KR20030084919A - Ｃｄｋ 억제제에 의해 조절되는 유전자의 발현을 확인하고조절하기 위한 시약 및 방법 - Google Patents

Ｃｄｋ 억제제에 의해 조절되는 유전자의 발현을 확인하고조절하기 위한 시약 및 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20030084919A
KR20030084919A KR10-2003-7010224A KR20037010224A KR20030084919A KR 20030084919 A KR20030084919 A KR 20030084919A KR 20037010224 A KR20037010224 A KR 20037010224A KR 20030084919 A KR20030084919 A KR 20030084919A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
gene
cell
expression
cdk inhibitor
mammalian
Prior art date
Application number
KR10-2003-7010224A
Other languages
English (en)
Inventor
제이슨 풀레
이고르 비. 로닌슨
베이-디 창
Original Assignee
더 보오드 오브 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 일리노이즈
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 더 보오드 오브 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 일리노이즈 filed Critical 더 보오드 오브 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 일리노이즈
Publication of KR20030084919A publication Critical patent/KR20030084919A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2510/00—Detection of programmed cell death, i.e. apoptosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)

Abstract

본 발명은 사이클린 의존성 키나아제 억제제에 의해 일어나는, 암 및 노화 관련 질병에 관여하는 유전자의 유도를 억제하는 화합물을 확인하기 위한 방법 및 시약을 제공한다.

