JPH07255500A - トロンビンレセプターの活性化を阻止する物質を同定するための試験法 - Google Patents
トロンビンレセプターの活性化を阻止する物質を同定するための試験法Info
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- JPH07255500A JPH07255500A JP7054690A JP5469095A JPH07255500A JP H07255500 A JPH07255500 A JP H07255500A JP 7054690 A JP7054690 A JP 7054690A JP 5469095 A JP5469095 A JP 5469095A JP H07255500 A JPH07255500 A JP H07255500A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 トロンビンレセプター特異性アンタゴニスト
を同定するための試験法を提供する。 【構成】 該試験法は、ａ）トロンビンレセプターを内
因的に発現する細胞系を選択するかまたはトロンビンレ
セプター組換え体を安定に発現する細胞系を製造する工
程、ｂ）工程ａ）による宿主細胞を組換えベクターでト
ランスフェクションする工程、ｃ）工程ｂ）による細胞
を樹立する工程、ｄ）工程ｃ）から細胞に被験物質を暴
露する工程、ｅ）工程ｄ）による細胞内でのリポーター
遺伝子の発現を測定する工程を包含する。 【効果】 トロンビンレセプター拮抗作用を有する物質
の有効な大規模スクリーニングの実施が可能である。
を同定するための試験法を提供する。 【構成】 該試験法は、ａ）トロンビンレセプターを内
因的に発現する細胞系を選択するかまたはトロンビンレ
セプター組換え体を安定に発現する細胞系を製造する工
程、ｂ）工程ａ）による宿主細胞を組換えベクターでト
ランスフェクションする工程、ｃ）工程ｂ）による細胞
を樹立する工程、ｄ）工程ｃ）から細胞に被験物質を暴
露する工程、ｅ）工程ｄ）による細胞内でのリポーター
遺伝子の発現を測定する工程を包含する。 【効果】 トロンビンレセプター拮抗作用を有する物質
の有効な大規模スクリーニングの実施が可能である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、トロンビンレセプター
アンタゴニストを同定するための試験法に関する。
アンタゴニストを同定するための試験法に関する。
【０００２】
【従来の技術】トロンビンは、血液凝固カスケード機構
の中心的酵素である。該酵素は、たとえば血管の損傷後
の自然環境下で重要であり、ならびに血管系の病理学的
変化の際にも重要である一連の活性を惹起する。
の中心的酵素である。該酵素は、たとえば血管の損傷後
の自然環境下で重要であり、ならびに血管系の病理学的
変化の際にも重要である一連の活性を惹起する。
【０００３】プロテアーゼトロンビンは、可溶性フィブ
リノーゲンの不溶性フィブリンへの変換を触媒するだけ
でなく、血小板凝集のアクチベーターでもある。動物実
験で、外ならぬこの活性は病理学的動脈血栓生成の原因
でありうることを示す。血小板上でのプロテアーゼトロ
ンピンとトロンピンレセプターとの間の相互作用の性質
は長い推測の対象であった。これが純結合機構であるか
またはレセプターのタンパク質分解的変化であるか否か
は、ビュ（Ｖｕ）等（Ｃｅｌｌ ６４，第１０５７頁〜
第１０６８頁、１９９１年）によりヒトのトロンビンレ
セプターのクローニングによって解明された。
リノーゲンの不溶性フィブリンへの変換を触媒するだけ
でなく、血小板凝集のアクチベーターでもある。動物実
験で、外ならぬこの活性は病理学的動脈血栓生成の原因
でありうることを示す。血小板上でのプロテアーゼトロ
ンピンとトロンピンレセプターとの間の相互作用の性質
は長い推測の対象であった。これが純結合機構であるか
またはレセプターのタンパク質分解的変化であるか否か
は、ビュ（Ｖｕ）等（Ｃｅｌｌ ６４，第１０５７頁〜
第１０６８頁、１９９１年）によりヒトのトロンビンレ
セプターのクローニングによって解明された。
