JP4472025B2 - 膵臓ランゲルハンス島細胞においてstf―1発現を刺激する化合物の特徴づけの新方法 - Google Patents
膵臓ランゲルハンス島細胞においてstf―1発現を刺激する化合物の特徴づけの新方法 Download PDFInfo
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Description
発明の分野
本発明は一般的には生化学的内分泌学、分子生物学、及びタンパク質化学の分野に関するものである。より具体的には本発明は膵臓ランゲルハンス島(膵島)細胞におけるSTF−1発現を刺激する化合物の特徴づけの新方法に関する。
関連技術の説明
グルコースホメオスタシスは多数の神経内分泌系の連携した作用を必要とする。膵島は哺乳類では1次“グルコースセンサー”の働きをすると考えられている。膵島細胞にはインシュリン生産細胞、グルカゴン生産細胞、ソマトスタンチン生産細胞、膵臓ポリペプチド生産細胞として特徴づけられる4群を含んでいる。これらのなかでは、インシュリン生産細胞であるβ−細胞の数が多い。血糖濃度の上昇によりインシュリンの生産と分泌が刺激され、その後、組織でのグルコースの取り込みが、必然的に行われる。したがって、β−細胞の機能障害あるいは破壊は血糖値の上昇をもたらし、最終的には悪化して糖尿病になる。
遺伝子連座分析の結果は、遺伝的要因が強く影響を及ぼし、糖尿病になりやすくしていることを示している。例えば、少なくとも18の遺伝子座がインシュリン依存性真性糖尿病(IDDM)に一定の関連性を有している。IDDM2と名付けられた病因遺伝子座はヒト・インシュリン遺伝子を含んでおり、インシュリンプロモーターの別の転写調節に関連している。したがって、インシュリン遺伝子の発現を調節する過程の停止は糖尿病発生の原因の1つであると考えられている。β−細胞機能障害が糖尿病において非常に多く見られる特徴となっていることは、この仮定と一致する。
インシュリン非依存性糖尿病(NIDDM)は外部的要因と複合した遺伝的要因の2つが重なった結果として起こるものと考えられている。興味深いことに、インシュリン遺伝子座それ自身の対立遺伝子変異体がその疾患に関係している。これらの変異体は正常なインシュリン遺伝子を含んでいるように見えるが、転写調節に関して通常と異なる性質を示す。
約2,000万人のアメリカ人がインシュリン非依存性糖尿病(タイプII)にかかっていると推定されている。この疾病の進行には環境的要因といまだ大部分未解明の糖尿病発症性遺伝子の両方が必要と思われる。その糖尿病発症性遺伝子はタイプII糖尿病における、インシュリンシグナルに応答して正しくグルコースの利用ができない末端組織でのインシュリン抵抗性に関連寄与していると推定される。別の考え方として、遺伝的要因がこれらの患者のもつインシュリンを生産する膵臓β−細胞のグルコース感受性の減少の原因となっているとも考えられる。これらの生理学的状態の最終的な段階は両方とも糖尿病の最も主要な特徴である著しい過血糖症である。
インシュリン遺伝子の転写制御は細胞特異的でグルコース感受性のシグナリング分子と相互に作用するフランキング(flanking)DNAの短い領域を通じて達成される。この調節機構の正確な特質はほとんど未解明のままではあるが、ベーシック・ヘリックス−ループ−ヘリックス(bHLH)及びホメオドメイン含有因子はインシュリンのβ−細胞特異性発現を支配する転写機構の重要な構成要素であることが広く知られている。膵島特異性なベーシック・ヘリックス−ループ−ヘリックス複合体はNir,IEB1あるいはICEと様々な名前で呼ばれる基部Eボックスと相互に作用する。この因子はラット・インシュリンI遺伝子では2カ所出現するが、ラット・インシュリンIIとヒト・インシュリン遺伝子では1カ所しか出現しない。
インシュリン生産細胞系のトランジェット(Transiet)アッセイによりEボックス結合因子はホメオドメイン認識配列の特徴を持つFLATと呼ばれるATリッチ配列に隣接して結合するβ−細胞特異性タンパク質と相助作用する事が示されてる。Isl−1,lmx−1,cdx−3及びSTF−1を含む数種の特質を明らかにされたホメオドメインタンパク質がFLAT因子と結合することが明らかにされている。さらに、STF−1はP要素と名付けられた進化上保存されたATリッチ配列に対する主要な結合活性に相当する。Isl−1はFLAT要素との結合力は弱くインシュリン生産細胞の抽出物ではFLAT結合複合物としての存在は見いだされない。最新の研究結果により神経系の発生においてIsl−1がより重要な役割を果たすことが裏付けられている。ホメオドメイン因子であるlmx−1及びcdx−3は異種細胞でのインシュリンプロモーター機能に関して興味深いトランスアクチベーション特性をもっている。しかし、これらの細胞内分布及びβ−細胞内でのFLAT結合能力については今だ解明にされていない。さらに、β−細胞系においてこれらの因子の機能について直接言及したデータはほとんどない。
インシュリン・プロモーター結合活性を持つ因子のグループの中では、STF−1は恐らくインシュリン・プロモーター機能の真正の調節物の最も有望な候補者である。マウスにおいては、STF−1は将来膵臓を生じさせる原始細胞の核に、その領域での最初に検出されるインシュリンの発現の寸前の胚発生日(embrionic day)8.5に最初に見いだされる。内分泌腺である膵臓の形成が続く期間中、STF−1とインシュリンは共に広く発現されている。加えて、STF−1はインシュリン生産細胞系からの抽出物において、インシュリンプロモーターの上のFLAT及びP要素の両方と内因性DNA結合活性の成分として現れる。また、STF−1はEボックス因子Pan−1と強力な相助作用を行い、FLAT結合因子として期待される。しかしながら、DNA結合アッセイではβ−細胞抽出物から得られる未知の別の因子もまた検出されたFLAT結合活性に大いに関係していることが示されている。FLAT仲介したインシュリンプロモーター活性がこれらの検出された種の全体あるいは一部を必要とするのかどうかは未解明のままである。
STF−1は初期には発生中の膵臓の外分泌細胞と内分泌細胞の両方で発現するが、STF−1の生産は次第にインシュリン及びソマトスタンチン生産膵臓細胞に限定されるようになる。これらの細胞では、ソマトスタンチンとインシュリンンの両方の遺伝子の高レベルの発現の維持に重要な働きをSTF−1は示す。
STF−1はFLAT及びPと名付けられたインシュリンプロモーター上の2つのはっきりと定義された膵島特異性要素を認知する。これらの部位に結合するとき、STF−1はFarとNirと名付けられた2つのEボックス要素を認知するヘッリクッス−ループ−ヘリックスタンパク質であるE47と協力しインシュリン遺伝子の転写を刺激する。同様にSTF−1は膵島細胞においてTSEIとTSEIIと名付けられた2つの膵島特異性要素を通じてソマトスタンチン発現を調節する。
STF−1ようなホメオドメインタンパク質は細胞確立あるいは体節同一の段階における発生において重要な役割を果たすことが分かっている。それらの生体内での特異的ではっきりした作用に対し、インビトロにおいては、ほとんどのホメオドメインタンパク質は低くて特異性の少ないDNA結合特性しか示さない。しかしながら、最近の研究ではインビトロにおけるホメオドメインDNA結合特異性の決定要因としてあるタンパク質の補因子の関与が示されている。例えば、ショウジョウバエでは、エクストラデンティクル(exd)はホメオティックなタンパク質の活性をそれらの発現の様式を変化させる事なく調節していることが示されてきている。一方、エクストラデンティクルはあるホメオドメインタンパク質のDNA結合特異性を高めることにより、目的となる遺伝子選択を促進するらしい。実際にエクストラデンティクルは脊椎動物において高い割合で保存されており、ヒト・プロト腫瘍遺伝子Pbx1との間で高い配列相同性(71%)を有する。
発生の期間中の特異的な一群への細胞の参加については、識別された遺伝的プログラムの活動を仲介する多種のホメオドメイン(HOX)選択タンパク質の発現の比較によって多くの部分が決定される。しかし、個々のHOX遺伝子それ自身が異なった細胞型での発現に対する目的物となるメカニズムは多くの部分が未解明のままである。
脊椎動物の膵臓は十二指腸原基の共通の幹細胞から生じる内分泌部と外分泌部とから構成される(1)。膵臓の内分泌部内では、初期に複数の膵臓ホルモンを発現する分化多能性先駆細胞は成熟したランゲルハンス島を構成する細胞の副集合体、すなわち、インシュリン、ソマトスタンチン、グルカゴン及び膵臓ポリペプチドをそれぞれ生産する細胞へと次第に制限的に分化する(2,3)。これらの発生経路が活性化するメカニズムについては明確になっていないが、最新の証明はホメオボックス因子STF−1(IPF−1/IDX−1)がこの過程の重要な決定要素であることを示す。実際、発生におけるSTF−1に対する必要性は膵臓の先天的欠損を導くSTF−1/IPF−1遺伝子の破壊を目的とした相同組み換え研究により裏付けられる(4)。
STF−1(Pdx1ともよばれる)の発現は8.5胚発生日(embryoric day)に膵臓原基と分化多能性先駆細胞で検出される。発生途中の膵臓の内分泌及び外分泌部分で一時的に発現したのち、STF−1の生産は次第にインシュリン及びソマトスタンチンを生産する膵島細胞に限定される(5,6)。これらの細胞ではSTF−1はそれぞれのプロモーター内の機能的要素と結合することによりインシュリン及びソマトスタンチンの両方の遺伝子を調節するらしい(5,7−16)。
先の技術では膵臓細胞におけるホメオドメインタンパク質STF−1の発現調節の効果的な手法が欠如している。今回の発明はこの技術におけるこの長年の必要性と要望を実現するものである。
発明の概要
