JP2009077705A - Ｃｄｋ阻害剤によって調節される遺伝子発現を同定及び調節するための試薬及び方法 - Google Patents

Abstract

【課題】サイクリン依存性キナーゼ阻害剤によって誘導される遺伝子である、癌及び老化関連疾病に関与する遺伝子の誘導を阻害する化合物を同定するための方法及び試薬を提供する。
【解決手段】サイクリン依存性キナーゼ阻害剤によって誘導される哺乳動物遺伝子に由来するプロモーターに作動可能に連結された、レポーター遺伝子をコードする組み換え発現構築物。当該組み換え発現構築物を含む哺乳動物細胞。当該哺乳動物細胞を用いたサイクリン依存性キナーゼ阻害剤によって誘導される遺伝子の誘導を阻害する化合物の同定方法。
【選択図】なし

Description

（発明の背景）
本願は２００１年２月１日に提出された米国仮出願番号６０／２６５，８４０、および２００１年５月２１日に提出された米国特許出願番号０９／８６１，９２５に基づく優先権を主張する。

本願は国立衛生研究所(National Institutes of Health)からの助成金（Ｎｏ．Ｒ０１ＣＡ６２０９９）による支援を受けた。政府は本発明における一定の権利を有する。

（発明の分野）
本発明は、細胞老化ならびに老化に伴う細胞性遺伝子発現の変化に関する。とりわけ、本発明は、老化の開始時に細胞内で誘導されるサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤と呼ばれるクラスの細胞性遺伝子産物によって発現が調節される遺伝子の同定に関する。より詳細には、本発明は上記のようなＣＤＫ阻害剤によって発現が誘導される遺伝子である細胞老化のマーカーを提供する。本発明は、細胞老化の病的結果を阻害する化合物の存在下において、ＣＤＫ阻害剤による上記マーカー遺伝子の誘導の阻害を検出することにより、当該化合物を同定するための方法を提供する。また、実験的に誘導可能なｐ２１、ｐ１６またはｐ２７などの様々な細胞性ＣＤＫ阻害剤をコードする組み換え発現構築物を含む組み換え哺乳動物細胞である試薬、ならびに、内在性または外来性の実験的に誘導可能なＣＤＫ阻害剤によってその発現が誘導される遺伝子に対するプロモーターの転写制御下においてレポーター遺伝子を発現する組み換え発現構築物を含む組み換え哺乳動物細胞も提供される。

（関連技術の概要）
細胞周期の進行は、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫｓ）として知られる一組のセリン／トレオニンキナーゼによって大いに調節されている。ＣＤＫ阻害剤として知られる特定の蛋白質群は、ＣＤＫと相互作用してこれを阻害することにより、様々な生理学的状況において細胞周期の停止を引き起こす（Ｓｉｅｌｅｃｋｉら，２０００年，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．第４３巻：１〜１８頁、及びその中の参考文献を参照）。ＣＤＫ阻害剤には２つのファミリーが存在する。Ｃｉｐ／Ｋｉｐとして知られる１つ目のファミリーには、ｐ２１^{Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１／Ｓｄｉ１}，ｐ２７^Ｋｉｐ１及びｐ５７^Ｋｉｐ２が含まれる。２つ目のファミリーであるＩｎｋ４には、ｐ１６^{Ｉｎｋ４Ａ}，ｐ１５^{Ｉｎｋ４ｂ}，ｐ１８^{Ｉｎｋ４ｃ}及びｐ１９^{Ｉｎｋ４ｄ}が含まれる。特定のＣＤＫ阻害剤の発現は、様々な因子によって活性化される。例えば、接触阻害はｐ２７及びｐ１６発現を誘導し（Ｄｉｅｔｒｉｃｈら，１９９７年，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ 第１５巻：２７４３〜２７４７頁）、ＴＧＦαなどの細胞外抗分裂促進因子はｐ１５発現を誘導し（Ｒｅｙｎｉｓｄｏｔｔｉｒら，１９９５年，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．第９巻：１８３１〜１８４５頁）、血清欠乏はｐ２７発現を誘導し（Ｐｏｌｙａｋら，１９９４年，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．第８巻：９〜２２頁）、紫外線照射はｐ１６発現を誘導する（Ｗａｎｇら，１９９６年，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第５６巻：２５１０〜２５１４頁）。さらに、上述のすべての処理は、様々な形態のＤＮＡ損傷とともに、既知のＣＤＫ阻害剤の中でも最も多面発現性のあるｐ２１の発現を誘導する（Ｄｏｔｔｏ，２０００年，ＢＢＡ Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ 第１４７１巻：Ｍ４３−Ｍ５６）。

本発明の分野で特に重要なことは、ＣＤＫ阻害剤のうちｐ２１とｐ１６の２つが、哺乳動物細胞における老化の進行に密接に関与しているということである。複製老化（Ａｌｃｏｒｔａら、１９９６年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ 第９３巻：１３７４２〜１３７４７頁）、及び損傷によって誘導され加速される老化（Ｒｏｂｌｅｓ＆Ａｄａｍｉ，１９９８年，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ 第１６巻：１１１３〜１１２３頁）の開始時には、ｐ２１誘導によって細胞の増殖が停止する。しかしながら、このｐ２１発現の急増は一時的なものであり、次にｐ１６の安定した活性化が起こり、このことが老化細胞における増殖停止の維持を担っていると考えられる。ｐ２１のノックアウト（Ｂｒｏｗｎら，１９９７年，Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２７７巻：８３１〜８３４頁）またはｐ１６のノックアウト（Ｓｅｒｒａｎｏら，１９９６年，Ｃｅｌｌ 第８５巻：２７〜３７頁）により、老化の開始が遅延または阻害される。さらに、ｐ２１またはｐ１６のいずれかの異所性過剰発現は、正常細胞及び腫瘍細胞の両方において老化の表現型マーカーを伴う増殖停止を誘導する（Ｖｏｇｔら，１９９８年，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．第９巻、１３９〜１４６頁；ＭｃＣｏｎｎｅｌｌら，１９９８年，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．第８巻：３５１〜３５４頁；Ｆａｎｇら，１９９９年，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ 第１８巻：２７８９〜２７９７頁）。

ｐ２１は、ＣＤＫと結合してこれを阻害する蛋白質として（Ｈａｒｐｅｒら，１９９３年，Ｃｅｌｌ 第７５巻：８０５〜８１６頁）、野生型ｐ５３によって上方制御される遺伝子として（ｅｌ−Ｄｅｉｒｙら，１９９３年，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第５５巻：２９１０〜２９１９頁）、及び老化線維芽細胞において過剰発現される増殖阻害遺伝子として（Ｎｏｄａら，１９９４年，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．第２１１巻：９０〜９８頁）、当該技術分野において別々に同定されている。ｐ５３によって制御される増殖の停止において極めて重要な役割を有することから、ｐ２１は通常は腫瘍サプレッサーと見なされている。それにもかかわらず、ヒトの癌においてｐ２１変異が見られることは稀であり（Ｈａｌｌ＆Ｐｅｔｅｒｓ，１９９６年、Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第６８巻：６７〜１０８頁）、ｐ２１ノックアウトマウスは正常に発育し、腫瘍形成速度の増加を見せることはない（Ｄｅｎｇら、１９９５年，Ｃｅｌｌ 第８２巻、６７５〜６８４頁）。

ｐ２１の細胞レベルは、ＤＮＡ損傷剤や分化剤を含む様々な刺激に反応して増大する。これらの反応のいくつかは、ｐ５３によるｐ２１遺伝子の転写活性化を介するが、ｐ２１は様々なｐ５３非依存性因子によっても制御される（ＧａｒｔｅｌとＴｙｎｅｒ，１９９９年、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． 第２２７巻：１７１〜１８１頁に概説されている）。

ｐ２１の一過性誘導は、細胞によるＤＮＡ損傷の修復を可能にする一過性停止、ならびに、ＤＮＡ損傷または発癌性ＲＡＳ（Ｓｅｒｒａｎｏら，１９９７年，Ｃｅｌｌ 第８８巻：５９３〜６０２頁）によって正常な線維芽細胞（ＤｉＬｅｏｎａｒｄｏら，１９９４年，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．第８巻：２５４０〜２５５１頁；Ｒｏｂｌｅｓ＆Ａｄａｍｉ，１９９８年，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ 第１６巻：１１１３〜１１２３頁）及び腫瘍細胞（Ｃｈａｎｇら，ｌ９９９年，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第５９巻：３７６１〜３７６７頁）において誘導される永久的増殖停止（「加速された老化」とも呼ばれる）を含む様々な形の損傷誘導性増殖停止を媒介する。ｐ２１発現の急増は、老化線維芽細胞の複製老化の間の最終増殖停止（Ｎｏｄａら、１９９４年，同書中；Ａｌｃｏｒｔａら，１９９６年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ 第９３巻：１３７４２〜１３７４７頁；Ｓｔｅｉｎら，１９９９年，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．第１９巻：２１０９〜２１１７頁）ならびに有糸分裂後細胞の最終分化（Ｅｌ−Ｄｅｉｒｙら，１９９５年，同書中；Ｇａｒｔｅｌら，１９９６年，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．第２４６巻：２８０〜２８９頁）の開始と同時にも起こる。

ｐ２１自体は転写因子ではないものの、細胞遺伝子発現に対して、細胞機能における役割を果たしうるという間接的な効果を有している（Ｄｏｔｔｏ，２０００年，ＢＢＡ Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ 第１４７１巻：Ｍ４３〜Ｍ５６及びその中の参考文献）。ｐ２１によるＣＤＫ阻害の結果の１つにＲｂの脱リン酸化があり、この脱リン酸化により、ＤＮＡ複製及び細胞周期の進行に関与する多くの遺伝子を制御するＥ２Ｆ転写因子が阻害される（Ｎｅｖｉｎｓ，１９９８年，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．第９巻：５８５〜５９３頁）。ｐ２１発現細胞（ｐ２１＋／＋）とｐ２１非発現細胞（ｐ２１−／−）との比較から、ｐ２１が細胞周期進行に関与するいくつかの遺伝子の照射誘導性阻害に関係していると見なされてきた（ｄｅ Ｔｏｌｅｄｏら，１９９８年，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．第９巻：８８７〜８９６頁）。ｐ２１によるＣＤＫ阻害の別の結果としては、ＮＦκＢを含む多くの誘導可能な転写因子を増強する、転写補因子ヒストンアセチルトランスフェラーゼｐ３００の刺激があげられる（Ｐｅｒｋｉｎｓら，１９８８年，Ｓｃｉｅｎｃｅ 第２７５巻：５２３〜５２７頁）。ｐ３００の活性化は、遺伝子発現に対して多面発現的な効果を有し得る（Ｓｎｏｗｄｅｎ＆Ｐｅｒｋｉｎｓ，ｌ９８８年，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．第５５巻：１９４７〜１９５４頁）。ｐ２１は、ＣＤＫ以外の多くの転写調節因子及び補調節因子、例えばＪＮＫキナーゼ類、アポトーシスシグナル調節キナーゼ１、Ｍｙｃ等との相互作用を介して遺伝子発現に影響を及ぼし得る（Ｄｏｔｔｏ，２０００年，ＢＢＡ Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ １４７１：Ｍ４３−Ｍ５６）。上記相互作用は、対応する経路によって制御される遺伝子の発現に影響を及ぼし得る。

本発明に特に関係する別のＣＤＫ阻害剤としては、Ｓｅｒｒａｎｏらによって記載されているヒトの蛋白質であるｐ１６^{ＩＮＫ４Ａ}があげられる（１９９３年，Ｎａｔｕｒｅ ３６６巻：７０４〜７０７頁）。上述のように、ｐ１６は哺乳動物細胞における老化に不可欠な調節因子である。これは真正(bona fide)腫瘍サプレッサーであるとともに、ヒト癌において最もよく変異する遺伝子の１つである（Ｈａｌｌ＆Ｐｅｔｅｒｓ，１９９６年，Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．第６８巻：６７〜１０８頁）。ｐ１６はＣＤＫ４及びＣＤＫ６を直接的に阻害することが知られており、ＣＤＫ２もまた同様に間接的に阻害し得る（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌら，１９９９年，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．第１９巻：１９８ｌ〜１９８９頁）。

本発明に特に関連する別のＣＤＫ阻害剤として、ｐ２７^Ｋｉｐ１があげられる。ｐ２７は当初、ＴＧＦ−βまたはロバスタチンとの接触阻害によって増殖が停止された細胞内において、ＣＤＫ２の阻害剤として同定された（Ｈｅｎｇｓｔら、１９９４年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ 第９１巻：５２９１〜５２９５頁；Ｐｏｌｙａｋら，１９９４年，Ｃｅｌｌ 第７８巻：５９〜６６頁）。ｐ２７は、分化、血清欠乏、浮遊状態での増殖、及び他の因子に応答して、細胞増殖停止を媒介する。ヒト癌におけるｐ２７発現のレベルは、正常な組織と比較して、頻繁に変化（増加および減少の両方）する（Ｐｈｉｌｉｐｐ−Ｓｔａｈｅｌｉら，２００１年，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．第２６４巻：１４８〜１６１頁）。ｐ２７は、老化をもたらす経路の１つにおいて、腫瘍サプレッサーＰＴＥＮと協働作用することが示唆されてきた（ＢｒｉｎｇｏｌｄとＳｅｒｒａｎｏ，２０００年，Ｅｘｐ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．第３５巻：３１７〜３２９頁）。

本技術分野においては、ｐ２１、ｐ１６またはｐ２７などのＣＤＫ阻害剤遺伝子の誘導によって発現が制御される遺伝子を同定する必要性が残されている。本技術分野においては、細胞老化、発癌、及び老化に関連する疾病に対する化合物の効果を調べるためのターゲットを開発する必要性もある。

（発明の概要）
本発明はＣＤＫ阻害剤遺伝子発現の誘導によって発現が制御される遺伝子を同定するための試薬及び方法を提供する。本発明は、発癌や老化関連疾病などの細胞老化の病原性結果を防止するための合理的ドラッグデザインにおける第１段階として、細胞遺伝子発現に対するｐ２１、ｐ２７及びｐ１６などのＣＤＫ阻害剤の効果を阻害する化合物を同定するための試薬及び方法も提供する。

第１の態様において、本発明は誘導可能なＣＤＫ阻害剤遺伝子を含む哺乳動物細胞を提供する。好ましい実施形態において、ＣＤＫ阻害剤遺伝子はｐ２１、ｐ１６またはｐ２７をコードする。好ましい実施形態において、哺乳動物細胞は、誘導可能なｐ２１遺伝子または誘導可能なｐ１６遺伝子または誘導可能はｐ２７遺伝子をコードする組み換え発現構築物を含んでいる。より好ましくは、前記構築物は、誘導可能なプロモーターの転写制御下にある、ｐ２１、最も好ましくはヒトｐ２１をコードするヌクレオチド配列を含んでいる。代替実施形態において、本構築物は、ＣＤＫ結合ドメインを含む、より好ましくはｐ２１のアミノ酸配列の１〜７８のアミノ酸を含むアミノ末端部分をコードするヌクレオチド配列を含んでいる。さらなる実施形態において、本構築物は、誘導可能なプロモーターの転写制御下にある、ｐ１６、最も好ましくはヒトｐ１６をコードするヌクレオチド配列を含んでいる。さらなる実施形態において、本構築物は、誘導可能なプロモーターの転写制御下にある、ｐ２７、好ましくはヒトｐ２７またはマウスｐ２７をコードするヌクレオチド配列を含んでいる。好ましい実施形態において、上記のような構築物内の誘導可能なプロモーターの誘導は、誘導可能なプロモーターから転写を誘導する、誘導剤、最も好ましくは生理学的に中立の誘導剤に細胞を接触させること、あるいは上記プロモーターからの転写を阻害する物質を除去することによって行うことができる。好ましい細胞としては、哺乳動物細胞、好ましくは齧歯類または霊長類細胞、より好ましくはマウスまたはヒト細胞があげられる。特に好ましい実施形態においては、線維肉腫細胞、より好ましくはヒト線維肉腫細胞、最も好ましくはヒトＨＴ１０８０線維肉腫細胞系列の細胞及びその類縁体である。

本発明の第１の態様の他の実施形態において、組み換え発現構築物を含む組み換え哺乳動物細胞が提供され、この組み換え発現構築物においては、レポーター遺伝子が、ＣＤＫ阻害剤、最も好ましくはｐ２１、ｐ１６またはｐ２７によって発現が調節される細胞遺伝子から取り出したプロモーターの転写制御下におかれている。好ましい実施形態において、プロモーターはｐ２１、ｐ１６またはｐ２７などのＣＤＫ阻害剤によって発現が誘導される細胞遺伝子から得られる。上記の実施形態において、プロモーターは最も好ましくは表ＩＩ内に示される遺伝子に由来するものであるが、当業者であればＣＤＫ阻害剤によって発現が誘導される遺伝子であればどんな遺伝子に由来するプロモーターでも上記構築物において有益に使用できることを認識するであろう。最も好ましくは、プロモーターは、血清アミロイドＡ（配列番号：１）、補体Ｃ３（配列番号：２）、結合組織増殖因子（配列番号：３）、インテグリンβ−３（配列番号：４）、アクチビンＡ（配列番号：５）、ナチュラルキラー細胞蛋白質４（配列番号：６）、プロサポシン（配列番号：７）、Ｍａｃ２結合蛋白質（配列番号：８）、ガレクチン−３（配列番号：９）、スーパーオキシドジスムターゼ２（配列番号：１０）、グラニュリン／エピテリン（配列番号：１１）、ｐ６６^ｓｈｃ（配列番号：１２）、カテプシンＢ（配列番号：１４）、β−アミロイド前駆体蛋白質（配列番号：１５）、組織トランスグルタミナーゼ（ｔ−ＴＧアーゼ；配列番号：１６）、クラステリン（配列番号：１７）、プロスタサイクリン刺激因子（配列番号：１８）、血管内皮細胞増殖因子−Ｃ（配列番号：１９）、及びメタロプロテアーゼ−１の組織阻害剤（配列番号：２０）から得られる。本発明の組み換え発現構築物を含む好ましいレポーター遺伝子としては、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光蛋白質またはアルカリホスファターゼが挙げられる。

さらなる好ましい実施形態において、本発明は、ＣＤＫ阻害剤、最も好ましくはｐ２１、ｐ１６またはｐ２７によってその発現が調節される哺乳動物遺伝子に対するプロモーターの転写制御下にある、レポーター遺伝子をコードする第１の組み換え発現構築物と、哺乳動物のＣＤＫ阻害剤遺伝子をコードする第２の組み換え発現構築物とを含む哺乳動物細胞を提供し、この哺乳動物細胞において、ＣＤＫ阻害剤の発現は哺乳動物細胞内で実験的に誘導される。好ましい実施形態において、ＣＤＫ阻害剤遺伝子はｐ２１、ｐ１６またはｐ２７である。好ましい実施形態において、哺乳動物ＣＤＫ阻害剤遺伝子をコードする組み換え発現構築物は、誘導可能な異種プロモーターの転写制御下にあり、組み換え発現構築物からのＣＤＫ阻害剤の発現は、組み換え細胞を、誘導可能なプロモーターからの転写を誘導する誘導剤に接触させることにより媒介されるか、あるいは、そのようなプロモーターからの転写を阻害する物質を除去することにより媒介される。好ましくは、前記構築物は、ｐ２１、最も好ましくはヒトｐ２１をコードするヌクレオチド配列を含んでいる。他の実施形態において、前記構築物は、ＣＤＫ結合ドメインを含む、より好ましくはｐ２１のアミノ酸配列の１〜７８のアミノ酸を含むアミノ末端部分をコードするヌクレオチド配列を含んでいる。代替の好ましい実施形態において、前記構築物は、ｐ１６、最も好ましくはヒトｐ１６をコードするヌクレオチド配列を含んでいる。代替の好ましい実施形態において、前記構築物は、ｐ２７、好ましくはヒトｐ２７またはマウスｐ２７をコードするヌクレオチド配列を含んでいる。レポーター遺伝子をコードする第２の組み換え発現構築物の好ましい実施形態において、プロモーターは、ｐ２１、ｐ１６またはｐ２７などのＣＤＫ阻害剤によって発現が制御される細胞遺伝子に由来する。これらの実施形態において、プロモーターは最も好ましくは表ＩＩに示された遺伝子に由来する。本発明の第２の組み換え発現構築物を含む好ましいレポーター遺伝子としては、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光蛋白質またはアルカリホスファターゼが挙げられる。特に好ましい実施形態においては、線維肉腫細胞、より好ましくはヒト線維肉腫細胞、最も好ましくはヒトＨＴ１０８０線維肉腫細胞系列の細胞及びその類縁体である。レポーター遺伝子またはＣＤＫ阻害剤によって誘導される内在性遺伝子の産物は、免疫学的試薬を用いて、遺伝子産物の活性をアッセイすることによって検出されるか、または相補的核酸へのハイブリダイゼーションによって検出されることが好ましい。

第２の態様において、本発明は、哺乳動物細胞における分裂促進因子または抗アポトーシス因子のＣＤＫ阻害剤誘導性発現を阻害する化合物を同定するためのスクリーニング方法を提供する。好ましい実施形態において、本方法は、化合物の存在下または非存在下の細胞において、ＣＤＫ阻害剤、最も好ましくはｐ２１、ｐ１６またはｐ２７の発現を誘導する工程と、馴化培地中で分裂促進因子または抗アポトーシス化合物、またはそれらの複数の物質の発現を比較する工程とを含む。ＣＤＫ阻害剤の阻害剤効果は、馴化培地中で当該化合物の非存在下よりも存在下での方が分裂促進因子または抗アポトーシス化合物またはそれらの複数の物質の量が少なくなっていることによって確認する。本発明の本態様において提供される方法において、あらゆるＣＤＫ阻害剤発現細胞が有用であるが、ｐ２１、ｐ１６またはｐ２７を発現する細胞が最も好ましく、そのような細胞内でのｐ２１、ｐ１６またはｐ２７の発現は、内在性ｐ２１，ｐ１６またはｐ２７を誘導するか、あるいは、本発明のｐ２１、ｐ１６またはｐ２７をコードする誘導可能な発現構築物を含む細胞を用いることによって達成することができる。好ましい細胞としては、哺乳動物細胞、好ましくは齧歯類または霊長類細胞、より好ましくはマウスまたはヒト細胞が挙げられる。特に好ましい実施形態においては、線維肉腫細胞、より好ましくはヒト線維肉腫細胞、最も好ましくはヒトＨＴ１０８０線維肉腫細胞系列の細胞及びその類縁体である。分裂促進因子または抗アポトーシス化合物の発現は、免疫学的試薬を用いて、遺伝子産物の活性をアッセイすることによって検出されるか、または相補的核酸へのハイブリダイゼーションによって検出される。