【０００４】トロンビンレセプターはいわゆる７−トラ
ンスメンブラン−ドメイン−レセプター族の一員であ
る。そのアミノ末端は細胞外にトロンビンに対する共通
の切断個所を有する。この個所におけるトロンビンによ
るタンパク質分解的切断が新しいアミノ末端を現わし、
これがいわゆる“束縛リガンド（ｔｅｔｈｅｒｅｄｌｉ
ｇａｎｄ）”としてレセプターを活性化する。レセプタ
ーの活性化を阻止しうる物質は、治療的に極めて有用で
ある。ヒルジン（Ｈｉｒｕｄｉｎ）またはＤ−Ｐｈｅ−
Ｐｒｏ−Ａｒｇ−クロロメチルケトンのような公知トロ
ンビン阻害剤の使用が考えられる。しかし、これらのも
のは、トロンビンのタンパク質分解に基づく活性、たと
えばフィブリノーゲンの分解またはプロテイン質Ｃの活
性化を阻止するトロンビンの“活性部位”阻害剤であ
る。
ンスメンブラン−ドメイン−レセプター族の一員であ
る。そのアミノ末端は細胞外にトロンビンに対する共通
の切断個所を有する。この個所におけるトロンビンによ
るタンパク質分解的切断が新しいアミノ末端を現わし、
これがいわゆる“束縛リガンド（ｔｅｔｈｅｒｅｄｌｉ
ｇａｎｄ）”としてレセプターを活性化する。レセプタ
ーの活性化を阻止しうる物質は、治療的に極めて有用で
ある。ヒルジン（Ｈｉｒｕｄｉｎ）またはＤ−Ｐｈｅ−
Ｐｒｏ−Ａｒｇ−クロロメチルケトンのような公知トロ
ンビン阻害剤の使用が考えられる。しかし、これらのも
のは、トロンビンのタンパク質分解に基づく活性、たと
えばフィブリノーゲンの分解またはプロテイン質Ｃの活
性化を阻止するトロンビンの“活性部位”阻害剤であ
る。
【０００５】従って、トロンビンレセプター特異性アン
タゴニストを見出すことが望ましい。
タゴニストを見出すことが望ましい。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】従って、レセプターの
機能的活性化の阻止を基礎とする試験法を見出す課題が
生じた。
機能的活性化の阻止を基礎とする試験法を見出す課題が
生じた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】この課題は本発明により
請求項１に記載の特徴によって解決される。即ち、本発
明の対象は、トロンビンレセプターの活性化を阻止する
物質を同定するための試験法であって、次の工程： ａ） トロンビンレセプターを内因的に発現する細胞系
を選択するかまたはトロンビンレセプター組換え体を安
定に発現する細胞系を製造する工程、 ｂ） 工程ａ）による宿主細胞を、 ｂ１） 細胞内メッセンジャー物質の増加により活性化
されるプロモーターを含有し、かつ ｂ２） ｂ１）に記載したプロモーターと機能的に結合
するレセプター遺伝子を担持する組換え体ベクターでト
ランスフェクションする工程、 ｃ） 工程ｂ）による細胞、即ち ｃ１） 工程ｂ）に記載されたベクターを過渡的に含有
するか、または ｃ２） 工程ｂ）に記載されたベクターを安定に組込ん
で含有する細胞を樹立する工程、 ｄ） 工程ｃ）からの細胞に試験すべき物質を暴露する
工程、 ｅ） 工程ｄ）による細胞内でのリポーター遺伝子の発
現を測定する工程を包含する。
請求項１に記載の特徴によって解決される。即ち、本発
明の対象は、トロンビンレセプターの活性化を阻止する
物質を同定するための試験法であって、次の工程： ａ） トロンビンレセプターを内因的に発現する細胞系
を選択するかまたはトロンビンレセプター組換え体を安
定に発現する細胞系を製造する工程、 ｂ） 工程ａ）による宿主細胞を、 ｂ１） 細胞内メッセンジャー物質の増加により活性化
されるプロモーターを含有し、かつ ｂ２） ｂ１）に記載したプロモーターと機能的に結合
するレセプター遺伝子を担持する組換え体ベクターでト
ランスフェクションする工程、 ｃ） 工程ｂ）による細胞、即ち ｃ１） 工程ｂ）に記載されたベクターを過渡的に含有
するか、または ｃ２） 工程ｂ）に記載されたベクターを安定に組込ん
で含有する細胞を樹立する工程、 ｄ） 工程ｃ）からの細胞に試験すべき物質を暴露する
工程、 ｅ） 工程ｄ）による細胞内でのリポーター遺伝子の発
現を測定する工程を包含する。
