JP2004509608A - レチノイドにより調節される遺伝子の発現を同定する試薬及び方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、レチノイドにより誘導される成長抑制遺伝子を同定する。本発明は、これらの細胞遺伝子の発現を誘導するレチノイド以外の化合物を同定するための、試薬及び方法を提供する。本発明はまた、組換え哺乳動物細胞であり、レチノイドにより調節される遺伝子のプロモーターの転写制御下でリポーター遺伝子を発現する組換え発現作成物を含む試薬、および、該細胞を使用して、これらの細胞遺伝子の発現を調節するレチノイド以外の化合物を同定する方法を提供する。
Description
【０００１】
（発明の背景）
本出願は、２０００年５月２６日に提出された、米国仮特許出願番号第６０／２０７，５３５号の優先権を主張する。
【０００２】
本出願は、国立衛生研究所からの補助金、ＲＯ１ＣＡ６２０９９により支援された。政府は、本発明にある権利を有し得る。
【０００３】
１．発明の分野
本発明は、細胞遺伝子発現の変化、及び、細胞遺伝子発現の変化をもたらす化合物に関する。特に、本発明は、その発現が、レチノイン酸及びビタミンＡに化学的に関連しているレチノイドとして知られる分類の化合物により調節される遺伝子の同定に関する。より具体的には、本発明は、これらの細胞遺伝子の発現を調節するレチノイド以外の化合物を同定する方法を提供する。本発明はまた、レチノイドにより調節される遺伝子のプロモーターの転写制御下でリポーター遺伝子を発現する組換え発現作成物を含む組換え哺乳動物細胞である試薬、及び、これらの細胞遺伝子の発現を調節するレチノイド以外の化合物を同定するために該細胞を使用する方法を提供する。
【０００４】
２．関連分野の要約
レチノイドは、ビタミンＡの天然または合成誘導体である。それらは、リガンド依存的な転写因子として作用する核受容体に結合することにより、転写レベルで細胞成長及び分化を調節する分類の臨床的に重要な分化剤を含む。これらの化合物は、レチノイド受容体を発現するインビボ及びインビトロで多くの腫瘍細胞型における、細胞分化または末端増殖停止を誘導し（Ｗａｒｒｅｌｌ、１９９７、癌、腫瘍学の原理及び実践（ＤｅＶｉｔａら編）、４８３〜４９０頁（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ、フィラディルフィア）、これによりそれらは、前骨髄球性白血病などのいくつかの癌の処置及び癌化学防御に有用となっている。
【０００５】
レチノイド作用の標的は細胞核であり、レチノイドは、ＲＡＲ（レチノイン酸受容体）及びＲＸＲ（レチノイドＸ受容体）と呼ばれる、２種類の受容体に結合する（Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆら、１９９４、「レチノイド受容体」レチノイド：生物学、化学及び医学、Ｓｐｏｒｎら編、ニューヨーク；Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、３１９〜３５１頁）。レチノイド結合受容体分子は、転写因子として作用する、ホモ（ＲＸＲ−ＲＸＲ）及びヘテロダイマー（ＲＡＲ−ＲＸＲ）を形成する。これらのダイマーは、ＲＡＲＥ（レチノイン酸応答エレメント）と呼ばれるレチノイド応答性標的遺伝子のプロモーターにおける特異的シス調節配列に結合し、その転写を調節する。遺伝子発現の生じた変化は、標的遺伝子発現のレチノイド受容体調節により直接に、または、レチノイド活性化シグナル伝達経路、例えば、転写因子ＡＰ−１により活性化される経路の作用により間接的に引き起こされる。これらの遺伝子発現変化は、最終的に、レチノイドの成長抑制作用に関与する（Ｗａｒｒｅｌｌ、同上）。
【０００６】
レチノイドは、癌処置においていくつかの臨床的な成功を示したが、その使用は、耐性の発達（Ｍｉｌｌｅｒら、１９９８、Ｃａｎｃｅｒ ８３：１４７１〜１４８２）または毒性という、少なくとも２つの因子により制限されている。耐性の発達は、一部には、レチノイン酸受容体及びレチノイド受容体を介した経路の変化による（Ｍｉｌｌｅｒら、同書）。毒性は、一般に、レチノイドによる処置により生じる遺伝子発現の多面発現変化から生じる、レチノイドの広範な生理的結果に帰せられる。
【０００７】
以前、上皮細胞において数個の成長抑制遺伝子が、レチノイドにより誘導されることが判明した。しかし、これらの遺伝子のいずれも、単独ではレチノイドの成長抑制作用に関与していないことが示された。
【０００８】
Ａｄａｍｏら、１９９２、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３１：１８５８〜１８６６は、乳癌細胞系におけるインシュリン様成長因子結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ−３）の誘導を開示した。
【０００９】
Ｓｗｉｓｓｈｅｌｍら、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：４４７２〜４４７６は、別のインシュリン様成長因子結合タンパク質であるＩＧＦＢＰ−７（インシュリン様成長因子結合タンパク質関連タンパク質１すなわちＩＧＦＢＰ−ｒＰ１、及びｍａｃ２５としても知られる）を、フェンレチニド（４−ヒドロキシフェニルレチナミド、４−ＨＰＲ）による細胞の処置により誘導されるタンパク質として同定した。このタンパク質はまた、哺乳動物癌細胞系において下方制御されることが示された。
【００１０】
Ｋａｔｏら、１９９６、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １２：１３６１〜１３６４は、ｍａｃ２５ｃＤＮＡの骨肉腫細胞系への導入により成長が阻害されたことを示した。
【００１１】
Ｇｕｃｅｖら、１９９６、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：１５４５〜１５５０は、ＩＧＦＢＰ−３を、全トランスレチノイン酸（ＲＡ）及びトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）の両方により、乳癌細胞で誘導されるタンパク質として同定した。これらの細胞におけるＲＡ媒介成長抑制は、ＩＧＦＢＰ−３発現を阻害する細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入することにより、または、外来性ＩＧＦＢＰ−３を細胞に導入することにより軽減した。
【００１２】
ＤｉＳｅｐｉｏら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１４８１１〜１４８１５は、推定腫瘍サプレッサー遺伝子である、タザロテン誘導遺伝子３（ＴＩＧ−３、レチノイド誘導性遺伝子１、すなわちＲＩＧ−１としても知られる）は、初期ヒトケラチノサイトにおいて誘導されることを示した。ＴＩＧ−３は、癌細胞での発現の減少を示し、発現時には癌細胞の成長を阻害し、そして、既知の腫瘍サプレッサー遺伝子Ｈ−ｒｅｖ１０７と配列相同性を共有する。
【００１３】
Ｈｕａｎｇら、２０００、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１５９：１５〜２４は、ＴＩＧ−３が、インビトロでの胃癌細胞系においてレチノイドにより誘導されたことを示した。
【００１４】
Ｌｉｕら、２０００、Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１２６：８５〜９０は、肝癌細胞系における転移サプレッサー遺伝子ｎｍ２３−Ｈ１のＲＡ誘導発現を報告した。
【００１５】
従来技術の教義により、レチノイド媒介成長抑制の１つの機序は、腫瘍サプレッサー遺伝子、及び、抑制されているか、または、その発現が腫瘍細胞において下方制御されている、腫瘍サプレッサー遺伝子及び他の成長抑制遺伝子の活性化（または再活性化）であることが示唆される。しかし、当分野の報告は、レチノイド誘導成長停止の条件下で活性化される成長抑制遺伝子の実体または数を示すことができていない。かかる報告はまた、レチノイド誘導遺伝子が、そのプロモーター中のＲＡＲＥ部位を通して直接誘導されたのか、または間接的に誘導されたのかを示すことができていない。後者の場合、レチノイドに応答性ではない細胞においてさえ、該成長抑制遺伝子を活性化することが可能であろう。
【００１６】
当分野には、発現がレチノイドにより調節される遺伝子、特に、レチノイドにより間接的に誘導される成長抑制遺伝子を同定する必要が依然としてある。また、当分野には、レチノイド調節される細胞遺伝子、特に成長抑制遺伝子の発現に対する、化合物の作用を評価する方法を開発する必要がある。さらに、現在の臨床使用において、耐性が容易に発達せず、レチノイドの毒性及び他の全身的副作用のない、細胞遺伝子発現に対するレチノイドの作用を模倣した代替の化合物を開発する必要がある。
【００１７】
（発明の要約）
本発明は、発現がレチノイドにより調節される遺伝子、並びに、該化合物に対する耐性または毒性を引き起こすことなく、レチノイドの作用を模倣する化合物を同定するための試薬及び方法を提供する。
【００１８】
第一の態様において、本発明は、遺伝子の発現がレチノイドにより誘導され、ＲＡＲＥ部位を含まない、遺伝子に由来するプロモーターに作動可能に連結したリポーター遺伝子をコードする組換え発現作成物を提供する。好ましい実施形態において、リポーター遺伝子は、ホタルルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑蛍光タンパク質、またはアルカリホスファターゼをコードする。好ましいレチノイドは、全トランスレチノイン酸、フェンレチニド、９−シスレチノイン酸、１３−シスレチノイン酸、エトレチナートおよびレチノール（ビタミンＡ）を含む。本発明の組換え発現作成物を含む最も好ましいプロモーターは、レチノイドにより誘導され、成長抑制活性を示すことが知られている、細胞遺伝子由来のプロモーターである。好ましい実施形態において、細胞遺伝子プロモーターは、ヒトインシュリン様成長因子結合タンパク質−３（ＩＧＦＢＰ−３；配列番号１）、分泌細胞接着タンパク質βＩＧ−Ｈ３（配列番号２）、新生物に欠失した上皮タンパク質（ＥＰＬＩＮ；配列番号３）、ユビキチン様タンパク質ＦＡＴ１０（配列番号４）、プロテアソームアクチベーターＰＡ２８サブユニットα（ＰＡ２８α；配列番号５）、Ｍａｃ−２結合タンパク質（Ｍａｃ−２ＢＰ；配列番号６）、プロテインＣ阻害剤（ＰＣＩ；配列番号７）、Ｔ細胞受容体γ（配列番号８）、レチナールオキシダーゼ（配列番号９）、Ｂｅｎｅ（配列番号１０）、ＨＩＦ−２α／ＥＰＡＳ−１（配列番号１１）またはセレクチンＬ（配列番号１２）に由来する。特に好ましい実施形態において、プロモーターは、ヒトインシュリン様成長因子結合タンパク質−３（ＩＧＦＢＰ−３；配列番号１）、分泌細胞接着タンパク質βＩＧ−Ｈ３（配列番号２）、新生物に欠失した上皮タンパク質（ＥＰＬＩＮ；配列番号３）、ユビキチン様タンパク質ＦＡＴ１０（配列番号４）、またはプロテアソームアクチベーターＰＡ２８サブユニットα（ＰＡ２８α；配列番号５）である。
【００１９】
第二の実施形態において、本発明は、レチノイド誘導性細胞遺伝子由来のプロモーターの転写制御下にあるリポーター遺伝子をコードする、発明の組換え発現作成物を含む哺乳動物細胞を提供する。好ましい実施形態において、リポーター遺伝子は、ホタルルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセトルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑蛍光タンパク質、またはアルカリホスファターゼをコードする。好ましいレチノイドは、全トランスレチノイン酸、フェンレチニド、９−シスレチノイン酸、１３−シスレチノイン酸、エトレチナート及びレチノールを含む。発明の組換え発現作成物を含む最も好ましいプロモーターは、レチノイドにより誘導され、成長抑制活性を有することが知られている細胞遺伝子由来の、または、ヒトインシュリン様成長因子結合タンパク質−３（ＩＧＦＢＰ−３；配列番号１）、分泌細胞接着タンパク質βＩＧ−Ｈ３（配列番号２）、新生物に欠失した上皮タンパク質（ＥＰＬＩＮ；配列番号３）、ユビキチン様タンパク質ＦＡＴ１０（配列番号４）、プロテアソームアクチベーターＰＡ２８サブユニットα（ＰＡ２８α；配列番号５）、Ｍａｃ−２結合タンパク質（Ｍａｃ−２ＢＰ；配列番号６）、プロテインＣ阻害剤（ＰＣＩ；配列番号７）、Ｔ細胞受容体γ（配列番号８）、レチナールオキシダーゼ（配列番号９）、Ｂｅｎｅ（配列番号１０）、ＨＩＦ−２α／ＥＰＡＳ−１（配列番号１１）またはセレクチンＬ（配列番号１２）由来のプロモーターである。特に好ましい実施形態において、プロモーターは、ヒトインシュリン様成長因子結合タンパク質−３（ＩＧＦＢＰ−３；配列番号１）、分泌細胞接着タンパク質βＩＧ−Ｈ３（配列番号２）、新生物に欠失した上皮タンパク質（ＥＰＬＩＮ；配列番号３）、ユビキチン様タンパク質ＦＡＴ１０（配列番号４）、またはプロテアソームアクチベーターＰＡ２８サブユニットα（ＰＡ２８α；配列番号５）に由来する。
【００２０】
第三の実施形態において、本発明は、哺乳動物細胞においてレチノイド誘導性遺伝子の発現を誘導する化合物を同定する方法を提供する。この方法では、レチノイド誘導性細胞遺伝子由来のプロモーターの転写制御下にあるリポーター遺伝子をコードする本発明の組換え発現作成物を含む本発明に記載の組換え哺乳動物細胞を、化合物の存在下及び不在下で哺乳動物細胞において少なくとも１つのレチノイド誘導遺伝子の発現を誘導する条件下で培養する。化合物の存在下における細胞のリポーター遺伝子発現を、化合物の不在下における該細胞のリポーター遺伝子発現と比較する。リポーター遺伝子発現が、化合物の不在下よりも化合物の存在下の方が高い場合に、レチノイド誘導遺伝子発現を誘導する化合物と同定する。好ましい実施形態において、リポーター遺伝子は、ホタルルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセトルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑蛍光タンパク質、またはアルカリホスファターゼをコードする。好ましいレチノイドは、全トランスレチノイン酸、フェンレチニド、９−シスレチノイン酸、１３−シスレチノイン酸、エトレチナート及びレチノールを含む。本発明の組換え発現作成物を含む最も好ましいプロモーターは、レチノイドにより誘導され、成長抑制活性を示すことが知られるか、または、ヒトインシュリン様成長因子結合タンパク質−３（ＩＧＦＢＰ−３；配列番号１）、分泌細胞接着タンパク質βＩＧ−Ｈ３（配列番号２）、新生物に欠失した上皮タンパク質（ＥＰＬＩＮ；配列番号３）、ユビキチン様タンパク質ＦＡＴ１０（配列番号４）、プロテアソームアクチベーターＰＡ２８サブユニットα（ＰＡ２８α；配列番号５）、Ｍａｃ−２結合タンパク質（Ｍａｃ−２ＢＰ；配列番号６）、プロテインＣ阻害剤（ＰＣＩ；配列番号７）、Ｔ細胞受容体γ（配列番号８）、レチナールオキシダーゼ（配列番号９）、Ｂｅｎｅ（配列番号１０）、ＨＩＦ−２α／ＥＰＡＳ−１（配列番号１１）またはセレクチンＬ（配列番号１２）に由来する、細胞遺伝子のプロモーターである。特に好ましい実施形態において、プロモーターは、ヒトインシュリン様成長因子結合タンパク質−３（ＩＧＦＢＰ−３；配列番号１）、分泌細胞接着タンパク質βＩＧ−Ｈ３（配列番号２）、新生物に欠失した上皮タンパク質（ＥＰＬＩＮ；配列番号３）、ユビキチン様タンパク質ＦＡＴ１０（配列番号４）、またはプロテアソームアクチベーターＰＡ２８サブユニットα（ＰＡ２８α；配列番号５）に由来する。好ましい実施形態において、リポーター遺伝子の発現は、免疫学的試薬を使用して、相補的で検出可能なように標識された核酸に対するハイブリダイゼーションにより、または、リポーター遺伝子産物の活性を検出することにより検出する。
【００２１】
第四の実施形態において、本発明は、哺乳動物細胞においてレチノイド誘導性遺伝子の発現を誘導する化合物の同定法を提供する。本発明のこの態様において、哺乳動物細胞を、化合物の存在下及び不在下で培養する。その後、細胞を、発現がレチノイドにより誘導される少なくとも１つの細胞遺伝子の発現についてアッセイする。下位区分（ｂ）の細胞遺伝子の発現が、化合物の不在下よりも化合物の存在下の方が高い場合、哺乳動物細胞においてレチノイド誘導性遺伝子の発現を誘導する化合物と同定する。好ましいレチノイドは、全トランスレチノイン酸、フェンレチニド、９−シスレチノイン酸、１３−シスレチノイン酸、エトレチナートまたはレチノールを含む。遺伝子は、レチノイドにより誘導され、成長抑制活性またはヒトインシュリン様成長因子結合タンパク質−３（ＩＧＦＢＰ−３；ＮＣＢＩ受託番号Ｍ３５８７８．１）、分泌細胞接着タンパク質βＩＧ−Ｈ３（受託番号ＡＣ００４５０３．１）、新生物に欠失した上皮タンパク質（ＥＰＬＩＮ；受託番号ＡＨ００９３８２．１）、ユビキチン様タンパク質ＦＡＴ１０（受託番号ＡＬ０３１９８３）、Ｍａｃ−２結合タンパク質（Ｍａｃ−２ＢＰ；受託番号Ｕ９１７２９）、プロテインＣ阻害剤（ＰＣＩ；受託番号ＡＬ０４９８３９．３）、Ｔ細胞受容体γ（受託番号ＡＣ００６０３３．２）、レチナールオキシダーゼ（受託番号ＡＦ０１０２６０）、Ｂｅｎｅ（受託番号ＡＰ００１２３４．３）、ＨＩＦ−２α／ＥＰＡＳ−１（受託番号ＮＴ＿００５０６５．３）、セレクチンＬ（受託番号ＡＬ０２１９４０．１）、またはプロテアソームアクチベーターＰＡ２８サブユニットα（ＰＡ２８α；受託番号ＡＬ１３６２９５．２）を有することが知られている細胞遺伝子である。特に好ましい実施形態において、遺伝子は、ヒトＩＧＦＢＰ−３、βＩＧ−Ｈ３、ＥＰＬＩＮ、ＦＡＴ１０またはＰＡ２８αである。好ましい実施形態において、細胞遺伝子の発現は、免疫学的試薬を使用して、相補的で検出可能なように標識された核酸に対するハイブリダイゼーションにより、または、遺伝子産物の活性を検出することにより検出する。
