduktionswege. In Tumorzellen können beispielsweise Rezeptoren auf der Zelloberfläche durch überhöhte Präsenz von Liganden, durch Mutation in kodierenden Genbereichen oder durch Mutationen in gen- regulatorischen Bereichen überaktiv sein. Andererseits können auch Proteine im Zyto- plasma auf Grund von Mutationen der entsprechenden Gene eine veränderte Aktivität aufweisen, so dass es zu veränderten posttranslationalen Modifikationen (z.B. Phos- phorylierung, Dephosphorylierung, Acetylierung, Deacetylierung, Ubiquitinylierung) und daraus resultierenden regulatorischen Geschehnissen (z.B. Stabilisierung, Destabi- lisierung, erhöhte oder verminderte enzymatische Aktivität, verminderte oder verstärkte Bindungsaffinitäten) von Komponenten des Signaltransduktionsgeschehens kommt. Letztendlich werden so Signalaktivitäten hervorgerufen die die Expression von Zielgenen erhöhen oder hemmen können.
Der Ausdruck „Reportergenkonstrukt" umfasst NuHeinsäurekonstrukte, die zumindest aus einer genregulatorischen oder gentechnisch funktionellen Sequenz und einem kodierenden Sequenzbereich bestehen. Insbesondere sind DNA-Konstrukte gemeint, die eine genregulatorische Sequenz enthalten, die die Expression des kodierenden Bereichs direkt (auf Grund der enthaltenen Transkriptionsfaktorbindungsstellen) oder indirekt (z.B. durch die Ermöglichung einer gezielten Integration, Insertion bzw. Rekombination des Reportergens in genomische DNA-Abschnitte) beeinflusst. Bei den genregulatorischen Sequenzen, die die Expression des Reportergens direkt beeinflussen, handelt es sich meist um Promotor-, Enhancer- oder Silencer-Regionen, die auf Grund der Wechselwirkung mit Eiweißmolekülen die Transkription kodierender
Nukleinsäurebereiche sowohl positiv als auch negativ beeinflussen können. Verfahren, bei denen genregulatorische Sequenzen die Expression von Reportergenen indirekt beeinflussen, umfassen die gezielte Integration des Reportergens in Stammzellpopulationen, bei denen die Zielregionen für die Integrationen zuvor durch Rekom- binationsschritte gezielt markiert werden (wie z.B. mit loxP Rekombinationssequenzen für die Cre-Rekombinase) und die endogenen Zielgene u.U. zusätzlich zu den Rekombinationssequenzen durch eine oder mehrere IRES-Sequenzen ergänzt werden bzw. die Reportergene IRES-Sequenzen enthalten, so dass bei Induktion der Expression des endogenen Genlokus zusätzlich Reportergensequenzen transkribiert werden. Werden für diese Zwecke embryonale oder partiell differenzierte Stammzellen von Säugetieren verwendet, so ist es möglich die Anwesenheit spezifischer Signalaktivitäten durch synthetische oder endogene genregulatorische Sequenzen zu visualisieren bzw. meßbar zu machen. Je nach Beschaffenheit des Reportergens können somit sehr frühe Stadien krankhafter Veränderungen, aber auch gesunder physiologischer Prozesse (wie z.B. Differenzierungsvorgänge, apoptotische oder proliferative Prozesse in Gewebebereichen), detektiert werden. Organoide
Modellsysteme bis bin zu ganzen gentechnisch veränderten Organismen können so Testsubstanzen ausgesetzt werden, wobei pathologische Veränderungen auf Grund der Reportergenexpression frühzeitig erkannt werden bzw. pathologisch veränderte Zellen zu unterschiedlichen Zeitpunkten isoliert werden können bzw. der Effekt der Wirksubstanzen analysiert werden kann.
Der Ausdruck „zellspezifische Expression" umfasst die Transkription und /oder Translation von kodierenden Sequenzbereichen in bestimmten Zellen einer betragenen Zellpopulation. Beispielsweise können es krankhaft veränderte Zellen sein, die in einer Köφeφrobe mit gesunden Zellen vorhanden sind. Insbesondere ist die spezifische
Expression von Genen in Tumorzellen gemeint, die auf besondere biochemische Aktivitäten in den Tumorzellen zurückzuführen sind, die in gesunden Zellen in dieser Ausprägung nicht vorkommen. Spezifität kann die Reportergenexpression dabei durch zellspezifische Transkription, Translation oder Degradation des Reportergenproduktes oder aber durch zellspezifische Transfektion des Nukleinsäurekonstruktes erreichen.
Der Ausdruck „Reportergen" umfasst kodierende Nukleinsäureabschnitte, die in Zellen eingebracht werden müssen, da sie in dieser Form in den zu analysierenden Zielzellen natürlicherweise endogen nicht vorkommen. Dabei sind auch Teilabschnitte oder ganze Bereiche von ursprünghch endogen vorkommenden Sequenzen eingeschlossen, die auf
Grund einer veränderten Sequenz oder eines neuen Kontextes innerhalb des synthetischen Nukleinsäurekonstruktes funktionell veränderte Eigenschaften gegenüber den endogenen Genprodukten besitzen oder verändert expremiert werden.
Der Ausdruck „Köφβφrobe" umfasst jegliche Köφβφroben, in denen vitale Zellen zur Transfektion von Nukleinsäurekonstrukten enthalten sind. Beispiele solcher
Köφeφroben sind Blut, Lymphflüssigkeit, Stuhl, Organpunktate und Biopsien. Insbesondere sind Blutproben gemeint, in denen krankhaft veränderte Zellen vermutet werden. Darüber hinaus sind auch Biopsien mit eingeschlossen, da sie sich nach Vereinzelung der Zellen aus dem Gewebeverband mittels üblicher Standartmethodiken (Zerschneiden, Resuspendieren mit immer enger werdenden Kanülen,
Proteasebehandlung, etc.) zur Transfektion von Nukleinsäurekonstrukten eignen.