代替実施形態において、本発明は、哺乳動物細胞において分裂促進因子または抗アポトーシス因子のＣＤＫ阻害剤誘導性発現を阻害する化合物を同定するための方法を提供し、この哺乳動物細胞は、ｐ２１、ｐ１６またはｐ２７などのＣＤＫ阻害剤によって誘導される分裂促進因子または抗アポトーシス因子をコードする細胞遺伝子のプロモーターの転写制御下にある、レポーター遺伝子をコードする組み換え発現構築物を含んでいる。好ましい実施形態において、プロモーターとしては、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ；配列番号：３）、アクチビンＡ（配列番号：５）、グラニュリン／エピテリン（配列番号：１１）、ガレクチン−３（配列番号：９）、プロサポシン（配列番号：７）、クラステリン（配列番号：１７）、プロスタサイクリン刺激因子（配列番号：１８）、血管内皮細胞増殖因子−Ｃ（配列番号：１９）、及びメタロプロテアーゼ−１の組織阻害剤（配列番号：２０）に対するプロモーターが挙げられる。好ましいレポーター遺伝子としては、特に限定されないが、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及び緑色蛍光蛋白質が挙げられる。これらの実施形態において、レポーター遺伝子発現のＣＤＫ阻害剤媒介性誘導の阻害を用いて、ＣＤＫ阻害剤発現細胞における分裂促進因子または抗アポトーシス因子の誘導を阻害する化合物を同定する。

この態様において、本発明は、哺乳動物細胞において、分裂促進因子もしくは化合物または抗アポトーシス因子もしくは化合物の産生を阻害するための方法であって、分裂促進因子または抗アポトーシス因子に細胞を接触させる工程を含む方法を提供し、この方法において、上記化合物は本発明の本態様の前述の方法によって同定される。好ましい実施形態において、分裂促進因子または抗アポトーシス因子の産生が阻害されている、阻害性化合物と接触された哺乳動物細胞は線維芽細胞であり、最も好ましくは間質線維芽細胞である。好ましい実施形態において、上記化合物は核因子κ−Ｂ（ＮＦκＢ）の活性または発現の阻害剤である。

第３の態様において、本発明は、細胞遺伝子発現のＣＤＫ阻害剤媒介性誘導を阻害する化合物を同定するための方法を提供する。これらの方法は、哺乳動物細胞内でＣＤＫ阻害剤遺伝子の発現を誘導もしくは生み出す工程と、ＣＤＫ阻害剤によって発現が誘導される細胞遺伝子の発現に変化をもたらすための化合物の存在下で細胞をアッセイする工程と、当該化合物の非存在下よりも当該化合物の存在下での方が細胞遺伝子発現の変化の度合いが少ない場合に、細胞遺伝子発現のＣＤＫ阻害剤媒介性誘導を阻害する化合物を同定する工程とを含む。好ましい実施形態において、ＣＤＫ阻害剤はｐ２１、ｐ１６またはｐ２７である。好ましい実施形態において、細胞遺伝子はＣＤＫ阻害剤によって誘導され、細胞遺伝子発現の誘導を阻害する化合物は、ＣＤＫ阻害剤を当該化合物の非存在下で発現させた場合に検出されるよりも低いレベルで遺伝子が発現していることを検出することにより検出される。本発明の方法の本態様の好ましい実施形態において、ＣＤＫ阻害剤はｐ２１、ｐ１６またはｐ２７である。好ましい実施形態において、上記遺伝子は表ＩＩに示されている。さらなる代替実施形態において、本方法は、ＣＤＫ阻害剤によって発現が誘導される遺伝子から得られるプロモーターの転写制御下、レポーター遺伝子を含む組み換え哺乳動物細胞を用いて実施される。ＣＤＫ阻害剤によって誘導される遺伝子に由来するプロモーターを含む構築物を用いる場合、化合物がＣＤＫ阻害剤媒介性遺伝子発現制御を阻害もしくは妨害する時には、レポーター遺伝子産物は当該化合物の非存在下よりも存在下での方が低いレベルで産生される。本発明方法の本態様の好ましい実施形態において、ＣＤＫ阻害剤はｐ２１、ｐ１６またはｐ２７である。これらの実施形態において、プロモーターは最も好ましくは、表ＩＩに示される遺伝子に由来する。最も好ましくは、プロモーターは、血清アミロイドＡ（配列番号：１）、補体Ｃ３（配列番号：２）、結合組織増殖因子（配列番号：３）、インテグリンβ−３（配列番号：４）、アクチビンＡ（配列番号：５）、ナチュラルキラー細胞蛋白質４（配列番号：６）、プロサポシン（配列番号：７）、Ｍａｃ２結合蛋白質（配列番号：８）、ガレクチン−３（配列番号：９）、スーパーオキシドジスムターゼ２（配列番号：１０）、グラニュリン／エピテリン（配列番号：１１）、ｐ６６^ｓｈｃ（配列番号：１２）、カテプシンＢ（配列番号：１４）、β−アミロイド前駆体蛋白質（配列番号：１５）、組織トランスグルタミナーゼ（ｔ−ＴＧアーゼ；配列番号：１６）、クラステリン（配列番号：１７）、プロスタサイクリン刺激因子（配列番号：１８）、血管内皮細胞増殖因子−Ｃ（配列番号：１９）、及びメタロプロテアーゼ−１の組織阻害剤（配列番号：２０）から得られる。本発明の組み換え発現構築物を含む好ましいレポーター遺伝子としては、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光蛋白質またはアルカリホスファターゼが挙げられる。他の好ましい実施形態において、細胞は、ＣＤＫ阻害剤によって発現が制御される哺乳動物遺伝子に対するプロモーターの転写制御下にある、レポーター遺伝子をコードする第１の組み換え発現構築物と、哺乳動物のＣＤＫ阻害剤遺伝子をコードする第２の組み換え発現構築物とを含み、ＣＤＫ阻害剤の発現は哺乳動物細胞内で実験的に誘導される。レポーター遺伝子またはＣＤＫ阻害剤によって誘導される内在性遺伝子の産物は、免疫学的試薬を用いて、遺伝子産物の活性をアッセイすることによって検出されるか、相補的核酸へのハイブリダイゼーションによって検出されることが好ましい。

第４の態様において、本発明は、哺乳動物細胞における老化の病原性結果を阻害する化合物を同定するための方法を提供し、この方法において、この病原性結果は少なくとも部分的に、ＣＤＫ阻害剤によって誘導される遺伝子の発現によって媒介される。これらの方法は、化合物の存在下で哺乳動物細胞を試薬で処理するか、ＣＤＫ阻害剤遺伝子発現を誘導する条件下で哺乳動物細胞を培養する工程と、ＣＤＫ阻害剤によって誘導された遺伝子の誘導について哺乳動物細胞をアッセイする工程と、ＣＤＫ阻害剤によって誘導される遺伝子の発現が化合物の非存在下よりも化合物の存在下に誘導の程度が小さい場合に、当該化合物を老化または老化の病原性結果の阻害剤と同定する工程とを含む。本発明の方法の本態様の好ましい実施形態において、ＣＤＫ阻害剤はｐ２１、ｐ１６またはｐ２７である。好ましい実施形態において、遺伝子は表ＩＩに示されている。さらなる代替実施形態において、本方法は、ＣＤＫ阻害剤によって発現が調節される遺伝子に由来するプロモーターの転写制御下にあるレポーター遺伝子を含む組み換え哺乳動物細胞を用いて実施される。これらの実施形態において、ＣＤＫ阻害剤によって誘導される遺伝子に由来するプロモーターを含む構築物を用いて、化合物の非存在下よりも存在下でのほうがレポーター遺伝子の産物が低いレベルで産生されることは、当該化合物が細胞老化の病原性結果の阻害剤である場合に検出される。本発明方法の本態様の好ましい実施形態において、ＣＤＫ阻害剤はｐ２１、ｐ１６またはｐ２７である。プロモーターは好ましくは、表ＩＩに示される遺伝子に由来する。プロモーターは最も好ましくは、血清アミロイドＡ（配列番号：１）、補体Ｃ３（配列番号：２）、結合組織増殖因子（配列番号：３）、インテグリンβ−３（配列番号：４）、アクチビンＡ（配列番号：５）、ナチュラルキラー細胞蛋白質４（配列番号：６）、プロサポシン（配列番号：７）、Ｍａｃ２結合蛋白質（配列番号：８）、ガレクチン−３（配列番号：９）、スーパーオキシドジスムターゼ２（配列番号：１０）、グラニュリン／エピテリン（配列番号：１１）、ｐ６６^ｓｈｃ（配列番号：１２）、カテプシンＢ（配列番号：１４）、β−アミロイド前駆体蛋白質（配列番号：１５）、組織トランスグルタミナーゼ（ｔ−ＴＧアーゼ；配列番号：１６）、クラステリン（配列番号：１７）、プロスタサイクリン刺激因子（配列番号：１８）、血管内皮細胞増殖因子−Ｃ（配列番号：１９）、及びメタロプロテアーゼ−１の組織阻害剤（配列番号：２０）に由来する。他の好ましい実施形態において、細胞は、ＣＤＫ阻害剤によって発現が制御される哺乳動物遺伝子に対するプロモーターの転写制御下にある、レポーター遺伝子をコードする第１の組み換え発現構築物と、哺乳動物のＣＤＫ阻害剤遺伝子をコードする第２の組み換え発現構築物とを含み、ＣＤＫ阻害剤の発現は哺乳動物細胞内で実験的に誘導される。本発明の方法の本態様の好ましい実施形態において、ＣＤＫ阻害剤はｐ２１、ｐ１６またはｐ２７である。特に好ましい実施形態においては、線維肉腫細胞、より好ましくはヒト線維肉腫細胞、最も好ましくはヒトＨＴ１０８０線維肉腫細胞系列の細胞及びその類縁体である。レポーター遺伝子またはＣＤＫ阻害剤によって誘導される内在性遺伝子の産物は、免疫学的試薬を用いて、遺伝子産物の活性をアッセイすることによって検出されるか、相補的核酸へのハイブリダイゼーションによって検出されることが好ましい。

第５の態様において、本発明は、発癌または老化関連疾病などの細胞老化の病原性結果を阻害するための方法を提供し、本方法は、細胞を、本発明の上記態様において提供される方法を用いて判定される老化または老化の病原性結果を防止する化合物と接触させる工程を含む。

第６の態様において、本発明は本明細書に開示される本発明の方法のいずれかを用いて同定される化合物を提供する。

第７の態様において、本発明はＣＤＫ阻害剤による遺伝子発現の誘導を阻害または防止するための方法を提供する。好ましい実施形態において、本発明は、細胞を、ＣＤＫ阻害剤による遺伝子発現の誘導を阻害または防止する化合物を同定するための新奇の方法によって同定される化合物と接触させる工程を含む。好ましい実施形態において有効量の化合物が、薬学的に許容される担体または他の薬剤を用いて医薬組成物中に調合され、動物、最も好ましくはＣＤＫ阻害剤誘導性遺伝子発現によって引き起こされる疾病に罹った動物に投与される。好ましい実施形態において、疾病は、癌、アルツハイマー病、腎臓病、関節炎、またはアテローム性動脈硬化症である。好ましい実施形態において、本方法はＮＦκＢ阻害剤である化合物を利用する。

本発明の具体的な好ましい実施形態については、以下の特定の実施形態のより詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。

（好ましい実施例の詳細な説明）
本発明は、ＣＤＫ阻害剤誘導性細胞老化及び老化の病原性結果の媒介に関与する遺伝子を同定するための試薬及び方法、ならびに、哺乳動物細胞内において老化及び老化の病原性結果を阻害することのできる化合物を提供する。とりわけ、細胞老化に関与し、ＣＤＫ阻害剤ｐ２１，ｐ２７またはｐ１６によって誘導される遺伝子を同定するための試薬及び方法の実施形態が提供される。

本発明の目的のために、用語「ＣＤＫ阻害剤」は、サイクリン依存性キナーゼ阻害の生化学的活性を有する哺乳動物遺伝子のファミリーのメンバーを包含するものとする。この定義内に明白に含まれるものとしては、ＣＤＫ阻害剤ｐ１５、ｐ１４、ｐ１８、また特にｐ２１、ｐ１６またはｐ２７が挙げられ、後の３つは本発明の試薬及び方法の特に好ましい実施形態である。

本発明の目的のために、「細胞（単数）」または「細胞（複数）」は同義であるものとし、特に、当技術分野において知られているように培養され維持された哺乳動物細胞のインビトロ培養物を包含するものとする。

本発明の目的のために、「細胞遺伝子」を複数形で記載する場合、これは２つ以上の遺伝子のみならず単一の遺伝子も包含するものとする。細胞遺伝子発現の調節の影響、または、細胞遺伝子に由来するプロモーターの転写制御下にあるレポーター構築物が、第１の遺伝子において検出され、その影響を第２の遺伝子もしくはレポーター遺伝子構築物または任意の数のさらなる遺伝子もしくはレポーター遺伝子構築物を試験することにより再現することができることは、当業者によって理解されるであろう。あるいは、２つまたはそれ以上の遺伝子またはレポーター遺伝子構築物の発現を本発明の範囲内において同時にアッセイすることができる。

本明細書において、「馴化培地」という用語は、分裂促進因子または抗アポトーシス因子を含むＣＤＫ阻害剤発現細胞の増殖によって馴化された細胞培養培地を包含するものとする。馴化培地は、哺乳動物細胞培養培地中で、最も好ましくは血清添加剤を含まない合成培地中でＣＤＫ阻害剤発現細胞を培養することにより、好ましい実施形態において作製される。任意のＣＤＫ阻害剤発現細胞を上記馴化培地の生産に有用に用いることができ、そのような細胞内でのＣＤＫ阻害剤発現は内在性ＣＤＫ阻害剤を誘導することによって（たとえばＤＮＡ損傷剤による処理、電離放射線照射もしくは紫外線照射、または接触阻害）、あるいは、本発明による誘導可能なＣＤＫ阻害剤発現構築物を含む細胞を用いて、生理学的に中立な誘導剤中で細胞を培養することによって達成することができる。本発明の本態様の好ましい実施形態において、ＣＤＫ阻害剤はｐ２１、ｐ１６またはｐ２７である。好ましい細胞としては、哺乳動物細胞、好ましくは齧歯類または霊長類細胞、より好ましくはマウスまたはヒト細胞があげられる。特に好ましい実施形態においては、線維肉腫細胞、より好ましくはヒト線維肉腫細胞、最も好ましくはヒトＨＴ１０８０線維肉腫細胞系列の細胞及びその類縁体である。

本発明の目的にために、「老化」という用語は、正常細胞の増殖寿命の最後に起こるか、あるいは細胞毒性薬物、ＤＮＡ損傷もしくは他の細胞傷害に応答して正常細胞または腫瘍細胞内で起こるような、増殖因子によって回復されないＤＮＡ複製及び細胞増殖の永久的中止を含むものと理解される。

老化は、哺乳動物細胞内で多数の方法で誘導することができる。１つめは、インビボまたはインビトロのいずれかにおける正常な細胞の増殖の正常な結果である。正常な細胞が老化する前に経験する細胞分裂、継代、世代の数は限られている。正確な数は、細胞の型と起源の種類によって異なる（ＨａｙｆｌｉｃｋとＭｏｏｒｈｅａｄ、１９６１年、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．第２５巻：５８５〜６２１頁）。任意の細胞型において老化を誘導するための別の方法としては、殆どの抗癌剤、照射、及び細胞分化剤などの細胞毒性薬剤での処理がある。Ｃｈａｎｇら、１９９９年，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第５９巻：３７６１〜３７６７頁を参照のこと。老化は、当該細胞内に腫瘍サプレッサー遺伝子を形質導入することによりあらゆる哺乳動物細胞（ｐ５３、ｐ２１、ｐ１６またはＲｂ等）において即座に誘導することができる。Ｓｕｇｒｕｅら、１９９７年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ 第９４巻：９６４８〜９６５３頁；Ｕｈｒｂｏｍら、１９９７年、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ 第１５巻：５０５〜５１４頁；Ｘｕら、１９９７年、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ 第１５巻：２５８９〜２５９６頁；Ｖｏｇｔら、１９９８年、Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．第９巻：１３９〜１４６頁を参照のこと。

本発明の目的のために、「老化の病原性結果」という用語は、癌、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病、アミロイドーシス、腎臓病、及び関節炎などの疾病を包含するものとする。

本発明の試薬には、ＣＤＫ阻害剤遺伝子、最も好ましくはｐ２１、ｐ１６またはｐ２７の発現を誘導することのできる、任意の哺乳動物細胞、好ましくは齧歯類または霊長類細胞、より好ましくはマウス細胞及び最も好ましくはヒト細胞が含まれ、そのような遺伝子は遺伝子工学によって導入された内在性遺伝子または外来性遺伝子のいずれかである。本実施例では、誘導可能なｐ２１、ｐ２７及びｐ１６遺伝子をコードする組み換え発現構築物を含む組み換え哺乳動物細胞を開示しているが、これらの実施形態は実験上の設計の選択と便宜の問題にすぎず、本発明はｐ２１、ｐ２７またはｐ１６などの内在性ＣＤＫ阻害剤遺伝子の誘導も完全に包含するものと理解されたい。

好ましい実施形態において、本発明は、誘導可能な哺乳動物ｐ２１遺伝子をコードする組み換え発現構築物を含む哺乳動物細胞を提供する。好ましい実施形態において、ｐ２１遺伝子は、引用により本願に組み込まれる米国特許第５，４２４，４００号に記載のヌクレオチド及びアミノ酸配列を有するヒトｐ２１である。代替実施形態において、ｐ２１遺伝子は、好ましくは（参照により本願に組み込まれる米国特許第５，８０７，６９２号に開示されるように）天然のヒトｐ２１蛋白質のアミノ酸残基１〜７８を含み、より好ましくは天然のヒトｐ２１蛋白質のアミノ酸２１〜７１からなるＣＤＫ結合ドメインを含む（Ｎａｋａｎｉｓｈｉら、１９９５年、ＥＭＢＯ Ｊ．第１４巻：５５５〜５６３頁）ヒトｐ２１遺伝子のアミノ末端部分である。好ましい宿主細胞としては、哺乳動物細胞、好ましくは齧歯類または霊長類細胞、より好ましくはマウスまたはヒト細胞があげられる。特に好ましい実施形態は、線維肉腫細胞、より好ましくはヒト線維肉腫細胞、最も好ましくはヒトＨＴ１０８０線維肉腫細胞系列の細胞及びその類縁体である。最も好ましい細胞系列は、２０００年４月６日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（在米国バージニア州マナサス）に受託番号ＰＴＡ１６６４として寄託された、ＨＴ１０８０ ｐ２１−９として識別されるＨＴ１０８０線維肉腫細胞系列類縁体である。

代替の好ましい実施形態において、本発明は誘導可能な哺乳動物ｐ１６遺伝子をコードする組み換え発現構築物を含む哺乳動物細胞を提供する。好ましい実施形態において、ｐ１６遺伝子は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００００７７及びＮＰ＿００００６８に記載されるヌクレオチド及びアミノ酸配列を有するヒトｐ１６である。好ましい宿主細胞としては、哺乳動物細胞、好ましくは齧歯類または霊長類細胞、より好ましくはマウスまたはヒト細胞があげられる。特に好ましい実施形態は、線維肉腫細胞、より好ましくはヒト線維肉腫細胞、最も好ましくはヒトＨＴ１０８０線維肉腫細胞系列の細胞及びその類縁体である。最も好ましい細胞系列は、２００２年１月３１日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（在米国バージニア州マナサス）に受託番号＿＿＿＿＿＿＿として寄託された、ＨＴ１０８０ ｐ１６−５として識別されるＨＴ１０８０線維肉腫細胞系列類縁体である。

代替の好ましい実施形態において、本発明は誘導可能な哺乳動物ｐ２７遺伝子をコードする組み換え発現構築物を含む哺乳動物細胞を提供する。好ましい実施形態において、ｐ２７遺伝子は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００４０６４及びＮＰ ００４０５５に記載されるヌクレオチド及びアミノ酸配列を有するヒトｐ２７またはＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００９８７５及びＮＰ ０３４００５に記載されるヌクレオチド及びアミノ酸配列を有するマウスｐ１６である。好ましい宿主細胞としては、哺乳動物細胞、好ましくは齧歯類または霊長類細胞、より好ましくはマウスまたはヒト細胞があげられる。特に好ましい実施形態は、線維肉腫細胞、より好ましくはヒト線維肉腫細胞、最も好ましくはヒトＨＴ１０８０線維肉腫細胞系列の細胞及びその類縁体である。最も好ましい細胞系列は、２００２年１月３１日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（在米国バージニア州マナサス）に受託番号＿＿＿＿＿＿＿として寄託された、ＨＴ１０８０ ｐ２７−２として識別されるＨＴ１０８０線維肉腫細胞系列類縁体である。

組み換え発現構築物は、当業者によって理解されるように適当な哺乳動物細胞内へ導入することができる。前記構築物の好ましい実施形態は、当技術分野において知られているように、伝達性ベクター、より好ましくはウィルスベクター、最も好ましくはレトロウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノ関連ウィルスベクター、及びワクシニアウィルスベクターにおいて産生される。一般的には、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＶＩＲＯＬＯＧＹ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ、（ＤａｖｉｓｏｎとＥｌｌｉｏｔｔ編）、オックスフォード大学出版局：ニューヨーク、１９９３年を参照のこと。

