MXPA05000159A - Reactivos y metodos para identificar y modular la expresion de genes de senescencia del tumor. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a la identificacion de genes de senescencia del tumor, por tratamiento con agentes citotoxicos. La invencion proporciona reactivos y metodos para identificar compuestos que inducen la expresion de estos genes celulares y producen senescencia celular, particularmente senescencia en celulas de tumor. La invencion tambien proporciona reactivos que son celulas de mamifero recombinantes que contienen constructos de expresion recombinante que expresan un gen reportero bajo el control transcripcional de un promotor para un gen, expresion del cual es modulada en celulas senescentes, y metodos para usar tales celulas para identificar compuestos que modulan la expresion de estos genes celulares.

Description

REACTIVOS Y METODOS PARA IDENTIFICAR Y MODULAR LA EXPRESION DE GENES DE SENESCENCIA DEL TUMOR Campo de la Invención Esta invención se refiere a cambios en la expresión del gen celular y compuestos que producen cambios en la expresión del gen celular. En particular, la invención está relacionada con la identificación de genes de expresión los cuales están asociados con el desarrollo de senescencia en células de tumor en mamíferos después del tratamiento con agentes citotóxicos, ' que incluyen fármacos quimioterapéuticos , tales como doxorubicina, y radiación ionizante. Más específicamente, la invención proporciona métodos para identificar compuestos que modulan la expresión de estos genes celulares. La invención también proporciona reactivos que son células de mamífero recombinantes que contienen constructos de expresión recombinante que expresan un gen reportero bajo el control transcripcional de un promotor para la expresión del gen asociada con la senescencia, y métodos para usar tales células para -identificar compuestos que modulan la expresión de estos genes celulares y producen senescencia en dichas células. Los compuestos identificados usando los métodos de la invención se proporcionan para uso en métodos terapéuticos para tratar enfermedades y trastornos que se refieren a REF. : 161237 proliferación celular anormal o crecimiento celular neoplástico. Los métodos de diagnóstico, particularmente métodos para monitorear la eficacia de los regímenes de tratamiento anticancerígeno, también se proporcionan por esta invención.

Antecedentes de la Invención El cáncer permanece como una de las causas conducentes de muerte en los Estados Unidos. El tratamiento actual para cáncer incluye quimioterapia y radiación, pero estos tratamiento no son invariablemente citotóxicos a todas las células tumorales. Algunas de las células que sobreviven al tratamiento se recuperan y resumen la proliferación, mientras otras se someten a la detención del crecimiento permanente. La detención de la proliferación irreversible en células de tumor tratadas con agentes anticancerígenos, puede resultar de la muerte celular o detención del crecimiento permanente. Aunque el mecanismo de muerte celular inducida por lesión es un sujeto de la investigación activa, 'se sabe poco acerca de las determinantes de la detención del crecimiento terminal en células de tumor. La exposición de diferente líneas de células de tumor a varios agentes anticancerígenos in vitro e in vivo, induce detención de crecimiento de largo término con características fenotípicas de la senescencia celular, tal como alargamiento celular, adhesión incrementada y granularidad, y actividad de ß-galactosidasa asociada con la senescencia (SA-^-gal; Chang et al., 1999a, Cáncer Res. 59: 3761-3767) . La inducción del fenotipo senescente en células de tumor tratadas se ha observado en células tratadas con una variedad de agentes citotóxicos, tales como doxorubicina, afidicolina, cisplatina, radiación ionizante, citarabina, etopósido o taxol; esta respuesta es detectable en células de tumor tratadas aún a la concentración más baja de un agente citotóxico que produce inhibición de crecimiento detectable (Chang et al., 1999a, ibid) . La senescencia de las células de tumor puede ser producida después del tratamiento no solamente con agentes citotóxicos, sino también con derivados de vitamina A, retinoides, bajo condiciones que producen la inhibición del crecimiento con solamente citotoxicidad mínima (Chang et ai., 1999a, ibid). La senescencia inducida por retinoides en células de carcinoma de mama, está asociada con la co-inducción de varios genes inhibitorios del crecimiento, como se describe en Dokmanovic et al. (2002, Cáncer Biol. Ther. 1: 16-19) y en el documento co-propietario y co-pendiente Estadounidense Serie No. 09/865,879, presentado el 25" de Mayo de 2001, incorporado aquí por referencia. Las células de tumor pueden también ser inducidas para someterse a senescencia a través de la expresión ectópica de los supresores del tumor (Sugrue et al., 1997, Proc. Nati. Acad. SUMARIO DE IA INVENCIÓN Esta invención proporciona genes que son inducidos o reprimidos en células senescentes y se originan después del tratamiento con agentes citotóxicos, asi como también reactivos y métodos para identificar compuestos que inducen o reprimen tales genes. La invención también proporciona venta osamente, compuestos que imitan los efectos de agentes citotóxicos en la inhibición del crecimiento de células de tumor sin producir toxicidad asociada con estos agentes. Más preferiblemente, el efecto imitado es la inducción de senescencia en células de tumor de mamífero. En un primer aspecto, la invención proporciona un método para identificar un compuesto que induce senescencia en una célula de mamífero. En una modalidad, el método comprende las etapas de cultivar la célula de mamífero en la presencia y ausencia del compuesto; ensayar la expresión de al menos, un gen celular expuesto en la Tabla 2A en dicha célula en la presencia del compuesto con expresión de dicho gen en la célula en la ausencia del compuesto; e identificar compuestos que inducen la senescencia cuando la expresión de al. menos un gen celular en la Tabla 2A es superior en la presencia del compuesto que en la ausencia del compuesto. En una modalidad preferida, la célula de mamífero es una célula deficiente en p53. En otras modalidades preferidas, la célula de mamífero es una célula de tumor. Preferiblemente, el gen celular es un gen humano, más preferiblemente, BTG1, BTG2, EPLIN, WIPl, Maspina, MIC-1, IGFBP-6 o anfiregulina. La expresión de genes celulares de conformidad con el método, es preferiblemente detectada por hibridación a un ácido nucleico complementario, usando un reactivo inmunológico o ensayando para determinar una activad del producto del gen celular. En modalidades alternativas, la célula de mamífero es una célula de mamífero recombinante que comprende un gen reportero operablemente ligado a un promotor a partir de un gen celular en la Tabla 2A. En estas modalidades, la inducción de al menos uno de los genes celulares en la Tabla 2A es ensayado usando la célula de mamífero recombinante y expresión incrementada del gen reportero detectado en la presencia y ausencia del compuesto. En modalidades preferidas adicionales, el método comprende las etapas adicionales de ensayar la célula de mamífero en la presencia y ausencia del compuesto de prueba para expresión de uno o más genes en la Tabla 2B; e identificar compuestos en donde la expresión de los genes en la Tabla 2B no es mayor en la presencia del compuesto que en la ausencia del compuesto. La expresión de genes reporteros de conformidad con el método es preferiblemente detectada por hibridación a un ácido nucleico complementario, usando un reactivo inmunológico o ensayando para una actividad del producto del gen reportero. En modalidades adicionales del primer aspecto de la invención, el método para identificar un compuesto que induce senescencia en una célula de mamífero, comprende las etapas de cultivar la célula de mamífero en la presencia y ausencia del compuesto; ensayar la expresión de al menos un gen celular expuesto en la Tabla 2A en dicha célula, en la presencia del compuesto con expresión de dicho gen en la célula en la ausencia del compuesto; ensayar la célula de mamífero recombinante para el crecimiento celular y características morfológicas de la senescencia; e identificar compuestos que inducen senescencia cuando la expresión de al menos un gen celular en la Tabla 2A es superior en la presencia del compuesto que en la ausencia del compuesto y las células son inhibidas en crecimiento y expresan características morfológicas de senescencia en la presencia del compuesto. En una modalidad preferida, la célula de mamífero es una célula deficiente en p53. En otras modalidades preferidas, la célula de mamífero es una célula de tumor. Preferiblemente, el gen celular es un gen humano, más preferiblemente BTG1 , BTG2, EPLIN, WIP1, Maspina, MIC-1, IGFBP-6 o anfiregulina . La expresión de los genes celulares .de conformidad con el método, es preferiblemente detectada por hibridación a un ácido nucleico complementario, usando un reactivo inmunológico o ensayando para una actividad del producto del gen celular. En modalidades alternativas, la célula de mamífero es una célula de mamífero recombinante que comprende un gen reportero operablemente ligado a un promotor a partir de un gen celular en la Tabla 2A. En estas modalidades, la inducción de al menos uno de los genes celulares en la Tabla 2A es ensayada usando la célula de mamífero recombinante y expresión incrementada del gen reportero detectada en la presencia y ausencia del compuesto. En modalidades preferidas adicionales, el método comprende las etapas adicionales de ensayar la célula de mamífero en la presencia y ausencia del compuesto de prueba para la expresión de uno o más reactivos en la Tabla 2B; e identificar compuestos en donde la expresión de los genes en la Tabla 2B no es mayor en la presencia del compuesto que en la ausencia del compuesto. La expresión de genes reporteros de conformidad con el método, es preferiblemente detectada por hibridación a un ácido nucleico complementario, usando un reactivo inmunológico o ensayando para una actividad del producto del gen reportero. En un segundo aspecto, la invención proporciona un método para identificar un compuesto que induce senescencia en una célula de mamífero. En una modalidad, el método ¦ comprende las etapas de cultivar la célula de mamífero en la presencia y ausencia del compuesto; ensayando la expresión de al menos, un gen celular expuesto en la Tabla 1 en dicha célula en la presencia del compuesto con expresión de dicho gen en la célula en la ausencia del compuesto; e identificar compuesto que inducen senescencia cuando la expresión de al menos, un gen celular en la Tabla 1 es inferior en la presencia del compuesto que en la ausencia del compuesto. En una modalidad preferida, la célula de mamífero es una célula deficiente en p53. En otras modalidades preferidas, la célula de mamífero es una célula de tumor. Preferiblemente, el gen celular es un gen humano, más preferiblemente HFH-11, STEAP, RHAMM, INSIGl, LRPR1. La expresión de genes celulares de conformidad con el método es preferiblemente detectada por hibridación a un ácido nucleico complementario, usando un reactivo inmunológico o ensayando para una actividad del producto del gen celular. En modalidades alternativas, la célula de mamífero es una célula de mamífero recombinante que comprende un gen reportero operablemente ligado a un promotor a partir de un gen celular en la Tabla 1. En estas modalidades, la inducción de al menos uno de los genes celulares en la Tabla 1 se ensaya usando la célula de mamífero recombinante y expresión decrementada del gen reportero detectada en la presencia y ausencia del compuesto. En modalidades preferidas adicionales, el método comprende las etapas adicionales de ensayar la célula de mamífero en la presencia y ausencia del compuesto de prueba para la expresión de uno o más genes en la Tabla 233; e identificar compuestos en donde la expresión de los genes en la Tabla 2B no es mayor en la presencia del compuesto que en la ausencia del compuesto. La expresión de genes reporteros de conformidad con el método es preferiblemente detectada por hibridación a un ácido nucleico complementario, usando un reactivo inmunológico o ensayando para una actividad del producto del gen reportero. En modalidades adicionales del segundo aspecto de la invención, el método para identificar un compuesto que induce senescencia en una célula de mamífero, comprende las etapas de cultivar la célula de mamífero en la presencia y ausencia del compuesto; ensayar la expresión de al menos, un gen celular expuesto en la Tabla 1 en dicha célula en la presencia del compuesto con expresión de dicho gen en la célula en la ausencia del compuesto; ensayar la célula de mamífero recombinante para crecimiento celular y características morfológicas de la senescencia; e identificar compuestos que inducen la senescencia cuando la expresión de al menos un gen celular en la Tabla 1 es superior en la presencia del compuesto que en la ausencia del compuesto y las células son inhibidas en crecimiento y expresan características morfológicas de senescencia en la presencia del compuesto. En una modalidad preferida, la célula de mamífero es una célula deficiente en p53. En otras modalidades preferidas, la célula de mamífero es una célula de tumor. Preferiblemente, el gen celular es un gen humano, más preferiblemente, HFH- 11, STEAP, RH¾MM, INSIG1, LRPR1. La expresión de genes celulares de conformidad con el método, es preferiblemente detectada por hibridación a un ácido nucleico complementario, usando un reactivo inmunológico o ensayando para determinar una activad del producto del gen celular. En modalidades alternativas, la célula de mamífero es una célula de mamífero recombinante que comprende un gen reportero operablemente ligado a un promotor a partir de un gen celular en la Tabla 1. En estas modalidades, la inducción de al menos uno de los genes celulares en la Tabla 1 es ensayada usando la célula de mamífero recombinante y expresión incrementada del gen reportero detectado en la presencia y ausencia del compuesto. En modalidades preferidas adicionales, el método comprende las etapas adicionales de ensayar la célula de mamífero en la presencia y ausencia del compuesto de prueba para expresión de uno o más genes en la Tabla 2B; e identificar compuestos en donde la expresión de los genes en la Tabla 2B no es mayor en la presencia del compuesto que en la ausencia del compuesto. La expresión de genes reporteros de conformidad con el método es preferiblemente detectada por hibridación a un ácido nucleico • complementario, usando un reactivo inmunológico o ensayando para una actividad del producto del gen reportero. En un tercer aspecto, la invención proporciona compuestos producidos de conformidad con los métodos de la invención, más preferiblemente modalidades de los métodos de la invención, de tal modo que el método comprende las etapas adicionales de ensayar la célula de mamífero en la presencia y ausencia del compuesto de prueba para expresión de uno o más genes en la Tabla 2B; e identificar compuestos en donde la expresión de los genes en la Tabla 2B no es mayor en la presencia del compuesto que en la ausencia del compuesto. La invención en un cuarto aspecto, proporciona un método para valorar la eficacia de un tratamiento de una enfermedad o condición que se refiere a la proliferación celular anormal o crecimiento celular neoplástico. El método comprende las etapas de: obtener una muestra biológica que comprende células de un animal que tiene una enfermedad o condición que se refiere a proliferación celular anormal o crecimiento celular neoplástico antes del tratamiento y después del tratamiento; comparar la expresión de al menos un gen en la Tabla 1, 2A o 2B después del tratamiento con la expresión de dichos genes antes del tratamiento; y determinar que dicho tratamiento tiene eficacia para tratar la enfermedad o condición que se refiere a la proliferación celular anormal o crecimiento celular neoplástico si la expresión de al menos un gen en la Tabla 2A y 2B es superior después del tratamiento que antes del tratamiento o la expresión de al menos un gen la Tabla 1 es inferior después del tratamiento que antes del tratamiento. En modalidades preferidas, la muestra biológica comprende células de tumor.

Preferiblemente, el gen es un gen celular en la Tabla 2A, más preferiblemente en donde al menos un gen celular es un gen humano que es BTG1 , BTG2, EPLIN, WIP1, Maspina, MIC-1, IGFBP-6 o anfiregulina . En modalidades preferidas alternativas, el gen es un gen celular en la Tabla 1, más preferiblemente, un gen humano que es HFH-11, STEAP, RHAMM, INSIG1, y LRPR1. La expresión de genes celulares de conformidad con el método es preferiblemente detectada por hibridación a un ácido nucleico complementario, usando un reactivo inmunológico o ensayando para una actividad del producto del gen celular. En un quinto aspecto, la invención proporciona un método para tratar una enfermedad o condición que se refiere a la proliferación celular anormal o crecimiento celular neoplástico, más preferiblemente cáncer. El método de la invención comprende las etapas de administrar a un animal que tiene dicha enfermedad o condición, una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto producido de conformidad con los métodos inventivos de la invención, más preferiblemente modalidades de los métodos de la invención, por medio del cual el método comprende las etapas adicionales de ensayar la célula de mamífero en la presencia y ausencia del compuesto de prueba para la expresión de uno o más genes en la Tabla 2B; e identificar compuestos en donde la expresión de los genes en la Tabla 2B no es mayor en la presencia del compuesto que en la ausencia del compuesto.