STF−1は膵臓遺伝子の重要な調節物質ではあるが、膵臓細胞を標的とするSTF−1それ自身の発現のメカニズムは特徴づけがなされていない。今回の発明ではSTF−1プロモーターの6.5kb断片は培養十二指腸細胞と同様にトランスジェニックマウスにおいてのβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子の膵島特異的発現を効果的に導くことを示している。この6.5kb断片内で、主要となる転写開始部位より−104塩基部位に位置するEボックス要素はSTF−1プロモーター活性に対し特に不可欠なものである。この要素はSTF−1の膵島発現の本質をなす上流の活性化因子により認知される。実際にこのSTF−1プロモーターは膵島細胞において目的とするSTF−1発現活性を20〜100倍に高める。−104部位の基部Eボックス配列の欠如はHIT細胞におけるSTF−1発現をまったく起こさせない。さらに、抗USF(upstream factor)抗血清がC1,C2及びC3の形成を阻害することはこれらのタンパク質はUSFタンパク質により作り出されることを示している。
さらに、STF−1エンハンサー(enhancer)要素は転写開始部位の600bp上流に存在する530bp領域に見いだされる。この530bp断片を含むプロモーター構造物はデキサメタゾン処理により完全に抑制されるが、偏在するUSF−1認知部位を含む最小限のSTF−1プロモーターは抑制されない。その530bp領域はCOS−7細胞に比較してHIT−T15細胞では5〜10倍の高い活性をもち、この断片が膵島細胞特異性活性をもつことを示している。それゆえ、今回の発明においてSTF−1−lacZ融合遺伝子が膵島細胞でのSTF−1発現を高める化合物の選別に使用された。STF−1生産を刺激する化合物は膵島β細胞機能、すなわちインシュリン生産機能を高める。したがって、今回の発明で記載された方法で識別された化合物はあいまいな膵島細胞の機能ためグルコースに対し不耐性のタイプII糖尿病にかかっている患者に対して特に有効である。
今回の発明の1つの具体化物は、STF−1転写を誘導する化合物の試験方法の供給である。
STF−1/lacZ融合遺伝子を発現する膵島細胞系はリン酸カルシュウム共沈降を使用することにより分離される。STF−1発現に対する様々な化合物の効果を検査するために、検査対象化合物をSTF−1/lacZを発現する細胞に加える。コントロールと検査する細胞のLacZ活性を比色法により定量分析する。この方法を使用すると、膨大な数の化合物がスクリーニングされSTF−1を誘導する化合物が迅速に同定できる。
今回の発明の1つの具体化物は、生体内のインシュリン生産膵島細胞に印をつけるためにSTF−1プロモーターを使用する方法がある。この方法に関しては、指標としてグリーンフルオレセントタンパク質(GFP)が使用される。グリーンフルオセントタンパク質の発現はOgawaらの方法より混乱なしに検出できる[Ogawa, et al.:Proc. Natl. Acad. Sci., 92, 11899-11903(1995)]。動物の膵臓のβ細胞の回収を高めるためにSTF−1プロモーターはGFPをコードする遺伝子に融合される。STF−1−グリーンフルオセントタンパクトランスジーンのブタへの導入は膵臓からのインシュリン生産細胞の効果的で迅速な回収を可能にする。端的に述べると、ブタから膵臓が回収され、細胞を離散させるためにコラーゲナーゼ処理される。インシュリン生産膵島細胞はSTF−1グリーンタンパク転換遺伝子の発現に基づく蛍光活性細胞選別(FACS)により効果的に回収される。精製されたβ細胞群は糖尿病患者の細胞治療に使用することが可能である。
今回の発明の1つの側面としては、膵島細胞を刺激してSTF−1転写を誘導する複合物を検査する能力を決定する方法をもたらしたことである。この方法は以下の段階より構成される。SEQ ID No.1群あるいはSEQ ID No.2群、あるいはそれらの断片から選別された配列、プロモーター及び前述のSTF−1エンハンサー及び前述のプロモーターの両方の転写制御を受けるレポーター遺伝子をもつベクターの供給の段階。ここで述べられているレポーター遺伝子は前述の宿主細胞に対して認知可能な標識を与えることができる。前述の宿主細胞への前述ベクターの導入の段階。前述の宿主細胞を刺激して前述の標識を生産させる物質の能力を決定するための検査複合物の存在下での前述宿主細胞の培養の段階。及び前述の検査複合物の前述の宿主細胞を刺激し前述の認知可能な標識を生産させる前述の能力を決定するための前述の指標分析の段階。ここにおいて、前述の標識の存在は前述の検査化合物が膵島細胞を刺激してSTF−1転写を誘導することを示している。また、前述の標識の不在は前述の検査化合物が膵島細胞に対してSTF−1転写誘導を刺激しないことを示している。
今回の発明のこの目的をさらに具体化すると、使用されたレポーター遺伝子は酵素である。さらに詳しく具体化すればその酵素はルシフェラーゼ及びβ−ガラクトシダーゼのグループから選抜される。
今回の発明の別の具体化は、前述の転移段階が動物に対する転換遺伝子のトランスフェクションあるいはマイクロインジェクション注入により実行されることである。
今回の発明の別の目的としては、以下の段階により構成される、生体内におけるインシュリン生産膵島細胞を標識づけ方法を与えたことである。STF−1プロモーター及び前述のSTF−1プロモーターによる転写制御支配を受けるレポーター遺伝子を含むベクターの供給の段階。そこにおいて、前述のレポーター遺伝子は膵島細胞に対し認知可能な標識を与えることができる。前述のベクターの動物の胚へのトランスジーンとしての注入の段階。前述の胚の膵島細胞をもつ動物個体への成長の段階。前述の動物の膵島細胞のいずれかが前述のレポーター遺伝子を発現するか否かを決定するための前述の認知可能標識の分析。ここにおいて、標識の存在はインシュリン生産膵島細胞の存在を意味し、一方、標識の不在はインシュリン生産細胞の不在を意味している。
この発明のこの目的を具体化すると、そのレポーター遺伝子は蛍光タンパク質を生産し、この方法はさらに蛍光活性細胞選別(FACS)による非インシュリン生産膵島細胞からのインシュリン生産膵島細胞の選抜の段階を含んでいる。
今回の発明の別のそしてより進んだ見地、特徴及び利点はこの発明の現在具体化されたものに関する以下の記載より今後明らかにされてくるであろう。
【図面の簡単な説明】
この発明の上記記述の特徴、利点及び目的に関する内容を達成し、及び詳細に理解できるようにするため、上で簡単に要約されたこの発明に関し、より詳細な記載を描き加えられた図面で示された具体例に対する参照として記載されている。これらの図面は明細書の一部を形成する。しかしながら、描き加えられた図面はこの発明の選ばれた具体例を図示しており、したがってその範囲に限定して検討すべきでないことを注意しなければならない。
図1はSTF−1遺伝子の染色体上の所在を示す。図1AはSTF−1(Pdx1として引用されている)とマウス染色体5上のほかの遺伝標識との位置関係を示す模式図上で(マウス)染色体5の末梢領域に所在するオルファン(orphan)ホメオボックス遺伝子によりコードされている事を示している。センチモルガンの目盛りが右側に示されている。図1BはSTF−1と染色体5上の多種類の遺伝標識の間での組み換え頻度を示す表である。左の列は染色体位置決定の為に使用された遺伝標識を記載している。STF−1はここではPdx1として引用されている。
図2は、STF−1プロモーターはTATA配列を欠如し、複数の転写開始部位を利用していることを示している。図2AはSTF−1の15キロベースのゲノムクローンを模式的に表しており、上にはキロベースの目盛りが付いている。6.5キロベースの5’フランク、4キロベースのイントロン、3キロベースの3’フランクが示されている。エキソンI(陰影をつけ、Iと示す)とエキソンII(陰影をつけ、IIと示す)を分断する4キロベースのイントロンはIVSと呼ばれる。図2BはSTF−1遺伝子の5’フランク領域のヌクレオシド配列を示している。RNアーゼ防護法により位置決定された転写開始部位(黒矢印)とプライマー・エクステンション法により決定された転写開始部位(白矢印)はS1(主要転写開始部位、太字)、S2及びS3と表されている。bHLH/bHLH−ZIPタンパク質(Eボックス)、CTF/NF−1(CAAT)及びC/EBPのそれぞれに対しての存在性上流因子結合部位はアンダーラインを引き主要開始部位に対する相対的な位置と共に記した。図2CはアンチセンスSTF−1 RNAプローブを使用したTu6 RNA(Tu6,2レーン)あるいはコントロールのイーストtRNA(yeast,3レーン)のRNアーゼ防護試験の結果を示している。未消化のプローブを左側に示す(1レーン)。図2DはアンチセンスSTF−1プライマーを使用したイースト(4レーン)、Tu6 mRNA(5レーン)あるいはRIN mRNA(6レーン)のプライマーエクステンション分析の結果を示している。連続するラダー(ladder)を一番右に示す(GATC,7−10レーン)。RNアーゼ防護生成物及びプリマーエクステンション生成物のとの間の一致したものが記録され、S1,S2及びS3と示される最初の3カ所の開始部位が示されている。(図2B、下部参照)。
図3はSTF−1プロモーターの6.5kb断片がトランスジェニックマウスの膵島細胞に対しβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子の発現を標的としていることを示している。トランスジェニックから得られた成熟膵臓(上)及びコントロールの同腹児からの膵臓(下)の凍結切片を色素原としてXgalを使用してlacZ活性を評価したものを表している。矢印は膵島細胞を示している。