Der Ausdruck „krankhafte Veränderung" umfasst biochemische Aktivitäten in Zellen, die in vergleichbaren Zellen desselben Gewebes zu diesem Zeitpunkt nicht vorhanden sind bzw. in anderen Bereichen des Gewebes oder in anderen Differenzierungsphasen oder Entwicklungsstadien aktiv sind.
Der Ausdruck „Transkriptionsfaktor" umfasst Eiweißmoleküle, die direkt oder indirekt mit Nuklemsäurebereichen assoziieren und dadurch veränderte Aktivitäten der Nukleinsäurebereiche hervorrufen.
Der Ausdruck „Expressionslevel" umfasst transkriptioneile oder translationale Veränderungen, die Nukleinsäurebereiche betreffen, die für eine Abfolge von Aminosäuren kodieren oder einer kodierenden Nukleinsäuresequenz komplementär sind. Darüber hinaus sind jedoch auch Veränderungen gemeint, die posttranslationale
Modifikationen von Aminosäuresequenzen betreffen und eine veränderte Stabilität, Lokalisierung oder Aktivität zur Folge haben.
Der Ausdruck „automatisierbares Verfahren" umfasst Methodiken, die die manuelle Arbeitskraft von menschlichem Personal ganz oder auch nur in Teilschritten ersetzt und insbesondere bei Schritten der Transfektion, Detektion, Isolation, Dokumentation oder hrformationsverarbeitung Verwendung finden. Die Detektion ist dabei von den Eigenschaften des verwendeten Reportergens abhängig.
Die Ausnutzung von Signalaktivitäten in Säugerzellen zur Expression von Reporter- genen, die die Detektion und Isolation bestimmter Zellen erlaubt, ist sowohl für diagnostische als auch therapeutische Fragestellungen von Vorteil. Mögliche Anwendungsgebiete dieser Technologie sind Detektion und Isolation krankhafter Zellen aus Köφeφroben, Therapie-begleitendes Monitoring, Drug-Screening und ex vivo Therapietest von Patientenproben. Weitere Anwendungsgebiete sind Verfahren in der Starnmzelltechnologie, wobei die Stammzellen isoliert, ggf. differenziert bzw. transdifferenziert und zur Heranzüchtung von Ersatzorganen oder aber für regenerative Prozesse verwendet werden.
1. Überexpression von afphaGFPT204I in SW480 Kolonkarzinomzellen auf Grund der tumor-assoziierten Wnt-Signalaktivität in diesen Zellen.
Zur tumorspezifischen Expression einer Variante des Grün-Fluoreszinierenden- Proteins (alphaGFPT204I), werden in einem ersten Schritt Wnt-responsive Reportergenkonstrukte hergestellt. Die Promotorregionen enthalten drei funktionelle oder drei nicht-funktionelle Bindungsstellen für LEF-1/TCF-Transkriptionsfaktoren
(CCTTTGATC bzw. CCTTTGGCC), oder Varianten dieser Bindungsstellen (CCTTTGAA oder CCATTGAA bzw. CCTTTGGA oder CCATTGGA). Zur Generierung von Wnt-responsiven GFP-Reportergenkonstrukten werden in den ersten Experimenten die beschriebenen Ausgangsvektoren pTOPFLASH-, pFOPFLASH-, pTOPCAT- und pFOPCAT-Vektoren verwendet (Van De Wetering, M., Cavallo, R.,
Dooijes, D., Van Beest, M., Van Es, J., Loureiro, J., Ypma, A., Hursch, D. , Jones, T., Brjsovec, A., Peifer, M., Mortin, M. & Clevers, H. (1997). Armadillo coactivates transcription driven by the product of the drosophila segmant polarity gene dTCF. Cell 88:789-99.; Van De Wetering, M., Oosterwegel, M., Dooijes, D. & Clevers, H. (1991). Identification and cloning of TCF-1, a T lymphocyte specific transcription factor containing a sequence-specific HMG box. EMBO J 10:123-32.). In weiteren Experimenten wird die Promotorregion durch Ligation von speziell synthetisierten, doppelsträngigen Oligonukleotide mit den Bindungsstellen für LEF-1, PPARδ, myc, etc. ergänzt (siehe unten).
Alle im Folgenden erwähnten, jedoch nicht näher ausgeführten, molekularbiologischen Standardmethoden wie z.B. Plasmid-DNA Präparationen in analytischem Maßstab, Spaltung von DNA mit Restriktionsendonucleasen, Dephosphorylierung linearisierter DNA, Auffüllen überstehender Enden, Ligation von DNA-Molekülen, Transformation von Bakterien, Auftrennung von Nukleinsäuren über Agarosegele, etc., sind prinzipiell in dem Laborbuch von SAMBROCK et al. beschrieben
(Sambrock, J., Fritsch, E.F. & Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York.).