En un aspecto adicional, la invención proporciona métodos para detectar las proteínas secretadas producidas en células senescentes. En particular, la invención en este aspecto proporciona métodos de diagnóstico para determinar, ínter alia, si un tratamiento que induce senescencias en células, preferiblemente células de tumor, es efectivo. En modalidades preferidas, los ensayos de detección como los proporcionados por la invención, se realizan en un fluido corporal, tal como sangre, orina, derrames, fluido ascitico, saliva, fluido cerebroespinal, secreciones cervicales, secreciones vaginales, secreciones endometriales, secreciones gastrointestinales, secreciones bronquiales, esputo, o secreciones o lavados de la mama. Las proteínas secretadas preferidas ensayadas en este aspecto de la invención incluyen maspina, MIOl, IGFBP-6 y anfiregulina. En un sexto aspecto, la invención proporciona métodos para identificar un compuesto que inhibe la inducción asociada con la senescencia de la expresión del gen celular. En modalidades preferidas de este aspecto, el método comprende las etapas de poner en contacto la célula con un agente citotóxico a una concentración de dicho agente que inhibe el crecimiento' celular; ensayar la célula en la presencia y ausencia del compuesto para cambios en la expresión de genes celulares inducidos cuando las células llegan a la senescencia; e identificar el compuesto como un inhibidor de la inducción asociada con la senescencia de la expresión del gen celular si la expresión de los genes celulares es inducida en la ausencia del compuesto, pero no está inducida en la presencia del compuesto. En modalidades preferidas, el gen celular es un gen humano que es ciclina DI, cinasa inducible por suero, CYR61, prosaposina, factor de crecimiento de transformación a (OÍTGF) , calicreina 7, calpaina-L2, neurosina, activador del plasminógeno, urocinasa, proteina precursora beta amiloide (A4) (ß???), o proteina de membrana integral 2B (BRI/ITM2B) . En una modalidad preferida, la célula de mamífero es una célula deficiente en p53. En otras modalidades preferidas, la célula de mamífero es una célula de tumor. La expresión de genes celulares de conformidad con el método es preferiblemente detectada por hibridación a un ácido nucleico complementario, usando un reactivo inmunológico o ensayando para una actividad del producto del gen celular. En modalidades alternativas, la célula de mamífero es una célula de mamífero recombinante que comprende un gen reportero operablemente ligado a un promotor a partir de un gen humano que es ciclina DI, prosaposina, factor de crecimiento de transformación a (OÍTGF) , calicreina 7, calpaína-L2, neurosina, activador del plasminógeno, urocinasa, proteína precursora beta amiloide (A4) (ß???), o proteína de membrana integral 2B (BRI/ITM2B) . En estas modalidades, el método comprende las etapas de poner en contacto la célula de mamífero con un agente citotóxico a una concentración de dicho agente que inhibe el crecimiento celular; ensayar la célula de mamífero en la presencia y ausencia del compuesto de prueba para expresión del gen reportero; e identificar compuestos en donde la expresión del gen reportero no es mayor en la presencia del compuesto que en la ausencia del compuesto. La expresión del gen reportero de conformidad con el método es preferiblemente detectada por hibridación a un ácido nucleico complementario, usando un reactivo inmunológico o ensayando para una actividad del producto del gen reportero. La invención también proporciona métodos para monitorear la eficacia del tratamiento. En estas modalidades, las células de tumor que han llegado a ser senescentes y no son capaces de crecer más, están identificadas y distinguidas de las células de tumor que se recuperan y proliferan después del tratamiento. La detección del marcador de senescencia en muestras de biopsia de tumores obtenidos después del tratamiento del paciente, se usa como un indicador de la respuesta del tratamiento. Las modalidades preferidas específicas de la presente invención, llegarán a ser evidentes de la siguiente descripción más detallada de ciertas modalidades preferidas y las reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1A es un perfil de clasificación celular activado por florescencia (FACS) , de fracciones de proliferación y detenidas en crecimiento de células HCT116 tratadas con doxorubicina - Las células son clasificadas basadas en la fluorescencia PKH2 en los dias indicados después de la liberación de doxorubicina. La población de PKH2iC de células de proliferación aparece al dia 4 y separada de la población PKH2hl (detenida en crecimiento) por el dia 6. La Figura IB es un perfil FACS de fracciones detenidas de crecimiento y proliferación de células HCT116 tratadas con doxorubicina separadas con base al contenido de ADN. Exponencialmente, el crecimiento de las células HCT116 tiene un pico en Gl, mientras la población de PKH2hl aislada 9 dias después del tratamiento con fármaco, tiene un pico en G2/M. La Figura 1C es una fotografía que muestra el teñido e?-ß-gal de poblaciones PKH2i y P H2lüf separadas 6 dias después de la liberación del fármaco. Ambos paneles son fotografiados a la misma amplificación de 200x. La Figura ID es una fotografía que muestra la formación de colonias por poblaciones PKH2hl y PKH2lc, separada 9 dias después del tratamiento con fármaco y colocadas en placas a 10,000 células vivas (PI-negativo) por 10 cm de placa.

Las Figuras 2A y 2B son fotografías del análisis de TI-RCP de cambios en la expresión de los genes asociados con la senescencia indicados. Se usó ß-actina como un estándar de normalización. La Figura 2A muestra una comparación de la expresión del gen en poblaciones de proliferación (PHK210) y senescentes (PKH2hi) , de células HCT116, separadas 9 días después del tratamiento con doxorubicina. La Figura 2B es una comparación de la expresión del gen en las poblaciones no clasificadas de tipo silvestre, de células HCT116 p21-/- y p53-/-, antes y después de 24 horas de tratamiento con 200 nM de doxorubicina, y en los días indicados después de la liberación del fármaco. Los genes fueron designados como dependientes de p53 o p21 si los cambios en su expresión llegan a ser detectables un dia. después o fueron menos pronunciados en las líneas p53-/- o p21-/- que en las células de tipo silvestre. Las Figuras 3A y 3B son fotografías de análisis de inmunomanchados de cambios en p53 y los productos de proteínas indicadas de genes que muestran expresión alterada en la senescencia inducida por fármaco. Se usó ß-actina como un estándar de normalización. La Figura 3A muestra los resultados de inmunomanchado de células HCT116 de tipo silvestre que fueron ya sea no tratadas, tratadas por dos días con 200 nM de doxorubicina, o clasificadas en poblaciones de células de proliferación (PKH2-10) y senescentes (PKH2h~) 9 días después del tratamiento con doxorubicina. La Figura 3B muestra la dependencia de p53 de la inducción de p21 en células HCT116 tratadas con doxorubicina, a través de los análisis de inmunomanchados de las líneas de células HCT116 p21-/- y p53-/- de tipo silvestre, tratadas con doxorubicina para el número indicado de días.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS Esta invención proporciona genes para la expresión del cual es modulado en las células que llegan a ser senescentes después del tratamiento con agentes citotóxicos. La invención también proporciona métodos para identificar compuestos que imitan las propiedades de modulación de expresión del gen de agentes citotóxicos, pero carecen de toxicidad que es característica del tratamiento de fármaco quimioterapéutico, así como también los compuestos identificados por los métodos. Los métodos de tratamiento terapéutico y diagnóstico se proporcionan como se expone más particularmente en este documento. Para propósitos de esta invención, el término "senescencia" será entendido para incluir la cesación permanente de replicación del ADN y crecimiento celular no reversible por factores de crecimiento, tales como los que ocurren al final del ciclo de vida proliferativo de células normales o en células de tumor o normales, en respuesta a fármacos citotóxicos, lesión al ADN u otros ataques celulares. La senescencia está también caracterizada por ciertas características morfológicas, que incluyen tamaño incrementado, granularidad incrementada por morfología aplanada, y actividad de ß-galactosidasa asociada con la senescencia (SA-3-gal) . Como se usa aquí, el término "gen asociado con la senescencia", está propuesto para abarcar genes, la expresión del cual es modulada (ya sea inducida o reprimida) cuando una célula expresa un fenotipo senescente, particularmente un fenotipo senescente producido poniendo en contacto las células con un agente citotóxico. Más preferiblemente, el término será entendido para referirse a los genes descritos aquí, inter alia, en las Tablas 1 y 2. La senescencia puede ser convenientemente inducida en células de mamífero poniendo en contacto la célula con una dosis de agente citotóxico que inhibe el crecimiento celular (como se describe en Chang et ai., 1999a, ibid.) . El crecimiento celular es determinado comparando el número de células cultivadas en la presencia y ausencia del agente y detectando la inhibición de crecimiento cuando existen algunas células en la presencia del agente que en la ausencia del agente, después de un periodo de tiempo de cultivo equivalente. Ejemplos de tales agentes citotóxicos incluyen pero no se limitan a, doxorubicina, afidicolina, cisplatina, citarabina, etopóxido, taxol y radiación ionizante. Las dosificaciones apropiadas variarán con diferentes tipos celulares; la determinación de la dosis que induce senescencia está dentro de la habilidad de uno que tiene habilidad ordinaria en la técnica corcio se describe en Chang et al., 1999a, ibid. Para propósitos de esta invención, la referencia a "una célula" o "células", está propuesta por ser equivalente, y particularmente abarca cultivos in vitro de células de mamífero que crecen y se mantienen como se conoce en la técnica, así como también muestras biológicas obtenidas, inter alia, de especímenes de tumor in vivo. Para propósitos de esta invención, la referencia a "genes celulares" en plural, está propuesta para abarcar un gen único, así como también dos o más genes. También se entenderá por aquellos de habilidades en la técnica, que los efectos de modulación de la expresión del gen celular, o constructos reporteros bajo el control transcripcional de promotores derivados de genes celulares, puede ser detectado en un primer gen y después el efecto replicado probando un segundo o cualquier número de genes adicionales o constructos de "gen reportero. Alternativamente, la expresión de dos o más genes o constructos de gen reportero, puede ser ensayada simultáneamente dentro del ámbito de esta invención. Los métodos de la invención pueden ser practicados usando cualquier célula de mamífero, preferi lemente una célula de roedor o primate, más preferiblemente, una célula humana que puede desarrollar un fenotipo de senescencia en respuesta a un agente citotóxico. Las células preferidas incluyen células de mamífero, preferiblemente células de roedores o primates, y más preferiblemente células humanas. En ciertas modalidades, las células más preferidas son células deficientes en p53, que son células que expresan menos que la cantidad normal o menos que la actividad funcional normal del supresor del tumor p53, como el resultado de mutación, supresión, recortioinación, pérdida de cromosoma o manipulación genética. En ciertas modalidades, los métodos de la invención son ventajosamente practicados usando células de mamífero recombinantes que comprenden un constructo de expresión recombinante que codifica un gen reportero operablemente ligado a un promotor a partir de un gen que es inducido en las células senescentes. Los genes reporteros preferidos que comprenden dichos constructos incluyen luciferasa de luciérnaga, acetiltransferasa de cloranfenicol, beta-galactosidasa, proteína fluorescente verde (GFP) , fosfatasa alcalina y más particularmente, un gen de fusión de luciferasa GFP comercialmente disponible. Los promotores más preferidos que comprenden los constructos de expresión recombinante de la invención, son promotores de un gen celular conocido por ser inducido en células senescentes. El promotor del gen celular es ventajosamente de un gen identificado en la Tabla 2A aquí. En modalidades más preferidas, el promotor celular es de BTG1, BTG2, EPLIN, WIP1, Maspina, MIC-1, IGFBP-6 o anfiregulin . En modalidades alternativas, el promotor del gen celular es de un gen que es reprimido en las células - senescentes. Los- promotores preferidos de este tipo que incluyen promotores son de un gen identificado en la Tabla 1 aquí. En modalidades más preferidas, el promotor celular es de HFH-11, STEAP, RHAMM, INSIG1, LRPR1. Las secuencias promotoras de algunos de estos genes se conocen en la técnica. Estas incluyen: ciclina DI (Motokura & Arnold, 1993, Genes Chromosomes Cáncer 1_: 89-95) ; CYR61 (Latinkic et al., 1991, Nucleic Acids Res. 19: 32.61-7).; prosaposina (Sun et ai., 1998, Gene 218: 23-34); factor a de crecimiento de transformación (TGFa; Raja et al., 1991, Mol Endocrinol. 5: 514-20); calicreína 7 (Yousef et al., 2000, Gene 254: 119-128); calpaína-L2 (Suzuki et al., 1995, Biol Chem Hoppe Seyler. 376: 523-9) ; urocinasa activadora del • , plasminógeno (Riccio et al., 1985, Nucleic Acids Res. 13: 2759-71); y proteína precursora beta amiloide (A4) (ß???; Lahiri & Robakis, 1991, Brain Res. Molec. Brain Res. 9: 253- 257). Para otros genes, las secuencias promotoras pueden ser fácilmente aisladas de una región del ADN genómico dentro de alrededor de 5 kilo bases (y más típicamente dentro de 1 kilo base) , corriente arriba del ADNc que codifica el gen. La biodisponibilidad de la secuencia completa del genoma humano permite la región genómica 5' en cualquier gen, ser inspeccionadas para las secuencias promotoras consenso, tales como secuencias ricas en AT llamadas cajas "TATA", y secuencias adicionales que comprenden la secuencia "CAAT" que son reconocidas por mediar la interacción del ácido nucleico del promotor con factores de proteína tales como polimerasa de ARN. Los promotores putativos pueden ser fácilmente probados insertando la secuencia promotora putativa corriente arriba de un gen reportero y comparar la actividad del gen reportero en tales constructos con actividad en constructos sin el inserto promotor putativo. Los constructos de expresión recombinante pueden ser introducidos en células de mamífero apropiadas, como se entiende por aquellos de habilidades en la técnica, más preferiblemente transfección y electroporación. Las modalidades preferidas de dichos constructos se producen en los vectores plásmidos u otros vectores que pueden ser usados para 'producir fácilmente cantidades útiles del vector. Modalidades alternativas incluyen vectores transmisibles, más preferiblemente vectores virales y más preferiblemente, vectores retrovirus, vectores adenovirus, vectores de virus adeno asociados, y vectores de virus vaccinia, como se conocen en la técnica. Véase de manera general llAMMALIAN CELL BIOTECH OLOGY: ? PRACTICAL APPROACH, (BUTLER, ED.), Oxford üniversity Press: New York, 1991, pp. 57-84. Las células transfretadas temporalmente con el constructo de expresión recombinante y más preferiblemente, células establemente transfectadas con el constructo y seleccionadas usando un agente selectivo, son ventajosamente usadas en la práctica de ciertas modalidades de los métodos de la invención. La detección de la respuesta de senescencia en cánceres clínicos requiere marcadores de diagnóstico para células senescentes. El marcador de senescencia más común, SA- -gal (Dimri et al., 1995, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92 : 9363-9367), tiene dos desventajas principales: representa una actividad enzimética la cual es preservada solamente en muestras de tejido congeladas y por un periodo de tiempo limitado, y no esté mecánicamente relacionada con la detención de crecimiento de las células senescentes. La invención proporciona un número de genes que son sobre regulados en células senescentes. Las proteínas proporcionan marcadores de diagnóstico sensitivos para la senescencia inducida por agentes citotóxicos . De interés especial como marcadores de diagnóstico son varios genes que son sobre regulados en células senescentes y están funcionalmente relacionados con la detención del crecimiento, tal como EPLIN, BTG1, BTG2, WIP1, Maspina, MIC-1, IGFBP-6 y anfiregulina . La inducción de estos inhibidores de crecimiento asociados con la senescencia, no está limitada a las células HCT116 tratadas con doxorubicina; por ejemplo EPLIN, una proteina inhibidora del crecimiento que fue regulada descendentemente en 20 de 21 lineas de células de carcinoma con relación a los tejidos epiteliales normales (Maul et al., 1999, Oncogene 18: 7838-7841), está fuertemente inducida en células de carcinoma de mama MCF-7 por tratamiento con retinoides, bajo las condiciones que producen detención del crecimiento similar a la senescencia (Dokmanovic et al., 2002, Cáncer Biol . Ther. 1: 16-19 y en el documento co-propietario y co-pendiente Estadounidense Serie No. 09/865,879, presentada el 25 de mayo de 2001, incorporada aqui por referencia) . El tratamiento con retinoide también mostró inducir el inhibidor de crecimiento secretado IGFBP-6 (Dailly et al., 2001, Biochim. Biophys. Acta 1518: 145-151). La mayoría de los otros inhibidores de crecimiento asociados con la senescencia han mostrado ser inducidos por lesión al ADN en una variedad de lineas de células derivadas de tumor, que incluyen BTG1 (Cortes et al., 2000, Mol. Carcinogen. 27 : 57-67), BTG2 (Fletcher ' et al., 1991, J. Biol. Che . 266.: 14511-14518), WIP1 (Fiscella et al-, 1997, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94: 6048-6053), Maspina (Zou et al., 2000, J. Biol. Chem. 275: 6051-6054 y MIC-1 (Komarova et al., ibid.) . Sin embargo, ninguno de estos estudios aprecia la asociación de estos genes con la senescencia, y la capacidad de inducción general de tales genes por lesión al ADN descrito aquí, indica fuertemente que tales genes son marcadores ampliamente aplicables de senescencia inducida por lesión. La invención también proporciona genes, expresión del cual está regulada descendentemente en la senescencia inducida por agentes citotóxicos. Estos genes son empleados para detectar la senescencia en células de tumor en una manera similar como los genes que son inducidos durante la senescencia, excepto que la senescencia será marcada por la regulación descendente de tales genes. Varios de estos genes son de interés especial como marcadores que son regulados descendentemente en células senescentes, que incluyen HFH-11 (Trident) , un factor de transcripción implicado en el progreso del ciclo celular (Ye et al., 1999, Mol. Cell. Biol. 19: 8570-8580), STEAP, un gen sobre expresado en diferentes cánceres (Hubert et al., 1999, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 96: 14523-14528), RHAMM mostró tener actividad oncogénica (Hall et al., 1995, Cell 82: 19-26) INSIG1, implicado en la regeneración del hígado (Peng et al., 1997, Genomics 43: 278-284") y LRPR1 que media la respuesta proliferativa a FSH (Slegtenhorst-Eegdeman et al., 1995, Mol. Cell. Endocriñol. 108: 115-24) . Los cambios en la expresión del gen, ya sea inducción o represión y ya sea genes nativos de constructos de gen reportero como se describe aquí, son detectados usando métodos bien establecidos' en la técnica. Estos incluyen ensayos de hibridación para detectar el ácido nucleico celular, más preferiblemente AKNm, dichos ensayos incluyen hibridación northern, hibridación Southern, y cualquier variedad de métodos de amplificación in vitro, conocidos en la técnica. Los cambios de la expresión del gen pueden también ser detectados usando reactivos inmunológicos y métodos, que incluyen ensayo inmunosorbente ligado a la enzima (ELISA) y otros ensayos usando anticuerpos policlonales o monoclonales, fragmentos anticuerpo o anticuerpos recombinantes o · quiméricos y tales reactivos inmunológicos. La actividad de los productos de gen específicos, más preferiblemente usados con constructos de gen reportero que tienen actividades cuantificables y conocidas, y más pref riblemente que producen productos fácilmente detectados, son también ventajosos para detectar cambios asociados con la senescencia en la expresión del gen. La aclaración de los cambios moleculares asociados con . la senescencia inducida por tratamiento, es también terapéuticamente ventajosa. La detención permanentemente del crecimiento de la célula de tumor a través de la inducción de senescencia acelerada, es un procedimiento de tratamiento atractivo, puesto que esta respuesta al tratamiento del fármaco puede ser estimulada aún bajo las condiciones de citotoxicidad mínima. La presente descripción de que la senescencia inducida por fármaco está asociada con la inducción concertada de genes antiproliferativos múltiples (algunos de los cuales también inhiben el crecimiento de células vecinas), sugiere la existencia de trayectorias regulatorias comunes que activan tales genes. De manera importante, la mayoría de los genes inhibidores del crecimiento, son también inducidos por el tratamiento de doxorubicina en células deficientes de p53. Los agentes que pueden ser desarrollados para estimular la inducción de los genes inhibitorios de crecimiento asociado con la senescencia, son probablemente por lo tanto, eficaces contra los tumores sin o con p53 funcional. El lado anverso de la senescencia inducida por fármaco sin embargo, es la inducción de genes asociados con condiciones patológicas (tales como enfermedad de Alzheimer), así como también proteasas y factores secretados mitogénicos, antiapoptóticos y angiogénicos. La expresión de tales genes por células senescentes puede tener efectos potencialmente • ¦ adversos, en término corto (estimulación de crecimiento de células de tumor no senescentes), y en el término largo' (probabilidad incrementada de la carcinogénesis de novo y enfermedades relacionadas con la edad) . Un enlace entre la senescencia de las células y la carcinogénesis in vivo, ha sido sugerido por un estudio reciente de Paradis et al. (2001, Human Pathol . 32: 327-332), quien encontró que la expresión de SA- -gal en hígado humano normal fue fuertemente correlacionada con el desarrollo de carcinoma hepatocelular. Tal enlace también fue directamente demostrado por Krtolica et al. (2001, Proc. Nati. Acad Sci. USA 98j_ 12072-12077), quien encontró que mezclando las células epiteliales transformadas con fibroblastos senescentes (pero no con pre-senescentes) , mejora el crecimiento y tumorigenicidad de las células transformadas. La inducción de p21 sobre regula muchos genes asociados con enfermedades e induce actividades anti-apoptóticas y mitogénicas de paracrina (Chang et al., 1999a, ibid) , y el p21 agónico fue mostrado aquí para disminuir o retardar la inducción de tales genes como prosaposina, aTGF y ß??? de Alzheimer. Estas observaciones sugieren que las trayectorias regulatorias estimuladas por p21 pueden ser ampliamente responsables de la expresión de los genes asociados con enfermedades en las células senescentes . La presente invención proporciona métodos para identificar compuestos que inducen la senescencia en células de tumor sin inducir concomitantemente la expresión de dichos factores secretados mitogénicos, antiapoptóticos y angiogénicos o genes asociados con condiciones patológicas. La existencia de tales compuestos está sugerida por el comportamiento de retinoides, los cuales inducen la senescencia de la célula del tumor a través de la coactivación de varios genes inhibitorios del crecimiento, pero no de p21 u otros genes asociados con las condiciones patológicas (como se describe en el documento co-propietario y co-pendiente Estadounidense Serie No. 09/865,879, presentado el 25 de mayo de 2001, incorporado por referencia aquí y en Dokmanovic et al., 2002, Cáncer Biol. Ther. 1: 16-19) , y la presente invención proporciona métodos para identificar otros compuestos disociados de citotoxicidad y otras características confusas de los compuestos conocidos en la técnica para producir senescencia en células de tumor. La invención también proporciona métodos para monitorear la eficacia del tratamiento, identificando células de tumor que han llegado a ser senescentes y no son ampliamente capaces de crecer y distinguir dichas células de las células de tumor que se recuperan y proliferan después del tratamiento. La detección de los marcadores de senescencia en las biopsias de tumores tratados, puede ser usada como un indicador de la respuesta de tratamiento. Este tipo de diagnósticos debe ser empleado en muchas situaciones clínicas, que 'incluyen por ejemplo, una prueba de biopsia para evaluar el éxito de la terapia por radiación que puede potencialme te requerir varios meses o aún años, para completar la respuesta (véase, Cox et al., 1983, Jnt. J.