図4はSTF−1プロモーター内にある末端及び基部要素が膵島細胞に対してSTF−1を発現させることを示している。図4Aは膵島細胞(βTC3,HIT)及び比較の意味で非膵島細胞系(PC12,COS,HeLa)にトランスフェクションされた−6500 STF−1ルシフェラーゼレポータープラスミド活性度を示している。記載されている分析結果はRSV−CATコントロールプラスミドを同時トランスフェクションさせ正常化した後のSTF−1プロモーター活性をHIT細胞を基準(100%)として他の細胞の比較値を示している。試験は最低3回繰り返し行われた。図4BはHIT細胞にトランスフェクションされた後のSTF−1ルシフェラーゼ(STF lus)プロモーター構造物の試験結果を表示している。構造物は主要転写開始部位に応じた5’プロモーター境界に従って命名された(S1、図2A及び2B参照)。模式図は核因子に対する潜在的結合部位を示している。主要転写開始部位は黒矢印で示されている。星印は3キロベース末端における特質未確認の結合部位を示す。それぞれの構造物は、活性を内部調整物としてRSV−CAT使用したトランスフェクション効率を正常化させた後の−6500 STF Lucを100%としてその比較から計算された。試験は最低4回繰り返しおこなわれた。
図5はSTF−1プロモーターに存在する基部Eボックス要素が上流因子USFに結合することを示している。図5Aは−182〜−37に及ぶ(145塩基対)32P標識STF−1プロモーター断片を使用したDNアーゼI防護分析の結果を示す。オートラジオグラムは無抽出物(1及び4レーン)、HIT及びHela細胞からの核抽出物(それぞれ2及び3レーン)、あるいは組み換えUSF−1の存在下(5レーン)での消化パターンを示している。
図5BはSTF−1 Eボックス(−118/−95)を含む32P標識二重鎖オリゴヌクレオチドとともにインキュベートされたHIT核抽出物の電気泳動移動度分析を示す(1レーン)。未標識競合オリゴヌクレオチド(50倍モル過剰)を結合反応に加えたものを示した(2−5レーン)。STF Eは野生型STF−1 Eボックスオリゴである。STF−E MUTは−106塩基(C/A)及び−102塩基(T/G)が置換されたEボックスを含む突然変異STF−Eオリゴを表す。Ins−1(P)はインシュリンIプロモーター由来のP要素である。また、Gal4はGAL4認識部位である。
左側の図5CはプローブとしてSTF−Eボックスを使用したHIT核抽出物のゲル移動分析の結果を示す(1レーン)。反応にUSFあるいはTFE−3抗体を付加した結果は2及び3レーンに示した通りである。複合体C1,C2,C3は図示された通りである。右側の図5DはSTF−Eプローブを使用したHIT(1−3レーン)抽出物のゲル移動分析の結果を示す。結合反応にUSF−1及びUSF−2の特異的抗血清を添加した結果が示されている。
図6は−104 Eボックスに対するUSFの結合はSTF−1プロモーター活性に対して重要であることを図示している。図6AはUSF結合特性に対するEボックス突然変異の効果を示している。野生型(E−WT)あるいは突然変異(E−MUT)STF−1 Eボックスプローブを使用したHIT核抽出物のゲル移動分析の結果が下段に描かれた−106〜−102までの野生型及び突然変異プローブの配列とともに示されている。C1−3とは化合物C1,C2及びC3である。図6BはHIT細胞におけるSTF−1プロモーター活性に対するEボックス突然変異の効果を示している。図にはSTF−1プロモーターの6500塩基対あるいは190塩基対に関係して野生型、突然変異あるいはSTF−1 Eボックス欠損体(−118/−95)をトランスフェクトされたHIT細胞の分析結果を表現している。レポーターの活性度はRSV−CAT支配プラスミドを同時トランスフェクトさせトランスフェクション能力を正常化させた後の野生型−6500 STF−1 Luc構造物を100%として、その比較で表されている。試験は最低3回繰り返し行われた。
図7はグルココルチコイドがSTF−1遺伝子5’フランキング領域に存在する膵島特異性促進物経由でSTF−1発現を抑制することを示している。
図7Aは18〜24時間のデキサメタゾン(10-7M)あるいはコントロールのエタノール媒体によるHIT−T15細胞処理後のSTF−1プロモーター活性を示す。−6.2/−5.67 STF Lucレポーターの活性を100%に合わせる。すべての構造物は5(基部フランキング領域の120塩基を含有するSTF−1ルシフェラーゼベクター(STF−1 Luc)との関係で評価される。STF−1 Lucレポーターに挿入されたSTF−1配列はヌクレオチド番号で表示されている。例えば、−6.5/−6.2 STF LucはSTF−1の5’フランキング領域の基部120塩基部位に融合した−6500〜−6200までのSTF−1配列を含有する。末梢領域は楕円及び正方形で図示された活性化要素を含んでおり、また、最小のSTF−1プロモーターは長方形で図示されている。標準偏差を表すバーが示されている。分析は最低3回繰り返された。STF−1レポーター活性はいかなるものも同時トランスフェクトされたCMV−βgal支配プラスミドを使用することによりトランスフェクション効率を正常化させた。
図7B(上段)はHIT T15細胞におけるSTF−1レポーター構造物のトランジエントトランスフェクション分析の結果を示している。5’フランキング領域配列の6500塩基領域を含む−6500 STF Lucの活性を100%に規定した。それぞれの試験は最低4回の倍数回繰り返して行われた。標準偏差は図示された通りである。下段ではCOS−7細胞にトランジエントトランスフェクションされた後のSTF−1ルシフェラーゼレポータープラスミドの活性を示している。プロモーター活性はCMV−βgal制御活性に対し正常化され、HIT細胞におけるSTF−レポーター活性との直接の比較が考慮されている。
図7Cは−6.2〜−5.67kbの範囲に展開するSTF−1遺伝子上の最小膵島特異性エンハンサーのヌクレオチド配列を表す。主体物と結合するHNF−3及びEボックス主要素は太字表示され、またアンダーラインが引かれている。
図8はSFT−1遺伝子中の膵島特異性エンハンサーがHNF−3βとBETA−2に対する結合部位を含むことを示す。
図8AはラットSTF−1プロモーターの−5870〜−6100塩基の範囲の32P標識STF−1プローブを使用したHIT T15膵島細胞、HelaあるいはCOS−7細胞由来の核粗抽出物のDNアーゼI保護試験の結果を示す。NONEとは抽出物を加えないコントロール反応であり、HNF−3αとは組み替えタンパクを使用した反応である。
図8Bはそれぞれのレーンの上に記載されたHele、HepG2、グルカゴン生産αTC、あるいはインシュリン生産HIT及びRIN細胞系由来の粗核抽出物のゲル移動度分析の結果を表す。分析はH要素を含有した32P標識のSTF−1オリゴヌクレオチドプローブを用いて行った。野生型(WT)と突然変異(MT)H要素の配列を下に示した。
図8CはHITインシュリノーマ(HIT NE)及び1次培養成体ラット膵島細胞(ISLET NE)由来の粗核抽出物の、−5907〜−5927までに存在する32P標識STF−1 H要素を使用したゲル移動度分析の結果を表す。それぞれのレーンの上に記載されているとおりHNF3α,βあるいはγ抗血清が反応に添加された。−は抗血清は添加されていない。I及びIIはそれぞれタンパク質−DNA及び抗体スーパーシフト複合体をそれぞれ表す。
図8DはSTF−1プロモーターの−5963〜−5981まで存在する32P標識B要素プローブを使用したHIT T15細胞由来粗核抽出物のゲル移動分析の結果を示す。BETA−2、E2AあるいはSTF−1抗血清の結合反応に対する添加が各レーンの上に示してある。100倍の過剰量の無標識野生型(WT:5’−TCAGTGACAGATGGAGTCCT−3’)あるいは突然変異(MT:5’−TCAGTGAAAGACGGAGTCCT−3’)の競合DNAが記載されているとおりに添加された。BETA−2及びE−47 cDNAでプログラムされた網状赤血球リゼイト由来の結合活性は7レーンで示した。7レーンの最上のバンドは網状赤血球に固有なものである。
図9はグルココルチコイドが膵島特異性エンハンサーのHNF−3活性を妨害することによりSTF−1発現を減少させることを示す。
図9AはHIT T15インシュリノーマ細胞におけるSTF−1レポータープラスミドのトランジエットトランスフェクション分析の結果を表す。最小膵島特異的エンハンサー(−6200〜−5700)を含有する−6.2/−5.7 STF Luc構造物の活性を100%に合わせる。HNF−3β及びBETA2/E2Aの結合を阻害するH及びB要素上の点突然変異を含んだ構造物は楕円あるいは正方形にXを記して表された。EボックスおよびH要素突然変異に相当する点突然変異はゲル移動分析に使用された(図8参照)。
図9Bはコントロール(−)及びデキサメタゾン処理(+)HIT−15細胞における野生型(有色縦棒)及びH要素変異(白色縦棒)のSTF−1レポーター活性に対するHNF−3β過剰発現に対する効果を表す。コントロール細胞において最小の膵島特異的エンハサー(−6200〜−5700)を含有する野生型−6.2/−5.7 STF Luc活性を100%にセットする。標準偏差を示すバーが示されている。実験は最低4回繰り返し行われた。
図9CはHIT−T15細胞におけるSTF−1(−6500 STF−1 LUC)レポーター活性に対するHNF−3βエフェクタープラスミド量の増加の効果を示す。HNF−3βエフェクタープラスミドの総量(μgで)をそれぞれのグラフの下に示した。それぞれの分析においてのエフェクタープラスミドの総量はCMV無発現ベクターで調整し一定に保たれた。コントロール(ETOH)及びデキサメタゾン(DEX)で記載のとおり細胞を処理した。
発明の詳細な説明