【０００８】この方法を用いると、その基礎がトロンビ
ン阻害でないリポーターアンタゴニストの検出が可能に
なる。
ン阻害でないリポーターアンタゴニストの検出が可能に
なる。
【０００９】７−トランスメンブラン−ドメイン−リポ
ーターの部類は通常機能的にＧタンパク質に結合してい
る。多くの場合、リポーターおよびＧタンパク質により
利用されるエフエクターはいわゆるアデニレート−シク
ラーゼ（Ａｄｅｎｙｌａｔ−Ｃｙｃｌａｓｅ）であり、
その生成物が細胞内メッセンジャー物質（“ｓｅｃｏｎ
ｄ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ”）ｃＡＭＰである。試験法の
基礎は、ｃＡＭＰ依存性遺伝子プロモーターおよび結合
したリポーター遺伝子による試験細胞内のｃＡＭＰ濃度
の変化の検出である。このため、試験細胞はトロンビン
レセブターを使用できる。
ーターの部類は通常機能的にＧタンパク質に結合してい
る。多くの場合、リポーターおよびＧタンパク質により
利用されるエフエクターはいわゆるアデニレート−シク
ラーゼ（Ａｄｅｎｙｌａｔ−Ｃｙｃｌａｓｅ）であり、
その生成物が細胞内メッセンジャー物質（“ｓｅｃｏｎ
ｄ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ”）ｃＡＭＰである。試験法の
基礎は、ｃＡＭＰ依存性遺伝子プロモーターおよび結合
したリポーター遺伝子による試験細胞内のｃＡＭＰ濃度
の変化の検出である。このため、試験細胞はトロンビン
レセブターを使用できる。
【００１０】本発明による試験法の第１工程においては
細胞膜中に機能性トロンビンレセプターを有する宿主細
胞が選択される。これには、ほ乳動物細胞が望ましい。
この細胞はたとえばトロンビンレセプターを発現するベ
クターでのトランスフェクションによって安定にするこ
とができる。
細胞膜中に機能性トロンビンレセプターを有する宿主細
胞が選択される。これには、ほ乳動物細胞が望ましい。
この細胞はたとえばトロンビンレセプターを発現するベ
クターでのトランスフェクションによって安定にするこ
とができる。
【００１１】望ましくは当然にかかるレセプターを内因
的に有する細胞、たとえばＣＨＯ細胞が利用される。
的に有する細胞、たとえばＣＨＯ細胞が利用される。
【００１２】第２工程においては、細胞内メッセンジャ
ー物質の濃度に依存して制御されるプロモーターを担持
する組換えベクターが製造される。細胞内メッセンジャ
ー物質または“二次メッセンジャー”とは、殊にカルシ
ウム、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰまたはホスホイノシトールリ
ン酸を表わす。
ー物質の濃度に依存して制御されるプロモーターを担持
する組換えベクターが製造される。細胞内メッセンジャ
ー物質または“二次メッセンジャー”とは、殊にカルシ
ウム、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰまたはホスホイノシトールリ
ン酸を表わす。
【００１３】こプロモーターとは、“二次メッセンジャ
ー”調節転写に必要なすべての要素を包含する配列範囲
を表わす。これには“ＴＡＴＡ−ｂｏｘ”および“ｃｃ
ＡＡＴ−ｂｏｘ”のような基礎転写制御の要素ならびに
“二次メッセンジャー”依存転写因子用の結合配列のよ
うな誘導可能な転写調節の要素、いわゆる“応答要素”
（ＲＥs）が入る。これは、カルシウムＲＥs、ｃＡＭＰ
−ＲＥs，ｃＧＭＰ−ＲＥsまたはホスホイノシトールリ
ン酸・ＲＥsである。これらＲＥsの配列およびそれに結
合する因子は、たとえばｃＡＭＰ応答要素結合タンパク
質について公知である（Ｍｏｎｔｍｉｎｙ，Ｍ．Ｒ．
等．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国，
第８３巻，第６６８２頁〜第６６８６頁，１９８６
年）。
ー”調節転写に必要なすべての要素を包含する配列範囲
を表わす。これには“ＴＡＴＡ−ｂｏｘ”および“ｃｃ
ＡＡＴ−ｂｏｘ”のような基礎転写制御の要素ならびに
“二次メッセンジャー”依存転写因子用の結合配列のよ