Radiat. Oncol. Biol. Phys. 9: 299-303; Bataini et al.t 1988, Am. J. Surg. 155: 754-760} . La predominancia de las células de tumor que expresan marcadores de senescencia se espera sea positivamente correlacionada con el éxito del tratamiento. La expresión de los genes correspondientes puede ser medida al nivel de la proteina, usando anticuerpos contra los productos de gen correspondientes para inmunoteñido in situ, ensayo inmunosorbente ligado a la enzima (ELISA) , o manchado western. La expresión del gen puede también ser medida al nivel del ácido nucleico, más preferiblemente detectando la expresión del AR que codifica al menos, uno de dichos genes, usando hibridación in situ, TI-RCP in situ, o técnicas de análisis de ARN en volumen, tales como TI-RCP o diferentes formas de hibridación de filtro 8que incluyen manchado northern) . La elección de marcadores que son inhibidos en las células senescentes es proporcionada por los genes listados en la Tabla 1. La elección de los marcadores de senescencia que son inducidos en células senescentes, se proporciona por los genes listados en la Tabla 2. Los marcadores inhibidos en células senescentes incluyen los genes que estén casualmente involucrados en la proliferación celular y son conocidos por ser inhibidos en otros sistemas de senescencia de la célula-, incluyendo por ejemplo, i-67 (el cual es ya ampliamente usado como un marcador de proliferación) , CENP-F, AIM-1, MAD-2, reductasa de ribonucleótido MI, y cinasa timidina. Tales marcadores también incluyen genes que muestran la expresión especifica del tumor y no han mostrado previamente ser inhibidos en senescencia, tales como STEAP, RHAM o TLS/FUS. De especial interés como marcadores de senescencia son los genes que son inducidos en células senescentes y están casualmente involucrados en la inhibición del crecimiento celular, que incluyen por ejemplo, BTG1, BTG2, EPLIN, WIP1, Maspina, MIC-1, IGFBP-6 o anfiregulina, y otros genes de expresión los cuales son regulados descendentemente n tumores con relación a tejidos normales, tales como P-cadherina, desmoplaquina, desmoyocina y neurosina. Algunos de los genes que son inducidos en células senescentes codifican proteínas secretadas que pueden ser detectadas no solamente dentro de los tejidos afectados, sino también en fluidos corporales, tales como sangre, orina, derrames, fluido ascitico, saliva, fluido cerebroespinal, secreciones cervicales, secreciones vaginales, secreciones endometriales, secreciones gastrointestinales, secreciones bronquiales, esputo, o secreciones o lavados de la mama. Cuatro de estas proteínas secretadas (maspina, MIC-1, IGFBP- 6, anfiregulina) , actúan como inhibidores del crecimiento del tumor, y su inducción por agentes terapéuticos del cáncer debe contribuir al éxito de la terapia. Los niveles de tales proteínas en la sangre u orina de pacientes, medidos después de la administración de la quimioterapia o un curso de radiación, se espera por lo tanto, proporcionen un parámetro de diagnóstico que se correlacionará con la probabilidad de tratamientos exitosos. La Maspina (Zou et al., 2000,. J. Biol. Chem. 275: 6051-6054) y MIC-1 (Komarova et al., 1998, Oncogene 17 : 1089-1096), han sido reportados previamente por ser inducidos por agentes o radiación quimioterapéutica, mientras el -IGFBP-6 se conoce por ser inducible por retinoides (Dailly et al., 2001, Biochim. Biophys. Acta 1518 145-151) y la anfiregulina es inducida por la vitamina D (Akutsu et al., 2001, Biochem. Biophys. Res. Comün. 281 ; 1051- 1056) , pero la inducción estable de estas proteínas en las células que se someten a la senescencia inducida por tratamiento no es conocida en la técnica anterior. Los anticuerpos contra las proteínas anteriores han sido desarrollados y muchos de ellos son comercialmente disponibles. Por ejemplo, el anticuerpo anti-Maspina es disponible de PharMingen, San Diego, CA (Catálogo # 554292), el anticuerpo anti-anfiregulina es disponible de Lab Vision Corp., Fremont, Ca (Catálogo # RB-257-P) , y el anticuerpo anti-IGFBP-6 es disponible de Cell Sciences, Inc., Norwood, ?? (Catálogo # PAU1) . Los anticuerpos monoclonales contra IC-1 han sido descritos en la técnica (Fairlie et al., 2001, Biochemistry £0: 65-73) . Estos o anticuerpos similares pueden ser usados más convenientemente en un ensayo ELISA, o en otros ensayos inmunoqulmicos convencionales, para detectar y medir la cantidad de proteínas correspondientes. Aunque los niveles de proteina en la sangre u orina que se correlacionan con el tratamiento exitoso no son actualmente conocidos, pueden ser determinados a través de estudios clínicos directos. En tales estudios, los niveles de proteina correspondientes son medidos en pacientes antes del tratamiento y a diferentes puntos de tiempo después de la administración del tratamiento. Los resultados de estas mediciones son entonces correlacionados con el criterio clínico estándar para tratamientos exitosos (remisión parcial y remisión subsecuentemente completa) . Como se describe aquí, los genes que pueden ser represivos e inducibles por agentes citotóxicos, son objetivos útiles para identificar compuestos distintos de agentes citotóxicos que imitan el efecto inhibidor del crecimiento fisiológicamente basado en la proliferación celular. Identificar tales compuestos ventajosamente, proporciona agentes alternativos para producir la detención del crecimiento en células de mamífero, particularmente células de tumor y otras células que proliferan ¦ inapropiad.amente o patogénicamente. Tales compuestos son benéficos, debido a que pueden imitar los efectos inhibitorios del crecimiento de agentes citotóxicos. Otra ventaja de tales compuestos es que se puede esperar tengan un efecto inhibitorio del crecimiento sin producir efectos colaterales sistémicos encontrados con otros compuestos inhibitorios del crecimiento conocidos en la técnica anterior. Por ejemplo, muchos fármacos inhibitorios del crecimiento y compuestos conocidos en la técnica anterior, ventajosamente inducen la expresión del gen p21, el cual induce senescencia, detención de crecimiento y apoptosis por activación de una pluralidad de genes, expresión de los cuales está asociada con el desarrollo de enfermedades, particularmente enfermedades relacionadas con la edad, tales como enfermedad e Alzheimer, ateroesclerosis, enfermedad renal y artritis (como se describe en el documento copropietario y co-pendiente Estadounidense Serie No. 60/265,840, presentado el 1 de febrero de 2001 (Documento del Abogado No. 99,216-E) y Documento Estadounidense Serie No. 09/861, 925, presentado el 21 de Mayo de 2001 (Documento del Abogado No. 99,216-F), incorporado aquí por referencia). El descubrimiento de compuestos que imitan los efectos inhibitorios de crecimiento de fármacos quimioterapéuticos de agentes citotóxicos sin producir los efectos colaterales tóxicos de compuestos inhibitorios del crecimiento conocidos en la técnica, está venta osamente proporcionado por la invención. La identificación aqui de genes asociados con la senescencia inducida por agentes citotóxicos con actividad patogénica, proporciona objetivos para el desarrollo de f rmacos que inhiben la inducción de tales genes . La invención proporciona métodos para ensayar compuestos de prueba que inhiben la inducción de genes asociados con la senescencia consecuentes a la senescencia inducida por agentes citotóxicos, poniendo en contacto las células con el compuesto de prueba. Los compuestos que inhiben la inducción de estos genes no muestran expresión incrementada de estos genes en células tratadas con agentes, comparados con las células no tratadas. Los constructos de gen reportero son también ventajosamente usados para ensayar la inducción del gen y carecen por lo tanto, de los métodos de la invención dirigidos a estos genes asociados con la enfermedad. Los siguientes ejemplos están propuestos para ilustrar además ciertas modalidades preferidas de la invención y no son limitantes en naturaleza.

EJEMPLO 1 La Detección de Crecimiento Permanente en Células de Tumor Tratadas con un Agente Citotóxico está Asociada con el Desarrollo de un Fenotipo Senescente Se realizaron análisis de expresión de gen y citológicos para determinar los efectos de doxorubicina, un fármaco anticancerígeno ampliamente usado que produce lesión al ADN estabilizando un complejo intermediario que se puede desdoblar formado por la topoisomerasa II en el proceso de segregación de ADN en células de cáncer de colon humano (HCY 116) en cultivo. Las células de carcinoma de colon HCT116 (Myohanen et al., 1998, Cáncer Res. 58: 591-593; Acceso No. CCL-247, American Type Culture Collection, Manassas, VA) , que incluye las lineas de células p21-/- (clon 80S4) y p53-/- (clon 379.2) , tipo silvestre (una donación de Dr. Vogelstein, Johns Hopkins University) , se hicieron crecer en Medio de Águila Modificado de Dulbecco con suero FC2 al 10%. Las células fueron colocadas en placas a 5x10° células por placa de 15 cm y tratadas por 24 horas con 200 nM de doxorubicina. Posteriormente, las células se dejaron recuperar en medio libre de fármaco hasta 10 dias. Para el análisis de clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) de división celular, las células fueron etiquetadas con PH 2 (un fluoróforo lipofilico; Sigma Chemical Co . , St. Louis, MO) , el cual establemente se incorpora en la membrana del plasma y distribuye uniformemente entre las células hijas, resultando en decremento gradual en la fluorescencia PHK2 durante las divisiones celulares consecuentes (Horan et al., 1989, Wature 340: 167-168). El análisis FACS y clasificación celular se llevaron a cabo como se describe en Chang et al., (1999·, Cáncer Res. 59: 3761-3767 y 1999, Oncogene 18: 4808-4818) . Las fracciones clasificadas de células senescentes (PKH2hl) y proliferantes (PKH210) (90-95% de pureza) , fueron analizadas por el contenido de ADN usando teñido de yoduro de propidio (IP) y el análisis FACS como se describe por Jordán et al. (1996, Cáncer Res. _56: 816-825) . Las células también fueron teñidas por la actividad ß-galactosidasa asociada con la senescencia (SA-p-gal) como se describe por Dimri et AL. (1995, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92: 9363-9367). Finalmente, la clonogenicidad de las poblaciones clasificadas fue probada colocando en placas 2,000-10,000 placas clasificadas por 10 cm de placa. Los resultados de estos ensayos se muestran en las Figuras 1A hasta ID. La proliferación celular como se detectó por EACS usando florescencia de PH H2, se muestra en la Figura 1A. Cambios en la fluorescencia PKH2 fueron monitoreados por FACS en dias diferentes después del tratamiento con doxorubicina. Las células que murieron después del tratamiento, fueron excluidas de este análisis basado en su teñido con tinte IP impermeable a la membrana. Casi todas las células negativas al IP permanecieron detenidas en crecimiento (PKH2nl) para los primeros 2-3 dias después del tratamiento con doxorubicina, pero una población celular proliferante (PKH2lQ) emergió iniciando el dia 4. Una fracción substancial de las células, sin embargó, permaneció PKH2h; y no decrementó su fluorescencia, indicando que estas células no se dividen aún una vez después liberadas del fármaco. 6-10 dias después del tratamiento con doxorubicina, las células sobrevivientes fueron separadas por FACS en fracciones de PKH2ni y PKH210. El análisis que contiene ADN mostró que la mayoría de las células PKH2hl permaneció en G2, la fase donde la mayoría de las células han sido originalmente detenidas por doxorubicina a través de su efecto en topoisomerasa II (Figura IB) . Como se muestra en la Figura 1C, las células PKH2hi fueron mayormente alargadas y teñidas positivamente para SA-3-gal, indicando su fenotipo senescente. Por el contrario, las células PKH210 retienen su tamaño normal y permanecen negativas para SA~ -gal. La habilidad para formar colonias fue esencialmente confinada a la fracción PKH2lc (Figura ID) , indicando que las células PKH2hl senescentes han perdido su capacidad proliferativa. Estos resultados indican claramente que las células HCT 116 fueron separadas en dos diferentes poblaciones, después del tratamiento con doxorubicina: una población celular senescente y una población que recuperan la capacidad para proliferar.