今回の発明では、膵臓の形態形成及びグルコースホメオスタシスの機能をもつホメオドメインタンパク質であるSTF−1がマウス染色体5上の“オルファン”ホメオボックス遺伝子によってコードされている事を示した。β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子と融合させた場合、STF−1遺伝子由来の5’フランキング配列を含む6.5キロベースゲノム断片はトランジェニックマウスにおて膵島特異性活性を示す。膵島限定発現に対し、STF−1プロモーター内の2つの末梢要素が必要とされ、それは、−3と−6.5キロベースの間に所在する末梢エンハンサー及び−104に位置し、ヘリックスループヘリックス(bHLH)/ロイシンジッパー(ZIP)核因子USFにより最初に認識される基部Eボックス配列である。USF結合を中断させる−104 Eボックス内の点突然変異はそれ相当にSTF−1プロモーター活性を減少させていることから、今回の発明ではUSFが膵島細胞に対してSTF−1発現を導く調節機構の重要な成分であることを示している。さらに、グルココルチコイドがHNF−3β及びBETA−2/E47という2つの内胚葉因子を認知する末梢膵島特異性エンハンサーの活性を妨害することによりSTF−1遺伝子の発現を強力に抑圧することを発見した。HNF−3βあるいはBETA−2/E47のいずれかの結合を妨害するSTF−1エンハンサーの突然変異はそれ相当にSTF−1プロモーター活性を妨害する。グルココルチコイド処理した細胞におけるSTF−1エンハンサー活性を回復させるHNF−3β発現ベクターの能力はHNF−3βが実際にSTF−1発現の重要な調節要因であることを示す。
この発明の1つの目的はSTF−1転写を誘導する化合物の検査方法の供給である。STF−1/lacZ融合遺伝子を発現する膵島細胞系リン酸カルシウム共沈降により分離される。STF−1発現に対する各種化合物の効果を調査するために、対象となる化合物をSTF−1/lacZ発現細胞に添加する。比色定量分析によりコントロールと処理細胞のLacZ活性を定量する。この方法を使用して、非常に多種類の化合物が選抜できSTF−1誘導化合物が迅速に同定できる。
今回の発明の別の目的は、生体内においてインシュリン生産膵島細胞を標識する方法の供給。本件に関してグリーンフルオセントタンパク(GFP)が不可欠の指示薬として使用される。GFPの発現はOgawaらの記載のとおり細胞を破壊する事なく検出できる[Ogawa et al.. :Proc. Natl. Acad. Sci., 92:11899-11903(1995)]。動物の膵臓からβ細胞の回収を容易にするために、GFPをコードする遺伝子とSTF−1プロモーターを融合させた。ブタへのSTF−1−GFP転換遺伝子の導入は膵臓からのインシュリン生産細胞の効果的で迅速な回収を可能にする。端的に述べると、ブタから膵臓を回収し細胞を離散させるためにコラーゲナーゼ処理される。インシュリン生産膵島細胞はSTF−1グリーンタンパク転換遺伝子の発現に基づく蛍光活性細胞選択(FACS)により回収される。精製したβ細胞群は糖尿病患者に対する細胞治療に使用される。
今回の発明の1つの側面においては、膵島細胞を刺激してSTF−1転写を誘導する検査化合物の能力を決定する方法の供給である。この方法は以下の段階で構成される。すなわち、SEQ ID No.1あるいはSEQ ID No.2あるいはそれらの断片群から選択された配列を持つSTF−エンハンサー、プロモーター、及び前述のSTF−1エンハンサー及び前述のプロモーターの転写制御をうけるレポーター遺伝子を持つベクターを供給する段階から構成される。ここで前述のレポーター遺伝子は前述の宿主細胞に対し認知可能な標識を与える能力がある。前述の宿主細胞に対して前述ベクターの導入の段階。前述の宿主細胞を刺激して前述の指標を生産させる前述の検査化合物の存在下での前述宿主細胞の培養の段階。および、前述の検査化合物の前述の宿主細胞を刺激し前述の認知可能な指標を生産させる前述の能力を決定するための前述の指標に対する分析の段階。ここにおいて、前述の指標の存在は前述の検査化合物が膵島細胞を刺激してSTF−1転写を誘導することを示唆する。また、前述の指標の不在は前述の検査化合物が膵島細胞にたいしてSTF−1転写誘導を刺激しないことを示している。
今回の発明のこの目的をさらに具体化すると、使用されたレポーター遺伝子は酵素である。さらにより具体化すれば、その酵素はルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼのグループから選抜される。
今回の発明の別の具体化は、前述の転移段階が動物に対する転換遺伝子のトランスフェクションあるいはマイクロインジェクション注入により実行されることである。
今回の発明のもう一方の目的は、以下の段階で構成される生体内でのインシュリン生産膵島細胞の標識づけ方法供給である。STF−1プロモーター及び前述のSTF−1プロモーターによる転写制御を受けるレポーター遺伝子を含有するベクターの供給の段階。ここにおいて、前述のレポーター遺伝子は膵島細胞に対し認知可能な標識を与える能力をもつ。前述のベクターの動物の胚への転換遺伝子の注入の段階。前述の胚の膵島細胞をもつ動物個体への育成の段階。及び前述の動物膵島細胞が前述のレポーター遺伝子を発現するか否かの決定のための前述の認知可能な標識の分析の段階。ここにおいて、標識の存在はインシュリン生産膵島細胞の存在を示し、一方、標識の不在はインシュリン生産膵島細胞の不在を示す。この方法は、これらの段階で構成される。
今回の発明のこの目的をさらに具体的にすると、このレポーター遺伝子は蛍光タンパク質を生産し、この方法は蛍光活性細胞選択(FACS)による非インシュリン生産細胞からのインシュリン生産細胞の選抜の段階を含んでいる。
ヒトゲノムはHoxあるいは相同異質形成選択遺伝子と命名され、胚形成期間中に軸体様式形成の不可欠の決定要因である4群の遺伝子を含有している[Krumlauf, Cell, 78:191−201(1994)]。その4群はそれぞれ13個までの遺伝子を含んでおり、一群から得られる遺伝子は通常他の3群の類似の遺伝子と特に高い相同性を有する。これらの関連遺伝子は、パラログス(palalogs)と命名されており、それゆえHoxA1,HoxB1,HoxC1及びHoxD1はすべて非常に関係性の強いパラログスであるが、それぞれは別の染色体上の異なったHox群に存在する。HoxB複合体は染色体17の長腕部に存在し、例えばHoxB1からHoxB9までが確認されている。
インシュリン遺伝子のグルコース依存性調節はグルコース仲介のインシュリン分泌の増加と協力して起こるようである。このことは、ある程度細胞内カルシュウムの増加のためであると推定される。加えて、グルコース反応性インシュリンプロモーター機能は、少なくともその一部はFLAT結合タンパク質の働きにより調節することにより起こることが推定される。HoxB13はインシュリンプロモーターの機能的に重要なFLAT要素と高い親和性で結合している。付け加えると、HoxB13とインシュリンICE/Nir要素結合因子Pan−1は共同して添加された場合インシュリンプロモーターを強力に活性化させる。このことはFLAT及びNir要素がインシュリン生産細胞において共同で作用するという観測結果と一致する。集約すると、これらのデータはカルシウム依存性信号経路がHoxB13の機能を調節する可能性を示している。
今回の発明に関して、在来の生物学、微生物学及び組み換えDNA技術がその技術範囲内で使われている。これらの技術はすべて論文に記載されている。例えば、次を参照Maniatis, Fritsch & Sambrook, “Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982);“DNA Cloning:A Practical Approach;Volume I and II(D. N. Glover ed. 1985);“Oligonucleotide Synthesis”(M. J. Gait ed. 1984);“Nucleic Acid Hybridization”[B. D. Hames & S. J. Higgins eds.(1985)];“Transcription and Translation”[B. D. Hames & S. J. Higgins eds.(1984)];“Animal Cell Culture”[R. I. Freshney, ed.(1986)];“Immobilized Cell And Enzyme”[IRL Press,(1986)];B. Perbal, “A Practical Guide To Molecular Cloning”(1984)。
それゆえこの文書中での出現の場合、以下の用語は以下で説明される定義で使われている。
“ベクター”はプラスミド、ファージあるいはコスミドのようなレプリコンであり、付着DNA分節の複製を生じさせるために別のDNAに付着することができるものである。
“DNA分子”は一本鎖、あるいは二本鎖らせん構造のデオキシリボヌクレオチド(アデニン、グアニン、チミンあるいはシトシン)の多重合形態に対して述べられている。この用語は分子の1次及び2次構造に対してのみ使用されるが、特殊な3次構造に関する部分に対しては制限していない。したがって、この用語の意味には直線上なかんずくDAN分子(例として制限断片)、ウイルス、プラスミド、及び染色体で見られる2重らせんDNAを含んでいる。本文で構造を考察する場合、無転換鎖のDNA(すなわちmRNAと相同的配列を持つ鎖である)の配列を5’から3’方向で示す通常の慣行に従う。
“複製の発端”とはDNA合成に参加するこれらのDNA配列のことを示す。
DNA“コーディング配列”とは正確な調節配列の支配下のもとにおかれた場合、生体内において転写されポリペプチドに翻訳される2本鎖DNA配列である。コーディング配列の境界は5’(アミノ)末端の開始コドンと3’(カルボキシル)末端の終了コドンによって決定される。コーディング配列とはそれに限られたものではないが、原核配列、真核mRNA由来のcDNA、真核(例えばヒト)DNA由来のゲノムDNA配列及び合成DNA配列までも含むことができる。ポリアデニル化シグナル及び転写終末配列は通常コーディング配列の3’末端に位置するであろう。
転写及び翻訳制御配列とはプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、その他のような、宿主細胞においてコーディング配列を発現するDNA調節配列である。