うな誘導可能な転写調節の要素、いわゆる“応答要素”
（ＲＥs）が入る。これは、カルシウムＲＥs、ｃＡＭＰ
−ＲＥs，ｃＧＭＰ−ＲＥsまたはホスホイノシトールリ
ン酸・ＲＥsである。これらＲＥsの配列およびそれに結
合する因子は、たとえばｃＡＭＰ応答要素結合タンパク
質について公知である（Ｍｏｎｔｍｉｎｙ，Ｍ．Ｒ．
等．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国，
第８３巻，第６６８２頁〜第６６８６頁，１９８６
年）。
【００１４】本発明に適当なプロモーターは天然に産出
するもの、たとえばソマトスタチンゲン、ｃ−ｆｏｓ遺
伝子、ＨＩＶ−１ ＬＴＲまたはバソアクティブ・イン
テスティナル・ペプチド（ＶＩＰ）遺伝子のプロモータ
ーであるかまたは幾つかの種々の遺伝子プロモーターか
ら人工的に構成されていてもよい。
するもの、たとえばソマトスタチンゲン、ｃ−ｆｏｓ遺
伝子、ＨＩＶ−１ ＬＴＲまたはバソアクティブ・イン
テスティナル・ペプチド（ＶＩＰ）遺伝子のプロモータ
ーであるかまたは幾つかの種々の遺伝子プロモーターか
ら人工的に構成されていてもよい。
【００１５】これは合成オリゴヌクレチドの融合および
連結反応によっても行なうことができる。望ましくは幾
つかのｃＡＭＰ応答要素と基礎サイトメガロウイルスＩ
Ｅ遺伝子プロモーターとの融合が実施される。
連結反応によっても行なうことができる。望ましくは幾
つかのｃＡＭＰ応答要素と基礎サイトメガロウイルスＩ
Ｅ遺伝子プロモーターとの融合が実施される。
【００１６】これらのまとめられたプロモーターに、リ
ポーター遺伝子が機能的に結合する。リポター遺伝子
は、その発現遺伝物質が容易に測定ないしは定量しうる
シグナルを生じるような遺伝子である。
ポーター遺伝子が機能的に結合する。リポター遺伝子
は、その発現遺伝物質が容易に測定ないしは定量しうる
シグナルを生じるような遺伝子である。
【００１７】たいてい、適当なリポーター遺伝子は慣用
法で検出できるかかるタンパク質の遺伝子である。望ま
しくはリポーター遺伝子として、容易に検出できない反
応を触媒する酵素の遺伝子が使用される。
法で検出できるかかるタンパク質の遺伝子である。望ま
しくはリポーター遺伝子として、容易に検出できない反
応を触媒する酵素の遺伝子が使用される。
【００１８】殊に適当なリポーター遺伝子は、クロラム
フェニコール−アセチル−トランスフェラーゼ（ＣＡ
Ｔ）またはルシフェラーゼの遺伝子である。構成された
プロモーターおよびリポーター遺伝子の機能的結合は、
リポーター遺伝子の転写が“二次メッセンジャー”依存
プロモーターの制御下に行なわれることを意味する。
フェニコール−アセチル−トランスフェラーゼ（ＣＡ
Ｔ）またはルシフェラーゼの遺伝子である。構成された
プロモーターおよびリポーター遺伝子の機能的結合は、
リポーター遺伝子の転写が“二次メッセンジャー”依存
プロモーターの制御下に行なわれることを意味する。
【００１９】これら２つの遺伝子領域のほかに、組換え
ベクターはなお別の遺伝子フラグメント、たとえば調節
シグナルまたは選択マーカーを担持することができる。
ネオマイシン耐性（ｎｅｏＲ）のような選択マーカーを
使用するのがとくに有利である。
ベクターはなお別の遺伝子フラグメント、たとえば調節
シグナルまたは選択マーカーを担持することができる。
ネオマイシン耐性（ｎｅｏＲ）のような選択マーカーを
使用するのがとくに有利である。
【００２０】工程ｂ）による組換えベクターによる宿主
細胞の形質転換は、すべての慣用の形質転換法、たとえ
ばエレクトロポレーション、リン酸カルシウムまたはリ
ポソーム仲介トランスフェクションによって行なうこと
ができる。形質転換にとくに好適なのは、リポソーム仲
介トランスフェクションである。
細胞の形質転換は、すべての慣用の形質転換法、たとえ
ばエレクトロポレーション、リン酸カルシウムまたはリ
ポソーム仲介トランスフェクションによって行なうこと
ができる。形質転換にとくに好適なのは、リポソーム仲
介トランスフェクションである。
【００２１】宿主細胞としては、真核細胞系が好適であ