Im Falle der pTOP-FLASH- und pFOP-FLASH-Vektoren wird das Luciferase-Gen durch Verdau mit den Restriktionsenzymen NCO1 und NOTl herausgeschnitten und die Vektoren anschließend durch Inkubation mit alkalischer Phosphatase dephospho- ryliert. Daraufhin werden die Reaktionsprodukte in Ethidiumbromid-haltigen Agaro- segelen gelelektrophoretisch aufgetrennt, die ca. 3,8 kb große Vektorbande aus dem Gel ausgeschnitten und die DNA mittels des „Qiaex R II Gel Extraction Kit" der
Firma Qiagen isoliert. Das alphaGFPT204I-Gen wird mittels PCR-Reaktion unter Einführung der entsprechenden Restriktionsschnittstellen für NCO1 (für den 5 '-gelegenen Primer (5'-CCC GGG CC ATG GCT AGC AAA GGA GAA GAA CTT TTC AC -3') und NOTl für den 3 '-gelegenen Primer (5'- GGC CGC GGC CGC TTA TTT GTA GAG CTC ATC CAT GCC - 3') ) aus dem pKU23-Vektor bzw. dem alpha+GFPcycle3 -Vektor der Firma Maxygen (siehe (Crameri, A., Whitehorn, E.A., Täte, E. & Stemmer, W.P.C. (1996). Improved Green Fluorescent Protein by molecular evolution using DNA shuffling. Nature Biotechnology 14:315-319.), der das alphaGFPT204I Gen enthält, amplifiziert, mit den Restriktionsendonukleasen NCO1 und Notl verdaut, durch Phenol/Chloroform-Behandlung aufgereinigt, präzi- pitiert (Zugabe von 1/10 Vol 3M NaAc und 2,5 Vol 100% Ethanol), mit 70% Etha- nol gewaschen, getrocknet und in lx Tris/EDTA-Puffer aufgenommen. Anschließend wird das ca. 700bp große Reaktionsprodukt gelelektrophoretisch aufgetrennt und aus dem Agarosegel isoliert (siehe oben). Die Ligation des TOP- bzw. FOP-Vektors mit der amplifizierten alphaGFPT204I-cDNA erfolte mittels T4-DNA-Ligase in entspre- chendem Mg2+- und ATP-haltigem Puffer. Die Ligationsansätze werden in Bakterien
(„DH5α ™ Competent Cells" der Firma GibcoBRL Life Technologies) transformiert, auf Ampicillin-haltigen LB-Agaφlatten ausgestrichen, gewachsene, Ampi- cillin-resistente Einzelkolonien wurden zur Animpfung von 5ml LB-Flüssigkulturen verwendet, die Plasmid-DNA aus gewachsenen Einzelkolonien isoliert („Concert ™ Rapid Plasmid Mini Prep System" der Firma GibcoBRL Life Technologies) durch
Restriktionsverdaus mit NOTl und NCO1 und Sequenzierung („Big Dye ™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction" der Firma PE Applied Biosystems) mit mehreren „Sense-" und „Anti-Sense" Primern analysiert und verifiziert. Die Plasmid-DNA der gewünschten Sequenz wird anschließend in größeren Mengen produ- ziert und aufgereinigt („QIAfilter Plasmid Maxi Kit" der Firma Qiagen) und zur
Transfektion von SW480 Kolonkarzinomzellen verwendet.
Die Transfektion der Reportergenkonstrukte erfolgt wahlweise mit „Lipofectin R Reagent", „Lipofectamine Plus ™ Reagent" oder „Lipofectamine ™ 2000 Reagent" nach Herstellerangaben der Firma GibcoBRL Life Technologies, wobei die SW480
Zellen vor der Transfektion in 6-well Platten (ca. 300.000 Zellen pro well) ausgesäht und über Nacht in DMEM, 10 % Fötales Kälber Serum, lOOμg Pennicillin bei 37°C, 90% Luftfeuchtigkeit und 7,5 % CO2-Gehalt inkubiert werden. Es werden zwischen lμg und lOμg DNA der Vektoren TOP- und FOP-alphaGFPT204I, sowie zur Kon- trolle des Alpha+GFPcycle3 -Vektors mit lOμl Lipofectin oder Lipofectamin und
90μl Optimem in Polystyrenröhrchen durchmischt und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird 800μl Optimem hinzugegeben und nach einstündiger Inkubation zu den mehrfach mit PBS gewaschenen Zellen gegeben und über Nacht inkubiert. Am nächsten Morgen werden die transfizierten SW480 Zellen erneut mit PBS gewaschen und wieder in DMEM + 10%FKS inkubiert. Dien mit
Alρha+GFPcycle3 und TOP-alρhaGFPT204I transfizierten Zellen beginnen nach entsprechender Anregung unter dem Fluoreszenzmikroskop (Olympus AX70 mit Multicontrol-Box 200-3 und analySIS Treibersoftware „Modul Stage") zu leuchten, während die mit FOP-alphaGFPT204I transfizierten Zellen keine signifikant erhöhte Fluoreszenz aufwiesen. Diese Befunde bestätigten sich bei der Vermessung der Fluoreszenzintensitäten im Durchflusszytometer (FACSscan, Becton Dickinson), welches mit Laser- Anregung für die grüne Fluoreszenz ausgestattet ist. Die Fluoreszenzintensitäten werden graphisch dargeteilt, indem den positiven Signalen definierte Schwellwerte für Fluoreszenzintensitäten zugeordnet werden. Zur Optimierung der GFP-Fluoreszenz-Detektion wird der Standart-Fluorescein-Filter gegebenenfalls durch Breitband- Violett-Filter ersetzt (z.B. U-MBV der Firma Olympus), die eine
Anregung zwischen 340-440nm und die Detektion ab 475 bzw. 490nm ermöglichen.