“プロモーター配列”とは細胞内でRNAポリメラーゼと結合できるDNA調節領域であり、下流(3’方向)コーディング配列の転写を開始することができるDNA調節領域である。今回の発明を定義する目的では、プロモーター配列は転写開始部からその3’末端が境界となりバックグラウンド上で認識できる水準の転写開始に必要とされる最小限の塩基あるいは要素を含む上流(5’方向)に伸びている。プロモーター配列の内部には、RNAポリメラーゼの結合の原因であるタンパク質結合ドメイン(コンセンサス配列)だけではなく、転写開始部位(ヌクレアーゼS1を使用したマッピングにより容易に定義された)が見いだされる。真核のプロモーターは頻繁に、だが常時ではなく、“TATA”ボックス及び“CAT”ボックスを含有している。真核プロモーターは−10及び−35コンセンサス配列に加えてシャイン−ダルガノの配列を含有している。
“発現制御配列”とは別のDNA配列の転写及び翻訳を制御するDNA配列である。RNAポリメラーゼがコーディング配列をmRNAに転写し、その後コーディング配列によりコードされたタンパク質に翻訳される場合には、コーディング配列は細胞内で転写及び翻訳配列の“制御支配下”にある。
“シグナル配列”はコーディング配列の前方に含まれることができる。この配列はペプチドのN−末端にあり、宿主細胞に伝達しペプチドを細胞膜を通過あるいはペプチドを媒体内へ分泌させるシグナルペプチドをコードし、また、このシグナルペプチドはタンパク質が細胞を通り過ぎる前に宿主細胞により切断される。シグナルペプチドは原核細胞及び真核細胞で生産される多様なタンパク質と結合した状態で見ることができる。
“オリゴヌクレオチド”の用語はここにおいては今回の発明のプローブに関して使用されており、2以上、多くは8以上のリボヌクレオチドから構成されている分子について定義されている。その正確な大きさは本質的な機能さらにオリゴヌクレオチドの使い方で決まる多くの要因により決まる。
ここで使用される“プライマー”の用語は制限消化物を精製させた天然物か合成されて生産されたかにかかわらず、オリゴヌクレオチドに対して使われており、そこは、プライマーエクステンション生成物が合成される状況下に置かれた場合の開始点としての機能する事ができ核酸鎖に対して相補的であり、例えば適切な温度とpHにおいてDNAポリメラーゼのような誘導薬とヌクレオチドの存在下で誘導される。プライマーは一本鎖あるいは二本鎖のいずれの可能性があり誘導薬の存在下で求めるエクステンション生産物の主要な合成が十分に長いことが必要である。プライマー正確な長さは温度、プライマーの原料及び使用する方法を含む多くの要因により決定される。例えば、診断上の適用においては、目的とする配列の構成により決定し、オリゴヌクレオチドプラーマーはより少ないヌクレオチドの含有でも可能であるが、典型的に15〜25あるいはそれ以上のヌクレオチドを含有している。
ここにおけるプライマーは目的となる特定のDNA配列の別個の鎖と“実質上”相補的なものが選択される。このことはプライマーがそれぞれの鎖を有効なものとして相補的に交雑されることが必要であることを意味している。さらに、プライマー配列は鋳型の正確な配列を反映する必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチド断片はその鎖に対し相補性をもつプライマー配列の残留物のある状態でプライマーの5’末端と接合することができる。別な言い方をすれば、非相補的塩基あるいはより長い配列をプライマー配列は配列に対し効果的相補性を所持あるいはそれをもって交雑し、及びエクステンション生成物の合成の鋳型を形成する条件でプラーマーの中に配置することができる。
ここで使用される“制限エンドヌクレアーゼ”及び“制限酵素”なる用語は、それぞれ特定のヌクレオチド配列のその地点あるいは近接点の二重鎖DNAを切断する細菌の酵素について使われる。
細胞はその内部に外因性のあるいは異型のDNAを導入された場合それらDNAにより“形質転換”される。形質転換DNAは細胞のゲノムの中に組み込まれる(共有的に結合する)可能性あるいは組み込まれない可能性の両方の可能性がある。たとえば原核生物、イースト及び哺乳類細胞では形質転換DNAはプラスミドのようなエピソーム要素の中で保持されている。真核細胞に関しては、安定した形質転換細胞は染色体複製を通じた娘細胞により遺伝するため形質転換DNAは染色体の中に組み込まれている。この安定性は真核細胞の形質転換DNAを持つ娘細胞の集合体で構成される細胞系統やコロニーを作り出す能力により示される。“クローン”とは単一の細胞あるいは共通の原種から分裂によって派生する細胞集合体の事である。“細胞系統”とは何代にもわたり試験管内で安定的に成長することができる1次細胞のコロニーである。
2つのDNA配列はDNA配列の配列が確定された長さに対してヌクレオチド最低約75%(一般的に言えばは少なくとも約80%、最も厳密に言えば少なくとも約90〜95%)適合する場合“実質的に相同”である。実質的に相同である配列は配列データバンクを利用できる標準ソフトウエアー配列比較あるいは例えば特殊システムに対して定義される厳格な条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験により同定される。定義される正確なハイブリダイゼーション条件は既存技術である。たとえば、上記の「Maniatisらの著作」、「DNA Cloning, Vols. I&II」「Nucleic Acid Hybridization」参照。
DNA構造物の“異型”領域は自然界でより大きな分子と会合した形で見いだされない、より大きなDNA分子の内部で識別可能のDNA分節である。したがって、異型領域が哺乳類の遺伝子をコードする場合、その遺伝子は元来の器官のゲノムにおいて哺乳類ゲノムDNAに側面を接しないDNAにより通常側面を接するであろう。別の例ではコーディング配列はコーディング配列それ自身が自然界では発見できない構造物に見られる。(例えば、ゲノムコーディング配列がイントロンを含むcDNAあるいは天然の遺伝子とは異なるコドンをもつ合成配列)。対立遺伝子の変異物あるいは自然発生の突然変異ではここで定義された様なDNAの異型領域を発生させることはない。
今回の研究で最も一般的に使用されている標識は放射性元素、酵素、紫外線を照射した場合に蛍光を発する化学物質、その他である。多種類の蛍光物質が知られており標識として使用することができる。これらには、例えば、フルオレセイン、ローダミン、オーラミン、テキサスレッド、AMCAブルー及びルシフェルイエローが含まれる。特殊な識別物質にはヤギで調製されイソチオシアネートによりフルオレセインと接合された抗ウサギ抗体である。
酵素標識も同様に有効あり、現在利用されている比色定量、分光分析、蛍光分光分析、アンペロメトリクあるいは気体定量の各技術のいずれかによって認識できる。その酵素はカルボジイミド、ジイソシアン酸、グルタラルデヒド、その他のような架橋分子と反応により選択された粒子と接合する。これらの手法に使用できる多種類の酵素が知られており、実際に効果がある。具体例を挙げるとペルオキシダーゼ、βグルクロニダーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ付加グルコースオキシダーゼ及びアルカリ性ホスファターゼである。U.S.Patent Nos. 3,654,090、3,850,752及び4,016,043には外の標識物質及び方法に関する明細書の実施例が言及されている。
以下の実施例はこの発明の様々な具体例を示す目的で記載されており、いかなる方法においても今回の発明に制限を持たせる意味ではない。
実施例1
染色体地図作製
STF−1遺伝子の染色体地図作製はJackson Laboratory Backcross DNA Panel Map Service社の(B6×SPRET)F1×SPRET戻し交雑パネル材料に32P標識STF−1 cDNA断片をプローブとして使用して実施された。
実施例2
トランスジェニックマウスの発生及びβガラクトシダーゼ染色
β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子の全面にSTF−1配列の上流部6500塩基対を含む融合遺伝子は通常のクローニング手法を使用して構築され受精卵の雄性前核に注入する。創始者マウスはサザンブロッティング及びPCR増幅技術を使用して決定される。STF−1/β−ガラクトシダーゼ遺伝子のトランスジェニック組織での発現は染色基質としてX−galしたパラホルムアルデヒド固定組織の20μM切片により評価された。
実施例3
抗体
スーパーシフト試験に使用する非識別USF−1,2抗体はSanta Cruz Biotechnologyより購入した。TFE3抗体はK. Jonesより入手した。USF−1あるいはUSF−2を特異的に認識する抗体はM. Sawadogoにより供給された(17,18)。
実施例4
STF−1ゲノムクローンの分離
STF−1遺伝子はハイブリダイゼーションプローブとして32P標識 STF−1 cDNA断片を使用してEMBL3ラットゲノムライブラリーから分離された。STF−1陽性ゲノム断片はSKIIプラスミド(Stratagene)のEcoRI部位にサブクローン化された。
実施例5
RNアーゼ防護及びプライマーエクステンション