Description

ＣＤＫ 억제제에 의해 조절되는 유전자의 발현을 확인하고 조절하기 위한 시약 및 방법 {REAGENTS AND METHODS FOR IDENTIFYING AND MODULATING EXPRESSION OF GENES REGULATED BY CDK INHIBITORS}
세포 사이클 진행은 사이클린 의존성 키나아제 (CDK)로서 공지된 일단의 세린/트레오닌 키나아제에 의해 대부분 조절된다. CDK 억제제로서 공지된 특수한 단백질 군은 CDK와 상호작용하여 이를 억제함으로써, 다양한 생리학적 상황에서 세포 사이클를 정지시킨다 (참조: Sielecki et al., 2000, J.Med. Chem.43: 1-18 및 여기에 인용된 참고문헌). CDK 억제제는 두 가지 패밀리가 존재한다. Cip/Kip로서 공지된 첫 번째 패밀리는 p21Waf1/Cip1/Sdi1, p27Kip1및 p57Kip2를 포함한다. Ink4인 두 번째 패밀리는 p16Ink4A, p15Ink4B, p18Ink4c및 p19Ink4d를 포함한다. 특정 CDK 억제제의 발현은 다양한 인자에 의해 활성화된다. 예를 들어, 접촉 억제는 p27 및 p16 발현을 유도하고 (Dietrich et al., 1997, Oncogene 15: 2743-2747), TGFα와 같은 세포외 항분열유발 인자는 p27 발현을 유도하고 (Reynisdottir et al., 1995, Genes Dev.9: 1831-1845), 혈청 결핍은 p27 발현을 유도하며 (Polyak et al., 1994, Genes Dev.8: 9-22), UV 방사선은 p16 발현을 유도한다 (Wang et al., 1996, Cancer Res. 56: 2510-2514). 또한, 모든 상기 처리 뿐만 아니라 다양한 형태의 DNA 손상은 p21의 발현을 유도하는데, 이러한 p21은 공지된 CDK 억제제 중 가장 다면발현성이다 (Dotto, 2000, BBA Rev. Cancer 1471: M43-M56).
본 발명의 분야에 있어서 특히 중요한 것은, CDK 억제제 중의 두 가지인 p21 및 p16이 포유류 세포에서 노화 작용과 밀접하게 관련되어 왔다는 것이다. 복제성 노화 (Alcorta et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 13742-13747) 및 손상-유도 가속된 노화 (Robles & Adami, 1998, Oncogene 16: 1113-1123)가 시작될 때에, p21 유도는 세포 성장 정지를 일으킨다. 이러한 p21 발현의 급상승은 일시적이지만, 그 후, p16의 안정적인 활성화가 일어나는데, 이는 노화 세포에서 성장 성지를 유지시키는 것을 담당하는 것으로 믿어진다. p21 (Brown et al., 1997, Science 277: 831-834) 또는 p16 (Serrano et al., 1996, Cell 85: 27-37)의 녹아웃은 노화의 시작을 늦추거나 예방한다. 또한, p21 또는 p16의 엑토픽 (ectopic) 과발현은 정상 세포 및 종양 세포 둘 모두에서 노화의 표현형 마커를 수반하는 성장 정지를 유도한다 (Vogt et al., 1998, Cell Growth Differ. 9: 139-146; McConnell et al., 1998, Curr. Biol. 8: 351-354; Fang et al., 1999, Oncogene 18: 2789-2797).
p21은 당해 분야에 CDK와 결합하여 이를 억제하는 단백질로서 (Harper et al., 1993, Cell 75: 805-816), 야생형 p53에 의해 상향조절되는 유전자로서 (el-Deiry et al., 1993, Cancer Res. 55: 2910-2919), 및 노화 섬유아세포에서 과발현되는 성장-억제 유전자로서 (Noda et al., 1994, Exp. Cell. Res. 211: 90-98)로서 독립적으로 확인되어 왔다. p53-조절 성장 억제에서 중추적인 역할로 인해, p21은 일반적으로 종양 억제제로 간주된다. 그럼에도 불구하고, 인간 암에서 p21 돌연변이는 드물고 (Hall & Peters, 1996, Adv. Cancer Res. 68: 67-108), p21 녹아웃 마우스는 정상적으로 발육하며, 종양발생율의 증가를 나타내지 않는다 (Deng et al., 1995, Cell 82: 675-684).
p21의 세포 수준은 DNA-손상 및 분화제를 포함하는 다양한 자극에 반응하여 증가한다. 이들 반응 중의 일부는 p53에 의한 p21 유전자의 전사 활성화를 통해 매개되지만, p21은 다양한 p53-비의존성 인자에 의해서도 조절된다 (참조: Gartel& Tyner, 1999, Exp. Cell Res. 227: 171-181).
p21의 일시적 유도는 세포가 DNA 손상을 복구하게 하는 일시적 정지 뿐만 아니라 DNA 손상 또는 종양유전자 RAS의 도입 (Serrano et al., 1997, Cell 88: 593-602)에 의해 정상 섬유아세포 (DiLeonardo et al., 1994, Genes Develop. 8: 2540-2551; Robles & Adami, 1998, Oncogene 16: 1113-1123) 및 종양 세포 (Chang et al., 1999, Cancer Res. 59: 3761-3767)에서 유도되는 영구적 성장 정지 ("가속된 노화"로도 일컬어짐)를 포함하는 다양한 형태의 손상-유도 성장 정지를 매개한다. 또한, p21 발현의 급상승은 노화 중인 섬유아세포의 복제성 노화 동안의 최종 성장 정지의 시작 (Noda et al., 1994, ibid.; Alcorta et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci USA 93: 13742-13747; Stein et al., 1999, Mol. Cell. Biol. 19: 2109-2117) 및 분열후 세포의 최종 분화 (EI-Deiry et al., 1995, ibid; Gartel et al., 1996, Exp. Cell Res. 246: 280-289)와 일치한다.
p21은 그 자체로 전사 인자가 아니지만, 이는 세포 기능에서 어떤 역할을 할 수 있는 세포 유전자 발현에 간접적인 영향을 미친다 (Dotto, 2000, BBA Rev. Cancer 1471: M43-M56 및 여기에 인용된 참고문헌). p21에 의한 CDK 억제의 결과 중의 하나는 Rb의 탈인산화인데, 이는 DNA 복제 및 세포 사이클 진행에 관여하는 다수의 유전자를 조절하는 E2F 전사 인자를 억제한다 (Nevins, 1998, Cell Growth Differ. 9: 585-593). p21-발현 세포 (p21 +/+)와 p21-비발현 세포 (p21 -/-)의 비교는 세포 사이클 진행에 관여하는 다수의 유전자의 방사선-유도 억제에서 p21을 암시하였다 (de Toledo et al., 1998, Cell Growth Differ. 9: 887-896). p21에의한 CDK 억제의 또 다른 결과는 전사 보조인자 히스톤 아세틸트랜스퍼라아제 p300의 자극인데, 이는 NFκB를 포함하는 다수의 유도성 전사 인자를 증대시킨다 (Perkins et al., 1988, Science 275: 523-527). p300의 활성화는 유전자 발현에 다면발현성 효과를 지닐 수 있다 (Snowden & Perkins, 1988, Biochem. Pharmacol. 55: 1947-1954). 또한, p21은 CDK 이외의 다수의 전사 조절물질 및 보조 조절물질, 예를 들어 JNK 키나아제, 아폽토시스 신호-조절 키나아제 1, Myc 등과 상호작용하여 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있다 (Dotto, 2000, BBA Rev. Cancer 1471: M43-M56). 이러한 상호작용은 상응하는 경로에 의해 조절되는 유전자의 발현에 영향을 미칠 수 있다.
본 발명과 특히 관련있는 또 다른 CDK 억제제는 p16INK4A인데, 이는 인간 단백질로서 세라노 (Serrano) 등의 문헌 [1993, Nature 366: 704-707)에 기재되어 있다. 상기 언급한 바와 같이, p16은 포유류 세포의 노화의 본질적인 조절물질이다. 또한, 이는 진정한 종양 억제제이며, 인간 암에서 가장 일반적으로 돌연변이되는 유전자 중의 하나이다 (Hall & Peters, 1996, Adv. Cancer Res. 68: 67-108). p16은 CDK4 및 CDK6을 직접 억제하는 것으로 알려져 있고, 또한 CDK를 간접적으로 억제할 수 있다 (McConnell et al., 1999, Molec. Cell. Biol. 19: 1981-1989).
본 발명과 특히 관련있는 또 다른 CDK 억제제는 p27Kip1이다. p27은 접촉 억제 (TGF-β또는 로바스타틴)에 의해 성장 정지된 세포에서 CDK2의 억제제로서 최초로 확인되었다 (Hengst et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 5291-5295; Polyak et al., 1994, Cell 78: 59-66). 또한, p27은 분화, 혈청 결핍, 현탁액 중의 성장 및 그 밖의 인자에 반응하여 세포 성장 정지를 매개한다. p27 발현의 수준은 정상 조직에 비해 인간 암에서 자주 변한다 (감소하거나 증가한다) (참조: Philipp-Staheli et al., 2001, Exp. Cell Res. 264: 148-161). 또한, p27은 노화를 일으키는 경로 중의 하나에서 종양 억제제 PTEN과 함께 작용하는 것으로 제안되었다 (Bringold 및 Serrano, 2000, Exp. Gerontol. 35: 317-329).
당해 분야에는 p21, p16 또는 p27과 같은 CDK 억제제 유전자의 유도에 의해 발현이 조절되는 유전자를 확인할 필요가 있다. 또한, 당해 분야에는 세포 노화, 발암과정 및 연령-관련 질병에 미치는 화합물의 효과를 평가하기 위한 표적을 개발할 필요가 있다.
발명의 요약
본 발명은 CDK 억제제 유전자 발현의 유도에 의해 발현이 조절되는 유전자를 확인하기 위한 시약 및 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은, 발암 및 연령-관련 질병과 같은, 세포 노화의 병리적 결과를 방지하기 위한 합리적인 약물 설계의 첫 번째 단계로서, 세포 유전자 발현에 대한, p21, p27, 및 p16과 같은 CDK 억제제의 효과를 억제하는 화합물을 확인하기 위한 시약 및 방법을 제공한다.
제 1 양태에서, 본 발명은 유도성 CDK 억제제 유전자를 함유하는 포유류 세포를 제공한다. 바람직한 구체예에서, CDK 억제제 유전자는 p21, p16, 또는 p27을 엔코딩한다. 바람직한 구체예에서, 포유류 세포는, 유도성 p21 유전자 또는 유도성 p16 유전자를 엔코딩하는 재조합 발현 구성물을 포함하는 재조합 포유류 세포이다. 보다 바람직하게는, 구성물은 유도성 프로모터의 전사 조절 하에 p21, 가장 바람직하게는 인간 p21을 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함한다. 대안적인 구체예에서, 구성물은 CDK 결합 도메인을 포함하는, 보다 바람직하게는 p21 아미노산 서열의 1번 아미노산 내지 78번 아미노산을 포함하는, p21의 아미노 말단 부분을 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함한다. 추가의 구체예에서, 구성물은 유도성 프로모터의 전사 조절 하에서 p16, 가장 바람직하게는 인간 p16을 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함한다. 추가의 구체예에서, 구성물은 유도성 프로모터의 전사 조절 하에 p27, 바람직하게는 인간 p27 또는 마우스 p27을 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 각 구성물의 유도성 프로모터는, 이러한 프로모터로부터의 전사를 억제하는 작용제를 제거하거나, 유도성 프로모터로부터의 전사를 유도하는 유도제, 가장 바람직하게는 생리학적으로 중성인 유도제를 세포에 접촉시킴에 의해 유도될 수 있다. 바람직한 세포는 포유류 세포, 바람직하게는 설치류 또는 영장류 세포, 보다 바람직하게는 마우스 또는 인간 세포이다. 특히 바람직한 구체예에서, 세포는 섬유육종 세포, 보다 바람직하게는 인간 섬유육종 세포, 가장 바람직하게는 인간 HT1080 섬유육종 세포주 및 이들의 유도체이다.
본 발명의 제 1 양태의 다른 구체예에서, 리포터 유전자가 CDK 억제제, 가장 바람직하게는 p21, p16, 또는 p27에 의해 그 발현이 조절되는 세포 유전자로부터 유래된 프로모터의 전사 조절 하에 있는, 재조합 발현 구성물을 포함하는 재조합 포유류 세포가 제공된다. 바람직한 구체예에서, 프로모터는 p21, p16, 또는 p27과 같은 CDK 억제제에 의해 그 발현이 유도되는 세포 유전자로부터 유래된다. 이러한구체예에서, 프로모터는 표 II에서 확인되는 유전자로부터 유래되는 것이 가장 바람직하다; 그러나, 당업자는, CDK 억제제 발현 유전자에 의해 그 발현이 유도되는 임의의 유전자로부터의 프로모터가 유리하게 이러한 구성물에 사용될 수 있음을 인지할 것이다. 가장 바람직하게는, 프로모터는, 혈청 아밀로이드 A(SEQ ID NO:1), 보체 C3(SEQ ID NO:2), 결합 조직 성장 인자(SEQ ID NO:3), 인테그린 β-3(SEQ ID NO:4), 액티빈 A(SEQ ID NO:5), 자연 살상 세포 단백질 4(SEQ ID NO:6), 프로사포신(SEQ ID NO:7), Mac2 결합 단백질(SEQ ID NO:8), 갈렉틴-3(SEQ ID NO:9), 수퍼옥시드 디스뮤타아제 2(SEQ ID NO:10), 그래뉼린/에피텔린(SEQ ID NO:11), p66she(SEQ ID NO:12), 카텝신 B(SEQ ID NO:14), β-아밀로이드 전구체 단백질(SEQ ID NO:15), 조직 트랜스글루타미나아제(t-TGase; SEQ ID NO:16), 클러스테린(SEQ ID NO:17), 프로스타시클린 자극 인자(SEQ ID NO:18), 혈관 내피 성장 인자-C(SEQ ID NO:19), 및 메탈로프로테이나아제-1의 조직 억제제 (SEQ ID NO:20)으로부터 유래된다. 본 발명의 재조합 발현 구성물을 포함하는 바람직한 리포터 유전자는 반딧불이 루시퍼라아제, 레닐라 루시퍼라아제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제, 베타-갈락토시다아제, 녹색 형광 단백질, 또는 알칼리 포스파타아제를 포함한다.
추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명은, CDK 억제제, 가장 바람직하게는 p21, p16, 또는 p27에 의해 그 발현이 조절되는 포유류 유전자에 대한 프로모터의 전사 조절 하의 리포터 유전자를 엔코딩하는 제 1 재조합 발현 구성물, 및 포유류 CDK 억제제 유전자를 엔코딩하는 제 2 재조합 발현 구성물을 포함하여, CDK 억제제의 발현이 포유류 세포에서 실험적으로 유도되는 포유류 세포를 제공한다. 바람직한 구체예에서, CDK 억제제 유전자는 p21, p16, 또는 p27이다. 바람직한 구체예에서, 포유류 CDK 억제제 유전자를 엔코딩하는 재조합 발현 구성물은 유도성의 이종성 프로모터의 전사 조절 하에 있고, 여기서 재조합 발현 구성물로부터의 CDK 억제제의 발현은 유도성 프로모터로부터 전사를 유도하는 유도제로 재조합 세포를 접촉시키거나, 이러한 프로모터로부터 전사를 억제하는 작용제를 제거함에 의해 매개될 수 있다. 바람직하게는, 구성물은 p21, 가장 바람직하게는 인간 p21 을 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 구성물은, CDK 결합 도메인, 보다 바람직하게는 p21 아미노산 서열의 아미노산 1번 내지 78번을 포함하는 p21의 아미노 말단 부분을 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함한다. 대안적인 바람직한 구체예에서, 구성물은 p16, 가장 바람직하게는 인간 p16을 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함한다. 대안적인 구체예에서, 구조물은 p27, 바람직하게는 인간 p27 또는 마우스 p27을 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함한다. 리포터 유전자를 엔코딩하는 제 2 재조합 발현 구성물의 바람직한 구체예에서, 프로모터는 p21, p16, 또는 p27과 같은 CDK 억제제에 의해 그 발현이 유도되는 세포 유전자로부터 유래된다. 이러한 구체예에서, 프로모터는 가장 바람직하게는 표 II에 확인된 유전자로부터 유래된다. 본 발명의 제 2 재조합 발현 구성물을 포함하는 바람직한 리포터 유전자는 반딧불이 루시퍼라아제, 레닐라 루시퍼라아제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제, 베타-갈락토시다아제, 녹색 형광 단백질, 또는 알칼리 포스파타아제를 포함한다. 특히 바람직한 구체예는 섬유육종 세포, 보다 바람직하게는 인간 섬유육종 세포, 가장 바람직하게는 인간 HT1080 섬유육종 세포주 및 이의 유도체이다. 리포터 유전자 및 CDK 억제제에 의해 유도되는 내인성 유전자의 생성물은 바람직하게는, 유전자 생성물의 활성을 검정하거나 상보적인 핵산에 하이브리드화함에 의해 면역학적 시약을 사용하여 검출된다.
제 2 양태에서, 본 발명은 포유류 세포의 분열유발 인자 또는 항아폽토시스 인자의 CDK 억제제 유도 발현을 억제하는 화합물을 확인하는 스크린 방법을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 방법은 상기 화합물의 존재 또는 부재 시에 세포의 CDK 억제제, 가장 바람직하게는 p21, p16, 또는 p27의 발현을 유도하는 단계; 및 적합한 배지에서 분열유발 화합물, 또는 항아폽토시스 화합물 또는 이들 모두의 발현을 비교하는 단계를 포함한다. CDK 억제제 효과의 억제제는, 상기 화합물의 부재 시보다 존재 시에 적합한 배지에서 분열유발 화합물 또는 항아폽토시스 화합물 또는 이들 모두의 더 적은 양을 가짐에 의해 확인되었다. 본 발명의 이러한 양태에서 제공된 방법에서, 임의의 CDK 억제제 발현 세포가 유용하고, 가장 바람직하게는 p21, p16, 또는 p27을 발현하는 세포가 유용하고, 이러한 세포에서의 p21, p16, 또는 p27 발현은 내인성 p21, p16, 또는 p27을 유도하거나, 본 발명에 따른, p21, p16, 또는 p27을 엔코딩하는 유도성 발현 구성물을 함유하는 세포를 사용함에 의해 달성될 수 있다. 바람직한 세포는 포유류 세포, 바람직하게는 설치류 또는 영장류 세포를 포함하고, 보다 바람직하게는 마우스 또는 인간 세포를 포함한다. 특히 바람직한 구체예에서, 섬유육종 세포, 보다 바람직하게는 인간 섬유육종 세포, 가장 바람직하게는 인간 HT1080 섬유육종 세포주 및 이의 유도체이다. 분열유발 또는항아폽토시스 화합물 발현은 유전자 생성물의 활성을 검정하거나 상보적인 핵산과의 하이브리드화에 의해 면역학적 시약을 사용하여 검출된다.
대안적인 구체예에서, 본 발명은 포유류 세포에서 분열유발 인자 또는 항아폽토시스 인자의 CDK 억제제 유도 발현을 억제하는 화합물을 확인하는 방법에 있어서, 세포가 p21, p16, 또는 p27과 같은 CDK 억제제에 의해 유도되는 분열유발 인자 또는 항아폽토시스 인자를 엔코딩하는 세포 유전자의 프로모터의 전사 조절 하에서 리포터 유전자를 엔코딩하는 재조합 발현 구성물을 포함하는 방법을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 프로모터는 결합 조직 성장 인자(CTGF, SEQ ID NO:3), 액티빈 A(SEQ ID NO:5), 에피텔린/그래뉼린(SEQ ID NO:11), 갈렉틴-3(SEQ ID NO:9), 프로사포신(SEQ ID NO:7), 클러스테린(SEQ ID NO:17), 프로스타시클린 자극 인자(SEQ ID NO:18), 혈관 내피 성장 인자-C(SEQ ID NO:19), 및 메탈로프로테이나아제(SEQ ID NO:20)을 포함한다. 바람직한 리포터 유전자에는, 반딧불이 루시퍼라아제, 레닐라 루시퍼라아제, β-갈락토시다아제, 알칼리 포스파타아제 및 녹색 형광 단백질이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 이러한 구체예에서, 수용체 유전자의 CDK 억제제-매개 발현 유도의 억제가 CDK-억제제-발현 세포에서 분열유발 또는 항아폽토시스 인자의 유도를 억제하는 화합물을 확인하는데 사용된다.
이러한 양태에서, 본 발명은 또한, 분열유발 또는 항아폽토시스 인자의 생성을 억제하는 화합물과 세포를 접촉시키는 것을 포함하여, 포유류 세포에서 분열유발 또는 항아폽토시스 인자 또는 복합물의 생성을 억제하는 방법을 제공하며, 여기서 화합물은 본 발명의 양태의 상기 언급된 방법에 의해 확인된다. 바람직한 구체예에서, 억제 화합물과 접촉하여 분열유발 또는 항아폽토시스 인자의 생성이 억제되는 포유류 세포는 섬유아세포, 가장 바람직하게는 간질 섬유아세포이다. 바람직한 구체예에서, 화합물은 핵인자 카파-B(NFκB) 활성 또는 발현 억제제이다.
제 3 양태에서, 본 발명은 세포 유전자의 CDK 억제제-매개 발현 유도를 억제하는 화합물을 확인하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 포유류 세포에서 CDK 억제제 유전자 발현을 유도하거나 야기하는 단계; CDK 억제제에 의해 유도되는 세포 유전자의 발현을 변화시키기 위한 화합물의 존재하에 세포를 검정하는 단계; 및 세포 유전자의 발현이 화합물의 부재시보다 화합물의 존재시에 더 적은 범위로 변화하는 경우, 세포 유전자의 CDK 억제제-매개 발현 유도를 억제하는 화합물을 확인하는 단계를 포함한다. 바람직한 구체예에서, CDK 억제제는 p21, p16 또는 p27이다. 바람직한 구체예에서, 세포 유전자는 CDK 억제제에 의해 유도되며, 이러한 세포 유전자 발현 유도를 억제하는 화합물은, CDK 억제제가 화합물의 부재시 발현되는 경우에 검출한 수준보다 낮은 수준의 유전자 발현을 검출함으로써 검출된다. 본 발명의 방법의 이러한 양태의 바람직한 구체예에서, CDK 억제제는 p21, p16 또는 p27이다. 바람직한 구체예에서, 유전자는 표 Π에 제시되어 있다. 추가의 대안적인 구체예에서, 상기 방법은, 발현이 CDK 억제제에 의해 유도되는 유전자로부터 유래된 프로모터의 전사 조절을 받는 리포터 유전자를 포함하는 재조합 포유류 세포를 사용함으로써 수행된다. CDK 억제제에 의해 유도된 유전자로부터 유래된 프로모터를 포함하는 구성물을 사용할 경우, 리포터 유전자 생성물은, CDK 억제제-매개 유전자 발현 조절을 억제하거나 방해하는 화합물의 부재시보다 존재시에 더 낮은 수준으로 생성된다. 본 발명의 방법의 이러한 양태의 바람직한 구체예에서, CDK 억제제는 p21, p16 또는 p27이다. 이러한 구체예에서, 프로모터는 가장 바람직하게는 표 Π의 유전자로부터 유래된다. 가장 바람직하게는, 프로모터는 혈청 아밀로이드 A(SEQ ID NO:1), 보체 C3(SEQ ID NO:2), 결합 조직 성장 인자(SEQ ID NO:3), 인테그린 β-3(SEQ ID NO:4), 액티빈 A(SEQ ID NO:5), 자연 살상 세포 4(SEQ ID NO:6), 프로사포신(SEQ ID NO:7), Mac2 결합 단백질(SEQ ID NO:8), 갈렉틴-3(SEQ ID NO:9), 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 2(SEQ ID NO: 10), 그래뉼린/에피텔린(SEQ ID NO:11), p66sbc(SEQ ID NO:12), 카텝신 B(SEQ ID NO: 14), β-아밀로이드 전구체 단백질(SEQ ID NO:15), 조직 트랜스글루타미나아제(t-TGase; SEQ ID NO:16), 클루스테린(SEQ ID NO:17), 프로스타시클린 자극 인자(SEQ ID NO:18), 혈관내피세포 성장인자-C(SEQ ID NO:19) 및 메탈로프로테이나아제-1의 조직 억제제(SEQ ID NO:20)으로부터 유래된다. 본 발명의 재조합 발현 구성물을 포함하는 바람직한 수용체 유전자는 반딧불이 루시퍼라아제, 레닐라(Renilla) 루시퍼라아제, 클로르암페니콜 아세틸트랜스퍼라아제, 베타-갈락토시다아제, 녹색 형광 단백질 또는 알칼리 포스파타아제를 포함한다. 다른 바람직한 구체예에서, 세포는, 발현이 CDK 억제제에 의해 유도되는 포유류 유전자에 대한 프로모터의 전사 조절을 받는 리포터 유전자를 코드화하는 제 1 재조합 발현 구성물, 및 포유류 CDK 억제제 유전자를 코드화하는 제 2 재조합 발현 구성물을 포함하며, 여기서 CDK 억제제의 발현은 포유류 세포에서 실험적으로 유도되는 것이다. CDK 억제제에 의해 유도되는 내인성 유전자 및리포터 유전자의 생성물은 바람직하게는, 면역학적 시약을 사용하여 유전자 생성물의 활성을 검정하거나 상보적 핵산에 하이브리드화됨으로써 검출된다.
제 4 양태에서, 본 발명은 포유류 세포에서 노화의 병리학적 결과를 억제하는 화합물을 확인하는 방법을 제공하며, 여기서 이러한 병리학적 결과는 CDK 억제제에 의해 유도되는 유전자의 발현에 의해 적어도 부분적으로 매개된다. 이러한 방법은 CDK 억제제 유전자 발현을 유도하는 조건하에 포유류 세포를 배양하거나, 제제를 갖는 화합물의 존재하에 포유류 세포를 처리하는 단계; CDK에 의해 유도되는 유전자 유도에 대해 포유류 세포를 검정하는 단계; 및 CDK 억제제에 의해 유도되는 유전자의 발현이 화합물의 부재시보다 화합물의 존재시에 더 적은 범위로 유도되는 경우, 노화 및 노화의 병리학적 결과의 억제제로서의 화합물을 확인하는 단계를 포함한다. 본 발명의 방법의 바람직한 구체예에서, CDK 억제제는 p21, p16 또는 p27이다. 바람직한 구체예에서, 유전자는 표 Π에 제시되어 있다. 추가의 대안적인 구체예에서, 상기 방법은, 발현이 CDK 억제제에 의해 유도되는 유전자로부터 유래된 프로모터의 전사 조절을 받는 리포터 유전자를 포함하는 재조합 포유류 세포를 사용함으로써 수행된다. 이러한 구체예에서, 화합물이 세포 노화의 병리학적 결과의 억제제인 경우, CDK 억제제에 의해 유도된 유전자로부터 유래된 프로모터를 포함하는 구성물을 사용함으로써, 화합물의 부재하에서 보다 존재하에 더 낮은 생성 수준으로 리포터 유전자의 생성물의 생성이 검출된다. 본 발명의 방법의 이러한 양태의 바람직한 구체예에서, CDK 억제제는 p21, p16 또는 p27이다. 프로모터는 바람직하게는 표 Π의 유전자로부터 유래된다. 가장 바람직하게는, 프로모터는 혈청 아밀로이드 A(SEQ ID NO:1), 보체 C3(SEQ ID NO:2), 결합 조직 성장 인자(SEQ ID NO:3), 인테그린 β-3(SEQ ID NO:4), 액티빈 A(SEQ ID NO:5), 자연 살상 세포 4(SEQ ID NO:6), 프로사포신(SEQ ID NO:7), Mac2 결합 단백질(SEQ ID NO:8), 갈렉틴-3(SEQ ID NO:9), 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 2(SEQ ID NO: 10), 그래뉼린/에피텔린(SEQ ID NO:11), p66sbc(SEQ ID NO:12), 카텝신 B(SEQ ID NO: 14), β-아밀로이드 전구체 단백질(SEQ ID NO:15), 조직 트랜스글루타미나아제(t-TGase; SEQ ID NO:16), 클루스테린(SEQ ID NO:17), 프로스타시클린 자극 인자(SEQ ID NO:18), 혈관내피세포 성장인자-C(SEQ ID NO:19) 및 메탈로프로테이나아제-1의 조직 억제제(SEQ ID NO:20)로부터 유래된다. 다른 바람직한 구체예에서, 세포는, 발현이 CDK 억제제에 의해 유도되는 포유류 유전자에 대한 프로모터의 전사 조절을 받는 리포터 유전자를 코드화하는 제 1 재조합 발현 구성물, 및 포유류 CDK 억제제 유전자를 코드화하는 제 2 재조합 발현 구성물을 포함하며, 여기서 CDK 억제제의 발현은 포유류 세포에서 실험적으로 유도되는 것이다. 본 발명의 방법의 이러한 양태의 바람직한 구체예에서, CDK 억제제는 p21, p16 또는 p27이다. 특히 바람직한 구체예에서, 세포는 섬유육종 세포, 더욱 바람직하게는 인간 섬유육종 세포, 및 가장 바람직하게는 인간 HT1080 섬유육종 세포주 및 이들의 유도체이다. CDK 억제제에 의해 유도되는 내인성 유전자 또는 리포터 유전자의 생성물은 바람직하게는, 면역학적 시약을 사용하여 유전자 생성물의 활성을 검정하거나, 상보적 핵산에 하이브리드화됨으로써 검출된다.
제 5 양태에서, 본 발명은 발암 또는 노화 관련 질환과 같은 세포 노화의 병리학적 결과를 억제하는 방법으로서, 본 발명의 상기 언급된 양태에서 제공된 방법을 이용하여 결정된 노화의 병리학적 결과 또는 노화를 억제하는 화합물을 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