さらなる好ましい実施形態において、本発明の組み換え細胞は、誘導可能なＣＤＫ阻害剤遺伝子をコードする構築物を含んでおり、この遺伝子は誘導可能なプロモーターの転写制御下にある。より好ましい実施形態において、誘導可能なプロモーターは、誘導剤によって効果の調節が可能なトランス作用因子に対して反応性である。この誘導剤は、温度及び最も好ましくは誘導剤の有無などを含む、実験的に操作されることのできるいかなる因子であってもよい。好ましくは、誘導剤は化学的化合物、最も好ましくはトランス作用因子に特異的な生理学的に中立の化合物である。本願に開示されるような誘導可能なプロモーターを含む構築物の使用時には、組み換え発現構築物からのＣＤＫ阻害剤の発現は、組み換え細胞を、誘導可能なプロモーターからの転写を誘導する誘導剤と接触させることによって媒介されるか、あるいはそのようなプロモーターからの転写を阻害する物質を除去することによって媒介される。本発明方法の本態様の好ましい実施形態において、ＣＤＫ阻害剤はｐ２１、ｐ２７またはｐ１６である。細胞培養の温度を上昇させることによって活性化することができる熱ショックプロモーター、ならびに、より好ましくはｔｅｔプロモーターとその同起源のｔｅｔリプレッサーなどのプロモーター／因子対、及びその哺乳動物転写因子との融合物（米国特許第５，６５４，１６８号，第５，８５１，７９６号、及び第５，９６８，７７３号に開示されるような）、ならびにラクトースオペロンの細菌ｌａｃプロモーターとその同起源のｌａｃリプレッサー蛋白質を含む、様々な誘導可能なプロモーター及び同起源のトランス作用因子が先行技術において知られている。好ましい実施形態において、組み換え細胞は、ｌａｃＩリプレッサー蛋白質と、１つまたは複数のｌａｃ応答要素を含むプロモーターの制御下にあるヒトｐ２１をコードする組み換え発現構築物とを発現し、ｐ２１の発現は、細胞を生理学的に中立な誘導剤であるイソプロピルチオ−β−ガラクトシドと接触させることにより誘導することができる。この好ましい実施形態において、ｌａｃＩリプレッサーは、３’ＳＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，カリフォルニア州ラホーヤから市販）として識別される組み換え発現構築物によってコードされる。代替の好ましい実施形態において、組み換え細胞はｌａｃＩリプレッサー蛋白質と、１つまたは複数のｌａｃ応答要素を含むプロモーターの制御下にあるヒトｐ１６をコードする組み換え発現構築物とを発現し、ｐ１６の発現は、細胞を生理学的に中立な誘導剤であるイソプロピルチオ−β−ガラクトシドと接触させることにより誘導することができる。ｌａｃＩリプレッサーは、３’ＳＳ組み換え発現構築物（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によってコードされる。代替の好ましい実施形態において、組み換え細胞はｌａｃＩリプレッサー蛋白質と、１つまたは複数のｌａｃ応答要素を含むプロモーターの制御下にあるヒトｐ２７をコードする組み換え発現構築物とを発現し、ｐ２７の発現は、細胞を生理学的に中立な誘導剤であるイソプロピルチオ−β−ガラクトシドと接触させることにより誘導することができる。ｌａｃＩリプレッサーは、３’ＳＳ組み換え発現構築物（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によってコードされる。

本発明は、レポーター遺伝子がｐ２１、ｐ１６またはｐ２７などのＣＤＫ阻害剤によって発現が調節されるプロモーターの転写制御下にある、組み換え発現構築物も提供する。これらは、ＣＤＫ阻害剤によって発現が誘導される遺伝子を含む。本発明の本態様の好ましい実施形態において、ＣＤＫ阻害剤はｐ２１、ｐ１６またはｐ２７である。好ましい実施形態において、プロモーターはＣＤＫ阻害剤発現によって発現が誘導または増大される遺伝子に由来し、これらのプロモーターは表ＩＩに示されている。最も好ましくは、プロモーターは血清アミロイドＡ（配列番号：１）、補体Ｃ３（配列番号：２）、結合組織増殖因子（配列番号：３）、インテグリンβ−３（配列番号：４）、アクチビンＡ（配列番号：５）、ナチュラルキラー細胞蛋白質４（配列番号：６）、プロサポシン（配列番号：７）、Ｍａｃ２結合蛋白質（配列番号：８）、ガレクチン−３（配列番号：９）、スーパーオキシドジスムターゼ２（配列番号：１０）、グラニュリン／エピテリン（配列番号：１１）、ｐ６６^ｓｈｃ（配列番号：１２）、カテプシンＢ（配列番号：１４）、β−アミロイド前駆体蛋白質（配列番号：１５）、組織トランスグルタミナーゼ（ｔ−ＴＧアーゼ；配列番号：１６）、クラステリン（配列番号：１７）、プロスタサイクリン刺激因子（配列番号：１８）、血管内皮細胞増殖因子−Ｃ（配列番号：１９）、及びメタロプロテアーゼ−１の組織阻害剤（配列番号：２０）から得られる。これらのレポーター遺伝子は、ＣＤＫ阻害剤遺伝子発現の効果に対する感受性が高く便利な指示薬として用いられ、哺乳動物細胞内でＣＤＫ阻害剤発現の効果を阻害する化合物を容易に同定することを可能にする。これらの構築物に対する宿主細胞としては、細胞内でＣＤＫ阻害剤遺伝子発現の誘導が可能であればどのような細胞でもよいが、上述のような誘導可能なＣＤＫ阻害剤遺伝子を含む組み換え発現構築物も含んだ細胞が好ましい。本発明の本態様の実施において有用なレポーター遺伝子としては、特に限定されないが、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光蛋白質またはアルカリホスファターゼが挙げられる。特に好ましい実施形態は、線維肉腫細胞、より好ましくはヒト線維肉腫細胞、最も好ましくはヒトＨＴ１０８０線維肉腫細胞系列の細胞及びその類縁体である。最も好ましい細胞系列は、２００１年５月１７日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（在米国バージニア州マナサス）に受託番号ＰＴＡ−３３８１として寄託された、ＨＴ１０８０／ＬＵＮＫ４ｐ２１として識別されるＨＴ１０８０線維肉腫細胞系列類縁体である。

好ましい実施形態において、本発明による細胞は、ＣＤＫ阻害剤によって発現が調節される哺乳動物遺伝子に対するプロモーターの転写制御下にあるレポーター遺伝子をコードする第１の組み換え発現構築物と、哺乳動物ＣＤＫ阻害剤遺伝子をコードする第２の組み換え発現構築物との両方を含み、これによりＣＤＫ阻害剤の発現は哺乳動物細胞内において実験的に誘導可能である。本発明の本態様の好ましい実施形態において、ＣＤＫ阻害剤はｐ２１、ｐ１６またはｐ２７である。代替実施形態において、本発明は、ＣＤＫ阻害剤によって発現が調節される哺乳動物遺伝子に対するプロモーターの転写制御下にあるレポーター遺伝子をコードする組み換え発現構築物を含む哺乳動物細胞を提供し、プロモーターは、血清アミロイドＡ（配列番号：１）、補体Ｃ３（配列番号：２）、結合組織増殖因子（配列番号：３）、インテグリンβ−３（配列番号：４）、アクチビンＡ（配列番号：５）、ナチュラルキラー細胞蛋白質４（配列番号：６）、プロサポシン（配列番号：７）、Ｍａｃ２結合蛋白質（配列番号：８）、ガレクチン−３（配列番号：９）、スーパーオキシドジスムターゼ２（配列番号：１０）、グラニュリン／エピテリン（配列番号：１１）、ｐ６６^ｓｈｃ（配列番号：１２）、カテプシンＢ（配列番号：１４）、β−アミロイド前駆体蛋白質（配列番号：１５）、組織トランスグルタミナーゼ（ｔ−ＴＧアーゼ；配列番号：１６）、クラステリン（配列番号：１７）、プロスタサイクリン刺激因子（配列番号：１８）、血管内皮細胞増殖因子−Ｃ（配列番号：１９）、及びメタロプロテアーゼ−１の組織阻害剤（配列番号：２０）をコードする遺伝子から得られる。本発明の本態様の好ましい実施形態において、ＣＤＫ阻害剤はｐ２１、ｐ１６またはｐ２７である。

本発明は、哺乳動物細胞における分裂促進因子または抗アポトーシス因子のＣＤＫ阻害剤誘導性発現を阻害する化合物を同定するためのスクリーニング方法を提供する。好ましい実施形態において、分裂促進因子または抗アポトーシス因子のＣＤＫ阻害剤誘導性発現の阻害剤であることを同定しようとしている化合物の存在下または非存在下、哺乳動物細胞培養内でＣＤＫ阻害剤発現が誘導される。化合物は、細胞内でＣＤＫ阻害剤の発現を誘導し、分裂促進因子もしくは抗アポトーシス因子またはそれらの複数の因子の発現の程度をこの化合物の存在下と非存在下とにおいて比較することにより阻害剤として同定され、そして、阻害剤は、この化合物の存在下において分裂促進因子もしくは抗アポトーシス因子またはそれらの複数の因子の発現の量が減っている場合の化合物として同定される。本発明の本態様の好ましい実施形態において、ＣＤＫ阻害剤はｐ２１、ｐ１６またはｐ２７である。上記馴化培地を作成するためにはあらゆるＣＤＫ阻害剤発現細胞が有用であり、そのような細胞内でのＣＤＫ阻害剤発現は、内在性ＣＤＫ阻害剤を（ＤＮＡ損傷剤や他の細胞毒性化合物での処理、電離放射線照射もしくは紫外線照射、または接触阻害などにより）誘導することにより、あるいは本発明による誘導可能なＣＤＫ阻害剤発現構築物を含む細胞を用いて、この細胞を生理学的に中立な誘導剤中で培養することによって達成される。本発明の本態様の好ましい実施形態において、ＣＤＫ阻害剤はｐ２１、ｐ１６またはｐ２７である。好ましい細胞としては、哺乳動物細胞、好ましくは齧歯類または霊長類細胞、より好ましくはマウスまたはヒト細胞があげられる。特に好ましい実施形態は、線維肉腫細胞、より好ましくはヒト線維肉腫細胞、最も好ましくはヒトＨＴ１０８０線維肉腫細胞系列の細胞及びその類縁体である。本発明の特に好ましい実施形態に従う例示的細胞系列は、２０００年４月６日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（在米国バージニア州マナサス）に受託番号ＰＴＡ１６６４として寄託された、ＨＴ１０８０ ｐ２１−９として識別されるＨＴ１０８０線維肉腫細胞系列類縁体である。例示的細胞集団は、２０００年１０月１０日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（在米国バージニア州マナサス）に受託番号ＰＴＡ−２５８０として寄託された、ＨＴ１０８０／ＬＮｐ１６ＲＯ２として識別されるヒトＨＴ１０８０線維肉腫類縁体である。本発明のこの特定の好ましい実施形態による他の例示的細胞系列は、＿＿＿にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（在米国バージニア州マナサス）に受託番号＿＿＿＿として寄託された、ＨＴ１０８０ ｐ１６−５として識別されるＨＴ１０８０線維肉腫細胞系列類縁体である。本発明のこの特定の好ましい実施形態による他の例示的細胞系列は、＿＿＿にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（在米国バージニア州マナサス）に受託番号＿＿＿＿として寄託された、ＨＴ１０８０ ｐ２７−２として識別されるＨＴ１０８０線維肉腫細胞系列類縁体である。

代替実施形態において、本発明は、哺乳動物細胞において分裂促進因子または抗アポトーシス因子のＣＤＫ阻害剤誘導性発現を阻害する化合物を同定するための方法を提供し、この哺乳動物細胞は、ＣＤＫ阻害剤によって誘導される分裂促進因子または抗アポトーシス因子をコードする細胞遺伝子のプロモーターの転写制御下、レポーター遺伝子をコードする組み換え発現構築物を含んでいる。本発明の本態様の好ましい実施形態において、ＣＤＫ阻害剤はｐ２１、ｐ１６またはｐ２７である。好ましいプロモーターとしては、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ；配列番号：３）、アクチビンＡ（配列番号：５）、エピテリン／グラニュリン（配列番号：１１）、ガレクチン−３（配列番号：９）、プロサポシン（配列番号：７）、クラステリン（配列番号：１７）、プロスタサイクリン刺激因子（配列番号：１８）、血管内皮細胞増殖因子−Ｃ（配列番号：１９）、及びメタロプロテアーゼの組織阻害剤（配列番号：２０）に対するプロモーターが挙げられる。好ましいレポーター遺伝子としては、特に限定されないが、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及び緑色蛍光蛋白質が挙げられ、これらすべては市販されている。これらの実施形態においては、細胞内でＣＤＫ阻害剤の発現が誘導され、レポーター遺伝子の発現の程度が、化合物が存在する場合と存在しない場合とで比較される。阻害剤は、当該化合物の非存在下よりも当該化合物の存在下での方がレポーター遺伝子の発現量が減るような化合物であるとみなされる。本発明の本態様においてはあらゆるＣＤＫ阻害剤発現細胞が有用であり、そのような細胞内でのＣＤＫ阻害剤発現は、内在性ＣＤＫ阻害剤を（ＤＮＡ損傷剤や他の細胞毒性化合物での処理、電離放射線照射もしくはＵＶ照射、または接触阻害などにより）誘導することにより、あるいは本発明による誘導可能なＣＤＫ阻害剤発現構築物を含む細胞を用いて、この細胞を生理学的に中立な誘導剤中で培養することによって達成される。本発明の本態様の好ましい実施形態において、ＣＤＫ阻害剤はｐ２１、ｐ１６またはｐ２７である。好ましい細胞としては、哺乳動物細胞、好ましくは齧歯類または霊長類細胞、より好ましくはマウスまたはヒト細胞があげられる。特に好ましい実施形態は、線維肉腫細胞、より好ましくはヒト線維肉腫細胞、最も好ましくはヒトＨＴ１０８０線維肉腫細胞系列の細胞及びその類縁体である。最も好ましい細胞系列は、２００１年５月１７日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（在米国バージニア州マナサス）に受託番号ＰＴＡ―３３８１として寄託された、ＨＴ１０８０／ＬＵＮＫ４ｐ２１として識別されるＨＴ１０８０線維肉腫細胞系列類縁体である。

本発明は、細胞老化の病原性結果を阻害する化合物を同定するための方法を提供し、この方法により、化合物がＣＤＫ阻害剤によって発現が誘導される遺伝子の誘導を阻害するかどうかを判定することによって当該化合物の効果がアッセイされる。本発明の方法の実施にあたっては、ＣＤＫ阻害剤を誘導することのできる培養哺乳動物細胞が、例えば電離放射線照射もしくは紫外線照射、または接触阻害処理、または細胞毒性薬剤による処理、あるいはＣＤＫ阻害剤をコードする伝達性ベクターによる形質導入により、阻害剤遺伝子を誘導するように処理される。本発明の本態様の好ましい実施形態において、ＣＤＫ阻害剤はｐ２１、ｐ１６またはｐ２７である。より好ましくは、細胞をＩＰＴＧに接触させることによりｐ２１を誘導することのできるＨＴ１０８０ ｐ２１−９細胞（２０００年４月６日に受託番号ＰＴＡ１６６４として、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，在米国バージニア州マナサスに寄託）、または、ＩＰＴＧによってｐ１６を誘導することができるＨＴ１０８０ ｐ１６−５細胞（２００２年１月３１日に受託番号＿＿＿＿として、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，在米国バージニア州マナサスに寄託）、またはＩＰＴＧによってｐ２７を誘導することのできるＨＴ１０８０ ｐ２７−２細胞（２００２年１月３１日に受託番号＿＿＿＿として、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，在米国バージニア州マナサスに寄託）が用いられる。典型的には、細胞は適当な培養培地（例えば、ＨＴ１０８０類縁体に対しては、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加したＤＭＥＭ）中で培養される。ＨＴ１０８０ ｐ２１−９、ＨＴ１０８０ ｐ１６−５またはＨＴ１０８０ ｐ２７−２細胞においては、ＣＤＫ阻害剤遺伝子発現は、ＩＰＴＧを約５０μＭの濃度で培養培地に添加することにより誘導される。典型的には、ＣＤＫ阻害剤は、本発明の方法に従って試験される化合物の存在下または非存在下にて上記細胞内において誘導される。次にＣＤＫ阻害剤が誘導されている細胞からｍＲＮＡを単離し、ＣＤＫ阻害剤によって調節されている遺伝子の発現を分析する。化合物の存在下でＣＤＫ阻害剤が誘導されている細胞における発現と、化合物の非存在下でＣＤＫ阻害剤が誘導されている細胞における発現とを比較し、この差異を用いて、本願に記載の方法に従って細胞遺伝子発現に影響を及ぼしている化合物を同定する。ある実施形態においては、細胞遺伝子発現は、（例えば、Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，在ミズーリ州セントルイスから）市販されているようなオリゴヌクレオチドまたは細胞ｃＤＮＡのマイクロアレイを用いて分析される。代替の実施形態において、ＣＤＫ阻害剤によって誘導されることが知られている遺伝子をアッセイする。遺伝子発現は、ＣＤＫ阻害剤によって調節される遺伝子の１つまたは複数について、細胞ｍＲＮＡまたは蛋白質のいずれかを分析することによってアッセイすることができる。本発明の本態様の好ましい実施形態において、ＣＤＫ阻害剤はｐ２１、ｐ１６またはｐ２７である。最も好ましくは、これらのアッセイに用いられる遺伝子は、表ＩＩに示されている遺伝子である。

代替実施形態において、そのような化合物は、ＣＤＫ阻害剤指向性の実験的操作とは無関係に同定された。そのようなアッセイにおいて、細胞は、特に限定されないが、細胞毒性薬物による処理、照射もしくは細胞分化剤、または腫瘍サプレッサー遺伝子の導入を含む上記に開示した任意の方法で老化を誘導するように処理される。ＣＤＫ阻害剤によって誘導される遺伝子の発現を、試験化合物の存在下または非存在下において分析した。最も好ましくは、遺伝子発現分析のために上記で検討したｍＲＮＡ及び蛋白質アッセイのタイプを用い、これらのアッセイでは表ＩＩに示される遺伝子を用いる。

代替実施形態において、ＣＤＫ阻害剤が誘導される細胞は、ＣＤＫ阻害剤によって誘導される細胞遺伝子のプロモーターの転写制御下にあるレポーター遺伝子をコードする組み換え発現構築物をさらに含む。本発明の本態様の好ましい実施形態において、ＣＤＫ阻害剤は、ｐ２１、ｐ１６またはｐ２７である。好ましい実施形態において、細胞遺伝子は、ＣＤＫ阻害剤によって誘導される遺伝子であり、プロモーターは、表ＩＩに示される遺伝子に由来するものである。そのような遺伝子に対するプロモータとしては、例えば、血清アミロイドＡ（配列番号：１）、補体Ｃ３（配列番号：２）、結合組織増殖因子（配列番号：３）、インテグリンβ−３（配列番号：４）、アクチビンＡ（配列番号：５）、ナチュラルキラー細胞蛋白質４（配列番号：６）、プロサポシン（配列番号：７）、Ｍａｃ２結合蛋白質（配列番号：８）、ガレクチン−３（配列番号：９）、スーパーオキシドジスムターゼ２（配列番号：１０）、グラニュリン／エピテリン（配列番号：１１）、ｐ６６^ｓｈｃ（配列番号：１２）、カテプシンＢ（配列番号：１４）、β−アミロイド前駆体蛋白質（配列番号：１５）、組織トランスグルタミナーゼ（ｔ−ＴＧアーゼ；配列番号：１６）、クラステリン（配列番号：１７）、プロスタサイクリン刺激因子（配列番号：１８）、血管内皮細胞増殖因子−Ｃ（配列番号：１９）、及びメタロプロテアーゼ−１の組織阻害剤（配列番号：２０）が知られている。好ましいレポーター遺伝子としては、特に限定されないが、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及び緑色蛍光蛋白質が挙げられ、これらすべては市販されている。

本発明は、細胞老化及び老化の病原性結果に関連する遺伝子、またはＣＤＫ阻害剤によって誘導される細胞老化の作用を媒介する遺伝子を同定するための方法も提供する。ＣＤＫ阻害剤の誘導は、老化、最終分化、及び細胞損傷に対する応答に伴う細胞増殖停止の不可欠な部分であることが分かっている。後述の実施例において記載するように、ｃＤＮＡアレイハイブリダイゼーションからは、これらの効果が遺伝子発現におけるｐ２１誘導性変化であることが示された。ｐ２１は細胞老化及び老化に関連するか、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病、アミロイドーシス、腎臓病、及び関節炎を含む老化関連疾病に関与していた遺伝子を選択的に誘導した。これらの知見は、生物体内でのｐ２１誘導の累積的効果が、癌及び老化関連疾病の病原性に寄与し得ることを示唆する。さらに、多数のｐ２１によって活性化される遺伝子は、細胞増殖及びアポトーシスに対して潜在的なパラクリンを有する分泌蛋白質をコードしている。この見解と一致して、ｐ２１によって誘導される細胞からの馴化培地は分裂促進活性及び抗アポトーシス活性を示した。

さらに、以下の実施例において示される結果からは、ｐ１６またはｐ２７の誘導発現がｐ２１遺伝子発現とよく似ていること、またｐ２１遺伝子発現によって発現が調節される同様の遺伝子は、ｐ１６またはｐ２７遺伝子発現によっても調節されることが実証された（図６を参照のこと）。したがって、本発明の方法は、内在性のｐ１６またはｐ２７遺伝子の誘導によって、あるいはｐ１６またはｐ２７をコードする誘導可能な発現構築物を含む組み換え細胞において、ｐ１６またはｐ２７遺伝子発現が誘導される細胞も含むように拡張された。

観察されたＣＤＫ阻害剤誘導、特に遺伝子発現に対するｐ２１、ｐ１６及びｐ２７誘導の効果は、細胞老化及び生物体の老化に伴う変化と多くの相関性を示した。これらの相関性のいくつかは、ＣＤＫ阻害剤によって阻害される遺伝子の解析から得られる。老化線維芽細胞は、ｐ２１誘導時に観察されたように、低いレベルのＲｂを発現することが報告されている（Ｓｔｅｉｎら、１９９９年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．第１９巻：２１０９〜２１１７頁）。また、ＣＤＫ阻害剤によって阻害された３つの遺伝子ＣＨＬ１、ＣＤＣ２１及びＲＡＤ５４は、ヘリカーゼファミリーのメンバーをコードしていることも興味深い。ヘリカーゼ群の別の蛋白質における欠失が、早期老化に関連する臨床状態であるウェルナー症候群の原因であり、細胞レベルでは、培養物中の細胞の老化が加速されていることが確認されている（Ｇｒａｙら、１９９７年、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．第１７巻：１００〜１０３頁）。