ポリA+RNAはオリゴテックス(dT)30システム(Quiagen)を使用して調製した。プライマーエクステンション分析のオリゴヌクレオチドプライマーはγ−32P ATP及びT4ポリヌクレオチドキナーゼを使用して5’末端が標識されてる。5μgのポリA+RNAは末端標識アンチセンスプライマーと最初に80℃で5分間、続いて42℃で16時間インキュベートした。プライマーエクステンション反応はAMV逆転写酵素37℃、1時間の条件で行われ生成物は5%変成ポリアクリルアミドにより分析された。RNアーゼ防護反応はTu6細胞から抽出された全RNAの25μg使用して行われた(19)。反感覚STF−1 RNAプローブは転写開始部位を起点として−185〜+93まで広がるSTF−1ゲノム断片を使用して生成される。32P標識アンチセンスSTF−1 RNAは試験管内でT7 RNAポリメラーゼと32P−UTP合成された。STF−1アンチセンスRNA及びmRNAは80℃で5分間アニーリングさせた後65℃で16時間インキュベートした。アニーリング反応物は続いて40μg/ml RNアーゼにより室温で1時間処理され、消化物は5%変成ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析された。
実施例6
レポータークローン及びトランジエットトランスフェクション
すべてのプロモーターはD. Helinski(20)が示した通常のクローニング手法を使用してp(A)3ルシフェラーゼバックボーンの中でクローンとされた。STF−1プロモーター由来の5’フランキング配列は主要転写開始部位を起点として+68部位(−6500 STF Luc,−3500 STF Luc,−540 STF Luc,−410 STF Luc,−225 STF Luc,−140 STF Luc)あるいは+78部位(−190 STF Luc,−130 STF Luc,−120 STF Luc,−95 STF Luc,−35 STF Luc)にルシフェラーゼ遺伝子を融合された。プラスミドはリン酸カルシウム沈殿によりHIT−T15細胞(ATCC)、βTC3(D. Hanahanの方法による(21))、PC12,COS及びHeLa細胞に対してトランスフェクトされた。ルシフェラーゼ値はムーンライトルミノメーターにより計測され、並びに同時トランスフェクトされたRSV−CAT内在制御プラスミドによりCAT活性を正常化させた。
実施例7
ゲル移動分析及びDNアーゼ防護分析
電気泳動分析ではオリゴヌクレオチドプローブはクレノールの断片を使用した補完反応によりα32P−dCTPにより標識された。4μgの核抽出物は0.5ngの32Pで標識された二本鎖オリゴヌクレオチドとインキュベートされ、先に記載の通り(9)無変成ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を受ける。スーパーシフト分析ではタンパク質は抗体とプレインキュベートされ、続いて放射性二本鎖オリゴヌクレオチドとインキュベートされ電気泳動される。DNアーゼ防護は先に記載の通り行われた(22)。
DNA結合の泳動像はHP ScanJet 3Cにより実物の写真を走査されマッキントッシュを使ったCanvasソフトウエアーにより組み立てられる。走査映像はTektronix Phaser II SDXにより再現された。
実施例8
STF−1遺伝子の染色体上の所在及びゲノム構造
STF−1 cDNAをJackson Laboratoriesから得られたDNAのバックロッスパネル上でハイブリダイゼーションプローブとして使用することにより、STF−1遺伝子のシングルコピーはマウス染色体5の末梢領域に位置が定められた(図1A)。末梢の遺伝標識であるPmv12あるいはIapls3−9との組み換えは見られなかったが、一方、さらに末梢部に所在するActb遺伝子座6個の組み換えが観察された。(図1B)。これらの結果はSTF−1遺伝子はラットでは染色体14に、ヒトでは染色体7qで見いだされ、その遺伝子座は4つのホメオティクHOX群のいずれとも一致していないことを予言している。これらの結果はSTF−1は分類がされていない“オルファン”ホメオボックス遺伝子であることを示している。
STF−1をコードする遺伝子を分離するために32P標識STF−1 cDNAを持つラットEMBL3ゲノムライブラリーから106個のバクテリオファージクローンがスクリーニングされ15キロベース(kilobases)が挿入されたゲノムをそれぞれ含有する陽性クローンが得られた。6.5kbの5’フランキング配列と3.5kbの3’フランキング配列が加わった、15キロベースSTF−1ゲノム断片はホメオボックスコーディング配列(アミノ酸140−215)の近接の上流(Ala135)に挿入されている1本の4キロベースイントロンによって中断されている完全なSTF−1コーディング領域を含んでいる(図2A)。
STF−1ゲノムクローン(図2B)の5’フランキング領域には一般に広く存在しているTATAボックス及びイニシエーターの配列が存在しない。次に、この遺伝子の転写開始部位を地図で示した。インシュリン生産細胞系RIN及びTu6由来のmRNAに対するRNアーゼ防護及びプライマーエクステンション分析により(図2C及び図2D)、S1,S2及びS3と命名され、それぞれ翻訳開始部位から91,107,120/125ヌクレオチド上流に所在する3つの主要な開始部位が決定された。翻訳開始部位から137ヌクレオチド上流のある4番目の比較的重要ではない転写開始部位も観測された。他のTATA欠如プロモーターと同様に、STF−1プロモーターもS1及びS2開始部位から30塩基対上流にG/A及びG/C豊富な配列を含んでいる(23−25)。
実施例9
膵島細胞におけるSTF−1プロモーター活性
STF−1遺伝子の5’フランキング領域配列が膵島細胞に対してSTF−1発現させることに有効か否か決定するために、STF−1の5’フランキング配列の6500塩基対をβ−ガラクトシダーゼ遺伝子に融合させ、トランスジェニックマウスにおいてSTF−1−lac zレポーターの発現を色素原基質としてX−galを使用してみると、β−ガラクトシダーゼ活性はトランジェニックの膵島で観測できるが3つの独立した創始者系統由来のコントロールの同腹子では観測できなかった(図3A)。
内因性STF−1タンパク質に対して先に記載した発現様式と一致して、有効なβ−ガラクトシダーゼ活性はトランスジェニックマウスの外分泌腺房細胞(図3B)あるいは肝臓や脾臓のような膵臓以外の組織(未掲示)では観察されない。
十二指腸における内因性STF−1遺伝子の報告されている発現(8,13)と一致して、抗感覚β−ガラクトシダーゼRNAプローブを使用した生体内でのハイブリダイゼーション研究ではまたトランスジェニック動物由来の十二指腸の上皮細胞において転換遺伝子発現を明らかにしている(未掲示)。これらの結果はSTF−1プロモーターの6500塩基対が膵島及び十二指腸細胞に対して目的とするSTF−1の発現に実際に十分効果があることを示している。
膵島細胞に対してSTF−1発現を導く機能的要素を定義するために、−6500 STF Lucレポーターの活性を2つの別個の膵島細胞系(βTC3,HIT)で調査した。トランジェニックマウスでの結果から予測されるようにSTF−1レポーターはこれらの膵島細胞において、HeLa,PC12及びCOSのような非膵島系に比較して20〜100倍の高い活性を示す(図4A)。対照的にSTF−1遺伝子の4キロベースのイントロン及び3キロベースの3’フランキング領域では最小のSV40 CATプロモータープラスミドに挿入された場合にはこのような活性は見られず(未掲示)、6.5キロベースSTF−1プロモーター断片は膵島細胞における目的とされるSTF−1発現を特異的に招くことを暗示する。
膵島細胞発現を与えるSTF−1プロモーター内部の配列を図示するために、一連の5’欠損変異構造物を生成させこれらのレポーターをHIT細胞にトランスフェクションすることにより分析された(図4B)。−6500レポーター構造物由来の−6500〜−3500塩基対までの配列の欠損変異はSTF−1レポーター活性を4分の1に減少させる。このことはその領域において末梢部賦活領域の存在を暗示する。さらに−3500塩基対から−190塩基対までのSTF−1プロモーターの先端切断HIT細胞におけるレポーター活性に意味をもつような影響を与えない(図4B)。しかしながらSTF−1の−190〜−95塩基対までの欠損はHIT細胞のレポーター活性を激的に弱め、基部の要素もまたSTF−1プロモーター機能に必要であることを示している。STF−1プロモーターの−190〜−95の領域における配列の綿密な調査の結果は3つの一致したEボックス主要素を示している(図2A)。−177部位の2つ並んだEボックスの除去はプロモーター活性を減少させないが、−104(−95 STF luc)部位の基部Eボックス配列の欠損はHIT細胞におけるSTF−1発現を完全に消滅させる。
実施例10
USF含有複合体を認識するSTF−1プロモーター上の基部Eボックス
STF−1プロモーター中の機能的要素と結合する上流因子を特徴づけるために、DNアーゼI防護分析はHIT及びHeLa細胞由来の核抽出物を使用することにより行われた(図5A)。両方の抽出物において、優越したフットプリンティング活性はその境界機能的に重要な基部Eボックス主要素(−118/−95)と一致する。HeLa抽出物に対照してHIT抽出物において重要な−104Eボックス結合タンパク質のさらなる特徴付けのためゲル移動度分析を行った。−118〜−95までに広がる二本鎖STF−1オリゴヌクレオチドを使用すると、C1,C2,C3と命名された3つの化合物が両方の核抽出物から確認された(右欄、図5B、1及び4レーン)。C1,C2及びC3化合物の形成は結合反応における50倍過多の無標識STF−1 Eボックス競合オリゴヌクレオチドにより抑制された。突然変異Eボックスヌクレオチドあるいは非特異的競合DNAはこれら結合活性に影響を持たないが、C1,C2,C3はSTF−1 Eビックス配列に対し実際に特異的であることを示している。HeLaとHIT抽出物の間でこれら化合物がつくる型には質的差異は見られなく(未掲示)、−104Eボックス主要素は両方の細胞種において比較できる程度に発現する因子を認知するであろうことを暗示している。