제 6 양태에서, 본 발명은 본원에 설명된 바와 같은 본 발명의 방법을 사용하여 확인된 화합물을 제공한다.
제 7 양태에서, 본 발명은 CDK 억제제에 의한 유전자 발현 유도를 억제하거나 예방하는 방법을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 상기 방법은, CDK 억제제에 의한 유전자 발현 유도를 억제하거나 예방하는 화합물을 확인하는 본 발명의 방법에 의해 확인된 화합물을 세포와 접촉시키는 단계를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 유효량의 상기 화합물은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 기타 제제를 사용하여 약제 조성물로 제형화되고, 동물 가장 바람직하게는, CDK 억제제-유도된 유전자 발현에 의해 초래된 질환을 앓고 있는 동물에 투여된다. 바람직한 구체예에서, 이러한 질환으로는 암, 알츠하이머병, 신장병, 관절염 또는 죽상경화증이 있다. 바람직한 구체예에서, 본 방법은 NFκB 억제제인 화합물을 사용한다.
본 발명의 특정 바람직한 구체예는 특정 바람직한 구체예의 하기의 더욱 상세한 설명 및 청구범위로부터 자명하게 될 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 인간 HT1080 섬유육종 세포주 변이체 HT1080 p21-9를 생성하는데 사용된 IPTG-조절 레트로바이러스 벡터의 개략도이다.
도 2a는 50μM의 IPTG 첨가 후 시간에 따른 p21 유도 경과를 나타낸 그래프로서, 여기서 p21 수준은 ELISA에 의해 측정된다.
도 2b는 IPTG의 제거 후 시간에 따른 p21 분해 경과를 나타낸 그래프이다.
도 3a는 표시된 유전자의 발현에서 IPTG-유도된 변화에 대한 RT-PCR 실험(왼쪽), 세포 mRNA 발현의 노던 블롯 검정(중간) 및 이뮤노블로팅 검정(오른쪽)의 겔 전기영동 패턴 사진으로서, 여기서 C는 비처리된 대조군 HT1080 p21-9 세포이며, I는 50μM IPTG로 3일 동안 처리된 세포이다. β2-마이크로글로불린(β2-M)은 RT-PCT에 대한 표준화 대조군으로서 사용되었으며, S14 리보좀 단백질 유전자는 노던 하이브리드화에 대한 표준화 대조군으로서 사용되었다.
도 3b는 IPTG 첨가 및 방출시, 시간에 따른 표시된 p21-억제된 유전자의 발현 변화를 나타내는 RT-PCR 실험(왼쪽) 및 이뮤노블로팅 검정(오른쪽)의 겔 전기영동 사진이다.
도 3c는 IPTG 첨가시, 시간에 따른 표시된 p21-유도된 유전자 발현 변화를 나타내는 RT-PCR 실험(왼쪽) 및 노던 하이브리드화 검정(오른쪽)의 겔 전기영동 패턴 사진이다.
도 3d는 비처리된 대조군 HT1080 p21-9 세포(C), 혈청-결핍 무활동 세포(Q) 및 IPTG-처리된 노화 세포(I)에서 유전자 발현을 비교한 도면이다.
도 4는 인간 HT1080 섬유육종 세포주 변이체인 HT1080/LNp16R02를 생성하는데 사용된 IPTG-조절 레트로바이러스 벡터 LNp16R02의 개략도이다.
도 5a 및 5b는 50μM IPTG의 첨가시 HT1080 p16-5(도 5A) 또는 HT1080 p27-2(도 5B)의 세포 사이클 분포 상태의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 6a 및 6b는 HT1080 p16-5 세포에서의 p16(도 6a) 또는 HT1080 p27-2 세포에서의 p27(도 6b)을 IPTG로 발현 유도시킬 때, 표시된 유전자 발현에서 IPTG에 의한 변화를 검출하기 위한 RT-PCR 실험의 겔 전기영동 패턴 사진이다. 여기서, "-"는 비처리된 대조군 세포이며; "+"는 50μM의 IPTG로 3일 동안 처리된 세포이다. β-액틴은 RT-PCR에 대한 표준화 대조군으로서 사용되었다.
도 7은 지시된 p21-유도가능한 유전자의 프로모터에 의해 유래된 루시퍼라아제 리포터 유전자의 발현에 대한 HT1080 p21-9 세포에서 p21 유도의 영향을 나타낸 그래프이다. 이러한 검정은 50μM IPTG의 존재 또는 부재하에 2일(프로사포신 프로모터) 또는 3일(모든 기타 프로모터) 동안 배양시킨 후, 일시적 트랜스펙션에 이어서 수행된다. 검정은 3회(프로사포신에 대해) 또는 4회(모든 기타 구성물에 대해) 수행된다.
도 8a 및 8b는 IPTG로 24시간 처리 후 LuNK4p21 세포에서 IPTG 용량에 따른 루시퍼라아제 발현을 나타낸 그래프(도 8A)이고, 50μM IPTG 첨가시 시간에 따른 루시퍼라아제 발현을 나타낸 그래프(도 8B)이다.
도 9a 내지 9g는 NFκB-의존적 프로모터(도 9a), 또는 지시된 p21-유도가능한 유전자의 프로모터(도 9b 내지 9g)에 의해 유래된 루시퍼라아제 리포터 유전자의 발현에 대한 HT1080 p21-9 세포에서 p21 유도의 영향을 나타낸 그래프이다. 프로모터-리포트 구성물은 NFκB의 지배적 억제제(IKK), p300/CBP를 억제하는 C-말단화된 E1A 뮤턴트(E1A△CR2), 또는 E1A의 비작용적인 N- 및 C-말단화된버젼(E1A△N/△CR2)을 발현하는 벡터와 1:1의 몰비로 혼합된다. 루시퍼라아제 수준은 IPTG의 존재 또는 부재하에 3일 후에 측정되며, 코-트랜스펙션된 pRL-CMV 플라스미드로부터 발현된 레닐라 루시퍼라아제 수준 또는 세포 단백질 수준(도 9c)에 의해 표준화된다. 실험은 3회 수행된다.
도 10은 상이한 양의 NSAID와 함께 인큐베이팅된 IPTG의 존재 및 부재하의 LuNK4p21 세포의 루시퍼라아제 활성을 나타낸 막대 그래프이다.
도 11은 LuNK4p21을 사용하여, 표시된 유전자 발현에서 IPTG-유도된 변화를 상이한 양의 설린닥 (sulindac)에 의해 억제하는 것을 검출하기 위한 RT-PCR 실험의 겔 전기영동 패턴 사진이며, 여기서, β-액틴은 RT-PCR에 대한 표준화 대조군으로서 사용된다.
도 12a 내지 12e는 NFκB-의존성 프로모터(도 12a) 또는 지시된 p21-유도가능한 유전자의 프로모터(도 12b 내지 12e)에 의해 유래된 루시퍼라아제 리포터 유전자의 발현에 대한 HT1080p16-5 세포에서 p16 유도의 영향을 나타낸 그래프이다. 루시퍼라아제 수준은 IPTG의 존재 또는 부재하에 3일 후에 측정되며, 코-트랜스펙션된 pRL-CMV 플라스미드로부터 발현된 레닐라 루시퍼라아제의 수준에 의해 표준화된다. 도 12a 및 12e의 실험은 3회 수행되며, 도 12b, 12c 및 12d는 1회 수행된다.
도 13a 내지 13e는 NFκB-의존성 프로모터(도 13a) 또는 지시된 p21-유도가능한 유전자의 프로모터(도 13b 내지 13e)에 의해 유래된 루시퍼라아제 리포터 유전자의 발현에 대한 HT1080p27-2 세포에서 p27 유도의 영향을 나타낸 그래프이다.도 13a에서, 프로모터-리포터 구성물은 NFκB의 지배적 억제제(IKK)를 발현하는 벡터와 1:2의 몰비로 혼합된다. 루시퍼라아제 수준은 IPTG의 존재 또는 부재하에 3일 후에 측정되며, 코-트랜스펙션된 pRL-CMV 플라스미드로부터 발현된 레닐라 루시퍼라아제의 수준에 의해 표준화된다. 모든 실험은 3회 수행된다.
본 발명은 세포 노화 및 노화를 수반하는 세포 유전자 발현의 변화에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 노화가 시작될 때에 세포에서 유도되는, 사이클린 의존성 키나아제 (CDK) 억제제라고 일컬어지는 하나의 부류의 세포 유전자 생성물에 의해 발현이 조절되는 유전자의 확인에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 이러한 CDK 억제제에 의해 발현이 유도되는 유전자인 세포 노화의 마커를 제공한다. 본 발명은 화합물의 존재하에서 CDK 억제제에 의한 이러한 마커 유전자의 유도의 억제를 검출함으로써 세포 노화의 병리학적 결과를 억제하는 화합물을 확인하는 방법을 제공한다. 또한, 실험적으로 유도성인 p21, p16 또는 p27과 같은 다양한 세포 CDK 억제제를 엔코딩하는 재조합 발현 구성물을 함유하는 재조합 포유류 세포, 및 발현이 내인성 또는 외인성의 실험적으로 유도성인 CDK 억제제에 의해 유도되는 유전자에 대한 프로모터의 전사 조절을 받는 리포터 유전자를 발현하는 재조합 발현 구성물을 함유하는 재조합 포유류 세포인 시약이 제공된다.
본 발명은 CDK 억제제-유도 세포 노화 및 노화의 병리학적 결과를 매개하는 데에 관여하는 유전자를 확인하기 위한 시약 및 방법을 제공하며, 포유류 세포에서 노화 및 노화의 병리학적 결과를 억제하는 화합물을 제공한다. 특히, 구체예에서 본 발명은 세포 노화와 관련되고, CDK 억제제 p21, p27 또는 p16에 의해 유도된 유전자를 확인하기 위한 시약 및 방법을 제공한다.
본 발명의 목적에 있어서, 용어 "CDK 억제제"는 시클린-의존적 키나아제 억제의 생화학적 활성을 갖는 포유류 유전자계의 구성원을 포함함을 의미한다. 명백하게는, 이러한 용어에는 CDK 억제제 p15, p14, p18, 특히 p21, p16 또는 p27이 함유되며, 후자 3개는 본 발명의 시약 및 방법의 특히 바람직한 구체예에 속한다.
본 발명의 목적에 있어서, 용어 "세포" 또는 세포들"은 동일하게 취급되며, 특히 당해분야에서 공지된 바와 같이 성장하고 유지된 포유류 세포의 시험관내 배양물을 포함한다.
본 발명의 목적상, 복수로 나타낸 용어 "세포 유전자들"은 2개 이상의 유전자 뿐만 아니라 단일 유전자를 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 당업자는 세포 유전자 발현의 조절의 효과, 또는 세포 유전자로부터 유래된 프로모터의 전사 조절을 받는 리포터 구성물은 제 1 유전자에서 검출될 수 있으며, 이러한 효과는 제 2 또는 추가적인 수의 유전자 또는 리포터 유전자 구성물을 시험함으로써 반복될 수 있는 것으로 이해할 것이다. 대안적으로, 2개 이상의 유전자 또는 리포터 유전자 구성물의 발현은 본 발명의 범위내에서 동시에 검정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "조절된 배지"는 분열유발 또는 항아폽토시스 인자를 함유하는 CDK 억제제-발현 세포의 성장에 의해 조절되는 세포 배양 배지를 포함한다. 포유류 세포 배지, 가장 바람직하게는 혈청 첨가제를 함유하지 않은 합성 배지에서 CDK 억제제-발현 세포를 배양함으로써 바람직한 구체예에서 조건 배지가 생성된다. 모든 CDK 억제제-발현 세포가 상기 조건 배지의 생산에 적합하며, 이러한 세포에서 내인성 CDK 억제제를 유도하거나 (예컨데, DNA 손상제를 이용한 처리, 이온화 또는 자외선 조사, 또는 접촉 억제에 의해) 본 발명에 따른 유도성 CDK 억제제 발현 구성물을 함유하는 세포를 이용하여 생리학적으로 중성인 유도제에서 세포를 배양함에 의해 CDK 억제제 발현이 달성될 수 있다. 본 발명의 이러한 관점에 대한 바람직한 구체예에서, CDK 억제제는 p21, p16 또는 p27이다. 바람직한 세포는 포유류 세포를 포함하고, 바람직하게는 설치류 또는 영장류 세포이며, 보다 바람직하게는 마우스 또는 인간 세포이다. 특히 바람직한 구체예는 섬유육종 세포이고, 보다 바람직한 것이 인간 섬유육종 세포이며, 가장 바람직한 것은 인간 HT1080 섬유육종 세포주 및 이것의 유도체이다.
본 발명의 목적을 위하여, 용어 "노화"는 DNA 복제의 영구적인 중지 및 성장 인자에 의한 비가역적인 세포 성장을 포함하는 것으로 이해될 것이고, 예컨데 표준세포의 증식성 수명의 끝에 발생하거나 세포독성 약물, DNA 손상 또는 그밖의 세포 충격에 반응하여 표준 세포 또는 종양 세포에서 발생한다.
포유류 세포에서 노화는 수많은 방법으로 유도될 수 있다. 첫번째는 생체내 또는 시험관내에서, 표준 세포 성장의 자연적인 결과로서 유도된다: 표준 세포가 노인성이 되기 이전에 진행할 수 있는 세포 분열, 계대 또는 세대의 수에는 제한이 있다. 정확한 수는 세포 유형 및 기원이 되는 종에 따라 다양하다 (Hayflick & Moorhead, 1961,Exp. Cell Res.25:585-621). 임의의 세포 유형에서 노화를 유도하는 또 다른 방법은 대개 항암 약물과 같은 세포독성 약물, 조사 및 세포 분화제로 처리하는 것이다. 문헌[창 외(Chang et al.), 1999,Cancer Res.59:3761-3767]. 노화는 또한 포유류 세포를 종양 억제 유전자 (예컨데, p53, p21, p16 또는 Rh)로 형질도입하고 거기에서 유전자를 발현시킴에 의해 여하한 포유류 세포에서 신속히 유도될 수 있다. 문헌[서그루 외(Sugrue et al.), 1997,Proc.Natl.Acad.Sci. USA 94:9648-9653; 허르봄 외(Uhrbom et al.), 1997,Oncogene 15:505-514; 수 외(Xu et al.), 1997,Oncogene 15:2589-2596; 보그트 외(Vogt et al.), 1998,Cell Growth Differ.9:139-146].
본 발명의 목적을 위해, 용어 "노화의 병리학적 결과"는 암, 죽상경화증, 알츠하이머병, 아밀로이드증, 신질환 및 관절염과 같은 질환을 포함하려는 의도이다.
본 발명의 시약은 임의의 포유류 세포를 포함하고, 바람직하게는 설치류 또는 영장류 세포이며, 보다 바람직하게는 마우스 세포이고, 가장 바람직하게는 인간 세포를 포함하며, 이들은 CDK 억제제 유전자, 가장 바람직하게는 p21, p16 또는p27의 발현을 유도할 수 있고, 이러한 유전자는 내인성 유전자이거나 유전 공학에 의해 도입된 외인성 유전자이다. 구체예에서 유도성 p21, p27 및 p16 유전자를 코드화하는 재조합 발현 구성물을 포함하는 재조합 포유류 세포에 대해 기재하고 있으나, 이러한 구체예는 단지 실험적 설계를 편리하게 선택하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명이 p21, p27 및 p16과 같은 내인성 CDK 억제제 유전자의 유도를 충분히 포함함을 이해할 것이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 유도성 포유류 p21 유전자를 코드화하는 재조합 발현 구성물을 함유하는 포유류 세포를 제공한다. 바람직한 구체예에서, p21 유전자는, 본원에서 참고문헌으로 인용되는 미국 특허 제 5,424,400호에 기술된 누클레오티드 및 아미노산 서열을 갖는 인간 p21이다. 선택적인 구체예에서, p21 유전자는 인간 p21 유전자의 아미노 말단 부분이고, 천연의 인간 p21 단백질의 아미노산 잔기 1 내지 78을 포함하는 것이 바람직하며 (미국 특허 제 5,807,692호에 기술됨, 본원에서 참고문헌으로 인용됨), 보다 바람직하게는 천연의 인간 p21 단백질의 아미노산 21-71을 포함하는 CDK 결합 도메인을 포함한다, 문헌[나카니시 외(Nakanishi et al.), 1995,EMBO J.14:555-563]. 바람직한 숙주 세포는 포유류 세포를 포함하고, 바람직하게는 설치류 또는 영장류 세포이며, 보다 바람직하게는 마우스 또는 인간 세포이다. 특히 바람직한 구체예는 섬유육종 세포이고, 인간 섬유육종 세포가 보다 바람직하며, 인간 HT1080 섬유육종 세포주 및 이것의 유도체가 가장 바람직하다. 가장 바람직한 세포주는 2000년 4월 6일에 수탁 번호 PTA 1664로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection, Manassas,Virginia U.S.A.)에 기탁된, HT1080 p21-9로서 확인되는 HT 1080 섬유육종 세포주 유도체이다.
선택적인 바람직한 구체예에서, 본 발명은 유도성 포유류 p16 유전자를 코드화하는 재조합 발현 구성물을 함유하는 포유류 세포를 제공한다. 바람직한 구체예에서, p16 유전자는 NCBI RefSeq NM_000077 및 NP_000068로 기술되는 누클레오티드 및 아미노산 서열을 갖는 인간 p16이다. 바람직한 숙주 세포는 포유류 세포를 포함하고, 바람직하게는 설치류 또는 영장류 세포이며, 보다 바람직하게는 마우스 또는 인간 세포이다. 특히 바람직한 구체예는 섬유육종 세포이고, 인간 섬유육종 세포가 보다 바람직하며, 인간 HT1080 섬유육종 세포주 및 이것의 유도체가 가장 바람직하다. 가장 바람직한 세포주는 2002년 1월 31일, 수탁 번호 PTA-4020으로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁된, HT1080 p16-5로서 확인되는 HT 1080 섬유육종 세포주 유도체이다.
선택적인 바람직한 구체예에서, 본 발명은 유도성 포유류 p27 유전자를 코드화하는 재조합 발현 구성물을 함유하는 포유류 세포를 제공한다. 바람직한 구체예에서, p27 유전자는 NCBI RefSeq NM_004064 및 NP_004055로 기술되는 누클레오티드 및 아미노산 서열을 갖는 인간 p27이거나, NCBI RefSeq NM_009875 및 NP_034005로 기술되는 누클레오티드 및 아미노산 서열을 갖는 마우스 p16이다. 바람직한 숙주 세포는 포유류 세포를 포함하고, 바람직하게는 설치류 또는 영장류 세포이며, 보다 바람직하게는 마우스 또는 인간 세포이다. 특히 바람직한 구체예는 섬유육종 세포이고, 인간 섬유육종 세포가 보다 바람직하며, 인간 HT1080 섬유육종 세포주 및 이것의 유도체가 가장 바람직하다. 가장 바람직한 세포주는 2002년 1월 31일, 수탁 번호 PTA 4021로 미국, 버지니아, 마나사스, 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁된, HT1080 p27-2로서 확인되는 HT 1080 섬유육종 세포주 유도체이다.
재조합 발현 구성물은 당업자가 이해하는대로, 적절한 포유류 세포로 도입될 수 있다. 상기 구성물의 바람직한 구체예가, 당해 분야에 공지인대로, 전달성 벡터, 보다 바람직하게는 바이러스 벡터, 가장 바람직하게는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터 및 백시니아 바이러스 벡터로 제조된다. 일반적인 참조, 문헌[MOLECULAR VIROLOGY: A PRACTICAL APPROACH, (Davison & Elliott, ed.), Oxford University Press: New York, 1993].
추가로 바람직한 구체예에서, 본 발명의 재조합 세포는 유도성 CDK 억제제 유전자를 코드화하는 구성물을 함유하고, 이 유전자는 유도성 프로모터의 전사적인 조절하에 있다. 보다 바람직한 구체예에서, 유도성 프로모터는 그 효과가 유도제에 의해 조절될 수 있는 상호작용 인자에 반응한다. 유도제는, 온도와, 가장 바람직하게는 유도제의 존재 또는 부재를 포함하는, 실험적으로 조작될 수 있는 여하한 인자일 수 있다. 유도제는 화학적 화합물인 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 상호작용 인자에 특이적인 생리학적으로 중성인 화합물이다. 본원에서 기술한대로, 유도성 프로모터를 포함하는 구성물의 이용에서, 재조합 발현 구성물로부터 CDK 억제제를 발현시키는 것은, 유도성 프로모터로부터 전사를 유도하는 유도제와 재조합 세포를 접촉시키거나, 이러한 프로모터에서 전사를 억제하는 제제를 제거함에 의해 조정된다. 본 방법의 이러한 관점에 따른 바람직한 구체예에서, CDK 억제제는 p21, p27 또는 p16이다. 다양한 유도가능 프로모터 및 동일한 기원의 상호작용 인자가 당해 분야에 공지이며, 이는 세포 배양의 온도를 상승시킴에 의해 활성화될 수 있는 열충격 프로모터를 포함하고, 보다 바람직하게는 포유류 전사 인자를 갖는tet프로모터 및 이것의 동일 기원성tet억제체 및 이들의 융합체와 같은 프로모터/인자의 쌍이며 (미국 특허 제 5,654,168호, 5,851,796호 및 5,968,773호에 기술됨), 락토스 오페론의 세균성lac프로모터와 이것의 동일 기원성lacI 억제체 단백질이다. 바람직한 구체예에서, 재조합 세포는 하나 또는 다수의lac-반응성 요소를 포함하는 프로모터의 조절하에 인간 p21을 코드화하는 재조합 발현 구성물 및lacI 억제체 단백질을 발현시키고, p21의 발현은 생리학적으로 중성인 유도제, 이소프로필티오-β-갈락토시드를 세포와 접촉시킴에 의해 유도될 수 있다. 바람직한 구체예에서,lacI 억제체는 3'SS(스트라타젠(Stratagene, LaJolla, CA)에서 시판됨)로서 확인된 재조합 발현 구성물에 의해 코드화된다. 선택적인 바람직한 구체예에서, 재조합 세포는 하나 또는 다수의lac-반응성 요소를 포함하는 프로모터의 조절하에 인간 p16을 코드화하는 재조합 발현 구성물 및lacI 억제체 단백질을 발현시키고, p16의 발현은 생리학적으로 중성인 유도제, 이소프로필티오-β-갈락토시드를 세포와 접촉시킴에 의해 유도될 수 있다. 바람직한 구체예에서,lacI 억제체는 3'SS 재조합 발현 구성물(Stratagene)에 의해 코드화된다. 선택적인 바람직한 구체예에서, 재조합 세포는 하나 또는 다수의lac-반응성 요소를 포함하는 프로모터의 조절하에 인간 p27 또는 마우스 p27을 코드화하는 재조합 발현 구성물 및lacI 억제체 단백질을 발현시키고, p27의 발현은 생리학적으로 중성인 유도제, 이소프로필티오-β-갈락토시드를 세포와 접촉시킴에 의해 유도될 수 있다. 이렇게 바람직한 구체예에서,lacI 억제체는 3'SS 재조합 발현 구성물(Stratagene)에 의해 코드화된다.
또한 본 발명은 리포터 유전자가 유전자 프로모터의 전사적 조절하에 있고, 유전자의 발현이 p21, p16 또는 p27을 포함하는 CDK 억제제에 의해 조절되는 재조합 발현 구성물을 제공한다. 이들은 CDK 억제제에 의해 발현이 유도되는 유전자를 포함한다. 본 발명의 이러한 관점에 대한 바람직한 구체예에서, CDK 억제제는 p21, p16 또는 p27이다. 바람직한 구체예에서, 프로모터는, 유전자의 발현이 CDK 억제제 발현에 의해 유도되거나 그렇지 않으면 증가하는 유전자로부터 유래되고, 이것이 표 II에서 확인된다. 가장 바람직하게는, 프로모터가, 혈청 아밀로이드 A(SEQ ID NO:1), 보체 C3(SEQ ID NO:2), 결합 조직 성장 인자(SEQ ID NO:3), 인테그린 β-3(SEQ ID NO:4), 액티빈 A(SEQ ID NO:5), 자연 살세포 단백질 4(SEQ ID NO:6), 프로사포신(SEQ ID NO:7), Mac2 결합 단백질(SEQ ID NO:8), 갈렉틴-3(SEQ ID NO:9), 과산화물 디스뮤타아제 2(SEQ ID NO:10), 그래뉼린/에피텔린(SEQ ID NO:11), p66she(SEQ ID NO:12), 카뎁신 B(SEQ ID NO:14), β-아밀로이드 전구체 단백질(SEQ ID NO:15), 조직 트랜스글루타미나제(t-TGase; SEQ ID NO:16), 클러스테린(SEQ ID NO:17), 프로스타시클린 자극 인자(SEQ ID NO:18), 혈관 내피 성장 인자-C(SEQ ID NO:19) 및 메탈로프로테이나아제-1의 조직 억제제(SEQ ID NO:20)로부터 유래된다. 이러한 리포터 유전자는 이후 CDK 억제제 유전자 발현의효과에 대한 민감하고도 편리한 지시제로서 이용되고, 포유류 세포에서 CDK 억제제 발현의 효과를 억제하는 화합물이 용이하게 확인되도록 할 수 있다. 이러한 구성물용 숙주 세포는 CDK 억제제 유전자 발현이 유도될 수 있는 여하한 세포를 포함하며, 또한 상기 기술한대로 유도성 CDK 억제제 유전자를 함유하는 재조합 발현 구성물을 함유하는 세포인 것이 바람직하다. 본 발명의 이러한 관점을 실행하는데 유용한 리포터 유전자로는 반딧불이 루시퍼라아제, 레닐라 루시퍼라아제, 클로르암페니콜 아세틸트랜스퍼라제, 베타-갈락토시다제, 녹색 형광 단백질 및 알칼리성 포스파타아제가 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다. 특히 바람직한 구체예는 섬유육종 세포이고, 보다 바람직하게는 인간 섬유육종 세포이며, 가장 바람직하게는 인간 HT1080 섬유육종 세포주 및 이것의 유도체이다. 가장 바람직한 세포주는 2001년 5월 17일, 수탁 번호 PTA 3381로 미국, 버지니아, 마나사스, 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁된, HT1080/LUNK4p21로서 확인되는 HT 1080 섬유육종 세포주 유도체이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 세포는, 유전자의 발현이 CDK 억제제에 의해 조절되는 포유류 유전자용 프로모터의 전사적 조절하에 리포터 유전자를 코드화하는 제 1 재조합 발현 구성물과, 포유류 CDK 억제제 유전자를 코드화하는 제 2 재조합 발현 구성물을 모두 포함하고, 그로 인해 CDK 억제제 발현이 포유류 세포에서 실험적으로 유도가능하다. 본 발명의 이러한 관점에 따른 바람직한 구체예에서, CDK 억제제는 p21, p16 또는 p27이다. 선택적인 구체예에서, 본 발명은, 유전자의 발현이 CDK 억제제에 의해 유도되는 포유류 유전자용 프로모터의 전사적 조절하에리포터 유전자를 코드화하는 재조합 발현 구성물을 포함하는 포유류 세포를 제공하고, 상기 프로모터는 결합 조직 성장 인자 혈청 아밀로이드 A(SEQ ID NO:1), 보체 C3(SEQ ID NO:2), 결합 조직 성장 인자(SEQ ID NO:3), 인테그린 β-3(SEQ ID NO:4), 액티빈 A(SEQ ID NO:5), 자연 살세포 단백질 4(SEQ ID NO:6), 프로사포신(SEQ ID NO:7), Mac2 결합 단백질(SEQ ID NO:8), 갈렉틴-3(SEQ ID NO:9), 과산화물 디스뮤타아제 2(SEQ ID NO:10), 그래뉼린/에피텔린(SEQ ID NO:11), p66she(SEQ ID NO:12), 카뎁신 B(SEQ ID NO:14), β-아밀로이드 전구체 단백질(SEQ ID NO:15), 조직 트랜스글루타미나제(t-TGase; SEQ ID NO:16), 클러스테린(SEQ ID NO:17), 프로스타시클린 자극 인자(SEQ ID NO:18), 혈관 내피 성장 인자-C(SEQ ID NO:19) 및 메탈로프로테이나아제-1의 조직 억제제(SEQ ID NO:20)를 코드화하는 유전자로부터 얻은 것이다. 이러한 관점의 본 발명의 바람직한 구체예에서, CDK 억제제는 p21, p16 또는 p27이다.