る。ＣＨＯ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ６１）のようなほ
乳動物細胞がとくに適当である。
る。ＣＨＯ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ６１）のようなほ
乳動物細胞がとくに適当である。
【００２２】宿主細胞を組換えベクターで形質転換した
後、次の工程ｃ）において、ベクターを過渡的または安
定に組込んで含有するこのような細胞が樹立される。
後、次の工程ｃ）において、ベクターを過渡的または安
定に組込んで含有するこのような細胞が樹立される。
【００２３】過渡的発現とは、制限された時間だけの表
現を表わす。安定な組込みとは、宿主細胞のゲノム中へ
の組換えベクターの取込みを表わす。
現を表わす。安定な組込みとは、宿主細胞のゲノム中へ
の組換えベクターの取込みを表わす。
【００２４】次の工程で、工程ｃ２）において樹立され
た安定な細胞を、該細胞に対する拮抗作用を被験物質に
暴露する。そのつどの試験物質と同時に、トロンビンな
いしはトロンビンレセプター（トロンビンレセプターペ
プチド）アゴニストが添加される。被験物質は通常１０
~3Ｍないし１０~6Ｍの濃度で細胞培地に添加される。被
験物質はたいてい２〜２４時間、形質転換した宿主細胞
と接触している。
た安定な細胞を、該細胞に対する拮抗作用を被験物質に
暴露する。そのつどの試験物質と同時に、トロンビンな
いしはトロンビンレセプター（トロンビンレセプターペ
プチド）アゴニストが添加される。被験物質は通常１０
~3Ｍないし１０~6Ｍの濃度で細胞培地に添加される。被
験物質はたいてい２〜２４時間、形質転換した宿主細胞
と接触している。
【００２５】引き続き、細胞を直接にまたはこれら細胞
の例４に記載したように溶解後の抽出物を、リポーター
遺伝子発現検定に使用する。被験物質で処理した宿主細
胞内でのリポーター遺伝子の発現を測定し、対照、つま
り被験物質不在における発現と比較する。これら２つの
宿主細胞の比較によって、直ちに被験物質がリポーター
遺伝子発現に影響を及ぼすか否かについて言明すること
ができる。
の例４に記載したように溶解後の抽出物を、リポーター
遺伝子発現検定に使用する。被験物質で処理した宿主細
胞内でのリポーター遺伝子の発現を測定し、対照、つま
り被験物質不在における発現と比較する。これら２つの
宿主細胞の比較によって、直ちに被験物質がリポーター
遺伝子発現に影響を及ぼすか否かについて言明すること
ができる。
【００２６】本発明による試験法は容易かつ迅速に実施
および評価でき、それで大量の試料処理ができるという
利点を有する。これにより、トロンビンレセプター拮抗
作用を有する物質の有効な大規模スクリーニングを実施
することが可能となる。
および評価でき、それで大量の試料処理ができるという
利点を有する。これにより、トロンビンレセプター拮抗
作用を有する物質の有効な大規模スクリーニングを実施
することが可能となる。
【００２７】本発明を下記実施例によってさらに説明す
る。
る。
【００２８】
例 １ 構成されたプロモーターの構造およびリポーター遺伝子
との融合 ａ） 市販のリポーター構造物ｐＭＡＭｎｅｏ−ｌｕｃ
（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社ｋａｔ．Ｎｏ．６１７１−１）か
ら出発し、エンハンサー／プロモーター不含リポーター
プラスミドを構成した。このため、ｐＭＡＭｎｅｏ−ｌ
ｕｃ中のＲＳＶ−ＬＴＲsおよびＭＭＴＶ−ＬＴＲsの調
節配列を含有する範囲をＮｄｅＩおよびＮｈｅＩでの制
限切断によって欠失し、制限酵素ＮｄｅＩ，ＭｌｕＩ，
ＮｏｔＩ，ＳｐｅＩおよびＮｈｏＩの認識配列を含有す
るポリリンカーによって置換した。
との融合 ａ） 市販のリポーター構造物ｐＭＡＭｎｅｏ−ｌｕｃ
（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社ｋａｔ．Ｎｏ．６１７１−１）か
ら出発し、エンハンサー／プロモーター不含リポーター
プラスミドを構成した。このため、ｐＭＡＭｎｅｏ−ｌ
ｕｃ中のＲＳＶ−ＬＴＲsおよびＭＭＴＶ−ＬＴＲsの調