【００２２】
本発明は、癌を有する動物を処置して、疾患を予防または寛解するための方法も提供する。この態様において、レチノイド誘導遺伝子の発現を誘導する本発明により同定される化合物の治療有効投与量を、それを必要とする動物、最も好ましくはヒトに投与する。
【００２３】
本発明の特に好ましい実施形態は、ある好ましい実施形態及び特許請求の範囲の以下のより詳細な説明から明らかとなろう。
【００２４】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明は、レチノイドにより発現が誘導される遺伝子を提供する。本発明はまた、レチノイドの遺伝子発現誘導特性を模倣しているが、レチノイド処理に特徴的である毒性及び細胞が耐性を発達する傾向のない、化合物を同定するための、試薬及び方法も提供する。
【００２５】
本発明者らは、ヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞などのレチノイド感受性細胞のレチノイドによる処理は、レチノイド誘導性遺伝子のコホートを含む遺伝子群の発現を誘導すると決定した。これらの遺伝子のいくつかは成長抑制遺伝子、すなわち、その発現が腫瘍細胞の成長または腫瘍原性を阻害する遺伝子である。これらの遺伝子は、とりわけ、腫瘍細胞、及び、不適切にまたは病原的に増殖する他の細胞において、その成長を阻害するために、誘導すべき標的として重要である。発現がレチノイドにより調節可能である遺伝子は、ＲＡＲＥと呼ばれる、そのプロモーターに特定のクラスの配列を含むことが当分野では知られていた（Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆら、１９９４、レチノイド：生物学、化学、及び医学、（Ｓｐｏｒｎら編）、３２７〜３３０頁（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク）。しかし、驚くべきことに、本発明者らにより決定されたＭＣＦ−７細胞でレチノイドにより最も強力に誘導される１つの遺伝子を除く全ての遺伝子が、そのプロモーターに該ＲＡＲＥ配列を含まなかった。この意外な結果により、レチノイドは、これらの遺伝子のＲＡＲＥ配列へのＲＸＲホモダイマーまたはＲＡＲ−ＲＸＲヘテロダイマー結合を必要としない機序により、これらの遺伝子を間接的に活性化することが示された。この結果により、レチノイド以外の化合物は、レチノイド感受性及びレチノイド非感受性細胞の両方において、これらの（及び、おそらく他の）成長抑制遺伝子の発現を誘導できるはずであることが示唆された。本発明より前には、レチノイド非感受性細胞を、レチノイド誘導性成長抑制遺伝子を発現するように誘導できることを疑う理由はなかった。
【００２６】
本明細書に開示したのは、哺乳動物細胞において成長抑制効果を有する数個の遺伝子を含む、１３個のレチノイド誘導性遺伝子の本発明者らによる発見である。当業者は、これらの結果は完全ではなく、他の成長抑制遺伝子も、哺乳動物細胞においてレチノイドにより誘導され得ることを理解するだろう。本結果を鑑みて、当業者はまた、これらの追加的な遺伝子のいくつかは、そのプロモーターにＲＡＲＥ配列を欠き、従って、レチノイドにより間接的に誘導されると期待されることを理解するだろう。本明細書に開示したように、プロモーターにＲＡＲＥ配列を欠いたレチノイド誘導性遺伝子は、細胞増殖に対する生理学的に基づいた成長抑制効果を模倣したレチノイド以外の化合物を同定するための有用な標的である。該化合物の同定は、有利には、哺乳動物細胞、特に腫瘍細胞及び不適切または病的に増殖する他の細胞において、成長停止を引き起こす代替的な薬剤を提供する。該化合物は、レチノイドの成長抑制効果を模倣できるので有益である。
【００２７】
該化合物の別の利点は、従来技術で既知の他の成長抑制化合物で見られる全身性副作用を引き起こすことなく、成長抑制効果を示すことを期待できることである。例えば、従来技術で既知の多くの成長抑制薬物及び化合物は、不利には、ｐ２１遺伝子発現を誘導し、これは、その発現が、本明細書に参考として取込んだ、疾患、特に年齢関連疾患、例えばアルツハイマー病、アテローム性動脈硬化症、腎疾患、及び関節炎の発達に関連している（２００１年２月１日に提出された共所有及び同時係属米国特許出願番号第６０／＿＿＿＿＿（代理人名簿番号９９，２１６−Ｅ）及び２００１年５月２１日に提出された米国特許出願番号第０９／＿＿＿＿＿（代理人名簿番号９９，２１６−Ｆ）、複数の遺伝子を活性化することにより老化、成長停止及びアポトーシスを誘導する。これに対し、ＭＣＦ−７細胞におけるレチノイン酸誘導成長抑制は、ｐ２１を誘導しない（Ｚｈｕら、１９９７、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．２３４：２９３〜２９９）。レチノイドにより誘導される本明細書に同定した遺伝子は、動物で発現した場合に、疾患或いは不利または病的な作用に関連していないことが知られている。従って、本明細書に同定した１つまたは複数の遺伝子の発現を誘導することによるレチノイドの成長抑制効果を模倣した該化合物の同定により、かかる副作用は減少または全く示さないことが期待でき、これによりそれらは、抗腫瘍及び他の療法のより良好な薬剤となる。従って、当分野で既知の成長抑制化合物の毒性副作用を引き起こすことなくレチノイドの成長抑制効果を模倣した化合物の発見は、有利には、本発明により提供される。
【００２８】
本明細書に提供したように、レチノイドに応答性であるがそのプロモーターにＲＡＲＥ部位を含まない哺乳動物遺伝子は、ヒトインシュリン様成長因子結合タンパク質−３（ＩＧＦＢＰ−３；ＮＣＢＩ受託番号Ｍ３５８７８．１）、分泌細胞接着タンパク質βＩＧ−Ｈ３（受託番号ＡＣ００４５０３．１）、新生物に欠失した上皮タンパク質（ＥＰＬＩＮ；受託番号ＡＨ００９３８２．１）、ユビキチン様タンパク質ＦＡＴ１０（受託番号ＡＬ０３１９８３）、Ｍａｃ−２結合タンパク質（Ｍａｃ−２ＢＰ；受託番号Ｕ９１７２９）、プロテインＣ阻害剤（ＰＣＩ；受託番号ＡＬ０４９８３９．３）、Ｔ細胞受容体γ（受託番号ＡＣ００６０３３．２）、レチナールオキシダーゼ（受託番号ＡＦ０１０２６０）、Ｂｅｎｅ（受託番号ＡＰ００１２３４．３）、ＨＩＦ−２α／ＥＰＡＳ−１（受託番号ＮＴ＿００５０６５．３）、セレクチンＬ（受託番号ＡＬ０２１９４０．１）またはプロテアソームアクチベーターＰＡ２８サブユニットα（ＰＡ２８α；受託番号ＡＬ１３６２９５．２）を含む。
【００２９】
本発明の目的では、「細胞」または「細胞群」なる言及は等価であるとし、特に、当分野で既知のように育成及び維持された哺乳動物細胞のインビトロ培養物を包含する。
【００３０】
本発明の目的では、複数形の「細胞遺伝子」の言及は、単一の遺伝子並びに２つ以上の遺伝子を包含するものとする。また、細胞遺伝子発現、または、細胞遺伝子に由来するプロモーターの転写制御下にあるリポーター作成物の調節の効果を、第一遺伝子で検出でき、その後、該効果を、第二または任意の数の追加的な遺伝子またはリポーター遺伝子作成物を試験することにより複製できることが当業者により理解されるだろう。または、２つ以上の遺伝子またはリポーター遺伝子作成物の発現を同時に本発明の範囲内でアッセイできる。
【００３１】
本明細書に使用したような、「ＲＡＲＥ部位」なる語は、１つ、２つまたは５つのヌクレオチドだけ離れた、２つの六量体コアモチーフ（Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆら、１９９４、レチノイド：生物学、化学、及び医学（Ｓｐｏｒｎら編）、３２７〜３３０頁（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク）に定義の通り）を包含するものとし、ここでの六量体モチーフは、直列、逆方向または回文構造反復として整列している。
【００３２】
本発明者らは、ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞を、低用量のレチノイドで処理すると、最小限の細胞毒性を伴い次第に成長停止及び細胞老化の表現型特徴を誘導する（Ｃｈａｎｇら、１９９９、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：３７６１〜３７６７）。比較的低用量のＲＡが、ＭＣＦ−７細胞において不可逆的な成長停止を誘導することが判明したが、細胞死により引き起こされる細胞数の減少はほんの僅かであった。「低用量」のＲＡ（１０〜１００ｎＭ）によるこの効果が顕現するのには、４〜６日間の連続的なＲＡへの暴露が必要であった。低用量のレチノイド処理は、拡大し平坦な細胞形態の発達及び老化関連マーカーＳＡ−β−ガラクトシダーゼ（ＳＡ−β−ｇａｌ）の発現を含む、細胞老化に特徴的な処理細胞における表現型特徴の発達を伴った。ＳＡ−β−ｇａｌの誘導も、フェンレチニドでの処理後にインビボでＭＣＦ−１０Ｔ新哺乳動物上皮細胞の異種移植片で観察された。これらの結果により、レチノイド処理は、細胞分裂停止用量で投与した場合に、インビボ及びインビトロで、腫瘍細胞に老化を誘導することが示唆された。
【００３３】
老化は、当業者に既知の多くの方法で哺乳動物細胞に誘導できる。例えば、老化は、インビボまたはインビトロで、正常な細胞成長の当然の結果であり：正常細胞が老化する前に受けることのできる、細胞分裂、継代または世代の数は限定されている。正確な数は、細胞型及び起源種により変化する（Ｈａｙｆｌｉｃｋ＆Ｍｏｏｒｈｅａｄ、１９６１、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．２５：５８５〜６２１）。老化はまた、大半の抗癌薬または照射などの細胞毒性薬物での処理により、正常及び腫瘍細胞の両方に誘導できる。Ｃｈａｎｇら、１９９９、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：３７６１〜３７６７参照。老化はまた、その細胞に、腫瘍サプレッサー遺伝子（例えばｐ５３、ｐ２１、ｐ１６またはＲｂ）を形質導入し、そこで該遺伝子を発現することにより、任意の哺乳動物細胞で迅速に誘導できる。Ｓｕｇｒｕｅら、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：９６４８〜９６５３；Ｕｈｒｂｏｒｎら、１９９７、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １５：５０５〜５１４；Ｘｕら、１９９７、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １５：２５８９〜２５９６；Ｖｏｇｔら、１９９８、Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．９：１３９〜１４６参照。哺乳動物細胞に老化を誘導するこれら及び他の手段並びに方法は、当業者により認識及び理解され、本発明の範囲内に該当する。
【００３４】
本発明の試薬は、レチノイドに応答して細胞遺伝子発現を誘導できる、任意の哺乳動物細胞、好ましくは齧歯類または霊長類細胞、より好ましくはマウス細胞、最も好ましくはヒト細胞を含み、該遺伝子は、遺伝子工学により導入した内因性遺伝子または外来性遺伝子である。好ましい細胞は、哺乳動物細胞、好ましくは齧歯類または霊長類細胞、より好ましくはマウスまたはヒト細胞を含む。
【００３５】
組換え発現作成物は、当業者に理解されているような適切な哺乳動物細胞に導入できる。該作成物の好ましい実施形態は、当分野で既知のような、感染性ベクター、より好ましくはウイルスベクター、最も好ましくはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、及びワクシニアウイルスベクターで作成する。一般に、哺乳動物細胞、生物工学：実践的なアプローチ（Ｂｕｔｌｅｒ編）、オックスフォード大学出版：ニューヨーク、１９９１、５７〜８４頁参照。
【００３６】
本発明はまた、リポーター遺伝子が、発現がレチノイドにより誘導される遺伝子のプロモーターの転写制御下にある、組換え発現作成物を提供する。本発明のこの態様の好ましい実施形態において、レチノイドは、全トランスレチノイン酸、フェンレチニド、９−シスレチノイン酸、１３−シスレチノイン酸、エトレチナートまたはレチノールである。好ましい実施形態において、プロモーターは、発現が、レチノイドによる細胞の処理によって誘導または別様に増加する遺伝子に由来し、好ましくは、ヒトインシュリン様成長因子結合タンパク質−３（ＩＧＦＢＰ−３；配列番号１）、分泌細胞接着タンパク質βＩＧ−Ｈ３（配列番号２）、新生物に欠失した上皮タンパク質（ＥＰＬＩＮ；配列番号３）、ユビキチン様タンパク質ＦＡＴ１０（配列番号４）、プロテアソームアクチベーターＰＡ２８サブユニットα（ＰＡ２８α；配列番号５）、Ｍａｃ−２結合タンパク質（Ｍａｃ−２ＢＰ；配列番号６）、プロテインＣ阻害剤（ＰＣＩ；配列番号７）、Ｔ細胞受容体γ（配列番号８）、レチナールオキシダーゼ（配列番号９）、Ｂｅｎｅ（配列番号１０）、ＨＩＦ−２α／ＥＰＡＳ−１（配列番号１１）、またはセレクチンＬ（配列番号１２）に由来する。最も好ましくは、プロモーターは、ヒトインシュリン様成長因子結合タンパク質−３（ＩＧＦＢＰ−３；配列番号１）、分泌細胞接着タンパク質βＩＧ−Ｈ３（配列番号２）、新生物に欠失した上皮タンパク質（ＥＰＬＩＮ；配列番号３）、ユビキチン様タンパク質ＦＡＴ１０（配列番号４）、またはプロテアソームアクチベーターＰＡ２８サブユニットα（ＰＡ２８α；配列番号５）、Ｍａｃ−２結合タンパク質（Ｍａｃ−２ＢＰ；配列番号６）、プロテインＣ阻害剤（ＰＣＩ；配列番号７）、Ｔ細胞受容体γ（配列番号８）、レチナールオキシダーゼ（配列番号９）、Ｂｅｎｅ（配列番号１０）、ＨＩＦ−２α／ＥＰＡＳ−１（配列番号１１）またはセレクチンＬ（配列番号１２）に由来する。最も好ましくは、プロモーターは、ヒトインシュリン様成長因子結合タンパク質−３（ＩＧＦＢＰ−３；配列番号１）、分泌細胞接着タンパク質βＩＧ−Ｈ３（配列番号２）、新生物に欠失した上皮タンパク質（ＥＰＬＩＮ；配列番号３）、ユビキチン様タンパクＦＡＴ１０（配列番号４）、またはプロテアソームアクチベーターＰＡ２８サブユニットα（ＰＡ２８α；配列番号５）に由来する。その後、これらのリポーター遺伝子は、レチノイド誘導遺伝子発現効果の高感度で簡便な指示薬として使用され、哺乳動物細胞でレチノイドの効果を模倣した化合物を容易に同定できる。これらの作成物用の宿主細胞は、任意の哺乳動物細胞を含む。本発明のこの態様の実践に有用なリポーター遺伝子は、蛍ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑蛍光タンパク質、及びアルカリホスファターゼを含むがこれに限定されない。
【００３７】
以下の実施例は、本発明のある好ましい実施形態をさらに説明するものであり、限定する性質のものではない。
【００３８】
（実施例１）
レチノイン酸での処理による遺伝子発現調節の解析
細胞学的及び遺伝子発現解析を実施して、ＭＣＦ−７細胞培養液に対するレチノイン酸処理の効果を決定した。
【００３９】
クローン原性アッセイを実施して、１００ｎＭのＲＡで様々な時間で処理した後に、ＭＣＦ−７細胞における増殖能の差異を解析した。細胞を、１〜７日間、１００ｎＭのＲＡに暴露し、各時間点における処理後のそのコロニー形成能について試験した。図１Ａに示したように、非処理対照に規準化したプレーティング効率は、１００ｎＭのＲＡと共に細胞をインキュベートする時間の経過と共に減少した。減少は、最初は急速で（ＲＡと共に２日間インキュベートした後にはプレーティング効率は１００％から４０％に）、７日目には最終プレーティング効率は約１０％までよりゆっくりと減少した。図１Ｂは、様々な濃度のＲＡにおける、ＭＣＦ−７細胞のプレーティング効率を示し；これらの結果は、全ての試験した用量における（１０ｎＭまで低い）プレーティング効率の用量依存的減少を示す。プレーティング効率の有意な減少が、細胞成長に対するレチノイドの効果の研究に慣用的に使用される濃度（≧１μＭ）よりもはるかに低い濃度で観察された。
【００４０】