또한 본 발명은 포유류 세포에서 CDK 억제제-유도성 분열 촉진 인자 또는 항-아포토틱 인자의 발현을 억제하는 화합물을 확인하는 선별 방법을 제공한다. 바람직한 구체예에서, CDK 억제제 발현은 CDK 억제제-유도성 분열 촉진 인자 또는 항-아포토틱 인자의 발현 억제제로서 확인되는 화합물의 존재 또는 부재하에 포유류 세포 배양으로 유도된다. 화합물의 부재하에 발현하는 화합물과, 화합물의 존재하에 분열 촉진 인자 또는 항-아포토틱 인자, 또는 이것의 다수의 발현 정도를 감소시키는 화합물로서 확인된 억제제의 존재하에, 세포에서 CDK 억제제의 발현을유도하고, 분열 촉진 인자 또는 항-아포토틱 인자, 또는 이것의 다수의 발현 정도를 비교함에 의해 억제제로서 화합물을 확인한다. 본 발명의 이러한 관점에 대한 바람직한 구체예에서, CDK 억제제는 p21, p16 또는 p27이다. 여하한 CDK 억제제-발현 세포가 상기 조절 배지의 생산에 유용하고, 내인성 CDK 억제제를 유도하거나(예컨데, DNA 손상제 및 그밖의 세포독성 화합물을 이용한 처리, 및 이온화 또는 자외선 조사, 또는 접촉 억제에 의해) 본 발명에 따른 유도성 CDK 억제제 발현 구성물을 함유하는 세포를 이용하여 생리학적으로 중성인 유도제에서 세포를 배양함에 의해 이러한 세포에서 CDK 억제제를 발현시킬 수 있다. 본 발명의 이러한 관점에 대한 바람직한 구체예에서, CDK 억제제는 p21, p16 또는 p27이다. 바람직한 세포는 포유류 세포를 포함하고, 바람직하게는 설치류 또는 영장류 세포이며, 보다 바람직하게는 마우스 또는 인간 세포이다. 특히 바람직한 구체예는 섬유육종 세포이고, 인간 섬유육종 세포가 보다 바람직하며, 인간 HT1080 섬유육종 세포주 및 이것의 유도체가 가장 바람직하다. 특히 바람직한 본 발명의 구체예에 따른 구체적인 세포주는 2000년 4월 6일, 수탁 번호 PTA 1664로 미국, 버지니아, 마나사스, 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁된, HT1080 p21-9로서 확인되는 HT 1080 섬유육종 세포주 유도체이다. 구체적인 세포 개체군은 2000년 10월 10일, 수탁 번호 PTA 2580로 미국, 버지니아, 마나사스, 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁된, HT1080/LNp16RO2로서 확인되는 인간 HT 1080 섬유육종 유도체이다. 특히 바람직한 본 발명의 구체예에 따른 또다른 구체적인 세포주는 2002년 1월 31일에 수탁 번호 PTA 4020으로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁된, HT1080 p16-5로서 확인되는 HT1080 섬유육종 세포주 유도체이다. 특히 바람직한 본 발명의 구체예에 따른 또다른 구체적인 세포주는 2002년 1월 31일에 수탁 번호 PTA 4020으로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁된, HT1080 p27-2로서 확인되는 HT 1080 섬유육종 세포주 유도체이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 포유류 세포에서 분열유발 인자 또는 항아폽토시스 인자의 CDK 억제제-유도 발현을 억제하는 화합물을 확인하는 방법을 제공하고, 이 세포는 CDK 억제제에 의해 유도되는 세포 유전자 프로모터의 전사 조절을 받는 리포터 유전자를 코드화하는 재조합 발현 구성물을 포함한다. 본 발명의 이러한 관점에 대한 바람직한 구체예에서, CDK 억제제는 p21, p16 또는 p27이다. 바람직한 프로모터는 결합 조직 성장 인자(CTGF;SEQ ID NO:3), 액티빈 A(SEQ ID NO:5), 에피텔린/그래뉼린(SEQ ID NO:11), 갈렉틴-3(SEQ ID NO:9), 프로사포신(SEQ ID NO:7), 클러스테린(SEQ ID NO:17), 프로스타시클린 자극 인자(SEQ ID NO:18), 혈관 내피 성장 인자-C(SEQ ID NO:19) 및 메탈로프로테이나아제-1의 조직 억제제(SEQ ID NO:20)에 대한 프로모터를 포함한다. 바람직한 리포터 유전자는, 이에 제한하는 것은 아니나, 반딧불이 루시퍼라아제, 레닐라 루시퍼라아제, β-갈락토시다제, 알칼리 포스파타아제 및 녹색 형광 단백질을 포함하고, 이들은 모두 시판된다. 이러한 구체예에서, CDK 억제제 발현이 세포에서 유도되고, 화합물의 존재하에 리포터 유전자의 발현 정도를 화합물의 부재하에 발생한 발현 정도와 비교한다. 억제제는 상기 화합물의 부재 하에서보다도 상기 화합물의 존재하에서 리포터 유전자의 발현을 감소시키는 화합물로서 확인된다. 임의의 CDK 억제제-발현세포는 본 발명의 이러한 일면에서 유용하며, 이러한 세포 내에서의 CDK 억제제의 발현은 (예를 들어, DNA 손상제 또는 그 밖의 세포독성 화합물로 처리하거나, 이온선 또는 자외선을 조사시키거나 접촉억제 시킴으로써) 내인성 억제제 유전자를 유발시키거나, 본 발명에 따른 유도성 CDK 억제제 발현 구성물을 함유하는 세포를 사용하여 상기 세포를 생리학적으로 중성인 유도제 내에서 배양시킴으로써 달성될 수 있다. 본 발명의 이러한 일면에 대한 바람직한 구체예에서, CDK 억제제는 p21, p16 또는 p27이다. 바람직한 세포는 포유류 세포, 바람직하게는 설치류 또는 영장류 세포, 더욱 바람직하게는 마우스 또는 사람의 세포이다. 특히 바람직한 구체예는 섬유 육종 세포, 더욱 바람직하게는 사람의 섬유 육종 세포, 및 가장 바람직하게는 사람의 HT 1080 섬유 육종 세포주 및 이들의 유도체이다. 가장 바람직한 세포주는, 2001년 5월 17일자로 수탁 번호 PTA-3381로서 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁된 HT 1080/LUNK 4p21로서 확인된 HT 1080 섬유 육종 세포주 유도체이다.
본 발명은 세포 노화의 병리학적 결과를 억제하는 화합물을 확인하는 방법을 제공하는데, 이로써 상기 화합물의 효과가, 유전자의 발현이 CDK 억제제에 의해 유도되는 유전자의 유도를 상기 화합물이 억제하는지를 측정함으로써 검정된다. 본 발명의 방법의 실시에 있어서, CDK 억제제가 유도될 수 있는 배양시킨 포유류 세포가, 예를 들어 이온선 또는 자외선의 조사, 또는 접촉 억제 처리 또는 세포 독성 약물을 사용하는 처리법, 또는 CDK 억제제를 엔코딩하는 전달가능한 벡터와 함께 유전자변형시킴으로써, 억제 유전자를 유도하도록 처리된다. 본 발명의 일면에 대한 바람직한 구체예에서, CDK 억제제는 p21, p16 또는 p27이다. 보다 바람직하게는, (2000년 4월 6일자로 수탁 번호 제 PTA-1664로서 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁된) IPTG와 HT 1080p21-9 세포를 접촉시킴으로써 p21이 유도될 수 있는 HT 1080p21-9 세포; 또는 p16이 IPTG와 함께 유도될 수 있는 (2002년 1월 31일자로 수탁 번호 PTA 4020으로서 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁된) HT 1080 p16-5 세포; 또는 p27이 IPTG와 함께 유도될 수 있는 (2002년 1월 31일자로 수탁 번호 PTA 4021로서 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁된) HT 1080 p27-2 세포가 사용된다. 일반적으로, 세포를 적당한 배지 (예를 들어, HT 1080 유도체에 대해, 10% 우태아 혈청(FCS)이 제공된 DMEM) 내에서 성장시킨다. HT 1080 p21-9, HT 1080 p16-5 또는 HT 1080 p27-2 세포에서, CDK 억제제 유전자의 발현은 IPTG를 약 50μM의 농도에서 상기 배지에 첨가함으로써 유도된다. 일반적으로, 상기 CDK 억제제는 본 발명의 방법에 따라 시험될 화합물의 존재 또는 부재 하에서 이러한 세포 내에서 유도된다. 이후, mRNA가 CDK 억제제가 유도되는 세포로부터 단리되어, CDK 억제제에 의해 조절되는 유전자의 발현이 검정된다. CDK 억제제가 상기 화합물의 존재하에서 유도되는 세포에서의 발현과, 상기 화합물의 부재하에서 유도되는 발현을 비교하고, 본 방법에 따른 세포 유전자 발현에 영향을 미치는 화합물을 확인하는데 사용된 차이점이 본원에 기술되어 있다. 특정 구체예에서, 세포 유전자 발현은 (예를 들어, 미주리 세인트 루이스 제놈 시스템즈, 인크.로부터) 시판되는 것들과 같은 올리고뉴클레오타이드 또는 세포 cDNA의 마이크로어레이를 사용하여 검정된다. 대안적인 구체예에서, CDK 억제제에 의해 유도되는 것으로 공지된 유전자가 검정된다. 유전자 발현은 하나 또는 다수개의 CDK 억제제-매개된 유전자에 대해 세포mRNA 또는 단백질을 검정함으로써 검정될 수 있다. 본 발명의 이러한 일면에 대한 바람직한 구체예에서, CDK 억제제는 p21, p16 또는 p27이다. 가장 바람직하게는, 이러한 검정에 사용된 유전자는 표 2에서 확인된 유전자들이다.
대안적인 구체예에서, 이러한 화합물은 CDK 억제제로부터 유래한 실험 조작과는 무관하게 확인된다. 이러한 검정법에서, 세포는 상기한 것중 임의의 방식으로 노화를 유발시키도록 처리되는데, 여기에 한정되는 것은 아니나 이러한 처리법에는 세포 독성 약물을 사용한 처리법, 방사선 또는 세포 분화제, 또는 종양 억제 유전자의 도입이 포함된다. CDK 억제제에 의해 유도되는 유전자의 발현은 시험 화합물의 존재 또는 부재하에서 검정된다. 가장 바람직하게는, 이러한 분석에 사용된 유전자는 유전자 발현 검정에 대해 상기 논의된 mRNA 및 단백질 검정법 유형을 사용하여 표 2에서 확인된 유전자들이다.
대안적인 구체예에서, CDK 억제제가 유도되는 세포는 CDK 억제제에 의해 유도되는 세포 유전자 프로모터를 일시적으로 제어하는 가운데 리포터 유전자를 엔코딩하는 재조합 발현 구성물을 추가로 포함한다. 본 발명의 이러한 일면에 대한 바람직한 구체예에서, CDK 억제제는 p21, p16 또는 p27이다. 바람직한 구체예에서, 세포 유전자는 CDK 억제제에 의해 유도되는 유전자이며, 상기 프로모터는 표 2에서 확인된 유전자로부터 유래한다. 이러한 유전자에 대해 공지된 프로모터의 예에는, 혈청 아밀로이드 A (SEQ ID NO: 1), 보체 C3 (SEQ ID NO: 1), 연결 조직 성장 인자 (SEQ ID NO: 3), 인테그린 β-3 (SEQ ID NO: 4), 액티빈 A (SEQ ID NO: 5), 자연 살상 세포 단백질 4 (SEQ ID NO: 6), 프로사포신 (SEQ ID NO: 7), Mac2 결합 단백질 (SEQ ID NO: 8), 갈렉틴-3 (SEQ ID NO: 9), 수퍼옥시드 디스마타아제 2 (SEQ ID NO: 10), 그래뉼린/에피텔린 (SEQ ID NO: 11), p66she(SEQ ID NO: 12), 카텝신 B (SEQ ID NO: 14), β-아밀로이드 전구물질 단백질 (SEQ ID NO: 15), 조직 트랜스글루타미나아제 (t-TGase; SEQ ID NO: 16), 클러스테린 (SEQ ID NO: 17), 프로스타사이클린 자극 인자 (SEQ ID NO: 18), 혈관성 내피 성장 인자-C (SEQ ID NO: 19) 및 메탈로프로테나아제-1의 조직 억제 물질 (SEQ ID NO: 20)이 포함된다. 바람직한 리포터 유전자에는, 여기에 한정되는 것은 아니나, 반딧불이 루시퍼라아제, 레닐라(renilla) 루시퍼라아제, β-갈락토시다아제, 알칼리성 포스파타아제 및 녹색의 형광성 단백질이 포함되는데, 이들은 모두 시판되고 있다.
또한, 본 발명은 세포 노화 및 노화의 병리학적 결과와 관련된 유전자를 확인하거나, CDK 억제제로 유도된 세포 노화 효과를 매개하는 방법을 제공한다. CDK 억제제의 유도는 노화, 말단 분화 및 세포 손상에 대한 응답반응과 관련된 세포 성장을 저지하는 통합부인 것으로 판명되었다. 하기 실시예에 기재된 바와 같이, cDNA 어레이 하이브리드화로부터, 이러한 효과가 유전자 발현에서 p21-유도된 변화에 기인한 것으로 밝혀졌다. p21은, 세포 노화 및 노화와 관련있거나, 죽상 경화증, 알츠하이머병, 아밀로이드증, 신병증 및 관절염을 포함하는 퇴행성 질환과 관련있는 유전자를 선택적으로 유도시킨다. 이러한 발견으로부터, 유기체 내에서의 p21 유도의 누적 효과가 암 및 퇴행성 질환의 발병기전에 기여할 수 있을 것으로 제안된다. 뿐만 아니라, 다수개의 p21-활성화된 유전자는, 세포 성장 및 아폽토시스에 대한 잠재적인 파라크린(paracrine) 효과를 가지면서 밝혀지지 않은 단백질을 엔코딩한다. 이러한 확인된 결과와 동일한 맥락에서, p21-유도된 세포로부터 처리된 매질이 분열촉진 활성 및 항아폽토시스 활성을 나타냄이 확인되었다.
또한, 하기 실시예에 제시된 결과로부터, p16 또는 p27의 유도된 발현이 p21 유전자 발현 효과와 유사하며, 유전자 발현이 p21 유전자 발현에 의해 매개되는 동일한 유전자가 또한 p16 또는 p27 유전자 발현에 의해서 매개된다(도 6 참조)는 것이 입증되었다. 따라서, 본 발명의 방법은, 내인성 p16 또는 p27 유전자를 유도시킴으로써 또는 p16 또는 p27을 엔코딩하는 유도성 발현 구성물을 포함하는 재조합 세포 내에서, p16 또는 p27 유전자 발현이 유도되는 세포를 포함하는 것으로 의도된다.
CDK 억제제 유도에 대해 확인된 효과, 특히 유전자 발현에 대한 p21, p16 및 p27의 유도는, 세포 노화 및 유기체 노화와 관련된 변화와 많은 상관관계가 있음을 나타낸다. 이러한 상관관계의 일부는 CDK 억제제에 의해 억제되는 유전자를 검정함으로써 얻어진다. 따라서, 노화된 섬유아세포는 p21 유도 시에 확인된 것보다 낮은 수준의 Rb를 발현하는 것으로 보고되었다[참조: Stein et al., 1999, Mol. Cell. Biol. 19: 2109-2117]. 또한, CDK 억제제에 의해 억제되는 3개의 유전자, 즉 CHL1, CDC21 및 RAD54가 헬리카아제 군의 성분을 엔코딩한다는 사실도 흥미롭다. 헬리카아제 군의 또 다른 단백질의 결핍은, 성숙 노화와 관련된 임상적 증상인 베르너 증후군의 원인으로서 그리고 세포 수준에서 배양중인 세포의 노화를 가속시키는 것으로 확인되었다 [참조: Gray et al, 1997, Nature Genet. 17: 100-103].
그러나, 노화되는 표현형과의 뚜렷한 상관관계는 CDK 억제제-유도된 유전자(이들 대부분은 복제시 노화 또는 유기체의 노화 중에 이들의 수준을 증가시키는 것으로 공지되어 있음)의 확인으로부터 비롯된다. 세포외 매트릭스(ECM) 단백질의 과다발현은 복제시 노화의 알려진 지표이며, 이러한 군 중의 2개의 CDK 억제제-유도된 유전자, 즉 파이브로넥틴 1 및 플라스미노겐 활성화제 억제제 1 (PAI-1)은 세포 노화와 빈번하게 관련이 있었다 [참조: Crisofalo & Pignolo, 1996, Exp. Gerontol. 31: 111-123]. 노화된 섬유아세포에서 과발현될 것으로 또한 보고된 그 밖의 CDK 억제제-유도된 유전자는 조직 유형의 플라스미노겐 활성제(참조: t-PA; West et al., 1996, Exp. Gerontol. 31: 175-193); 카텝신 B(참조: diPaolo et al., 1992, Exp. Cell Res. 201: 500-505), 인테그린 β3(참조: Hashimoto et al., 1997, Biochem, Biophys. Res. Commun. 240: 88-92), 및 APP(참조: Adler et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 16-20)를 포함한다. 다수의 CDK 억제제-유도된 단백질은 유기체 노화와도 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌는데, 이는 t-PA 및 PAI-1(참조: Hashimoto et al., 1987, Thromb. Res. 46: 625-633), 카텝신 B(참조: Bernstein et al., 1990, Brain Res. Bull. 24: 43-549), 액티빈 A(참조: Loria et al., 1998, Eur. J. Endocrinol. 139: 487-492), 프로사포신(참조: Mathur et al., 1994, Biochem. Mol. Biol. Int. 34: 1063-1071), APP(참조: Ogomori et al., 1998, J. Gerontol. 43: B157-B162), SAA(참조: Rosenthal & Franklin, 1975, J. Clin. Invest. 55:746-753) 및 t-TGase(참조: Singhal et al., 1997, J. Investig.Med. 45: 567-575)를 포함한다.
세포 노화에 대해 가장 보편적으로 사용되는 마커는 SA-β-gal 활성이다[참조: Dimri et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci USA 92: 9363-9367]. 이 유전자는 IPTG-처리된 HT 1080 p21-9 세포에서 뚜렷하게 상승된다[참조: Chang et al., 1999, Oncogene 18: 4808-4818]. SA-β-gal은 리포좀의 β-갈락토시다아제의 국부화를 변경시키고 증가된 활성을 나타내는 것으로 제안되어 있으며(참조: Dimri et al., 1995, ibid), 그 밖의 연구서에는 노화된 세포에서 리포좀의 활성이 증가되는 것으로 기술되어 있다(참조: Cristofalo & Kabakijan, 1975, Mech. Aging Dev. 4: 19-28). 5개의 리포좀 효소가 표 2에 기재되어 있는데, 여기에는 N-아세틸갈락토사민-6-술페이트 술페타아제(GALNS), 카텝신 B, 산성 α-글루코시다아제, 산성 리파아제 A 및 리포좀 펩스타틴을 감지하지 못하는 프로테아제가 포함된다. p21은 또한 미토콘드리아 단백질 SOD2, 메타진 및 2,4-디에노일-CoA 리덕타아제에 대한 유전자를 과조절하며, 이는 또한 노화 세포에서 과발현된 다양한 미토콘드리아 유전자의 리포터와 상관관계가 있다[참조: Doggett et al., 1992, Mech. Aging Dev. 65: 239-255; Kodama et al., 1995, Exp. Cell Res. 219: 82-86; Kumazaki et al., 1998, Mech. Aging Dev. 101: 91-99].
두드러지게는, p21, p16 또는 p27에 의해 유도되는 것으로 확인된 대부분의 유전자 생성물이 퇴행성 질환과 연관되어 있었는데, 상기 질환에는 알츠하이머병, 아밀로이드증, 죽상경화증 및 관절염이 포함된다. 따라서, APP는 알츠하이머의 아밀로이드 플라그의 주성분인 β-아밀로이드 펩타이드를 유발시킨다. 보체 C3(참조: Veerhuis et al., 1995, Virchows Arch. 426: 603-610) 및 AMP 데아미나아제(참조: Sims et al., 1998, Neurobiol. Aging 19: 385-391) 또한 알츠하이머병에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 제안되었다. p21에 의해서 가장 신속하게 유도되며 세포 분화, 발암, 아폽토시스 및 노화의 다면성 발현 매개체로서 기술된(참조: Park et al., 1999, J. Gerontol. A Biol. Sci. 54: B78-B83) t-TGase가 알츠하이머병 및 아밀로이드증 모두와 관련된 플라그의 형성에 관여한다는 사실이 흥미롭다[참조: Dudek & Johnson, 1994, Brain Res. 651: 129-133]. 후자의 질환은 또 다른 CDK 억제제-유도된 유전자 생성물, SAA의 퇴적과 관련되어 있으며, 이는 또한 죽상경화증, 골관절염 및 류마티스성 관절염과도 연관성이 있다 [참조: Jensen & Whitehead, 1998, Biochem. J. 334: 489-503]. 2개의 그 밖의 CDK 억제제로 과조절된 밝혀지지 않은 단백질, 즉 CTGF 및 갈렉틴 3은 죽상경화증과 연관성이 있었다[참조: Oemar et al., 1997, Circulation 95: 831-839; Nachtigal et al., 1998, Am. J. Pathol. 152: 1199-1208]. 또한, 카텝신 B(참조: Howie et al., 1985, J. Pathol. 145: 307-314), PAI-1(참조: Cerinic et al., 1998, Life Sci. 63: 441-453), 파이브로넥틴(참조: Chevalier, 1993, Semin. Arthritis Rheum. 22: 307-318), GALNS 및 Mac-2 결합 단백질(참조: Seki et al., 1998, Arthritis Rheum. 41: 1356-1364)은 골관절염 및/또는 류마티스성 관절염과 연관성이 있었다. 뿐만 아니라, 증가된 PAI-1 발현과 같은 ECM 단백질에 있어서의 노화와 관련된 변화가 피부 및 그 밖의 조직의 구조가 연령에 특이적인 열화를 유발시키는 것으로 제안되었다[참조: Campisi, 1998, J. Investig. Dermatol. Symp.Proc. 3: 1-5]. 노화되는 세포에 의한 파이브로넥틴의 생성량 증가는 ECM 내의 파이브로넥틴 네트워크의 밀도를 증가시키는 것으로 제안되어 있으며, 상기 밀도의 증가는 노화된 개체에 있어서 상처 치유를 보다 더디게 할 수 있다[참조: Albini et al., 1988, Coll. Relat. Res. 8: 23-37].
p21 및 p21-유도성 유전자는 또한 당뇨에 의한 신병증 및 크론성 장 질환과 연관성이 있었다. 쿠안 등(Kuan et al.)(참조: 1998, J. Am. Soc. Nephrol. 9: 986-993)은, p21이 글루코오스-유도된 혈관간 세포를 비대하게 하는 조건 하에서 당뇨병에 의한 신병증의 시험관내 모델을 유도한다는 사실을 확인하였다. 메기에시 등(Megyesi et al.)(참조: 1996, Am. J. Physiol 271: F1211-1216)은, p21이 급성 장 질환에 대한 생체내의 다수개 동물 모델에서 유도되며, 이러한 p21의 유도가 p53과는 무관하다는 것을 입증하였다. 이러한 병의 진행에 있어서 p21의 기능적 역할이 알-도우아히지 등(Al-Douahji et al)(1999, Kidney Int. 56: 1691-1699)에 의해 입증되었는데, 이는 p21(-/-) 마우스가 실험적으로 설정된 당뇨 조건 하에서 사구체 비대증을 진행시키지 않는다는 사실을 확인하였다. 또한, 메기에시 등(1999, Proc Natl Acad Sci USA. 96: 10830-10835)은 p21(-/-) 마우스가 부분적인 장 제거후에 크론성 잘 질환을 진행시키지 않는다는 것을 확인하였다. 두드러지게는, 쿠안 등(1998, J. Am. Soc. Nephrol. 9: 986-993)에 의해 사용된 것과 동일한 시험관내 모델을 사용하여 작업을 실시한 머피 등(Murphy et al.)(1999, J. Biol. Chem. 274: 5830-5834)에 의해서, 혈관간 세포 비대증이 본원에서 p21에 의해 유도성 것으로 본원에서 확인된 다수개의 유전자를 과조절시키는 것과 관련되어있다는 것이 보고되었다. 이들에는 CTGF, 파이브로넥틴 및 플라스미노겐 활성화제 억제제 1이 포함된다. 후자의 연구로부터 또한 CTGF가 이러한 모델 시스템에서 혈관간 매트릭스 축적에 있어서 중요한 역할을 담당한다는 사실이 입증되었다[참조: Murphy et al., 1999, J. Biol. Chem. 274: 5830-5834]. 이러한 결과는 장 질환의 발병기전에 있어서 유전자 발현의 p21 및 p21-매개된 유도와 관련이 있다.
그 중에서도, p21은 산화에 의한 손상을 촉진시키는 것으로 최근에 확인된 p66she의 발현을 유도하였는데, 이때 p66(-/-) 마우스는 증가된 스트레스 내성 및 현저하게 연장된 수명을 나타내었다[참조: Migliaccio et al., 1999, Nature 402: 309-313]. 이러한 관찰로부터, 유전자 발현에 대한 p21의 효과가 다수개 질환의 발병기전에 기여할 수 있을 뿐만 아니라, 포유류 수명을 전반적으로 제한할 수 있다는 사실이 제안된다.
임상적으로 테스팅되는 대부분의 신규한 군의 항암제는 혈관생성 억제제이다. 이러한 제제들은 종양 세포를 표적으로 하기 보다는, 종양에 의해 가려진 혈관생성 인자에 의해 간질 모세혈관의 성장을 자극하였다[참조: Kerbel, 2000, Carcinogenesis 21: 505-515, for a recent review]. 그러나, 맥관은 종양성장에 요구되는 유일한 간질 성분이 아니다. 다수의 연구서에서 간질 섬유아세포가 또한 시험관내 및 생체내에서 종양세포의 성장을 지지하며, 정상 섬유아세포 및 무한증식된 섬유아세포가 종양생성을 촉진하고 암세포의 괴사를 억제하는 파라크린 인자를 분비하는 것으로 밝혀졌다[참조: Gregoire and Lieubeau, 1995, CancerMetastasis Rev. 14: 339-350; Camps et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 75-79; Noel et al., 1998, Int. J. Cancer 76: 267-273; Olumi et al., 1998, Cancer Res. 58: 4525-4530]. 이러한 인자들은 섬유아세포-컨디셔닝된 매질 내에서 (참조: Chung, 1991, Cancer Metastasis Rev 10: 263-74) 그리고 합동배양 연구에서 확인되었다. 특히, 올루미 등(Olumi et al.,)(1998, Cancer Res. 58: 4525-4530)은 정상의 전립선 섬유아세포와 함께 전립성 암세포를 합동배양시키면 암세포 괴사가 현저하게 감소되며, 이종이식된 종양 형성이 촉진되는 것을 확인하였다. 섬유아세포의 파라크린 효과는, 또한 개시된 전립선 상피 세포에 대해 입증된 바와 같이 암세포 형성에 있어서 종양-촉진 활성을 갖는다[참조: Olumi et al., 1999, Cancer Res. 59: 5002-5011]. 이러한 결과에도 불구하고, 종양과 관련된 섬유아세포의 이러한 파라크린 발암성 및 종양 자극 활성은, 아직 약리효과 중재에 대한 표적으로서 이용되지 않고 있었다. 본 발명은 이러한 간질 섬유아세포로부터 미토겐 형성을 억제할 수 있는 화합물을 검출하고 확인하여, 종양세포의 성장을 억제하는 방법을 제공하는 방법을 제공한다.
이러한 파라크린 종양-촉진 활성은, p21 및 p16의 유도와 관련된 과정인 정상적인 사람 섬유아세포의 복제시 노화 동안에 선택적으로 증가되는 것(참조: Krtolica et al., 2000, Proc. Amer. Assoc. Can. Res. 41, Abs. 448)으로 최근 밝혀졌다. 또한, 마우스의 유방암 발암 모델에서 간질 조직의 종양-촉진 효과는 이온선(참조: Barcellos-Hoff and Ravani, 2000, Cancer Res. 60: 1254-30), 간질 섬유아세포에서 p21의 수준을 상승시키는 처리(참조: Meyer et al., 1999, Oncogene18: 5795-5805)에 의해 유도되는 것으로 밝혀졌다. 이러한 결과로부터, p21-과다발현 세포의 처리시킨 매질 내에서 본원에 기술된 파라크린 항아폽토시스 및 분열유발 활성이 동일한 생물학적 현상을 가장 쉽게 유발시킨다는 것을 알 수 있다.
본원에 기술된 결과로부터, CDK 억제제를 유도시키면 암 또는 퇴행성 질환의 진행 가능성을 증가시킬 수 있는 방식으로 세포의 유전자 발현에 영향을 미친다는 것을 알 수 있다. CDK 억제제 발현정도의 변화는 정상적인 복제시 노화에서 뿐만 아니라 세포 손상에 대한 응답반응에서도 일어나며; 이 양자의 경우에, CDK 억제제 유도에 대한 바람직하지 못한 효과는 연령이 증가할 수록 더욱더 축적될 것으로 예측된다.
따라서, 본 발명은 세포의 노화의 발병기전 결과와 관련된 유전자, 특히 노화 동안에 유도되는 유전자, 보다 구체적으로는 CDK 억제제의 발현에 의해 유도되는 유전자의 유도를 억제할 수 있는 화합물을 확인하는 방법을 제공한다. 이러한 화합물은 유전자 발현의 CDK 억제제-매개된 유도에 대한 이들의 효과에 의해 퇴행성 질환을 예방, 지연 또는 역전시키는 능력을 억제시키는 것으로 예측된다.
한 가지 양태로서, 본 발명은 CDK 억제제, 예컨대, p21, p16 또는 p27에 의해서 유도된 유전자 발현을 억제하는 방법을 제공한다. 바람직한 양태에서, 이러한 억제는 핵 인자 카파-B(NFKB)의 활성, 발현 또는 핵 전좌을 억제하는 유효량의 화합물과 세포를 접촉시킴으로써 달성된다. 당업자라면 NFKB 활성이 세포에서 세 가지 이상의 방법으로 억제될 수 있다는 것을 이해할 것이다: 상기 방법중 첫 번째방법은 NFKB 헤테로이량체를 유도하는 유전자의 전사, 프로세싱 및/또는 번역을 하향 조절 또는 억제하는 것이고, 두 번째 방법은 세포내의 IKB 발현 및/또는 활성의 불활성화의 억제에 의존할 수 있는 세포질로부터 핵으로의 NFKB의 전좌의 억제이며, 세 번째 방법은 NFKB 자체의 활성을 억제하는 것이다. 이러한 본 발명은 NFKB 활성을 억제시키고, 그로 인해서, 상기 방법중 어떠한 방법 또는 모든 방법으로 CDK 억제제에 의해서 유전자의 유도를 억제하는 방법을 포함한다. 본 기술 분야에 공지된 NFKB 억제제의 예에는 N-헤테로사이클 카르복시미드 유도체(예를 들어, 국제출원공보 WO01/02359호에 기재됨); 아닐리드 화합물(예를 들어, 국제출원공보 WO00/15603); 4-피리미디노아미노인단 유도체(예를 들어, 국제출원공보 WO00/05234호에 기재됨); 4H-1-벤조피란-4-온 유도체(예를 들어, 일본국특허출원 JP11193231호에 기재됨); 크산틴 유도체(예를 들어, 일본국특허출원 JP9227561호에 기재됨); 카르복시알케닐벤조퀴논 및 카르복시알케닐나프톨 유도체(예를 들어, 일본국특허출원 JP7291860호에 기재됨); 디술피드 및 이의 유도체(예를 들어, 국제출원공보 WO99/40907호에 기재됨); 프로테아제 억제제(예를 들어, 유럽출원공보 EP652290호에 기재됨); 플루르바이프로펜, 탈리도미드, 덱사메타손, 피롤리딘, 디티오카르바메이트, 디메틸푸마레이트, 메살리진, 피모벤단, 술파살라진, 메틸 클로로제네이트, 클로로메틸케톤, 알파-토코페롤 숙시네이트, 테폭살린, 및 아스피린, 살리실산 나트륨 및 설린닥을 포함한 특정의 비스테로이드성 항-염증 약물(NSAID)이 포함된다.
하기 실시예는 본 발명의 특정의 바람직한 양태를 추가로 예시하고자 하는 것이며, 이로써 본 발명을 한정하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1
유도성 p21유전자를 포함하는 포유류 세포의 생성
인간 섬유육종 세포주 HT1080 p21-9의 재조합 유도체를 기본적으로는 본원에서 참조로 통합되는 창(Chang)등의 문헌[1999,Oncogene 18: 4808-4818]에 따라서 생성시켰다. 이러한 세포주는 이소프로필-β-티오갈락토시드(IPTG)에 의해서 조절된 프로모터의 전사 조절하에 p21 코딩 서열을 함유하였다. p21의 발현은 유효량의 IPTG의 존재하에 상기 세포를 배양함으로써 유도될 수 있으며, 그렇게 함으로써 내생성 p21 유전자의 유도가 유발될 수 있는 어떠한 추가의 효과가 없는 상태에서 p21 발현의 결과물을 연구할 수 있다. 이러한 세포주를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection: A.T.C.C.)에 2000년 4월 6일에 기탁했으며, 수탁번호 PTA 1664를 부여받았다.