節配列を含有する範囲をＮｄｅＩおよびＮｈｅＩでの制
限切断によって欠失し、制限酵素ＮｄｅＩ，ＭｌｕＩ，
ＮｏｔＩ，ＳｐｅＩおよびＮｈｏＩの認識配列を含有す
るポリリンカーによって置換した。
【００２９】それにより、こうして生じたリポータープ
ラスミドはポリリンカー領域中へ調節配列を取込むのに
役立つ。構成されたプロモーターは、４つの合成オリゴ
ヌクレオチドから製造した： ｂ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１はサイトメガロウイルス
のプロモーター領域、（位置−６７から＋１までの即時
型遺伝子）に相当する（Ｈｅｎｎｉｇｈａｕｓｅｎ
Ｌ．Ｇ．，Ｆｌｅｃｋｅｎｓｔｅｉｎ Ｂ．；ＥＭＢＯ
Ｊ．５，第１３６７〜１３７１頁（１９８６年））。
付加的に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１は制限エンドヌクレ
アーゼの２つの認識配列：５’末端にＮｏｔＩ、３’末
端にＳｐｅＩの認識配列を包含する。ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対し逆向き鎖に相当
する。
ラスミドはポリリンカー領域中へ調節配列を取込むのに
役立つ。構成されたプロモーターは、４つの合成オリゴ
ヌクレオチドから製造した： ｂ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１はサイトメガロウイルス
のプロモーター領域、（位置−６７から＋１までの即時
型遺伝子）に相当する（Ｈｅｎｎｉｇｈａｕｓｅｎ
Ｌ．Ｇ．，Ｆｌｅｃｋｅｎｓｔｅｉｎ Ｂ．；ＥＭＢＯ
Ｊ．５，第１３６７〜１３７１頁（１９８６年））。
付加的に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１は制限エンドヌクレ
アーゼの２つの認識配列：５’末端にＮｏｔＩ、３’末
端にＳｐｅＩの認識配列を包含する。ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対し逆向き鎖に相当
する。
【００３０】ｃ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３はバソアク
ティブ・インテステイナル・ペプチド（ＶＩＰ）遺伝子
のｃＡＭＰ応答要素の４回繰返しに相当する（Ｔｓｕｋ
ａｄａ，Ｔ．等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，第２６２
巻，第８７４３頁〜第８７４７頁，１９８７年）。付加
的に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３は制限エンドヌクレアー
ゼの２つの認識配列：５’末端にＮｄｅＩ、３’末端に
ＮｏｔＩの認識配列を含有する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
４はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に対し逆向き鎖に相当す
る。
ティブ・インテステイナル・ペプチド（ＶＩＰ）遺伝子
のｃＡＭＰ応答要素の４回繰返しに相当する（Ｔｓｕｋ
ａｄａ，Ｔ．等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，第２６２
巻，第８７４３頁〜第８７４７頁，１９８７年）。付加
的に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３は制限エンドヌクレアー
ゼの２つの認識配列：５’末端にＮｄｅＩ、３’末端に
ＮｏｔＩの認識配列を含有する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
４はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に対し逆向き鎖に相当す
る。
【００３１】ｄ） 組換えベクターの製造のために、Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱＩＤ ＮＯ：２をハ