しかしながら、老化の表現型との最も強い相関性は、ＣＤＫ阻害剤によって誘導される遺伝子の同定から得られ、その多くが複製老化または生物体老化の間にそのレベルを増加させることが知られている。細胞外基質（ＥＣＭ）蛋白質の過剰発現は、複製老化のよく知られた顕著な特徴であり、このグループ内の２つのＣＤＫ阻害剤誘導性遺伝子である、フィブロネクチン１及びプラスミノーゲン活性化因子阻害剤１（ＰＡＩ−１）が、細胞老化に頻繁に関与している（ＣｒｉｓｏｆａｌｏとＰｉｇｎｏｌｏ、１９９６年、Ｅｘｐ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．第３１巻：１１１〜１２３頁に概説）。老化線維芽細胞内で過剰発現されていると報告された他のＣＤＫ阻害剤誘導性遺伝子としては、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ；Ｗｅｓｔら、１９９６年、Ｅｘｐ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．第３１巻：１７５〜１９３頁）、カテプシンＢ（ｄｉＰａｏｌｏら、１９９２年、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．第２０１巻：５００〜５０５頁）、インテグリンβ３（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、１９９７年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．第２４０巻：８８〜９２頁）及びＡＰＰ（Ａｄｌｅｒら、１９９１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ 第８８巻：１６〜２０頁）が挙げられる。ｔ−ＰＡ及びＰＡＩ−１（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、１９８７年、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．第４６巻：６２５〜６３３頁）、カテプシンＢ（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、１９９０年、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．第２４巻：４３〜５４９頁）アクチビンＡ（Ｌｏｒｉａら、１９９８年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．第１３９巻：４８７〜４９２頁）、プロサポシン（Ｍａｔｈｕｒら、１９９４年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．第３４巻：１０６３〜１０７１頁）、ＡＰＰ（Ｏｇｏｍｏｒｉら、１９８８年、Ｊ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．第４３巻：Ｂ１５７〜Ｂ１６２）、ＳＡＡ（ＲｏｓｅｎｔｈａｌとＦｒａｎｋｌｉｎ、１９７５年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．第５５巻：７４６〜７５３頁）、及びｔ−ＴＧアーゼ（Ｓｉｎｇｈａｌら、１９９７年、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｍｅｄ．第４５巻：５６７〜５７５頁）を含む、いくつかのＣＤＫ阻害剤誘導性蛋白質の発現は、生物体の老化と相関性があることが示されている。

最も一般的に用いられている細胞老化のマーカーはＳＡ−β―ｇａｌ活性（Ｄｉｍｒｉら、１９９５年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ 第９２巻：９３６３〜９３６７頁）である。この遺伝子は、ＩＰＴＧ処理したＨＴ１０８０ ｐ２１−９細胞において強く高められる（Ｃｈａｎｇら、１９９９年、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ 第１８巻：４８０８〜４８１８頁）。ＳＡ−β−ｇａｌは、リソソームβ−ガラクトシダーゼの活性の増加と局在性の変化とを見せると示唆されていたが（Ｄｉｍｒｉら、１９９５年、同書中）、他の研究では、老化細胞内でリソソーム活性が高まると記述されている（ＣｒｉｓｔｏｆａｌｏとＫａｂａｋｉｊａｎ、１９７５年、Ｍｅｃｈ．Ａｇｉｎｇ Ｄｅｖ．第４巻：１９〜２８頁）。Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）、カテプシンＢ、酸α−グルコシダーゼ、酸リパーゼＡ、及びリソソームペプスタチン非感受性プロテアーゼを含む５つのリソソーム酵素が表ＩＩに示されている。ｐ２１は、ミトコンドリア蛋白質ＳＯＤ２、メタジン、及び２，４−ジエノイル−ＣｏＡレダクターゼに対する遺伝子も上方制御したが、これは、老化細胞において過剰発現される様々なミトコンドリア遺伝子の報告と相関する（Ｄｏｇｇｅｔｔら、１９９２年、Ｍｅｃｈ．Ａｇｉｎｇ Ｄｅｖ．第６５巻：２３９〜２５５頁；Ｋｏｄａｍａら、１９９５年、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．第２１９巻：８２〜８６頁；Ｋｕｍａｚａｋｉら、１９９８年、Ｍｅｃｈ．Ａｇｉｎｇ Ｄｅｖ．第１０１巻：９１〜９９）。

際立っていることに、本発明者らがｐ２１、ｐ１６またはｐ２７によって誘導されることを見つけた多くの遺伝子の産物は、アルツハイマー病、アミロイドーシス、アテローム性動脈硬化症、及び関節炎と関連していた。たとえば、ＡＰＰはアルツハイマーのアミロイド斑の主成分であるβ−アミロイドペプチドになる。補体Ｃ３（Ｖｅｅｒｈｕｉｓら、１９９５年、Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ．第４２６巻：６０３〜６１０）及びＡＭＰデアミナーゼ（Ｓｉｍｓら、１９９８年、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ 第１９巻：３８５〜３９１頁）もまた、アルツハイマー病において役割を果たすことが示唆されていた。また、ｐ２１によって最も迅速に誘導され、細胞分化、発癌、アポトーシス、及び老化の多面発現的メディエーターであることが記載されている（Ｐａｒｋら、１９９９年、Ｊ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．Ａ Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．第５４巻：Ｂ７８〜Ｂ８３）。ｔ−ＴＧアーゼが、アルツハイマー病とアミロイドーシスの両方に付随するプラークの形成に関与していること（ＤｕｄｅｋとＪｏｈｎｓｏｎ、１９９４年、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．第６５１巻：１２９〜１３３頁）は特に興味深いことである。アミロイドーシスは、アテローム性動脈硬化症、変形性関節症及び関節リウマチにも関与していると見なされる、別のＣＤＫ阻害剤誘導性遺伝子産物であるＳＡＡの沈着によるものである（ＪｅｎｓｅｎとＷｈｉｔｅｈｅａｄ、１９９８年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．第３３４巻：４８９〜５０３頁）。ＣＤＫ阻害剤によって上方制御された他の２つの分泌蛋白質、ＣＴＧＦ及びガレクチン３は、アテローム性動脈硬化症に関与している（Ｏｅｍａｒら、１９９７年、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ 第９５巻：８３１〜８３９頁；Ｎａｃｈｔｉｇａｌら、１９９８年、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．第１５２巻：１１９９〜１２０８頁）。さらに、カテプシンＢ（Ｈｏｗｉｅら、１９８５年、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．第１４５巻：３０７〜３１４頁）、ＰＡＩ−１（Ｃｅｒｉｎｉｃら、１９９８年、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．第６３巻：４４１〜４５３頁）、フィブロネクチン（Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ、１９９３年、Ｓｅｍｉｎ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．第２２巻：３０７〜３１８頁）、ＧＡＬＮＳ及びＭａｃ−２結合蛋白質（Ｓｅｋｉら、１９９８年、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．第４１巻：１３５６〜１３６４頁）は、変形性関節症及び／または関節リウマチに関与している。さらに、ＥＣＭ蛋白質における老化に関係する変化、例えばＰＡＩ−１発現の増加などは、皮膚及び他の組織の構造に年齢特異的な劣化をもたらすと提唱されている（Ｃａｍｐｉｓｉ、１９９８年、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｙｍｐ．Ｐｒｏｃ．第３巻：１〜５頁）。老化細胞によるフィブロネクチン産生の増加は、ＥＣＭフィブロネクチン網目構造の密度を増大させて、これが老化した個体における損傷の治癒を遅らせる原因になっていると示唆されている（Ａｌｂｉｎｉら、１９８８年、Ｃｏｌｌ Ｒｅｌａｔ．Ｒｅｓ．第８巻：２３〜３７頁）。

ｐ２１及びｐ２１誘導可能な遺伝子は、糖尿病性腎症及び慢性腎不全にも関与している。Ｋｕａｎら（１９９８年、Ｊ．Ａｍ、Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．第９巻：９８６〜９９３頁）は、ｐ２１が、糖尿病性腎症のインビトロモデルであるグルコース誘導性メサンギウム細胞肥大の条件下で誘導されることを発見した。Ｍｅｇｙｅｓｉら（１９９６年、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．第２７１巻：Ｆ１２１１〜１２１６）は、ｐ２１がいくつかの急性腎不全の動物モデルにおいて、インビボで誘導され、このｐ２１の誘導がｐ５３に依存しないことを実証した。この病原性プロセスにおけるｐ２１の機能的役割は、ｐ２１（−／−）マウスが実験的糖尿病の条件下で糸球体肥大を発症しないことを発見したＡ１−Ｄｏｕａｈｊｉら（１９９９年、Ｋｉｄｎｙ Ｉｎｔ．第５６巻：１６９１〜１６９９頁）、及び、ｐ２１（−／−）マウスが腎臓の部分切除後にも慢性腎不全を発症しないことを示したＭｅｇｙｅｓｉら（１９９９年、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．第９６巻：１０８３０〜１０８３５頁）によって実証されている。際立ったものとしては、Ｍｕｒｐｈｙら（１９９９年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７４巻：５８３０〜５８３４頁）は、Ｋｕａｎら（１９９８年、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．第９巻：９８６〜９９３頁）によって用いられたものと同じインビトロモデルを用いて研究を行い、メサンギウム細胞の肥大には、本明細書においてｐ２１によって誘導されることが示されたいくつかの遺伝子の上方制御が関与していることを報告した。これらには、ＣＴＧＦ、フィブロネクチン及びプラスミノーゲン活性化因子阻害剤１が含まれる。後者の研究は、ＣＴＧＦが、モデル系におけるメサンギウム基質の蓄積において機能的役割を果たすことも示した（Ｍｕｒｐｈｙら、１９９９年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７４巻：５８３０〜５８３４頁）。これらの結果は、腎不全の病原性において、ｐ２１及びｐ２１によって媒介される遺伝子発現の誘導が関与していることを示す。

特に興味深いのは、最近になって酸化的損傷を増強することが分かった遺伝子であるｐ６６^ｓｈｃの発現がｐ２１によって誘導され、ｐ６６（−／−）マウスがストレス耐性の増加と顕著な寿命の延長をみせた（Ｍｉｇｌｉａｃｃｉｏら、１９９９年、Ｎａｔｕｒｅ 第４０２巻：３０９〜３１３頁）。これらの知見は、遺伝子発現に対するｐ２１の影響が複数の疾病の病原性及び哺乳動物の寿命の全般的制限に寄与しているかもしれないことを示唆する。

治験を実施中の抗癌剤の主要な新しいクラスは、血管形成阻害剤である。これらの薬剤は腫瘍細胞ではなく、腫瘍によって分泌される血管形成因子により刺激される間質毛細管の増殖をターゲットとしている（最近の概説としては、Ｋｅｒｂｅｌ、２０００年、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ 第２１巻：５０５〜５１５頁を参照のこと）。しかしながら、脈管系は腫瘍増殖に必要とされるただ一つの間質成分ではない。複数の研究において、間質線維芽細胞もまたインビトロ及びインビボにおいて腫瘍細胞の増殖を支持すること、及び、正常及び不死化線維芽細胞が、腫瘍形成を促進し癌細胞の死を阻害するパラクリンを分泌することが示されている（ＧｒｅｇｏｉｒｅとＬｉｅｕｂｅａｕ、１９９５年、Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．第１４巻：３３９〜３５０頁；Ｃａｍｐｓら、１９９０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． 第８７巻：７５〜７９頁；Ｎｏｅｌら、１９９８年，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ 第７６巻：２６７〜２７３頁；Ｏｌｕｍｉら、ｌ９９８年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第５８巻：４５２５〜４５３０頁）。上記のような因子は、線維芽細胞馴化培地中において（Ｃｈｕｎｇ、１９９１年、Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ 第１０巻：２６３〜７４頁）、及び共培養の研究において同定された。特に、Ｏｌｕｍｉら（１９９８年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第５８巻：４５２５〜４５３０頁）は、前立腺癌細胞を正常な前立腺線維芽細胞と共培養すると、癌細胞死が強力に低下し、異種移植片腫瘍形成が促進されることを示した。線維芽細胞のパラクリン効果もまた、初期の前立腺上皮細胞発癌において実証されているのと同様に、腫瘍促進活性を有している（Ｏｌｕｍｉら、１９９９年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第５９巻：５００２〜５０１１頁）。これらの結果にも拘わらず、腫瘍関連線維芽細胞のパラクリン発癌性及び腫瘍刺激活性は、薬理学的介入に対するターゲットとして利用されたことはなかった。本発明は、そのような間質線維芽細胞からの分裂促進因子の産生を阻害することができ、腫瘍細胞の増殖を阻害する手だてを与える化合物を検出及び同定するための方法を提供する。

最近になって、このパラクリン腫瘍促進活性は、ｐ２１及びｐ１６の誘導を伴うプロセスである、正常なヒト線維芽細胞の複製老化の間に選択的に高められることが示された（Ｋｒｔｏｌｉｃａら、２０００年、Ｐｒｏｃ．Ａｍｅｒ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎ．Ｒｅｓ．第４１巻、Ａｂｓ．４４８）。間質組織の腫瘍促進効果は、間質線維芽細胞において高レベルのｐ２１を産生する処理（Ｍｅｙｅｒら、１９９９年、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ 第１８巻：５７９５〜５８０５頁）である、電離放射線照射（Ｂａｒｃｅｌｌｏｓ−Ｈｏｆｆ及びＲａｖａｎｉ、２０００年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第６０巻：１２５４〜６０頁）によって、マウスの哺乳動物発癌モデルにおいても誘導されることが示された。これらの結果は、ｐ２１過剰発現細胞の馴化培地において、本明細書に開示されるパラクリン抗アポトーシス活性及び分裂促進活性が、同様の生物学的現象を示す可能性が非常に高いことを示している。

本願において開示される結果は、ＣＤＫ阻害剤誘導が癌または老化関連疾病の発症の可能性を増大させ得る様式で、細胞遺伝子発現に影響を及ぼすことを示している。ＣＤＫ阻害剤発現の急増は、正常な複製老化においてのみならず、細胞損傷に応答しても起こり、いずれの場合も、ＣＤＫ阻害剤誘導の好ましくない効果が年齢依存的に蓄積すると予想される。

したがって、本発明は細胞老化の病原性結果に伴う遺伝子の誘導を阻害することのできる化合物、特に老化の間に誘導される遺伝子、及び特にＣＤＫ阻害剤発現によって誘導される遺伝子を同定する方法を提供する。そのような化合物は、遺伝子発現のＣＤＫ阻害剤媒介性誘導に対する当該化合物の効果によって老化関連疾病を防止する能力、遅延させる能力、または逆行させる能力を示すと予想される。

本発明の１つの実施形態は、ｐ２１、ｐ１６またはｐ２７などのＣＤＫ阻害剤によって誘導される遺伝子発現を阻害するための方法を提供する。好ましい実施形態において、そのような阻害は、細胞を、核因子κ−Ｂ（ＮＦκＢ）の活性、発現または核転座を阻害する有効量の化合物と接触させることによって達成される。当業者であれば、ＮＦκＢ活性を以下の少なくとも３つの様式で阻害できることを理解するであろう。第１に、ＮＦκＢヘテロダイマーを構成している遺伝子のいずれかの転写、プロセッシング及び／または翻訳を下方制御または阻害すること、第２には、細胞内でのＩκＢの発現及び／または活性の不活性化を阻害することに依存する可能性のある、細胞質から核へのＮＦκＢの転座を阻害すること、第３には、ＮＦκＢそのもの活性を阻害することである。本発明は、ＮＦκＢ活性を阻害することにより、これらのいずれかまたはすべての様式でＣＤＫ阻害剤による遺伝子の誘導を阻害する方法も包含する。当技術分野において知られているＮＦκＢ阻害剤の例としては、Ｎ−複素環カルボキシイミド誘導体（例えば、国際出願公開ＷＯ０１／０２３５９に開示される）；アニリド化合物（例えば、国際出願公開ＷＯ０１／１５６０３に開示される）；４−ピリミジノアミノインダン誘導体（例えば、国際出願公開ＷＯ００／０５２３４に開示される）；４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン誘導体（例えば、日本出願ＪＰ１１１９３２３１に開示される）；キサンチン誘導体（例えば、日本出願ＪＰ９２２７５６１に開示される）；カルボキシアルケニルベンゾキノン及びカルボキシアルケニルナフトール誘導体（例えば、日本出願ＪＰ７２９１８６０に開示される）；ジスルフィド及びその誘導体（例えば、国際出願公開ＷＯ９９／４０９０７に開示される）；プロテアーゼ阻害剤（例えば、欧州出願公開ＥＰ６５２２９０に開示される）；フルルビプロフェン、タリドミド、デキサメタゾン、ピロリジンジチオカルバメート、ジメチルフマル酸、メサリジン、ピモベンダン、スルファサラジン、クロロゲン酸メチル、クロロメチルケトン、コハク酸α−トコフェロール、テポキサリン、ならびに、アスピリン、サリチル酸ナトリウム及びスリンダクを含むある種の非ステロイド抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）が挙げられる。

以下の実施例は、本発明の特定の好ましい実施形態をさらに説明することを意図しており、本質的に限定するものではない。

誘導可能なｐ２１遺伝子を含む哺乳動物細胞の作製
ヒト繊維肉腫細胞系列ＨＴ１０８０ ｐ２１−９の組み換え類縁体を、基本的にＣｈａｎｇら（１９９９年、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ 第１８巻：４８０８〜４８１８頁、参照により本願に組み込まれる）に従って生産した。この細胞系列は、イソプロピル−β−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）によって調節されるプロモーターの転写制御下にあるｐ２１コード配列を含むものとした。上記細胞を十分な量のＩＰＴＧの存在下で培養して、内在性ｐ２１遺伝子の誘導が誘発され得るあらゆる付加的効果の非存在下において、研究対象とするｐ２１発現が連続して起こるようにすることにより、ｐ２１の発現を誘導することができる。この細胞系列は、２０００年４月６日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ：在米国バージニア州マナサス）に受託番号ＰＴＡ１６６４として寄託されている。

簡単に説明すると、マウス狭宿主性レトロウィルス受容体及びプラスミド３’ＳＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によってコードされる改変細菌ｌａｃＩリプレッサーを発現するＨＴ１０８０のサブ系列（ＣｈａｎｇとＲｏｎｉｎｓｏｎ、１９９６年、Ｇｅｎｅ 第３３巻：７０３〜７０９頁、参照により本願に組み込まれる）を、図１に構造が示されている組み換えレトロウィルスＬＮｐ２１ＣＯ３を含むレトロウィルス粒子に感染させた。このレトロウィルスベクターは、レトロウィルスの長い末端反復プロモーターの転写制御下にある細菌ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）を含んでいる。ｐ２１をコードする配列をｎｅｏ遺伝子の転写方向とは逆向きに、かつ改変ヒトサイトメガロウィルスプロモーターの制御下にクローン化した。詳細には、ＣＭＶプロモーターは、細胞内で発現されるｌａｃＩリプレッサーに感受性のプロモーターからの発現を行う細菌ｌａｃオペレータ配列を３回反復して含んでいる。ＬＮｐ２１ＣＯ３は、ｐ２１をコードする配列を含む４９２ｂｐのＤＮＡ断片を、親ベクターＬＮＸＣＯ３のＮｏｔＩ及びＢｇｌＩＩ部位にクローニングすることにより構築した（ＣｈａｎｇとＲｏｎｉｎｓｏｎ、同書中、に開示）。

感染後、ＬＮｐ２１ＣＯ３Ｘベクターに感染した細胞は、４００μｇ／ｍＬのＧ４１８（ＢＲＬ−ＧＢＣＯ，在メリーランド州ガイザースバーグ）の存在下で細胞を培養することにより選択した。クローン系列ＨＴ１０８０ ｐ２１−９は、ＬＮｐ２１ＣＯ３によって変換されたＧ４１８耐性細胞系列から、クローン細胞系列が得られるまでの終点希釈によって得た。

細胞増殖アッセイ
実施例１のようにして生産したＨＴ１０８０ ｐ２１−９を用いて、細胞内でｐ２１が発現された場合に細胞増殖にどのような変化が起こるかを調べるための細胞増殖アッセイを行った。

ＨＴ１０８０ ｐ２１−９細胞におけるＬＮｐ２１ＣＯ３ベクターからのｐ２１の発現は、細胞を１０％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、在ユタ州ローガン）及びＩＰＴＧを含有するＤＭＥＭ培地中で培養することによって誘導した。上記アッセイの結果が図２Ａ及び図２Ｂに示されている。図２Ａは、５０μＭのＩＰＴＧの存在下で培養した細胞におけるｐ２１蛋白質産生の経時変化を示している。ｐ２１遺伝子の発現は、培養培地にＩＰＴＧを導入してから６〜１２時間の間は増加し、導入後約２４時間で発現はピークに達した。細胞をＩＰＴＧ含有培地から除去すると、ｐ２１の発現は上昇時とほぼ同程度に迅速に低下し、ＩＰＴＧの除去から約２４時間後に導入前のレベルに戻った（図２Ｂ）。

ＩＰＴＧの存在下における細胞増殖は、以下の３つの方法でアッセイした。^３Ｈ−チミジン取り込み（「ラベリング指標」とよぶ）の測定；顕微鏡による培養中の分裂細胞の数の観察（「分裂指標」とよぶ）；及び細胞周期の異なる部分における培養細胞の分布の判定（「細胞周期分布」とよぶ）。

^３Ｈ−チミジン取り込みアッセイは、実質的に、Ｄｉｍｒｉら（１９９５年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ 第９２巻：９３６３〜９３６７頁）に記載されているようにして実施した。細胞を^３Ｈ−チミジンの存在下で３時間培養し、オートラジオグラフィーによって分析した。ＤＮＡの複製は、培養培地にＩＰＴＧを添加してから９時間までに完全に停止していることが、オートラジオグラフィーによって確認された。分裂指標は、５μｇ／ｍＬの４，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色した後、顕微鏡観察して分裂中の細胞を計算することによって決定し、画像はＬｅｉｃａ ＤＭＩＲＢ蛍光顕微鏡及びＶａｙｔｅｋ（在アイオワ州フェアフィールド）イメージングシステムによって収集した。顕微鏡によって検出可能な分裂細胞は、１４時間のＩＰＴＧ処理によって上記培養から消失した。

細胞周期分布は、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｏｒｔを用いて、Ｊｏｒｄａｎら（１９９６年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第５６巻：８１６〜８２５頁）に記載されているように、ヨウ化プロピジウムで染色した後、ＤＮＡ含量のＦＡＣＳ分析を用いて判定した。細胞周期分布は、ＩＰＴＧ処理の２４時間後に安定した。この時間までに、ＩＰＴＧ処理細胞の４２〜４３％が、それぞれＧ１及びＧ２において進行が停止され、約１５％の細胞が、Ｓ期ＤＮＡ含有物を伴って進行が停止されていた。ＩＰＴＧ処理したＨＴ１０８０ ｐ２１−９細胞もまた、ＳＡ−β−ｇａｌ活性（Ｃｈａｎｇら、１９９９年、同書中）だけでなく、形態的老化マーカー（大きくなって平坦になり、粒度が増大）を示した。これらの結果は、ｐ２１の誘導発現が、細胞周期の停止と細胞老化に特徴的な他の様々な変化のどちらをも生み出すことを示している。