요약하면, 플라스미드 3'SS (Stratagene)(본원에서 참조로 통합되고 있는 문헌[Chang & Roninson, 1996,Gene 33: 703-709])에 의해서 엔코딩된 변성 박테리아lacI 리프레서(repressor) 및 뮤린 에코트로픽(ecotropic) 레트로바이러스 수용체를 발현하는 HT1080의 서브라인을 구조가 도 1에 도시되고 있는 재조합 레트로바이러스 LNP21CO3을 함유한 레트로바이러스 입자로 감염시켰다. 이러한 레트로바이러스 벡터는 레트로바이러스 장말단 반복 프로모터의 전사 조절하에 박테리아 네오마이신 내성 유전자(neo)를 함유한다. p21-엔코딩 서열은neo유전자의 전사방향에 반대 배향으로 변형된 인간 시토메갈로바이러스 프로모터의 조절하에 클로닝된다. 특이적으로, CMV 프로모터는 세포내에서 발현된lacI 억제인자에 민감한 프로모터로부터 발현을 유도하는 박테리아lac작동인자 서열의 3-폴드(fold) 반복체를 함유한다. LNP12CO3은 p21 코딩 서열을 포함하는 DNA의 492bp 단편을 페어런트(parent) 벡터, 즉, LNXCO3의NotI 및BglII 부위내로 클로닝시킴으로써 구성되었다(상기 창 및 로닌슨(Chang & Roninson)의 문헌에 기재됨).
감염 후에, LNP21CO3X 벡터로 감염된 세포를 400㎍/mL G418(미국 매릴렌드 게이더스버그 소재의 BRL-GIBCO사로부터 입수)의 존재하에 세포를 배양함으로써 선택하였다. 클론성 세포주 HT1080 p21-9를 클론성 세포주를 얻을 때까지의 종말점 희석에 의해서 LNP21CO3 형질도입된 G-418-내성 세포주로부터 유도하였다.
실시예 2
세포 성장 검정
실시예 1에 기재된 바와 같이 생성된 HT1080 p21-9 세포를 세포 성장 검정에 사용하여 p21이 세포에서 발현되었을 때 세포 성장에서 어떠한 변화가 발생되었는지를 측정하였다.
HT1080p21-9 세포에서 LNP21CO3 벡터로부터의 p21 발현은 10% 소 태아 혈청(미국 유타 라곤 소재의 하이클론사(Hyclone)) 및 IPTG를 함유하는 DMEM 배지에서 세포를 배양함으로써 유도되었다. 이들 검정의 결과를 도 2a 및 도 2b에 도시한다. 도 2a는 50μM의 IPTG의 존재하에 배양된 세포에서 p21 단백질 생성의 시간에 따른 과정을 도시하고 있다. p21 유전자 발현은 IPTG를 성장 배지내로 도입한 후 6 내지 12 시간 사이에서 증가하였으며, 발현은 유도 후 약 24 시간에서 최대였다. 세포를 IPTG-함유 배지로부터 제거하면, p21 발현은 이러한 발현이 상승되었던 속도만큼 신속하게 저하되는데, IPTG를 제거한 후 약 24시간에서 유도전 수준으로 되돌아왔다(도 2b).
IPTG의 존재하의 세포 성장은 세 가지 방법으로 검정하였는데: 즉,3H-티미딘 혼입("라벨링 인덱스"라 일컬어짐)을 측정하고; 현미경으로 배양물중의 유사분열 세포의 수("유사분열 인덱스"라 일컬어짐)를 관찰하고, 세포 사이클의 상이한 부분에서 배양 세포의 분포("세포 사이클 분포"라 일컬어짐)를 측정하였다.
3H-티미딘 혼입 검정은 실질적으로 문헌[Dimri et al., 1995,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 9363-9367]에 기재된 바와 같이 수행되었다. 세포를3H-티미딘의 존재하에 3 시간동안 배양하고, 자동방사선사진으로 분석하였다. DNA 복제는 배양 배지에 IPTG를 첨가한 후 완전히 정지된 9 시간까지 자동방사선사진으로 측정하였다. 유사분열 인덱스는 세포를 현미경으로 관찰하고, 5㎍/mL의 4,6-디아미노-2-페닐인돌(DAPI)로 염색한 후에 유사분열중의 세포의 수를 계수함으로써 측정하고, 영상은 레이카 DMIRB 형광 현미경(Leica DMIRB fluorescence microscope)과 바이텍(Vaytek; 미국 아이오와 페어필드 소재) 영상화 시스템을 사용함으로써 얻었다. 현미경으로 검출 가능한 유사분열 세포는 IPTG 처리 14 시간 후에 이들 배양물로부터 사라졌다.
세포 사이클 분포는 벡톤 디킨슨 FACSort(Becton Dickinson FACSort)를 사용하여 문헌[Jordanet al., 1996,Cancer Res.56: 816-825]에 기재된 바와 같이 요오드화프로피듐으로 염색한 후에 DNA 함량을 FACS 분석으로 측정하였다. 세포 사이클 분포는 IPTG 처리 24시간 후에 안정화되었다. 이 시점에서, 42-43%의 IPTG-처리된 세포가 각각 G1 및 G2에서 정지되고, 약 15%의 세포가 S기 DNA 함유 상태로 정지되었다. IPTG-처리된 HT1080 p21-9 세포는 또한 SA-β-gal 활성(상기 창(Chang) 등의 문헌)뿐만 아니라, 형태학상 노령 마커(확대 및 평탄화된 형태 및 증가된 과립성)로 진행되었다. 이러한 결과는 유도된 p21 발현이 세포 노령의 특징인 세포 사이클 정지 및 다양한 그 밖의 변화를 생성시킨다는 것을 나타냈다.
실시예 3
p21 유전자 발현에 의해서 변성된 유전자 발현 분석
실시예 2에 기재된 결과는 p21 유도에 의한 형태학적 결과 및 세포 사이클 결과가 유전자 발현에서 다양한 변화를 반영할 수 있음을 제시하였다. 세포 유전자 발현에 대한 p21 유도의 효과를 이하 기재된 바와 같이 시험하였다.
폴리(A)+RNA를 비처리된 HT1080 p21-9 세포 및 50㎛의 IPTG로 3일 동안 처리된 세포로부터 분리하였다. cDNA를 폴리(A)+RNA로부터 제조하고, 4,000 이상의 서열-확인된 공지의 인간 유전자 및 3,000이상의 EST를 함유하는 휴먼 UniGEM V cDNA 마이크로어레이(Human UniGEM V cDNA microarray)(미국 미주리 세인트 루이스 소재의 게놈 시스템즈, 아이엔씨(Genome Systems, Inc.)에 의해서 수행됨)와 함께 차별 하이브리드화를 위한 프로브로 사용하였다. 2,500 이상의 유전자 및 EST가 비처리된 및 IPTG-처리된 HT1080 p21-9 세포 둘 모두에서 프로브로 측정가능한 하이브리드화 신호를 나타냈다. 차별적 발현 차이가 ≥2.5으로 하향 조절되거나 차별적 발현 차이가 ≥2.0으로 상향 조절된 유전자를 각각 표 I 및 표 II에 수록하였다.
이들 유전자의 69의 발현을 RT-PCR 또는 노던 하이브리드화(northern hybridization)로 각각 시험하였다. RT-PCR 분석을 기본적으로는 문헌[Noonan et al., 1990,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 7160-7164]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 노던 하이브리드화를 위한 프로브는 마이크로어레이에 존재하는 cDNA 클론의 삽입물로부터 유도하였고; 이들 cDNA는 게놈 시스템즈, 아이엔씨로부터 얻었다. 또한, 몇몇의 p21-조절된 유전자 생성물의 발현에서의 변화를 면역블롯팅으로 분석하였다. 하기 일차 항체를 면역블롯팅에 사용하였다: Cdc2(산타 크루즈: Santa Cruz), 사이클린 A(네오마커스: NeoMarkers), Plk 1(자이메드: Zymed) 및 Rb(파밍엔: PharMingen)에 대한 마우스 모노클론성 항체; MAD2(베드코: BadCo),p107(산타 크루즈: Santa Cruz), CTGF(Fisp-12; 엘. 라우 박사(Dr. L. Lau) 기증), Prc 1(더블유. 지앙 박사(Dr. W. Jiang) 및 티. 헌터 박사(Dr. T. Hunter) 기증), 및 토포이소머라제 IIα(Ab0284; 더블유. 티. 벡크 박사(Dr. W.T. Beck) 기증)에 대한 토끼 폴리클론성 항체, 및 SOD2(칼바이오켐: Calbiochem)에 대한 양 폴리클론성 항체. 사용된 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)-컨주게이트된 이차 항체는 염소 항-마우스 및 염소 항-토끼 IgG(산타 크루즈) 및 토끼 항-양 IgG(KPL)였다. 모든 샘플에서 단백질 농도는 바이오라드 단백질 검정 키트로 측정한 후에 동일하게 되었다. 면역블롯팅을 표준 방법으로 수행하였고, 신호를 루미글로(LumiGlo; KPL)를 사용한 화학발광법으로 검출하였다.
이들 결과를 도 3a 내지 도 3c에 도시하였다. 상기된 마이크로어레이 검정에 의해서 예측된 유전자 발현에서의 변화를 38/39 하향 조절된 유전자 및 27/30 상향 조절된 유전자에 대해서 확인하였다. 대부분의 시험된 유전자(도 3a 내지 도 3c)에 대한 노던 하이브리드화 또는 RT-PCR에서의 관찰된 신호 차이는 cDNA 어레이(표 I 및 표 II)로부터 측정된 차별적 발현 차이의 값 보다 높은 것으로 나타나서, cDNA 어레이 하이브리드화가 유전자 발현에 대한 p21 효과의 크기를 하향 산정하는 경향이 있다는 것을 제시하고 있다. 6 하향 조절된 유전자 및 4 상향 조절된 유전자의 발현에서의 변화를 면역블롯팅(도 3b) 또는 지모그래피(zymography)(도시되지 않음)로 단백질 수준에서 시험하였고, 시험된 모든 경우에서 확인하였다.
유전자 발현에서 p21-매개된 변화는 후속된 p21-유도된 세포 성장이 정지되는 장시간 효과 및 단시간 효과를 포함하였음이 인지되었다. 이를 위해서, IPTG의 첨가 및 제거 후에 p21-억제된 유전자(도 3b) 및 p21-유도된 유전자(도 3c)의 서브세트의 RNA 수준에서의 시간에 따른 변화를 측정하였다. 면역블롯팅을 이용하여 Rb 인산화(전기영동 이동성에 의해서 나타냄)에서의 시간에 따른 p21-유도된 변화를 분석하고, cDNA 어레이에 따른 p21에 의해서 억제되는 Rb 및 몇몇의 단백질의 세포 수준에서 분석하였고; 이들 결과를 도 3b에 도시하였다. Rb는 IPTG 첨가 6 시간후인 만큼 빠르게 탈인산화되는 것으로 밝혀졌다. 또한, Rb 단백질 수준은 12-24 시간 사이에서 빠르게 감소(도 3b에 도시됨)하지만, RB mRNA 수준(도면에 도시되지 않음)에서는 현저한 변화가 없었다. 유사한 감소가 Rb-관련된 단백질 p107에 대해서 관찰되었다(도 3a에 도시됨).
1.p21에 의해 억제되는 유전자 발현
모든 시험된 p21-억제된 유전자는 p21 유도 및 방출에 빠른 반응을 보였다. 이러한 유전자 중 5개(토포이소머라아제 IIα, ORC1, PLK1, PRC1 및 XRCC9)는 IPTG 첨가 후 4시간 내지 8시간 사이에 RNA 및 단백질 수준 둘 모두에서 상당한 억제를 보였다(도 3b). 이러한 패턴을 세포 증식 정지 및 Rb 탈인산화의 속도론과 유사한 "즉각적인 반응"이라 칭하였다. 다른 p21-억제된 유전자(예를 들어, CDC2 또는 DHFR)는, mRNA 수준의 상당한 감소가 단지 IPTG의 첨가 후 12시간 후에 검출될 수 있는, DNA 복제 및 유사분열의 중단 후에 다소 지체하는 "초기 반응" 패턴을 보였다. 그러나, 모든 p21-억제된 유전자는, 세포의 증식이 여전히 중단된, IPTG의 제거 후 12 내지 16시간 후와 DNA 복제 및 유사분열 전에 발현을 재개하였다(도 3b).이러한 분석은 p21-억제된 유전자의 발현의 변화가 p21 유도 및 방출의 단기적 효과이고, 세포 증식 정지 및 회복의 결과가 아니라는 것을 의미한다.
요약하면, 69개의 유전자 및 3개의 EST가, 2.5 내지 12.6의 차별적 발현 차이로 p21-유도된 세포에서 하향조절되는 것으로 cDNA 마이크로어레이에 의해 확인되었다(표 IA); 세포 사이클 진행과 관련되고, 본 발명자들의 개별적인 검정에 의해 IPTG-처리된 세포에서 하향조절되는 것으로 확인된 5개의 추가 유전자를 표 IB에 나열하였다. cDNA 어레이에 의해 확인된 하향조절되는 유전자의 매우 높은 분획(43/69)은 유사분열, DNA 복제, 분리 및 수선, 크로마틴 어셈블리와 관련되고, 이는 유전자 발현의 p21-매개된 억제의 매우 선별적인 특성을 의미한다.
p21-하향조절된 유전자의 가장 큰 그룹은 유사분열의 시그날링, 수행 및 조절에 관련된 것이다. 많은 p21-억제된 유전자는 DNA 복제 및 분리, 크로마틴 어셈블리 및 DNA 수선에 관련된다. 이러한 유전자의 일부는 누클레오티드 생합성에 관련된 효소를 엔코딩하고, 다른 단백질은 DNA 복제에 관여한다. 수개의 p21-억제된 유전자는 DNA 수선과 관련된다. 이러한 결과는 치료적 간섭에 대한 표적이 되는 p21-유도된 증식의 세포 프로그램의 구성요소를 발견하는 기회를 제공한다.
2.p21에 의해 유도된 유전자 발현
p21 발현에 의해 억제되는 유전자 외에, 상기에 설명된 검정은 p21에 의해 유도된 유전자를 검출하였다. p21-유도된 유전자의 유전자 발현의 패턴은 도 3c에 도시되어 있다. p21-억제된 유전자와 대조하여, p21-상향조절된 유전자는 단지 IPTG의 첨가 후 48시간 후에, 예를 들어 모든 세포에서 증식이 정지된 후에 발현을증가시켰다. 단지 1개의 시험된 유전자, 조직 트랜스글루타미나아제(t-TGase)는 IPTG의 첨가 후 12시간 후에 검출될 수 있는 증가를 보였지만, 이의 발현은 단지 48시간 후에 최대에 도달하였다(도 3c에 도시됨). 또한, 모든 시험된 유전자(t-TGase 제외)의 상승된 발현은, 세포 사이클의 재개 후에 충분하게, IPTG로부터 방출 후 3일 이상 지속되었다(도시되지 않음). 이러한 "늦은 반응" 속도론은 이러한 유전자의 p21 유도가 p21-매개 증식 중단에 비해 지연된 효과였다는 것을 의미한다.
48개의 공지된 유전자 및 6개의 EST 유전자 또는 미지의 기능을 가지는 유전자는, 2.0 내지 7.8의 차별적 발현 차이를 보이며 p21-유도 세포에서 상향조절되는 것으로 확인되었다(표 II). 이러한 그룹에서 확인될 수 있는 유전자의 매우 높은 분획(20/48)은 세포외 매트릭스(ECM) 구성요소(예를 들어, 피브로넥틴 1, 라민α2, Mac-2 결합 단백질), 다른 분비 단백질(예를 들어, 액티빈 A, 결합 조직 성장 인자, 혈청 아밀로이드 A), 또는 ECM 수용체(예를 들어, 인테그린 β3)를 엔코딩한다. p21-유도된 세포내 단백질의 큰 그룹(표 II) 뿐만 아니라 수개의 이러한 분비 단백질은 상이한 형태의 스트레스 반응으로 유도되거나 스트레스 관련된 시그날 트랜스덕션에 역활하는 것으로 공지되어 있다. 놀랍게도, p21에 의해 유도되는 것으로 관찰된 많은 유전자가 또한 세포 노화, 유기체 노화, 또는 상이한 연령-관련 질병에서 상향조절되었고, 이는 p21-매개된 유전자 유도의 억제가 이러한 질병의 발병을 예방하는 방법을 제공할 수 있다는 것을 의미한다. 하기 실시예 5에 개시된 바와 같이, 수개의 p21-유도된 유전자는 측분비 항아폽토시스 및 분열유발 활성을가지는 분비 인자를 엔코딩하고, p21-유도된 세포로부터의 적합한 배지는 p21-상향조절된 유전자의 특성에 의해 예상되는 2개의 생물학적 효과(세포 증식의 촉진 및 아폽토시스의 억제)를 보였다. 이러한 발견은 p21의 "측분비" 효과가 이웃하는 세포에 대한 종양-촉진 효과를 통하여 발암에 기여할 수 있다는 것을 제시한다. 이는 p21-매개 유전자 유도가 또한 항-발암 효과를 달성하는 방법을 제공할 수 있다는 가능성을 높인다.
실시예 4
IPTG-처리되고 혈청-결핍된 HT1080 p21-9 세포를 비교함에 의한 p21 유도의 특이성 확인
세포 증식 정지의 결과일 것으로 보이는 세포 유전자 발현의 p21-유도된 변경의 특성을 하기와 같이 결정하였다.
증식 정지(quiscence: 무활동)를, 세포를 4일 동안 무혈청 배지에서 배양하여 생성된 혈청 결핍에 의해 HT1080 p21-9에서 유도하였다. 혈청-결핍 세포에서, IPTG-처리된 HT1080 p21-9 세포와 달리, 세포는 노화 형태를 나타나게 하지 않았고, 단지 매우 약한 SA-β-gal 발현만을 보였다. 혈청 결핍 세포 중의 p21 수준은, IPTG-처리된 세포에서 보여지는 15 내지 20배의 증가와 대치되게, 단지 약 2배 증가하였다. 도 3d에, 50μM IPTG의 존재 시에 3일 또는 무혈청 배지 중에서 4일 후에 증식이 정지된 HT1080 p21-9 세포 중의 p21-억제되고 p21-유도된 유전자의 한 그룹의 발현에 대한, 상기 설명된 바와 같이 수행된 RT-PCR 분석을 도시하였다. 배양 배지가 50μM IPTG를 함유한 경우에 HT1080 p21-9 중에서 완전히 억제된 유전자는 또한 혈청-결핍 세포 중에서 억제되고, 이러한 유전자 대부분은 IPTG-처리된 세포에서 보다 더 적은 양으로 억제되었다.
발현이 p21에 의해 유도되는 유전자는 3개의 구별되는 패턴을 보였다. 제 1 그룹은 노화 세포에서처럼 무활동 세포에서도 강하게 발현이 유도되는 유전자이다. 이들에는 갈렉틴-3, 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 2, 보체 C3 및 프로사포신을 포함하며, 이들이 유도되는 것은 세포 성장 정지의 결과이거나, 이러한 유전자가 약간 상승된 p21 수준에 매우 민감하다는 것을 시사한다. 제 2 그룹은 노화된 세포에서와 같이 강력한 것은 아니지만 무활동 세포에서 상승 조절된 유전자이다. 이들 유전자에는 피브로넥틴-1, Mac2 결합 단백질 및 알츠하이머 전구체 단백질 혈청 아밀로이드 A를 포함한다. 제 3 그룹은 무활동 세포에서 검출가능하게 유도되는 것이 아니라 노화 세포에서 강력하게 유도되는 유전자이다. 이들 유전자로는 CTGF, 플라스미노겐 활성제 억제제 1, 조직 트랜스글루타미나아제 또는 자연 살상 세포 마커 단백질 NK4, 인테그린 베타 3 및 액티빈 A가 포함된다.
혈청 결핍에 의한 무활동 유도와 p21의 IPTG 유도 과발현을 통한 세포 노화 유도에 대한 특정 유전자의 반응 간의 차이는 이들 유전자가 노화에 대한 진단 마커임을 확인시켜 준다. 추가로, 신규 노화 마커는 이제 p21 발현 세포와 무활동 세포 간에 발현을 비교함으로써 확인될 수 있다.
실시예 5
분열유발 인자를 함유하는 조건 배지의 제조 및 분열유발 활성 검정
수개의 p21 상향조절된 유전자(표 II)를, CTGF(Bradham et al., 1991, J.Cell Biol. 114:1285-1294), 액티빈 A(Sakurai et al., 1994, J. Biol. Chem. 269: 14118-14122), 에피텔린/그래뉼린(Shoyab et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:7912-7916) 및 갈렉틴-3(Inohara et al., 1998, Exp Cell Res. 245: 294-302)를 포함하는 성장 인자로서 작용하는 분비된 단백질을 암호화한다. 또한, 갈렉틴-3(Akahani et al., 1997, Cancer Res. 57:5272-5276) 및 프로사포신(Hiraiwa et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4778-4781)은 세포사멸 억제 활성을 갖는 것으로 나타났다. 파라크린 세포사멸 억제 또는 분열유발 활성은 또한 표 II에 기재되어 있지 않은 수개의 p21-유도성 유전자 생성물에 대해 보고되어 왔는데, 그 이유는 cDNA 마이크로어레이 하이브리드화 (cDNA microarry hybridization)에서 이들의 평형화된 발현 값의 차가 1.8 내지 1.9였기 때문이다. 이것은 상기 표에 포함되어 사용하여 왔거나, RT-PCR에 의해 확인된 임의의 선택된 최소값인 2.0보다 낮다. 이들 단백질이 클러스테린 (Koch-Brandt and Morgans, 1996, Prog. Mol. Subcell. Biol. 16: 130-149), 프로스타시클린 자극 인자(PSF)(Yamauchi et al., 1994, Biochem. J. 303: 591-598), 혈관 내피세포 성장 인자-C(VEGF-C)(Joukov et al., 1996, EMBO J. 15:290-298), 겔솔린(Ohtsu et al., 1996, EMBO J 16: 4650-4656) 및 메탈로프로테이나아제-1(TIMP-1)(Li et al., 1999, Cancer Res. 59:6267-6275)이다.
p21에 의해 분비된 분열유발 인자 및 세포사멸 억제 인자의 유도를 입증하기 위해, IPTG 처리된 HT1080 p21-9 세포로부터의 조건 배지를 시험하여 세포 성장 및 세포사멸에 대한 효과를 갖는 지에 대해 조사하였다. 이러한 실험에서, 조건 배지는 DMEM/10% FCS의 존재하에 15cm 플레이트에 대해 106개의 HT 1080 p21-9 세포를 플레이팅함으로써 제조하였다. 다음날, IPTG를 최종 농도 50μM로 첨가하고, 이 배지를 3일 후에 0.5% FCS 및 50μM IPTG가 보충된 DMEM로 대체하였다. 2일 후(IPTP 처리 3-5일), 상기 조건 배지를 수거하고, 사용 전에 15일 까지는 4℃에서 저장하였다. IPTG 비함유 DMEM/0.5% FCS를 IPTG 처리된 세포와 동일한 밀도로 비처리된 세포에 첨가함으로써 대조군 배지를 제조하고, 이 배지를 이틀 후에 수거하였다.
성장이 느린 인간 피부육종 세포주 HS 15.T를 사용하여 상기 조건 배지에서의 분열유발 활성을 검출하였다. 분열유발 활성 검정을 위해 두가지 타입을 조건 배지 뿐만 아니라 새로운 배지 및 조건 배지와 새로운 배지의 1:1 혼합물을 사용하여 분열유발 활성을 시험하였다. 이들 실험에서, 조건 배지는 1% 또는 2% FCS로 보충되었다. 간단히 말해, HS 15.T 세포를 웰당 15,000개의 세포로 12개의 웰 플레이트에 플레이팅하였다. 이틀 후, 이들 세포를 상이한 타입의 배지에서 배양시켰다. 이들 세포를 60시간 동안 조건 배지에서 성장시키고, 3.13μCi/mL의 농도에서3H-티미딘을 첨가하고, 25시간 동안 인큐베이팅시켰다. 이후, 세포를 수거하고, 문헌(Mosca et al. 1992, Mol. Cell. Biol. 12:4375-4383)에 의해 기술된 바와 같이 이들의3H-티미딘 혼입율을 측정하였다.
새로운 배지에 IPTG를 첨가하는 것은 상기 검정에서 아무런 효과를 나타내지 않았다. 새로운 배지에서의 세포 성장과 비처리된 HT 1080 p21-9세포로부터의 조건 배지에서의 성장 인자 간에 현저한 차이는 전혀 없었다. 대조적으로, IPTG 처리된 세포로부터 조건 배지는3H 혼입율이 세배까지 증가하였다. IPTG 처리된 세포로부터 조건 배지에 의한 HS 15.T의 성장 촉진은 메틸렌 블루 염색에 의해 검출가능하였다.
또한, 세포사멸에 대해 상기 조건 배지의 효과를 측정하였다. 이 실험에서는 E1A에 의해 불멸화된, 마우스의 배아 섬유육종주 C8을 사용하였다. 이 세포주는 혈청 기아(Lowe et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2026-2030)을 포함하는, 상이한 자극에 대해 유도된 세포사멸에 매우 민감하다[참조: Lowe et al., 1994, Science 266: 807-810; Nikiforov et al., 1996, Oncogene 13: 1709-1719]. 6cm 플레이트에 대해 3 x 105개의 C8 세포를 플레이팅하고, 다음날 이 배지를 0.4% 혈청이 보충된 새로운 배지 또는 조건 배지(새로운 혈청이 첨가되지 않은)로 대체시켜 세포사멸을 분석하였다. DNA 함량 분석 및 DAPI 염색을 24시간 후 및 48시간 후에 수행하고, 저혈청 배지에서 48시간 후에 상대적 세포 수를 메틸렌 블루 염색법에 의해 측정하였다(Perry et al., 1992, Mutat. Res. 276: 189-197).
저혈청의 새로운 배지 또는 IPTG 처리되거나 비처리된 세포로부터의 조건 배지의 첨가는 C8 세포의 세포사멸을 유도하였으며, 이는 DAPI 염색(미도시됨) 후 대다수의 세포에서 검출가능한 세포 탈착 및 세포사멸 형태에 의해 입증된다. 그러나, IPTG 처리된 세포로부터의 조건 배지는 새로운 배지 및 비처리된 세포로부터의 조건 배지에 비해 세포 생존율이 매우 증가하였는데, 이는 메틸렌블루 염색법에 의해 측정하였을 때, 48시간 후에 부착하여 존재하였다. p21 유도된 세포로부터의 조건 배지의 효과는 세포 DNA 함량에 대한 FACS 분석에서 훨씬 더 명백하게 나타났으며, 이는 배지를 교체한 후, 24시간 및 48시간 후에 결합되어, 부착되고, 플로팅되어 있는 C8 세포에 대해 수행되었다. 다수의 세포주와는 달리, C8세포의 세포사멸은 감소된(서브-G1) 양의 DNA를 갖는 소수의 세포만을 생성시키며, 이는 G2/M DNA 함량을 갖는 세포의 선택적인 소멸에 의해 특징된다[참조: Nikiforov et al., 1996, ibid.]. IPTG 처리된 세포로부터의 조건 배지에서의 혈청 기아 세포는 G2/M 단편을 보유하였으며, 혈청 부화 배지에서 성장하는 대조군 세포와 유사한 세포 사이클 프로파일을 보여주였다. IPTG를 그 자체로 첨가하는 것은 C8세포에서의 세포사멸에 어떠한 영향을 미치지 않았다. 이로써, p21 비조절 유전자의 특성에 의해 예측되는 바와 같이 HT1080 세포에서의 p21 유도는 분열유발 및 세포사멸 억제 인자의 분비를 유도한다.
실시예 6
유도성 p16 Ink4A 또는 p27 Kip1 유전자를 포함하는 포유류 세포의 제조
유도성 CDK 억제제 p16Ink4A(우선적으로 CDK4/6을 억제함; Serrano et al., Nature 16, 704-707, 1993) 또는 p27Kip1(우선적으로 CDK2를 억제함; Blain et al., J. Biol. Chem. 272, 25863-25872, 1997)을 포함하는 포유류 세포주를 일반적으로 유도성 p21 세포주를 제조하기 위한 실시예 1에서 기재된 바와 같이 제조하였다. 박테리아 lacI 유전자를 암호화하고, 뮤린 에코트로픽 레트로바이러스 수용체를 발현시키는 재조합 발현 구조를 함유하는 인간 HT1080 섬유육종 세포주의 재조합 유도체(HT1080 3'SS6; Chang & Roninson, 1996, Gene 183: 137-142)를 사용하여 유도성 세포주를 제조하는데 사용하였다. p16의 유도성 발현을 위해, 인간 p16의 471bp 코딩 서열을 포함하는 DNA 단편(본원에서 참고문헌으로 인용되는 미국 특허 제 5,889,169호에 개시된 바와 같이)을 IPTG 조절된 레트로바이러스 벡터 LNXRO2로 클로닝하였다[참조: Chang & Roninson, 1996, Gene 183: 137-142]. 상기 레트로바이러스는 레트로바이러스의 긴 말단 반복 프로모터의 전사 조절을 받는 박테리아 네오마이신 내성 유전자(neo)를 함유하여 G418(BRL-GIBCO)를 선택하여 사용가능하게 한다. 이에 따라 형성된 LNp16RO2로 명명된 구조가 도 4에 개략적으로 도시된다. p27의 유도성 발현을 위해, 동일한 LNXR02 벡터에 뮤린 p27 cDNA(NCBI RefSeq NM_009875)를 지니고 있는 벡터 LNp27R02가 개발되어 문헌(Kokontis et al., 1998, Mol. Endocrinol. 12: 941-953)에 개시되었으며, 엔. 헤이(N. Hay) 박사(University of Illinois at Chicago)에 의해 전달되었다.
LNp 16RO2 및 LNp27RO2 구조는 통상적인 레트로바이러스 감염 방법을 사용하여 HT1080 3'SS 세포로 개별적으로 도입되었다. 감염된 세포를 400㎍/ml G418(BRL-GIBCO로부터 수득됨)의 존재 하에 상기 세포를 배양함으로써 선택하였다. LNp16RO2 형질도입 세포의 G418 선택된 집단을 HT1080/LNp16RO2로 표시하였다. 이러한 세포 집단을 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(A.T.C.C.)(Manassas, VA)에 2000년 10월 10일자로 기탁하고, 수탁 번호 PTA-2580을 받았다.
상기 세포 집단을 서브클로닝하고, 20개의 클론 세포주를 분리시키고, IPTG유도성 성장 억제에 대해 시험하였다. 최고 성장 억제를 나타내는 세포주를 HT1080 p16-5로 표시하였다. 상기 세포주를 A.T.C.C.(Manassas, VA)에 2002년 1월 31일자로 기탁하고, 수탁 번호 PTA 4020을 받았다. 도 5a는 50μM IPTG의 첨가시 HT1080 p16-5의 세포 사이클 분포에서의 변화를 나타낸다. 세포 사이클의 상이한 상에 있어서의 세포 분획을, 벡톤 딕킨슨 팩소트(Becton Dickinson FACSort)를 사용하여 문헌(Jordan et al. 1996, Cancer REs. 56: 186-825)에 기술된 바와 같이 요오드화프로피듐으로 염색시킨 후, DNA 함량의 FACS 분석을 사용하여 측정하였다. IPTG 처리 24시간 후, 이때까지 93%의 IPTG 처리된 세포가 안정화된 세포 사이클 분포는 G1에서 정지하였다. 이러한 G1 정지는 p16에 의한 CDK4/6 의 억제로부터 예측된다.