EJEMPLO 2 Identificación de Genes Inducidos y Reprimidos en senescencia Inducida por Doxorubicina Las poblaciones de células senescentes y proliferantes producidas por tratamiento con doxorubicina de células HCT116 como se describe en el Ejemplo 1, fueron usadas para identificar diferencias en la expresión del gen entre estas poblaciones celulares y células no tratadas. ¦ En estos experimentos, el poli (A) ~AR y extractos de proteina, fueron preparados a partir de poblaciones celulares PKH210 y PKH2hl, separadas en diferentes experimentos 6, 9, o 10 dias después de la liberación de doxorubicina. Las sondas de ADNc fluorescentes fueron sintetizadas y usadas para hibridación con el microarreglo de ADNc Humano UniGEM V 2.0 y análisis de señal (los análisis fueron conducidos por IncyteGenomics, St. Louis, MO, como se describe en el sitio de red de la compañia, vrww.incyte.com). Los cambios en la expresión del gen fueron verificados por transcripción inversa-RCP semi-cuantitativa (TI-RCP) , esencialmente como se describe (Noonan et al., 1990, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87: 7160-7164), usando ß-actina como un estándar de normalización interno y los cebadores de oligonucleótidos se muestran en la Tabla 3. El análisis de TI-RCP · se llevó a cabo usando dos pares de preparaciones de ARN de células proliferantes y senescentes aisladas en experimentos independientes, con los • · mismos resultados. Estos resultados fueron confirmados por ensayos de inmunomanchado que se llevaron a cabo al menos, dos veces (con los mismos resultados), usando los siguientes anticuerpos primarios : anticuerpos monoclonales de ratón contra ß-actina (Sigma Chemical Co.), p53 y p5l (Oncogene Research, Cambridge, A) , Maspina (Pharmingen, San Diego, CA) , queratina 18 (Neomarkers, Union City, CA) , ciclina DI (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) , y anticuerpos policlonales de conejo contra ATF-3 (Santa Cruz) , Mad-2 (BabCo, Richmond, CA) y EPLIN (una donación de Dr. D. Chang, UCLA) . Las bandas fueron detectadas usando anticuerpos secundarios etiquetados con peroxidasa de rábano picante y kit de detección quimioluminiscente ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) . Las sondas de ADN fluorescentes fueron preparadas de AR de poblaciones de células proliferantes (PKH2io) y senescentes (PKH2ni) , y usadas para hibridación diferencial con microarreglo de ADNc humano UniGEM V 2.0 ( IncyteGenomics, Inc.), que contiene genes >9,000. 82% de los más de 9,000 genes verificados por secuencia y extremos de secuencia expresados (ESTs) presentes en el microarreglo UniGem V, dieron señales de hibridación medible con ambas sondas. Las listas de genes identificados por esta hibridación como regulados descendentemente o sobre regulados en la senescencia con relación a las células de proliferación (con expresión diferencial balanceada de 2.0 o superior), se proporcionan en las Tablas 1 y 2. El análisis de TI-RCP (Figura 2A) , se llevó a cabo por 74 genes individuales detectados usando el ensayo de hibridación y. cambios cualitativos confirmados en la expresión del gen para genes regulados descendentemente 26/29 y sobre regulados 37/45. En la mayoría de los casos, las diferencias en la expresión del gen revelada por TI-RCP fueron muy superiores que los valores indicados por la hibridación de microarreglo de ADNc. Cambios en la expresión de 7 genes fueron también confirmados al nivel de la proteína por inmunomanchado (Figura 3A) . Más de una mitad de 68 genes de EST regulado descendentemente en células senescentes se conocen por jugar un papel en el progreso del ciclo celular: 25 de estos genes están involucrados en diferentes etapas de la mitosis o segregación de ADN (por ejemplo, CDC2, i-67r MAD2, Topoisomerasa lia) ; 11 genes funcionan en la replicación de ADN y montaje de cromatina (por ejemplo, reductasa de ribonucleótido MI, cinasa timidilato, proteína de replicación A3) ; y 4 genes están involucrados en la reparación del ADN (por ejemplo, HEX1, FEN1) . La regulación descendente de genes involucrados en la proliferación celular, se correlaciona con el estado de crecimiento detenido de las células senescentes y demuestra la relevancia biológica de la expresión del gen que. prolifera en nuestro sistema. Además, los genes inhibitorios de crecimiento múltiple, fueron inducidos por tratamiento con doxorubicina. • Las células HCT116 senescentes se encontraron sobre regulando genes múltiples con actividad inhibitoria del crecimiento documentada, proporcionando una amplia explicación para el mantenimiento de la detención del ciclo celular inducido por doxorubicina en la ausencia de pl6 (el cual no está expresado en células HCT 116] . Uno de los genes sobre regulados es p21 (mostrado en la Figura 2A) . El análisis de la inducción de proteína p21 y p53 por doxorubicina en tipo silvestre, líneas de células HCT116 p53-/-(14) y p21-/- (15) , demostró que la inducción p21 en este sistema es fuertemente dependiente de p53 (mostrado en la Figura 3B) . Tanto las proteínas p53 como p21 se mantienen a niveles elevados en células senescentes aisladas 9 días después de liberadas del fármaco (Figura 3A) . Contrario a p21., sin embargo , p53 es sobre regulado solamente al nivel de la proteína. Además de la inducción con p21 sostenida, las células senescentes fuertemente sobre expresan muchos otros inhibidores del crecimiento, que incluyen varios genes supresores del tumor putativo o conocido. Algunos de estos genes codifican proteínas inhibitorias del crecimiento intracelular, que incluyen supresor del tumor BTG1 y su homólogo BTG2, supresor de tumor putativo EPLIN (Pérdida de Proteína Epitelial en Neoplasma) y fosfatasa WIP1. Las células HCT116 senescentes,, también sobre expresan varios inhibidores del crecimiento secretados, que incluyen MIC-1 (pTGF-ß) , proteína 6 de enlace al factor de crecimiento similar a la insulina (IGFBP-6), aspina inhibidor de la proteasa serina (un supresor del tumor regulado descendentemente en cánceres de mama avanzados) , y anfiregulina y factor relacionado con EGF, que inhibe la proliferación de varias lineas de carcinoma, mientras promueve el crecimiento de células epiteliales normales. Estos hallazgos sugieren que la detención de crecimiento inducida por fármaco de células de tumor se mantiene por una serie de factores intracelulares y paracrinos aparentemente redundantes. Las diferencias en la expresión del gen entre las poblaciones senescentes y proliferantes de células HCT116 tratadas con fármaco son paralelas a las diferencias entre células epiteliales normales y cancerosas. Además de los supresores de tumor listados anteriormente, las células HCT116 senescentes inducen varios otros genes que son regulados descendentemente en cánceres con relación a células epiteliales normales (que incluye MIC-1, P-cadherina, desmoplaquina, desmoyocina, neurosina) . Por otro lado, las células senescentes reguladas descendentemente, no solamente involucran múltiples genes en la proliferación celular, sino también algunos otros genes que tienen actividad oncogénica (RHA y TLS/FUS) o muestran expresión especifica del tumor (STEAP) . Otra señal de "normalización" putativa de células senescentes es la sobre regulación de seis elementos de la familia del gen queratina. La inducción más fuerte en este grupo se observó para queratinas 8 y 18, un par de queratina con actividad anti-apoptótica (Caulin et al., 2000r J. Cell Biol. 149: 17-22). Sin embargo, las células HCT116 senescente no mostró evidencia de apoptosis, aún aunque fueron sobre regulados dos genes proapoptóticos, APO-l/Fas y NOXA. Además de los genes inhibitorios del crecimiento, las células HCT116 senescentes mostraron expresión incrementada de genes para factores mitogénicos, anti-apoptóticos y angiogénicos secretados, tales como proteínas de matriz extracelular (ECM) Cyr61 y prosaposina, y factor de crecimiento de transformación a (TGF-a) . La inducción de tales genes resulta en actividades paracrinas, las cuales promueven el crecimiento del tumor in vivo e in vi tro. Tales actividades han sido previamente asociadas con la senescencia replicativa (Campisi, 2000, In vitro 14: 183- 188) en células normales, y con inducción p21 en células tumorales (Chang et al., 2000, P-roc. Nati. Acad. Scí. USA 9T_ 1497-150117). Las células HCT116 senescentes también sobre regulan varias proteasas (calicreína-7, calpaína L2, neurosina, activador del plasminógeno tipo urocinasa) , que puede contribuir potencialmente al crecimiento metastásico. Varios otros genes inducidos en las células HCT116 senescentes, están involucrados en la adhesión celular y contacto célula-célula (que incluyen P-cadherina, proteína de enlace a Mac2 y desmoplaquina) . Otros genes inducidos codifican receptores ECM, que incluyen varias integrinas y sindecan-4 (riudocan) , involucrados en la angiogénesis . Algunas otras proteínas de la transmem rana inducidas en células senescentes, son proteínas regulatorias del crecimiento CD44 y proteína precursora ß-amiloide del Alzheimer (ß???) y Jagged-1, y otros precursores amiloides, BRI, asociados con la enfermedad similar al Alzheimer. Aunque, los factores secretados, proteínas ECM, receptores ECM y otras proteínas de membrana integral, hacen 33 de los 68 genes con funciones conocidas que son inducidas en células HCT116 senescentes. Por el contrario, solamente 2 de 64 genes regulados descendentemente con funciones conocidas fueron inducidos en la población de células senescentes de células HCT116 tratadas con doxorubicina. Una clase de genes que son diferencialmente expresados en células HCT116 tratadas con doxorubicina, son genes que codifican factores o cofactores de transcripción putativa o conocida. Los genes para varios factores y cofactores de transcripción conocidos o putativos, muestran regulación alterada en las células HCT116 senescentes. Uno de los factores de transcripción regulados descendentemente de la proteína de hélice voladiza HFH-11 (Trident) , un regulador positivo de la replicación de ADN, que está específicamente expresado en células en estado de repetición (Ye et al., 1999, Mol. Cell. Biol. 19: 8570-8580) . Varios factores de transcripción sobre regulados están relacionados con la familia AP-1, los cuales median la respuesta celular a varias señales mitogénicas, interferonas y formas diferentes de estrés (Wisdom, 1999, Exp. Cell. Res. 253: 180-185) . Estos incluyen c-Jun y dos otras proteínas de cierre de leucina básicas, XBP-1 (estructuralmente relacionadas con c-Jun) y ATF3 que dimeriza con c-Jun. La sobre regulación sostenida de ARNm ATF3 y proteina en células senescentes, es sorprendente, puesto que la inducción de este factor responsable del estrés, es usualmente temporal (durante horas) , debido a la habilidad del ATF3 para inhibir su propia transcripción (Wolfgang et al., 2000, J. Biol Chéta. 275: 16865-16870) . Otro factor de transcripción inducido es ELF-1, un elemento de la familia Ets de proteínas de hélice-bucle-hélice que son conocidas por interactuar funcionalmente, y posiblemente físicamente, con AP-1 (Wisdom, ibid.) El patrón observado de la expresión del gen en senescencia inducida por fármaco citotóxico de células HCH16, mostró muchas similitudes a la senescencia en células normales. Algunas de las propiedades generales de las células senescentes (distintas de la detención de crecimiento terminal), son resistentes a la apoptosis, adhesión celular incrementada (asociada con la sobreproducción de componentes ECM) , y secreción de proteasas, inhibidores de proteasa y factores mitogénicos (Campisi, ibid.). Los genes involucrados en todos estos fenómenos están ampliamente representados entre aquellos que son sobre regulados en células de tumor HCT116 senescentes. Contrario a células normales, sin embargo, las células HCTll'6 senescentes, no sobre regulan a pl6 o PML supresor del tumor, asociados con la senescencia acelerada inducida por RAS (Pearson et al., 2000, Nature 406:207-210) . Los cambios en la expresión del gen asociada con la senescencia inducida por fármaco, también se muestran paralelos con el enve ecimiento de organismos. Algunas de las proteínas que son inducidas en las células de carcinoma de colon HCT116 senescentes, tales como ß??? y prosaposina, muestran expresión dependiente de la edad en animales. Remarcablemente, la Maspina, CD44 y Ciclina DI fueron reportadas por ser sobre reguladas específicamente en el epitelio colónico de animales envejecidos (Lee et al., 2001, Mech ñgeing Dev. 122 : 355-371) . Además, ocho genes regulados descendentemente en células HCT116 senescentes, también mostraron expresión decrementada en cultivos de fibroblastos que crecen activamente de personas de edad avanzada en .cultivos similares de personas jóvenes, mientras dos genes inducidos (MIC-1 y desmoplaguina) , fueron sobre regulados en cultivos de individuos más viejos (Ly et al., 2000, Science 287: 2486-2492) . Estos resultados demuestran que el proceso de senescencia inducida por fármaco en células de tumor está relacionado con tanto senescencia replicativa como envejecimiento de organismos.

EJEMPLO 3 Efectos de p53 y p21 Agénicos en Cambios Inducidos por Fármacos Citotóxicos en Expresión de Gen Asociada con la Senescencia Muchos de estos genes que muestran expresión alterada en células HCT116 senescentes, han mostrado cambios similares después de la sobre expresión de p53 (9 genes regulados descendentemente y 11 sobre regulados) o p21 (46 genes regulados descendentemente y 7 sobre regulados) (véase Tablas 1 y 2) . El p53 actúa como un activador transcripcxonal directo de muchos genes (que incluyen p21) e indirectamente regula un grupo de genes que no tienen sitios de enlace p53 en sus promotores ( omarova et al., 1998, Oncogene 7: 1089-1096; Zhao et al., 1999, Cell Res. 9: 51-59). Una clase prominente de genes inducidos por p53 que codifica factores inhibitorios del crecimiento secretados, proporciona actividad antiproliferativa paracrina (Komarova et al., ibld.) . Contrario a p53, el p21 no es un regulador transcripcxonal per se, pero interactúa con una amplia red de factores, cofactores y mediadores de transcripción de la transducción de la señal. (Dotto, 2000, Biochi . Biophys. Acta 1471 : M43-M56) . La sobre expresión de p21 en células de fibrosarcoma, resulta en la regulación descendente de genes de proliferación celular múltiple y la sobre regulación de muchos componentes ECM y factores mitogénicos y antiapoptóticos secretados, proporcionando las actividades correspondientes en medio acondicionado de células inducidas por p21 (Chang et al., 1999a, ibid) . Un mecanismo conocido para la activación de la transcripción por p21, se basa en su habilidad para estimular los cofactores de transcripción P300/CBP (Snowden et al., 2000, Mol. Cell. Biol. 20: 2676-2686) . Las células HGT116 sin embargo, expresan una forma mutante dominante del factor de transcripción p300 (Gayther et al., 2000, Wat. Genet. 24: 300-303), el cual puede explicar porqué las células HCT116 senescentes sobre regulan un número relativamente menor de genes inducibles por p21. Para aclarar las funciones de p53 y p21 en los cambios observados en la expresión del gen, se analizó la expresión de genes asociados con la senescencia después del tratamiento con doxorubicina de células HCT116 p21-/- y p53-/-, de tipo silvestre. Las muestras de ARN fueron asiladas antes de la adición del fármaco, inmediatamente después de un día de tratamiento con doxorubicina, y en tres días consecutivos después de la eliminación del fármaco. La expresión de 33 genes que fueron sobre regulados y 11 genes regulados descendentemente en células senescentes, fue analizado por TI-RCP como se describe anteriormente; los resultados se muestran en la Figura 2B. Este análisis mostró que todos los genes probados fueron expresados en células de tipo silvestre no tratadas a niveles similares a aquellos en la fracción proliferante de células tratadas con doxorubicina. Los cambios asociados con la senescencia en la expresión de la mayoría de estos genes, llegó a ser detectable en la población total de las células HCT116 de tipo silvestre, después de un día de tratamiento con doxorubicina o un día después de la liberación del fármaco. Esta respuesta claramente hizo posible evaluar los efectos de p21 y p53 agénicos en poblaciones totales de células tratadas con doxorubicina, sin tener que purificar las fracciones senescentes pequeñas de las líneas celulares p21-/- y p53-/-. Aproximadamente un tercio de los genes que son sobre regulados, en células senescentes, mostró respuesta indistinguible entre las líneas de células p21-/- y p53-/-, tipo silvestre, indicando que la inducción de estos genes no involucra ya sea p53 o p21 (Figura 2B) . Estos genes incluyen el supresor del tumor BTG1 e inhibidor del tumor secretado IGFBP-6. De manera sorprendente, uno de los genes que no mostró dependencia de p53 es ????, aunque se sabe es inducible por p53. Los restantes dos tercios de los genes sobre regulados mostró inducción disminuida o retardada en células p53-/-. Una mitad de los últimos genes no fue afectada por p21 agénico. Este grupo incluye factores de transcripción de la familia AP-1, CYR61, y varios inhibidores del crecimiento secretado e intracelular (BTG2, WIP1) (Maspina, MIC-1, anfiregulina) . Ninguno de estos genes, sin embargo, son completamente dependientes de p53 por su inducción, y todos ellos son inducidos en células p53-/- dos dias después de liberar el fármaco. Casi todos los inhibidores asociados con la senescencia (excepto para p21 y EPLIN) fueron eventualmente inducidos en células p53-/- a un nivel comparable con la linea de células de tipo silvestre (Figura 2B) . Estos resultados proporcionan una explicación para la disminuida pero todavía inducción substancial de la detención del crecimiento similar a senescencia en células p53-/- después del tratamiento con doxorubícina (Chang et al., 1999a, ibid) . Un grupo final de los genes inducidos mostró cambios muy débiles en p21-/- gue en las células de tipo silvestre (Figura 2B) , indicando que la regulación de estos genes está mediada a través de p21. Puesto que la inducción de p21 en células HCT116 tratadas con doxorubicina es dependiente de p53, tales genes también mostraron inducción disminuida .en células p53-/-. La dependencia p21 más fuerte entre los genes probados, se encontró para Ciclina DI. Ninguno de los genes dependientes de p21 produce inhibidores del crecimiento secretados, sino dos de ellos codifican las proteínas mitogénicas/antiapoptóticas secretadas (prosaposina y TGFa) . La mayoría de los genes que son regulados descendentemente en células HCT116 senescentes, se conocen por ser inhibidos por p21 (Caulin et al. , ibid) . De acuerdo con esta observación, tales genes muestran expresión decrementada después del tratamiento con doxorubicina solamente en el tipo silvestre, pero no en las líneas de células p21-/- y p53-/- (Figura 2B) . Junto con los genes que muestran inducción dependiente de p21, 20 de 31 genes probados que son afectados por p53 agénico (excluyendo p21) , son también afectados al mismo o mayor grado por el agénico de p21. Por lo tanto, p21, el cual no fue recientemente conocido por jugar un papel en la regulación de la expresión del gen, parece ser un mediador principal de los efectos correspondientes de p53. Estos resultados indican que los genes identificados aquí pueden ser usados como marcadores para valorar compuestos por sus efectos en la senescencia celular y también para identificar compuestos que inducen el fenotipo de senescencia por mecanismos que no implican p53, p21 o ambos.

EJEMPLO 4 Construcción de Constructos de Gen Promotor-Reportero que son Inducidos en Células Senescentes y Selección de Agentes que Inducen Senescencia en células de Tumor Un ensayo de selección basado en las células, es usado para identificar compuestos que activan los genes inhibitorios del crecimiento asociados con la senescencia en células de tumor deficientes en p53, sin activación concurrente de factores que promueven el tumor secretados. Para este propósito, son construidos los constructos promotores de diferentes genes inhibitorios del crecimiento asociados con la senescencia, que accionan la expresión del reportero de luciferasa GFP quimérico. Tal reportero quimérico fue mostrado por ser adecuado para la selección basada en fluorescencia GFP y para las mediciones de la actividad del promotor sensitivo basados en quimioluminiscencia de luciferasa (Kotarsky et al., 2001, Anal. Bioche . 288 ; 209-215) . Un en reportero quimérico similar está disponible comercialmente (Clontech, Palo Alto, CA) . Los constructos promotores-reporteros, son probados por su capacidad de inducción por doxorubicina bajo condiciones que activan los genes correspondientes. Los constructos promotores mejor regulados son usados para desarrollar lineas de células establemente transfectadas, y lineas celulares identificadas que tienen la inducción más fuerte del gen .reportero bajo condiciones de senescencia inducida por f rmaco . Una vez que las lineas celulares reporteras adecuadas se desarrollan, se determinan las condiciones optimizadas para selección de alto rendimiento (HTS) de bibliotecas químicas, basadas en la actividad de luciferasa del reportero. Este ensayo de HTS es usado para seleccionar una biblioteca de compuesto químico (tal como la Serie ' de Diversidad de 1,990 compuestos del Developmental Therapeutics Program (DTP) de NCI) . Los compuestos positivos en este ensayo son entonces probados por sus efectos en la expresión de otros genes asociados con aspectos positivos y negativos de senescencia acelerada. Siete genes inhibitorios del crecimiento asociados con la senescencia, son objetivos preferenciales para los ensayos de inducción: El BTG1 es un reacomodo supresor del tumor en la translocación cromosomal t (8;12) (q24;q22) de leucemia de células B y un inhibidor de la proliferación celular (Rouault et al., 1992, EMEO J. 11: 1663-1670) . El BTG1 mostró ser inducido por la lesión al ADN en diferentes lineas de células de tumor humano (Cortes et al., 2000, Mol. Carcinog 27: 57-64) . La expresión de BTG1 inducida por lesión, fue mostrada por Cortes et al. y se muestra aqui por ser independiente de p53. El BTG2 (PC3/TIS21) es un gen antiproliferativo relacionado con BTG1 (Rouault et al., 1996, Nat. Genet. 14: 482-486) . El BTG1 es responsivo del estrés (Fiedler et al., 1998, Biochem. Biophys. Res.