2. Überexpression von alphaGFPT204I in SW480 Zellen auf Grund der kombinatorischen Verwendung von Transkriptionsfaktorbindungsstellen für LEF-1/TCF und PPARδ
SW480 Zellen überexpremieren auf Grund der Wnt-Signalaktivität den Transkriptionsfaktor PPARδ (HE T.C., CHAN T.A., VOGELSTEIN B. & KINZLER K.W. (1999). PPARdelta is an APC-regulated target of nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Cell 99:335-45.). Zur Messung der synergistischen Wirkung von Transkrip- tionsfaktorbindungsstellen bei der Expression von Reportergenen werden PPARdelta responsive Elemente in den TOP-alphaGFPT204I- und FOP-alρhaGFPT204I-Vektor kloniert. Hierzu wurden die Oligonukleotide 5'-
CTAGCGTGAGCGCTCACAGGTCAATTCGGTGAGCGCTCACAGG TCAATTCG-3' (= fünktionelle PPARδ-DNA-Bindungsstellen) bzw. 5*-
CTAGCGGA
CCAGGACAAAGGTCACGTTCGGACCAGGACAAAGGTCACGTTCG-3' (= funktioneile PPARα- und PPARγ-DNA-Bindungsstellen) nach Durchmischung mit entsprechend synthetisierten, komplementären Gegenstrang-Oligonukleotiden glei- eher Mengen durch Erhitzen und Abkühlen dimerisiert und stromaufwärts, 5 '-gelegen von den funktioneilen bzw. nicht-funktionellen LEF-1/TCF-Bindungsstellen durch „Blunt-end"-Ligation in die Promotor-Region des Reportergerikonstruktes inseriert. Die Ligationsansätze werden in Bakterien transformiert, auf Ampicillin- haltigen LB-Agaφlatten ausgestrichen, die Plasmid-DNA von gewachsenen Einzelkolonien isoliert, durch Restriktionsverdaus mit NOTl und NCO1 und Sequenzie- rung mit mehreren „Sense-" und „Anti-Sense" Primern analysiert und verifiziert.
Die Plasmid-DNA der gewünschten Sequenz wird anschließend in größeren Mengen produziert und aufgereinigt und zur Transfektion von SW480 Kolonkarzinomzellen mit Lipofectin oder Lipofectamin in der oben beschriebenen Art und Weise verwendet. Die Vermessung der Fluoreszenzintensitäten im Durchflusszytometer ergibt einen meßbaren synergistischen Effekt hinsichtlich einer gesteigerten alphaGFPT204I-Expression bzw. Fluoreszenzintensität in Anwesenheit funktioneller LEF-1/TCF- und PPARδ-DNA-Bindungsstellen. Darüber hinaus zeigt sich, dass eine 10-stündige Inkubation transfizierter Zellen mit Nicht-Steroidalen Anti-Inflammato- rischen Substanzen (i.e. 300μM Sulindac Sulfid, Indomethacin und Aspirin) die beobachtete Aktivierung des FOP-alphaGFPT204I-Reportergens in Anwesenheit funktioneller PPARδ-DNA-Bindungsstellen signifikant inhibiert, so dass die alphaGFPT204I-Exρression nahezu auf den Hintergrundslevel der FOP- alphaGFPT204I-Reportergenaktivität ohne funktionelle PPARδ-DNA-Bindungsstellen zurückgeht.
3. Isolierung von Kolonkarzinomzellen aus heterogenen Zellgemischen mittels Durchflusszytometrie
Zur Isolierung von fluoreszinierenden SW480 Zellen, die in der oben beschriebenen
Art und Weise mit TOP-alρhaGFPT204I oder Alρha+GFPcycle3 transfiziert werden, werden die SW480 Zellen durch Zugabe von Trypsinlösung (0,5mM EDTA und 2°/00 Trypsin in PBS) von der Unterlage abgelöst und in DMEM +10% FKS resuspendiert. Die Zellen werden anschliessend wahlweise in ISOTON II (Coulter) aufgenommen oder direkt in einem Durchflusszytometer (FACSscan, Becton Dickinson) vermessen. Fluoreszinierende Zellen ab einer definierten Signalintensität werden isoliert und in definiertem Zahlenverhältnis mit Zellsuspensionen von transfizierten oder nicht-transfizierten Zellen anderer Ursprungsgewebe (i.e. nicht Kolon; z.B. HAI .6 B Zellen, C57MG Brusttumorzellen, Jurkat Zellen, BW5147 T Zellen) gemischt, die keine Wnt-Signalaktivität besitzen und demzufolge in Experimenten
(wie in Beispiel 1 dargelegt) keine signifikant erhöhten Fluoreszenzen nach Transfektion mit TOP-alphaGFPT204I im Vergleich zur Fluoreszenz nach Transfektion mit FOP-alphaGFPT204I aufweisen. Diese heterogenen Zellgemische werden anschließend erneut in dem Durchflusszytometer vermessen und die Zahl der delektierten, fluoreszinierenden Zellen mit der Zahl der ursprünglich zugesetzten
Anzahl fluoreszinierender SW480 Zellen verglichen (- 'Recovery Rate").
4. Isolierung von Kolonkarzinomzellen aus heterogenen Zellgemischen mittels Durchflusszytometrie nach Transfektion von heterogenen Zellpopulationen
HeLa Zervixkarzinomzellen, 3T3 Fibroblasten oder SV40-transformierte COS Zellen werden in unterschiedlichen Mengenverhältnissen mit SW480 Kolonkarzinomzellen gemischt oder zur Kontrolle als homogene Zellpopulation belassen. Danach werden je 300.000 Zellen des heterogenen Zellgemisches bzw. der homogenen Zellpopula- tionen in die Vertiefungen von 6-well Platten ausgesäht und über Nacht in DMEM,
10% Fötales Kälber Serum, lOOμg Pennicillin bei 37°C, 90% Luftfeuchtigkeit und 7,5%» CO2-Gehalt inkubiert. Die anschließende Transfektion der Plasmide TOP-, FOP-alphaGFPT204I und Alpha+GFPcycle3 erfolgt, wie in Beispiel 1 beschrieben, mittels der Lipofectin und Lipofectamin Reagentien. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Transfektion (4 Stunden, 16 Stunden, 24 Stunden und 48 Stunden) wer- den die Zellen durch Trypsin-Behandlung abgelöst und mittels Durchflusszytometrie vermessen. Die Zahl der detektierten, fluoreszinierenden Zellen je Ansatz wird mit der Zahl der ursprünglich zugesetzten Anzahl SW480 Zellen verglichen, um die Spezifität und Sensitivität des Tumorzellnachweises zu bestimmen.