イブリッド形成し、ＶｏｔＩ／ＳｐｅＩを用いて切断
し、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３およびＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：４をハイブリッド形成し、ＮｄｅＩ／Ｎｏｔ
Ｉを用いて切断した。次いで、双方の生成物を、Ｎｄｅ
ＩおよびＳｐｅＩで線状にしたベクター中へ例１ａ）か
らのｐｎｅｏＬｕｃをクローニングした。このクローニ
ング戦略は個々の成分の適正、つまり機能的配列を生じ
た。
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱＩＤ ＮＯ：２をハ
イブリッド形成し、ＶｏｔＩ／ＳｐｅＩを用いて切断
し、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３およびＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：４をハイブリッド形成し、ＮｄｅＩ／Ｎｏｔ
Ｉを用いて切断した。次いで、双方の生成物を、Ｎｄｅ
ＩおよびＳｐｅＩで線状にしたベクター中へ例１ａ）か
らのｐｎｅｏＬｕｃをクローニングした。このクローニ
ング戦略は個々の成分の適正、つまり機能的配列を生じ
た。
【００３２】例 ２ 安定な細胞系の形質転換および選択 ＣＨＯ−Ｋｌ細胞を、ＦＣＳ１０％を有するＤＭＥＭ／
ＨａｍＦ１２（１：１）培地中に、１０ｃｍのペトリ皿
中、細胞１０6／ｍｌの細胞密度で播種し、一夜培養し
た。トランスフェクションは、トランスフェクタム（Ｔ
ｒａｎｓｆｅｋｔａｍ；Ｐｒｏｍｅｇａ社，Ｎｏ．Ｅ１
２３）１０μｌ中の例１ｄ）に記載したリポーター構造
物２μｇを用いて行ない、６時間血清不含培地２ｍＬに
とった。
ＨａｍＦ１２（１：１）培地中に、１０ｃｍのペトリ皿
中、細胞１０6／ｍｌの細胞密度で播種し、一夜培養し
た。トランスフェクションは、トランスフェクタム（Ｔ
ｒａｎｓｆｅｋｔａｍ；Ｐｒｏｍｅｇａ社，Ｎｏ．Ｅ１
２３）１０μｌ中の例１ｄ）に記載したリポーター構造
物２μｇを用いて行ない、６時間血清不含培地２ｍＬに
とった。
【００３３】その後、血清含有培地に移した。さらに４
２時間後、細胞を選択培地（Ｇ−４１８−スルフェー
ト、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ ６００μｇ／ｍｌ）に移し
た。安定なゲネチシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）耐性細胞
クローンを、１０〜１４日後に単離した。
２時間後、細胞を選択培地（Ｇ−４１８−スルフェー
ト、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ ６００μｇ／ｍｌ）に移し
た。安定なゲネチシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）耐性細胞
クローンを、１０〜１４日後に単離した。
【００３４】例 ３ 遺伝子活性の測定 例２による細胞を、微量滴定板（Ｐａｃｋａｒｄ Ｖｉ
ｅｗｐｌａｔｅ Ｎｏ．６００−５１８２）中に播種し
（１×１０5細胞／ウェル）、１６ｈ後ＦＣＳを有しな
いＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２（１：１）培地に移した。さ
らに４時間後、被験物質の希釈液を添加した。同時に、
トロンビン０．０１〜０．１ＮＩＨＵ／ｍＬを添加し
た。トロンビン処理した細胞だけを負の対照として使用
した。試験は、２〜２４ｈ後、細胞の溶解によって終了
した。
ｅｗｐｌａｔｅ Ｎｏ．６００−５１８２）中に播種し
（１×１０5細胞／ウェル）、１６ｈ後ＦＣＳを有しな
いＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２（１：１）培地に移した。さ
らに４時間後、被験物質の希釈液を添加した。同時に、
トロンビン０．０１〜０．１ＮＩＨＵ／ｍＬを添加し