以前の報告では−118/−95 STF−1主要因(CACGTG)はmyc,max,TFE−3,TFE−B及びUSFのようなbHLH−ZIPタンパク質に優先的に結合することが示されていた。これらの候補タンパク質のそれぞれがC1,C2あるいはC3複合物内部に含まれているのかどうかを決定された(26,27)。−118/−95Eボックス結合タンパク質の熱変成抵抗に対する能力(未掲示)により熱安定上流因子のUSFのいずれがC1,C2あるいはC3の構成成分であるかの試験が行われた(未掲示)(28)。ゲル移動度反応における抗USF抗結成の添加は3つの複合物すべての形成を著しく抑制する(図5C)。しかし、抗TFE−3抗血清はC1,C2あるいはC3複合体に対して影響を与えず、これらの複合体は高い可能性でUSFタンパク質により形成されることを暗示している。ゲル移動分析において、組み換えUSF−1はC2複合体と同じ位置に移動するタンパク質DNA複合体を生じさせた(未掲示)。加えてDNアーゼI防護研究においては、組み換えUSF−1のフットプリンティング活性はHIT抽出物で得られる結果と一致する(図5A)。
USF−1及びUSF−2と命名されたUSFのほとんどの細胞型において発現される(18)。これらUSFタンパク質どちらがC1,C2及びC3複合体内部に含まれているか識別するために、HITあるいはHeLa抽出物を抗USF−1特異性あるいは抗USF−1特異性抗血清のいずれかとインキュベートした(図5D)。USF−1抗血清は3種類の複合物のすべてを“スーパーシフト”することができたが、USF−2特異性抗血清C1及びC3複合体のみの形成を抑制する。これらの結果はC1及びC3複合体はUSF−1/USF−2ヘテロダイマーに相当し、一方C2はUSF−1ホモダイマーを含有している可能性を示している。
CACGTG Eボックス配列がSTF−1プロモーター活性に不可欠か否かを証明するためにEボックス上2つの塩基対(−118/−95)の置換を含むSTF−1オリゴヌクレオチド突然変異が生成された。HIT核抽出物をともなうゲル移動度分析においては、この突然変異Eボックス主要素(AACGCG)はC1,C2及びC3を形成することはできなく、野生型Eボックスヌクレオチドに対するUSF−1の結合に対し競合することもできない(図6A)。対応して、突然変異STF E主要素を含有する完全な長さ(6.5キロベース)をもつSTF−1及び先端切断(−190 STF)レポータープラスミドは膵島細胞において野生型複製と比較して約10分の1の活性しか持たない(図6B)。これらの結果はUSFと結合する基部EボックスがSTF−1プロモーター活性に対し実際に不可欠なものであることを表している。
したがって、STF−1 5’配列の最初の6500塩基対内に存在する2つの要素は膵島発現に重要のようである。末梢要素は−6500〜−3500の間に所在し、基部要素は−104に所在する。基部−104要素は上流活性化因子USFを認知する一致Eボックス主要素を構成する。複数の連続した証拠はUSFがSTFプロモーター活性に重要であることを示している。最初に、区別することのできないUSF−1,2抗体の両方はUSF−1及びUSF−2特異性抗体と同様にSTF−1 Eボックスに対して特異的な複合物を認知する。2番目に、HIT核抽出物に対するSTF−1 Eボックス結合活性はUSFを連想させる特性を持つ。この複合体は熱安定的で組み換えUSF−1と同様に半数の活動が持続することを示す。最後に、STF Eボックス上のUSF形成を抑制する点突然変異はSTF−1レポーターそれ相当に弱める。これらの結果はUSF複合体はSTF−1プロモーター活性にとって実際に重要であり、その結果として膵臓形態形成に重要であることを暗示している。
USFに添加されたほかの核因子、最も顕著なものはmyc及びmaxであるが、それもまたSTF−1 Eボックス(CACGTG)主要素に対し高い親和性により結合することができる。mycは、Eボックス主要素へのmaxのヘテロダイマーのような結合によって標的遺伝子転写を刺激することが示されている。myc遺伝子発現は膵島注中のような有糸分裂後の典型的な細胞においては識別できないことから、myc−max複合体にはSTF−1プロモーター調節機能を持たないと推定される。しかしながら発生の期間中、STF−1発現は増殖中の管状細胞に濃縮され(6)、myc mayはこれらの条件下で結果的にSTF−1発現を刺激すると思われる。この点については、膵臓発生期間中に観察されるSTF−1発現の激しい変化は、その一部は膵島細胞に対しSTF−1生産を最終的には限定するEボックス結合活性の変化を反映していると思われる。
実施例11
ゲル移動分析及びDNアーゼI保護分析
電気泳動移動分析に関して、2本鎖オリゴヌクレオチドがクレノール断片を用いた32P dCTP補完反応により標識された。5マイクログラムの核抽出物0.5ngの標識オリゴヌクレオチド及び1μg非特異的競合DNAともに氷上で30分インキュベートし、非変成ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけられた。抗HNF−3α,HNF−3β及びHNF−3γ抗体はS. Duncan及びJ. Darnellの好意により供給された。抗BETA−2抗体はM. J. Tsaiの好意により送られたものである。抗E2A抗体はSanta Cruz Biochemicalsより購入した。DNアーゼI保護分析は先に記載されている方法に従い行われた(37)。組み換えHNF−3αはK. Zaretより入手した。
実施例12
ノーザンブロッティング
ソマトスタチノーマ/インシュリノーマTu6細胞はエタノールあるいは10-7デキサメタゾン中で時間を変えて培養された。すべてのRNAはグアニジニウム−フェノール法を使うことにより抽出された。全RNAのうちの15マイクログラムをホルムアルデヒドを含むアガロースゲルで分離されZetaプローブに転写される。ランダムプライムSTF−1とチューブリンcDNAはAmersham random priming kitにより濃縮された。
実施例13
膵島特異性エンハンサーを経由してSTF−1発現を調節する内胚葉分子HNF−3β及びBETA−2
STF−1遺伝子の−6200〜−5670領域に広がって存在する530塩基対を含んだプロモター構造物はデキサメタゾン処理により完全に抑圧されるが、偏在するUSF−1認知部位を含有する最小STF−1プロモーター構造物は抑圧されない(図7a)。STF−1の同じ530bp領域はHIT−T15細胞においてはCOS−7細胞中と比較し5〜10倍の高い活性を示し、この断片は膵島細胞特異性活性があることを示している(図7b)。細胞特異性STF−1エンハンサー内のヌクレオチド配列の厳密な調査からEボックス結合タンパク質対するコンセンサス主要素(−5.98〜−5.963)及びHNF−3に対する主要素(−5.927〜−5.907)を表した(図7c)。B要素とよばれるEボックスの主要素の配列ははラットインシュリンI及びIIプロモータ内のNIR及びFAR要素の配列と同一である(34)。そして、H要素としして言及されるHNF−3部位はHNF−3調和結合部位の12カ所のうちの9カ所と一致する。
B及びH要素が膵島特異的核タンパク質により実際に認知されるのかを決定するために−5870〜−6100の範囲に存在する32P標識STF−1エンハンサー断片を使用したDNアーゼI保護分析を行った。HIT T15細胞から調整された核抽出物にはB(Eボックス主要素)及びH(HNF−3主要素)の両方の部位に対するDNA結合活性を含むことが見いだされる。B要素はHIT,Hela,COS7細胞のいずれの核抽出物とのDNアーゼI保護分析比較において可能な程度まで防護されるが、一方H要素の防護はHIT細胞由来の核抽出物を伴う場合のみ観察される(図8a、2及び4レーンを比較)。H要素フットプリントを分断する主要な過敏性部位もまた、精製した組み換えHNF−3αタンパク質を含む反応で示され、HIT−T15細胞において調節物の多種類のHNF−3族がSTF−1 H要素と結合する考察される(図8a、2及び5レーンを比較)。
STF−1エンハンサーのH要素を認識する核因子をさらに特徴づけるために32P標識STF−1 H要素プローブを使用したゲル移動度分析を行った。HITあるいはRIN核抽出物を含む反応により1つの主要な低移動度の複合体が観測できこの複合体の形成が100倍の分子過剰の未標識野生型H要素競合DNAにより阻害されるが、突然変異のものでは見られない(図8b,4−5,9−10,14−15レーンを比較)。Hela核抽出物を含む反応では特異的なタンパクDNA複合体は見られず、H要素は限られた発現様式のもとで核因子を認識すると推定される(図8b,1,6レーンを比較)。しかし、HepG2肝腫瘍抽出物において存在するH要素特異的複合体はRIN/HIT−T15複合体と同じ移動度の地点に移動することから、H要素結合タンパク質は一般に内胚葉起源の細胞内に表現される可能性が示された(図8b,3−5レーンを比較)。
核活性因子のHNF−3族は高度に保存された翼状ヘリックスドメインを経由してDNAと結合する3個の遺伝子、(α,β,γ)で構成される。HIT抽出物中でのH要素結合活性がHNF−3族のどれに相当するのかを決定するために、HNF−3族それぞれに対する特異的抗血清を使用したゲル移動度研究を行った。ウエスタンブロット分析において3種のHNF−3タンパク質のそれぞれが核抽出物中に見いだされたが(未掲載)、HNF−3β抗血清のみはH要素プローブとともに同じ抽出物を使用すると主要タンパク−DNA複合体の形成を阻止する(図8c、1−4レーン)。生体ラット膵島細胞の1次培養細胞から調整された核抽出物のゲル移動分析からも同一結果が得られた(図8c、5−8レーン)。