5. Adenovirale Transfektion von heterogenen Zellpopulationen aus Kolonkarzinomzellen mit Wnt-Signalaktivität und Kontrollzellen ohne Wnt-Signalaktivität und anschließende Durchflusszytometrie
Zur Erhöhung der Transfektionseffizienzen werden adenovirale Reportergenkonstrukte mittels des „Adeno-X TM Expression Systems" der Firma Clontech ( Kat. Nr. Kl 650-
1) hergestellt. Hierzu werden die Promotorregion einschließlich der alphaGFPT204I- Sequenz mittels PCR-Reaktion aus den Vektoren TOP- und FOP-alphaGFPT204I amplifiziert. Dabei werden Primer verwendet, die in die Restriktionsschnittstellen für die Enzyme I-CEU I und NOTl an das 5'- bzw 3'-Ende des Reaktionsproduktes einführen (5'-gelegener „Sense"-Prirner: 5'-CCC GGG TAA CTA TAA CGG TCC
TAA GGT AGC GAG CAA TTG TTG TTA ACT TGT TTA TTG CAG CTT ATA ATG G-3'; 3'-gelegener „Anti-Sense"-Pimer: 5'-GGC CGC GGC CGC TTA TTT GTA GAG CTC ATC CAT GCC - 3'). Die Reaktionsprodukte werden anschließend mit den Restriktionsendonukleasen I-CEU I und NOTl verdaut, durch Phenol/Chloro- form-Behandlung aufgereinigt, präzipitiert (Zugabe von 1/10 Vol 3M NaAc und
2,5 Vol 100%) Ethanol), mit 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und in lx Tris/EDTA- Puffer aufgenommen. Nach gelelektrophoretischer Aufreinigung wird das Reaktionsprodukt aus dem Agarosegel isoliert. Der von der Firma Clontech bereitgestellte pShuttle- Vektor wird entsprechend mit den Enzymen I-CEU I und NOTl verdaut, dephosphoryliert, gelelektrophoretisch aufgetrennt und der Vektor (wie in Beispiel 1 beschrieben) aus dem Gel extrahiert. Die Ligation des pShuttle- Vektors mit der ampli- fizierten TOP- bzw. FOP-alphaGFPT204I-Sequenz erfolgt mittels T4-DNA-Ligase in entsprechendem Mg2+- und ATP-haltigem Puffer. Die Ligationsansätze werden anschließend in Bakterien transformiert, auf Ampicillin-haltigen LB-Agaφlatten ausgestrichen, die Plasmid-DNA aus gewachsenen Einzelkolonien isoliert durch Restriktionsverdaus und Sequenzierung mit mehreren „Sense-" und „Anti-Sense"
Primern analysiert und verifiziert. Die Plasmid-DNA der gewünschten Sequenz wird in größeren Mengen produziert und aufgereinigt.
Die anschließenden Schritte erfolgen gemäß Herstellerangaben der Firma Clontech (siehe „Adeno-X TM Expression System User Manual"). Die TOP- bzw. FOP- alphaGFPT204I-Sequenz wird aus dem pShuttle Vektor mittels der Restriktionsenzyme I-CEUI und PI-SCEI herausgeschnitten und mit der entsprechend verdauten Adeno-X Virus DNA (nach den üblichen molekularbiologischen Zwischenschritten wie oben beschrieben) ligiert . Die in vitro Ligation wird anschließend mit dem Restriktionsenzym SWAI verdaut und der entsprechende Ansatz zur Transformation von Bakterien verwendet. DNA-Präparationen von Ampicillin-resistenten Transformanden werden mittels geeigneter Restriktionsverdaus und Sequenzierungen mit mehreren „Sense-" und „Anti-Sense" Primern analysiert und verifiziert. Die rekom- binante adenovirale Plasmid DNA der gewünschten Sequenz wird anschließend entsprechend den Angaben im Clontech Handbuch in kleinem Maßstab präpariert und mit dem NucleoBond R Plasmid Maxi Kit gemäß den Angaben der Firma Clontech in größerem Maßstab produziert und aufgereinigt. Die aufgereinigte Plasmid-DNA wird mit dem Restriktionsenzym PACI verdaut und nach Aufreinigung des Restriktionsansatzes zur Transfektion von HEK 293 Zellen mittels Lipofectamin oder Lipofectin verwendet. Nach 4 bis 7 Tagen löst sich ein Großteil der Zellen ab, so dass der Überstand, der rekombinante Adenoviren mit der Die TOP- bzw. FOP-alphaGFPT204I- Sequenz enthält, nach Zentrifugation zur Infektion der Zielzellen verwendet werden kann.