유사하게, LNp27RO2 형질도입 세포의 G418 선택된 집단을 서브클로닝하고, 38개의 클론 세포주를 분리시키고, IPTG 유도성 성장 억제에 대해 시험하였다. 최고 성장 억제를 나타내는 세포주를 HT1080p27-2라고 명명하였다. 이 세포주를 를 A.T.C.C.(Manassas, VA)에 2002년 1월 31일자로 기탁하고, 수탁 번호 PTA 4021을 받았다. 도 5b는 50μM IPTG의 첨가시 HT1080 p27-2의 세포 사이클 분포에서의 변화를 나타낸다. 세포 사이클 분포는 IPTG 처리 24시간 후에 안정화되었으며, 이때까지 89%의 IPTG 처리된 세포가 G1에서 정지하였다. 이러한 G1 정지는 p16에 의한 CDK4/6 의 억제로부터 예측된다.
실시예 7
p21 유도성 유전자의 발현에 대한 p16 및 p27의 효과
실시예 6에서 기술된 바와 같이 IPTG로 유도성 p16 또는 p27 유전자를 지닌 HT1080 유도체, HT1080 p16-5 및 HT1080 p27-2를 하기와 같이 유전자 발현 검정에 사용하였다.
RNA를 이들 세포주로부터 수득하고, 3일 동안 50μM IPTG의 존재 또는 부재 하에 배양시켰다. 이후, 이들 RNA 샘플을, 표준화를 위해 β2-마이크로글로불린 대신에 β-악틴을 사용하는 것 이외에, 실질적으로 실시예 3에서 상기 기술된 바와 같이 수행된 RT-PCR 검정에 사용하였다. p21에 의해 유도된 상기 나타난 18개의 유전자를 상기 세포의 IPTG 처리에 의해 유도된 p16 또는 p27 유전자 발현의 효과에 대해 분석하였다. 시험된 유전자는 유도된 p21 발현에 대해 상기 기술된 바와 같이 알츠하이머병, 아밀로이드증, 관절염, 죽상경화증 및 파라크린 세포사멸 및 분열유발 효과에 관여하는 유전자를 포함하였다. p16에 대한 결과는 도 6a에 도시되며, p27에 대한 결과는 도 6b에 도시된다. 시험된 모든 p21 유도된 유전자는 또한 IPTG 유도된 p16 발현에 의해 유도되었으며, 시험된 유전자 거의 모두(t-PA 및 CTGF 제외)는 또한 p27에 의해 유도되었다. 도 6에 도시된 결과는 p16 또는 p27 발현은 p21 발현에 대한 효과가 검출되지 않음을 보여준다.
실시예 8
p21 반응성 프로모터에 의해 발현된 리포터 유전자를 함유하는 재조합 발현 구조의 제조
NK4, SAA, 보체 C3(CC3), 프로사포신, βAPP 및 t-TGase를 포함하는 수개의p21 유도성 인간 유전자의 프로모터로부터 프로모터-리포터 구조를 다음과 같이 제조하였다. CC3 유전자의 프로모터 영역을, CC3 cDNA(Vik et al., 1991, Biochemistry 30:1080-1085)의 5' 말단에 인접한 인간 게놈 서열(NCBI 수탁 번호 M63423.1)에서 확인하였다. NK4 유전자의 상기 프로모터 영역을, NK4 cDNA(수탁 번호 M59807)의 5'말단에 인접한 인간 게놈 서열(수탁 번호 AJ003147)에서 확인하였다. SAA 유전자의 상기 기술된 프로모터(Edbrooke et al., 1989, Mol. Cell. Biol. 9: 1908-1916)을, 인간 게놈 서열(수탁 번호 M26698)에서 확인하였다. βAPP 유전자의 프로모터 영역을 βAPP cDNA(수탁 번호 XM009710)의 5'말단에 인접한 인간 게놈 서열(수탁 번호 X12751)에서 확인하였다. t-TGase 유전자의 프로모터 영역을 t-TGase cDNA(수탁 번호 M55153)의 5' 말단에 인접한 인간 게놈 서열(수탁 번호 Z46905)에서 확인하였다. 프로모터-특이적 DNA의 중합효소 연쇄 반응(PCT) 증폭을 주형으로서 HT1080p21-9 세포로부터 게놈 DNA를 사용하여 수행하였다.PfuTurboDNA 중합효소 (Stratagene) 및 표 IIIa에 기재된 프라미어 셋을 사용하여 PCR을 수행하였다. 각각의 프라이머 셋에 대한 PCR 조건은 표 IIIb에 기술된다. 본 실시예에서 기술된 바와 같이 사용된 유전자 프로모터를 포함하는, CDK 억제제에 의해 유도된 수 개의 유전자로부터 프로모터 서열을 증폭시키기 위한 프라이머 셋은 표 IIIc에 기재된다.
PCR 생성물을 수득하고, TOPO TA 클로닝 벡터, pCR2.1/TOPO(SAA, CC3, βAPP 및 t-TGase에 대해) 또는 pCRII/TOPO로 클로닝시켰다. 이들 구조를 시퀀싱에 의해 확인하고, 올바른 배향으로 프로모터를 함유하는KpnI-XhoI 단편을 표준 재조합유전자 기술(Sambrook et al., ibid)을 사용하여 반딧불이 루시퍼라아제-리포터 벡터 pGL2 염기(Promega, Madison, WI)에서KpnI-XhoI 자리에 삽입시켰다. 반딧불이 루시퍼라아제 발현을 유도하는 프로사포신 프로모터의 480bp 서열을 함유하는 클론은 문헌(Sun et al. 1999, Gene 218, 37-47)에 개시되어 있으며, 그라보스키(Grabowski, Children's Hospital Medical Center, Cincinnati, OH)에 의해 제공받았다.
각각의 프로모터 구조에 대한 플라스미드 클론을 일시적 트랜스펙션 검정에 의해 p21-조절에 대해 시험하였다. HT1080 p21-9 세포의 일시적 트랜스펙션을 실질적으로 Bio-Rad 프로토콜에 기술된 바와 같이 전기충격에 의해 수행하였다. 각각의 전기 충격에 있어서, HT1080 p21-9 세포는 10% FC2 혈청으로 보충된 DMEM을 사용하고, 페니실린, 스트렙토마이신 및 글루타민을 함유하는 15cm 플레이트 중에서 95% 융합율로 성장하였다. 이후, 상기 세포는 트립신처리하고, DMEM 또는 Opti-MEM 배지(GibcoBRL) 중에서 재현탁시키고, 10분 동안 IEC HN-SII 원심분리기에서 1000rpm으로 회전 침강시켰다. 원심분리 후, 배지를 흡입시켜, 세포를 다시 ml 당 18-20 x 106개의 세포의 농도로 Opti-MEM에 재현탁시켰다. 400㎕의 세포 현탁액(약 7 내지 8 x 106개의 세포)을 4cm 갭의 전기충격 큐벳(Bio-Rad)에 옮겼다. 10 내지 20㎍의 프로모터-루시퍼라아제 구조를 세포에 첨가하였다. 일부 실험에서, CMV 프로모터로부터 박테리아 β-갈락토시다아제를 발현시키는 대조 플라스미드 pCMVbgal를 표준화를 위해 1:10의 비로 혼합물에 첨가하였다. 다른 실험에서,표준화를 CMV 프로모터로부터 레닐리아 루시퍼라아제를 발현시키는 벡터 pRL-CMV를 1:20의 몰비로 첨가함으로써 수행하고, 반딧불이 루시퍼라아제 및 레닐리아 루시퍼라아제 활성을 이중 루시퍼라아제 검정 킷(Promega)를 사용하여 동일 샘플에서 측정하였다. 커패시턴스 익스텐더(capacitance extender)를 960μFD로 맞추고, 27 내지 30의 τ값을 제공하면서, 바이오-라드 진 펄서(Bio-Rad Gene Pulser)를 사용하여 0.22 볼트에서 표준화를 수행하였다. 예비 실험에서, 전기충격 후 세포 생존율과 부착율을 측정한 결과 약 33%였다. 12웰 플레이트에서 약 50,000개의 부착 세포/웰의 초기 밀도로 세포를 삼중으로 플레이팅시켰다. 상기 세포를 3 내지 6시간 동안 침강되게 한 후, 배지를 흡인시키고, 50μM IPTG를 함유하거나 함유하지 않는 새로운 배지로 대체하였다. 2 내지 4일 후에, 세포를 인산염 완충 식염수로 2회 세척하고, 300㎕의 1 x 패시브 라이시스 버퍼(Passive Lysis Buffer) 또는 리포터 용해 완충액 (Reporter Lysis Buffer)(Promega) 중에서 수거하였다. 용해물을 간단히 10,000g에서 펠릿 부스러기로 원심분리시키고, 50㎕의 분취액을 반딧불이 루시퍼라아제 검정(Promega)에 사용하기 위해 새로운 튜브에 옮겼다. 루시퍼라아제 활성을 터너(Turner) 20/20 루미노미터(luminometer)를 사용하여 52.1%에서 5초 지연 기간 및 10 내지 15초 통합 시간으로 측정하였다.
도 7은 대표적인 실험의 결과를 보여준다. 트랜스펙션된 세포에서 p21의 유도 2 내지 4일 후, p21 유도된 유전자의 프로모터 구조로부터의 발현이 NK4에 대해 약 7.0배, SAA에 대해 3.7배, CC3에 대해 12.5배, 프로사포신에 대해 3.0배, βAPP에 대해 2.6배, 및 t-TGase에 대해 2.3배 증가하였다. 이러한 결과는 p21이 프로모터를 조절함으로써 상기 유전자의 발현을 상향조절하고, 이러한 유전자의 프로모터 구조가 유전 발현의 p21 매개된 조절을 검정하는데 사용될 수 있음을 시사한다. 이러한 검정은 하기 실시예 9에서 기술되는 바와 같이 p21 매개된 유전자 활성을 억제하는 화합물을 확인하는데 사용될 수 있다.
표 IIIa. 프라이머 서열
표 IIIb. PCR 조건
실시예 9
p21-유도성 리포터 구성물로 안정하게 트랜스펙션된 세포의 생산
p21로 루시페라아제 발현이 조절되는 안정하게 트랜스펙션된 세포주를 개발하기 위하여, 실시예 8에 기재되어 있고 pLuNK4로 명명되는 NK4 프로모터-루시페라아제 구성물을, 선별 마커로서 퓨로마이신 N-아세틸트랜스퍼라아제를 갖는 pBabePuro으로 코트랜스펙션시킴으로써, IPTG-유도성 p21을 갖는 HT1080 p21-9 세포에 도입시켰다. 트랜스펙션은 LIPOFECTAMINE 2000(Life Technologies, Inc., Gaithersburg, Md.)을 사용하고 pLuNK4 및 pBabePuro을 10:1의 비로 사용하여 수행하였다. 안정한 트랜스펙턴트를 5일 동안 퓨로마이신 1㎍/ml를 사용하여 선별하였다. 54개의 내성 세포주를 분리하고 50μM IPTG의 존재 및 부재하에 루시페라아제 활성에 대하여 시험하였다(Luciferase Assay System, Promega 사용).
본 검정은 하기와 같이 수행하였다. 12웰 플레이트에서 페니실린/스트렙토마이신, 글루타민, 및 10% 우태아혈청(FCS)를 함유하는 배지 1ml중에 웰당 40,000개 세포의 밀도로 세포를 플레이팅하였다. 부착후에, 다양한 기간 동안 세포를 50μM IPTG로 처리하거나 미처리 상태로 두었다. 그 후, 루시페라아제 활성을 상기 실시예 8에서 기술된 바와 같이 측정하였다. 추가의 분취액을 세포 용해물로부터 취하여 Bio-Rad 단백질 검정 키트(Bradford assay)를 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. 각 샘플에 대한 루시페라아제 활성을 단백질 함량에 대하여 표준화하고 단백질 ㎍당 루시페라아제 활성으로서 표시하였다. 모든 검정을 3회(triplicate) 수행하였고, 평균 및 표준 편차로 표시하였다.
시험한 세포주 54개중 21개가 측정가능한 루시페라아제 활성을 나타내었으나, HT1080 LuNK4p21로 명명된 단지 하나의 세포주만이 IPTG의 부재하에서 보다 IPTG 존재하에서 더 높은 루시페라아제 발현을 나타내었다. p21LuNK4 세포주를 사용하여 수행된 검정의 결과는 도 8a 및 8b에 도시되어 있다. 도 8a는 IPTG 처리 24시간 경과후에 루시페라아제 발현의 IPTG 용량 의존성을 나타내고, 도 8b는 50μM IPTG의 첨가시 루시페라아제 발현의 시간 경과를 나타낸다. 이 분석은 대부분의 유도가 5μM IPTG 및 17시간의 처리 기간을 사용하여 달성될 수 있음을 나타낸다.
이러한 결과는 pLuNK4 리포터 구성물이 리포터 유전자 전사의 p21 유도에 반응성인 안정하게 트랜스펙션된 세포주를 생산하는데 사용될 수 있음을 입증하였다. 이러한 구성물 및 세포는 p21-매개의 유전자 활성화를 억제하는 화합물을 확인하는 스크리닝 검정에 대한 근거를 제공한다. IPTG 처리된 세포에서 현저한(약 3배) 루시페라아제 수준의 증가와 함께 루시페라아제 유도에 요구되는 시간이 비교적 단시간(약 17시간)이기 때문에, LuNK4p21 세포주는 p21의 유도 효과를 억제할 화합물을 고처리량으로 스크리닝하는데 적합할 것이다. 유사한 (그리고 잠재적으로 더 우수한) 유도성을 갖는 다른 세포주 또한 LuNK4p21을 얻기 위하여 사용된 본원에 개시된 방법에 의해 개발될 수 있다. 실시예 8에 기재된 결과는 안정하게 트랜스펙션된 세포주 이외의 p21 유도성 유전자의 프로모터 구성물을 사용한 일시적인 트랜스펙션을 사용하여 동일한 형태의 스크리닝이 수행될 수도 있음을 입증한다. 루시페라아제 발현에 기초한 고처리량 스크리닝 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다[일시적 트랜스펙션에 기초한 검정의 최근예에 대해서는, 문헌(Storz et al., 1999,Analyt. Biochem. 276: 97-104) 참조, 안정하게 트랜스펙션된 세포주에 기초한 스크리닝예에 대해서는 문헌(Roos et al., 2000, Virology 273: 307-315) 참조]. 이러한 세포 및 검정을 사용하여 확인된 화합물은 연령 관련 유전자의 p21 매개성 유도를 억제하거나 방지할 수 있는 치료제의 개발에 유용하다.
실시예 10
일시적 트랜스펙션 검정에서 p-21 매개성 유도를 억제하기 위한 NFκB 및 p300/CBP 억제제의 용도
p-21 유도성 유전자의 프로모터 서열을 조사한 결과, NK4를 포함하는 이들 프로모터의 대다수가 공지된 또는 잠재적인 NFκB 결합 부위를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 2(SOD2) (Jones et al., 1997, Mol. Cell. Biol. 17: 6970-6981), t-TGase(Mirza et al., 1997, Amer. J. Physiol. 272: G281-G288), 알쯔하이머 β-아밀로이드 전구체 단백질(APP)(Grilli et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 15002-15007) 및 염증성 단백질 혈청 아밀로이드 A (SAA)(Jensen and whitehead, 1998, Biochem J. 334: 489-503)를 포함하여, p21로 유도된 몇몇 유전자들은 NFκB에 의해 확실히 조절되는 것으로 공지되어 있다. p21은 일시적인 코트렌스펙션 실험에 의해 NFκB 의존성 전사를 활성화하는 것으로 종래에 입증된 바 있다(Perkins et al., 1997, Science 275: 523-527). p21의 이러한 효과는 전사 보조인자 p300 및 CBP의 자극에 기인하는 것으로 밝혀졌고(Perkins et al., 1997, Science 275: 523-527), p300/CBP의 활성화 또는 관련 전사 보조인자의 활성화는 조절되지 않은 일부 유전자에 대한 p21의 효과를초래할 수 있다는 것이 가능하다. 따라서, NFκB 또는 p300/CBP의 억제제는 p21에 의한 전사의 유도를 잠재적으로 억제할 수 있다.
HT1080 p21-9 세포에서 IPTG 유도성 p21 발현이 NFκB의 전사 활성을 자극하는지 여부를 결정하기 위하여 본 발명자들은 일시적인 트랜스펙션 검정을 사용하여 스트라타젠(Stratagene)으로부터 구입가능한 플라스미드 pNFkB-Luc로부터 루시페라아제 발현에 미치는 p21 유도의 효과를 조사하였다. 이러한 플라스미드는 5개의 NFκB 콘센서스 서열을 함유하는 인공 프로모터로부터 반딧불 루시페라아제를 발현시킨다. pNFkB-Luc로부터 루시페라아제 발현에 미치는 NFκB의 유전적 억제제의 효과를 평가하기 위하여, 후자인 플라스미드 20㎍을, NFκB를 선택적으로 억제하는 IFκB 키나아제 α의 우성 돌연변이를 발현시키는 플라스미드 MAD3(a.k.a. pRC/β액틴-HA-IKKα)(DiDonato et al., 1996, Mol. Cell. Biol. 16: 1295-1304)(유니버시티 오브 캘리포니아 샌 디에고의 M. 카린(Karin) 박사에 의해 제공)와 혼합하였다(1:2의 몰비로). 이러한 플라스미드는 이하에서 IKK로 지칭된다. pNFkB-Luc로부터 루시페라아제 발현에 미치는 p300/CBP 억제의 효과를 결정하기 위하여, 후자인 플라스미드를 유사하게 또다른 검정에서 C-말단 결실이 있는{ΔCR2 (120-140)} 아데노바이러스 E1A 단백질에 대한 트렁케이션된 유전자를 발현시키는 벡터와 혼합하였다. C-트렁케이션된 E1A(E1AΔCR2로 명명)은 p300/CBP 및 관련 인자(예를 들어, PCAF)를 억제시키는 것으로 알려져 있지만, E1A의 C-말단 도메인의 표적인 Rb를 억제하지는 않는다(Chakravarti et al., 1999, Cell 96: 393-403). 음성 대조로서, pNFkB-Luc을 C-말단 및 N-말단 모두에서 결실이 있는{ΔN(2-36)} E1A의 기능적 불활성형(E1AΔN/ΔCR2로 명명)과 혼합하였다. E1AΔCR2 및 E1AΔN/ΔCR2 구성물은 V. 오그리즈코(Ogryzko) 박사(NICHHD, NIH)에 의해 제공되었다. pNFkB-Luc과 IKK, E1AΔCR2 또는 E1AΔN/ΔCR2과의 혼합물을, 실시예 8에 기재된 바와 같이 일렉트로포레이션에 의해 HT1080 p21-9 세포로 트랜스펙션시켰다(표준화를 위하여 pRL-CMV 플라스미드를 추가로 첨가함). 일렉트로포레이션 후에, 동일한 수의 트랜스펙션된 세포를 3일 동안 50μM IPTG로 처리하거나 미처리하였다(3회). 각 트랜스펙션된 샘플에서 반딧불 루시페라아제 활성을 측정하고, (IPTG 부재하에) 측정된 레닐라(Renilla) 루시페라아제 활성으로 표준화하였다.
본 분석의 결과는 도 9a에 도시되어 있다. 음성 대조(E1AΔN/ΔCR2)와 혼합된 pNFkB-Luc는 IPTG 존재하에 15배에 이르는 유도를 나타내었고, 이는 HT1080 p21-9 세포에서 NFκB 전사 활성의 증가를 나타낸다. pNFkB-Luc를 IKK 억제제와 혼합하면 IPTG 처리 또는 미처리 세포에서 루시페라아제 발현이 거의 완전히 제거되었고, 이는 이러한 억제제의 효능을 나타낸다. E1AΔCR2는 유사하지만 IKK 보다는 약한 효과를 가졌으며, 이는 HT1080 p21-9 세포에서 NFκB 활성을 위해 p300/CBP이 필요함을 시사한다(도 9a).
6개의 p21 유도성 유전자에 대해 프로모터-루시페라아제 구성물을 사용하여 동일한 분석을 수행하였다. SAA에 대한 결과는 도 9b에, 프로사포신에 대헤서는 도 9c에, βAPP에 대해서는 도 9d에, t-TGase에 대해서는 도 9e에, 보체 C3에 대해서는 도 9f에, NK4에 대해서는 도 9g에 도시되어 있다. IKK 및 E1AΔCR2 둘 모두는 IPTG 존재하에 시험된 모든 프로모터의 유도를 억제하였고, 이는 p21에 의한 이러한 프로모터의 조절이 p300/CBP 및 NFκB를 통해 부분적으로 매개됨을 의미한다. 그러나, 정량적으로는 이들 억제제의 효과는 프로모터중에서 변화한다. SAA(도 9b) 및 NK4(도 9g)의 프로모터의 기본 발현 및 IPTG 자극 발현 둘 모두는 NFκB의 경우와 거의 동일한 강도로 IKK 및 E1AΔCR2에 의해 억제되었다. 대조적으로, 이들 억제제는 프로사포신(도 9c), βAPP(도 9d), t-TGase(도 9e), 또는 보체 C3(도 9f)의 프로모터로부터의 기본 발명에 대해서는 거의 또는 전혀 효과를 미치지 못하였으나, IPTG의 존재하에 이들 프로모터의 발현을 저해하였다. 이러한 결과는 p300/CBP 및 NFκB가 p21에 의한 모든 시험 프로모터의 유도에 관여하고 있음을 나타낸다.
실시예 11
p21 매개성 유전자 유도를 억제하기 위한 비스테로이드성 항염증 약물의 용도
임상 용도에서 가장 잘 연구되는 NFκB 억제제는 특정 비스테로이드성 항염증 약물(NSAID), 예를 들어 아스피린, 살리실산 나트륨 및 설린닥이다(Kopp and Ghosh, 1994, Science 265: 956-959; Yin et al., 1998, Nature 396: 77-80; Yamamoto et al., 1999, J. Biol. Chem. 274: 27307-27314). 실시예 9에서 설명된 LuNK4p21 세포주를 사용하여 이 세포주에서 p21에 의한 루시페라아제 발현의 유도가 NFκB 억제 활성을 갖는 NSAID에 의해 억제될 수 있는지 여부를 결정하였다.
루시페라아제 검정을 실시예 9에 기술된 바와 실질적으로 동일하게 수행하였다. 50μM IPTG의 존재 또는 부재하에 16시간 동안 인큐베이션한 후, 20mM 실리실산 나트륨, 1mM 설린닥, 또는 10mM 아스피린의 존재 또는 부재하에 추가로 20시간처리한 후 루시페라아제 활성을 측정하였다. 추가로, NFκB를 억제하지 않는 두 NSAID, 즉 인도메타신 및 이부프로펜(각각 25μM)를 시험하였다(Yamamoto et al., 1999, ibid.). NSAID 농도는 이들의 항염증성에 요구되는 환자 혈청중의 이들 약제의 약리학적 농도를 기초로 하였다(Yin et al., 1998, ibid.).
이들 검정의 결과는 도 10에 도시되어 있다. IPTG는 NSAID 부재하에서 루시페라아제 발현을 약 3 내지 4배 증가시켰으나, 이러한 유도는 살리실산염, 설린닥, 또는 아스피린의 존재하에 완전히 또는 거의 완전히 제거되었다. 대조적으로, 인도메타신 및 이부프로펜은 IPTG에 의한 루시페라아제의 유도에 유의한 차이를 나타내지 않았다.
NFκB 억제성 NSAID가 NK4 프로모터로부터 전사의 유도 뿐만 아니라 내인성 p21 유도성 유전자의 RNA 발현도 억제하였는지 여부를 결정하기 위하여, LuNK4p21 세포를 6-웰 플레이트에 웰당 125,000개 세포로 플레이팅하고, 250μM, 500μM, 또는 1mM농도의 설린닥의 존재 또는 부재하에 48시간(p21 유도성 유전자의 최대 자극에 필요한 기간; Chang et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 4291-4296) 동안 50μM IPTG로 처리하거나 처리하지 않았다. 이 인큐베이션 후에, Qiagen RNeasy Mini Kit를 사용하여 RNA를 세포로부터 추출하고, 여러 p21 유도성 유전자의 상대적인 RNA 수준을, β2-마이크로글로불린이 아니라 β-액틴을 사용하여 cDNA 표준화를 수행한 것을 제외하고는 문헌[Noonan et al. 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 7160-7164]에 기재된 방법과 실질적으로 동일하게 역전사-PCR(RT-PCR)에 의해 측정하였다. 시험한 유전자 각각에 대한 PCR 프라이머의 서열은 표 IVa에 제시되어 있다. PCR 사이클은 다음과 같았다: 제 1 사이클에 대해서는, 변성 3분, 어닐링 30초, 및 연장 2분, 나머지 사이클에 대해서는, 변성 30초, 어닐링 30초, 및 연장 1분. PCR 사이클의 온도 조건 및 PCR 생성물의 크기는 표 IVb에 제시되어 있다.
RT-PCR 분석의 결과는 도 11에 도시되어 있다. NK4(NK4의 프라이머를 LuNK4p21 세포에서 루시페라아제 발현을 유도하기 위해 사용하였음)의 경우, 설린닥의 첨가는 IPTG의 부재하의 유전자 발현에 거의 영향을 미치지 않았으나, 모든 농도의 설린닥은 IPTG의 존재하에 NK4 RNA 수준의 용량 의존적 감소를 일으켰다. 매우 유사한 결과가 t-TGase RNA에 있어서 얻어졌다. 모든 다른 시험 유전자에 있어서, 설린닥은 IPTG의 부재하에 유전자 발현의 용량 의존적 증가를 초래하였다. 이러한 효과의 결과로서, 설린닥의 최고 시험 용량(1mM)은 IPTG의 존재하에 유전자 발현을 감소시키지 않았으나, 설린닥의 보다 저용량에서 IPTG 효과의 현저한 감소가 관찰되었다. 특히, IPTG의 효과는 APP 유전자의 경우 250 및 500μM 설린닥에 의해 감소되었으나, p66shc, CTGF, 및 Mac2-결합 단백질(Mac2-BP) 유전자의 경우 250μM 설린닥에 의해서만 감소되었다. 시험된 설린닥 농도중 어떠한 것도 프로사포신 또는 수퍼옥사이드 디스뮤타아제2(SOD2)의 IPTG 유도된 RNA 수준의 유의한 감소를 일으키지 않았다. 설린닥이 프로사포신에 대해 효과가 없다는 것은 프로사포신 프로모터에 대한 IKK 억제제의 중간정도의 효과와 일치한다(실시예 10 참조).따라서, 중간 용량의 설린닥(250μM)은 시험 유전자의 대부분에 대한 p21의 전사 유도능을 억제한다.
표 Ⅳb. PCR 온도(℃)
이러한 결과는, p21-유도성 유전자의 프로모터로부터의 리포터 발현의 p21-매개 유도에 의한 간섭에 대한 검정이 발암 및 노화 관련 질병과 관련된 유전자의p21-매개 유도를 억제하는 시약을 검정할 수 있다는 것을 입증한다. 특히, LuNK4p21 세포주를 이용한 프로모터-기초 검정에 유효한 억제제로서 최초로 확인된 시약(Sulindac)이 p21에 의해 여러 노화관련 유전자의 유도를 억제하는 것으로 밝혀졌다. 추가로, 이러한 결과는, NFkB 억제제로서 활성인 NSAIDs가 CDK 억제제에 의해 노화관련 유전자의 유도를 방지할 수 있다는 것을 입증한다.
CDK 억제제에 의한 전사의 유도를 억제하는 작용제는 알츠하이머병, 아밀로이드증, 죽상경화증 및 관절염과 같은 노화관련 질병의 화학예방 또는 지연에 임상적으로 유용할 수 있다. 또한, 그러한 화합물들은, 분비된 성장 인자(예를 들어, CTGF)의 발현에 대한 그들의 효과를 통해, 암 치료 또는 예방에 유용하다. 사실, NFkB-억제 작용에 의한 NSAIDs에 대한 가용한 임상 데이타는 이러한 분야의 용도를 지지한다. 따라서, 설린닥, 아스피린 및 살리실레이트를 포함하는 여러 NSAID가 결장직장 암종 및 다양한 다른 유형의 암을 화학예방하는데 유용하고, 결장 폴립의 소멸을 촉진한다(Lee et al., 1997, "Use of aspirin and other nonsteroidal anti-inflammatory drugs and the risk of cancer development." in DeVita et al., eds., CANCER. PRINCIPLES & PRACTICE OF ONCOLOGY, Lippincott-Raven: Philadelphia, pp. 599-607). 아스피린 및 기타 NSAIDs의 용도는 알츠하이머병의 위험을 감소시키는 것으로 보인다(Stewart et al., 1997, Neurology 48: 626-632). 장기간의 아스프린 치료가 죽상경화증의 발병을 감소시키는 것으로 추가로 보고되었다(Sloop, 1998, Angiology 49: 827-832). 마지막으로, 설린닥은 관절염의 치료에 입증된 임상 효과를 갖는 가장 통상적으로 사용되는 약물 중 하나이다(Brogdenet al., 1978, Drugs 16: 97-114). NSAIDs의 이러한 유용한 효과 중 일부가 시클로옥시제나제 2 억제제로서의 활성에 기인하는(Pennisi, 1998, Science 280: 1191-1192) 반면, 본원에 개시된 결과는 이러한 임상적 활성이, 아마도 이들 화합물들의 NFkB-억제 활성을 통한, p21-유도 유전자 발현의 억제에 기인할 수도 있다는 것을 제안한다. 본 발명에 의해 제공된 이러한 검정 및 스크리닝 시스템은 당업자가 다양한 NSAID 유도체를 이러한 활성에서의 개선에 대하여 시험할 수 있도록 한다. 게다가, 이들 결과는 일반 카테고리의 NFkB 및 p300/CBP 억제제를 암 및 노화관련 질병의 화학예방 또는 치료를 위한 시약으로서 사용하기 위한 기초를 제공한다.
실시예 12
p21-유도성 유전자의 프로모터의 p16 및 p27에 의한 자극
실시예 7에서 설명되듯이, p21-유도성 유전자의 발현도 다른 CDK 억제제, p16Ink4A및 p27Kip1에 의해 상향조절된다. p21-유도성 유전자의 프로모터가 후자의 CDK 억제제에 의해 자극되는지 결정하기 위해, 실시예 8에 설명된 여러 프로모터-루시페라제 구조 및 pNFkB-Luc를, 실시예 6에 설명된 p16(HT1080 p16-5) 또는 p27(HT1080 p27-2)의 IPTG-유도성 발현을 갖는 HT1080 유도체내로 트랜스펙션시켰다. 그 후, 이들 프로모터의 발현에 대한 IPTG의 효과는 실시예 8에서 p21-유도성 계통에 대하여 설명된 바와 같이 분석되었다.
pNFkB-Luc로부터의 NFkB-의존성 발현은 p16(도 12a) 또는 p27(도 13a) 중 어느 하나의 유도로 강하게 자극되었다. p27의 경우에, NFkB에 대한 관찰된 유도효과의 특이성은 IKK 억제제와의 코트랜스펙션에 의해 설명될 수도 있으며, 이것은 기본 및 IPGR-유도성 발현을 강하게 억제한다(도 13a). 이러한 결과는 p21과 같은 이들 CDK 억제제가 NFkB 활성을 자극하는 것을 입증한다. 게다가, p21-유도성 유전자의 모든 시험된 프로모터도 p16 및 p21에 의해 상향조절된다. 특히, IPTG-유도성 p16 발현은 보체 C3(도 12b), SAA(도 12c), t-TGase(도 12d) 및 NK4(도 12e) 의 프로모터로부터 리포터 발현을 유도한다. IPTG-유도성 p27 발현은 보체 C3(도 13B), βAPP(도 13C), t-TGase(도 13D) 및 NK4(도 13E)의 프로모터를 강하게 유도한다. 이러한 발견은, p21-유도성 프로모터가 p21 뿐만 아니라 p16 및 p27과 같은 다른 CDK 억제제에 의해서도 활성된다는 것을 나타낸다.
전술한 내용이 본 발명의 특정 구체예를 강조하고, 모든 변형 또는 대안적 균등물이 첨부된 청구항에 개시된 본 발명의 사상 및 범주에 속하는 것임이 이해되어야 한다.
표 Ⅰ
표 Ⅰ
표 Ⅱ
표 Ⅱ