ｐ２１遺伝子発現によって調節される遺伝子発現の解析
実施例２に開示した結果は、ｐ２１誘導の形態学的結果及び細胞周期の結果は、遺伝子発現における複数の変化を反映していることを示唆した。細胞遺伝子発現に対するｐ２１誘導の効果は、以下のようにして調べた。

未処理のＨＴ１０８０ ｐ２１−９細胞及び５０μｍのＩＰＴＧで３日間処理した細胞から、ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを単離した。ｐｏｌｙ（Ａ）^＋ＲＮＡからｃＤＮＡを調製し、そして、ｃＤＮＡは、４，０００個を超える配列を変えた既知のヒト遺伝子と３，０００個のＥＳＴとを含むヒトＵｎｉＧＥＭ Ｖ ｃＤＮＡマイクロアレイを用いた（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｉｎｃ．（在ミズーリ州セントルイス）によって実施されるように）分別ハイブリダイゼーションのためのプローブとして用いた。２，５００個を超える遺伝子とＥＳＴは、未処理ＨＴ１０８０ ｐ２１−９細胞及びＩＰＴＧ処理したＨＴ１０８０ ｐ２１−９細胞の両方から得たプローブについて、測定可能なハイブリダイゼーションシグナルを示した。発現量差（≧２．５）で下方制御された遺伝子または発現量差が≦２．０で上方制御された遺伝子をそれぞれ表Ｉ及びＩＩに示す。

これらの遺伝子のうちの６９個の発現は、ＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンハイブリダイゼーションによって個々に調べた。ＲＴ−ＰＣＲは基本的にＮｏｏｎａｎら（１９９０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ 第８７巻：７１６０〜７１６４頁）に記載されるようにして実施した。ノーザンハイブリダイゼーションのためのプローブは、マイクロアレイ内に存在するｃＤＮＡクローンのインサートから取り出し、当該ｃＤＮＡはＧｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．より入手した。さらに、ｐ２１によって調節されたいくつかの遺伝子産物の発現の変化は、イムノブロッティングによって解析した。イムノブロッティングのためには以下の一次抗体を用いた。Ｃｄｃ２に対するマウスモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、サイクリンＡ（ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ）、Ｐｌｋ１（Ｚｙｍｅｄ）及びＲｂ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）；ＭＡＤ２に対するウサギポリクローナル抗体（ＢａｄＣｏ）、ｐ１０７（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ＣＴＧＦ（Ｆｉｓｐ−１２；Ｄｒ．Ｌ．Ｌａｕより寄贈）、Ｐｒｃ１（Ｄｒ．Ｗ．ＪｉａｎｇとＤｒ．Ｔ．Ｈｕｎｔｅｒより寄贈）及びトポイソメラーゼＩＩα（Ａｂ０２８４；Ｄｒ．Ｗ．Ｔ．Ｂｅｃｋより寄贈）、及びＳＯＤ２に対するヒツジモノクローナル抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）。使用したホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合化二次抗体は、ヤギ抗マウス及びヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）及びウサギ抗ヒツジＩｇＧ（ＫＰＬ）である。すべての試料中の蛋白質濃度は、ＢｉｏＲａｄ蛋白質アッセイキットによる測定後、均一にした。イムノブロッティングは、標準的な手法によって実施し、シグナルはＬｕｍｉＧｌｏ（ＫＰＬ）を用いて化学発光により検出した。

これらの結果は図３Ａ〜図３Ｃに示されている。３８／３９下方制御遺伝子及び２７／３０上方制御遺伝子について、上述のマイクロアレイアッセイによって予測される遺伝子発現の変化を確認した。被験遺伝子の殆どに対してノーザンハイブリダイゼーションまたはＲＴ−ＰＣＲ観察されたシグナルの差異（図３Ａ〜図３Ｃ）は、ｃＤＮＡアレイから判定された発現量差の値よりも高いようであった（表Ｉ及びＩＩ）。このことは、ｃＤＮＡアレイハイブリダイゼーションが遺伝子発現に対するｐ２１の効果の大きさを過小評価する傾向にあることを示唆している。６個の下方制御された遺伝子及び４個の上方制御された遺伝子の発現の変化については、イムノブロッティング（図３Ｂ）またはザイモグラフィー（図示せず）によって蛋白質レベルでも試験し、すべての被験ケースについて確認を行った。

遺伝子発現におけるｐ２１によって媒介される変化は、短期効果と、ｐ２１によって誘導される細胞増殖の停止に続く長期効果とからなることを認めた。この目的にために、ＩＰＴＧの添加及び除去後の、ｐ２１によって阻害された（図３Ｂ）及びｐ２１によって誘導された遺伝子（図３Ｃ）のサブセットのＲＮＡレベルの経時変化を調べた。イムノブロッティングは、Ｒｂリン酸化（電気泳動度によって示される）のｐ２１によって誘導された経時変化、及びＲｂとｃＤＮＡアレイによりｐ２１によって阻害されたいくつかの蛋白質との細胞レベルについてのｐ２１によって誘導された経時変化を解析するために、用いた。これらの結果は図３Ｂに示されている。ＲｂはＩＰＴＧの添加後６時間で早くも脱リン酸化されていることが分かった。さらに、Ｒｂ蛋白質レベルは、１２〜２４時間の間に急激に減少したが（図３Ｂに示される）、ＲＢ ｍＲＮＡレベルには顕著な変化は全く見られなかった（図示せず）。同様の減少がＲｂ関連蛋白質ｐ１０７に対しても観察された（図３Ａに示される）。

１．ｐ２１によって阻害される遺伝子発現
ｐ２１によって阻害されたすべて被験遺伝子は、ｐ２１誘導及び放出に対して迅速な反応を示した。これらの遺伝子のうちの５個（トポイソメラーゼＩＩα、ＯＲＣ１、ＰＬＫ１、ＰＲＣ１及びＸＲＣＣ９）は、ＲＮＡ及び蛋白質レベルの両方に、ＩＰＴＧの添加後４〜８時間の間に顕著な阻害を示した（図３Ｂ）。このパターンは、細胞増殖の停止と脱リン酸化の動態と平行しており、「即時反応」と呼ばれる。他のｐ２１によって阻害された遺伝子（ＣＤＣ２またはＣＨＦＲなど）は、ＤＮＡ複製及び分裂の停止より僅かに遅れて「早期反応」を示し、ｍＲＮＡレベルの大きな増加はＩＰＴＧを添加してから１２時間後にしか検出されなかった。すべてのｐ２１によって阻害された遺伝子は、細胞がまだ増殖停止されており、ＤＮＡ複製及び分裂の再開前である、ＩＰＴＧの除去から１２〜１６時間後に発現を一時停止した（図３Ｂ）。この分析は、ｐ２１によって阻害された遺伝子の発現の変化が、ｐ２１誘導及び放出の短期効果であり、細胞増殖の停止及び回復の結果ではないことを実証した。

まとめると、６９個の遺伝子と３個のＥＳＴが、ｐ２１誘導性細胞において２．５〜１２．６の発現量差で下方制御されることをｃＤＮＡマイクロアレイによって確認した（表ＩＡ）。細胞周期の進行に関与し、本発明者らの個別のアッセイによってＩＰＴＧ処理細胞において下方制御されることが確認されているさらに５個の遺伝子が、表ＩＢに挙げられている。ｃＤＮＡアレイによって同定された下方制御された遺伝子は高い割合で（６９のうち４３）、分裂、ＤＮＡ複製、分離及び修復、及びクロマチン構築が伴い、このことはｐ２１によって媒介される遺伝子発現の阻害が高度に選択的な性質を有していることを示している。

ｐ２１によって下方制御された遺伝子の最大のグループは、分裂のシグナリング、実行、及び制御に関与していた。いくつかのｐ２１によって阻害された遺伝子は、ＤＮＡ複製及び分離、クロマチン構築及びＤＮＡ修復に関与している。これらの遺伝子のいくつかは、ヌクレオチド生合成に関与する酵素をコードし、他の蛋白質はＤＮＡ複製に関与している。いくつかのｐ２１によって阻害される遺伝子は、ＤＮＡ修復に関係している。これらの結果は、治療的介入に対するターゲットになり得る、ｐ２１誘導性の増殖停止の細胞プログラムの成分を発見する機会を示唆するものである。

２．ｐ２１によって誘導される遺伝子発現
ｐ２１発現によって抑制される遺伝子に加えて、上述のアッセイではｐ２１によって誘導される遺伝子も検出した。ｐ２１によって誘導される遺伝子の遺伝子発現のパターンは図３Ｃに示されている。ｐ２１によって阻害される遺伝子とは対照的に、ｐ２１によって上方制御される遺伝子は、ＩＰＴＧの添加から４８時間後、すなわちすべての細胞において増殖の停止が起こった後においてのみ発現の増大を示した。１つの被験遺伝子、組織トランスグルタミナーゼ（ｔ−ＴＧアーゼ）のみが、ＩＰＴＧの添加から１２時間後に検出可能な増加を示したが、その発現が最大に達したのは４８時間であった（図３Ｃに示されるように）。さらに、すべての被験遺伝子（ｔ−ＴＧアーゼ以外）の発現の増大は、ＩＰＴＧからの遊離後少なくとも３日間は持続し、細胞周期の回復後の持続していた（図示せず）。この「遅延反応」動態は、このような遺伝子のｐ２１誘導が、ｐ２１によって媒介される増殖進行の停止に対して遅れた効果であることを示した。

４８個の既知の遺伝子及び６個のＥＳＴまたは未知の機能を有する遺伝子が、ｐ２１によって誘導された細胞において、２．０〜７．８の発現量差で上方制御されることが確認された（表ＩＩ）。このグループに同定可能な遺伝子は非常に高い割合で（２０／４８）、細胞外基質（ＥＣＭ）成分（例えば、フィブロネクチン１、ラミニンα２、Ｍａｃ−２結合蛋白質）、他の分泌蛋白質（例えば、アクチンＡ、結合組織増殖因子、血清アミロイドＡ）、またはＥＣＭ受容体（インテグリンβ３など）をコードしている。これらの分泌蛋白質のうちのいくつかは、ｐ２１によって誘導される細胞内蛋白質の大きなグループとともに（表ＩＩ）、様々な形のストレス反応において誘導されるか、あるいはストレス関連の信号伝達において役割を果たすことが知られている。顕著なものとしては、本発明者らがｐ２１によって誘導されることを見いだした多くの遺伝子は、細胞老化、生物体の老化、または様々な老化関連疾病においても上方制御され、このことから、ｐ２１媒介性遺伝子誘導の抑制が、そのような疾病の発症を防止する手だてを与えうることが示された。下記の実施例５に開示するように、いくつかのｐ２１によって誘導される遺伝子は、パラクリン抗アポトーシス活性及び分裂促進活性を有する分泌因子をコードし、ｐ２１によって誘導される細胞からの馴化培地は、ｐ２１によって上方制御される遺伝子の性質によって予測される２つの生物学的効果、すなわち細胞増殖の刺激とアポトーシスの抑制を示す。この発見は、ｐ２１の「パラクリン」効果が、隣接細胞に対する腫瘍促進効果を介して発癌に寄与している可能性を示唆するものである。このことは、ｐ２１媒介性遺伝子誘導の抑制が、抗発癌効果を達成する手だてを与え得るという可能性をもたらす。

ＩＰＴＧ処理したＨＴ１０８０ ｐ２１−９細胞と血清欠乏ＨＴ１０８０ ｐ２１−９細胞との比較による、ｐ２１誘導の特異性の同定
細胞増殖の停止の結果である可能性の高い細胞遺伝子発現におけるｐ２１誘導性変化の正体を、以下のようにして確かめた。

血清を含まない培地中で細胞を４日間培養することによって生み出した血清欠乏状態により、ＨＴ１０８０ ｐ２１−９細胞において増殖の停止（静止）を誘導した。ＩＰＴＧ処理したＨＴ１０８０ ｐ２１−９細胞とは異なり、血清欠乏細胞においては、細胞は老化形態をみせず、非常に弱いＳＡ−β−ｇａｌ発現しか示さなかった。血清欠乏細胞におけるｐ２１レベルは、ＩＰＴＧ処理細胞で見られる１５〜２０倍の増加とは対照的に、約２倍にしか増加しなかった。図３Ｄは、血清を含まない培地中で４日間後、または５０μＭ ＩＰＴＧ存在下で３日間後に増殖が阻害されたＨＰ１０８０ｐ２１−９細胞における、ｐ２１によって阻害された遺伝子とｐ２１によって誘導された遺伝子の発現を上述のようにしてＲＴ−ＰＣＲ解析した結果を示している。培養培地が５０μＭ ＩＰＴＧを含んでいた場合にＨＴ１０８０ ｐ２１−９細胞において完全に阻害された遺伝子は、血清欠乏細胞においても阻害されたが、これらの遺伝子の大半はＩＰＴＧ処理細胞におけるよりも受けた阻害の程度は小さかった。

ｐ２１によって発現が誘導される遺伝子は、３つの明確に区別できるパターンを見せた。第１のグループは、発現が静止細胞においても老化細胞と同様に強く誘導される遺伝子である。これらにはガレクチン−３、スーパーオキシドジスムターゼ２、補体Ｃ３、及びプロサポシンが含まれ、これらの誘導が細胞増殖の停止の結果であったこと、または上記遺伝子がわずかに高められたｐ２１レベルに対して極めて敏感であったことが示される。第２のグループは、静止細胞においては上方制御されたが、老化細胞においてはそれほど強く上方制御されなかった遺伝子である。これらの遺伝子には、フィブロネクチン−１、Ｍａｃ２結合蛋白質、及びアルツハイマー前駆体蛋白質血清アミロイドＡが含まれる。第３のグループは、静止細胞においては検出可能に誘導されることはないが、老化細胞においては強く誘導された遺伝子である。これらの遺伝子には、ＣＴＧＦ、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１、組織トランスグルタミナーゼまたはナチュラルキラー細胞マーカー蛋白質ＮＫ４、インテグリンβ３及びアクチビンＡが含まれる。

血清欠乏による静止状態の誘導に対するある遺伝子の反応と、ｐ２１のＩＰＴＧ誘導性過剰発現を介した細胞老化との間の差異から、これらの遺伝子が老化の診断マーカーであると同定された。さらに、ｐ２１発現細胞と静止細胞との間での発現を比較することにより、新規の老化マーカーを同定することもできる。

分裂促進因子を含む馴化培地の生産と分裂促進活性アッセイ
ｐ２１によって上方制御された数個の遺伝子（表ＩＩ）は、ＣＴＧＦ（Ｂｒａｄｈａｍら、１９９１年、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．第１１４巻：１２８５〜１２９４頁）、アクチビンＡ（Ｓａｋｕｒａｉら、１９９４年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６９巻：１４１１８〜１４１２２頁）、エピテリン／グラニュリン（Ｓｈｏｙａｂら、１９９０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ 第８７巻：７９１２〜７９１６頁）及びガラクチン−３（Ｉｎｏｈａｒａら、１９９８年、Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．第２４５巻：２９４〜３０２頁）を含む増殖因子として作用する分泌蛋白質をコードする。さらに、ガレクチン−３（Ａｋａｈａｎｉら、１９９７年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第５７巻：５２７２〜５２７６頁）及びプロサポシン（Ｈｉｒａｉｗａら、１９９７年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ 第９４巻：４７７８〜４７８１頁）は、抗アポトーシス活性を有することが示されている。パラクリン抗アポトーシス活性または分裂促進活性は、ｃＤＮＡマイクロアレイハイブリダイゼーションにおける発現量差値が１．８〜１．９であったために表ＩＩに挙げられていない、いくつかのｐ２１誘導可能な遺伝子産物に対しても報告されている。上記の値は、この表に含めるために、あるいはＲＴ−ＰＣＲによる検証のために用いた、任意に選んだ最小値２．０を下回っている。上記の蛋白質は、クラステリン（Ｋｏｃｈ−ＢｒａｎｄｔとＭｏｒｇａｎｓ、１９９６年、Ｐｒｏｇ．Ｍｏｌ．Ｓｕｂｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．第１６巻：１３０〜１４９頁）、プロスタサイクリン刺激因子（ＰＳＦ）（Ｙａｍａｕｃｈｉら、１９９４年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．第３０３巻：５９１〜５９８頁）、血管内皮細胞増殖因子−Ｃ（ＶＥＧＦ−Ｃ）（Ｊｏｕｋｏｖら、１９９６年、ＥＭＢＯ Ｊ．第１５巻：２９０〜２９８頁）、ゲルソリン（Ｏｈｔｓｕら、１９９６年、ＥＭＢＯ Ｊ 第１６巻：４６５０〜４６５６頁）及びメタロプロテアーゼ１の組織阻害剤（ＴＩＭＰ−１）（Ｌｉら、１９９９年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第５９巻：６２６７〜６２７５頁）である。

分泌された分裂促進因子及び抗アポトーシス因子のｐ２１による誘導を検証するために、ＩＰＴＧ処理したＨＴ１０８０ ｐ２１−９細胞からの馴化培地を試験して、これらが細胞増殖及びアポトーシスに対して効果を有するかどうかを調べた。これらの実験において、馴化培地は、ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳを含む１５ｃｍのプレートあたり１０^６個のＨＴ１０８０ ｐ２１−９細胞を播種することにより調製した。翌日、ＩＰＴＧを最終濃度が５０μＭとなるように添加し、３日後にこの培地を、０．５％ＦＣＳ及び５０μＭ ＩＰＴＧを添加したＤＭＥＭに交換した。２日後（ＩＰＴＧ処理して３〜５日目）、この馴化培地を回収し、使用時まで４℃で最長１５日間まで保存した。対照培地は、ＩＰＴＧを含まないＤＭＥＭ／０．５％ＦＣＳを、ＩＰＴＧ処理細胞と同じ密度まで増殖させた未処理細胞に添加し、その２日後に培地を回収することにより調製した。

遅く増殖するヒト線維肉腫細胞系列ＨＳ１５．Ｔを用いて、馴化培地内の分裂促進活性を検出した。分裂促進活性アッセイのためには両方のタイプの馴化培地、ならびに、分裂促進活性をテストするためには新鮮な培地、及び馴化培地と新鮮培地の１：１混合物を用いた。これらの実験において、馴化培地には１％または２％ＦＣＳを添加した。簡単に述べると、ＨＳ１５．Ｔ細胞を１２ウェルプレートに１ウェルあたり１５，０００細胞となるように播種した。２日後、これらの細胞を異なるタイプの培地中で培養した。細胞は馴化培地中で６０時間増殖させ、^３Ｈ−チミジンを３．１３μＣｉ／ｍＬの濃度で添加して２４時間インキュベーションした。その後、細胞を回収して、^３Ｈ−チミジン取り込みをＭｏｓｃａら（１９９２年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ、第１２巻：４３７５〜４３８３頁）に記載されるようにして決定した。

このアッセイにおいて新鮮培地にＩＰＴＧを添加しても全く効果はなかった。新鮮培地とＨＴ１０８０ ｐ２１−９細胞からの馴化培地との間に、細胞増殖についての有意な差異はみられなかった。これに対し、ＩＰＴＧ処理細胞からの馴化培地では、^３Ｈ−チミジンの取り込みが３倍にも上昇していた。ＩＰＴＧ処理細胞からの馴化培地によるＨＳ１５．Ｔの増殖刺激は、メチレンブルー染色によっても検出可能である。

アポトーシスに対するこの馴化培地の効果も調べた。これらの実験では、Ｅ１Ａで不死化したマウス胚線維芽細胞系列Ｃ８を用いた。この細胞系列は、様々な刺激によってアポトーシスの誘導を非常に受けやすい（Ｌｏｗｅら、１９９４年、Ｓｃｉｅｎｃｅ 第２６６巻：８０７〜８１０頁；Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖら、１９９６年、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ第１３巻：１７０９〜１７１９頁）。上記の様々な刺激としては、血清欠乏状態（Ｌｏｗｅら、１９９４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ 第９１巻：２０２６〜２０３０頁）が含まれる。アポトーシスは、６ｃｍのプレートにつき３×１０^５個のＣ８細胞を播種し、翌日に培地を、０．４％血清を添加した新鮮培地または馴化培地（新鮮な血清を添加していない）に交換することにより分析した。ＤＮＡ含量分析及びＤＡＰＩ染色は、２４時間後及び４８時間後に実施し、低血清培地において４８時間後に相対細胞数をメチレンブルー染色によって測定した（Ｐｅｒｒｙら、１９９２年、Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．第２７６巻：１８９〜１９７頁）。

低血清新鮮培地または、ＩＰＴＧ処理細胞または未処理細胞からの馴化培地の添加によって、Ｃ８細胞におけるアポトーシスが迅速に誘導された。このことはＤＡＰＩ染色後の大多数の細胞において検出可能な細胞脱離とアポトーシス形態とによって（図示せず）証明された。しかしながら、４８時間後にまだ付着したままの細胞のメチレンブルー染色によって測定されたように、ＩＰＴＧ処理細胞からの馴化培地は、新鮮培地及び未処理細胞からの馴化培地に比較して、細胞の生存率を強力に高めていた。ｐ２１誘導性細胞からの馴化培地の効果は、培地交換から２４時間後及び４８時間後の付着及び浮遊Ｃ８細胞混合物に対して実施した、細胞ＤＮＡ含有物のＦＡＣＳ分析においてさらに明らかであった。他の多くの細胞系列とは違って、Ｃ８細胞のアポトーシスでは、ＤＮＡの量が減少（サブ−Ｇ１）した細胞はわずかしか生産されず、このことはＧ２／Ｍ ＤＮＡ含有物を有した細胞の選択的消失によって特徴づけられる（Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖら、１９９６年、同書中）。ＩＰＴＧ処理細胞からの馴化培地における血清欠乏細胞は、Ｇ２／Ｍ画分を維持しており、血清富化培地中で増殖している対照細胞に類似した細胞周期プロファイルを見せた。ＩＰＴＧを単独で添加した場合、Ｃ８細胞におけるアポトーシスに対して全く効果を有しなかった。したがって、ＨＴ１０８０細胞におけるｐ２１の誘導は、ｐ２１によって調節されなかった遺伝子の性質によって予測されるように、分裂促進因子及び抗アポトーシス因子の分泌をもたらす。