Commun. 249 : 562-565) y es también inducido en diferentes lineas celulares por la lesión al ADN, factores de crecimiento y promotores del tumor (Fletcher et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 14511-14518) . El BTG2 mostró ser inducido por p53 al nivel de la transcripción (Rouault et al., 1996, Ibid.) , pero es inducible por doxorubicina en células p53-/-, no obstante a un grado inferior que en las células de tipo silvestre. La proteina 6 de enlace a IGF (IGFBP-6) , un inhibidor secretado de la función IGF y crecimiento celular del tumor (Bach, 1999, florín. Metab. Res. 31: 226-234; Sueoka et al., 2000, Oncogene 19: 4432-4436) , mostró ser inducible por retinoides al nivel de la transcripción (Dailly et al., 2001, Biochim. Biophys. Acta 1518: 145-151) . La inducción de IGFBP-6 por doxorubicina no mostró dependencia en p53. La anfiregulina es un factor relacionado con EGF que mostró inhibir el crecimiento de varias lineas de célula de carcinoma, mientras promueve el crecimiento de células epiteliales normales (Plowman et al., 1990, Mol. Cell Biol. 10: 1969-1981). La anfiregulina es el objetivo principal de la inducción transcripcional por el gen supresor del tumor Wilms WT1 (Lee et al., 1999, Cell 98: 663-673) y es inducible por la vitamina D3 (Akutsu et al., 2001, Biochem. Biophys. Res. Commun. 281 : 1051-1056) . La inducción de anfiregulina por doxorubicina mostró solamente dependencia moderada en p53. El MIC-1 (pTGF-3/PLAB/PDF/GDF15) , un elemento inhibitorio de crecimiento secretado, de la superfamilia TGF-ß, mostró ser inducible por p53 al nivel de transcripción (Tan et al., 2000, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97: 109-114) y fue sugerido por ser un mediador clave los efectos de inhibición de crecimiento paracrino de p53 ( annan et al., 2000, FEBS Lett. 470 : 77-82) . De manera sorprendente, la inducción de MIC por doxorubicina, mostró débil dependencia en p53. La Maspina, un inhibidor de proteasa serina secretada, ha sido identificado como un supresor del tumor, cuya es presión está perdida en muchos cánceres de mama avanzados (Domann et al., 2000, Int. J. Cáncer 85: 805-810) . La Maspina muestra inducción muy fuerte por la lesión de ADN al nivel de la proteína en células HCT116 tratadas con doxorubicina, y otros; Zou et al. (2000, J. Biol. Chem. 275: 6051-6054), mostró inducción de maspina por tratamiento con fármaco en cuatro de otras lineas celulares de tumor. La expresión de Maspina es inducida al nivel transcripcional por p53 (Zou et al., íbid.) . Aunque el p53 agénico disminuye fuertemente la inducción de Maspina por doxorubicina, tal inducción es todavía fácilmente detectable en células p53-/-. La EPLIN (Pérdida de Proteína Epitelial en Neoplasmas), una proteína citoesqueleto de unión a actina, es expresada en casi todos los tejidos epiteliales normales, pero regulada descendentemente en 20 de 21 líneas de células de carcinoma probadas. EPLIN inhibe la proliferación celular, haciendo un supresor de tumor putativo (Maul & Chang, 1999, Oncogene 18: 7838-7841). EPLIN es inducido no solamente en la población senescente de células HCT116 tratadas con doxorubicina, sino también en células de carcinoma de mama MCF7 que se someten a detención de crecimiento similar a senescencia después del tratamiento con retinoides. Entre todos los genes en este grupo, la EPLIN muestra la inducción más débil por doxorubicina en las células no clasificadas; esta inducción es aún además disminuida en células p21-/- y p53-/-. Aunque esté patrón hace potencialmente difícil detectar la inducción EPLIN después del tratamiento del fármaco, el fuerte incremento en la expresión de EPLIN en la población clasificada de células senescentes, sugiere que esta inducción puede ser un marcador particularmente especifico de senescencia. Las secuencias promotoras funcionales han sido publicadas para todos estos genes: BTG1 (Rodier et al., 1999, Exp. Cell Res. 249: 337-348), BTG2 (Fletcher et al., 1991, ibid.) , IGFBP-6 (Dailly et al., 2001, ibid.) , anfiregulina (Lee et al., 1999, ibid.), Maspina (Zou et al., 2000, ibid.), MIC-1 (Tan et al., 2000, ibid.), EPLIN (Gao et al., 2000, J. Celi Physiol. 184: 373-379; EPLIN tiene dos promotores alternativos; el promotor preferido es el promotor que corresponde a la isoforma ß más larga que está preferencialmente expresada en células HCT116 y MCF7. La transcripción de los genes correspondientes está regulada por varios factores (lesión al ADN, suero, agentes de diferenciación, ésteres de forbol, supresores del tumor) , a través de los elementos cis-regulatorios en sus promotores . Además, la Maspina ha mostrado ser silenciada en cánceres de mama al nivel de metilación del promotor (Domann et al., 2000, ibid.). De este modo, se puede esperar que los cambios asociados con la senescencia en la expresión de estos genes, sean reproducibles en los constructos promotores. Substancialmente, todos estos promotores portan varios sitios cis-regulatorios comunes, que incluyen AP-1, AP-4 EL 1 y GATA, como se revela por la examinación de los sitios de enlace al factor de transcripción en las secuencias promotoras correspondientes, usando el programa Matlnspector V2.2 basados en la base de datos TRANSFAC 4.0. Junto con la co-regulación observada de estos genes en la senescencia inducida por fármaco, estas observaciones soportan la probabilidad de identificar agentes que estimularán todo o la mayoría de estos genes al mismo tiempo. Los constructos del gen reportero son preparados por métodos de clonación tradicional o por amplificación de reacción en cadena de la polimerasa (RCP) de secuencias promotoras usando cebadores designados de secuencias de flanqueos de los promotores correspondientes y ADN genómico humano como plantillas. Las secuencias promotoras son clonadas corriente arriba de un gen reportero adecuado, el más conveniente el cual es empleado tanto como un marcador seleccionable como la base para HTS. Un reportero comercialmente disponible que comprende una quimera de proteína fluorescente verde y luciferasa es más adecuado para este propósito. Este reportero es una proteína quimérica formada por la forma Mejorada de la Proteína Fluorescente Verde (GFP) (comercialmente disponible de Clontech) , al extremo amino ' terminal, fusionado con luciferasa de luciérnaga al término carboxilo. Este reportero quimérico proporciona fuerte fluorescencia GFP y alta sensibilidad de los ensayos quimioluminiscentes basados en luciferasa. Este gen es clonado en vectores menos promotores en una orientación que un sitio de clonación conveniente o múltiples sitios de clonación, están operablemente ligados al extremo 5' del gen reportero, de manera que los promotores de los siete genes asociados con la senescencia, pueden ser fácilmente insertados y con ello, operablemente ligados al gen reportero. Varios de los genes probados se conocen por ser inducibles por p53. Para seleccionar compuestos que activan los inhibidores del crecimiento asociados con la senescencia a través de mecanismos independientes de p53, las lineas celulares deficientes en p53 serán usadas para selección. La linea celular primaria es un derivado p53-/- de células de carcinoma de colon HCT116 (Bunz et al., 1998, Science 282 : 1497-1501) , como se describe anteriormente. Los constructos promotores que muestran resultados positivos en esta linea celular, son entonces probados en otros tipos de células de tumor deficientes de p53, para confirmar que la inducción de estos promotores no es única a las células HCT116 (la responsabilidad de daño en un número de lineas celulares ya • ha..sido demostrada por BTG1, BTG2 y Maspina, y la capacidad de inducción retinoide ' en lineas de carcinoma de mama, se mostró por EPLIN e IGFBP-6) . Son usadas las lineas celulares de tumor imitadas p53, particularmente aquellas lineas celulares que desarrollan el fenotipo senescente después del tratamiento con doxorubicina, que incluyen carcinoma de colon SW480, glioma U251 y osteosarcoma Saos2 (como se describe por Chang et al., 1999b, ibid) . También usado en este ensayo, esté un derivado de fibrosarcoma HT1080, en donde la función p53 ha sido completamente inhibida con el elemento supresor genético derivado de p53 GSE56 (como se describe por Chang et al., 1999a, ibid). Estos constructos promotores-reporteros, son usados inicialmente en ensayos de transíección temporal para la inducción de la actividad de luciferasa por tratamiento con doxorubicina. Para normalización, los constructos de prueba son mezclados con un constructo que porta un gen reportero diferente bajo un promotor constitutivamente expresado (por ejemplo, ß-galactosidasa transcrita del promotor CMV) . Estas mezclas son transfectadas (usando electroporación) en células HCT116 p53-/-, las cuales son entonces ya sea tratadas o no tratadas con 200 nM de doxorubicina. La actividad de luciferasa de luciérnaga y el gen reportero de control (ß-gal) , se determinó usando kits de ensayos comercialmente disponibles, y los valores normalizados de la actividad de luciferasa de luciérnaga, se compararon entre las células tratadas y no tratadas. Los constructos promotores que proporcionan la expresión más alta y la mejor inducción, son determinados a partir de estos ensayos. Varios constructos promotores que muestran al menos 3 veces inducción en ensayos de transfección temporal, son transfectados en células HCT116 p53-/-, y lineas celulares establemente transfectadas seleccionadas con puromicina. Alrededor de 100 transfectantes clónales de cada constructo de prueba, son aislados y expandidos al tamaño cercano a 100,000 células. En esta etapa, las lineas escogidas son seleccionadas por actividad por doxorubicina en ensayos de placas de 96 cavidades (como se describe en más detalla abajo) . Las lineas celulares mejor inducibles, son expandidas y subsecuentemente caracterizadas por pruebas repetidas para inducción tanto de GFP como de luciferasa. Las lineas de células reporteras se seleccionan para maximizar el nivel absoluto de expresión de ' luciferasa inducida, mientras retiene una inducción de partes altas, debido a que la expresión de luciferasa absoluta alta, minimiza el número de células requeridas para producir una señal detectable en ensayos HTS. Una vez desarrolladas, estas lineas celulares óptimas son analizadas con respecto al curso del tiempo y a la dependencia de dosis de doxorubicina de la expresión del reportero y probadas para verificar la especificidad de senescencia de la expresión. El último análisis se realiza etiquetando células con PKH26 (un fluoróforo relacionado con P H2, pero que tiene una longitud de onda de emisión que cambia a roja) , seguida por tratamiento con doxorubicina y liberación en el medio libre de fármaco. Entre 6-7 dias después de la liberación, las células son analizadas con FACS por análisis de dos colores para la fluorescencia GFP y PKH26. La fluorescencia GFP selectivamente asociada con células PKH26'" (senescentes) , esté con ello determinada sin clasificación física. Finalmente, la capacidad de inducción de la expresión del reportero en las líneas celulares seleccionadas, se prueba con agentes que inducen senescencia distintos de doxorubicina, otros agentes, tales como radiación por ionización, cisplatina, afidicolina o citarabina (Chang et al., 1999b, ibid) . La línea de células reporteras primaria para la selección del compuesto subsecuente, es de este modo generada, y las líneas celulares secundarias que expresan el reportero de los promotores de diferentes genes, pueden ser usadas para ensayos confirmatorios. La línea celular reportera primaria desarrollada como se describe anteriormente, es usada para desarrollar el ensayo HST. La naturaleza de luciferasa GFP dual del gen reportero, es especialmente conveniente para conducir ensayos de selección usando el ensayo quimioluminiscente a base de • ¦ luciferasa . más sensitiva, y la fluorescencia de GFP, para confirmar que el efecto de un compuesto probado no es debido a la influencia artificial en el ensayo de luciferasa. La selección primaria se llevará a cabo usando las condiciones de ensayo establecidas para doxorubicina y otros agentes que inducen senescencia, y de manera similar a los procedimientos usados por otros investigadores para la selección a base de luciferasa de bibliotecas químicas (Sohn et al., 2001, Ann. Surg. 233: 696-703). Alícuotas de 1 irú de base de cada compuesto en una biblioteca de compuesto, son agregadas a una concentración final de 2 uM en una serie de tres placas de 96 cavidades que contienen medio de cultivo celular. Estas placas de 96 cavidades son entonces sembradas con las células reporteras e incubadas a 37 °C por el periodo de tiempo requerido, con al menos, dos cavidades de control negativo libres de reactivo y dos cavidades de control positivo que contienen doxorubicina por placa. Después de la incubación, las placas son leídas (sin manipulaciones adicionales) en .el lector de fluorescencia, para identificar las cavidades con incremento substancial en la actividad GFP. Las mismas placas son entonces procesadas para el ensayo de luciferasa y leídas en un luminómetro de microplaca. Las lecturas del luminómetro en tres placas son usadas para identificar candidatos positivos, y comparadas con los resultados de la fluorescencia de GFP. Los compuestos positivos son probados nuevamente en otra serie de ensayos previo a la selección secundaria. La naturaleza de los ensayos para la actividad de luciferasa y GFP incrementada, los cuales necesitan ser expresados en células vivas durante el curso del ensayo, debe eliminar compuestos altamente citotóxico de la lista de candidatos. Los compuestos que se marcan como positivos en el análisis primario, son probados por su efecto en la expresión de diferentes genes asociados con la senescencia. Algunos de estos ensayos se llevan a cabo usando lineas de células establemente transíectadas, en donde el gen reportero es accionado por promotores de otros genes que lo de la linea del reportero primario. Estos simples ensayos de activación de reportero son efectivos si un número muy grande de positivos se detectan en el ensayo primario. Una segunda linea de reporteros puede ser usada para limitar el número de compuestos a aquellos que son activos con más de un promotor. Si el número de compuestos positivos después de la selección primaria es bajo, sin embargo, esta etapa de selección secundaria es innecesaria y los compuestos positivos son usados para el análisis directo de los compuestos en la expresión del gen. En adición y previo a la selección adicional extensiva, se determina la concentración minima del compuesto que produce un fuerte incremento en el ensayo reportero. Esta concentración es también probada en células HCT116 p53-/- por su efecto en la expresión de los genes asociados con la senescencia endógena. En estos ensayos, el ARN es extraído antes y después del tratamiento, y se analiza la expresión de diferentes genes asociados con la senescencia, por ejemplo, por TI-RCP cuantitativo (como se describe por Noonan et al., 1990), que permite los niveles de expresión para genes múltiples entre una serie de muestras de ARN a ser comparadas. Un ensayo único de TI-RCP usa alrededor de 50 ng de ARN celular total, lo cual hace posible llevar a cabo 100 ensayos que parten desde 5 g de ARN total, una cantidad que es típicamente usada para una linea única en la hibridación northern. En este ensayo, la ß-actina es usada como un estándar de normalización, puesto que su expresión es inalterada en células senescentes, de conformidad con los manchados northern y western. Los cebadores de TI-RCP y condiciones de ensayo para 63 genes que son sobre o regulados descendentemente en senescencia acelerada inducida por doxorubicina (Chang et al., 1999a, ibid) r se describen en la Tabla 3. Estos ensayos son usados para probar si los compuestos positivos pueden activar no solamente los genes inhibitorios del crecimiento que son descritos anteriormente, sino también otros reguladores del crecimiento asociados con la senescencia, tales como WIP1, CD44, Jaggedl y también varios genes que se conocen por ser regulados descendentemente en cánceres con relación a células normales y después sobre regulados en células de tumor senescente, tales como P-cadherina, desmoplaquina y desmoyocina. Los últimos genes son probablemente co-regulados con los inhibidores de crecimiento asociados con la senescencia que son regulados descendentemente en cánceres (tales como EPLIN o aspina) . Por otro lado, se espera encontrar que los compuestos no inducirán p21 o las proteínas potencialmente patogénicas que son sobre reguladas en senescencia inducida por doxorubicina, tal como factores que promueven el tumor secretado, TGFoc, CYR61 y prosaposina, proteasas tales como calicreina-7 o calpaina L2 y proteínas que forman placa, tales como precursor ß-amiloide del Alzheimer y BRI . Los compuestos positivos son también ensayados por los efectos de los compuestos en genes que son regulados descendentemente en células senescentes, tales como proteína de la transmembrana específica del tumor STEAP, y genes involucrados en la proliferación celular (por ejemplo, Ki-67, Topoisomerasa lia, CDC2, PLK1, MAD2, timidilato sintetasa, reductasa de ribonucleótido MI) . La inhibición de los últimos genes será indicativa de un efecto citostático del compuesto probado, el cual será probado en ensayos separados (véase abajo) . Si este análisis revela un compuesto que tiene el efecto deseado en la expresión del gen, se realizan análisis para determinar como el compuesto afecta el crecimiento. Este aná'lisis se llevará a cabo tanto por ensayos de proliferación celular estándar, como por un ensayo que evalúa los componentes citostáticos y citotóxicos del efecto antiproliferativo . En este ensayo, las células son etiquetadas con PKH2, tratadas con el compuesto de prueba ya sea continuamente o por un periodo limitado de tiempo (por ejemplo, 24 horas), y analizados después del periodo de tiempo que corresponde a tres duplicados celulares. Para este análisis, las células unidas y flotantes serán combinadas y teñidas con yoduro de propidio (IP), el cual tiñe solamente las células comprometidas con la membrana (muertas) . Las células teñidas son entonces analizadas por FACS para cambios en la fluorescencia PKH2 y para la fracción de células positivas PI, después de la muestra de control de células no tratadas que fueron etiquetadas con PKH2 al mismo tiempo. La fluorescencia PKH2 incrementada con relación a las células de control, indica la inhibición de la división celular (efecto citostático) y la fracción PI+ incrementada indica el efecto citotóxico. Los compuestos con efecto preferencialmente citostático (distinto del citotóxico) , en células de tumor son de particular interés, debido a que tal efecto se espera de la activación especifica del programa de senescencia. Si se encuentra un compuesto prototipo con las propiedades deseadas, se prepara una biblioteca de derivados de este compuesto, el cual es entonces seleccionado para encontrar agentes más efectivos. Tales agentes son evaluados como fármacos prototipos por estudios preclinicos.