これらの結果は、レチノイドにより調節された細胞遺伝子発現の変化に因る、細胞成長及び増殖能の減少と一致した。遺伝子発現変化を研究するために、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを、非処理ＭＣＦ−７細胞から、及び、１００ｎＭのＲＡで５日間処理した細胞から単離した。ｃＤＮＡを、これらのＲＮＡ個体群から調製し、ｃＤＮＡを、異なるヒト遺伝子及びＥＳＴの＞７，０００個のｃＤＮＡを含むｃＤＮＡマイクロアレイ（ヒトＵｎｉＧＥＭ Ｖ ｃＤＮＡマイクロアレイ、Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、ミズーリ州セントルイス）とハイブリダイズさせた。ｃＤＮＡプローブ合成、マイクロアレイとのハイブリダイゼーション、及びシグナル解析を、Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓの市販サービスにより実施した。
【００４１】
マイクロアレイ中のＲＮＡ処理細胞のどの遺伝子も、相対的なハイブリダイゼーション強度の２．５倍以上の増加、または、３倍以上の減少を示さなかった。マイクロアレイハイブリダイゼーションにおいて最大の差異を示した計４７個の遺伝子のＲＮＡレベルの変化を、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）解析により試験した。これらの中で、「平衡差次的発現」（相対的ハイブリダイゼーション強度の尺度）において、２７個の遺伝子が１．４〜２．５倍の増加を示し、２０個の遺伝子が１．７〜３．０倍の減少を示した。
【００４２】
ＲＴ−ＰＣＲ解析を、内部規準標準物質としてβ−アクチンを使用して、実質的に記載のように実施した（Ｎｏｏｎａｎら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：７１６０〜７１６４）。ＲＡにより最も強力に誘導された、１３個の遺伝子のＲＴ−ＰＣＲプライマーの配列及びＰＣＲ条件は以下の通りである：
【表１】
【表２】
【００４３】
ＲＴ−ＰＣＲアッセイにより、４７個中４３個の遺伝子の発現の変化が確認され、１３個の上方制御された遺伝子が、マイクロアレイハイブリダイゼーションにより示されたよりもはるかに強力に（５〜１０倍以上）ＲＡにより誘導されたことが示唆され；これらの結果を図２Ａ及び２Ｂに示す。これらの１３個の遺伝子のＲＮＡレベルの変化の時間経緯の解析（図２Ａ）により、クローン原性の消失と平行して、ＲＡ処理の１から４日間の間に、その発現が増加したことが示された（図１Ａに示す）。遺伝子発現のＲＡ用量依存性の解析（図２Ｂに示す）により、これらのほぼ全ての遺伝子が、検出可能なクローン原性の消失をもたらした最も低い用量のＲＡ（１０ｎＭ）によってさえ誘導されることが示された。全１３個の遺伝子は、乳癌化学防御に使用される、１μＭの別のレチノイドであるフェンレチニドでの処理によっても誘導された（これらの結果は図２Ｃに示す）。
【００４４】
この群の３つの遺伝子の誘導を試験し、ＥＰＬＩＮに対するウサギポリクローナル抗体（ＵＣＬＡのＤａｖｉｄ Ｃｈａｎｇ博士より贈与）、及び、ＩＧＦＢＰ−３及びＥＰＡＳ−１／ＨＩＦ−２αに対するヤギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンタクルス）及び標準的な技術を使用して、図３Ａに示した免疫細胞化学アッセイにより、タンパク質レベルで確認した。抗体染色は、製造業者の指示に従って、ベクタステインキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ、カリフォルニア州バーリンゲーム）を使用して検出した。これらの結果により、ＲＡ処理細胞におけるＩＧＦＢＰ−３、ＥＰＡＳ−１／ＨＩＦ２α、及びＥＰＬＩＮｍＲＮＡの誘導は、対応するタンパク質の発現の増加を伴ったことが示される。
【００４５】
これらの結果により、ＲＡ及びフェンレチニドは、これらのレチノイドが細胞成長を阻害し老化表現型を誘導する条件下で、共通の遺伝子セットの発現を強力に誘導することが示された。
【００４６】
（実施例２）
レチノイン酸での処理により、ＭＣＦ−７細胞に誘導された遺伝子の生物学的機能
実施例１に考察したように検出した遺伝子は、文献探索により、レチノイドの細胞効果に関連した生物学的機能を有することが判明した。
【００４７】
顕著には、レチノイドにより強力に誘導された１３個中４個の遺伝子が、抗増殖活性を有すると報告されている。第一の遺伝子は、乳癌細胞でＲＡにより誘導可能であり、これらの細胞の成長を阻害することが示された分泌因子である、インシュリン様成長因子結合タンパク質−３（ＩＧＦＢＰ−３）をコードする（Ａｄａｍｏら、１９９２、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３１：１８５８〜１８６６；Ｇｕｃｅｖら、１９９６、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：１５４５〜１５５０）。ＩＧＦ隔絶におけるその役割に加えて、ＩＧＦＢＰ−３は、近年、レチノイド受容体ＲＸＲαに結合し、その転写活性を調節することが判明した（Ｌｉｕら、２０００、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３３６０７〜３３６１３）。ＩＧＦＢＰ−３の誘導は、図３Ａに示した免疫細胞化学アッセイにより確認した。
【００４８】
レチノイドでの処理により誘導される別の成長抑制遺伝子は、数個の細胞型においてＴＦＧ−βにより誘導可能である、分泌細胞接着タンパク質βＩＧ−Ｈ３をコードする（Ｓｋｏｎｉｅｒら、１９９２、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１：５１１〜５２２）。βＩＧ−Ｈ３の形質移入により、チャイニーズハムスター卵巣細胞の腫瘍原性が阻害されることが示された（Ｓｋｏｎｉｅｒら、１９９４、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３：５７１〜５８４）。βＩＧ−Ｈ３は、正常なヒト線維芽細胞では発現されるが、悪性形質転換されたヒト線維芽細胞では発現されず（Ｓｃｈｅｎｋｅｒ＆Ｔｒｕｅｂ、１９９８、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．２３９：１６１〜１６８）、これは、この遺伝子が腫瘍サプレッサーであり得ることを示唆する。
【００４９】
第三の遺伝子は、初期上皮細胞に発現されるが、異なる型の癌では下方制御されているアクチン結合タンパク質である、ＥＰＬＩＮと呼ばれるＬＩＭドメインタンパク質をコードする（Ｍａｕｌ＆Ｃｈａｎｇ、１９９９、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８：７８３８〜７８４１）。ＥＰＬＩＮの異所的発現は、骨肉腫細胞系で細胞増殖を抑制することが示された（ＭａｕｌとＣｈａｎｇ、同上）。ＥＰＬＩＮ遺伝子は、ＥＰＬＩＮα及びＥＰＬＩＮβという２つのタンパク質アイソフォームをコードし、大きい方の（β）アイソフォームが、より強力な成長抑制効果を示す。観察されたＥＰＬＩＮ遺伝子発現の誘導は、免疫細胞化学及びイムノブロットアッセイにより確認した（結果を図３Ａ及び３Ｂに示す）。これらのアッセイを、ＥＰＬＩＮに対するウサギポリクローナル抗体（ＵＣＬＡのＤａｖｉｄ Ｃｈａｎｇ博士より贈与）を使用して実施し、標準的な技術により実施した。抗体染色は、免疫細胞化学ではベクタステインキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）を使用して、イムノブロットではホースラディッシュペルオキシダーゼ抱合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を使用して検出した。ＭＣＦ−７細胞におけるＥＰＬＩＮの電気泳動移動度（１１０ｋＤａ；図３Ｂ）は、βアイソフォームに対応し、これは、このアイソフォームによるより強力な成長抑制を示した当該技術に一致する。
【００５０】
第四の遺伝子は、ユビキチン様タンパク質ＦＡＴ１０をコードする。ＦＡＴ１０は、紡錘体タンパク質Ｍａｄ２と相互作用し、ＨｅＬａ癌細胞におけるその過剰発現は、細胞生存に有害であると報告された（Ｌｉｕら、１９９９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：４３１３〜４３１８）。
【００５１】
レチノイン酸処理は、レチノイン酸受容体ＲＡＲα（Ｚｈｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１４８０７〜１４８１２）及びサイクリンＤ（Ｓｐｉｎｅｌｌａら、１９９９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２２０１３〜２２０１８）のプロテアソームを介した分解を促進することが知られている。プロテアソームを介したサイクリンＤの分解は、レチノイド誘導成長停止の機序として提唱されている（Ｓｐｉｎｅｌｌａら、同上）。顕著なことには、ＲＡ誘導遺伝子の１つが、プロテアソームアクチベーターＰＡ２８サブユニットα（ＰＡ２８α）をコードしている。ＰＡ２８αの発現は、プロテアソームを活性化するのに十分であり（Ｇｒｏｅｔｔｒｕｐら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ ３８１：１６６〜１６８）、この遺伝子の誘導は、少なくとも一部には、レチノイドによるプロテアソーム活性化を説明し得る。それ故、Ｐａ２８αは別の成長抑制剤と捉えることができる。
【００５２】
さらに別のＲＡ誘導遺伝子は、ビタミンＡからＲＡを合成する第一段階を触媒する酵素である、レチナールオキシダーゼ（アルデヒドオキシダーゼ）をコードしている（Ｈｕａｎｇら、１９９９、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３６４：２６４〜２７２）。観察されたレチナールオキシダーゼの誘導により、レチノイド処理は、処理細胞におけるＲＡ合成を刺激し得、正のフィードバック機序を提供する可能性があることが示唆される。
【００５３】
βＩＧ−Ｈ３とは別に、２つの他の誘導遺伝子は、老化に似た平板な形態及びＲＡ処理ＭＣＦ−７細胞の接着の増加に寄与し得る、分泌タンパク質をコードする。これらの１つは、細胞外マトリックスの細胞接着因子であるＭａｃ−２結合タンパク質（Ｍａｃ−２ＢＰ）をコードしている（Ｓａｓａｋｉら、１９９８、ＥＭＢＯ Ｊ．１７：１６０６〜１６１３）。Ｍａｃ−２ＢＰはまた、ｐ２１により誘導されたヒト線維肉腫細胞の老化でも上方制御されている（Ｃｈａｎｇら、２０００、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：４２９１〜４２９６）。他の遺伝子は、普通肝臓により産生される非特異的セリンプロテアーゼ阻害剤である、プロテインＣ阻害剤（ＰＣＩ）をコードしている。レチノイド処理ＭＣＦ−７細胞は、老化マーカーを発現しているが、この細胞系でＲＡにより強力に誘導されるどの遺伝子も、上皮細胞分化に関与していない。しかし、誘導遺伝子の２つは、白血球ホーミング受容体Ｌ−セレクチン及びＴ細胞受容体を含む、造血系統に特異的な膜貫通タンパク質をコードしている。これらの遺伝子の誘導は、造血悪性疾患におけるレチノイドの十分に文書化されている分化効果に相関している（Ｗａｒｒｅｌｌ、１９９７、同書）。ＲＡはまた、既知の機能を全く有さないＢｅｎｅという別の膜貫通タンパク質を誘導する。
【００５４】
最後の２つのＲＡ誘導遺伝子は、既知または推定の転写調節因子をコードしている。それらの１つは、遺伝子発現に対する、低酸素症及びいくつかの他のストレス因子の効果を媒介する、ＰＡＳドメイン転写因子のファミリーの一員であるＨＩＦ−２α／ＥＰＡＳ−１である（Ｓｅｍｅｎｚａ、１９９９、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１５：５５１〜５７８）。興味深いことに、ＩＧＦＢＰ−３はまた、低酸素症刺激遺伝子の１つである（Ｆｅｌｄｓｅｒら、１９９９、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：３９１５〜３９１８）。ＨＩＦ−２α／ＥＰＡＳ−１の誘導は、図３Ａに示した免疫細胞化学アッセイにより確認した。
【００５５】
最後のＲＡ誘導遺伝子は、リングフィンガータンパク質ＲＮＦ（受託番号ＹＯ７８２８）をコードしている。ＲＮＦ機能は不明であるが、それは、調節タンパク質の１ファミリーと２５〜３８％のアミノ酸同一性を共有し、そのいくつかは、レチノイド応答、老化または分化に関与している。これらは、レチノイド受容体のリガンド依存的転写活性化補助因子として機能するＴＩＦ１α（Ｌｅ Ｄｏｕａｒｉｎら、１９９５、ＥＭＢＯ Ｊ．１４：２０２０〜２０３３）、並びに、ＰＭＬのｔ（１５；１７）転位置でＲＡＲαと融合する前骨髄球性白血病（ＰＭＬ）遺伝子（Ｋａｋｉｚｕｋａら、１９９１、Ｃｅｌｌ ６６：６６３〜６７４）を含む。ＰＭＬは、近年、ヒト線維芽細胞において変異ＲＡＳにより誘導される加速老化のメディエーターとして同定された（Ｆｅｒｂｅｙｒｅら、２０００、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１４：２０１５〜２０２７）。同じファミリーの別のメンバーはＨＥＲＦ１であり、これは、赤血球の末端分化に必要である（Ｈａｒａｄａら、１９９９、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９：３８０８〜３８１５）。興味深いことに、ＨＥＲＦ１、ＲＮＦ及びＦＡＴ１０は全て、染色体６ｐ２１．３の主要組織適合遺伝子座に位置する。この遺伝子座はまた、ＲＡＲαの遺伝子を含み、これはＲＡにより誘導され（Ｓｈａｎｇら、１９９９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１８００５〜１８０１０）、老化哺乳動物細胞で上方制御されていると報告された（Ｓｗｉｓｓｈｅｌｍら、１９９４、Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．５：１３３〜１４１）。
【００５６】
本明細書に開示したように、レチノイドでの乳癌細胞の処理は、同時に、新生物細胞（ＥＰＬＩＮ及びβＩＧ−Ｈ３）で選択的に下方制御されている候補腫瘍サプレッサーを含む、既知の抗増殖機能をもつ数個の遺伝子を誘導する。ＵｎｉＧｅｍＶアレイは、全てのヒト遺伝子の僅か一部を含むので、レチノイドにより同時誘導される成長抑制剤の実際の数は、本明細書で同定した遺伝子よりもはるかに多いはずである。しかし、追加のレチノイド誘導性成長抑制剤は、本明細書に記載のｃＤＮＡプローブを、より大きなｃＤＮＡアレイまたはアレイの組合せにハイブリダイズすることにより、または、当分野で公知の方法を使用して差次的ｃＤＮＡクローニングを実施することにより容易に同定できる（例として、本明細書に参考として取込んだ国際特許出願公開公報第ＷＯ００／６１７５１号参照）。
【００５７】
これらの結果により、レチノイドは、数個の成長抑制遺伝子を誘導でき、これは、レチノイド関連耐性または毒性を引き起こすことなく、これらの遺伝子の１つ以上を誘導できる化合物をスクリーニングするための試薬を開発する基礎を提供することが実証された。
【００５８】
（実施例３）
レチノイン酸で誘導されるレチノイド調節プロモーター−リポーター遺伝子作成物の作成
レチノイド誘導遺伝子の転写制御下にあるリポーター遺伝子作成物を作製するために、それぞれの遺伝子の最長の利用可能なｃＤＮＡ配列の５′末端の１４００〜１５００ｂｐ上流を含む、レチノイドにより強力に誘導される全１３個の遺伝子のプロモーター配列をヒトゲノムデータベース中に同定した。
【００５９】
その後、これらの配列を、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｃｍｂ．ｕｌｂ．ａｃ．ｂｅ／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｒｓａ−ｔｏｏｌｓ／で入手可能な調節配列解析ツールを使用して、様々な配向で、ＲＡＲＥ部位の２つの空間的に近くに配置された六量体コアモチーフ（Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆら、１９９４、レチノイド：生物学、化学及び医学（Ｓｐｏｒｎら編）、３２７〜３３０頁（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク）の存在について解析した。
【００６０】
唯１つのプロモーターのみに見られる推定ＲＡＲＥ部位であるリングフィンガータンパク質ＲＮＦで、ここで配列：
ＡＧＧＴＣＡＣＡＧＣＣＡＧＴＴＣＡ （配列番号４２）