Entsprechend den Beispielen 2 und 3 werden zunächst homogene Zellpopulationen von
SW480 Zellen mit den rekombinanten Adenoviren inkubiert. Hierzu werden ca. 5x105 SW480 Zellen in 100 mm Zellkulturschalen ausgesäht, so dass sie über Nacht (oder auch für bis zu 48 Stunden) an den Zellkulturschalenboden adhärieren können. Anschließend wird 1ml des Virus-haltigen Mediums für ca. 1 Stunde zu den Zellen gegeben. Danach werden die Zellen einmal mit DMEM+10%FKS gewaschen und für bis zu 48 Stunden im Brutschrank inkubiert. Nach 2, 4, 8, 16, 24 und 48 Stunden wird die
GFP-Expression mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie vermessen. Die Zahl der GFP-expremierenden Zellen nach Infektion mit der TOP-- alphaGFPT204I-Sequenz ist extrem hoch (70-95% nach 24 Stunden), während Zellen, die mit der FOP-alphaGFPT204I-Sequenz infiziert werden keine signifikante GFP- Expression aufweisen. Die Infektion von heterogenen Zellgemischen (siehe oben) führt zur spezifischen Überexpression des GFP-Gens, nach Infektion mit der TOP- alphaGFPT204I-Sequenz, in den Kolonkarzinomzellen, die eine aktive Wnt-Signalaktivität besitzen. In einem nächsten Schritt werden SW480 Zellen in unterschiedlichen Mengen zu jeweils 1ml von humaner Vollblutproben von gesunden Menschen gegeben und die Zellsuspension für 1 Stunde mit 1ml Virus-haltigem Medium versetzt. Die
Proben werden durch mehrere vorsichtige Zentrifugationsschritte und Medienwechsel gewaschen und für weitere 12 bis 18 Stunden bei 37°C unter leichter Bewegung im Brutschrank inkubiert. Anschließend wird die GFP-Expression mittels Durchflusszytometrie vermessen und die Zahl der positiven Fluoreszenzsignale mit der Zahl der jeweils zugegebenen SW480 Zellen koreliiert. Darüber hinaus werden die fluoreszierenden Zellen mittels entsprechender Schwellwertsetzungen isoliert und durch rein moφhologische Betrachtung, bzw. mittels eines immuncytochemischen Standartverfahrens der Firma Miltenyi Biotec (Kat. Nr. 603-01) unter Verwendung hochspezifischer Cytokeratin-FITC Antiköφer und Anti-Fite Alkalischer Phosphatase gemäß den Herstellerangaben als epitheliale (i.e. Kolonkarzinomzellen) identifiziert. 6. Überexpression von sTF-LZ in SW480 Kolonkarzinomzellen auf Grund der tumor-assoziierten Wnt-Signalaktivität in diesen Zellen.
Zur tumorspezifischen Expression eines Fusionsproduktes aus löslichem Thromboplastin (= soluble Tissue Factor; Aminosäure 1 bis 220) und der Leuzin-Reißver- schluss Domäne (= Leucin-Zipper) des Hefe Transkriptionsfaktors GCN4, werden in einem ersten Schritt Wnt-responsive Reportergerikonstrukte hergestellt. Die Promotorregionen enthalten drei funktionelle oder drei rticht-funktionelle Bindungs- stellen für LEF-1/TCF-Transkriptionsfaktoren (CCTTTGATC bzw. CCTTTGGCC), oder Varianten dieser Bindungsstellen (CCTTTGAA oder CCATTGAA bzw. CCTTTGGA oder CCATTGGA). Zur Generierung von Wnt-responsiven sTF-LZ- Reportergenkonstrukten werden in den ersten Experimenten die beschriebenen Ausgangsvektoren pTOPFLASH-, pFOPFLASH-, pTOPCAT- und pFOPCAT-Vektoren verwendet (Van De Wetering, M., Cavallo, R., Dooijes, D., Van Beest, M., Van Es,
J., Loureiro, J., Ypma, A., Hursch, D. , Jones, T., Brjsovec, A., Peifer, M., Mortin, M. & Clevers, H. (1997). Armadillo coactivates transcription driven by the product of the drosophila segmant polarity gene dTCF. Cell 88:789-99; Van De Wetering, M., Oosterwegel, M., Dooijes, D. & Clevers, H. (1991). Identification and cloning of TCF-1, a T lymphocyte specific transcription factor containing a sequence-specific
HMG box. EMBO J 10:123-32). Im Falle der pTOP-FLASH- und pFOP-FLASH- Vektoren wirde das Luciferase-Gen durch Verdau mit den Restriktionsenzymen NCO1 und NOTl herausgeschnitten und die Vektoren anschließend durch Inkubation mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliert. Daraufhin werden die Reaktions- produkte in Ethidiumbromid-haltigen Agarosegelen gelelektrophoretisch aufgetrennt, die ca. 3,8 kb große Vektorbande aus dem Gel ausgeschnitten und die DNA mittels des „Qiaex R LT Gel Extraction Kit" der Firma Qiagen isoliert.
Alle im Folgenden erwähnten, jedoch nicht näher ausgeführten, molekularbiolo- gischen Standardmethoden wie z.B. Plasmid-DNA Präparationen in analytischem
Maßstab, Spaltung von DNA mit Restriktionsendonucleasen, Dephosphorylierung linearisierter DNA, Auffüllen überstehender Enden, Ligation von DNA-Molekülen, Transformation von Bakterien, Auftrermung von Nukleinsäuren über Agarosegele, etc., sind prinzipiell in dem Laborbuch von SAMBROCK et al. beschrieben (Sambrock, J., Fritsch, E.F. & Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New
York.).