EJEMPLO 5 Construcción de Constructos del Gen Reportero Promotor y Selección para Agentes que Previene la Inducción de Genes Patogénicos Asociados con Senescencia Inducida por Agentes Anti-cancerígenos Los resultados descritos aquí muestran que ciertos genes son inducidos por tratamiento con fármacos citotóxico que han sido asociados con enfermedades de efectos estimulantes del crecimiento paracrino y de enve ecimiento, especialmente estimulación del crecimiento de células de tumor. Estos genes incluyen ciclina DI, cinasa inducible del suero, CYR61, prosaposina, factor ot de crecimiento de transformación (TGF ) , calicreina 7, calpaína-L2, neurosina, activador del plasminógeno, urocinasa, proteína precursoras beta amiloide (A4) (ß???), y proteina 2B de membrana integral (BRI/ITM2B) . Los promotores de estos genes pueden ser usados para hacer constructos del gen reportero en maneras similares como se describe en el Ejemplo 4 para otros genes asociados con la senescencia. Estos constructos pueden entonces ser usados para el ensayo de inducción del gen reportero por tratamiento de fármaco citotóxico en la presencia y ausencia de un compuesto de prueba. Las secuencias promotoras funcionales han sido publicadas para todos estos genes: ciclina DI (Motokura & Arnold, 1993, Genes Chromosomes Cáncer 7: 89-95); CYR61 (Latinkic et al., 1991, Nucleic Acids Res. 19: 3261-7); prosaposina (Sun et al . , 1998, Gene 218 : 23-34); factor a de crecimiento de transformación (TGFa; Raja et al., 1991, Mol. Endocrinol. 5: 514-20); calicreina 7 (Yousef et al., 2000, Gene 254: 119-128); calpaína-L2 (Suzuki et ai., 1995, SioJ Chem Hoppe Seyler. 376: 523-9) ; urocinasa del activador del plasminógeno (Riccio eü al., 1985, Nucleic Acíds Res. 13: 2759-71) ; y proteina precursora beta amiloide (A4) (ß???; Lahiri & Robakis, 1991, Brain Res. Molec. Brain Res. 9: 253-257) . Los constructos del gen reportero se preparan por modificación de los métodos descritos en el Ejemplo 4. La senescencia se induce en células transfectadas temporal y establemente, típicamente poniendo en contacto las células con una concentración que induce la senescencia de doxorubicina u otro agente citotóxico. Estos experimentos son usados para establecer niveles de inducción del gen reportero en la ausencia de un compuesto de prueba. Los constructos promotor-reportero son probados por su capacidad de inducción por doxorubicina bajo condiciones que activan los genes correspondientes. Los constructos promotores mejor regulados son usados para desarrollar lineas celulares establemente transíectadas, y lineas celulares identificados que tiene la inducción más fuerte del reporteo bajo condiciones de tratamiento de fármaco, como se describe en el Ejemplo 4. También se realizaron experimentos en la presencia de un compuesto de prueba de manera idéntica como los experimentos realizados en la ausencia del compuesto de prueba. Los experimentos son típicamente realizados a una variedad de concentraciones del compuesto de prueba en células inducidas con la misma concentración de agente citotóxico, y expresión del gen reportero determinada y comparada con la expresión del gen reportero en células inducidas con aquella concentración de agente citotóxico en ausencia del compuesto de prueba. Los resultados de estos experimentos identifican compuestos de prueba que reducen, inhiben o previenen la inducción asociada con la senescencia de genes asociados que la senescencia que promueven la enfermedad en células tratadas con un fármaco citotóxico, y concentraciones efectivas de los mismos. Estos resultados proporcionan compuestos empleados para prevenir la inducción de genes que promueven la enfermedad, particularmente, que estimulan el crecimiento de células de tumor, como una consecuencia de senescencia inducida por agente citotóxico asociada con tratamientos cancerígenos convencionales. Se debe entender que la descripción anterior enfatiza ciertas modalidades específicas de la invención y que todas las modificaciones o alternativas equivalentes a esta, están dentro del espíritu y ámbito de la invención como se expone en las reivindicaciones adjuntas.

Tabla 1. Genes regulados descendentemente en senescencia con relación a las fracciones celulares de proliferación en células HCT116 separadas después del tratamiento con doxorubicina (genes confínnados por TI-RCP se muestran en negritas) Número de Efectos de" : Nombre del Gen Notas acceso p53 fi21 Factores y cofactores de transcripción HFH-1 l/Trident/Win/IVIPP2 U74612 4-' Regulador de crecimiento celular positivo , regulado descendentemente en envejecimiento -3.3 AND-1 AJ006266 repetición WD, cuadro HMG -2.4 Proleina 1 de reconocimiento específico de estructura (SS P1) M86737 Factor de elongación de transcripción -2.3 Acetitransferasa de histona 1 (HAT1) AF030424 V Cofactor de transcripción -2.1 Proteína dedo de cinc, ligado a Y (ZFY) M30607 Determinación en testículos -2.1 Mitósis segregación de ADN Antiseno l-67 X65S50 ld Condensación de cromatina -4.9 Homólogo de condesóla XCAP-C NM_005496 Condensación de cromatina -4.2 Proteina F de centrómetro (CENP-F) Componente de cinetonúcleo, regulado NM_005196 descendentemente en envejecimiento -3.8 Homólogo de condesina XCAP-H D38S53 V Condensación de cromatina -3.7 BUBR1/BUB1B AF053306 V Cinetonúcleo, control de punto de verificación de huso -3.6 Proteína que enlaza al ADN similar a cinesina (Kid/Obo-2) AB017430 Cinetonúcleo -3.1 ???-1/???-2 NM_004217 4-1 Regulador centrosomal -3.1 Receptor de Lamina B L25941 i* Montaje de cubirta nuclear -3 Centrosoma; protección de apoptósis asociada con Inhibidor de apoptósis 4 (survivina) . U75285 ." mitosis -2.9 CDC2 X05360 i¡ Iniciación de mitosis -2.7 CDC20 AW41 1344 · Activación APC/ataque de anafase, regulación descendente de envejecimiento -2.6 Proteína 1 similar a cinesina mitotica H63163 Movimiento de huso -2.5 Proteina E centrómetro (CENP-E) Z 15005 F" Cinetonúcleo -2.5 Interactor ZW10 (hZwint-l/MPP5) AW409765 V Cinetonúcleo -2.5 Interactor 13 del receptor de la hormona Tiroide eína de punto de verificación (TRIP13)/proteina que enlaza HPV16 El AA134541 4' Homólogo de una prot de paquiteno de levadura -2.4 Cáncer 1 de mama (BRCA1) Regulador de duplicador de centrosoma, tumor L78833 supresor -2.3 Homólogo de proteína (Rod) de distribución basta de Drosojihila AFO70553 Segrecación de cromosoma -2.3 soma, protooncógeno 5 AIK-1/AIM-2/STK15 N _003600 4' Regulador de centro amplificado en canceres -2.1 MAD2 NM 002358 V V Cinetonúcleo, control de punto de verificación huso -2.1 Topoisomerasa lia AF071747 4' Segregación de cromosoma y ADN -2.1 Lamina B2 M94363 41 Montaje de cubierta nuclear -2.1 Pcricentrina AI970199 Centrosoma -2 Timopoyetina U18271 4' Montaje de cubierta nuclear -2 Proteína 5 de enlace a FK506 Homólogos para el roedor TP2 involucrado en U71321 condensación cromática de testículo específico -2 Cinasa similar a polo (PL 1) , U01038 4' Iniciación de controles y varias etapas de mitosis regulación descendente en envejecimiento NDe RepUeacióti de ADN/mont je de cromatina Reductasa de ribonucléotido MI (RRM1 NM_001033 4' Síntesis de Nucléotido -3.4 Proteína 1 del grupo de alta movilidad (HMG1) AW160834 4' Componente de cromatina -3.4 Cinasa de Timidina 1 NM 003258 4l Síntesis de Nucléotido -3.3 CM7/CDC47 D55716 44 4' Componente del factor que permite la replicación -3.3 Sintasa de timidilato NM_001071 4' Síntesis de nucléotido, regulación descendente -3.2 en envejecimiento MC 2(miotina) A 264268 IA Componente del factor que permite la replicación -2.8 Factor de replicación C (activador 1) (36.5kD) AI65 I635, mación del fijador PCNA -2.7,- AW651734 4" For 2.4° Proteína 2 del grupo de alta movilidad (HMG2) Componente de cromatina, regulación descendente X62534 44 4' en envejecimiento -2.5 Proteína de replicación A3 (14kD) NM_002947 4d Proteína de enlace al ADN de una hebra, 15 involucrada en replicación y restauración -2.1 Hidrolasa de gama-glutamilo (Hidrolasa de folilpoligamaglutamilo) NM_003878 Regulador del metabolismo folato -2 MC 3 NM 002388 4d Factor de replicación -2 t Restauración de ADN HEX1 (homólogo RAD2 AF042282 Exonucleasa -3.7 Endonucleasa flap 1 (homólogo FEN 1 , RAD2) AW246270 Exonucleasa, regulación descendente en envecejimiento -3 Homólogo RAD 51 D14134 Similar a E. coli RecA -2.4 Fusión de liposarcoma maligna T(12;16) (TLS/FUS) S62I40 id Retioide inhibido, protooncogéno -2.2 Tráfico/procesamiento de ARN Ribonucleoproteína nuclear heteróloga Hl NM 005520 -2.1 Protefna acídica rica en leucína (AFRIL) Y07570 Estabilidad de ARN -2.1 Factor Im de desdoblamiento Pre-ARNm (25kD AA738354 -2 Ribonucleoproteína nuclear heteróloga G Z23064 -2 Ribonucleoproteína nuclear heteróloga A2/B1 NM 002137 id -2 Ribonucleoproteína nuclear heteróloga Al AA173135 -d -2 Proliferación asociada Gen 1 que induce insulina (INSIG1/CL-6) AW663903 Regeneración de hígado -2.3 Receptor de motididad mediado por hialuromana (RHAMM) U29343 ll Motilidad celular, actividad oncogénica -2.1 Respuesta primaria FSH (LRPR1) NM 006733 Respuesta proliferativa FSH -2.1 10 Proteína epitelial de sies membranas de la Sobreexpresión en carcinoma, transportador próstata (STEAP) AC004969 potencial de membrana -2.1 Oíros Rabcinesina-6 NM 005733 Golgi, transportador celular -3 Cinasa 1 relacionada a Vaccinia Fosforilación p53, interferencia Mdm-2 AA312869 ld -3 posible Cinasa de proteína C, teta L07032 Transducción de señal -2.4 Proteína que porta ubiquitina AI571293 Proteólisis, regulación descendente en envccecimiento -2.2 lActina, yl NM 001614 -2.1 KIAA0008 DI 3633 i1 -4.6 15 KIAA0101 D14657 i4 -4 KIAA0056 AF070553 -2.3 KIAA0225 D86978 -2.1 a Cambios conocidos en la expresión del gen después de la sobre expresión ectópica de p53 o p21 " B.D.E. expresión diferencial balanceada (de análisis de hibridización Incyte UniGem V 2.0), en casi todos los casos, causa sobre estimaciones de la diferencia de veces actual observada por TI-RCP 0 dos clone en el arreglo, se encontraron ser derivados del mismo gen, se myestran los valores B.D.E. para ambos clones ? efecto de inducción de p21 en células de fibrosarcoma HT1080, como se determina por hibridación de microarreglos (nuestros datos no publicados, no se incluyen en el reporte originan). e no se detectó por hibridación de microarreglo, pero se identificó por TI-RCP LISTA DE REFERENCIAS , 10 1. B. D. Chang ct al., Proc. Nati. Acad. Sci.USA 97, 4291-4296 (2000). 2. H. Ye, A. X. Holterman, K. W. Yoo, R. R. Franks, R. H. Costa, Mol.Cell Biol. 19, 8570-8580 (1999). 3. D. H. Ly, D. J. Lockhart, R. A. Lemer, P. G. Schultz, Science 287, 2486-2492 (2000). 4. R. Zhao et al., Genes Dev. 14, 981-993 (2000). 5. K. Katuian, N. Amariglio, G. Rec avi, D. Oivol, FEBS Lett. 470, 77-82 (2000). 6. P. Arizti el al., Mol.Cell Biol. 20, 7450-7459 (2000). 7. H. Zhou etal., Nal.Genet. 20, 189-193 (1998). 8. D. Perrotti et al., EMBOJ. 17, 442-4455 (1998). 9. C. L. Hall et al., Cell 82, 19-26 (1995). 10. R. S. Hubert et al., Proc Naíl.AcadSci. U.S.A 96, 14523-14528 (1999). 15 Tabla 2. Genes sobre regulados en senescencia con relación a las fracciones celulares de proliferación en células HCT116 separadas después del tratamiento con doxorubicina (genes confirmados por TI-RCP se muestran en negritas) Tabla 2A Nombre del Gen ' Número de Efecto de : Notas B.D.E. Acceso p53 Eli Factores de transcripción Proteína 1 de enlace al cuadro X (XBP-l/HFT/TREB) AW021229 Dominio ZIPb, familia C-Jun, dimerizado con Fos 3.9 Activación del factor de transcripción 3_(ATF3) N39944 T2 Domino ZIPb, dimerizado con c-Jun 3.3 C-JUN AI078377 AP-1, respuesta al estrés 2.5 Factor de dominio est, expresado en tejidos linfoides ELF-1 AW503166 y epiteliales 2.4 Proteina 3 del ¡millo del dedo (RNF3) AA403225 Homólogo del regulador 73Ah de Drosophila 2.3 Homólogo de proteína de Drosophila muscleblind B AF061261 Proteina de dedo de cinc tipo C3H ( BLL) 2.3 10 Dominio HMG, retinoide inducible , involucrada en SOX9/SRY (región Y que determina el sexo) NM_000346 diferenciación de condrocito , 2.2 Antígeno A2 del síndrome Sjogren (60kD, egulador de transcripción putativo ribonucleoproteína SS-A/Ro) U44388 R 2.1 Proteina de enlace al elemento promotor del núcleo Factor de transcripción similar a Kruppel, (CPBP/ZF9/KLF8) AL037865 que activa el promotor de ceratina 4 2 inhibidores de crecimiento, intraceltilar Pérdida de Proteína Epitelial en Neoplasma (EPMIN) AL048161 Disminución en carcinoma múltiple 3.5 Gen 1 de traslocación de célula B (BTG1) AI560266 Supresor de tumor 2.8 Gen 2 de traslocación de célula B (BTG2) NM 006763 Supresor de Tumor 2.1 WIP1 Fosfatasa de proteína inducible p53 NM_003620 2 Inhibidores de crecimiento, secretados 15 Inhibidor de protcasa de serina, regulación descendente en AA316156, Masplna neoplasmas, inhibidores de crecimiento de tumor, metástasis 5.2, AI435384 angiogénesis , regulación descendente en envejecimiento 3.3C Transporte de ion e intercambio de ion similar a Fosfoleman, 8kD ( AT-8) AA826766 Activador del canal de cloruro 2.3 Ferrina, polipéptido 1 pesado AW575826 †d Almacenaje de hierro 2.8 Caveolina 2 AI093287 Capacidad de compartimiento de la membrana 2.2 Neurogranina Y09689 †d Proteína de enlace a calmodulina, neural 2.2 Canal de cloruro Hl AI381979 Colocalizas con caveolina 2 Tráfico, cüoesqueleto y andamiaje mtracelular Proteina 56 que induce Interferona (IFI-56K P56) NM 001548 Proteína de tetratricqpéptido, interación Int6 3.2 Proteina de envida principal (proteína de defensa del múltiples fármacos pulmón, LRP) X79882 Respuesta al estrés, resistencia a 2.4 Macroflna (proteína similar a filamente de actina AB029290 Citoesqueleto 2.4 transveral y micofilamento) Proteína 1 B asociado com microtubo ( AP IB) L06237 Citoesqueleto, sustrato C 2 2 Proapoptótico NOXA D90070 †46 Miembro de la familia Bcl2 2.7 Antigeno Fas/APO-1 M67454 †47 Receptro de señal apoptótico 2.3 Ceratinas Ceratina 18 X12881 antiapoptótico 4 Ceratina 8 X74929 Antiapoptótico 3.4 Ceratina 2A AF019084 2.9 I 3955, 2.6 Ceratina 7 AA307373 2.1° Ceratina 15 NM 002275 2.3 Ceratina 6B L42611 2.1 Otros Homólogo HMG2 de proteína del grupo de alta movilidad AI191623 5.4 Homólogo ISNRP de ribonucleoproteína de poco Ul AI400786 3.7 Retinaldehido deshidrogenasa 3 U07919 Síntesis de ácido retinoico 3.2 (ALDH6/RALDH3) ¦Proteina de transmembrana, homólogos para Tumor diferencialtnente espresado 1 (TDE1) N _006811 incremento de gen de ratón en tumores testiculares 2.4 Apolipoproteína E K00396 Alzheimer's, aterosclerosis 2 Incito EST X62654 2.1 mARN humano 23815 U909I 6 2.1 5 Tabla 2B Reguladores de crecimiento, intracehdar Inhibidor pleiotrópico de complejos ciclina-CDK, p21 (Wafl/Cipl/SdÍÍ) AA481712 †9 que inhiben o estimulan varios factores y cofactores 5.1 de transcripción M73554, 2.8, aclina DI (Bcl-1) †2S TRansición Gl/S, coregulado con p21 en X59798 canceres 2.2° Cinasa inducible con suero (Snk, similar a polo) NM 006622 Regulador de crecimiento celular putativo 2.2 Factores mitogénicos/anüapoptóticos, secretados CY 61 Y 12084 Factor mitogénico/angiogénico 3.3 Prosanosina †28 Mitogénico/angiogénico sobreregulado en J03015 envejecimiento 2.3 Factor a que transforma el crecimiento (TGFa) X70340 Mitogéno relacionado a EGF 2 Proteasa CuIIcreiiia 7 (proteasa de serbia 6) L33404 Sobreregulado en carcinoma de ovario 3.2 CaIoain-L2 M23254 2.3 Neurosina (proteasa de serbia 9, Zima, Proteasa Sobreregulado en canceres de mama , sobreregulado M) NM_002774 en carcinoma de ovario 2 Activador de plasminógeno, urocinansa DI 1 143 2 Otros Proteína precursora de beta amiloide (A4) (ß???) X06989 †28 Precursor amiloide de la enfermedad de Alzheimer 2 Proteina de membrana integral 2B (BRI/1TM2B) Precursor amiloide en demencia familiar AW131784 Británica 2 a Cambios conocidos en la expresión del gen después de la sobre expresión ectópica de p53 o p21 B.D.E. expresión diferencial balanceada (de análisis de hibridización Incyte UniGem V 2.0), en casi todos los casos, causa sobre estimaciones de la diferencia de veces actual observada por TI-RCP c dos clone en el arreglo, se encontraron ser derivados del mismo gen, se myestran los valores B.D.E. 5 para ambos clones d efecto de inducción de p21 en células de fibrosarcoma HT1080, como se determina por hibridación de microarreglos (nuestros datos no publicados, no se incluyen en el reporte originan ).