Claims (100)

  1. 사이클린 의존성 키나아제 억제제에 의해 유도되는 포유류 유전자로부터의 프로모터에 작동적으로 결합된 리포터 유전자를 엔코딩하는 재조합 발현 구성물.
  2. 제 1항에 있어서, 리포터 유전자가 반딧불이 루시퍼라아제, 레닐라 (Renilla) 루시퍼라아제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제, 베타-갈락토시다아제, 녹색 형광 단백질 또는 알칼리 포스파타아제를 엔코딩함을 특징으로 하는 재조합 발현 구성물.
  3. 제 1항에 있어서, 프로모터가 CDK 억제제에 의해 유도되는 인간 유전자로부터의 프로모터임을 특징으로 하는 재조합 발현 구성물.
  4. 제 3항에 있어서, 프로모터가 표 II에서 확인되는 인간 유전자로부터의 프로모터임을 특징으로 하는 재조합 발현 구성물.
  5. 제 4항에 있어서, 프로모터가 혈청 아밀로이드 A (SEQ ID NO:1), 보체 C3 (SEQ ID NO:2), 결합 조직 성장 인자 (SEQ ID NO:3), 인테그린 β-3 (SEQ ID NO:4), 액티빈 A (SEQ ID NO:5), 자연 살상 세포 단백질 4 (SEQ ID NO:6), 프로사포신 (SEQ ID NO:7), Mac2 결합 단백질 (SEQ ID NO:8), 갈렉틴-3 (SEQ ID NO:9),수퍼옥사이드 디스뮤타아제 2 (SEQ ID NO:10), 그래뉼린/에피텔린 (SEQ ID NO:11), p66shc(SEQ ID NO:12), 카텝신 B (SEQ ID NO:14), β-아밀로이드 전구체 단백질 (SEQ ID NO:15), 조직 트랜스글루타미나아제 (t-TGase; SEQ ID NO:16), 클러스테린 (SEQ ID NO:17), 프로스타사이클린 자극 인자 (SEQ ID NO:18), 혈관 내피 성장 인자-C (SEQ ID NO:19) 및 메탈로프로테이나아제-1의 조직 억제제 (SEQ ID NO:20)로부터의 프로모터임을 특징으로 하는 재조합 발현 구성물.
  6. 제 4항에 있어서, 프로모터가 인간 자연 살상 세포 단백질 4 (SEQ ID NO:6), 혈청 아밀로이드 A (SEQ ID NO:1), 보체 C3 (SEQ ID NO:2), 조직 트랜스글루타미나아제 (SEQ ID NO:16), β-아밀로이드 전구체 단백질 (SEQ ID NO:15) 또는 프로사포신 (SEQ ID NO:7)으로부터의 프로모터임을 특징으로 하는 재조합 발현 구성물.
  7. 제 4항에 있어서, 재조합 발현 구성물이 pLuNK4임을 특징으로 하는 재조합 발현 구성물
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 재조합 발현 구성물을 포함하는 포유류 세포.
  9. 제 8항에 있어서, A.T.C.C. 수탁 번호 PTA 3381 (HT1080 LuNK4p21)로 확인됨을 특징으로 하는 포유류 세포.
  10. 제 8항에 있어서, 재조합 발현 구성물의 발현이 NFκB에 의해 조절됨을 특징으로 하는 포유류 세포.
  11. 제 8항에 있어서, 포유류 CDK 억제제 유전자를 엔코딩하는 제 2의 재조합 발현 구성물을 추가로 포함함을 특징으로 하는 포유류 세포.
  12. 제 11항에 있어서, CDK 억제제의 발현이 포유류 세포에서 실험적으로 유도됨을 특징으로 하는 포유류 세포.
  13. 제 11항에 있어서, 포유류 CDK 억제제 유전자를 엔코딩하는 재조합 발현 구성물이 유도성 프로모터의 전사 조절을 받으며, 재조합 발현 구성물로부터의 CDK 억제제의 발현이, 재조합 세포를 유도성 프로모터로부터의 전사를 유도하는 유도제와 접촉시키거나 이러한 프로모터로부터의 전사를 억제하는 작용제를 제거함으로써 매개됨을 특징으로 하는 포유류 세포.
  14. 제 13항에 있어서, 포유류 CDK 억제제 유전자가 인간 p21 유전자 또는 이의 CDK 결합 단편임을 특징으로 하는 포유류 세포.
  15. 제 13항에 있어서, 포유류 CDK 억제제 유전자가 인간 p16 유전자 또는 이의 CDK-결합 단편임을 특징으로 하는 포유류 세포.
  16. 제 13항에 있어서, 포유류 CDK 억제제 유전자가 마우스 또는 인간 p27 유전자 또는 이의 CDK-결합 단편임을 특징으로 하는 포유류 세포.
  17. 제 13항에 있어서, 포유류 프로모터에 의해 전사가 조절되는 세균 락토오스 리프레서를 엔코딩하는 재조합 발현 구성물을 추가로 포함하고, 포유류 CDK 억제제 유전자를 엔코딩하는 재조합 발현 구성물이 락토오스 리프레서-반응성 프로모터 엘리먼트를 포함하여, CDK 억제제 유전자의 전사가 상기 락토오스 리프레서-반응성 프로모터 엘리먼트에 의해 조절되며, 재조합 발현 구성물로부터의 CDK 억제제 유전자의 발현이 재조합 세포를 락토오스 리프레서-특이적 유도제와 접촉시킴으로써 매개됨을 특징으로 하는 포유류 세포.
  18. 제 8항에 있어서, 세포가 인간 HT1080 섬유육종 세포임을 특징으로 하는 포유류 세포.
  19. 제 11항에 있어서, 세포가 인간 HT1080 섬유육종 세포임을 특징으로 하는 포유류 세포.
  20. 제 17항에 있어서, 세포가 인간 HT1080 섬유육종 세포임을 특징으로 하는 포유류 세포.
  21. 제 11항에 있어서, 제 2의 발현 구성물이 LNp21CO3임을 특징으로 하는 포유류 세포.
  22. 제 21항에 있어서, A.T.C.C. 수탁 번호 PTA 1664 (HT1080 p21-9)로 확인됨을 특징으로 하는 포유류 세포.
  23. 제 11항에 있어서, 제 2의 발현 구성물이 LNp16RO2임을 특징으로 하는 포유류 세포.
  24. 제 23항에 있어서, A.T.C.C. 수탁 번호 PTA 4020 (HT1080 p16-5)로 확인됨을 특징으로 하는 포유류 세포.
  25. 제 11항에 있어서, 제 2의 발현 구성물이 LNp27RO2임을 특징으로 하는 포유류 세포.
  26. 제 25항에 있어서, A.T.C.C. 수탁 번호 PTA 4021 (HT1080 p27-2)로 확인됨을 특징으로 하는 포유류 세포.
  27. 제 17항에 있어서, 락토오스 리프레서-특이적 유도제가 β-갈락토시다아제임을 특징으로 하는 포유류 세포.
  28. (a) 화합물의 존재 및 부재하에서 포유류 세포에서 CDK 억제제에 의해 유도되는 유전자의 발현을 유도하는 조건하에서 제 8항에 따른 재조합 포유류 세포를 배양하는 단계;
    (b) 화합물의 존재하에서 세포에서의 리포터 유전자 발현을 화합물의 부재하에서 세포에서의 리포터 유전자 발현과 비교하는 단계; 및
    (c) 리포터 유전자 발현이 화합물이 부재할 때 보다 화합물이 존재할 때에 더 낮은 경우, CDK 억제제에 의해 유도되는 유전자의 유도를 억제하는 화합물임을 확인하는 단계를 포함하여, 포유류 세포에서 CDK 억제제에 의해 유도되는 유전자의 유도를 억제하는 화합물을 확인하는 방법.
  29. 제 28항에 있어서, 세포가 세포에서 CDK 억제제의 발현을 유도하는 조건하에서 배양됨을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 29항에 있어서, CDK 억제제가 p21, p27 또는 p16, 또는 이들의 CDK-결합 단편임을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 28항에 있어서, 세포가 포유류 CDK 억제제 유전자를 엔코딩하는 제 2의 재조합 발현 구성물을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 31항에 있어서, 제 2의 재조합 발현 구성물이 유도성 프로모터의 전사 조절을 받는 포유류 CDK 억제제 유전자를 포함하며, 재조합 발현 구성물로부터의 CDK 억제제의 발현이, 재조합 세포를 유도성 프로모터로부터의 전사를 유도하는 유도제와 접촉시키거나 이러한 프로모터로부터의 전사를 억제하는 작용제를 제거함으로써 매개됨을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 32항에 있어서, 포유류 CDK 억제제 유전자가 인간 p21 유전자 또는 이의 CDK 결합 단편임을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 32항에 있어서, 포유류 CDK 억제제 유전자가 인간 p16 유전자 또는 이의 CDK 결합 단편임을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 32항에 있어서, 포유류 CDK 억제제 유전자가 인간 p27 유전자 또는 이의 CDK-결합 단편임을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 32항에 있어서, 세포가 인간 HT1080 섬유육종 세포임을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 32항에 있어서, 포유류 세포가 포유류 프로모터에 의해 전사가 조절되는 세균 락토오스 리프레서를 엔코딩하는 재조합 발현 구성물을 추가로 포함하고, 포유류 CDK 억제제 유전자를 엔코딩하는 재조합 발현 구성물이 락토오스 리프레서-반응성 프로모터 엘리먼트를 포함하여, CDK 억제제 유전자의 전사가 상기 락토오스 리프레서-반응성 프로모터 엘리먼트에 의해 조절되며, 재조합 발현 구성물로부터의 CDK 억제제 유전자의 발현이 재조합 세포를 락토오스 리프레서-특이적 유도제와 접촉시킴으로써 매개됨을 특징으로 하는 방법.
  38. (a) 포유류 세포에서 CDK 억제제를 발현시키는 단계;
    (b) 세포를 화합물의 존재하에서 CDK 억제제에 의해 발현이 조절되는 세포 유전자의 발현의 변화에 대해 검정하는 단계; 및
    (c) 단계 (b)의 세포 유전자의 발현이 화합물의 존재하에서 보다 적은 정도로 변하는 경우, 화합물을 세포 유전자 발현의 CDK 억제제-매개 조절의 억제제로서 확인하는 단계를 포함하여, 세포 유전자 발현의 CDK 억제제-매개 유도를 억제하는 화합물을 확인하는 방법.
  39. 제 38항에 있어서, CDK 억제제가 p16, p27 또는 p21임을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 39항에 있어서, 포유류 세포가 유도성 이종 프로모터의 전사 조절을 받는 포유류 CDK 억제제를 엔코딩하는 재조합 발현 구성물을 포함하며, 재조합 발현 구성물로부터의 CDK 억제제의 발현이, 재조합 세포를 유도성 프로모터로부터의 전사를 유도하는 유도제와 접촉시키거나 이러한 프로모터로부터의 전사를 억제하는 작용제를 제거함으로써 매개됨을 특징으로 하는 방법.
  41. 제 40항에 있어서, CDK 억제제가 p16임을 특징으로 하는 방법.
  42. 제 40항에 있어서, CDK 억제제가 p21임을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 40항에 있어서, CDK 억제제가 p27임을 특징으로 하는 방법.
  44. 제 38항에 있어서, 세포 유전자의 발현이 p21에 의해 유도됨을 특징으로 하는 방법.
  45. 제 38항에 있어서, 세포 유전자의 발현이 p16에 의해 유도됨을 특징으로 하는 방법.
  46. 제 38항에 있어서, 세포 유전자의 발현이 p27에 의해 유도됨을 특징으로 하는 방법.
  47. 제 38항에 있어서, 세포 유전자가 표 II에서 확인됨을 특징으로 하는 방법.
  48. 제 40항에 있어서, 세포 유전자가 표 II에서 확인됨을 특징으로 하는 방법.
  49. 제 38항에 있어서, 세포 유전자의 발현이 면역학적 시약을 사용하여 검출됨을 특징으로 하는 방법.
  50. 제 38항에 있어서, 세포 유전자의 발현이 세포 유전자 생성물의 활성을 검정함으로써 검출됨을 특징으로 하는 방법.
  51. 제 38항에 있어서, 세포 유전자의 발현이 상보적 핵산에 하이브리드화됨으로써 검출됨을 특징으로 하는 방법.
  52. (a) 화합물의 존재 또는 부재하에서 포유류 세포를 작용제로 처리하거나 노화를 유도하는 조건하에서 포유류 세포를 배양하는 단계;
    (b) 포유류 세포를 CDK 억제제 유전자 발현에 의해 유도되는 유전자의 유도에 대해 검정하는 단계; 및
    (c) CDK 억제제에 의해 유도되는 유전자가 화합물이 부재할 때 보다 화합물이 존재할 때 더 적은 정도로 유도되는 경우, 화합물을 세포 유전자 발현의 CDK 억제제-매개 유도의 억제제로서 확인하는 단계를 포함하여, 포유류 세포에서 세포 유전자 발현의 CDK 억제제-매개 유도를 억제하는 화합물을 확인하는 방법.
  53. 제 52항에 있어서, CDK 억제제가 p21, p16 또는 p27임을 특징으로 하는 방법.
  54. 제 52항에 있어서, 유전자가 표 II에서 확인됨을 특징으로 하는 방법.
  55. 제 52항에 있어서, 세포 유전자의 발현이 면역학적 시약을 사용하여 검출됨을 특징으로 하는 방법.
  56. 제 52항에 있어서, 세포 유전자의 발현이 세포 유전자 생성물의 활성을 검정함으로써 검출됨을 특징으로 하는 방법.
  57. 제 52항에 있어서, 세포 유전자의 발현이 상보적 핵산에 하이브리드화됨으로써 검출됨을 특징으로 하는 방법.
  58. (a) 화합물의 존재 또는 부재하에서 포유류 세포를 작용제와 접촉시키거나, 노화를 유도하는 조건하에서 포유류 세포를 배양하는 단계로서, 세포가 CDK 억제제에 의해 발현이 조절되는 포유류 유전자에 대한 프로모터의 전사 조절을 받는 리포터 유전자를 포함하는 단계;
    (b) 세포를 리포터 유전자의 발현의 변화에 대해 검정하는 단계; 및
    (c) 리포터 유전자의 발현이 화합물이 부재할 때 보다 화합물이 존재할 때 보다 적은 정도로 변하는 경우, 화합물을 세포 유전자 발현의 CDK 억제제-매개 유도의 억제제로서 확인하는 단계를 포함하여, 포유류 세포에서 세포 유전자 발현의 CDK 억제제-매개 유도를 억제하는 화합물을 확인하는 방법.
  59. 제 58항에 있어서, CDK 억제제가 p21, p16 또는 p27임을 특징으로 하는 방법.
  60. 제 58항에 있어서, 포유류 유전자 프로모터가 표 II에서 확인되는 포유류 유전자의 프로모터임을 특징으로 하는 방법.
  61. 제 58항에 있어서, 세포 유전자의 발현이 면역학적 시약을 사용하여 검출됨을 특징으로 하는 방법.
  62. 제 58항에 있어서, 세포 유전자의 발현이 세포 유전자 생성물의 활성을 검정함으로써 검출됨을 특징으로 하는 방법.
  63. 제 58항에 있어서, 세포 유전자의 발현이 상보적 핵산에 하이브리드화됨으로써 검출됨을 특징으로 하는 방법.
  64. 세포를 제 28항의 방법에 따라 생성된 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하여, 세포 유전자 발현의 CDK 억제제-매개 유도를 억제하는 방법.
  65. 세포를 제 38항의 방법에 따라 생성된 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하여, 세포 유전자 발현의 CDK 억제제-매개 유도를 억제하는 방법.
  66. 세포를 제 52항의 방법에 따라 생성된 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하여, 세포 유전자 발현의 CDK 억제제-매개 유도를 억제하는 방법.
  67. 세포를 제 58항의 방법에 따라 생성된 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하여, 세포 유전자 발현의 CDK 억제제-매개 유도를 억제하는 방법.
  68. 세포를 유효량의 NFκB 활성을 억제하는 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하여, 세포 유전자 발현의 CDK 억제제-매개 유도를 억제하는 방법.
  69. 동물에게 유효량의 NFκB 활성을 억제하는 비스테로이드성 항염증 약물 (NSAID)를 투여하는 단계를 포함하여, CDK 억제제 유도된 유전자 발현에 수반되는 동물의 질병을 치료하는 방법.
  70. 제 69항에 있어서, 질병이 결장암 이외의 암임을 특징으로 하는 방법.
  71. 제 69항에 있어서, 질병이 신부전임을 특징으로 하는 방법.
  72. 제 69항에 있어서, 질병이 알츠하이머병이고, NSAID가 아스피린 또는 살리실레이트 이외의 약물임을 특징으로 하는 방법.
  73. 제 69항에 있어서, 질병이 죽상경화증이고, NSAID가 아스피린 이외의 약물임을 특징으로 하는 방법.
  74. 제 69항에 있어서, 질병이 관절염이고, NSAID가 아스피린, 설린닥 또는 살리실레이트 이외의 약물임을 특징으로 하는 방법.
  75. (a) 화합물의 존재하에서 포유류 세포를 작용제로 처리하거나 노화를 유도하는 조건하에서 포유류 세포를 배양하는 단계;
    (b) 포유류 세포를 CDK 억제제 유전자 발현에 의해 유도되는 유전자의 유도에 대해 검정하는 단계; 및
    (c) CDK 억제제에 의해 유도되는 유전자가 화합물의 존재하에서 보다 적은 정도로 유도되는 경우, 화합물을 노화의 억제제로서 확인하는 단계로 구성된 방법에 의해 생성되는, 포유류 세포에서 노화의 병리학적 결과과 관련된 유전자를 억제하는 화합물
  76. 제 69항에 있어서, CDK 억제제가 p21, p16 또는 p27임을 특징으로 하는 화합물.
  77. (a) 화합물의 존재하에서 포유류 세포를 작용제로 처리하거나 CDK 억제제의 발현을 유도하는 조건하에서 포유류 세포를 배양하는 단계;
    (b) 포유류 세포를 CDK 억제제 유전자 발현에 의해 유도되는 유전자의 유도에 대해 검정하는 단계; 및
    (c) CDK 억제제에 의해 유도되는 유전자가 화합물의 존재하에서 보다 적은 정도로 유도되는 경우, 화합물을 CDK 억제제 유도의 억제제로서 확인하는 단계로 구성된 방법에 의해 생성되는, 포유류 세포에서 CDK 억제제에 의해 유도되는 유전자 생성물의 생성을 억제하는 화합물.
  78. 제 77항에 있어서, CDK 억제제가 p21, p27 또는 p16임을 특징으로 하는 화합물.
  79. 세포를 CDK 억제제에 의한 유전자 발현의 유도를 억제하는 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하여, 포유류 세포에서 항아폽토시스 인자 또는 분열유발 인자의생성을 억제하는 방법.
  80. 제 79항에 있어서, 포유류 세포가 간질 섬유아세포임을 특징으로 하는 방법.
  81. 제 79항에 있어서, 화합물이 NFκB 억제제 또는 p300/CPB 억제제임을 특징으로 하는 방법.
  82. 동물을 처리하여 CDK 억제제 유도된 유전자 발현에 수반되는 질병의 영향을 예방하거나 경감시키는 방법으로서, 이러한 처리가 필요한 동물에게 치료적 유효량의 제 28항, 제 38항, 제 52항 또는 제 58항의 방법에 따라 확인되는 화합물의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  83. 포유류 세포를 CDK 억제제에 의해 유도되는 유전자의 발현을 억제하거나 예방하기에 유효한 양의 제 28항, 제 38항, 제 52항 또는 제 58항의 방법에 따라 확인되는 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하여, 포유류 세포에서 CDK 억제제에 의해 유도되는 유전자의 발현을 억제하거나 예방하는 방법.
  84. 동물에서 CDK 억제제에 의해 유도되는 유전자의 유도를 선택적으로 억제하는 방법으로서, NFκB 억제제를 이러한 처리가 필요한 동물에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  85. 제 84항에 있어서, NFκB 억제제가 비스테로이드성 항염증 화합물임을 특징으로 하는 방법.
  86. 제 85항에 있어서, 동물이 인간임을 특징으로 하는 방법.
  87. 동물에게 제 28항의 방법에 의해 생성된 화합물을 투여하는 것을 포함하여, 동물에서 CDK 억제제에 의해 유도되는 유전자의 유도를 선택적으로 억제하는 방법.
  88. 제 87항에 있어서, 동물이 인간임을 특징으로 하는 방법.
  89. 동물에게 제 38항의 방법에 의해 생성된 화합물을 투여하는 것을 포함하여, 동물에서 CDK 억제제에 의해 유도되는 유전자의 유도를 선택적으로 억제하는 방법.
  90. 제 89항에 있어서, 동물이 인간임을 특징으로 하는 방법.
  91. 동물에게 제 52항의 방법에 의해 생성된 화합물을 투여하는 것을 포함하여, 동물에서 CDK 억제제에 의해 유도되는 유전자의 유도를 선택적으로 억제하는 방법.
  92. 제 91항에 있어서, 동물이 인간임을 특징으로 하는 방법.
  93. 동물에게 제 58항의 방법에 의해 생성된 화합물을 투여하는 것을 포함하여, 동물에서 CDK 억제제에 의해 유도되는 유전자의 유도를 선택적으로 억제하는 방법.
  94. 제 93항에 있어서, 동물이 인간임을 특징으로 하는 방법.
  95. 동물에게 제 75항의 방법에 의해 생성된 화합물을 투여하는 것을 포함하여, 동물에서 CDK 억제제에 의해 유도되는 유전자의 유도를 선택적으로 억제하는 방법.
  96. 제 95항에 있어서, 동물이 인간임을 특징으로 하는 방법.
  97. 동물에게 제 28항, 제 38항, 제 52항 또는 제 58항의 방법에 의해 생성된 화합물을 투여하는 것을 포함하여, 동물에서 CDK 억제제에 의해 유도되는 유전자의 유도를 선택적으로 억제하는 방법.
  98. 제 97항에 있어서, 동물이 인간임을 특징으로 하는 방법.
  99. 동물에게 제 77항에 따른 화합물을 투여하는 것을 포함하여, 동물에서 CDK 억제제에 의해 유도되는 유전자의 유도를 선택적으로 억제하는 방법.
  100. 제 99항에 있어서, 동물이 인간임을 특징으로 하는 방법.
KR10-2003-7010224A 2001-02-01 2002-02-01 Ｃｄｋ 억제제에 의해 조절되는 유전자의 발현을 확인하고조절하기 위한 시약 및 방법 KR20030084919A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US26584001P 2001-02-01 2001-02-01
US60/265,840 2001-02-01
US09/861,925 2001-05-21
US09/861,925 US20030064426A1 (en) 2001-02-01 2001-05-21 Reagents and methods for identifying and modulating expression of genes regulated by CDK inhibitors
PCT/US2002/002784 WO2002066681A2 (en) 2001-02-01 2002-02-01 Reagents and methods for identifying and modulating expression of genes regulated by cdk inhibitors