（下線部はＲＡＲＥコアモチーフを示す；Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆら、１９９４、同書）は、見かけの転写開始部位の約３６０ｂｐ上流に逆配向で出現する。他のプロモーターのいずれも、識別可能なＲＡＲＥ配列を含まず、これは、これらの遺伝子の大半が、間接的な機序によりレチノイドにより誘導されることを示唆する。興味深いことに、ＲＮＦはまた、唯１日間の処理後にその最大の発現に到達するこの群における唯一の遺伝子であり（図２Ａ参照）、これは、ＲＮＦがレチノイドにより直接誘導可能であることを示唆する。
【００６１】
ＲＡ処理ＭＣＦ−７細胞での強力かつ持続した誘導を示す成長抑制遺伝子のいずれも、そのプロモーターにＲＡＲＥ部位を含まないことは注目すべきことであり、これは、レチノイド受容体を欠いた細胞において、非レチノイド誘導剤を使用して、これらの成長抑制遺伝子を誘導することが可能であり得ることを示唆する。レチノイド誘導遺伝子、特にプロモーターにＲＡＲＥ配列を欠いた遺伝子由来のプロモーターの転写制御下にあるレポーター遺伝子含有作成物によって、毒性または耐性の発達を引き起こすことなく、レチノイドの遺伝子誘導効果を模倣した様式で、これらの遺伝子からの遺伝子発現誘導能について、試験化合物をスクリーニングすることが可能となる。
【００６２】
該リポーター遺伝子作成物は以下のように調製する。βＩＧ−Ｈ３などのレチノイド調節遺伝子のプロモーター領域は、ｃＤＮＡの５′末端に隣接するとして、ゲノム配列（ＮＣＢＩ受託番号ＡＣ００４５０３）に同定されている。プロモーター特異的ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅は、鋳型としてヒトＭＣＦ−７細胞由来のゲノムＤＮＡ、及び、βＩＧ−Ｈ３用の以下のプライマー：
５′ＧＧＣＣＡＧＧＴＧＣＣＴＣＴＴＣＴＴＡＧ３′（センス）（配列番号４３）
及び
５′ＣＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＴＧＡＧ３′（アンチセンス）（配列番号４４）
を使用して、ＰｆｕＴｕｒｂｏＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）及び２８サイクルのＰＣＲを使用して実施し、ここでの各サイクルは９５℃で４５秒間、６０℃で１分３０秒間、７２℃で２分間からなる。１０２０ｂｐの断片をこの方法を使用して増幅し、ＴＯＰＯ ＴＡクローニングベクターｐＣＲＩＩ／ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングする。この作成物の配列同一性を確認し、その後、正しい配向のプロモーターを含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ断片を、標準的な組換え遺伝子技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０、分子クローニング：実験マニュアル、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：ニューヨーク）を使用して、ホタルルシフェラーゼ−リポーターベクターｐＧＬ２−Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）のＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩ部位に挿入する。
【００６３】
この作成物が哺乳動物細胞でレチノイド誘導性ルシフェラーゼ発現を駆動する能力は、本明細書に参考として取込んだ２００１年２月１日に提出された米国仮特許出願番号第６０／＿＿＿＿＿（代理人名簿番号９９，２１６−Ｅ）及び２００１年５月２１日に提出された米国特許出願番号第０９／＿＿＿＿＿に記載のように、一過性形質移入アッセイで実証する。簡潔には、形質移入はＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ゲーサーズバーグ）を使用して実施する。細胞を、１ｍＬ中に２ｍＭグルタミン、１０％ＦＢＳ、０．１ｍＭ ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸、ＧＩＢＣＯ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、及び１０μｇ／ｍＬインシュリンを含み、ペニシリン／ストレプトマイシンを含まない培地に、１２ウェルプレートへ７０，０００細胞／ウェルの密度でプレーティングする。細胞が培養皿に付着するのに十分な時間、細胞を培養した後、形質移入を、製造業者の指示に従って、１μｇのｐＧＬ２−ベーシックベクターＤＮＡ及び１μｇのｐＧＬ２−βＩＧ−Ｈ３プロモーターＤＮＡを使用して実施した。１０時間後、培養培地を、標準的な組織培養濃度のペニシリン／ストレプトマイシンを含む培地と交換する。その後、細胞を、１００ｎＭのＲＡの存在下または不在下で７２時間培養した。インキュベート後、細胞を、２回リン酸緩衝食塩水で洗浄し、１００μＬのリポーター溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）に捕集した。溶解液を１０分間室温で放置し、その後、細胞試料を凍結し３７℃の水浴で解凍するためにドライアイス−エタノール浴を使用して、１サイクルの凍結／解凍を行なう。５０μＬのアリコートをホタルルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のために新しい管に移す。ルシフェラーゼ活性を、５秒間の遅延期間及び１５秒間の積分時間で、４７．９％の感度で、Ｔｕｒｎｅｒ２０／２０ルミノメーターを使用して上記のように測定する。追加のアリコートを、細胞溶解液から取り出し、バイオ−ラッドタンパク質アッセイキット（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙ）を使用してタンパク質濃度を測定する。各試料のルシフェラーゼ活性を、タンパク質含量に規準化し、タンパク質１μｇあたりのルシフェラーゼ活性として表現する。全アッセイを三重に実施し、平均及び標準偏差として示す。
【００６４】
レチノイドで調節されるルシフェラーゼ発現をもつ安定に形質移入された細胞系を開発するために、上記の作成物を、プロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ選択マーカーを有する、ｐＢａｂｅＰｕｒｏなどの選択マーカーをコードするベクターを用いた同時形質移入により、ＭＣＦ７細胞などのレチノイドによる成長抑制を受けやすい細胞系に導入する。形質移入は、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、メリーランド州ゲーサーズバーグ）を使用して、１０：１の比の作成物並びに選択マーカーを含むプラスミドまたは他のベクターを使用して実施する。安定な形質転換体を、プラスミドまたはベクターによりコードされる選択マーカーに特異的な、適切な量の選択剤を使用して選択する。選択剤に抵抗性の細胞系を単離し、ルシフェラーゼ活性について、１００ｎＭのＲＡ、または、レシピエント細胞系で成長抑制を引き起こす濃度の別のレチノイドの存在下及び不在下で試験する（Ｐｒｏｍｅｇａのルシフェラーゼアッセイシステムを使用）。
【００６５】
このアッセイは以下のように実施する。細胞を、ペニシリン／ストレプトマイシン、グルタミン及び１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を含む１ｍＬの培地中、１２ウェルのプレートに、４０，０００細胞／ウェルの密度でプレーティングする。付着後、細胞を、１００ｎＭのＲＡで処理するか、または種々の時間の間、未処理で放置する。細胞を２回リン酸緩衝食塩水で洗浄し、３００μＬのリポーター溶解緩衝液（ＲＬＢ；Ｐｒｏｍｅｇａ）に捕集した。溶解液を、簡潔に、１０，０００ｇで遠心分離して破砕片をペレット化し、５０μＬの分割量を、ホタルルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で使用するために新しいチューブに移す。ルシフェラーゼ活性を、５秒間の遅延期間及び１５秒間の積分時間で、５５．６％の感度で、Ｔｕｒｎｅｒ２０／２０ルミノメーターを使用して測定する。追加の一定分量を、バイオ−ラッドタンパク質アッセイキット（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙ）を使用してタンパク質濃度を測定するために、細胞溶解液から取り出す。各試料のルシフェラーゼ活性をタンパク質含量に規準化し、タンパク質１μｇあたりのルシフェラーゼ活性として表現する。全アッセイを三重で実施し、平均及び標準偏差として示す。
【００６６】
かかる作成物及び細胞は、レチノイド誘導遺伝子発現を誘導する化合物を同定するためのスクリーニングアッセイの基礎を提供する。同じ型のスクリーニングはまた、安定に形質移入した細胞系ではなく、むしろレチノイド誘導性遺伝子のプロモーター作成物を用いて、一過性形質移入アッセイを使用して実施できる。ルシフェラーゼ発現に基づいたハイスループットなスクリーニング法は当分野で公知である（一過性の形質移入をベースとしたアッセイの近年の例としてＳｔｏｒｚら、１９９９、Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７６：９７〜１０４、及び、安定に形質移入された細胞系に基づいたスクリーニングの例についてはＲｏｏｓら、２０００、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２７３：３０７〜３１５を参照）。これらの細胞及びアッセイを使用して同定した化合物は、次に、併発毒性またはレチノイド耐性を生じる傾向なく、レチノイド誘導遺伝子の遺伝子発現を誘導できる治療剤を開発するのに有用である。
【００６７】
レチノイドによるＭＣＦ−７細胞の処理により誘導すべき、本明細書に示した遺伝子のほぼ全てのプロモーターにレチノイド応答性エレメントが存在しないことによって、レチノイド以外の化合物を、レチノイドの不在下で、または、レチノイド受容体を欠失した細胞において、レチノイド誘導性遺伝子発現の誘導能についてスクリーニングできることが示唆される。該スクリーニングアッセイは、以下のように実施する。上記のように調製し、レチノイドによる誘導性について確認した、組換え発現作成物は、レチノイドに感受性であろうが非感受性であろうが、レチノイン酸受容体を欠失していることが知られる、例えばＨＴ１０８０細胞（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号ＣＣＬ１２１）などの、任意の哺乳動物細胞系への形質移入により導入する。安定な形質転換体を、プラスミドまたはベクターによりコードされる選択マーカーに特異的な適切な量の選択剤を使用して選択し、選択剤に抵抗性の細胞系をこれにより単離する。
【００６８】
これらの細胞は、上記のようなルシフェラーゼ活性アッセイ（ルシフェラーゼアッセイシステム、Ｐｒｏｍｅｇａを使用）に使用する。これらのアッセイは、種々の時間、試験すべき漸増量の化合物の存在下または不在下で培養するか、または、化合物を含まない培地中で培養した細胞に実施する。
【００６９】
このアッセイは、実質的に上記のように実施する。細胞を、ペニシリン／ストレプトマイシン、グルタミン及び１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を含む１ｍＬの培地中、１２ウェルのプレートに、４０，０００細胞／ウェルの密度でプレーティングする。付着後、細胞を、試験すべき漸増量の化合物で処理するか、または、種々の時間、未処理で放置する。細胞をＰＢＳで洗浄し、３００μＬのＲＬＢに捕集し、簡潔に遠心分離にかけて破砕片を除去し、その後、ホタルルシフェラーゼアッセイを使用して上記のようにアッセイする。タンパク質濃度を決定して、ルシフェラーゼ結果を規準化し、これは、タンパク質１μｇあたりのルシフェラーゼ活性として表現する。全アッセイを三重に実施し、平均及び標準偏差として示す。最後に、細胞を、細胞計測またはＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）、メチレンブルーまたは他の細胞特異的株で染色後に細胞数を測定することにより、試験化合物による成長抑制について平行してアッセイする。
【００７０】
前記の開示は、本発明のある特定の実施形態を強調し、それに等価な全ての修飾または代替物は、添付の特許請求の範囲に示したような本発明の精神及び範囲内であることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａ及び１Ｂは、ＭＣＦ−７細胞によるコロニー形成に対するレチノイン酸（ＲＡ）の効果を示したグラフである。各アッセイにおいて、Ｐ１００あたり１．５×１０５個の細胞を、ＲＡの不在下または存在下でプレーティングした。クローン原性アッセイのために、処理後に細胞をトリプシン処理し、Ｐ１００あたり２，５００個の細胞をプレーティングし、薬物を含まない培地中で育成した。少なくとも６０〜８０個の細胞を含むコロニーを、プレーティングの１２〜１４日後に計測し；これらの結果を、非処理細胞により形成されたコロニー数により規準化した。各点は、三重アッセイの平均及び標準誤差を示す。図１Ａは、示した日数の間、１００ｎＭのＲＡで処理した効果を示す。図１Ｂは、示した用量のＲＡで４０時間処理した効果を示す。
【図２】
図２Ａから２Ｃは、実施例１に記載したようなレチノイド誘導性遺伝子の発現の変化をＲＴ−ＰＣＲにより解析した結果を示す。各遺伝子の実体の後に、ＮＣＢＩ受託番号（括弧内）を示す。図２Ａは、１００ｎＭのＲＡの添加後の表示された日における、遺伝子発現の変化の時間経緯を示す。「Ｒ５」及び「Ｒ８」の名称は、それぞれ、５日間のＲＡ処理による放出の５日後及び８日後に対応する。図２Ｂは、示した用量のＲＡで４０時間処理した効果を示す。図２Ｃは、１μＭのフェンレチニドの添加後の指定した日にちにおける、遺伝子発現の変化の時間経緯を示す。
【図３】
図３Ａは顕微鏡写真であり、図３Ｂは、ＲＡ処理細胞における、ＩＧＦＢＰ−３、ＨＩＦ２α／ＥＰＡＳ−１及びＥＰＬＩＮタンパク質の誘導を示したイムノブロットの写真である。図３Ａは、非処理ＭＣＦ−７細胞、及び５日間１００ｎＭのＲＡで処理した細胞における、ＩＧＦＢＰ−３、ＨＩＦ２α／ＥＰＡＳ−１及びＥＰＬＩＮの免疫細胞化学解析の結果を示す。図３Ｂは、非処理ＭＣＦ−７細胞、及び、指定した日数の間１００ｎＭのＲＡで処理した細胞における、ＥＰＬＩＮのイムノブロット解析を示す。
（発明の背景）
本出願は、２０００年５月２６日に提出された、米国仮特許出願番号第６０／２０７，５３５号の優先権を主張する。
【０００２】
本出願は、国立衛生研究所からの補助金、ＲＯ１ＣＡ６２０９９により支援された。政府は、本発明にある権利を有し得る。
【０００３】
１．発明の分野
本発明は、細胞遺伝子発現の変化、及び、細胞遺伝子発現の変化をもたらす化合物に関する。特に、本発明は、その発現が、レチノイン酸及びビタミンＡに化学的に関連しているレチノイドとして知られる分類の化合物により調節される遺伝子の同定に関する。より具体的には、本発明は、これらの細胞遺伝子の発現を調節するレチノイド以外の化合物を同定する方法を提供する。本発明はまた、レチノイドにより調節される遺伝子のプロモーターの転写制御下でリポーター遺伝子を発現する組換え発現作成物を含む組換え哺乳動物細胞である試薬、及び、これらの細胞遺伝子の発現を調節するレチノイド以外の化合物を同定するために該細胞を使用する方法を提供する。
【０００４】
２．関連分野の要約
レチノイドは、ビタミンＡの天然または合成誘導体である。それらは、リガンド依存的な転写因子として作用する核受容体に結合することにより、転写レベルで細胞成長及び分化を調節する分類の臨床的に重要な分化剤を含む。これらの化合物は、レチノイド受容体を発現するインビボ及びインビトロで多くの腫瘍細胞型における、細胞分化または末端増殖停止を誘導し（Ｗａｒｒｅｌｌ、１９９７、癌、腫瘍学の原理及び実践（ＤｅＶｉｔａら編）、４８３〜４９０頁（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ、フィラディルフィア）、これによりそれらは、前骨髄球性白血病などのいくつかの癌の処置及び癌化学防御に有用となっている。
【０００５】
レチノイド作用の標的は細胞核であり、レチノイドは、ＲＡＲ（レチノイン酸受容体）及びＲＸＲ（レチノイドＸ受容体）と呼ばれる、２種類の受容体に結合する（Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆら、１９９４、「レチノイド受容体」レチノイド：生物学、化学及び医学、Ｓｐｏｒｎら編、ニューヨーク；Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、３１９〜３５１頁）。レチノイド結合受容体分子は、転写因子として作用する、ホモ（ＲＸＲ−ＲＸＲ）及びヘテロダイマー（ＲＡＲ−ＲＸＲ）を形成する。これらのダイマーは、ＲＡＲＥ（レチノイン酸応答エレメント）と呼ばれるレチノイド応答性標的遺伝子のプロモーターにおける特異的シス調節配列に結合し、その転写を調節する。遺伝子発現の生じた変化は、標的遺伝子発現のレチノイド受容体調節により直接に、または、レチノイド活性化シグナル伝達経路、例えば、転写因子ＡＰ−１により活性化される経路の作用により間接的に引き起こされる。これらの遺伝子発現変化は、最終的に、レチノイドの成長抑制作用に関与する（Ｗａｒｒｅｌｌ、同上）。