Die cDNA der Leuzin-Reißverschluss Domäne wird mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) aus genomischer Hefe DNA unter Verwendung der Primeφaare 5' -ATC GGC GGC GCC GCC ATG AAA CAA CTT GAA GAC AAG -3' (kodierender Sense-
Primer) und 5'- GAT CAA AGC TTG CGG CCG CTC AGC GTT CGC CAA CTA A -3' (Anti-Sense-Primer) amplifiziert. Der kodierende Sense-Primer enthält dabei eine Narl-RestriMorisenzymschnittstelle und kodiert darüber hinaus für eine kurze Linker- Sequenz Gly-Gly-Ala-Ala, die stromaufwärts von der Leuzin-Reißverschluss-Sequenz Met-Lys-Asn-Leu... liegt. Der Anti-Sense Primer enthält Schnittstellen für die Restriktionsenzyme Hind3 und Notl, für spätere Klonierungsschritte. Die cDNA für lösliches Thromboplastin (Aminosäure 1 - 220 mit und ohne Signalsequenz) wird mittels PCR unter Verwendung der kodierenden Sequenzprimer 5' -GAA GAA GGG ATC CTG GTG CCT CGT GGT TCT GCC ATG GGC ACT ACA AAT ACT GTG GCA GC- 3', 5' -GAA GAA GGG ATC CTG GTG CCT CGT GGT TCT GCC ATG GAG ACC
CCT GCC TGG CCC CGG G-3' und der Anti-Sense Primer 5* -GGC GGC GCC GCC TAT TTC TCG AAT TCC CC-3' (Codon 226 -> F), 5' -GGC GGC GCC GCC TAT TTC TCG CCC ATA CAC TCT ACC GGG CTG TCT G -3' (Codon 220 -> G), 5' -GGC GGC GCC GCC TAT TTC TCC TCT ACC GGG CTG TCT GTA CTC TTC CGG -3' (Codon 217 -> E) amplifiziert. Die Sense-Primer enthalten dabei
Schnittstellen für die Restriktionsenzyme BamHl und Notl für spätere Klonierungs- schritte. Die Anti-Sense Primer enthalten eine Narl -Schnittstelle für die Fusion mit der Leuzin-Reißverschluss Domäne von GCN4 (siehe oben). Die PCR-Fragmente wurden nach Verdau mit den entsprechenden Restriktionsenzymen, Aufreinigung durch Phenol/Chloroform-Behandlung, Präzipitation (Zugabe von 1/10 Vol 3M NaAc und 2,5 Vol 100% Ethanol) und Waschen mit 70% Ethanol, getrocknet und in lx Tris/EDTA-Puffer aufgenommen.
Anschließend werden die Reaktionsprodukte gelelektrophoretisch aufgetrennt und aus den Agarosegelen isoliert (siehe oben). Die Ligation mit dem BamHl- und
Hind3-geschnittenen, dephosphorylierten, gelelektrophoretisch aufgetrennten und anschließend isolierten pTrcHisC- Vektor (siehe Stone, M.J., Ruf, M., Miles, D ., Edgington, T.S. & Wright, P.E. (1995). Biochem J. 310:605-614) mit den PCR-
Produkten erfolgt mittels T4-DNA-Ligase in entsprechendem Mg 94- - und ATP-halti- gern Puffer. Die Ligationsansätze werden in Bakterien („DH5α ™ Competent Cells" der Firma GibcoBRL Life Technologies) transformiert, auf Ampicillin-haltigen LB- Agaφlatten ausgestrichen, gewachsene, Ampicillin-resistente Einzelkolonien werden zur Animpfung von 5ml LB-Flüssigkulturen verwendet, die Plasmid-DNA aus gewachsenen Einzelkolonien isoliert („Concert ™ Rapid Plasmid Mini Prep System" der Firma GibcoBRL Life Technologies) durch Restriktionsverdaus und Sequenzierung („Big Dye ™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction" der Firma PE Applied Biosystems) mit mehreren „Sense-" und „Anti-Sense" Primern analysiert und verifiziert. Die Plasmid-DNA der gewünschten Sequenz wird anschließend in größeren Mengen produziert, aufgereinigt („QIAfilter Plasmid Maxi Kit" der Firma Qiagen) und zur Expression des Fusionsproteins in Escherichia coli verwendet.
Bakteriell expremiertes Protein wird mittels Guanidium Hydrochlorid (GuHCl) aus den Bakterien extrahiert und nach Aufreinigung durch Ni-Chelat Säulen (Ni-NTA von Qiagen) mittels eines linearen Gradientens von Puffer A (6M GuHCl; 0,5M NaCl; 20mM Natriumphosphat; pH 8) und Puffer B (0,8M GuHCl; 0,3M NaCl; 50mM Tris-
HC1; 2,5mM reduzierendes Glutathion; 0,5M oxidierendes Glutathion; pH8) auf der Säule gefaltet. Nach intensivem Waschen mit lOmM Tris/20mM NaCl/pH7.5 wird das Protein im dem gleichen Puffer, der zusätzich 50mM hnidazol enthält, eluiert und dient dem Nachweis der Funktionalität des Fusionsproteins bzw. als Positiv-Kontrolle in Blutgerinnungsassays. Durch Verdau mit den Restriktionsendonukleasen Ncol und Notl wird das Fusionsgen aus dem pTrcHisC-sTF-LZ-Expressionsvektors herausgeschnitten und in die entsprechend verdauten TOP-/FOP-Vektoren (siehe oben) ligiert. Nach Transformation in Bakterien werden auf Agaφlatten gewachsene Einzelkolonien in der oben beschriebenen Art und Weise vermehrt und analysiert. Bakterienklone, die die gewünschten Nuklemsäurekonstrukte enthalten, werden in größeren Mengen produziert, die jeweilige Plasmid-DNA aufgereinigt und zur Transfektion von SW480 Zellen verwendet.