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20030084919A true KR20030084919A (ko) 2003-11-01

Family

ID=26951458

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR10-2003-7010224A KR20030084919A (ko) 2001-02-01 2002-02-01 Ｃｄｋ 억제제에 의해 조절되는 유전자의 발현을 확인하고조절하기 위한 시약 및 방법

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20030064426A1 (ko)
EP (1) EP1387895A2 (ko)
JP (2) JP2004535775A (ko)
KR (1) KR20030084919A (ko)
CA (1) CA2437529A1 (ko)
WO (1) WO2002066681A2 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100931188B1 (ko) * 2007-09-27 2009-12-10 고려대학교 산학협력단 ＮＭＴＲ 효율의 정량적 측정법 및 ｅＩＦ４ＡⅢ에 의한ＮＭＴＲ 조절 방법
KR100957706B1 (ko) * 2009-09-11 2010-05-12 고려대학교 산학협력단 ＮＭＴＲ 저해제 및 ｅＩＦ４ＡⅢ에 의한 ＮＭＴＲ 조절 방법

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003020930A1 (en) * 2001-08-29 2003-03-13 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois IDENTIFICATION AND USE OF MAMMALIAN p21 INHIBITORS
WO2004026109A2 (en) * 2002-09-20 2004-04-01 Wayne State University Molecular targets of cancer and aging
JP4317188B2 (ja) * 2003-02-26 2009-08-19 シスメックス株式会社 細胞の検査方法
US20050158321A1 (en) * 2003-12-17 2005-07-21 Entelos, Inc. Treatment of rheumatoid arthritis with galectin-3 antagonists
EP1591104A1 (de) * 2004-03-17 2005-11-02 Stada Arzneimittel Ag Verwendung von Antioxidantien zur Herstellung einer pharmazeutischen oder kosmetischen Zusammensetzung zum Schutz der Haut gegen Schädigung durch Infrarot-Strahlung
US8592147B2 (en) * 2005-01-13 2013-11-26 Senex Biotechnology High-content screening for drugs against cancer and age-related diseases
IN2014MN02330A (ko) 2007-06-21 2015-08-14 Wistar Inst

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19613691A1 (de) * 1996-04-05 1997-10-09 Boehringer Ingelheim Int Arzneimittel für die Behandlung von Tumorerkrankungen
US6706491B1 (en) * 1999-04-09 2004-03-16 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Reagents and methods for identifying and modulating expression of genes regulated by p21
WO2003020930A1 (en) * 2001-08-29 2003-03-13 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois IDENTIFICATION AND USE OF MAMMALIAN p21 INHIBITORS

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100931188B1 (ko) * 2007-09-27 2009-12-10 고려대학교 산학협력단 ＮＭＴＲ 효율의 정량적 측정법 및 ｅＩＦ４ＡⅢ에 의한ＮＭＴＲ 조절 방법
KR100957706B1 (ko) * 2009-09-11 2010-05-12 고려대학교 산학협력단 ＮＭＴＲ 저해제 및 ｅＩＦ４ＡⅢ에 의한 ＮＭＴＲ 조절 방법

Also Published As

Publication number Publication date
CA2437529A1 (en) 2002-08-29
JP2004535775A (ja) 2004-12-02
JP2009077705A (ja) 2009-04-16
WO2002066681A2 (en) 2002-08-29
WO2002066681A9 (en) 2002-10-31
US20030064426A1 (en) 2003-04-03
WO2002066681A3 (en) 2003-11-13
EP1387895A2 (en) 2004-02-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1734120A2 (en) Reagents and methods for identifying and modulating expression of genes regulated by CDK inhibitors
Attardi et al. PERP, an apoptosis-associated target of p53, is a novel member of the PMP-22/gas3 family
JP2009077705A (ja) Ｃｄｋ阻害剤によって調節される遺伝子発現を同定及び調節するための試薬及び方法
JP2008505307A (ja) ＨＡＵＳＰ−Ｍｄｍ２相互作用及びその使用
WO2002061134A9 (en) Reagents and methods for identifying and modulating expression of tumor senescence genes
JP2009077714A (ja) 腫瘍老化遺伝子の発現を同定および調節するための試薬および方法
AU2002248262A1 (en) Reagents and methods for identifying and modulating expression of tumor senescence genes
JP2005518222A (ja) Ｃｄｋインヒビターによって調節される遺伝子の発現を同定および調整するための薬剤および方法
JP2004535775A5 (ko)
AU2004202327B2 (en) Reagents and Methods for Identifying and Modulating Expression of Genes Regulated by p21
AU2008200727A1 (en) Reagents and methods for identifying and modulating expression of genes regulated by CDK inhibitors
AU2002251842A1 (en) Reagents and methods for identifying and modulating expression of genes regulated by CDK inhibitors
AU2006200921A1 (en) Reagents and methods for identifying and modulating expression of genes regulated by CDK inhibitors
JP2006340722A (ja) ｐ２１により調節される遺伝子の発現を同定および調節するための試薬および方法
Watanabe Effects of p21 WAF1/CIP1/SDI1 on gene expression, mitosis and cell death
JP2003527088A (ja) ＰＰＡＲδが仲介するＡＰＣと化学予防薬の結合

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application