LISTA DE REFERENCIAS 1. A. M. Reimold et al., Genes Dev. 14, 152-157 (2000). 2. T. Ha¡, C. D. Wolfgang, D. K. Marsee, A. E. Alien, U. Sivaprasad, Gene Expr. 7, 321-335 (1999). 3. C. D. Wolfgang, G. Liang, Y. Okamoto, A. E. Alien, T. Hai, J.Biol.Chem. 275, 16865-16870 (2000). 4. D. Bohmann et al., Science 238, 1386-1392 (1987). 5. A. G. Bassuk, . P. Barton, R. T. Anandappa, M. M. Lu, J. M. Leiden, Mol.Med. 4, 392-401 (1998). 6. O. J. Marshall and V. R. Harley, Mol Genet.Metab 71 , 455-462 (2000). 7. W. Huang, U. I. Chung, H. M. Kronenbcrg, B. de Crombrugghc, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 98, 160-165 (2001). 8. J. Okano et al., FEBSLett. 473, 95-100 (2000). 9. W. S. El Deíry et al., Cell 75, 817-825 (1993). 10. G. P. Dotto, Biochim.Biophys.Acta 1471, M43-M56 (2000). 11. R. S. Maul and D. D. Chang, Oncogene 18, 7838-7841 (1999). 12. J. P. Rouault et al., EMBOJ. 1 1, 1663-1670 (1992). 13. J. P. Rouault et al., NatGenet. 14, 482-486 (1996). 14. M. Fiscella et al., Proc.NaÚ.Acad.Sci. U.S.A 94, 6048-6053 (1997). 15. Z. Zou et al., J.Biol.Chem. 275, 6051-6054 (2000). 16. F. E. Domann, J. C. Rice, M. J. Hendrix, B. W. Futscher, IntJ.Cancer 85, 805-810 (2000). 17. C. K. Lee, R. Weindmch, T. A. Prolla, NatGenet. 25, 294-297 (2000). 18. M. Tan, Y. Wang, K. Guan, Y. Sun, Proc.NatlAcad.Sci. U.S.A 97, 109-114 (2000). 19. P. X. Li et al., J.Biol.Chem. 275, 20127-20135 (2000). 20. Y. P. Dailly, Y. Zhou, T. A. Linkhart, D. J. Baylink, D. D. Strong, Biochim.Biophys.Acta 1518, 145-151 (2001). 21. G. D. Plowman et al., Mol. Cell Biol. 10, 1969- 1981 ( 1990). 22. S. B. Lee et al., Cell 98, 663-673 (1999). 23. P. Herrlich et al., Ann.N. Y.Acad.Sci. 910, 106-1 18 (2000). 24. L. Walker et al., Stem Cells 17, 162-171 (1999). 5 25. X. Chen, J. Bargonetti, C. Prives, C ncer Res. 55, 4257-4263 (1995). 26. J. S. de Jong, P. J. van Diest, . J. Michalides, J. P. Baak, MolPathol. 52, 78-83 (1999). 27. A. M. Babic, M. L. Kireeva, T. V. Kolesnikova, L. F. Lau, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A 95, 6355-6360 (1998). 28. B. D. Chang et al., Proc.Natl.Acad.Sc U.S.A 97, 4291-4296 (2000). 29. M. Hiraiwa, E. M. Taylor, W. M. Campana, S. J. Darin, J. S. O'Brien, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A 94, 4778-4781 (1997). 30. P. P. Mathur et al., Biochem.Mol.BioUnt. 34, 1063-1071 (1994). 31. T. H. Shin, A. J. Paterson, J. E. Kudlow, Mol.Cell Biol. 15, 4694-4701 (1995). 32. V. Kumar, S. A. Bustin, I. A. McKay, Cell Biol.Int. 19, 373-388 (1995). 33. H. Tanimoto et al., Cáncer 86, 2074-2082 (1999). 34. A. Aniso icz, G. Sotiiopoulou, G. Stenman, S. C. Mok, R. Sager, Mol.Med. 2, 624-636 (1996). 35. H. Tanimoto, L. J. Underwood, K. Shigemasa, T. H. Parmley, T. J. O'Brien, Tumour.Biol. 22, 11-18 (2001). 10 36. D. F. Jarrard et al, Clin.Cancer Res. 3, 2121-2128 (1997). 37. A. Hiraki et al., BrJ.Cancer 73, 1491-1497 (1996). 38. D. H. Ly, D. J. Lockhart, R. A. Lerner, P. G. Schultz, Science 287, 2486-2492 (2000). 39. T. Sasaki, C. Brakebusch, J. Engel, R. Timpl, EMBOJ. 17, 1606-1613 (1998). 40. F. Echtermeyer et al., J. Clin.Invest 107, R9-R14 (2001). 41. F. Sekiya, Y. S. Bae, D. Y. Jhon, S. C. Hwang, S. G. Rhee, J.Biol.Chem. 274, 13900-13907 (1999). 42. E. Shtivelman, F. E. Cohén, J. M. Bishop, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A 89, 5472-5476 (1992). 43. M. Fogel et al., Cáncer Lett. 143, 87-94 ( 1999). 44. J. C. Edwards, AmJ.Physiol 276, F398-F408 (1999). 45. J. Guo and G. C. Sen, J. Virol. 74, 1892- 1899 (2000). 46. E. Oda et al., Science 288, 1053-1058 (2000). 47. M. Muller et al., J.Exp.Med. 188, 2033-2045 (1998). 15 48. C. Caulin, C. F. Ware, T. M. Magin, R. G. Oshima, J.Cell Biol. 149, 17-22 (2000). 49. T. Mukhopadhyay and J. A. Roth, Anticancer Res. 16, 105-112 (1996). 50. M. Bossolasco, M. Lebel, N. Lemieux, A. M. Mes-Masson, MolCarcinog. 26, 189-200 (1999). 51. R. Vidal et al., Nature 399, 776-781 (1999).