誘導可能なｐ１６ ^{Ｉｎｋ４Ａ} またはｐ２７ ^Ｋｉｐ１ 遺伝子を含む哺乳動物細胞の生産
誘導可能なＣＤＫ阻害剤ｐ１６^{Ｉｎｋ４Ａ}（ＣＤＫ４／６を優先的に阻害する；Ｓｅｒｒａｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ 第１６巻、７０４〜７０７頁、１９９３年）またはｐ２７^Ｋｉｐ１（ＣＤＫ２を優先的に阻害する；Ｂ１ａｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７２巻、２５８６３〜２５８７２頁、１９９７年）を含む哺乳動物細胞系列を、誘導可能なｐ２１含有細胞系列の作製に関して実施例１に記載したようにして作製した。細菌ｌａｃＩ遺伝子をコードし、マウス狭宿主性レトロウィルス受容体を発現する組み換え発現構築物を含む、ヒトＨＴ１０８０線維肉腫細胞系列の組み換え類縁体（ＨＴ１０８０ ３’ＳＳ６；ＣｈａｎｇとＲｏｎｉｎｓｏｎ、１９９６年、Ｇｅｎｅ 第１８３巻：１３７〜１４２頁）を用いて、誘導可能な系列を作製した。ｐ１６の誘導可能発現のために、ヒトｐ１６の４７１ｂｐコード配列を含むＤＮＡ断片（参照により本願に組み込む、米国特許第５，８８９，１６９号に記載されるように）をＩＰＴＧによって調節されるレトロウィルスベクターＬＮＸＲＯ２（ＣｈａｎｇとＲｏｎｉｎｓｏｎ、１９９６年、Ｇｅｎｅ 第１８３巻：１３７〜１４２頁）中にクローン化した。このレトロウィルスベクターは、レトロウィルスの長い末端反復プロモーターの転写制御下にある細菌のネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）を含み、Ｇ４１８（ＢＲＬ−ＧＩＢＣＯ）を用いた選択が可能である。結果として得られるＬＮｐ１６ＲＯ２と呼ぶ構築物が図４に模式的に描かれている。ｐ２７の誘導可能発現のために、同一のＬＮＸＲ０２ベクター内にマウスｐ２７ｃＤＮＡを保有するベクターＬＮｐ２７ＲＯ２（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００９８７５）が開発され、Ｋｏｋｏｎｔｉｓら（１９９８年、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．第１２巻、９４１〜９５３頁）によって記載されている。このベクターはＤｒ．Ｎ．Ｈａｙ（イリノイ大学、シカゴ）から提供された。

従来のレトロウィルス感染方法を用いて、ＬＮｐ１６ＲＯ２及びＬＮｐ２７ＲＯ２構築物を個別にＨＴ１０８０ ３’ＳＳ細胞に導入した。細胞を４００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８（ＢＲＬ−ＧＩＢＣＯより入手）の存在下で培養することにより、感染細胞を選択した。Ｇ４１８によって選択されたＬＮｐ１６ＲＯ２形質導入細胞の集団をＨＴ１０８０／ＬＮｐ１６ＲＯ２と名付けた。この細胞集団は、２０００年１０月１０日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ；バージニア州マナサス）に寄託されており、受託番号ＰＴＡ−２５８０が与えられている。

この細胞集団をサブクローン化し、２０個のクローン細胞系列を単離し、ＩＰＴＧ誘導可能増殖阻害について調べた。最も強い増殖阻害を示した細胞系列をＨＴ１０８０ ｐ１６−５と名付けた。この細胞系列は、２００２年１月３１日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ；バージニア州マナサス）に寄託されており、受託番号＿＿＿＿＿が与えられている。図５Ａは、５０μＭ ＩＰＴＧを添加したときの、ＨＴ１０８０ ｐ１６−５細胞の細胞周期分布の変化を示したものである。異なる細胞周期にある細胞画分は、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｏｒｔを用いて、Ｊｏｒｄａｎら（１９９６年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第５６巻：８１６〜８２５頁）に記載されるように、ヨウ化プロピジウムによる染色の後、ＤＮＡ含有物のＦＡＣＳ分析を用いて決定した。細胞周期分布はＩＰＴＧ処理から２４時間後に安定した。この時間までにＩＰＴＧ処理細胞の９３％がＧ１において停止していた。このようなＧ１停止は、ｐ１６によるＣＤＫ４／６の阻害によるものと予想される。

同様に、Ｇ４１８によって選択されたＬＮｐ２７ＲＯ２形質導入細胞の集団をサブクローン化し、３８個のクローン細胞系列を単離し、ＩＰＴＧ誘導可能な増殖阻害について調べた。最も強い増殖阻害を示した細胞系列をＨＴ１０８０ ｐ２７−２と名付けた。この細胞系列は、２００２年１月３１日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ；バージニア州マナサス）に寄託されており、受託番号＿＿＿＿＿が与えられている。図５Ｂは、５０μＭ ＩＰＴＧを添加したときの、ＨＴ１０８０ ｐ２７−２細胞の細胞周期分布の変化を示したものである。細胞周期分布はＩＰＴＧ処理から２４時間後に安定した。この時間までにＩＰＴＧ処理細胞の８９％がＧ１において停止していた。このようなＧ１停止は、ｐ１６によるＣＤＫ４／６の阻害によるものと予想される。

ｐ２１誘導可能遺伝子の発現に対するｐ１６及びｐ２７の効果
実施例６に記載されるようにＩＰＴＧによって誘導可能なｐ１６またはｐ２７遺伝子を保持する、ＨＴ１０８０類縁体、ＨＴ１０８０ ｐ１６−５及びＨＴ１０８０ ｐ２７−２を用いて、以下のように遺伝子発現アッセイを行った。

５０μＭ ＩＰＴＧの存在下または非存在下で３日間培養したこれらの細胞系列からＲＮＡを得た。次にこれらのＲＮＡ試料を用いてＲＴ−ＰＣＲアッセイを行った。このＲＴ−ＰＣＲアッセイは、標準化のためにβ_２−ミクログロビンではなくβ−アクチンを用いたことを除いては、基本的に上述の実施例３に記載されるようにして実施した。ｐ２１によって誘導されることが示された上述の１８個の遺伝子について、これらの細胞のＩＰＴＧ処理によって誘導されたｐ１６またはｐ２７遺伝子発現の効果を調べた。試験対象遺伝子としては、アルツハイマー病、アミロイドーシス、関節炎、アテローム性動脈硬化症、及び誘導されたｐ２１発現に関して上述したようなパラクリンアポトーシス効果及び分裂促進効果に関与している遺伝子を含めた。ｐ１６に対する結果は図６Ａに、ｐ２７に対する結果は図６Ｂに示されている。ｐ２１によって誘導されるすべての被験遺伝子は、ＩＰＴＧ誘導性ｐ１６発現によっても誘導され、試験対象遺伝子の殆どすべて（ｔ−ＰＡ及びＣＴＧＦ以外）が、ｐ２７によっても誘導された。図６に示される結果は、Ｐ１６またはｐ２７発現がｐ２１発現に対して検出可能な効果を一切有しなかったことも示している。

ｐ２１応答性プロモーターによって発現されたレポーター遺伝子を含む組み換え発現構築物の作製
プロモーター - レポーター構築物は、以下のようなＮＫ４、ＳＡＡ、補体Ｃ３（ＣＣ３）、プロサポシン、βＡＰＰ及びｔ−ＴＧアーゼを含む、いくつかのｐ２１誘導可能ヒト遺伝子のプロモーターから調製した。ＣＣ３遺伝子のプロモーター領域は、ヒトゲノム配列において（ＮＣＢＩ受託番号Ｍ６３４２３．１）ＣＣ３ ｃＤＮＡの５’末端に隣接していることが確認された（Ｖｉｋら、１９９１年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 第３０巻：１０８０〜１０８５頁）。ＮＫ４遺伝子のプロモーター領域は、ヒトゲノム配列（受託番号ＡＪ００３１４７）において、ＮＫ４ ｃＤＮＡ（受託番号Ｍ５９８０７）の５末端に隣接していることが確認された。以前に説明したＳＡＡ遺伝子（Ｅｄｂｒｏｏｋｅら、１９８９年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．第９巻：１９０８〜１９１６頁）のプロモーターは、ヒトゲノム配列（受託番号Ｍ２６６９８）内で確認された。βＡＰＰ遺伝子のプロモーター領域は、ヒトゲノム配列（受託番号Ｘｌ２７５１）において、βＡＰＰ ｃＤＮＡ（受託番号ＸＭ００９７１０）の５’末端に隣接することが確認された。ｔ−ＴＧアーゼ遺伝子のプロモーター領域は、ヒトゲノム配列（受託番号Ｚ４６９０５）において、ｔ−ＴＧアーゼｃＤＮＡ（受託番号Ｍ５５１５３）の５’末端に隣接することが確認された。プロモーター特異的ＤＮＡのポリメラーゼ鎖長延長反応（ＰＣＲ）増幅は、ＨＴ１０８０ ｐ２１−９細胞からのゲノムＤＮＡを鋳型に用いて実施した。ＰＣＲは、ＰｆｕＴｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）及び表ＩＩＩａにあげたプライマーセットを用いて実施した。それぞれのプライマーセットに対するＰＣＲ条件は、表ＩＩＩｂに記載されている。本実施例に開示されるような使用遺伝子プロモーターを含む、プロモーターＣＤＫ阻害剤によって誘導されるいくつかの遺伝子からのプロモーター配列の増幅のためのプライマーセットは、表ＩＩＩｃに挙げられている。

得られたＰＣＲ産物はＴＯＰＯ ＴＡクローニングベクターｐＣＲ２．１／ＴＯＰＯ（ＳＡＡ，ＣＣ３，βＡＰＰ及びｔ−ＴＧアーゼに対して）、またはｐＣＲＩＩ／ＴＯＰＯ（ＮＫ４に対して）にクローン化した。これらの構築物をシーケンシングによって確認し、プロモーターを正しい向きで含んだＫｐｎＩ−ＸｈｏＩ断片を、標準的な組み換え遺伝子技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、同書中）を用いて、ホタルルシフェラーゼ−レポーターベクターｐＧＬ２ベーシック（Ｐｒｏｍｅｇａ，在ウィスコンシン州マディソン）のＫｐｎＩ及びＸｈｏＩ部位に挿入した。プロサポシンプロモーターの４８０ｂｐ配列を含み、ホタルルシフェラーゼ発現を駆動するクローンは、Ｓｕｎら（１９９９年、Ｇｅｎｅ 第２１８巻、３７〜４７頁）に記載されており、Ｄｒ．Ｇｒａｂｏｗｓｋｉ（子供病院医療センター、在オハイオ州シンシナティ）より提供された。

それぞれのプロモーター構築物に対するプラスミドクローンについては、一過性トランスフェクションアッセイによってｐ２１調節を調べた。ＨＴ１０８０ ｐ２１−９細胞の一過性トランスフェクションは、本質的にＢｉｏ−Ｒａｄプロトコールに記載されているようにして、エレクトロポーレーションによって実施した。それぞれのエレクトロポーレーションに対して、ＨＴ１０８０ ｐ２１−９細胞は、１０％ＦＣ２血清を添加し、ペニシリン、ストレプトマイシン及びグルタミンを含有したＤＭＥＭを用いて１５ｃｍプレートに９５％の集密になるまで増殖させた。次に細胞をトリプシン処理し、ＤＭＥＭまたはＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）に再懸濁し、ＩＥＣ ＨＮ−ＳＩＩ遠心分離器中、１０分間、１，０００ｒｐｍでスピンダウンした。遠心分離に続いて、培地を吸引して、細胞を１ｍＬあたり１８００万〜２０００万細胞の濃度になるように、再度Ｏｐｔｉ−ＭＥＭに懸濁した。４００μＬの細胞懸濁液（約７００万〜８００万細胞）を４ｃｍ溝のエレクトロポーレーションキュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移した。１０〜２０μｇのプロモータ−ルシフェラーゼ構築物を細胞に加えた。いくつかの実験においては、標準化のために、ＣＭＶプロモーターから細菌β−ガラクトシダーゼを発現する対照プラスミドｐＣＭＶｂｇａｌを、１：１０の比率で混合液に加えた。他の実験においては、ＣＭＶプロモーターからウミシイタケルシフェラーゼを発現するベクターｐＲＬ−ＣＭＶを１：２０のモル比で加えることによって標準化を行い、ホタルルシフェラーゼ及びウミシイタケルシフェラーゼの活性は、二重ルシフェラーゼＥｓｓａｙキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて同一試料中で測定した。エレクトロポーレーションは、９６０μＦＤにセットされたキャパシタンス拡張器を備え、２７〜３０のτ値を与える、０．２２ボルトのＢｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒを用いて実施した。予備実験において、エレクトロポーレーション後の細胞の生存率及び付着は約３３％であると測定された。細胞は、１２ウェルプレート内に１ウェルあたり約５０，０００付着細胞の初期密度となるように播種した（同一のものを３つ作成）。細胞を３〜６時間静置した後、培地を吸引して、５０μＭ ＩＰＴＧを含むかまたは含まない新鮮培地に交換した。２〜４日後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄し、３００μＬの１×Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ ＢｕｆｆｅｒまたはＲｅｐｏｒｔｅｒ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中に回収した。溶解物を１０，０００ｇで簡単に遠心してペレットデブリスとし、５０μＬのアリコートをホタルルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で用いるために新鮮なチューブに移した。ルシフェラーゼ活性は、５２．１％の感度のＴｕｒｎｅｒ２０／２０照度計を用いて、遅延時間５秒、第２積分時間１０〜ｌ５秒として測定した。

図７は代表的な実験の結果を示したものである。トランスフェクション細胞におけるｐ２１誘導の２〜４日後、ｐ２１によって誘導された遺伝子のプロモーター構築物からの発現は、ＮＫ４に対しては約７．０倍、ＳＡＡに対しては３．７倍、ＣＣ３に対しては１２．５倍、プロサポシンに対しては３．０倍、βＡＰＰに対しては２．６倍、ｔ−ＴＧアーゼに対しては２．３倍増加していた。これらの結果は、ｐ２１がこれらの遺伝子の発現を、当該遺伝子のプロモーターを調節することにより上方制御すること、及びそのような遺伝子のプロモーター構築物が遺伝子発現のｐ２１によって媒介される調節に対するアッセイに使用可能であることを示した。そうしたアッセイは、下記実施例９に記載するように、ｐ２１によって媒介される遺伝子活性化を阻害する化合物を同定するのに用いることができる。

ｐ２１誘導可能なレポーター構築物で安定的にトランスフェクションされた細胞の作製
ｐ２１によって調節されるルシフェラーゼ発現を有する安定的にトランスフェクションされた細胞系列を開発するために、実施例８に記載し、ｐＬｕＮＫ４と名付けたＮＫ４プロモーター - ルシフェラーゼ構築物を、ＩＰＴＧ誘導可能ｐ２１を保持するＨＴ１０８０ ｐ２１−９細胞に、選択可能なマーカーとしてのプロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼを保持するｐＢａｂｅＰｕｒｏとのコトランスフェクションにより導入した。トランスフェクションは、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．在メリーランド州ガイザースバーグ）を用い、ｐＬｕＮＫ４とｐＢａｂｅＰｕｒｏとの比を１０：１として実施した。安定な形質転換体を１μｇ／ｍＬのプロマイシンを用いて５日間かけて選択した。５４個のプロマイシン耐性細胞系列を単離し、５０μＭ ＩＰＴＧの存在下及び非存在下における、ルシフェラーゼ活性を調べた（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａを使用）。

このアッセイは以下のようにして実施した。細胞を１２ウェルプレートに、ペニシリン／ストレプトマイシン、グルタミン、及び１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有する培地１ｍＬあたり、４０，０００個／ウェルの密度で播種した。付着後、細胞を、時間を変えながら、５０μＭ ＩＰＴＧで処理するか、または未処理のままにした。次に、ルシフェラーゼ活性を上述の実施例８に記載されるようにして測定した。さらに、別のアリコートを細胞溶解物から取り出し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ蛋白質アッセイキット（Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ）を用いて蛋白質濃度を測定した。各試料に対するルシフェラーゼ活性は、蛋白質含量に正規化し、ルシフェラーゼ活性／１μｇ蛋白質として表現した。すべてのアッセイは３回ずつ行い、その平均と標準偏差が示されている。

５４個の被験細胞系列のうちの２１個が、測定可能なルシフェラーゼ活性を示したが、ＨＴ１０８０ ＬｕＮＫ４ｐ２１と名付けたわずか１個の細胞系列だけが、ＩＰＴＧ非存在下よりもＩＰＴＧ存在下でより高いルシフェラーゼ発現を示した。ｐ２１ＬｕＮＫ４細胞系列を用いて実施したアッセイの結果が図８Ａ及び図８Ｂに示されている。図８Ａは、２４時間のＩＰＴＧ処理後のルシフェラーゼ発現のＩＰＴＧ用量依存性を示し、図８Ｂは５０μＭ ＩＰＴＧを添加時のルシフェラーゼ発現の経時変化を示している。この分析から、殆どの誘導はわずか５μＭのＩＰＴＧとわずか１７時間の処理時間を用いて達成できることが分かった。

これらの結果は、レポーター遺伝子転写のｐ２１誘導に関与する安定的にトランスフェクションされた細胞系列を作製するために、ｐＬｕＮＫ４レポーター構築物を使用できることを実証した。このような構築物及び細胞は、ｐ２１によって媒介される遺伝子活性化を阻害する化合物を同定するためのスクリーニングアッセイの基礎を与える。ルシフェラーゼ誘導に必要とされる比較的短い時間（約１７時間）、ならびにＩＰＴＧ処理細胞におけるルシフェラーゼレベルの顕著な増加（約３倍）は、ＬｕＮＫ４９２１細胞系列を、ｐ２１の誘導効果を阻害する化合物の高処理能スクリーニングに適したものにするに違いない。同様の（潜在的にはより良好な）誘導性を有する他の細胞系列もまた、ＬｕＮＫ４ｐ２１を得るために用いた本明細書に開示の方法によって開発することができる。実施例８に記載した結果は、同様のタイプのスクリーニングが、安定的にトランスフェクションされた細胞系列ではなくｐ２１誘導可能遺伝子のプロモーター構築物を用いた一過性トランスフェクションアッセイを用いても行えることを実証している。ルシフェラーゼ発現に基づく高処理能スクリーニングのための方法は、当技術分野においてよく知られている（一過性トランスフェクションに基づくアッセイの最近の例としては、Ｓｔｏｒｚら、１９９９年、Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第２７６巻：９７〜１０４頁を参照。また安定的にトランスフェクションされる細胞系列に基づくスクリーニングの例としては、Ｒｏｏｓら、２０００年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ 第２７３巻．３０７〜３１５頁を参照のこと）。これらの細胞及びアッセイを用いて同定された化合物は、老化関連遺伝子のｐ２１によって媒介される誘導を阻害または防止する治療剤を開発するために有用である。

一過性トランスフェクションアッセイにおいてｐ２１媒介性誘導を阻害するための、ＮＦκＢ及びｐ３００／ＣＢＰ阻害剤の利用
ｐ２１誘導可能遺伝子のプロモーター配列を調べたところ、ＮＫ４を含むこれらのプロモーターの多くが、既知または潜在的なＮＦκＢ結合部位を含んでいることが判明した。いくつかのｐ２１によって誘導された遺伝子が、ＮＦκＢによって正に調節されることが知られている。このような遺伝子としては、スーパーオキシドジスムターゼ２（ＳＯＤ２）（Ｊｏｎｅｓら、１９９７年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．第１７巻：６９７０〜６９８１頁）、ｔ−ＴＧアーゼ（Ｍｉｒｚａら、１９９７年、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．第２７２巻：Ｇ２８１〜Ｇ２８８）、アルツハイマーβ−アミロイド前駆体蛋白質（ＡＰＰ）（Ｇｒｉｌｌｉら、１９９６年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７１巻：１５００２〜１５００７頁）、及び炎症性蛋白質血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）（ＪｅｎｓｅｎとＷｈｉｔｅｈｅａｄ、１９９８年、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．第３３４巻：４８９〜５０３）が挙げられる。ｐ２１は以前に一過性コトランスフェクション実験によって、ＮＦκＢ依存性転写を活性化することが示されている（Ｐｅｒｋｉｎｓら、１９９７年、Ｓｃｉｅｎｃｅ第２７５巻：５２３〜５２７頁）。このｐ２１の効果は、転写補因子ｐ３００及びＣＢＰの刺激によるものであることが示されており（Ｐｅｒｋｉｎｓら、１９９７年、Ｓｃｉｅｎｃｅ 第２７５巻：５２３〜５２７頁）、ｐ３００／ＣＢＰまたは関連する転写補因子の活性化が、上方制御される遺伝子のいくつかに対してｐ２１の効果に関与している可能性がある。したがって、ＮＦκＢまたはｐ３００／ＣＢＰは、ｐ２１による転写の誘導を潜在的に阻害し得る。

ＨＴ１０８０ ｐ２１−９細胞におけるＩＰＴＧ誘導可能なｐ２１発現が、ＮＦκＢの転写活性を刺激するかどうかを判定するために、本発明者らは、一過性トランスフェクションアッセイを用いて、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅより市販されているプラスミドｐＮＦκＢ−Ｌｕｃからのルシフェラーゼ発現のｐ２１誘導の効果を調べた。このプラスミドは、５つのＮＦκＢコンセンサス配列を含む人工プロモーターからホタルルシフェラーゼを発現する。ｐＮＦκＢ−Ｌｕｃからのルシフェラーゼ発現に対するＮＦκＢの遺伝子阻害剤の効果を評価するために、２０μｇのｐＮＦκＢ−Ｌｕｃプラスミド（モル比１：２）を、ＮＦκＢを選択的に阻害するＩκＢキナーゼ（ＤｉＤｏｎａｔｏら、１９９６年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．第１６巻：１２９５〜１３０４頁）の優性変異体を発現するプラスミドＭＡＤ３（ａ．ｋ．ａ、ＰＲＣ／βアクチン−ＨＡ−ＩＫＫα）（Ｄｒ．Ｍ．Ｋａｒｉｎ、カリフォルニア大学サンディエゴ校より提供）と混合した。以後このプラスミドはＩＫＫと呼ぶ。ｐＮＦｋＢ−Ｌｕｃからのルシフェラーゼ発現に対するｐ３００／ＣＢＰ阻害の効果を判定するために、プラスミドｐＮＦｋＢ−Ｌｕｃを、別のアッセイにおいて、Ｃ末端を欠失したアデノウィルスＥ１Ａ蛋白質｛ΔＣＲ２（１２０−１４０）｝に対する欠失遺伝子を発現するベクターと混合した。Ｃ末端を欠失したＥ１Ａ（Ｅ１ＡΔＣＲ２と呼ばれる）は、ｐ３００／ＣＢＰ及び関連する因子（ＰＣＡＦなど）を阻害するが、Ｅ１ＡのＣ末端ドメインのターゲットであるＲｂは阻害しないことが知られている（Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｉら、１９９９年、Ｃｅｌｌ 第９６巻：３９３〜４０３頁）。負の対照として、ｐＮＦκＢ−Ｌｕｃを、Ｅ１ＡΔＮ／ΔＣＲ２と呼ばれ、Ｃ末端とＮ末端の両方に欠失を有した｛ΔＮ（２−３６）｝機能的に不活性な形のＥ１Ａと混合した。Ｅ１ＡΔＣＲ２及びＥ１ＡΔＮ／ΔＣＲ２構築物は、Ｄｒ．Ｖ．Ｏｇｒｙｚｋｏ（ＮＩＣＨＨＤ，ＮＩＨ）より提供された。ｐＮＦｋＢ−ＬｕｃとＩＫＫ、Ｅ１ＡΔＣＲ２またはＥ１ＡΔＮ／ΔＣＲ２との混合物は、実施例８に記載されるように、エレクトロポーレーションによってＨＴ１０８０ ｐ２１−９細胞にトランスフェクションした（標準化のためのｐＲＬ−ＣＭＶプラスミドをさらに加えて）。エレクトロポーレーション後、同数のトランスフェクション細胞を５０μＭ ＩＰＴＧで処理するか、未処理のまま３日間おいた（同一実験につき３回実施）。ホタルルシフェラーゼ活性を測定し、それぞれのトランスフェクション試料において、（ＩＰＴＧの非存在下で）測定されたウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して標準化した。