【０００６】
レチノイドは、癌処置においていくつかの臨床的な成功を示したが、その使用は、耐性の発達（Ｍｉｌｌｅｒら、１９９８、Ｃａｎｃｅｒ ８３：１４７１〜１４８２）または毒性という、少なくとも２つの因子により制限されている。耐性の発達は、一部には、レチノイン酸受容体及びレチノイド受容体を介した経路の変化による（Ｍｉｌｌｅｒら、同書）。毒性は、一般に、レチノイドによる処置により生じる遺伝子発現の多面発現変化から生じる、レチノイドの広範な生理的結果に帰せられる。
【０００７】
以前、上皮細胞において数個の成長抑制遺伝子が、レチノイドにより誘導されることが判明した。しかし、これらの遺伝子のいずれも、単独ではレチノイドの成長抑制作用に関与していないことが示された。
【０００８】
Ａｄａｍｏら、１９９２、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３１：１８５８〜１８６６は、乳癌細胞系におけるインシュリン様成長因子結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ−３）の誘導を開示した。
【０００９】
Ｓｗｉｓｓｈｅｌｍら、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：４４７２〜４４７６は、別のインシュリン様成長因子結合タンパク質であるＩＧＦＢＰ−７（インシュリン様成長因子結合タンパク質関連タンパク質１すなわちＩＧＦＢＰ−ｒＰ１、及びｍａｃ２５としても知られる）を、フェンレチニド（４−ヒドロキシフェニルレチナミド、４−ＨＰＲ）による細胞の処置により誘導されるタンパク質として同定した。このタンパク質はまた、哺乳動物癌細胞系において下方制御されることが示された。
【００１０】
Ｋａｔｏら、１９９６、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １２：１３６１〜１３６４は、ｍａｃ２５ｃＤＮＡの骨肉腫細胞系への導入により成長が阻害されたことを示した。
【００１１】
Ｇｕｃｅｖら、１９９６、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：１５４５〜１５５０は、ＩＧＦＢＰ−３を、全トランスレチノイン酸（ＲＡ）及びトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）の両方により、乳癌細胞で誘導されるタンパク質として同定した。これらの細胞におけるＲＡ媒介成長抑制は、ＩＧＦＢＰ−３発現を阻害する細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入することにより、または、外来性ＩＧＦＢＰ−３を細胞に導入することにより軽減した。
【００１２】
ＤｉＳｅｐｉｏら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１４８１１〜１４８１５は、推定腫瘍サプレッサー遺伝子である、タザロテン誘導遺伝子３（ＴＩＧ−３、レチノイド誘導性遺伝子１、すなわちＲＩＧ−１としても知られる）は、初期ヒトケラチノサイトにおいて誘導されることを示した。ＴＩＧ−３は、癌細胞での発現の減少を示し、発現時には癌細胞の成長を阻害し、そして、既知の腫瘍サプレッサー遺伝子Ｈ−ｒｅｖ１０７と配列相同性を共有する。
【００１３】
Ｈｕａｎｇら、２０００、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１５９：１５〜２４は、ＴＩＧ−３が、インビトロでの胃癌細胞系においてレチノイドにより誘導されたことを示した。
【００１４】
Ｌｉｕら、２０００、Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１２６：８５〜９０は、肝癌細胞系における転移サプレッサー遺伝子ｎｍ２３−Ｈ１のＲＡ誘導発現を報告した。
【００１５】
従来技術の教義により、レチノイド媒介成長抑制の１つの機序は、腫瘍サプレッサー遺伝子、及び、抑制されているか、または、その発現が腫瘍細胞において下方制御されている、腫瘍サプレッサー遺伝子及び他の成長抑制遺伝子の活性化（または再活性化）であることが示唆される。しかし、当分野の報告は、レチノイド誘導成長停止の条件下で活性化される成長抑制遺伝子の実体または数を示すことができていない。かかる報告はまた、レチノイド誘導遺伝子が、そのプロモーター中のＲＡＲＥ部位を通して直接誘導されたのか、または間接的に誘導されたのかを示すことができていない。後者の場合、レチノイドに応答性ではない細胞においてさえ、該成長抑制遺伝子を活性化することが可能であろう。
【００１６】
当分野には、発現がレチノイドにより調節される遺伝子、特に、レチノイドにより間接的に誘導される成長抑制遺伝子を同定する必要が依然としてある。また、当分野には、レチノイド調節される細胞遺伝子、特に成長抑制遺伝子の発現に対する、化合物の作用を評価する方法を開発する必要がある。さらに、現在の臨床使用において、耐性が容易に発達せず、レチノイドの毒性及び他の全身的副作用のない、細胞遺伝子発現に対するレチノイドの作用を模倣した代替の化合物を開発する必要がある。
【００１７】
（発明の要約）
本発明は、発現がレチノイドにより調節される遺伝子、並びに、該化合物に対する耐性または毒性を引き起こすことなく、レチノイドの作用を模倣する化合物を同定するための試薬及び方法を提供する。
【００１８】
第一の態様において、本発明は、遺伝子の発現がレチノイドにより誘導され、ＲＡＲＥ部位を含まない、遺伝子に由来するプロモーターに作動可能に連結したリポーター遺伝子をコードする組換え発現作成物を提供する。好ましい実施形態において、リポーター遺伝子は、ホタルルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑蛍光タンパク質、またはアルカリホスファターゼをコードする。好ましいレチノイドは、全トランスレチノイン酸、フェンレチニド、９−シスレチノイン酸、１３−シスレチノイン酸、エトレチナートおよびレチノール（ビタミンＡ）を含む。本発明の組換え発現作成物を含む最も好ましいプロモーターは、レチノイドにより誘導され、成長抑制活性を示すことが知られている、細胞遺伝子由来のプロモーターである。好ましい実施形態において、細胞遺伝子プロモーターは、ヒトインシュリン様成長因子結合タンパク質−３（ＩＧＦＢＰ−３；配列番号１）、分泌細胞接着タンパク質βＩＧ−Ｈ３（配列番号２）、新生物に欠失した上皮タンパク質（ＥＰＬＩＮ；配列番号３）、ユビキチン様タンパク質ＦＡＴ１０（配列番号４）、プロテアソームアクチベーターＰＡ２８サブユニットα（ＰＡ２８α；配列番号５）、Ｍａｃ−２結合タンパク質（Ｍａｃ−２ＢＰ；配列番号６）、プロテインＣ阻害剤（ＰＣＩ；配列番号７）、Ｔ細胞受容体γ（配列番号８）、レチナールオキシダーゼ（配列番号９）、Ｂｅｎｅ（配列番号１０）、ＨＩＦ−２α／ＥＰＡＳ−１（配列番号１１）またはセレクチンＬ（配列番号１２）に由来する。特に好ましい実施形態において、プロモーターは、ヒトインシュリン様成長因子結合タンパク質−３（ＩＧＦＢＰ−３；配列番号１）、分泌細胞接着タンパク質βＩＧ−Ｈ３（配列番号２）、新生物に欠失した上皮タンパク質（ＥＰＬＩＮ；配列番号３）、ユビキチン様タンパク質ＦＡＴ１０（配列番号４）、またはプロテアソームアクチベーターＰＡ２８サブユニットα（ＰＡ２８α；配列番号５）である。
【００１９】
第二の実施形態において、本発明は、レチノイド誘導性細胞遺伝子由来のプロモーターの転写制御下にあるリポーター遺伝子をコードする、発明の組換え発現作成物を含む哺乳動物細胞を提供する。好ましい実施形態において、リポーター遺伝子は、ホタルルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセトルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑蛍光タンパク質、またはアルカリホスファターゼをコードする。好ましいレチノイドは、全トランスレチノイン酸、フェンレチニド、９−シスレチノイン酸、１３−シスレチノイン酸、エトレチナート及びレチノールを含む。発明の組換え発現作成物を含む最も好ましいプロモーターは、レチノイドにより誘導され、成長抑制活性を有することが知られている細胞遺伝子由来の、または、ヒトインシュリン様成長因子結合タンパク質−３（ＩＧＦＢＰ−３；配列番号１）、分泌細胞接着タンパク質βＩＧ−Ｈ３（配列番号２）、新生物に欠失した上皮タンパク質（ＥＰＬＩＮ；配列番号３）、ユビキチン様タンパク質ＦＡＴ１０（配列番号４）、プロテアソームアクチベーターＰＡ２８サブユニットα（ＰＡ２８α；配列番号５）、Ｍａｃ−２結合タンパク質（Ｍａｃ−２ＢＰ；配列番号６）、プロテインＣ阻害剤（ＰＣＩ；配列番号７）、Ｔ細胞受容体γ（配列番号８）、レチナールオキシダーゼ（配列番号９）、Ｂｅｎｅ（配列番号１０）、ＨＩＦ−２α／ＥＰＡＳ−１（配列番号１１）またはセレクチンＬ（配列番号１２）由来のプロモーターである。特に好ましい実施形態において、プロモーターは、ヒトインシュリン様成長因子結合タンパク質−３（ＩＧＦＢＰ−３；配列番号１）、分泌細胞接着タンパク質βＩＧ−Ｈ３（配列番号２）、新生物に欠失した上皮タンパク質（ＥＰＬＩＮ；配列番号３）、ユビキチン様タンパク質ＦＡＴ１０（配列番号４）、またはプロテアソームアクチベーターＰＡ２８サブユニットα（ＰＡ２８α；配列番号５）に由来する。
【００２０】
第三の実施形態において、本発明は、哺乳動物細胞においてレチノイド誘導性遺伝子の発現を誘導する化合物を同定する方法を提供する。この方法では、レチノイド誘導性細胞遺伝子由来のプロモーターの転写制御下にあるリポーター遺伝子をコードする本発明の組換え発現作成物を含む本発明に記載の組換え哺乳動物細胞を、化合物の存在下及び不在下で哺乳動物細胞において少なくとも１つのレチノイド誘導遺伝子の発現を誘導する条件下で培養する。化合物の存在下における細胞のリポーター遺伝子発現を、化合物の不在下における該細胞のリポーター遺伝子発現と比較する。リポーター遺伝子発現が、化合物の不在下よりも化合物の存在下の方が高い場合に、レチノイド誘導遺伝子発現を誘導する化合物と同定する。好ましい実施形態において、リポーター遺伝子は、ホタルルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセトルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑蛍光タンパク質、またはアルカリホスファターゼをコードする。好ましいレチノイドは、全トランスレチノイン酸、フェンレチニド、９−シスレチノイン酸、１３−シスレチノイン酸、エトレチナート及びレチノールを含む。本発明の組換え発現作成物を含む最も好ましいプロモーターは、レチノイドにより誘導され、成長抑制活性を示すことが知られるか、または、ヒトインシュリン様成長因子結合タンパク質−３（ＩＧＦＢＰ−３；配列番号１）、分泌細胞接着タンパク質βＩＧ−Ｈ３（配列番号２）、新生物に欠失した上皮タンパク質（ＥＰＬＩＮ；配列番号３）、ユビキチン様タンパク質ＦＡＴ１０（配列番号４）、プロテアソームアクチベーターＰＡ２８サブユニットα（ＰＡ２８α；配列番号５）、Ｍａｃ−２結合タンパク質（Ｍａｃ−２ＢＰ；配列番号６）、プロテインＣ阻害剤（ＰＣＩ；配列番号７）、Ｔ細胞受容体γ（配列番号８）、レチナールオキシダーゼ（配列番号９）、Ｂｅｎｅ（配列番号１０）、ＨＩＦ−２α／ＥＰＡＳ−１（配列番号１１）またはセレクチンＬ（配列番号１２）に由来する、細胞遺伝子のプロモーターである。特に好ましい実施形態において、プロモーターは、ヒトインシュリン様成長因子結合タンパク質−３（ＩＧＦＢＰ−３；配列番号１）、分泌細胞接着タンパク質βＩＧ−Ｈ３（配列番号２）、新生物に欠失した上皮タンパク質（ＥＰＬＩＮ；配列番号３）、ユビキチン様タンパク質ＦＡＴ１０（配列番号４）、またはプロテアソームアクチベーターＰＡ２８サブユニットα（ＰＡ２８α；配列番号５）に由来する。好ましい実施形態において、リポーター遺伝子の発現は、免疫学的試薬を使用して、相補的で検出可能なように標識された核酸に対するハイブリダイゼーションにより、または、リポーター遺伝子産物の活性を検出することにより検出する。
【００２１】
第四の実施形態において、本発明は、哺乳動物細胞においてレチノイド誘導性遺伝子の発現を誘導する化合物の同定法を提供する。本発明のこの態様において、哺乳動物細胞を、化合物の存在下及び不在下で培養する。その後、細胞を、発現がレチノイドにより誘導される少なくとも１つの細胞遺伝子の発現についてアッセイする。下位区分（ｂ）の細胞遺伝子の発現が、化合物の不在下よりも化合物の存在下の方が高い場合、哺乳動物細胞においてレチノイド誘導性遺伝子の発現を誘導する化合物と同定する。好ましいレチノイドは、全トランスレチノイン酸、フェンレチニド、９−シスレチノイン酸、１３−シスレチノイン酸、エトレチナートまたはレチノールを含む。遺伝子は、レチノイドにより誘導され、成長抑制活性またはヒトインシュリン様成長因子結合タンパク質−３（ＩＧＦＢＰ−３；ＮＣＢＩ受託番号Ｍ３５８７８．１）、分泌細胞接着タンパク質βＩＧ−Ｈ３（受託番号ＡＣ００４５０３．１）、新生物に欠失した上皮タンパク質（ＥＰＬＩＮ；受託番号ＡＨ００９３８２．１）、ユビキチン様タンパク質ＦＡＴ１０（受託番号ＡＬ０３１９８３）、Ｍａｃ−２結合タンパク質（Ｍａｃ−２ＢＰ；受託番号Ｕ９１７２９）、プロテインＣ阻害剤（ＰＣＩ；受託番号ＡＬ０４９８３９．３）、Ｔ細胞受容体γ（受託番号ＡＣ００６０３３．２）、レチナールオキシダーゼ（受託番号ＡＦ０１０２６０）、Ｂｅｎｅ（受託番号ＡＰ００１２３４．３）、ＨＩＦ−２α／ＥＰＡＳ−１（受託番号ＮＴ＿００５０６５．３）、セレクチンＬ（受託番号ＡＬ０２１９４０．１）、またはプロテアソームアクチベーターＰＡ２８サブユニットα（ＰＡ２８α；受託番号ＡＬ１３６２９５．２）を有することが知られている細胞遺伝子である。特に好ましい実施形態において、遺伝子は、ヒトＩＧＦＢＰ−３、βＩＧ−Ｈ３、ＥＰＬＩＮ、ＦＡＴ１０またはＰＡ２８αである。好ましい実施形態において、細胞遺伝子の発現は、免疫学的試薬を使用して、相補的で検出可能なように標識された核酸に対するハイブリダイゼーションにより、または、遺伝子産物の活性を検出することにより検出する。
【００２２】
本発明は、癌を有する動物を処置して、疾患を予防または寛解するための方法も提供する。この態様において、レチノイド誘導遺伝子の発現を誘導する本発明により同定される化合物の治療有効投与量を、それを必要とする動物、最も好ましくはヒトに投与する。
【００２３】
本発明の特に好ましい実施形態は、ある好ましい実施形態及び特許請求の範囲の以下のより詳細な説明から明らかとなろう。
【００２４】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明は、レチノイドにより発現が誘導される遺伝子を提供する。本発明はまた、レチノイドの遺伝子発現誘導特性を模倣しているが、レチノイド処理に特徴的である毒性及び細胞が耐性を発達する傾向のない、化合物を同定するための、試薬及び方法も提供する。
【００２５】
本発明者らは、ヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞などのレチノイド感受性細胞のレチノイドによる処理は、レチノイド誘導性遺伝子のコホートを含む遺伝子群の発現を誘導すると決定した。これらの遺伝子のいくつかは成長抑制遺伝子、すなわち、その発現が腫瘍細胞の成長または腫瘍原性を阻害する遺伝子である。これらの遺伝子は、とりわけ、腫瘍細胞、及び、不適切にまたは病原的に増殖する他の細胞において、その成長を阻害するために、誘導すべき標的として重要である。発現がレチノイドにより調節可能である遺伝子は、ＲＡＲＥと呼ばれる、そのプロモーターに特定のクラスの配列を含むことが当分野では知られていた（Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆら、１９９４、レチノイド：生物学、化学、及び医学、（Ｓｐｏｒｎら編）、３２７〜３３０頁（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク）。しかし、驚くべきことに、本発明者らにより決定されたＭＣＦ−７細胞でレチノイドにより最も強力に誘導される１つの遺伝子を除く全ての遺伝子が、そのプロモーターに該ＲＡＲＥ配列を含まなかった。この意外な結果により、レチノイドは、これらの遺伝子のＲＡＲＥ配列へのＲＸＲホモダイマーまたはＲＡＲ−ＲＸＲヘテロダイマー結合を必要としない機序により、これらの遺伝子を間接的に活性化することが示された。この結果により、レチノイド以外の化合物は、レチノイド感受性及びレチノイド非感受性細胞の両方において、これらの（及び、おそらく他の）成長抑制遺伝子の発現を誘導できるはずであることが示唆された。本発明より前には、レチノイド非感受性細胞を、レチノイド誘導性成長抑制遺伝子を発現するように誘導できることを疑う理由はなかった。