STF−1エンハンサー内のB要素インシュリンプロモーターのEボックス要素と同一構造の一致Eボックス主要素を含有している。以前の研究で膵島特異性因子BETA−2は偏在性因子E47を持つヘテロダイマーとしてこれらインシュリンプロモーター要素に結合することによりインシュリンプロモーター活性を高めることを示し、その結果に基づいて、STF−1 B要素に対するBETA−2/E47ヘテロダイマー形成試験を行った。HIT核抽出物のゲル移動分析において32P標識B要素プローブは未標識野生型B要素オリゴヌクレオチドの添加により競合を受けることができるが、突然変異型では受けることができない4種の特異的DNAタンパク質の形成が観測される(図8d、1,5,6レーンを比較)。最も移動速度の遅い複合体は組み換えE2A/BETA2ヘテロダイマー複合体が示す位置と同じ位置に移動する(図8d、1及び7レーンを比較)。関連性の無い抗血清はB要素結合活性に何の効果をもたらさないが(図8d、4レーン)、BETA−2あるいはE2A抗血清は最も移動速度の遅い複合物の形成を特異的に抑制し(図8d、2及び3レーン)、このことは、BETA−2/E47ヘテロダイマーはHIT核抽出物においてB要素を実際に認知することを明らかにしている。
STF−1エンハンサー活性仲介におけるHNF−3β及びE2A/BETA−2認識部位の重要さを評価するために、我々は試験管内でこれらの同族の因子との結合を妨害するB及びH要素に点突然変異を生じさせた。530bpのエンハンサーの前後関係を試験した時にはBあるいはH要素のいずれかの突然変異を含有するSTF−1レポータープラスミドはHIT T15細胞において野生型構造物に比較して低い活性を示す(図9a)。それに対して、COS−7細胞においては突然変異B及びH要素構造物は野生型−6500 STF−1レポーターと同等の活性を示す。しかしながら、これらの突然変異は膵島細胞と特異的に提携する転写活性を妨害することを示している。対応して、B及びH要素変異STF−1レポータープラスミドはまたHIT−T15細胞においてデキサメタゾン誘導に対して非応答性であり、このホルモンはE2A/BETA2あるいはHNF−3β活性のいずれれかに効果的に干渉することが推定される(図9b)。
末梢エンハンサーにおけるHNF−3βあるいはBETA2/E47活性を妨害することによりデキサメタゾンがSTF−1発現を減少させるかどうかを評価するためにHNF−3βあるいはBETA−2及びE47エフェクタープラスミドを使用してトランジエントトランスフェクション試験が行われた。HNF−3β(図9b)あるいはBETA−2/E47(未掲載)の過大発現は刺激を受けていないHIT−T15細胞におけるSTF−1レポーターの発現に対し、ごくわずかな効果しか持たない(図9b、1および5番目の縦棒を比較)。HNF−3βは野生型STF−1レポーター活性に対するデキサメタゾンの減少を抑制するように見える(図9b,1,3,7の縦棒を比較)、しかし、BETA−2/E47,STF−1及びHNF−4のような活性化因子はデキサメタゾン処理した細胞においてSTF−1プロモーター活性を減少させない(未掲載)。増量したエフェクタープラスミドを使用した滴定実験によると、HNF−3βは線量依存法により−6500 STF−1 LUCレポーター活性を減少させることが分かった(図9c)。しかしながら、HNF−3βはH要素の変異を含む変異STF−1レポータープラスミドの活性を強力にすることは無く、この活性化因子の抑制効果はSTF−1エンハンサーの認識部位を経由して起こることを暗示している。
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29. Krumlauf, R., Cell;78, 191−201(1994)
30. Boncinelli, E., et al., Hum. Reproduc.;3,880−886(1988)
31. Lewis, E. B., Nature;276, 565−570(1978)
32. Kretzner, L., et al., Nature;359, 426−429(1992)
33. Blackwood, E., et al., Science;251, 1211−1217(1991)
34. Edlund, T., et al., Science;230:912−916(1985)
35. Clark, K., et al., Nature;364:412−420(1993)
36. Lai, E., et al., PNAS;90:10421−10423(1993)
37. Sharma, et al., JBC;271:2294−2299(1996)
配列のリスト
(1)一般情報
(i)出願人:モントミィとシャルマ
(ii)発明の名称:膵臓ランゲルハンス島細胞においてSTF−1発現を刺激する化合物の特徴づけの新方法
(iii)配列の数:4
(iv)対応する住所
(A)あて先:ジェイムス エフ.ウエイラー,法代理人
(B)街路:スイート 1560,ワン リバーウエイ
(C)都市:ヒューストン
(D)州:テキサス
(E)国:アメリカ合衆国
(F)郵便番号:77056
(v)コンピュータ読取方式:
(A)メディアタイプ:DS,HD1.44Mb/1.44Mo
(B)コンピュータ:IBM互換型PC
(C)オペーレーティング システム:PC−DOS/MS−DOS
(D)ソフトウェア:ワードパーフェクト6.0
(vi)現出願データ:
(A)出願番号:譲渡されない
(B)出願日:
(C)分類:実用
(viii)弁理士/代理人に関する情報:
(A)氏名:ウエイラー,ジエイムス エフ.
(B)登録番号:16,040
(C)参考/処理番号:D-5848
(ix)電信電話情報:
(A)電話:713-626-8646
(B)テレファックス:713-963-5853
(2)SEQ ID NO:1の情報
(i)配列特徴:
(A)長さ:403bp
(B)タイプ:核酸
(C)繊維状:2本
(D)トポロジー:ライナー
(ii)分子タイプ:
(A)記事:他の核酸
(iii)ヒポセチカル:なし
(iv)アンチセンス:なし
(vi)本来のソース:
(B)菌株:
(C)個体分離:
(D)開発段階:
(F)組織タイプ:
(G)細胞タイプ:
(H)細胞株:
(xi)配列図示:SEQ ID NO:1:
(3)SEQ ID NO:2の情報
(i)配列特徴:
(A)長さ:490bp
(B)タイプ:核酸
(C)繊維状:2本
(D)トポロジー:ライナー
(ii)分子タイプ:
(A)記事:他の核酸
(iii)ヒポセチカル:なし
(iv)アンチセンス:なし
(vi)本来のソース:
(B)菌株:
(C)個体分離:
(D)開発段階:
(F)組織タイプ:
(G)細胞タイプ:
(H)細胞株:
(xi)配列図示:SEQ ID NO:2:
(4)SEQ ID NO:3の情報
(i)配列特徴:
(A)長さ:20bp
(B)タイプ:核酸
(C)繊維状:単繊維
(D)トポロジー:ライナー
(ii)分子タイプ:
(A)記事:他の核酸
(iii)ヒポセチカル:なし
(iv)アンチセンス:なし
(vi)本来のソース:
(B)菌株:
(C)個体分離:
(D)開発段階:
(F)組織タイプ:
(G)細胞タイプ:
(H)細胞株:
(xi)配列図示:SEQ ID NO:3:
(5)SEQ ID NO:4の情報
(i)配列特徴:
(A)長さ:20bp
(B)タイプ:核酸
(C)繊維状:単繊維
(D)トポロジー:ライナー
(ii)分子タイプ:
(A)記事:他の核酸
(iii)ヒポセチカル:なし
(iv)アンチセンス:なし
(vi)本来のソース:
(B)菌株:
(C)個体分離:
(D)開発段階:
(F)組織タイプ:
(G)細胞タイプ:
(H)細胞株:
(xi)配列図示:SEQ ID NO:4:
Claims (9)
- 試験化合物の膵島細胞を刺激してSTF−1転写を誘導する能力を決定する、次のステップを含む方法。
下記のSEQ ID No.1の配列又はその断片のうち少なくともSEQ ID No.1における主要な転写開始部位S1(0)から、それの−104塩基部位に位置するEボックス要素(CACGTG)までの配列を有する転写調節配列、及び該転写調節配列の転写制御を受け、宿主細胞に識別可能な標識を与えるレポーター遺伝子を含有するベクターを供給するステップと、
前記ベクターを前記宿主細胞へ移転するステップと、
前記宿主細胞を刺激し前記の標識を生産させる試験化合物の能力を決定するために該試験化合物の存在下で前記宿主細胞を培養するステップと、
標識の存在は試験化合物が膵島細胞を刺激しSTF−1転写を誘導したことを示し、標識の不存在は試験化合物が膵島細胞に対しSTF−1転写を誘導させる刺激を与えなかったことを示す、宿主細胞に前記識別可能な標識を生産させる刺激を与える試験化合物の能力を決定するための前記標識を分析するステップ
- レポーター遺伝子が酵素である請求項1の方法。
- 酵素がルシフェラーゼ及びβ−ガラクトシダーゼの群から選択される請求項2の方法。
- 移転するステップがトランスフェクションによって行われる請求項1の方法。
- 膵島細胞がHIT細胞である請求項4の方法。
- 移転するステップがトランスジーンを動物(ヒトを除く)内へマイクロインジェクション誘導によって行う請求項1の方法。
- 生体内インシュリン生産膵島細胞を標識化する次のステップを含む方法。
上記のSEQ ID No.1の配列又はその断片のうち少なくともSEQ ID No.1における主要な転写開始部位S1(0)から、それの−104塩基部位に位置するEボックス要素(CACGTG)までの配列を有する転写調節配列、及び該転写調節配列の転写制御を受け、膵島細胞に対し認知可能な標識を与えることができるレポーター遺伝子を含有するベクターを供給するステップと、
前記ベクターをトランスジーンとして動物(ヒトを除く)の胚に導入するステップと、
前記胚を膵島細胞を持つ個体に成長させるステップと、
前記動物の膵島細胞が、標識の存在がインシュリン生産膵島細胞の存在を示し、標識の不在がインシュリン生産膵島細胞の不在を意味する前記のレポーター遺伝子を発現させたかを決定するための前記の識別可能な標識分析のステップ。 - レポーター遺伝子が蛍光タンパク質を作る請求項7の方法。
- 前記方法がさらに蛍光活性化細胞選別(FACS)により、非インシュリン生産膵島細胞とインシュリン生産膵島細胞とを選別するステップを含む請求項8の方法。
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