この分析の結果が図９Ａに示されている。負の対照（Ｅ１ＡΔＮ／ΔＣＲ２）と混合したｐＮＦｋＢ−Ｌｕｃは、ＩＰＴＧの存在下において最大１５倍もの誘導を示し、ＨＴ１０８０ ｐ２１−９細胞におけるＮＦκＢ転写活性の増加が実証された。ｐＮＦｋＢ−Ｌｕｃを阻害剤と混合すると、ＩＰＴＧ処理細胞または未処理細胞においてルシフェラーゼの発現がほぼ完全に停止し、この阻害剤の有効性が実証された。Ｅ１ＡΔＣＲ２は、ＩＫＫよりと同様でではあるがより弱い効果しか有しておらず、ＨＴ１０８０ ｐ２ｌ−９細胞におけるＮＦκＢ活性に対するｐ３００／ＣＢＰの必要性が示唆された（図９Ａ）。

６個のｐ２１誘導可能遺伝子に対して、プロモーター - ルシフェラーゼ構築物を用いて同様の分析を行った。ＳＡＡに対する結果は図９Ｂに、プロサポシンに対する結果は図９Ｃに、βＡＰＰに対する結果は図９Ｄに、ｔ−ＴＧアーゼに対する結果は図９Ｅに、補体Ｃに対する結果は図９Ｆに、ＮＫ４に対する結果は図９Ｇに示されている。ＩＫＫとＥ１ＡΔＣＲ２のいずれもが、ＩＰＴＧの存在下においてすべての被験プロモーターの誘導を阻害したことから、ｐ２１によるこれらのプロモーターの調節が、部分的にｐ３００／ＣＢＰ及びＮＦκＢを介していることが分かった。しかしながら、定量的には、これらの阻害剤の効果はプロモーター間で異なっていた。ＳＡＡ（図９Ｂ）及びＮＫ４（図９Ｇ）のプロモーターの基底発現及びＩＰＴＧ刺激性発現はいずれも、ＮＦκＢと殆ど同等の強さでＩＫＫ及びＥ１ＡΔＣＲ２によっても阻害された。これとは対照的に、上記阻害剤は、プロサポシン（図９Ｃ）、βＡＰＰ（図９Ｄ）、ｔ−ＴＧアーゼ（図９Ｅ）または補体Ｃ３（図９Ｆ）のプロモーターからの基底発現に対して、殆どまたは全く効果を示さなかったが、ＩＰＴＧの存在下ではこれらのプロモーターの誘導を阻害した。これらの結果は、ｐ３００／ＣＢＰとＮＦκＢがすべての被験プロモーターのｐ２１による誘導に関与していることを示す。

ｐ２１媒介性遺伝子誘導を阻害するための非ステロイド抗炎症剤の使用
臨床用途において最も研究の進んでいるＮＦκＢ阻害剤は、アスピリン、サリチル酸ナトリウム及びスリンダクなどの、ある種の非ステロイド抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）である。（ＫｏｐｐとＧｈｏｓｈ、１９９４年、Ｓｃｉｅｎｃｅ 第２６５間：９５６〜９５９頁；Ｙｉｎら、１９９８年、Ｎａｔｕｒｅ 第３９６巻：７７〜８０頁；Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９９９年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７４巻：２７３０７〜２７３１４頁）。上記実施例９に記載のＬｕＮＫ４ｐ２１細胞系列を用いて、これらの細胞系列におけるｐ２１によるルシフェラーゼ活性の誘導を、ＮＦκＢ阻害活性を有するＮＳＡＩＤによって阻害することができるかどうかを調べた。

ルシフェラーゼ活性アッセイは、実質的に実施例９に記載されるように実施した。ルシフェラーゼ活性は、５０μＭ ＩＰＴＧの存在下または非存在下で１６時間インキュベーションし、２０ｍＭサリチル酸ナトリウム、１ｍＭスリンダク、または１０ｍＭアスピリンの存在下または非存在下でさらに２０時間処理した後に測定した。さらに、ＮＦκＢを阻害しない２つのＮＳＡＩＤ、すなわちインドメタシンとイブプロフェン（それぞれ２５μＭで）についても試験した（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９９９年、同書中）。ＮＳＡＩＤ濃度は、これらの薬剤が抗炎症特性に必要とする、患者の血清中の当該薬剤の薬理学的濃度に基づいたものとした（Ｙｉｎら、１９９８年、同書中）。

これらのアッセイの結果が図１０に示されている。ＩＰＴＧは、ＮＳＡＩＤの非存在下においてルシフェラーゼ活性を約３〜４倍増加させたが、この誘導はサリチル酸塩、スリンダクまたはアスピリンの存在下ではほぼ完全に無効化されていた。これとは対照的に、インドメタシン及びイブプロフェンは、ＩＰＴＧによるルシフェラーゼの誘導に顕著な違いを与えなかった。

ＮＦκＢ阻害性ＮＳＡＩＤが、ＮＫ４プロモーターからの転写の誘導だけでなく、内在性のｐ２１誘導可能な遺伝子のＲＮＡ発現も阻害したかどうかを確かめるために、ＬｕＫ４ｐ２１細胞を６ウェルプレートに１ウェルあたり１２５，０００細胞となるように播種し、２５０μＭ、５００μＭまたは１ｍＭ濃度のスリンダクの存在下または非存在下にて、５０μＭ ＩＰＴＧ処理するか、または未処理のまま４８時間（ｐ２１誘導可能遺伝子の最大刺激に必要とされる時間；Ｃｈａｎｇら、２０００年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ 第９７巻：４２９１〜４２９６頁）おいた。このインキュベーション後、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用いて細胞からＲＮＡを抽出し、そして、いくつかのｐ２１誘導可能遺伝子の相対ＲＮＡレベルは、ｃＤＮＡ標準化のためにβ_２−ミクログロビンではなくβアクチンを用いたことを除いては基本的にＮｏｏｎａｎら（１９９０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ 第８７巻：７１６０〜７１６４頁）に記載されるようにして、逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって決定した。被験遺伝子のそれぞれに対するＰＣＲプライマーの配列が表ＩＶａに示されている。ＰＣＲサイクルは以下の通りである。１サイクル目は、変性のための３分間と、アニーリングのための３０秒間と、伸長のための２分間とからなり、残りのサイクルは、変性のための３０秒間と、アニーリングのための３０秒間と、伸長のための１分間からなるものとした。ＰＣＲサイクルの温度条件及びＰＣＲ産物のサイズは、表ＩＶｂに示されている。

ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果が図１１に示されている。ＮＫ４（このＮＫ４のプロモーターは、ＬｕＮＫ４ｐ２１細胞においてルシフェラーゼ発現を駆動するために用いられた）に対しては、スリンダクの添加はＩＰＴＧ非存在下における遺伝子発現に僅かな効果しか与えなかったが、すべてのスリンダク濃度で、ＩＰＴＧ存在下におけるＮＫ４ＲＮＡレベルの用量依存性低下が見られた。非常によく似た結果がｔ−ＴＧアーゼＲＮＡを用いた場合にも得られた。他のすべての被験遺伝子を用いた場合に、スリンダクはＩＰＴＧ非存在下において遺伝子発現の用量依存性低下を与えた。この効果の結果として、スリンダクの最高試験用量（１ｍＭ）では、ＩＰＴＧ存在下における遺伝子発現が低下しなかったが、それより低いスリンダク用量においてはＩＰＴＧ効果に顕著な低下が見られた。特に、ＩＰＴＧの効果は、ＡＰＰ遺伝子については２５０及び５００μＭスリンダクによって減少したが、ｐ６６^Ｓｈｃ、ＣＴＧＦ及びＭａｃ２結合蛋白質（Ｍａｃ２−ＢＰ）については、２５０μＭスリンダクによる場合のみ減少した。どの被験スリンダク濃度も、プロサポシンまたはスーパーオキシドジスムターゼ２（ＳＯＤ２）のＩＰＴＧ誘導性ＲＮＡレベルに顕著な低下を与えなかった。プロサポシンに対するスリンダク効果の欠如は、プロサポシンプロモーターに対するＩＫＫ阻害剤の穏やかな効果と一致するものである（上記実施例１０を参照）。したがって、スリンダクの中用量（２５０μＭ）では、被験遺伝子の殆どに対してｐ２１の転写誘導能が阻害される。

上記の結果から、ｐ２１誘導可能な遺伝子のプロモーターからのレポーター発現のｐ２１媒介性誘導の阻害アッセイによって、発癌及び老化関連疾病に伴う遺伝子のｐ２１媒介性誘導を阻害する物質を同定することができることが実証された。特に、ＬｕＮＫ４ｐ２１細胞系列を用いたプロモーターに基づくアッセイにおいて有効な阻害剤であると初めて同定された物質（スリンダク）は、いくつかの老化関連遺伝子のｐ２１による誘導を阻害することが発見された。これらの結果は、さらに、ＮＦκＢ阻害剤として有効なＮＳＡＩＤが、ＣＤＫ阻害剤による老化関連疾病の誘導を防止することができることを実証した。

ＣＤＫ阻害剤による転写の誘導を阻害する物質は、アルツハイマー病、アミロイドーシス、アテローム性動脈硬化症、及び関節炎を含む老化関連疾病の化学的予防または発症の遅延に対して臨床的に有用であり得る。さらに、そのような化合物は、当該化合物の有する分泌増殖因子（ＣＴＧＦなど）の発現に対する効果により、癌の治療または予防における有用性を有し得る。実際に、ＮＦκＢ阻害活性を有するＮＳＡＩＤについての入手可能な臨床データは、この範囲の用途を支持している。したがって、スリンダク、アスピリン、及びサリチル酸塩を含むいくつかのＮＳＡＩＤが、大腸癌や様々な種類の癌における化学的予防価値を有することが示され、大腸ポリープの消失を促進した（「ＣＡＮＣＥＲ．ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ＆ＰＲＡＣＴＩＣＥ ＯＦ ＯＮＣＯＬＯＧＹ」、ＤｅＶｉｔａら編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ：フィラデルフィア、５９９〜６０７頁の中の、Ｌｅｅら、１９９７年、「アスピリンとその他の非ステロイド性抗炎症薬の使用と癌発生の危険性」）。また、アスピリン及び他のＮＳＡＩＤを使用して、アルツハイマー病の危険性が低下することが示されている（Ｓｔｅｗａｒｔら、１９９７年、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、第４８巻：６２６〜６３２頁）。長期のアスピリン治療によって、アテローム性動脈硬化症の発生率が低下するという報告もある（Ｓｌｏｏｐ、１９９８年、Ａｎｇｉｏｌｏｇｙ第４９巻：８２７〜８３２頁）。最後に、スリンダクは、関節炎の治療において臨床効果が証明されている最も一般的に用いられている薬剤の１つである（Ｂｒｏｇｄｅｎら、１９７８年、Ｄｒｕｇｓ第１６巻：９７〜１１４頁）。ＮＳＡＩＤのこれらの有益な効果のいくつかが、それらの持つシクロオキシゲナーゼ２阻害剤としての活性によるものであることが示されているが（Ｐｅｎｎｉｓｉ，１９９８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ 第２８０巻：１１９１〜１１９２頁）、本明細書に開示した結果は、これらの臨床活性が、おそらくは上記化合物のＮＦκＢ阻害活性を介した、ｐ２１によって誘導される遺伝子発現の阻害によるのではないかという可能性を示唆する。本発明によって提供されるアッセイ系及びスクリーニング系により、当業者は、この活性の向上のために様々なＮＳＡＩＤ誘導体を試験することができるようになる。さらに、これらの結果は、ＮＦκＢ及びｐ３００／ＣＢＰ阻害剤の一般的なカテゴリーを、癌及び老化関連疾病の化学的予防または治療のための物質として用いることの基礎を提供する。

ｐ１６及びｐ２７によるｐ２１誘導可能遺伝子のプロモーターの刺激
実施例７において実証したように、ｐ２１誘導可能遺伝子の発現は、他のＣＤＫ阻害剤、ｐ１６^{Ｉｎｋ４Ａ}及びｐ２７^Ｋｉｐ１によっても上方制御される。ｐ２１誘導可能な遺伝子のプロモーターが、これらのＣＤＫ阻害剤によって刺激されるかどうかを判定するために、実施例８に記載のｐＮＦκＢ−Ｌｕｃ及びプロモーター - ルシフェラーゼ構築物を、実施例６に記載されている、ｐ１６のＩＰＴＧ誘導可能発現を有するか（ＰＴ１０８０ｐ１６−５）またはｐ２７のＩＰＴＧ誘導可能発現を有する（ＰＴ１０８０ｐ２７−２）ＨＴ１０８０類縁体にトランスフェクションした。次にこれらのプロモーターの発現に対するＩＰＴＧの効果を、実施例８のｐ２１−誘導可能系列に対して記載したようにして分析した。

ｐＮＦκＢ−ＬｕｃからのＮＦκＢ−依存性発現は、ｐ１６（図１２Ａ）またはｐ２７（図１３Ａ）の誘導によって強く刺激された。ｐ２７の場合、ＮＦκＢに対して観察された誘導の特異性は、基底発現及びＩＰＴＧ誘導発現の両方を強く阻害したＩＫＫ阻害剤とのコトランスフェクションによっても実証された（図１３Ａ）。これらの結果は、ｐ２１のような上記ＣＤＫ阻害剤がＮＦκＢ活性を刺激することを実証する。さらに、ｐ２１誘導可能遺伝子のすべての被験プロモーターは、ｐ１６またはｐ２７によっても上方制御された。特に、ＩＰＴＧによって誘導されるｐ１６発現は、補体Ｃ３（図１２Ｂ）、ＳＡＡ（図１２Ｃ）、ｔ−ＴＧアーゼ（図１２Ｄ）及びＮＫ４（図１２Ｅ）のプロモーターからのレポーター発現の誘導も導いた。ＩＰＴＧによって誘導されるｐ２７発現は、補体Ｃ３（図１３Ｂ）、βＡＰＰ（図１３Ｃ）、ｔ−ＴＧａｓｅ（図１３Ｄ）及びＮＫ４（図１３Ｅ）のプロモーターを強く誘導した。これらの発見は、ｐ２１誘導可能なプロモーターが、ｐ２１によってだけでなく、ｐ１６やｐ２７などの他のＣＤＫ阻害剤によっても活性化されることを示している。

上記開示は本発明のある特定の実施形態を強調するものであって、これらに対するすべての変更または代替は、添付の請求項に記載される本発明の精神及び範囲に含まれると理解すべきである。

図１は、ヒトＨＰ１０８０線維肉腫細胞系列変種ＨＴ１０８０ ｐ２１−９を生産するために用いたＩＰＴＧによって調節されるレトロウィルスベクターＬＮｐ２１ＣＯ３の模式図である。 図２Ａは、５０μＭ ＩＰＴＧを添加した後の、ｐ２１誘導の経時変化を示したグラフであり、ｐ２１のレベルはＥＬＩＳＡによって測定されている。図２Ｂは、ＩＰＴＧ除去後のｐ２１減衰の経時変化を示したグラフである。 図３Ａは、ＲＴ−ＰＣＲ実験（左）、細胞ｍＲＮＡ発現のノーザンブロット分析（中央）、及び表示された遺伝子の発現のＩＰＴＧ誘導性変化に対するイムノブロッティングアッセイ（右）のゲル電気泳動パターンの写真であり、「Ｃ」は対照の未処理ＨＴ１０８０ ｐ２１−９細胞であり、「Ｉ」は５０μＭ ＩＰＴＧで３日間処理した細胞である。β２−ミクログロブリン（β２−Ｍ）をＲＴ−ＰＣＲに対する標準化対照として用い、Ｓ１４リボソーム蛋白質をノーザンハイブリダイゼーションのために用いた。 図３Ｂは、ＩＰＴＧを添加及び除去した場合の表示したｐ２１によって阻害される遺伝子の発現における経時変化を示す、ＲＧ−ＰＣＲ実験（左）及びイムノブロッティング分析（右）のゲル電気泳動の写真である。 図３Ｃは、ＩＰＴＧを添加及び除去した場合の表示したｐ２１によって阻害される遺伝子の発現における経時変化を示す、ＲＧ−ＰＣＲ実験（左）及びイムノブロッティング分析（右）のゲル電気泳動の写真である。 図３Ｄは、未処理の対照ＨＴ１０８０ ｐ２１−９細胞（Ｃ）、血清不足静止細胞（Ｑ）及びＩＰＴＧ処理老化細胞（Ｉ）の間での遺伝子発現の比較である。 図４は、ヒトＨＰ１０８０線維肉腫細胞系列変種ＨＴ１０８０／ＬＮｐ１６ＲＯ２を生産するために用いたＩＰＴＧによって調節されるレトロウィルスベクターＬＮｐ１６ＲＯ２の模式図である。 図５Ａおよび５Ｂは、５０μＭ ＩＰＴＧを添加時の、ＨＴ１０８０ ｐ１６−５（図５Ａ）またはＨＴ１０８０ ｐ２７−２（図５Ｂ）細胞の細胞周期分布の変化を示した模式図である。 図６Ａおよび６Ｂは、ＨＴ１０８０ ｐ１６−５細胞におけるｐ１６（図６Ａ）またはＨＴ１０８０ ｐ２７−２細胞におけるｐ２７（図６Ｂ）のＩＰＴＧ誘導性発現時における、表示された遺伝子の発現のＩＰＴＧ誘導性変化を検出するためのＲＴ−ＰＣＲ実験のゲル電気泳動パターンの写真であり、「−」は対照細胞であり、「＋」は５０μＭ ＩＰＴＧで３日間処理した細胞である。β−アクチンをＲＴ−ＰＣＲのための標準化対照として用いた。 図７は、ＨＴ１０８０ ｐ２１−９細胞におけるｐ２１誘導の、示されたｐ２１誘導可能遺伝子のプロモーターによって駆動されるルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現に対する影響を示した図である。５０μＭ ＩＰＴＧの存在下または非存在下で２日間（プロサポシンプロモーターの場合）または３日間（他のすべてのプロモーターの場合）培養した後、一過性トランスフェクションの後に、アッセイを実施した。アッセイは、３回（プロサポシンの場合）または４回（他のすべてのプロモーターの場合）実施した。 図８Ａおよび８Ｂは、２４時間のＩＰＴＧ処理後のＬｕＮＫ４ｐ２１細胞系列におけるルシフェラーゼ発現のＩＰＴＧ用量依存性と（図８Ａ）、５０μＭ ＩＰＴＧ添加時のルシフェラーゼ発現の経時変化（図８Ｂ）とを示すグラフである。 図９Ａ〜９Ｇは、ＮＦκＢ依存性プロモーター（図９Ａ）または表示したｐ２１誘導可能遺伝子のプロモーター（図９Ｂ〜図９Ｇ）によって駆動されるルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現に対する、ＨＴ１０８０ ｐ２１−９細胞内のｐ２１誘導の影響を示している。プロモーター - レポーター構築物は、ＮＦκＢの優勢な阻害剤（ＩＫＫ）、ｐ３００／ＣＢＰを阻害するＣ欠失Ｅ１Ａ変異体（Ｅ１ＡΔＣＲ２）、またはＥ１Ａの非機能性Ｎ及びＣ欠失変異体（Ｅ１ＡΔＮ／ΔＣＲ２）を発現するベクターと、１：２のモル比で混合した。ルシフェラーゼレベルは、ＩＰＴＧの存在下または非存在下において３日後に測定し、コトランスフェクションされたｐＲＬ−ＣＭＶプラスミドから発現されたウミシイタケルシフェラーゼのレベル（図９Ｃ）または細胞蛋白質のレベルのいずれかによって標準化した。実験は３回実施した。 図１０は、ＩＰＴＧの存在下及び非存在下で様々な量のＮＳＡＩＤとともにインキュベーションしたＬｕＮＫ４ｐ２１細胞におけるルシフェラーゼ活性の棒グラフを示す。 図１１は、様々な量のスリンダクによる表示された遺伝子の発現におけるＩＰＴＧに誘導性変化の阻害を検出するための、ＬｕＮＫ４ｐ２１を用いたＲＴ−ＰＣＲ実験のゲル電気泳動パターンの写真である。β−アクチンをＲＴ−ＰＣＲのための標準化対照として用いた。 図１２Ａ〜１２Ｅは、ＨＴ１０８０ ｐ１６−５細胞における、ＮＦκＢ依存性プロモーター（図１２Ａ）または表示したｐ２１誘導可能な遺伝子のプロモーター（図１２Ｂ〜１２Ｅ）によって駆動されるルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現に対する、ｐ１６誘導の影響を示す図を示す。ルシフェラーゼレベルは、ＩＰＴＧの存在下または非存在下において３日後に測定し、コトランスフェクションされたｐＲＬ−ＣＭＶプラスミドから発現されたウミシイタケルシフェラーゼのレベルによって標準化した。図１２Ａ及び図１２Ｅの実験は３回ずつ実施し、図１２Ｂ、１２Ｃ及び１２Ｄは１点のみで実施した。 図１３Ａ〜１３Ｅは、ＨＴ１０８０ ｐ２７−２細胞における、ＮＦκＢ依存性プロモーター（図１３Ａ）または表示したｐ２１誘導可能な遺伝子のプロモーター（図１３Ｂ〜１３Ｅ）によって駆動されるルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現に対する、ｐ２７誘導の影響を示す図を示す。図１３Ａにおいて、プロモーター - レポーター構築物は、ＮＦκＢの優勢な阻害剤（ＩＫＫ）を発現するベクターと、１：２のモル比で混合した。ルシフェラーゼレベルは、ＩＰＴＧの存在下または非存在下において３日後に測定し、コトランスフェクションされたｐＲＬ−ＣＭＶプラスミドから発現されたウミシイタケルシフェラーゼのレベルによって標準化した。すべての実験は３回実施した。