【００２６】
本明細書に開示したのは、哺乳動物細胞において成長抑制効果を有する数個の遺伝子を含む、１３個のレチノイド誘導性遺伝子の本発明者らによる発見である。当業者は、これらの結果は完全ではなく、他の成長抑制遺伝子も、哺乳動物細胞においてレチノイドにより誘導され得ることを理解するだろう。本結果を鑑みて、当業者はまた、これらの追加的な遺伝子のいくつかは、そのプロモーターにＲＡＲＥ配列を欠き、従って、レチノイドにより間接的に誘導されると期待されることを理解するだろう。本明細書に開示したように、プロモーターにＲＡＲＥ配列を欠いたレチノイド誘導性遺伝子は、細胞増殖に対する生理学的に基づいた成長抑制効果を模倣したレチノイド以外の化合物を同定するための有用な標的である。該化合物の同定は、有利には、哺乳動物細胞、特に腫瘍細胞及び不適切または病的に増殖する他の細胞において、成長停止を引き起こす代替的な薬剤を提供する。該化合物は、レチノイドの成長抑制効果を模倣できるので有益である。
【００２７】
該化合物の別の利点は、従来技術で既知の他の成長抑制化合物で見られる全身性副作用を引き起こすことなく、成長抑制効果を示すことを期待できることである。例えば、従来技術で既知の多くの成長抑制薬物及び化合物は、不利には、ｐ２１遺伝子発現を誘導し、これは、その発現が、本明細書に参考として取込んだ、疾患、特に年齢関連疾患、例えばアルツハイマー病、アテローム性動脈硬化症、腎疾患、及び関節炎の発達に関連している（２００１年２月１日に提出された共所有及び同時係属米国特許出願番号第６０／＿＿＿＿＿（代理人名簿番号９９，２１６−Ｅ）及び２００１年５月２１日に提出された米国特許出願番号第０９／＿＿＿＿＿（代理人名簿番号９９，２１６−Ｆ）、複数の遺伝子を活性化することにより老化、成長停止及びアポトーシスを誘導する。これに対し、ＭＣＦ−７細胞におけるレチノイン酸誘導成長抑制は、ｐ２１を誘導しない（Ｚｈｕら、１９９７、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．２３４：２９３〜２９９）。レチノイドにより誘導される本明細書に同定した遺伝子は、動物で発現した場合に、疾患或いは不利または病的な作用に関連していないことが知られている。従って、本明細書に同定した１つまたは複数の遺伝子の発現を誘導することによるレチノイドの成長抑制効果を模倣した該化合物の同定により、かかる副作用は減少または全く示さないことが期待でき、これによりそれらは、抗腫瘍及び他の療法のより良好な薬剤となる。従って、当分野で既知の成長抑制化合物の毒性副作用を引き起こすことなくレチノイドの成長抑制効果を模倣した化合物の発見は、有利には、本発明により提供される。
【００２８】
本明細書に提供したように、レチノイドに応答性であるがそのプロモーターにＲＡＲＥ部位を含まない哺乳動物遺伝子は、ヒトインシュリン様成長因子結合タンパク質−３（ＩＧＦＢＰ−３；ＮＣＢＩ受託番号Ｍ３５８７８．１）、分泌細胞接着タンパク質βＩＧ−Ｈ３（受託番号ＡＣ００４５０３．１）、新生物に欠失した上皮タンパク質（ＥＰＬＩＮ；受託番号ＡＨ００９３８２．１）、ユビキチン様タンパク質ＦＡＴ１０（受託番号ＡＬ０３１９８３）、Ｍａｃ−２結合タンパク質（Ｍａｃ−２ＢＰ；受託番号Ｕ９１７２９）、プロテインＣ阻害剤（ＰＣＩ；受託番号ＡＬ０４９８３９．３）、Ｔ細胞受容体γ（受託番号ＡＣ００６０３３．２）、レチナールオキシダーゼ（受託番号ＡＦ０１０２６０）、Ｂｅｎｅ（受託番号ＡＰ００１２３４．３）、ＨＩＦ−２α／ＥＰＡＳ−１（受託番号ＮＴ＿００５０６５．３）、セレクチンＬ（受託番号ＡＬ０２１９４０．１）またはプロテアソームアクチベーターＰＡ２８サブユニットα（ＰＡ２８α；受託番号ＡＬ１３６２９５．２）を含む。
【００２９】
本発明の目的では、「細胞」または「細胞群」なる言及は等価であるとし、特に、当分野で既知のように育成及び維持された哺乳動物細胞のインビトロ培養物を包含する。
【００３０】
本発明の目的では、複数形の「細胞遺伝子」の言及は、単一の遺伝子並びに２つ以上の遺伝子を包含するものとする。また、細胞遺伝子発現、または、細胞遺伝子に由来するプロモーターの転写制御下にあるリポーター作成物の調節の効果を、第一遺伝子で検出でき、その後、該効果を、第二または任意の数の追加的な遺伝子またはリポーター遺伝子作成物を試験することにより複製できることが当業者により理解されるだろう。または、２つ以上の遺伝子またはリポーター遺伝子作成物の発現を同時に本発明の範囲内でアッセイできる。
【００３１】
本明細書に使用したような、「ＲＡＲＥ部位」なる語は、１つ、２つまたは５つのヌクレオチドだけ離れた、２つの六量体コアモチーフ（Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆら、１９９４、レチノイド：生物学、化学、及び医学（Ｓｐｏｒｎら編）、３２７〜３３０頁（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク）に定義の通り）を包含するものとし、ここでの六量体モチーフは、直列、逆方向または回文構造反復として整列している。
【００３２】
本発明者らは、ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞を、低用量のレチノイドで処理すると、最小限の細胞毒性を伴い次第に成長停止及び細胞老化の表現型特徴を誘導する（Ｃｈａｎｇら、１９９９、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：３７６１〜３７６７）。比較的低用量のＲＡが、ＭＣＦ−７細胞において不可逆的な成長停止を誘導することが判明したが、細胞死により引き起こされる細胞数の減少はほんの僅かであった。「低用量」のＲＡ（１０〜１００ｎＭ）によるこの効果が顕現するのには、４〜６日間の連続的なＲＡへの暴露が必要であった。低用量のレチノイド処理は、拡大し平坦な細胞形態の発達及び老化関連マーカーＳＡ−β−ガラクトシダーゼ（ＳＡ−β−ｇａｌ）の発現を含む、細胞老化に特徴的な処理細胞における表現型特徴の発達を伴った。ＳＡ−β−ｇａｌの誘導も、フェンレチニドでの処理後にインビボでＭＣＦ−１０Ｔ新哺乳動物上皮細胞の異種移植片で観察された。これらの結果により、レチノイド処理は、細胞分裂停止用量で投与した場合に、インビボ及びインビトロで、腫瘍細胞に老化を誘導することが示唆された。
【００３３】
老化は、当業者に既知の多くの方法で哺乳動物細胞に誘導できる。例えば、老化は、インビボまたはインビトロで、正常な細胞成長の当然の結果であり：正常細胞が老化する前に受けることのできる、細胞分裂、継代または世代の数は限定されている。正確な数は、細胞型及び起源種により変化する（Ｈａｙｆｌｉｃｋ＆Ｍｏｏｒｈｅａｄ、１９６１、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．２５：５８５〜６２１）。老化はまた、大半の抗癌薬または照射などの細胞毒性薬物での処理により、正常及び腫瘍細胞の両方に誘導できる。Ｃｈａｎｇら、１９９９、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：３７６１〜３７６７参照。老化はまた、その細胞に、腫瘍サプレッサー遺伝子（例えばｐ５３、ｐ２１、ｐ１６またはＲｂ）を形質導入し、そこで該遺伝子を発現することにより、任意の哺乳動物細胞で迅速に誘導できる。Ｓｕｇｒｕｅら、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：９６４８〜９６５３；Ｕｈｒｂｏｒｎら、１９９７、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １５：５０５〜５１４；Ｘｕら、１９９７、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １５：２５８９〜２５９６；Ｖｏｇｔら、１９９８、Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．９：１３９〜１４６参照。哺乳動物細胞に老化を誘導するこれら及び他の手段並びに方法は、当業者により認識及び理解され、本発明の範囲内に該当する。
【００３４】
本発明の試薬は、レチノイドに応答して細胞遺伝子発現を誘導できる、任意の哺乳動物細胞、好ましくは齧歯類または霊長類細胞、より好ましくはマウス細胞、最も好ましくはヒト細胞を含み、該遺伝子は、遺伝子工学により導入した内因性遺伝子または外来性遺伝子である。好ましい細胞は、哺乳動物細胞、好ましくは齧歯類または霊長類細胞、より好ましくはマウスまたはヒト細胞を含む。
【００３５】
組換え発現作成物は、当業者に理解されているような適切な哺乳動物細胞に導入できる。該作成物の好ましい実施形態は、当分野で既知のような、感染性ベクター、より好ましくはウイルスベクター、最も好ましくはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、及びワクシニアウイルスベクターで作成する。一般に、哺乳動物細胞、生物工学：実践的なアプローチ（Ｂｕｔｌｅｒ編）、オックスフォード大学出版：ニューヨーク、１９９１、５７〜８４頁参照。
【００３６】
本発明はまた、リポーター遺伝子が、発現がレチノイドにより誘導される遺伝子のプロモーターの転写制御下にある、組換え発現作成物を提供する。本発明のこの態様の好ましい実施形態において、レチノイドは、全トランスレチノイン酸、フェンレチニド、９−シスレチノイン酸、１３−シスレチノイン酸、エトレチナートまたはレチノールである。好ましい実施形態において、プロモーターは、発現が、レチノイドによる細胞の処理によって誘導または別様に増加する遺伝子に由来し、好ましくは、ヒトインシュリン様成長因子結合タンパク質−３（ＩＧＦＢＰ−３；配列番号１）、分泌細胞接着タンパク質βＩＧ−Ｈ３（配列番号２）、新生物に欠失した上皮タンパク質（ＥＰＬＩＮ；配列番号３）、ユビキチン様タンパク質ＦＡＴ１０（配列番号４）、プロテアソームアクチベーターＰＡ２８サブユニットα（ＰＡ２８α；配列番号５）、Ｍａｃ−２結合タンパク質（Ｍａｃ−２ＢＰ；配列番号６）、プロテインＣ阻害剤（ＰＣＩ；配列番号７）、Ｔ細胞受容体γ（配列番号８）、レチナールオキシダーゼ（配列番号９）、Ｂｅｎｅ（配列番号１０）、ＨＩＦ−２α／ＥＰＡＳ−１（配列番号１１）、またはセレクチンＬ（配列番号１２）に由来する。最も好ましくは、プロモーターは、ヒトインシュリン様成長因子結合タンパク質−３（ＩＧＦＢＰ−３；配列番号１）、分泌細胞接着タンパク質βＩＧ−Ｈ３（配列番号２）、新生物に欠失した上皮タンパク質（ＥＰＬＩＮ；配列番号３）、ユビキチン様タンパク質ＦＡＴ１０（配列番号４）、またはプロテアソームアクチベーターＰＡ２８サブユニットα（ＰＡ２８α；配列番号５）、Ｍａｃ−２結合タンパク質（Ｍａｃ−２ＢＰ；配列番号６）、プロテインＣ阻害剤（ＰＣＩ；配列番号７）、Ｔ細胞受容体γ（配列番号８）、レチナールオキシダーゼ（配列番号９）、Ｂｅｎｅ（配列番号１０）、ＨＩＦ−２α／ＥＰＡＳ−１（配列番号１１）またはセレクチンＬ（配列番号１２）に由来する。最も好ましくは、プロモーターは、ヒトインシュリン様成長因子結合タンパク質−３（ＩＧＦＢＰ−３；配列番号１）、分泌細胞接着タンパク質βＩＧ−Ｈ３（配列番号２）、新生物に欠失した上皮タンパク質（ＥＰＬＩＮ；配列番号３）、ユビキチン様タンパクＦＡＴ１０（配列番号４）、またはプロテアソームアクチベーターＰＡ２８サブユニットα（ＰＡ２８α；配列番号５）に由来する。その後、これらのリポーター遺伝子は、レチノイド誘導遺伝子発現効果の高感度で簡便な指示薬として使用され、哺乳動物細胞でレチノイドの効果を模倣した化合物を容易に同定できる。これらの作成物用の宿主細胞は、任意の哺乳動物細胞を含む。本発明のこの態様の実践に有用なリポーター遺伝子は、蛍ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑蛍光タンパク質、及びアルカリホスファターゼを含むがこれに限定されない。
【００３７】
以下の実施例は、本発明のある好ましい実施形態をさらに説明するものであり、限定する性質のものではない。
【００３８】
（実施例１）
レチノイン酸での処理による遺伝子発現調節の解析
細胞学的及び遺伝子発現解析を実施して、ＭＣＦ−７細胞培養液に対するレチノイン酸処理の効果を決定した。
【００３９】
クローン原性アッセイを実施して、１００ｎＭのＲＡで様々な時間で処理した後に、ＭＣＦ−７細胞における増殖能の差異を解析した。細胞を、１〜７日間、１００ｎＭのＲＡに暴露し、各時間点における処理後のそのコロニー形成能について試験した。図１Ａに示したように、非処理対照に規準化したプレーティング効率は、１００ｎＭのＲＡと共に細胞をインキュベートする時間の経過と共に減少した。減少は、最初は急速で（ＲＡと共に２日間インキュベートした後にはプレーティング効率は１００％から４０％に）、７日目には最終プレーティング効率は約１０％までよりゆっくりと減少した。図１Ｂは、様々な濃度のＲＡにおける、ＭＣＦ−７細胞のプレーティング効率を示し；これらの結果は、全ての試験した用量における（１０ｎＭまで低い）プレーティング効率の用量依存的減少を示す。プレーティング効率の有意な減少が、細胞成長に対するレチノイドの効果の研究に慣用的に使用される濃度（≧１μＭ）よりもはるかに低い濃度で観察された。
【００４０】
これらの結果は、レチノイドにより調節された細胞遺伝子発現の変化に因る、細胞成長及び増殖能の減少と一致した。遺伝子発現変化を研究するために、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを、非処理ＭＣＦ−７細胞から、及び、１００ｎＭのＲＡで５日間処理した細胞から単離した。ｃＤＮＡを、これらのＲＮＡ個体群から調製し、ｃＤＮＡを、異なるヒト遺伝子及びＥＳＴの＞７，０００個のｃＤＮＡを含むｃＤＮＡマイクロアレイ（ヒトＵｎｉＧＥＭ Ｖ ｃＤＮＡマイクロアレイ、Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、ミズーリ州セントルイス）とハイブリダイズさせた。ｃＤＮＡプローブ合成、マイクロアレイとのハイブリダイゼーション、及びシグナル解析を、Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓの市販サービスにより実施した。
【００４１】
マイクロアレイ中のＲＮＡ処理細胞のどの遺伝子も、相対的なハイブリダイゼーション強度の２．５倍以上の増加、または、３倍以上の減少を示さなかった。マイクロアレイハイブリダイゼーションにおいて最大の差異を示した計４７個の遺伝子のＲＮＡレベルの変化を、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）解析により試験した。これらの中で、「平衡差次的発現」（相対的ハイブリダイゼーション強度の尺度）において、２７個の遺伝子が１．４〜２．５倍の増加を示し、２０個の遺伝子が１．７〜３．０倍の減少を示した。
【００４２】
ＲＴ−ＰＣＲ解析を、内部規準標準物質としてβ−アクチンを使用して、実質的に記載のように実施した（Ｎｏｏｎａｎら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：７１６０〜７１６４）。ＲＡにより最も強力に誘導された、１３個の遺伝子のＲＴ−ＰＣＲプライマーの配列及びＰＣＲ条件は以下の通りである：
【表１】
ＲＴ−ＰＣＲアッセイにより、４７個中４３個の遺伝子の発現の変化が確認され、１３個の上方制御された遺伝子が、マイクロアレイハイブリダイゼーションにより示されたよりもはるかに強力に（５〜１０倍以上）ＲＡにより誘導されたことが示唆され；これらの結果を図２Ａ及び２Ｂに示す。これらの１３個の遺伝子のＲＮＡレベルの変化の時間経緯の解析（図２Ａ）により、クローン原性の消失と平行して、ＲＡ処理の１から４日間の間に、その発現が増加したことが示された（図１Ａに示す）。遺伝子発現のＲＡ用量依存性の解析（図２Ｂに示す）により、これらのほぼ全ての遺伝子が、検出可能なクローン原性の消失をもたらした最も低い用量のＲＡ（１０ｎＭ）によってさえ誘導されることが示された。全１３個の遺伝子は、乳癌化学防御に使用される、１μＭの別のレチノイドであるフェンレチニドでの処理によっても誘導された（これらの結果は図２Ｃに示す）。
【００４４】