Die Transfektion der Reportergenkonstrukte erfolgt wahlweise mit „Lipofectin R
Reagent", „Lipofectamine Plus Reagent" oder „Lipofectamine 2000 Reagent" nach Herstellerangaben der Firma GibcoBRL Life Technologies, wobei die SW480 Zellen vor der Transfektion in 6-well Platten (ca. 300.000 Zellen pro well) ausgesät und über Nacht in DMEM, 10% Fötales Kälber Serum, lOOμg Pennicillin bei 37°C, 90% Luftfeuchtigkeit und 7,5% CO2-Gehalt inkubiert werden. Es werden zwischen lμg und lOμg DNA der Vektoren TOP- und FOP-sTF-LZ mit lOμl Lipofectin oder Lipofectamin und 90μl Optimem in Polystyrenröhrchen durchmischt und 1 Stunde bei Raumtemperatur irikubiert. Anschließend wird 800μl Optimem hinzugegeben und nach emstündiger Inkubation zu den mehrfach mit PBS gewaschenen Zellen gegeben und über Nacht inkubiert. Am nächsten Morgen werden die transfizierten SW480 Zellen erneut mit PBS gewaschen und wieder in DMEM + 10%FKS inkubiert. Die Zellkul- turüberstände von Parallelansätzen der mit FOP-/-TOP-sTF-LZ transfizierten SW480 Zellen werden zu unterschiedlichen Zeitpunkten (12 Stunden, 24 Stunden und 36 Stunden nach Transfektion) abgenommen, durch Zentrifugation bei 10.000*g von Zell- resten befreit. Anschließend werden die Überstände in ersten Experimenten durch
Zugäbe von TrisHCl (pH7,4) und EDTA auf eine Konzentration von 50mM bzw. lOmM eingestellt, durch Filterzentrifugation ("S1Y10 spiral ultracentrifugation cartridge" der Firma Amicon) zehnfach aufkonzentriert. Diese aufkonzentrierten Zell- kulturüberstände werden entweder bei -80°C gelagert oder direkt für Blutgerinnungs- assays eingesetzt. Überstände, die sTF217-LZ, sTF220-LZ oder sTF226-LZ enthielten, werden zu Aliqots von gepooltem humanem Blutproben (Citrat-Vollblut) gegeben, die teiweise zusätzlichen Faktor VUa und 28μM eines Phosphatidyl- serm Phosphatidylcholin-Gemisches (40% PS zu 60% PC in TBS mit 0,1% BSA) enthalten. Die Zeiträume bis zur Gerinnung der unterschiedlichen Blutprobenansätze nach Rekalzifizierung wirde manuell gemessen. Es zeigt sich, dass die Zugabe von Zellkul- turüberständen der mit TOP-sTF-LZ transfizierten SW480 Zellen zu einer signifikant beschleunigten Blutgerinnung der jeweiligen Blutprobe führt, wobei sTF217-LZ und sTF220-LZ besonders aktiv sind. Im Gegensatz dazu sind die Blutgerinnungszeiten nach Zugabe von Zelllαilturüberständen der mit FOP-sTF-LZ transfizierten SW480 Zellen nicht signifikant gegenüber Kontrollansätzen verändert, denen keine Zellkulturüber- stände zugesetzt werden.
7. Detektion von TOP-sTF-LZ transfizierten Zellen in Blutproben
Zunächst werden SW480 Zellen mit den Plasmiden Alρha+GFPcycle3 und TOP- sTF-LZ oder FOP-sTF-LZ in der in Beispiel 1 beschriebenen Art und Weise kotrans- fiziert. Danach werden die SW480 Zellen durch Zugabe von Trypsinlösung (0,5mM EDTA und 2%0 Trypsin in PBS) von der Unterlage abgelöst und in DMEM +10% FKS resuspendiert. Fluoreszinierende Zellen ab einer definierten Signalintensität werden mittels Durchflusszytometrie isoliert (siehe oben) und in definiertem Zahlen- Verhältnis zu Aliquots von gepoolten, humanen Blutproben zugegeben. Die Zeiträume bis zur Gerinnung der unterschiedlichen Blutprobenansätze nach Rekalzifizierung werden manuell gemessen. Es zeigt sich, dass die Abnahme der Blutgerinnungszeiten in einem direkten Verhältnis zur zugesetzten, mit TOP-sTF-LZ transfizierten SW480-Zellmenge steht. Die Zugabe von FOP-sTF-LZ transfizierten SW480-Zellen zeigt hingegen keinen derart drastischen Effekt hinsichtlich der Verkürzung der Blutgerinnungszeiten.

Claims

Patentansprtiche
1. Verfahren zur Detektion krankheits-assoziierter Zellen aus Köφeφroben dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen der Köφeφrobe mit Nukleinsäure- konstrukten transfiziert oder infiziert werden die folgende Komponenten beinhalten:
a) ein Promoter-Element mit mindestens einer DNA-Bindungsstelle für Transkriptionsfaktoren, die auf Grund der krankhaften Veränderung der Zellen eine veränderte Aktivität aufweisen und
b) ein Reportergen, das die Detektion der krankhaften Zellen ermöglicht und anschliessend die transfizierten oder infizierten Zellen detektiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure- konstrukte Bindungsstellen für die Transkriptionsfaktoren oder responsive Elemente aus der Gruppe TCF/LEF-1, jun, fos, myc, max, myb, E2F, DPI, CREB, p53, NFkB, NFAT, PPAR, ETS, ELK1, ATF, DPC, SMAD, CHOP, MEF, MADH4, GR, ER, STAT, SRF, ISRE, SRE, HSE, API, CRE enthal- ten.
3. Verfahren nach Anspruch 1 - 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Reportergene auf Grund ihrer enzymatischen, fluoreszenten oder strukturellen Eigenschaften nachgewiesen werden können.
4. Verfahren nach Anspruch 1 - 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Reportergene auf Grund der Aktivierung oder Inhibierung von enzymatischen Kaskaden nachgewiesen werden können.
5. Verfahren nach Anspruch 1 - 4, dadurch gekennzeichnet, dass die isolierten
Zellen mit Substanzen in Kontakt gebracht werden, die das Verhalten der Zellen hinsichtlich Proliferation, Differenzierung, Apoptose, Motilität und Stoffwechselaktivität verändern könnten.
6. Verfahren nach Anspruch 1 - 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Köφeφro- ben krebsartig veränderte Zellen enthalten.
7. Verfahren nach Anspruch 1 - 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Promotorregion durch veränderte Aktivitäten der Wnt- oder Ras-Signaltransduk- tionskaskade sowie durch die Transkriptionsfaktoren myc und p53 beeinflusst werden.
8. Kit enthaltend die Reagenzien zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1-6.
-1-
SEQUENZPROTOKO
<110> Bayer AG
<120> Verfahren zur spezifischen Detektion, Isolation und Charakterisierung von Zellen aus Körperproben durch Transfektion von Nukleinsäurekonstrukten
<130> LeA34930
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<160> 13
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