Claims (100)

1. サイクリン依存性キナーゼ阻害剤によって誘導される哺乳動物遺伝子に由来するプロモーターに作動可能に連結された、レポーター遺伝子をコードする組み換え発現構築物。
2. レポーター遺伝子が、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光蛋白質、またはアルカリホスファターゼをコードすることを特徴とする、請求項１に記載の組み換え発現構築物。
3. プロモーターが、ＣＤＫ阻害剤によって誘導されるヒト遺伝子に由来するプロモーターであることを特徴とする、請求項１に記載の組み換え発現構築物。
4. プロモーターが、表ＩＩに示されるヒト遺伝子に由来するプロモーターであることを特徴とする、請求項３に記載の組み換え発現構築物。
5. プロモーターが、血清アミロイドＡ（配列番号：１）、補体Ｃ３（配列番号：２）、結合組織増殖因子（配列番号：３）、インテグリンβ−３（配列番号：４）、アクチビンＡ（配列番号：５）、ナチュラルキラー細胞蛋白質４（配列番号：６）、プロサポシン（配列番号：７）、Ｍａｃ２結合蛋白質（配列番号：８）、ガレクチン−３（配列番号：９）、スーパーオキシドジスムターゼ２（配列番号：１０）、グラニュリン／エピテリン（配列番号：１１）、ｐ６６^ｓｈｃ（配列番号：１２）、カテプシンＢ（配列番号：１４）、β−アミロイド前駆体蛋白質（配列番号：１５）、組織トランスグルタミナーゼ（ｔ−ＴＧアーゼ；配列番号：１６）、クラステリン（配列番号：１７）、プロスタサイクリン刺激因子（配列番号：１８）、血管内皮細胞増殖因子−Ｃ（配列番号：１９）、及びメタロプロテアーゼ−１の組織阻害剤（配列番号：２０）に由来するプロモーターであることを特徴とする、請求項４に記載の組み換え発現構築物。
6. プロモーターが、ヒトナチュラルキラー細胞蛋白質４（配列番号：６）、血清アミロイドＡ（配列番号：１）、補体Ｃ３（配列番号：２）、組織トランスグルタミナーゼ（ｔ−ＴＧアーゼ；配列番号：１６）、β−アミロイド前駆体蛋白質（配列番号：１５）、またはプロサポシン（配列番号：７）に由来するプロモーターであることを特徴とする、請求項４に記載の組み換え発現構築物。
7. 組み換え発現構築物はｐＬｕＮＫ４であることを特徴とする、請求項４に記載の組み換え発現構築物。
8. 請求項１、２、３、４、５、６または７に記載の組み換え発現構築物を含む哺乳動物細胞。
9. Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ受託番号ＰＴＡ３３８１（ＨＴ１０８０ ＬｕＮＫ４９２１）で識別される、請求項８の哺乳動物細胞。
10. 組み換え発現構築物の発現がＮＦκＢによって調節されることを特徴とする、請求項８に記載の哺乳動物細胞。
11. 哺乳動物ＣＤＫ阻害剤遺伝子をコードする第２の組み換え発現構築物をさらに含むことを特徴とする、請求項８に記載の哺乳動物細胞。
12. ＣＤＫ阻害剤の発現が前記哺乳動物細胞内で実験的に誘導されることを特徴とする、請求項１１に記載の哺乳動物細胞。
13. 哺乳動物ＣＤＫ阻害剤遺伝子をコードする組み換え発現構築物が、誘導可能なプロモーターの転写制御下にあり、組み換え発現構築物からのＣＤＫ阻害剤の発現が、組み換え細胞と誘導可能なプロモーターからの転写を誘導する誘導剤とを接触させることによって媒介されるか、あるいは当該プロモーターからの転写を阻害する物質を除去することによって媒介されることを特徴とする、請求項１１に記載の哺乳動物細胞。
14. 哺乳動物ＣＤＫ阻害剤遺伝子が、ヒトｐ２１またはそのＣＤＫ結合断片であることを特徴とする、請求項１３に記載の哺乳動物細胞。
15. 哺乳動物ＣＤＫ阻害剤遺伝子が、ヒトｐ１６またはそのＣＤＫ結合断片であることを特徴とする、請求項１３に記載の哺乳動物細胞。
16. 哺乳動物ＣＤＫ阻害剤遺伝子が、マウスまたはヒトのｐ２７遺伝子またはそのＣＤＫ結合断片であることを特徴とする、請求項１３に記載の哺乳動物細胞。
17. 細菌ラクトースリプレッサーをコードする組み換え発現構築物をさらに含み、その転写が哺乳動物プロモーターによって制御され、哺乳動物ＣＤＫ阻害剤遺伝子をコードする組み換え発現構築物がラクトースリプレッサー応答プロモーター要素を含み、ＣＤＫ阻害剤遺伝子の転写が前記ラクトースリプレッサー応答プロモーター要素によって制御され、及び、組み換え発現構築物からのＣＤＫ阻害剤遺伝子の発現が組み換え細胞をラクトースリプレッサー特異的誘導剤と接触させることによって媒介されることを特徴とする、請求項１３に記載の哺乳動物細胞。
18. 細胞がヒトＨＴ１０８０線維肉腫細胞であることを特徴とする、請求項８に記載の哺乳動物細胞。
19. 細胞がヒトＨＴ１０８０線維肉腫細胞であることを特徴とする、請求項１１に記載の哺乳動物細胞。
20. 細胞がヒトＨＴ１０８０線維肉腫細胞であることを特徴とする、請求項１７に記載の哺乳動物細胞。
21. 第２の発現構築物がＬＮｐ２１ＣＯ３であることを特徴とする、請求項１１に記載の哺乳動物細胞。
22. Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ受託番号ＰＴＡ１６６４（ＨＴ１０８０ ｐ２１−９）で識別される、請求項２１に記載の哺乳動物細胞。
23. 第２の発現構築物がＬＮｐ１６ＲＯ２であることを特徴とする、請求項１１に記載の哺乳動物細胞。
24. Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ受託番号＿＿＿＿＿（ＨＴ１０８０ ｐ１６−５）で識別される、請求項２３に記載の哺乳動物細胞。
25. 第２の発現構築物がＬＮｐ２７ＲＯ２であることを特徴とする、請求項１１に記載の哺乳動物細胞。
26. Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ受託番号＿＿＿＿＿（ＨＴ１０８０ ｐ２７−２）で識別される、請求項２５に記載の哺乳動物細胞。
27. ラクトースリプレッサー特異的誘導剤がβ−ガラクトシドであることを特徴とする、請求項１７に記載の哺乳動物細胞。
28. 哺乳動物細胞内でＣＤＫ阻害剤によって誘導される遺伝子の誘導を阻害する化合物の同定方法であって、以下の工程：
    （ａ）請求項８に記載の組み換え哺乳動物細胞を、当該化合物の存在下または非存在下において哺乳動物細胞内でＣＤＫ阻害剤によって誘導される遺伝子の発現を誘導する条件下で培養する工程と；
    （ｂ）化合物の存在下での前記細胞におけるレポーター遺伝子の発現と、化合物の非存在下での前記細胞におけるレポーター遺伝子の発現とを比較する工程；および
    （ｃ）化合物の非存在下よりも化合物の存在下においてレポーター遺伝子発現が低い場合に、当該化合物がＣＤＫ阻害剤によって誘導される遺伝子の誘導を阻害すると同定する工程；
    を含む方法。
29. 前記細胞内でＣＤＫ阻害剤の発現を誘導する条件下で、細胞が培養されることを特徴とする、請求項２８の方法。
30. ＣＤＫ阻害剤がｐ２１、ｐ２７、もしくはｐ１６、またはそのＣＤＫ結合断片であることを特徴とする、請求項２９の方法。
31. 細胞が哺乳動物ＣＤＫ阻害剤遺伝子をコードする第２の組み換え発現構築物をさらに含むことを特徴とする、請求項２８の方法。
32. 哺乳動物ＣＤＫ阻害剤遺伝子をコードする第２の組み換え発現構築物は誘導可能なプロモーターの転写制御下にあり、組み換え発現構築物からのＣＤＫ阻害剤の発現が、組み換え細胞と誘導可能なプロモーターからの転写を誘導する誘導剤とを接触させることによって媒介されるか、あるいは当該プロモーターからの転写を阻害する物質を除去することによって媒介されることを特徴とする、請求項３１の方法。
33. 哺乳動物ＣＤＫ阻害剤遺伝子がヒトｐ２１またはそのＣＤＫ結合断片であることを特徴とする、請求項３２の方法。
34. 哺乳動物ＣＤＫ阻害剤遺伝子がヒトｐ１６またはそのＣＤＫ結合断片であることを特徴とする、請求項３２の方法。
35. 哺乳動物ＣＤＫ阻害剤遺伝子がヒトｐ２７遺伝子またはそのＣＤＫ結合断片であることを特徴とする、請求項３２の哺乳動物細胞。
36. 細胞がヒトＨＴ１０８０線維肉腫細胞であることを特徴とする、請求項３２の方法。
37. 細菌ラクトースリプレッサーをコードする組み換え発現構築物をさらに含み、その転写が哺乳動物プロモーターによって制御され、哺乳動物ＣＤＫ阻害剤遺伝子をコードする組み換え発現構築物がラクトースリプレッサー応答プロモーター要素を含み、ＣＤＫ阻害剤遺伝子の転写が前記ラクトースリプレッサー応答プロモーター要素によって制御され、及び、組み換え発現構築物からのＣＤＫ阻害剤遺伝子の発現が組み換え細胞をラクトースリプレッサー特異的誘導剤と接触させることによって媒介されることを特徴とする、請求項３２の方法。
38. 細胞遺伝子発現のＣＤＫ阻害剤媒介性誘導を阻害する化合物を同定するため方法であって、以下の工程：
    （ａ）哺乳動物細胞においてＣＤＫ阻害剤の発現を生み出す工程；
    （ｂ）化合物の存在下において、該細胞について、ＣＤＫ阻害剤によって発現が調節される細胞遺伝子の発現におけるアッセイする工程；および
    （ｃ）工程（ｂ）の細胞遺伝子発現の変化の程度が化合物の存在下での方が小さい場合に、その化合物を、細胞遺伝子発現のＣＤＫ阻害剤媒介性調節の阻害剤として同定する工程；
    を含む方法。
39. ＣＤＫ阻害剤がｐ１６，ｐ２７またはｐ２１であることを特徴とする、請求項３８の方法。
40. 哺乳動物細胞が誘導可能な異種プロモーターの転写制御下にある哺乳動物ＣＤＫ阻害剤をコードする組み換え発現構築物を含み、組み換え発現構築物からのＣＤＫ阻害剤の発現が、組み換え細胞と誘導可能プロモーターからの転写を誘導する誘導剤とを接触させることによって媒介されるか、あるいはそのようなプロモーターからの転写を阻害する物質を除去することによって媒介されることを特徴とする、請求項３９の方法。
41. ＣＤＫ阻害剤がｐ１６であることを特徴とする、請求項４０の方法。
42. ＣＤＫ阻害剤がｐ２１あることを特徴とする、請求項４０の方法。
43. ＣＤＫ阻害剤がｐ２７であることを特徴とする、請求項４０の方法。
44. 細胞遺伝子の発現がｐ２１によって誘導されることを特徴とする、請求項３８の方法。
45. 細胞遺伝子の発現がｐ１６によって誘導されることを特徴とする、請求項３８の方法。
46. 細胞遺伝子の発現がｐ２７によって誘導されることを特徴とする、請求項３８の方法。
47. 細胞遺伝子が表ＩＩに示されることを特徴とする、請求項３８の方法。
48. 細胞遺伝子が表ＩＩに示されることを特徴とする、請求項４０の方法。
49. 細胞遺伝子の発現が免疫学的試薬を用いて検出されることを特徴とする、請求項３８の方法。
50. 細胞遺伝子の発現が、細胞遺伝子産物の活性をアッセイすることにより検出されることを特徴とする、請求項３８の方法。
51. 細胞遺伝子の発現が、相補的核酸へのハイブリダイゼーションによって検出されることを特徴とする、請求項３８の方法。
52. 哺乳動物細胞において細胞遺伝子発現のＣＤＫ阻害剤媒介性誘導を阻害する化合物を同定するための方法であって、以下の工程：
    （ａ）哺乳動物細胞を化合物の存在下または非存在下において試薬で処理するか、あるいは哺乳動物細胞を、老化を誘導する条件下で培養する工程；
    （ｂ）哺乳動物細胞について、ＣＤＫ阻害剤遺伝子発現によって誘導される遺伝子の誘導をアッセイする工程；および
    （ｃ）ＣＤＫ阻害剤によって誘導される遺伝子の誘導の程度が、化合物の非存在下よりも化合物の存在下での方が小さければ、当該化合物を、細胞遺伝子発現のＣＤＫ阻害剤媒介性誘導の阻害剤と同定する工程；
    を含む方法。
53. ＣＤＫ阻害剤がｐ２１、ｐ１６またはｐ２７であることを特徴とする、請求項５２の方法。
54. 遺伝子が表ＩＩに示されていることを特徴とする、請求項５２の方法。
55. 細胞遺伝子の発現が免疫学的試薬を用いて検出されることを特徴とする、請求項５２の方法。
56. 細胞遺伝子の発現が細胞遺伝子産物の活性をアッセイすることによって検出されることを特徴とする、請求項５２の方法。
57. 細胞遺伝子の発現が相補的核酸へのハイブリダイゼーションによって検出されることを特徴とする、請求項５２の方法。
58. 哺乳動物細胞において細胞遺伝子発現のＣＤＫ阻害剤媒介性誘導を阻害する化合物を同定する方法であって、以下の工程：
    （ａ）化合物の存在下または非存在下において哺乳動物細胞を試薬に接触させるか、あるいは哺乳動物細胞を、老化を誘導する条件下で培養する工程であって、細胞はＣＤＫ阻害剤によって発現が調節される哺乳動物遺伝子に対するプロモーターの転写制御下にあるレポーター遺伝子を含む工程；
    （ｂ）細胞について、レポーター遺伝子の発現の変化をアッセイする工程；および
    （ｃ）レポーター遺伝子発現の変化の程度が、化合物の非存在下よりも化合物の存在下で小さい場合に、その化合物を細胞遺伝子発現のＣＤＫ阻害剤媒介性誘導の阻害剤として同定する工程；
    を含む方法。
59. ＣＤＫ阻害剤がｐ２１、ｐ１６またはｐ２７であることを特徴とする、請求項５８の方法。
60. 遺伝子が表ＩＩに示されていることを特徴とする、請求項５８に記載の方法。
61. 細胞遺伝子の発現が免疫学的試薬を用いて検出されることを特徴とする、請求項５８の方法。
62. 細胞遺伝子の発現が細胞遺伝子産物の活性をアッセイすることによって検出されることを特徴とする、請求項５８の方法。
63. 細胞遺伝子の発現が相補的核酸へのハイブリダイゼーションによって検出されることを特徴とする、請求項５８の方法。
64. 細胞遺伝子発現のＣＤＫ阻害剤媒介性誘導を阻害するための方法であって、細胞を、請求項２８に記載の方法に従って得られた化合物と接触させる工程を含む方法。
65. 細胞遺伝子発現のＣＤＫ阻害剤媒介性誘導を阻害するための方法であって、細胞を、請求項３８に記載の方法に従って得られた化合物と接触させる工程を含む方法。
66. 細胞遺伝子発現のＣＤＫ阻害剤媒介性誘導を阻害するための方法であって、細胞を、請求項５２に記載の方法に従って得られた化合物と接触させる工程を含む方法。
67. 細胞遺伝子発現のＣＤＫ阻害剤媒介性誘導を阻害するための方法であって、細胞を、請求項５８に記載の方法に従って得られた化合物と接触させる工程を含む方法。
68. 細胞遺伝子発現のＣＤＫ阻害剤媒介性誘導を阻害するための方法であって、細胞を、有効量のＮＦκＢ活性を阻害する化合物と接触させる工程を含む方法。
69. ＣＤＫ阻害剤によって誘導される遺伝子誘導を伴う動物における疾病を治療するための方法であって、動物に、ＮＦκＢ活性を阻害する有効量の非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）を投与する工程を含む方法。
70. 疾病が大腸癌以外の癌であることを特徴とする、請求項６９に記載の方法。
71. 疾病が腎不全であることを特徴とする、請求項６９に記載の方法。
72. 疾病はアルツハイマー病であり、ＮＳＡＩＤはアスピリンまたはサリチル酸塩以外であることを特徴とする請求項６９に記載の方法。
73. 疾病はアテローム性動脈硬化症であり、ＮＳＡＩＤはアスピリン以外であることを特徴とする請求項６９に記載の方法。
74. 疾病は関節炎であり、ＮＳＡＩＤはアスピリン、スリンダクまたはサリチル酸塩以外であることを特徴とする請求項６９に記載の方法。
75. 哺乳動物細胞における老化の病原性結果に関与する遺伝子を阻害する化合物であって、前記化合物が、
    （ａ）哺乳動物細胞を化合物の存在下において試薬で処理するか、あるいは哺乳動物細胞を、老化を誘導する条件下で培養する工程；
    （ｂ）哺乳動物細胞について、ＣＤＫ阻害剤遺伝子発現によって誘導される遺伝子の誘導をアッセイする工程；および
    （ｃ）ＣＤＫ阻害剤によって誘導される遺伝子の誘導の程度が化合物の存在下での方が小さいならば、その化合物を老化の阻害剤と同定する工程；
    を含む方法によって得られることを特徴とする化合物。
76. ＣＤＫ阻害剤がｐ２１、ｐ１６またはｐ２７であることを特徴とする、請求項６９の化合物。
77. 哺乳動物細胞におけるＣＤＫ阻害剤によって誘導される遺伝子産物の産生を阻害する化合物であって、前記化合物が、
    （ａ）哺乳動物細胞を化合物の存在下において試薬で処理するか、あるいは哺乳動物細胞をＣＤＫ阻害剤の発現を誘導する条件下で培養する工程；
    （ｂ）哺乳動物細胞について、ＣＤＫ阻害剤遺伝子発現によって誘導される遺伝子の誘導をアッセイする工程；
    （ｃ）ＣＤＫ阻害剤によって誘導される遺伝子の誘導の程度が化合物の存在下での方が小さいならば、その化合物をＣＤＫ阻害剤誘導の阻害剤と同定する工程；
    を含む方法によって得られることを特徴とする化合物。
78. ＣＤＫ阻害剤はｐ２１、ｐ１６またはｐ２７であることを特徴とする、請求項７７の化合物。
79. 哺乳動物細胞において抗アポトーシス因子または分裂促進因子の産生を阻害するための方法であって、細胞を、ＣＤＫ阻害剤による遺伝子発現の誘導を阻害する化合物と接触させる工程を含む方法。
80. 哺乳動物細胞が間質線維芽細胞であることを特徴とする、請求項７９の方法。
81. 化合物がＮＦκＢ阻害剤またはｐ３００／ＣＰＢ阻害剤であることを特徴とする、請求項７９に記載の方法。
82. ＣＤＫ阻害剤によって誘導される遺伝子発現に伴う疾病の影響を防止または改善するために動物を治療するための方法であって、これを必要とする動物に、請求項２８、３８、５２または５８の方法に従って同定される化合物の医薬組成物を、治療上有効な用量で投与する工程を含む方法。
83. 哺乳動物細胞においてＣＤＫ阻害剤によって誘導される遺伝子の発現を阻害または防止する方法であって、哺乳動物細胞と、請求項２８、３８、５２または５８の方法に従って同定される、ＣＤＫ阻害剤によって誘導される遺伝子の発現を阻害または防止するのに有効な量の化合物とを、接触させる工程を含む方法。
84. 動物においてＣＤＫ阻害剤によって誘導される遺伝子の誘導を選択的に阻害するための方法であって、当該治療が必要な動物にＮＦκＢを投与することを含む方法。
85. ＮＦκＢ阻害剤が非ステロイド系抗炎症化合物であることを特徴とする、請求項８４の方法。
86. 動物がヒトであることを特徴とする、請求項８５の方法。
87. 動物においてＣＤＫ阻害剤によって誘導される遺伝子の誘導を選択的に阻害するための方法であって、動物に請求項２８の方法によって得られる化合物を投与することを含む方法。
88. 動物がヒトであることを特徴とする、請求項８７の方法。
89. 動物においてＣＤＫ阻害剤によって誘導される遺伝子の誘導を選択的に阻害するための方法であって、動物に請求項３８の方法によって得られる化合物を投与することを含む方法。
90. 動物はヒトであることを特徴とする、請求項８９の方法。
91. 動物においてＣＤＫ阻害剤によって誘導される遺伝子の誘導を選択的に阻害するための方法であって、動物に請求項５２の方法によって得られる化合物を投与することを含む方法。
92. 動物はヒトであることを特徴とする、請求項９１の方法。
93. 動物においてＣＤＫ阻害剤によって誘導される遺伝子の誘導を選択的に阻害するための方法であって、動物に請求項５８の方法によって得られる化合物を投与することを含む方法。
94. 動物がヒトであることを特徴とする、請求項９３の方法。
95. 動物においてＣＤＫ阻害剤によって誘導される遺伝子の誘導を選択的に阻害するための方法であって、動物に請求項７５の方法によって得られる化合物を投与することを含む方法。
96. 動物がヒトであることを特徴とする、請求項９５の方法。
97. 動物においてＣＤＫ阻害剤によって誘導される遺伝子の誘導を選択的に阻害するための方法であって、動物に請求項２８、３８、５２または５８の方法によって得られる化合物を投与することを含む方法。
98. 動物がヒトであることを特徴とする、請求項９７の方法。
99. 動物においてＣＤＫ阻害剤によって誘導される遺伝子の誘導を選択的に阻害するための方法であって、動物に請求項７７に記載の化合物を投与することを含む方法。
100. 動物がヒトであることを特徴とする、請求項９９の方法。

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