この群の３つの遺伝子の誘導を試験し、ＥＰＬＩＮに対するウサギポリクローナル抗体（ＵＣＬＡのＤａｖｉｄ Ｃｈａｎｇ博士より贈与）、及び、ＩＧＦＢＰ−３及びＥＰＡＳ−１／ＨＩＦ−２αに対するヤギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンタクルス）及び標準的な技術を使用して、図３Ａに示した免疫細胞化学アッセイにより、タンパク質レベルで確認した。抗体染色は、製造業者の指示に従って、ベクタステインキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ、カリフォルニア州バーリンゲーム）を使用して検出した。これらの結果により、ＲＡ処理細胞におけるＩＧＦＢＰ−３、ＥＰＡＳ−１／ＨＩＦ２α、及びＥＰＬＩＮｍＲＮＡの誘導は、対応するタンパク質の発現の増加を伴ったことが示される。
【００４５】
これらの結果により、ＲＡ及びフェンレチニドは、これらのレチノイドが細胞成長を阻害し老化表現型を誘導する条件下で、共通の遺伝子セットの発現を強力に誘導することが示された。
【００４６】
（実施例２）
レチノイン酸での処理により、ＭＣＦ−７細胞に誘導された遺伝子の生物学的機能
実施例１に考察したように検出した遺伝子は、文献探索により、レチノイドの細胞効果に関連した生物学的機能を有することが判明した。
【００４７】
顕著には、レチノイドにより強力に誘導された１３個中４個の遺伝子が、抗増殖活性を有すると報告されている。第一の遺伝子は、乳癌細胞でＲＡにより誘導可能であり、これらの細胞の成長を阻害することが示された分泌因子である、インシュリン様成長因子結合タンパク質−３（ＩＧＦＢＰ−３）をコードする（Ａｄａｍｏら、１９９２、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３１：１８５８〜１８６６；Ｇｕｃｅｖら、１９９６、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：１５４５〜１５５０）。ＩＧＦ隔絶におけるその役割に加えて、ＩＧＦＢＰ−３は、近年、レチノイド受容体ＲＸＲαに結合し、その転写活性を調節することが判明した（Ｌｉｕら、２０００、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３３６０７〜３３６１３）。ＩＧＦＢＰ−３の誘導は、図３Ａに示した免疫細胞化学アッセイにより確認した。
【００４８】
レチノイドでの処理により誘導される別の成長抑制遺伝子は、数個の細胞型においてＴＦＧ−βにより誘導可能である、分泌細胞接着タンパク質βＩＧ−Ｈ３をコードする（Ｓｋｏｎｉｅｒら、１９９２、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１：５１１〜５２２）。βＩＧ−Ｈ３の形質移入により、チャイニーズハムスター卵巣細胞の腫瘍原性が阻害されることが示された（Ｓｋｏｎｉｅｒら、１９９４、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３：５７１〜５８４）。βＩＧ−Ｈ３は、正常なヒト線維芽細胞では発現されるが、悪性形質転換されたヒト線維芽細胞では発現されず（Ｓｃｈｅｎｋｅｒ＆Ｔｒｕｅｂ、１９９８、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．２３９：１６１〜１６８）、これは、この遺伝子が腫瘍サプレッサーであり得ることを示唆する。
【００４９】
第三の遺伝子は、初期上皮細胞に発現されるが、異なる型の癌では下方制御されているアクチン結合タンパク質である、ＥＰＬＩＮと呼ばれるＬＩＭドメインタンパク質をコードする（Ｍａｕｌ＆Ｃｈａｎｇ、１９９９、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８：７８３８〜７８４１）。ＥＰＬＩＮの異所的発現は、骨肉腫細胞系で細胞増殖を抑制することが示された（ＭａｕｌとＣｈａｎｇ、同上）。ＥＰＬＩＮ遺伝子は、ＥＰＬＩＮα及びＥＰＬＩＮβという２つのタンパク質アイソフォームをコードし、大きい方の（β）アイソフォームが、より強力な成長抑制効果を示す。観察されたＥＰＬＩＮ遺伝子発現の誘導は、免疫細胞化学及びイムノブロットアッセイにより確認した（結果を図３Ａ及び３Ｂに示す）。これらのアッセイを、ＥＰＬＩＮに対するウサギポリクローナル抗体（ＵＣＬＡのＤａｖｉｄ Ｃｈａｎｇ博士より贈与）を使用して実施し、標準的な技術により実施した。抗体染色は、免疫細胞化学ではベクタステインキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）を使用して、イムノブロットではホースラディッシュペルオキシダーゼ抱合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を使用して検出した。ＭＣＦ−７細胞におけるＥＰＬＩＮの電気泳動移動度（１１０ｋＤａ；図３Ｂ）は、βアイソフォームに対応し、これは、このアイソフォームによるより強力な成長抑制を示した当該技術に一致する。
【００５０】
第四の遺伝子は、ユビキチン様タンパク質ＦＡＴ１０をコードする。ＦＡＴ１０は、紡錘体タンパク質Ｍａｄ２と相互作用し、ＨｅＬａ癌細胞におけるその過剰発現は、細胞生存に有害であると報告された（Ｌｉｕら、１９９９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：４３１３〜４３１８）。
【００５１】
レチノイン酸処理は、レチノイン酸受容体ＲＡＲα（Ｚｈｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１４８０７〜１４８１２）及びサイクリンＤ（Ｓｐｉｎｅｌｌａら、１９９９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２２０１３〜２２０１８）のプロテアソームを介した分解を促進することが知られている。プロテアソームを介したサイクリンＤの分解は、レチノイド誘導成長停止の機序として提唱されている（Ｓｐｉｎｅｌｌａら、同上）。顕著なことには、ＲＡ誘導遺伝子の１つが、プロテアソームアクチベーターＰＡ２８サブユニットα（ＰＡ２８α）をコードしている。ＰＡ２８αの発現は、プロテアソームを活性化するのに十分であり（Ｇｒｏｅｔｔｒｕｐら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ ３８１：１６６〜１６８）、この遺伝子の誘導は、少なくとも一部には、レチノイドによるプロテアソーム活性化を説明し得る。それ故、Ｐａ２８αは別の成長抑制剤と捉えることができる。
【００５２】
さらに別のＲＡ誘導遺伝子は、ビタミンＡからＲＡを合成する第一段階を触媒する酵素である、レチナールオキシダーゼ（アルデヒドオキシダーゼ）をコードしている（Ｈｕａｎｇら、１９９９、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３６４：２６４〜２７２）。観察されたレチナールオキシダーゼの誘導により、レチノイド処理は、処理細胞におけるＲＡ合成を刺激し得、正のフィードバック機序を提供する可能性があることが示唆される。
【００５３】
βＩＧ−Ｈ３とは別に、２つの他の誘導遺伝子は、老化に似た平板な形態及びＲＡ処理ＭＣＦ−７細胞の接着の増加に寄与し得る、分泌タンパク質をコードする。これらの１つは、細胞外マトリックスの細胞接着因子であるＭａｃ−２結合タンパク質（Ｍａｃ−２ＢＰ）をコードしている（Ｓａｓａｋｉら、１９９８、ＥＭＢＯ Ｊ．１７：１６０６〜１６１３）。Ｍａｃ−２ＢＰはまた、ｐ２１により誘導されたヒト線維肉腫細胞の老化でも上方制御されている（Ｃｈａｎｇら、２０００、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：４２９１〜４２９６）。他の遺伝子は、普通肝臓により産生される非特異的セリンプロテアーゼ阻害剤である、プロテインＣ阻害剤（ＰＣＩ）をコードしている。レチノイド処理ＭＣＦ−７細胞は、老化マーカーを発現しているが、この細胞系でＲＡにより強力に誘導されるどの遺伝子も、上皮細胞分化に関与していない。しかし、誘導遺伝子の２つは、白血球ホーミング受容体Ｌ−セレクチン及びＴ細胞受容体を含む、造血系統に特異的な膜貫通タンパク質をコードしている。これらの遺伝子の誘導は、造血悪性疾患におけるレチノイドの十分に文書化されている分化効果に相関している（Ｗａｒｒｅｌｌ、１９９７、同書）。ＲＡはまた、既知の機能を全く有さないＢｅｎｅという別の膜貫通タンパク質を誘導する。
【００５４】
最後の２つのＲＡ誘導遺伝子は、既知または推定の転写調節因子をコードしている。それらの１つは、遺伝子発現に対する、低酸素症及びいくつかの他のストレス因子の効果を媒介する、ＰＡＳドメイン転写因子のファミリーの一員であるＨＩＦ−２α／ＥＰＡＳ−１である（Ｓｅｍｅｎｚａ、１９９９、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１５：５５１〜５７８）。興味深いことに、ＩＧＦＢＰ−３はまた、低酸素症刺激遺伝子の１つである（Ｆｅｌｄｓｅｒら、１９９９、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：３９１５〜３９１８）。ＨＩＦ−２α／ＥＰＡＳ−１の誘導は、図３Ａに示した免疫細胞化学アッセイにより確認した。
【００５５】
最後のＲＡ誘導遺伝子は、リングフィンガータンパク質ＲＮＦ（受託番号ＹＯ７８２８）をコードしている。ＲＮＦ機能は不明であるが、それは、調節タンパク質の１ファミリーと２５〜３８％のアミノ酸同一性を共有し、そのいくつかは、レチノイド応答、老化または分化に関与している。これらは、レチノイド受容体のリガンド依存的転写活性化補助因子として機能するＴＩＦ１α（Ｌｅ Ｄｏｕａｒｉｎら、１９９５、ＥＭＢＯ Ｊ．１４：２０２０〜２０３３）、並びに、ＰＭＬのｔ（１５；１７）転位置でＲＡＲαと融合する前骨髄球性白血病（ＰＭＬ）遺伝子（Ｋａｋｉｚｕｋａら、１９９１、Ｃｅｌｌ ６６：６６３〜６７４）を含む。ＰＭＬは、近年、ヒト線維芽細胞において変異ＲＡＳにより誘導される加速老化のメディエーターとして同定された（Ｆｅｒｂｅｙｒｅら、２０００、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１４：２０１５〜２０２７）。同じファミリーの別のメンバーはＨＥＲＦ１であり、これは、赤血球の末端分化に必要である（Ｈａｒａｄａら、１９９９、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９：３８０８〜３８１５）。興味深いことに、ＨＥＲＦ１、ＲＮＦ及びＦＡＴ１０は全て、染色体６ｐ２１．３の主要組織適合遺伝子座に位置する。この遺伝子座はまた、ＲＡＲαの遺伝子を含み、これはＲＡにより誘導され（Ｓｈａｎｇら、１９９９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１８００５〜１８０１０）、老化哺乳動物細胞で上方制御されていると報告された（Ｓｗｉｓｓｈｅｌｍら、１９９４、Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．５：１３３〜１４１）。
【００５６】
本明細書に開示したように、レチノイドでの乳癌細胞の処理は、同時に、新生物細胞（ＥＰＬＩＮ及びβＩＧ−Ｈ３）で選択的に下方制御されている候補腫瘍サプレッサーを含む、既知の抗増殖機能をもつ数個の遺伝子を誘導する。ＵｎｉＧｅｍＶアレイは、全てのヒト遺伝子の僅か一部を含むので、レチノイドにより同時誘導される成長抑制剤の実際の数は、本明細書で同定した遺伝子よりもはるかに多いはずである。しかし、追加のレチノイド誘導性成長抑制剤は、本明細書に記載のｃＤＮＡプローブを、より大きなｃＤＮＡアレイまたはアレイの組合せにハイブリダイズすることにより、または、当分野で公知の方法を使用して差次的ｃＤＮＡクローニングを実施することにより容易に同定できる（例として、本明細書に参考として取込んだ国際特許出願公開公報第ＷＯ００／６１７５１号参照）。
【００５７】
これらの結果により、レチノイドは、数個の成長抑制遺伝子を誘導でき、これは、レチノイド関連耐性または毒性を引き起こすことなく、これらの遺伝子の１つ以上を誘導できる化合物をスクリーニングするための試薬を開発する基礎を提供することが実証された。
【００５８】
（実施例３）
レチノイン酸で誘導されるレチノイド調節プロモーター−リポーター遺伝子作成物の作成
レチノイド誘導遺伝子の転写制御下にあるリポーター遺伝子作成物を作製するために、それぞれの遺伝子の最長の利用可能なｃＤＮＡ配列の５′末端の１４００〜１５００ｂｐ上流を含む、レチノイドにより強力に誘導される全１３個の遺伝子のプロモーター配列をヒトゲノムデータベース中に同定した。
【００５９】
その後、これらの配列を、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｃｍｂ．ｕｌｂ．ａｃ．ｂｅ／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｒｓａ−ｔｏｏｌｓ／で入手可能な調節配列解析ツールを使用して、様々な配向で、ＲＡＲＥ部位の２つの空間的に近くに配置された六量体コアモチーフ（Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆら、１９９４、レチノイド：生物学、化学及び医学（Ｓｐｏｒｎら編）、３２７〜３３０頁（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク）の存在について解析した。
【００６０】
唯１つのプロモーターのみに見られる推定ＲＡＲＥ部位であるリングフィンガータンパク質ＲＮＦで、ここで配列：
ＡＧＧＴＣＡＣＡＧＣＣＡＧＴＴＣＡ （配列番号４２）
（下線部はＲＡＲＥコアモチーフを示す；Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆら、１９９４、同書）は、見かけの転写開始部位の約３６０ｂｐ上流に逆配向で出現する。他のプロモーターのいずれも、識別可能なＲＡＲＥ配列を含まず、これは、これらの遺伝子の大半が、間接的な機序によりレチノイドにより誘導されることを示唆する。興味深いことに、ＲＮＦはまた、唯１日間の処理後にその最大の発現に到達するこの群における唯一の遺伝子であり（図２Ａ参照）、これは、ＲＮＦがレチノイドにより直接誘導可能であることを示唆する。
【００６１】
ＲＡ処理ＭＣＦ−７細胞での強力かつ持続した誘導を示す成長抑制遺伝子のいずれも、そのプロモーターにＲＡＲＥ部位を含まないことは注目すべきことであり、これは、レチノイド受容体を欠いた細胞において、非レチノイド誘導剤を使用して、これらの成長抑制遺伝子を誘導することが可能であり得ることを示唆する。レチノイド誘導遺伝子、特にプロモーターにＲＡＲＥ配列を欠いた遺伝子由来のプロモーターの転写制御下にあるレポーター遺伝子含有作成物によって、毒性または耐性の発達を引き起こすことなく、レチノイドの遺伝子誘導効果を模倣した様式で、これらの遺伝子からの遺伝子発現誘導能について、試験化合物をスクリーニングすることが可能となる。
【００６２】
該リポーター遺伝子作成物は以下のように調製する。βＩＧ−Ｈ３などのレチノイド調節遺伝子のプロモーター領域は、ｃＤＮＡの５′末端に隣接するとして、ゲノム配列（ＮＣＢＩ受託番号ＡＣ００４５０３）に同定されている。プロモーター特異的ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅は、鋳型としてヒトＭＣＦ−７細胞由来のゲノムＤＮＡ、及び、βＩＧ−Ｈ３用の以下のプライマー：
５′ＧＧＣＣＡＧＧＴＧＣＣＴＣＴＴＣＴＴＡＧ３′（センス）（配列番号４３）
及び
５′ＣＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＴＧＡＧ３′（アンチセンス）（配列番号４４）
を使用して、ＰｆｕＴｕｒｂｏＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）及び２８サイクルのＰＣＲを使用して実施し、ここでの各サイクルは９５℃で４５秒間、６０℃で１分３０秒間、７２℃で２分間からなる。１０２０ｂｐの断片をこの方法を使用して増幅し、ＴＯＰＯ ＴＡクローニングベクターｐＣＲＩＩ／ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングする。この作成物の配列同一性を確認し、その後、正しい配向のプロモーターを含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ断片を、標準的な組換え遺伝子技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０、分子クローニング：実験マニュアル、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：ニューヨーク）を使用して、ホタルルシフェラーゼ−リポーターベクターｐＧＬ２−Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）のＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩ部位に挿入する。