Tabla 3 Secuencias Cebadoras de Amplificación por RCP SEC ID SEC ID Gen Sentido (5'-3') NO Antisentido (5'-3') NO Pericentrina CAGCCAGGTCTCCATTTTGT 21 AGCTTCGTCTCCCAGCATAA 83 PLK1 AAGAGATCCCGGAGGTCCTA 22 TCCCACACAGGGTCTTCTTC 84 Reductasa de robonucléotído MI ACCAGCAAAGATGAGGTTGC 23 GCATCGGGGCAATAAGTAAA 85 STEAP GCCCTTCAGAACTTCAGCAC 24 GCTCAATCCAGGCATCTTCT 86 ;Survivina GGACCACCGCATCTCTACAT 25 CTGGTGCCACTTTCAAGACA 87 TopoII a AGGTGGTCGAAATGGCTATG 26 CACTTCCCACCTGTGGTTTAC 88 ZWint (MPP5) CAGAACCAGTGGCAGCTACA 27 AATGATGGTTGGGAGGTGAG 89 Amfiregulina CATTATGCTGCTGGATTGGA 28 TCATGGACTTTTCCCCACAC 90 APR ÍNOXA) CCGGCAGAAACTTCTGAATC 29 GTGCTGAGTTGGCACTGAAA 91 ATF3 GCTGGAATCAGTCACTGTCA 30 GCCTTCAGTTCAGCATTCAC 92 bAPP CTCGTTCCTGACAAGTGCAA 31 TGTTCAGAGCACACCTCTCG 93 BRI AGAAGAGCCTGGTGTTGGTG 32 GCAAATAGGTTCCAGCCTTG 94 BTG1 CCGTGTCCTTCATCTCCAAG 33 TCCATAATCCATCCCCAAGA 95 10 BTG2 AACAGGCCACCACATACCTC 34 CTCTGCCCAGGACCTCATTA 96 Calpaina L2 GCAGGGATCTTTCACTTCCA 35 AGCTTGGGCAGTTGTCATTC 97 CD44 CTGCCGCTTTGCAGGTGTAT 36 TAGCAGGGATTCTGTCTGTG 98 C-JUN ATGAGGAACCGCATCGCTGCCT 37 GACCAAGTCCTTCCCACTCGTG 99 Ciclina DI AGGTCTGCGAGGAACAGAAG 38 AGCGTGTGAGGCGGTAGTAG 100 CYR61 GAAAGTTTCCAGCCCAACTG 39 TACACTGGCTGTCCACAAGG 101 ELF-1 TGTGGATCTAAGGGGAATGC 40 TCTTGCACCTGCTGTGTTTC 102 EPLI b AGAAAGGGGACCCTGACTGT 41 AAGATCCTCACCGTCCTTGA 103 FAS ÍAPO-1) ATTGCTCAACAACCATGCTG 42 GTTGCTGGTGAGTGTGCATT 104 IGFBP-6 AACCGCAGAGACCAACAGAG 43 GACCCCAAGCACAGCTTTAT 105 Intcgrina b4 GTGACTGTCCCCTCAGCAAT 44 CAGCAGGCACAGTACTTCCA 106 15 Jagged-l TGCCTCTGTGAGACCAACTG 45 TCACAATTCTGACCCATCCA 107 Ceratina 18 CAGCATGAGCTTCACCACTC 46 CTCCTTCTCGTTCTGGATGC 108 LRP AGATCATTCAGGCCACCATC 47 CCGACAGCACATACACATCC 109 SEC ID SEC ID Gen Sentido (5'-3*) NO Antisentido (5*-3') NO 5 MAC2-BP ACCATGAGTGTGGATGCTGA 48 ACAGGGACAGGTTGAACTGC 110 MASPIN CCCTATGCAAAGGAATTGGA 49 CAAGCCTGTGGACTCATCCT 111 MBLL TCCTGTTCCTTGGATTGGAC 50 AAAGTGGGCACTGGATGAAG 112 IC-1 CGGATACTCACGCCAGAAGT 51 CACATGGTCACTTGCACCTC 113 P21WAF GGAAGACCATGTGGACCTGT 52 ATGCCCAGCACTCTTAGGAA 114 P-caderina GTGACAGCCACAGATGAGGA 53 TTTGGCCTCAAAATCCAAAC 115 Propasina CCAGAGCTGGACATGACTGA 54 GTCACCTCCTTCACCAGGAA 116 PRSS6 Calicreina 7) ATGGCAAGATCCCTTCTCCT 55 GGTCAGAGGGAAAGGTCACA 117 10 PRSS9 (Neurosina) GGGGTCCTTATCCATCCACT 56 GGGATGTTACCCCATGACAC 118 R F3 AGACATCAAGGGGGAGACCT 57 CACCCAGAGGCAATGTTCTT 119 SOX-9 GGTTGTTGGAGCTTTCCTCA 58 TAGCCTCCCTCACTCCAAGA 120 Sindecano 4 TCGATCCGAGAGACTGAGGT 59 GGTTTCTTGCCCAGGTCATA 121 TGFa CAGGTCCGAAAACACTGTGA 60 AATTCTGTTGTGGGGAGGTG 122 VV1P1 CGACCTCGACTCACTCACAA 61 ATGGGGAAGGAGTCATCACA 123 XBP-1 TAGCAGCTCAGACTGCCAGA 62 ACTGGGTCCAAGTTGTCCAG 124 15 Se hace constar que con relación a esta fewcha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la practica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Método para identificar un compuesto que induce senescencia en una célula de mamífero, caracterizado porque el método comprende las etapas de : (a) cultivar la célula de mamífero en la presencia y ausencia del compuesto; (b) ensayar la expresión de al menos, un gen celular expuesto en la Tabla 2A en dicha célula en la presencia del compuesto con expresión de dicho gen en la célula en la ausencia del compuesto; y (c) identificar compuestos que inducen la senescencia cuando la expresión de al menos un gen celular en la Tabla 2A es superior en la presencia del compuesto que en la ausencia del compuesto. 2. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque, la célula de mamífero es una célula deficiente en p53. 3. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la célula de mamífero es una célula de tumor . 4. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la expresión del gen celular de la Tabla 2A se detecta por hibridación. a un ácido nucleico complementario . 5. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la expresión del gen celular de la Tabla 2A se detecta usando un reactivo inmunológico . 6. Método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la expresión del gen celular de la Tabla 2? se detecta por ensayo para la actividad del producto del gen celular. 7. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el gen celular es BTG1, BTG2 , EPLIN, WIP1, Maspina, MIC-1, IGFBP-6 o anfiregulina . 8. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la inducción de al menos uno de los genes celulares en la Tabla 2A es ensayado usando una célula de mamífero recombinante que comprende un gen reportero operablemente ligado a un promotor, a partir de un gen celular en la Tabla 2A y detectar la expresión incrementada del gen reportero en la presencia del compuesto que en la ausencia del compuesto. 9. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además, las etapas: d) ensayar la expresión de uno o más genes en la Tabla 2B; y e) identificar compuestos en donde la expresión de los genes en la Tabla 2B no es mayor en la presencia del compuesto que en la ausencia del compuesto . 10. Método . de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la expresión del gen celular de la Tabla 2B se detecta por hibridación a un ácido nucleico complementario . 11. Método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la expresión del gen celular de la Tabla 2B se detecta usando un reactivo inmunológico . 12. Método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la expresión del gen celular de la Tabla 2B se detecta por ensayo para la actividad del producto del gen celular. 13. Método para identificar un compuesto que induce senescencia en una célula de mamífero, caracterizado porque el método comprende las etapas de : (a) cultivar la célula de mamífero en la presencia y ausencia del compuesto; (b) ensayar la expresión de al menos, un gen celular expuesto en la Tabla 2A en dicha célula en la presencia del compuesto con expresión de dicho gen en la célula en la ausencia del compuesto; (c) ensayar la célula de mamífero recombinante para crecimiento celular y características morfológicas de senescencia; y (d) identificar compuestos que inducen la senescencia cuando la expresión de al menos un gen celular en la Tabla 2? es superior en la presencia del compuesto que en la ausencia del compuesto, y las células son inhibidas en crecimiento y expresan características morfológicas de senescencia en la presencia del compuesto. 14. Método de conformidad con la reivindicación 13 , caracterizado porque la célula de mamífero es una célula deficiente en p53. 15. Método de conformidad con la reivindicación 13 , caracterizado porque la célula de mamífero es una célula de tumor . 16. Método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la expresión del gen celular de la Tabla 2A se detecta por hibridación a un ácido nucleico complementario . 17. Método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la expresión del gen celular de la Tabla 2A se detecta usando un reactivo inmunológico . 18. Método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la expresión del gen celular de la Tabla 2A se detecta por ensayo para una actividad del producto del gen celular. Método de conformidad con la reivindicación 13 , caracterizado porgue el gen celular es BTG1, BTG2 , EPLIN, WIP1, Maspina, MIC-1, IGFBP-6 o anfiregulina . 20. Método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la inducción de al menos uno de los genes celulares en la Tabla 2A es ensayada usando una célula de mamífero recombinante que comprende un gen reportero operablemente ligada a un promotor, a partir de un gen celular en la Tabla 2A y detectar la expresión incrementada del gen reportero en la presencia del compuesto que en la ausencia del compuesto. 21. Método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque comprende además, las etapas: e) ensayar la expresión de uno o más genes en la Tabla 2B; y identificar compuestos en donde la expresión de los genes en la Tabla 2B no es mayor en la presencia del compuesto que en la ausencia del compuesto . Método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque además comprende las etapas f) ensayar la expresión de uno o más genes en la Tabla 2B; y f) identificar compuestos en donde la expresión de los genes en la Tabla 2B no es mayor en la presencia . del compuesto que en la ausencia del compuesto . 23. Método de conformidad con las reivindicaciones 21 ó 22, caracterizado porque la expresión del gen celular de la Tabla 2B se detecta por hibridación a un ácido nucleico complementario . 2 . Método de conformidad con las reivindicaciones 21 ó 22, caracterizado porque la expresión del gen celular de la Tabla 2B se detecta usando un reactivo inmunológico. 25. Método de conformidad con las reivindicaciones 21 ó 22, caracterizado porque la expresión del gen celular de la Tabla 2B se detecta por ensayo para la actividad del producto del gen celular. 26. Método para identificar un compuesto que induce senescencia en una célula de mamífero, caracterizado porque el método comprende las etapas de: (a) producir una célula de mamífero recombinante, introduciendo dentro de dicha célula de mamífero, constructo de expresión recombinante que comprende un promotor, a partir de un gen celular Tabla 2A, operablemente ligado a un gen reportero . (b) cultivar la célula de mamífero recombinante en la presencia y ausencia del compuesto; ensayar la expresión del gen reportero en dicha célula recombinante en la presencia del compuesto con la expresión de dicho gen reportero en la célula recombinante en la ausencia del compuesto; y (d) identificar compuestos que inducen la senescencia cuando la expresión del gen del gen reportero es superior en la presencia del compuesto que en la ausencia del compuesto . 27. Método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la célula de mamífero es una célula deficiente en p53. 28. Método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la célula de mamífero es una célula de tumor . 29. Método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el gen celular es un promotor de BTG1, BTG2, EPLIN, WIP1 , Maspina, MIC-1, IGFBP-6 o anfiregulina . 30. Método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque comprende además, las etapas: e) ensayar la expresión de uno o más genes en la Tabla 2B; y f) identificar compuestos en donde la expresión de los genes en la Tabla 2B no es mayor en la presencia del compuesto que en la ausencia del compuesto . 31. Método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la expresión del gen celular de la Tabla 2B se detecta por hibridación a un ácido nucleico complementario . 32. Método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la expresión del gen celular de la Tabla 2B se detecta usando un reactivo inmunológico . 33. Método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la expresión del gen celular de la Tabla 2B se detecta por ensayo para la actividad del producto del gen celular. 34. Método para identificar un compuesto que induce senescencia en una célula de mamífero, caracterizado porque el método comprende las etapas de: (a) producir una célula de mamífero recombinante, introduciendo dentro de dicha célula de mamífero, un constructo de expresión recombinante comprende un promotor, a partir de un gen celular en la Tabla 2?, operablemente ligado a un gen reportero . (b) cultivar la célula de mamífero recombinante en la presencia y ausencia del compuesto; ensayar la expresión del gen reportero en dicha célula recombinante en la presencia del compuesto con la expresión de dicho gen reportero célula recombinante en la ausencia del compue (d) ensayar la célula de mamífero recombinante para el crecimiento celular y características morfológicas de senescencia; y (e) identificar compuestos que inducen la senescencia cuando la expresión del gen reportero es superior en la presencia del compuesto que en la ausencia del compuesto, y las células son inhibidas en crecimiento y expresan características morfológicas de senescencia en la presencia del compuesto . 35. Método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la célula de mamífero es una célula deficiente en p53. 36. Método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la célula de mamífero es una célula de tumor . 37. Método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el promotor del gen celular es un promotor de BTG1, BTG2 , EPLIN, WIP1, Maspina, MIC-1, IGFBP-6 o anfiregulina . 38. Método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque comprende además, las etapas: f) ensayar la expresión de uno o más genes en la Tabla 2B; y . g) identificar compuestos en donde la expresión de los genes en la Tabla 2B no es mayor en la presencia del compuesto que en la ausencia del compuesto . 39. Método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la expresión del gen celular de la Tabla 2B se detecta por hibridación a un ácido nucleico complementario . 40. Método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la expresión del gen celular de la Tabla 2B se detecta usando un reactivo inmunológico . 41. Método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la expresión del gen celular de la Tabla 2B se detecta por ensayo para la actividad del producto del gen celular. 42. Método para identificar un compuesto que induce senescencia en una célula de mamífero, caracterizado porque el método comprende las etapas de : (a) cultivar la célula de mamífero en la presencia y ausencia del compuesto; (b) ensayar la expresión de al menos, un gen celular expuesto en la Tabla 1 en dicha célula en la presencia del compuesto con expresión de dicho gen en la célula en la ausencia del compuesto; y (c) identificar compuestos que inducen la senescencia cuando la expresión de al menos un gen celular en la Tabla 1 es inferior en la presencia del compuesto que en la ausencia del compuesto. 43. Método de conformidad con la reivindicación 42 , caracterizado porque la célula de mamífero es una célula deficiente en p53. 44. Método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque la célula de mamífero es una célula de tumor . 45. Método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque la expresión del gen celular de la Tabla 1 se detecta por hibridación a un ácido nucleico complementario . 46. Método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque la expresión del gen celular de la Tabla 1, se detecta usando un reactivo inmunológico . 47. Método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque la expresión del gen celular de la Tabla 1 se detecta por ensayo para una actividad del producto del gen celular. 48. Método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el gen celular es HFH-11, STEAP, RHAMM, INSIG1, LRPR1. 49. Método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque la inhibición de al menos uno de los genes celulares en la Tabla 1 es ensayada usando una célula de mamífero recombinante que comprende un gen reportero operablemente ligado a un promotor, a partir de un gen celular en la Tabla 1 y detectar la expresión decrementada del gen reportero en la presencia del compuesto que en la ausencia del compuesto . 50. Método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque comprende además, las etapas: d) ensayar la expresión de uno o más genes en la Tabla 2B; y e) identificar compuestos en donde la expresión de los genes en la Tabla 2B no es mayor en la presencia del compuesto que en la ausencia del compuesto . 51. Método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque además comprende las etapas de: d) ensayar la expresión de uno o más genes en la Tabla 2B; y e) identificar compuestos en donde la expresión de los genes en la Tabla 2B no es mayor en la presencia del compuesto que en la ausencia del compuesto . 52. Método de conformidad con las reivindicaciones 50 ó 51, caracterizado porque la expresión del gen celular de la Tabla 2B se detecta por hibridación a un ácido nucleico complementario . 53. Método de conformidad con las reivindicaciones 50 6 51, caracterizado porque la expresión del gen celular de la Tabla 2B se detecta usando un reactivo inmunológico . 54. Método de conformidad con las reivindicaciones 50 ó 51, caracterizado porque la expresión del gen celular de la Tabla 2B se detecta por ensayo para la actividad del producto del gen celular. 55. Método para identificar un compuesto que induce senescencia en una célula de mamífero, caracterizado porque el método comprende las etapas de: (a) cultivar la célula de mamífero en la presencia y ausencia del compuesto; (b) ensayar la expresión de al menos un gen celular en la Tabla 1 en dicha célula en la presencia del compuesto con expresión de dicho gen en la célula en la ausencia del compuesto; (c) ensayar las células de mamífero recombinantes para crecimiento celular y características morfológicas de senescencia; y (d) identificar compuestos que inducen la senescencia cuando la expresión de al menos un gen celular en la Tabla 1 es inferior en la presencia del compuesto que en la ausencia del compuesto, y las células son inhibidas en crecimiento y expresan características morfológicas de senescencia en la presencia del compuesto. 56. Método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porgue la célula de mamífero es una célula deficiente en p53. 57. Método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque la célula de mamífero es una célula de tumor . 58. Método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque la expresión del gen celular de la Tabla 1 se detecta por hibridación a un ácido nucleico complementario . 59. Método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque la expresión del gen celular de la Tabla 1, se detecta usando un reactivo inmunológico . 60. Método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque la expresión del gen celular de la Tabla 1 se detecta por ensayo para la actividad del producto del gen celular. 61. Método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque el gen celular es HFH-11, STEAP, RHAMM, INSIG1, LRPR1. 62. Método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque la inhibición de al menos uno de los genes celulares en la Tabla 1 es ensayada usando una célula de mamífero recombinante que comprende un gen reportero operablemente ligado a un promotor, a partir de un gen celular en la Tabla 1 y detectar la expresión decrementada del gen reportero en la presencia del compuesto que en la ausencia del compuesto. 63. Método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque comprende además, las etapas: e) ensayar la expresión de uno o más genes en la Tabla 2B; y f) identificar compuestos en donde la expresión de los genes en la Tabla 2B no es mayor en la presencia del compuesto que en la ausencia del compuesto . 64. Método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque además comprende las etapas de: f) ensayar la expresión de uno o más genes en la Tabla 2B; y f) identificar compuestos en donde la expresión de los genes en la Tabla 2B no es mayor en la presencia del compuesto que en la ausencia del compuesto . 65. Método de conformidad con las reivindicaciones 63 ó 64, caracterizado porque la expresión del gen celular de la Tabla 2B se detecta por hibridación a un ácido nucleico complementario . 66. Método de conformidad con las reivindicaciones 63 ó 64, caracterizado porgue la expresión del gen celular de la Tabla 2B se detecta usando un reactivo inmunológico . 67. Método de conformidad con las reivindicaciones 63 ó 64, caracterizado porque la expresión del gen celular de la Tabla 2B se detecta por ensayo para la actividad del producto del gen celular. 68. Método para identificar un compuesto que induce senescencia en una célula de mamífero, caracterizado porgue el método comprende las etapas de : (a) producir una célula de mamífero recombinante, introduciendo dentro de dicha célula de mamífero, un constructo de expresión recombinante que comprende un promotor, a partir de un gen celular en la Tabla 1, operablemente ligado a un gen reportero . (b) cultivar la célula de mamífero recombinante en la presencia y ausencia del compuesto; (c) ensayar la expresión del gen reportero en dicha célula recombinante en la presencia del compuesto con la expresión de dicho gen reportero en la célula recombinante en la ausencia del compuesto; y (d) identificar compuestos que inducen la senescencia cuando la expresión del gen del gen reportero es inferior en la presencia del compuesto que en la ausencia del compuesto. 69. Método de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque la célula de mamífero es una célula deficiente en p53. 70. Método de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque la célula de mamífero es una célula de tumor . 71. Método de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque el gen celular es un promotor de HEFH-11, STEAP, HAMM, INSIG1, LRPR1. 72. Método de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque comprende además, las etapas: e) ensayar la expresión de uno o más genes en la Tabla 2B; y f) identificar compuestos en donde la expresión de los genes en la Tabla 2B no es mayor en la presencia del compuesto que en la ausencia del compuesto . 73. Método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado porque la expresión del gen celular de la Tabla 2B se detecta por hibridación a un ácido nucleico complementario . 7 . Método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado porque la expresión del gen celular de la Tabla 2B se detecta usando un reactivo inmunológico . 75. Método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado porque la expresión del gen celular de la Tabla 2B se detecta por ensayo para la actividad del producto del gen celular. 76. Método para identificar un compuesto que induce senescencia en una célula de mamífero, caracterizado porque el método comprende las etapas de : (a) producir una célula de mamífero recombinante, introduciendo dentro de dicha célula de mamífero, un constructo de expresión recombinante que comprende un promotor, a partir de un gen celular en la Tabla 1, operablemente ligado a un gen reportero; (b) cultivar la célula de mamífero recombinante en la presencia y ausencia del compuesto; (c) ensayar la expresión del gen reportero en dicha célula recombinante en la presencia del compuesto con la expresión de dicho gen reportero en la célula recombinante en la ausencia del compuesto; (d) ensayar la célula de mamífero recombinante para el crecimiento celular y características morfológicas de senescencia; y (e) identificar compuestos que inducen la senescencia cuando la expresión del gen reportero es inferior en la presencia del compuesto que en la ausencia del compuesto, y las células son inhibidas en crecimiento y expresan características morfológicas de senescencia en la presencia del compuesto. 77. Método de conformidad con la reivindicación 76, caracterizado porque la célula de mamífero es una célula deficiente en p53. 78. Método de conformidad con la reivindicación 76, caracterizado porgue la célula de mamífero es una célula de tumor. 79. Método de conformidad con la reivindicación 76, caracterizado porque el promotor del gen celular es un promotor de HEEH-11, STEñP, EHAM, INSIG1, LRPR1. 80. Método de conformidad con la reivindicación 76, caracterizado porque comprende adems, las etapas: g) ensayar la expresión de uno o más genes en la Tabla 2B; y g) identificar compuestos en donde la expresión de los genes en la Tabla 2B no es mayor en la presencia del compuesto que en la ausencia del compuesto. 81. Método de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porgue la expresión del gen celular de la Tabla 2B se detecta por hibridación a un ácido nucleico complementario. 82. Método de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque la expresión del gen celular de la Tabla 2B se detecta usando un reactivo inmunológico. 83. Método de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque la expresión del gen celular de la Tabla 2B se detecta por ensayo para la actividad del producto del gen celular. 84. Compuesto que induce senescencia en células de mamífero, caracterizado porque el compuesto se identifica de conformidad con el método de la reivindicación 9, 21, 22, 30, 38, 50, 51, 63, 64, 72 u 80. 85. Compuesto de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque es un compuesto no retinoide. 86. Método para valorar la eficacia de un tratamiento o una enfermedad o condición que se refiere a la proliferación celular anormal o crecimiento celular neoplástico, caracterizado porque el método comprende las etapas de: (a) obtener una muestra biológica que comprende células de un animal que tiene una enfermedad o condición que se refiere a proliferación celular anormal o crecimiento celular neoplástico antes del tratamiento y después del tratamiento; comparar la expresión de al menos un gen en la Tabla 1, 2B después del tratamiento con la expresión de dichos genes antes del tratamiento; determinar que dicho tratamiento tiene eficacia para tratar la enfermedad o condición que se refiere proliferación celular anormal o crecimiento celular neoplástico si la expresión de al menos un gen en la Tabla 2A y 2B es superior después del tratamiento que antes del tratamiento o la expresión de al menos un gen la Tabla 1 inferior después del tratamiento que antes del tratamiento. 87. Método de conformidad con la reivindicación 86, caracterizado porque la muestra biológica comprende células de tumor. 88. Método de conformidad con la reivindicación 86, caracterizado porque el gen es un gen celular en la Tabla 2A. 89. Método de conformidad con la reivindicación 88, caracterizado porque al menos, un gen celular es BTG1, BTG2, EPLI , WIP1, Maspina, MIC-1, IGEBP-6 o anfiregulina. 90. Método de conformidad con la reivindicación 86, caracterizado porque el gen es un gen celular en la Tabla 1. 91. Método de conformidad con la reivindicación 90, caracterizado porque el gen celular es HEH-11, STEAP, ?????, INSIGl, LRPR1. 92. Método de conformidad con la reivindicación 86, caracterizado porque el gen celular de las Tablas 1, 2? o 2B, se detecta por hibridación a un ácido nucleico complementario. 93. Método de conformidad con la reivindicación 86, caracterizado porque el gen celular de las Tablas 1, 2A o 2B, se detecta usando un reactivo inmunológico. 94. Método de conformidad con la reivindicación 86 , caracterizado porque la expresión del gen celular de las Tablas 1, 2A o 2B, se detecta por ensayo por la actividad del producto del gen celular. 95. Método para tratar una enfermedad o condición que se refiere a la proliferación anormal de células normales o crecimiento celular neoplástico, caracterizado porque el método comprende las etapas de administrar a un animal que tiene dicha enfermedad o condición, una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto producido de conformidad con el método de las reivindicaciones 9, 21, 22, 30, 38, 50, 51, 63, 64, 72 u 80, que induce senescencia en células anormalmente proliferantes o neoplásticas. 96. Método de conformidad con la reivindicación 95, caracterizado porque el compuesto es un compuesto no retinoide. 97. Método para identificar un compuesto que inhibe la inducción celular asociada con la senescencia de la expresión del gen celular, caracterizado porque el método comprende las etapas de: (a) poner en contacto la célula con un agente citotóxico a una concentración de dicho agente que inhibe el crecimiento celular; (b) ensayar la célula en la presencia y ausencia del compuesto para cambios en la expresión de genes celulares inducidos cuando las células llegan a la senescencia; y (c) identificar el compuesto como un inhibidor de la inducción asociada con la senescencia de la expresión del gen celular si la expresión de los genes celulares de la subparte (b) es inducida en la ausencia del compuesto, pero no está inducida en la presencia del compuesto. 98. Método de conformidad con la reivindicación 97, caracterizado porque el gen celular es ciclina DI, cinasa inducible por suero, CYR61, prosaposina, factor de crecimiento de transformación a ( TGF) , calicrelna 7, calpaína-L2, neurosina, activador del plasminógeno urocinasa, proteína precursora beta amiloide (A4) (ß???) , o proteína de membrana integral 2B (BRI/ITM2B) . 99. Método de conformidad con la reivindicación 97, caracterizado porque la expresión del gen celular se detecta por hibridación a un ácido nucleico complementario. - 100. Método de conformidad con la reivindicación 97, caracterizado porque la expresión del gen celular se detecta usando reactivo inmunológico. 101. Método de conformidad con la reivindicación 97, caracterizado porque la expresión del gen celular se detecta por ensayo por la actividad del producto del gen celular. 102. Método de conformidad con la reivindicación 97, caracterizado porque la célula de mamífero es una célula deficiente en p53. 103. Método de conformidad con la reivindicación 97, caracterizado porque la célula de mamífero es una célula de tumor. 10 . Método para identificar un compuesto que inhibe la inducción asociada con la senescencia de la expresión del gen celular, caracterizado porque el método comprende las etapas de: (a) producir una célula de mamífero recombinante introduciendo en dicha célula de mamífero un constructo de expresión recombinante que comprende un promotor de ciclina DI, cinasa inducible por suero, CYR61, prosaposina, factor de crecimiento de transformación c¡ (OÍTGF) , calicreína 7, calpaína-L2, neurosina, activador del plasminógeno, urocinasa, proteína precursora beta amiloide (A4) (ß???) , o proteína de membrana integral 2B (BRI/ITM2B) , operablemente ligado a un gen reportero; (b) poner en contacto la célula con un agente citotóxico a una concentración de dicho agente que inhibe el crecimiento celular,- (c) ensayar la expresión del gen reportero en dicha célula recombinante en la presencia del compuesto con expresión de dicho gen reportero en la célula recombinante en la ausencia del compuesto (d) identificar el compuesto como un inhibidor de la inducción asociada con la senescencia de la expresión del gen celular si la expresión de los genes celulares de la subparte (c) es inducida en la ausencia del compuesto, pero no está inducida en la presencia del compuesto. 105. Método de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado porque la expresión del gen celular se detecta por hibridación a un ácido nucleico complementario. 106. Método de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado porque la expresión del gen celular se detecta usando reactivo inmunológico. 107. Método de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado porque la expresión del gen celular se detecta por ensayo por la actividad del producto del gen celular. 108. Método para determinar la eficacia del tratamiento en un animal tratado con un compuesto que induce senescencia celular, caracterizado porque el método conprende las etapas de: (a) ensayar un fluido biológico a partir del animal, antes y después del tratamiento por un marcador de senescencia; y (b) determinar que el tratamiento es efectivo cuando la cantidad del marcador detectada después del tratamiento, es mayor que la cantidad del marcador seleccionado antes del tratamiento. 109. Método de conformidad con la reivindicación 108, caracterizado porque el marcador de senescencia es maspina, MIC-1, IGEBP-6 o anfiregulina. 110. Método de conformidad con la reivindicación 108, caracterizado porque el fluido corporal es sangre, orina, derrames, fluido ascítico, saliva, fluido cerebroespinal, secreciones cervicales, secreciones vaginales, secreciones endometriales, secreciones gastrointestinales, secreciones bronquiales, esputo, o secreciones o lavados de la mama. 111. Método de conformidad con la reivindicación 108, caracterizado porque el marcador de senescencia se detecta por hibridación a un ácido nucleico complementario, usando un reactivo inmunológico o por ensayo por la actividad del producto del gen celular.