【００６３】
この作成物が哺乳動物細胞でレチノイド誘導性ルシフェラーゼ発現を駆動する能力は、本明細書に参考として取込んだ２００１年２月１日に提出された米国仮特許出願番号第６０／＿＿＿＿＿（代理人名簿番号９９，２１６−Ｅ）及び２００１年５月２１日に提出された米国特許出願番号第０９／＿＿＿＿＿に記載のように、一過性形質移入アッセイで実証する。簡潔には、形質移入はＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ゲーサーズバーグ）を使用して実施する。細胞を、１ｍＬ中に２ｍＭグルタミン、１０％ＦＢＳ、０．１ｍＭ ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸、ＧＩＢＣＯ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、及び１０μｇ／ｍＬインシュリンを含み、ペニシリン／ストレプトマイシンを含まない培地に、１２ウェルプレートへ７０，０００細胞／ウェルの密度でプレーティングする。細胞が培養皿に付着するのに十分な時間、細胞を培養した後、形質移入を、製造業者の指示に従って、１μｇのｐＧＬ２−ベーシックベクターＤＮＡ及び１μｇのｐＧＬ２−βＩＧ−Ｈ３プロモーターＤＮＡを使用して実施した。１０時間後、培養培地を、標準的な組織培養濃度のペニシリン／ストレプトマイシンを含む培地と交換する。その後、細胞を、１００ｎＭのＲＡの存在下または不在下で７２時間培養した。インキュベート後、細胞を、２回リン酸緩衝食塩水で洗浄し、１００μＬのリポーター溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）に捕集した。溶解液を１０分間室温で放置し、その後、細胞試料を凍結し３７℃の水浴で解凍するためにドライアイス−エタノール浴を使用して、１サイクルの凍結／解凍を行なう。５０μＬのアリコートをホタルルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のために新しい管に移す。ルシフェラーゼ活性を、５秒間の遅延期間及び１５秒間の積分時間で、４７．９％の感度で、Ｔｕｒｎｅｒ２０／２０ルミノメーターを使用して上記のように測定する。追加のアリコートを、細胞溶解液から取り出し、バイオ−ラッドタンパク質アッセイキット（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙ）を使用してタンパク質濃度を測定する。各試料のルシフェラーゼ活性を、タンパク質含量に規準化し、タンパク質１μｇあたりのルシフェラーゼ活性として表現する。全アッセイを三重に実施し、平均及び標準偏差として示す。
【００６４】
レチノイドで調節されるルシフェラーゼ発現をもつ安定に形質移入された細胞系を開発するために、上記の作成物を、プロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ選択マーカーを有する、ｐＢａｂｅＰｕｒｏなどの選択マーカーをコードするベクターを用いた同時形質移入により、ＭＣＦ７細胞などのレチノイドによる成長抑制を受けやすい細胞系に導入する。形質移入は、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、メリーランド州ゲーサーズバーグ）を使用して、１０：１の比の作成物並びに選択マーカーを含むプラスミドまたは他のベクターを使用して実施する。安定な形質転換体を、プラスミドまたはベクターによりコードされる選択マーカーに特異的な、適切な量の選択剤を使用して選択する。選択剤に抵抗性の細胞系を単離し、ルシフェラーゼ活性について、１００ｎＭのＲＡ、または、レシピエント細胞系で成長抑制を引き起こす濃度の別のレチノイドの存在下及び不在下で試験する（Ｐｒｏｍｅｇａのルシフェラーゼアッセイシステムを使用）。
【００６５】
このアッセイは以下のように実施する。細胞を、ペニシリン／ストレプトマイシン、グルタミン及び１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を含む１ｍＬの培地中、１２ウェルのプレートに、４０，０００細胞／ウェルの密度でプレーティングする。付着後、細胞を、１００ｎＭのＲＡで処理するか、または種々の時間の間、未処理で放置する。細胞を２回リン酸緩衝食塩水で洗浄し、３００μＬのリポーター溶解緩衝液（ＲＬＢ；Ｐｒｏｍｅｇａ）に捕集した。溶解液を、簡潔に、１０，０００ｇで遠心分離して破砕片をペレット化し、５０μＬの分割量を、ホタルルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で使用するために新しいチューブに移す。ルシフェラーゼ活性を、５秒間の遅延期間及び１５秒間の積分時間で、５５．６％の感度で、Ｔｕｒｎｅｒ２０／２０ルミノメーターを使用して測定する。追加の一定分量を、バイオ−ラッドタンパク質アッセイキット（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙ）を使用してタンパク質濃度を測定するために、細胞溶解液から取り出す。各試料のルシフェラーゼ活性をタンパク質含量に規準化し、タンパク質１μｇあたりのルシフェラーゼ活性として表現する。全アッセイを三重で実施し、平均及び標準偏差として示す。
【００６６】
かかる作成物及び細胞は、レチノイド誘導遺伝子発現を誘導する化合物を同定するためのスクリーニングアッセイの基礎を提供する。同じ型のスクリーニングはまた、安定に形質移入した細胞系ではなく、むしろレチノイド誘導性遺伝子のプロモーター作成物を用いて、一過性形質移入アッセイを使用して実施できる。ルシフェラーゼ発現に基づいたハイスループットなスクリーニング法は当分野で公知である（一過性の形質移入をベースとしたアッセイの近年の例としてＳｔｏｒｚら、１９９９、Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７６：９７〜１０４、及び、安定に形質移入された細胞系に基づいたスクリーニングの例についてはＲｏｏｓら、２０００、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２７３：３０７〜３１５を参照）。これらの細胞及びアッセイを使用して同定した化合物は、次に、併発毒性またはレチノイド耐性を生じる傾向なく、レチノイド誘導遺伝子の遺伝子発現を誘導できる治療剤を開発するのに有用である。
【００６７】
レチノイドによるＭＣＦ−７細胞の処理により誘導すべき、本明細書に示した遺伝子のほぼ全てのプロモーターにレチノイド応答性エレメントが存在しないことによって、レチノイド以外の化合物を、レチノイドの不在下で、または、レチノイド受容体を欠失した細胞において、レチノイド誘導性遺伝子発現の誘導能についてスクリーニングできることが示唆される。該スクリーニングアッセイは、以下のように実施する。上記のように調製し、レチノイドによる誘導性について確認した、組換え発現作成物は、レチノイドに感受性であろうが非感受性であろうが、レチノイン酸受容体を欠失していることが知られる、例えばＨＴ１０８０細胞（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号ＣＣＬ１２１）などの、任意の哺乳動物細胞系への形質移入により導入する。安定な形質転換体を、プラスミドまたはベクターによりコードされる選択マーカーに特異的な適切な量の選択剤を使用して選択し、選択剤に抵抗性の細胞系をこれにより単離する。
【００６８】
これらの細胞は、上記のようなルシフェラーゼ活性アッセイ（ルシフェラーゼアッセイシステム、Ｐｒｏｍｅｇａを使用）に使用する。これらのアッセイは、種々の時間、試験すべき漸増量の化合物の存在下または不在下で培養するか、または、化合物を含まない培地中で培養した細胞に実施する。
【００６９】
このアッセイは、実質的に上記のように実施する。細胞を、ペニシリン／ストレプトマイシン、グルタミン及び１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を含む１ｍＬの培地中、１２ウェルのプレートに、４０，０００細胞／ウェルの密度でプレーティングする。付着後、細胞を、試験すべき漸増量の化合物で処理するか、または、種々の時間、未処理で放置する。細胞をＰＢＳで洗浄し、３００μＬのＲＬＢに捕集し、簡潔に遠心分離にかけて破砕片を除去し、その後、ホタルルシフェラーゼアッセイを使用して上記のようにアッセイする。タンパク質濃度を決定して、ルシフェラーゼ結果を規準化し、これは、タンパク質１μｇあたりのルシフェラーゼ活性として表現する。全アッセイを三重に実施し、平均及び標準偏差として示す。最後に、細胞を、細胞計測またはＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）、メチレンブルーまたは他の細胞特異的株で染色後に細胞数を測定することにより、試験化合物による成長抑制について平行してアッセイする。
【００７０】
前記の開示は、本発明のある特定の実施形態を強調し、それに等価な全ての修飾または代替物は、添付の特許請求の範囲に示したような本発明の精神及び範囲内であることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａ及び１Ｂは、ＭＣＦ−７細胞によるコロニー形成に対するレチノイン酸（ＲＡ）の効果を示したグラフである。各アッセイにおいて、Ｐ１００あたり１．５×１０５個の細胞を、ＲＡの不在下または存在下でプレーティングした。クローン原性アッセイのために、処理後に細胞をトリプシン処理し、Ｐ１００あたり２，５００個の細胞をプレーティングし、薬物を含まない培地中で育成した。少なくとも６０〜８０個の細胞を含むコロニーを、プレーティングの１２〜１４日後に計測し；これらの結果を、非処理細胞により形成されたコロニー数により規準化した。各点は、三重アッセイの平均及び標準誤差を示す。図１Ａは、示した日数の間、１００ｎＭのＲＡで処理した効果を示す。図１Ｂは、示した用量のＲＡで４０時間処理した効果を示す。
【図２】
図２Ａから２Ｃは、実施例１に記載したようなレチノイド誘導性遺伝子の発現の変化をＲＴ−ＰＣＲにより解析した結果を示す。各遺伝子の実体の後に、ＮＣＢＩ受託番号（括弧内）を示す。図２Ａは、１００ｎＭのＲＡの添加後の表示された日における、遺伝子発現の変化の時間経緯を示す。「Ｒ５」及び「Ｒ８」の名称は、それぞれ、５日間のＲＡ処理による放出の５日後及び８日後に対応する。図２Ｂは、示した用量のＲＡで４０時間処理した効果を示す。図２Ｃは、１μＭのフェンレチニドの添加後の指定した日にちにおける、遺伝子発現の変化の時間経緯を示す。
【図３】
図３Ａは顕微鏡写真であり、図３Ｂは、ＲＡ処理細胞における、ＩＧＦＢＰ−３、ＨＩＦ２α／ＥＰＡＳ−１及びＥＰＬＩＮタンパク質の誘導を示したイムノブロットの写真である。図３Ａは、非処理ＭＣＦ−７細胞、及び５日間１００ｎＭのＲＡで処理した細胞における、ＩＧＦＢＰ−３、ＨＩＦ２α／ＥＰＡＳ−１及びＥＰＬＩＮの免疫細胞化学解析の結果を示す。図３Ｂは、非処理ＭＣＦ−７細胞、及び、指定した日数の間１００ｎＭのＲＡで処理した細胞における、ＥＰＬＩＮのイムノブロット解析を示す。
Claims (20)
- 発現がレチノイドにより誘導される遺伝子に由来するプロモーターに作動可能に連結したリポーター遺伝子をコードする組換え発現作成物であって、該プロモーターはＲＡＲＥ部位を含まない、前記発現作成物。
- リポーター遺伝子が、ホタルルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑蛍光タンパク質、またはアルカリホスファターゼをコードする、請求項１に記載の組換え発現作成物。
- レチノイドが、全トランスレチノイン酸、フェンレチニド、９−シスレチノイン酸、１３−シスレチノイン酸、エトレチナートまたはレチノールである、請求項１に記載の組換え発現作成物。
- プロモーターが、ヒトインシュリン様成長因子結合タンパク質−３（ＩＧＦＢＰ−３；配列番号１）、分泌細胞接着タンパク質βＩＧ−Ｈ３（配列番号２）、新生物に欠失した上皮タンパク質（ＥＰＬＩＮ；配列番号３）、ユビキチン様タンパク質ＦＡＴ１０（配列番号４）、プロテアソームアクチベーターＰＡ２８サブユニットα（ＰＡ２８α；配列番号５）、Ｍａｃ−２結合タンパク質（Ｍａｃ−２ＢＰ；配列番号６）、プロテインＣ阻害剤（ＰＣＩ；配列番号７）、Ｔ細胞受容体γ（配列番号８）、レチナールオキシダーゼ（配列番号９）、Ｂｅｎｅ（配列番号１０）、ＨＩＦ−２α／ＥＰＡＳ−１（配列番号１１）またはセレクチンＬ（配列番号１２）に由来するプロモーターである、請求項１に記載の組換え発現作成物。
- プロモーターが細胞遺伝子由来のプロモーターであり、哺乳動物細胞におけるその発現はレチノイドにより誘導され、それにより細胞の成長を阻害する、請求項１に記載の組換え発現作成物。
- プロモーターが、ヒトインシュリン様成長因子結合タンパク質−３（ＩＧＦＢＰ−３；配列番号１）、分泌細胞接着タンパク質βＩＧ−Ｈ３（配列番号２）、新生物に欠失した上皮タンパク質（ＥＰＬＩＮ；配列番号３）、ユビキチン様タンパク質ＦＡＴ１０（配列番号４）、またはプロテアソームアクチベーターＰＡ２８サブユニットα（ＰＡ２８α；配列番号５）に由来するプロモーターである、請求項５に記載の組換え発現作成物。
- 請求項１、２、３、４、５または６に記載の組換え発現作成物を含む、組換え哺乳動物細胞。
- 哺乳動物細胞においてレチノイド誘導性遺伝子の発現を誘導する化合物を同定する方法であって、該方法は、
（ａ）化合物の存在下及び不在下で請求項７に記載の組換え哺乳動物細胞を培養し：
（ｂ）化合物の存在下での該細胞におけるリポーター遺伝子発現を、化合物の不在下での該細胞におけるリポーター遺伝子発現と比較し；そして
（ｃ）リポーター遺伝子発現が、化合物の不在下よりも化合物の存在下の方がより高い場合に、レチノイド誘導遺伝子発現を誘導する化合物と同定する段階を含む、前記方法。 - リポーター遺伝子の発現が、免疫学的試薬を使用して検出される、請求項８の方法。
- リポーター遺伝子の発現が、リポーター遺伝子産物の活性をアッセイすることにより検出される、請求項８の方法。
- リポーター遺伝子の発現が、相補的核酸に対するハイブリダイゼーションにより検出される、請求項８の方法。
- 哺乳動物細胞におけるレチノイド誘導遺伝子の発現を誘導する化合物を同定する方法であって、
（ａ）化合物の存在下及び不在下で細胞を培養し；
（ｂ）発現がレチノイドにより誘導される少なくとも１つの細胞遺伝子の発現の変化について細胞をアッセイし、ここでのプロモーターはＲＡＲＥ部位を含まず；そして
（ｃ）下位区分（ｂ）の細胞遺伝子の発現が、化合物の存在下でより高い場合に、レチノイド誘導遺伝子発現の誘導物質として化合物を同定する段階を含む、前記方法。 - 細胞遺伝子が、インシュリン様成長因子結合タンパク質−３（ＩＧＦＢＰ−３；ＮＣＢＩ受託番号Ｍ３５８７８．１）、分泌細胞接着タンパク質βＩＧ−Ｈ３（受託番号ＡＣ００４５０３．１）、新生物に欠失した上皮タンパク質（ＥＰＬＩＮ；受託番号ＡＨ００９３８２．１）、ユビキチン様タンパク質ＦＡＴ１０（受託番号ＡＬ０３１９８３）、Ｍａｃ−２結合タンパク質（Ｍａｃ−２ＢＰ；受託番号Ｕ９１７２９）、プロテインＣ阻害剤（ＰＣＩ；受託番号ＡＬ０４９８３９．３）、Ｔ細胞受容体γ（受託番号ＡＣ００６０３３．２）、レチナールオキシダーゼ（受託番号ＡＦ０１０２６０）、Ｂｅｎｅ（受託番号ＡＰ００１２３４．３）、ＨＩＦ−２α／ＥＰＡＳ−１（受託番号ＮＴ＿００５０６５．３）、セレクチンＬ（受託番号ＡＬ０２１９４０．１）、またはプロテアソームアクチベーターＰＡ２８サブユニットα（ＰＡ２８α；受託番号ＡＬ１３６２９５．２）である、請求項１３の方法。
- 細胞遺伝子が、哺乳動物細胞におけるその発現がレチノイドにより誘導され、それにより細胞の成長を阻害する遺伝子である、請求項１２の方法。
- 細胞遺伝子が、ヒトインシュリン様成長因子結合タンパク質−３（ＩＧＦＢＰ−３）、分泌細胞接着タンパク質βＩＧ−Ｈ３、新生物に欠失した上皮タンパク質（ＥＰＬＩＮ）、ユビキチン様タンパク質ＦＡＴ１０またはプロテアソームアクチベーターＰＡ２８サブユニットα（ＰＡ２８α）である、請求項１２の方法。
- 細胞遺伝子の発現が、免疫学的試薬を使用して検出される、請求項１２の方法。
- 細胞遺伝子の発現が、細胞遺伝子産物の活性をアッセイすることにより検出される、請求項１２の方法。
- 細胞遺伝子の発現が、相補的核酸に対するハイブリダイゼーションにより検出される、請求項１２の方法。
- 癌の作用を予防または寛解するように動物を処置する方法であって、該方法は、それを必要とする動物に、請求項８または１２の方法に従って同定した化合物の医薬組成物の治療有効量を投与する段階を含む、前記方法。
- 動物がヒトである、請求項１９の方法。
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