た。トロンビン処理した細胞だけを負の対照として使用
した。試験は、２〜２４ｈ後、細胞の溶解によって終了
した。
【００３５】細胞溶解、細胞抽出物の製造ならびにルシ
フェラーゼ活性の測定は、ルシフェラーゼ検定キット
（Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｎｏ．Ｅ−１５００）を用い、記
載に従って行なった。詳細には、細胞を溶解緩衝液（ト
リスホスフェート２５ｍＭ，ｐＨ７．８；ＤＴＴ２ｍ
Ｍ；１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，
Ｎ′−テトラ酢酸２ｍＭ，グリセリン１０％、Ｔｒｉｔ
ｏｎ Ｘ−１００１％）３０μｌ／ウェルの添加によっ
て溶解した（室温で１５分）。
フェラーゼ活性の測定は、ルシフェラーゼ検定キット
（Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｎｏ．Ｅ−１５００）を用い、記
載に従って行なった。詳細には、細胞を溶解緩衝液（ト
リスホスフェート２５ｍＭ，ｐＨ７．８；ＤＴＴ２ｍ
Ｍ；１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，
Ｎ′−テトラ酢酸２ｍＭ，グリセリン１０％、Ｔｒｉｔ
ｏｎ Ｘ−１００１％）３０μｌ／ウェルの添加によっ
て溶解した（室温で１５分）。
【００３６】この細胞抽出物に、ルシフェラーゼ検定基
質（補酵素Ａ２７０μＭ，ルシフェリン４７０μＭ，Ａ
ＴＰ５３０μＭ）５０μｌを添加した。ルシフェラーゼ
活性の測定は慣用のルミノメーター中で実施することが
でき；とくに測定はＨａｍａｍａｔｓｕ社の２−Ｄ−ル
ミノメーター中で行なう。
質（補酵素Ａ２７０μＭ，ルシフェリン４７０μＭ，Ａ
ＴＰ５３０μＭ）５０μｌを添加した。ルシフェラーゼ
活性の測定は慣用のルミノメーター中で実施することが
でき；とくに測定はＨａｍａｍａｔｓｕ社の２−Ｄ−ル
ミノメーター中で行なう。
【００３７】例 ４ “ランダム・スクリーニング”における試験系の使用 例１〜３による検定系を、トロンビンレセプターの活性
に特異的に影響を及ぼす物質の“ランダム・スクリーニ
ング”に使用する。スクリーニングに使用すべき物質を
ＤＭＳＯに１〜５ｍＭの濃度に溶解し、例３による適当
な希釈液中で試験に使用した。
に特異的に影響を及ぼす物質の“ランダム・スクリーニ
ング”に使用する。スクリーニングに使用すべき物質を
ＤＭＳＯに１〜５ｍＭの濃度に溶解し、例３による適当
な希釈液中で試験に使用した。
【００３８】配列記録 （１） 一般的情報： （ｉ） 出願人： （Ａ） 名称：バスフ・アクチェンゲゼルシャフト （Ｂ） 街路：カール・ボッシュ・ストラーセ （Ｃ） 居所：ルードウィヒスハーフェン （Ｅ） 国籍：ドイツ連邦共和国 （Ｆ） 郵便番号：Ｄ−６７０５６ （Ｇ） 電話： ０６２１／６０４８５２６ （Ｈ） テレファックス：０６２１／６０４３１２３ （Ｉ） テレックス： １７６２１７５１７０ （ｉｉ） 出願名称：トロンビンレセプター・アンタゴ
ニストを同定するための試験法 （ｉｉｉ） 配列の数： ４ （ｉｖ） コンピュータで読取り可能な形： （Ａ） データ媒体：フロッピィ・ディスク （Ｂ） コンピュータ：ＩＢＭ ＰＣ 互換性有 （Ｃ） オペレーティング・システム：ＰＣ−ＤＯＳ／
ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ） ソフトウェア：パテント・イン・レリース＃
１．０、バージョン＃１．２５（ＥＰＡ） （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対する情報 （ｉ） 配列特性： （Ａ） 長さ：７５塩基対 （Ｂ） 種類：核酸 （Ｃ） 鎖型：一体鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （ｉｉ） 分子の種類：ＤＮＳ（ゲノム） （ｉｉｉ） 仮説： なし （ｉｖ） アンチセンス：なし （ｖｉ） 原出所： （Ａ） 生物：ヒト・サイトメガロ・ウイルス （ｖｉｉ） ゲノム中の位置： （Ｂ） 地図の位置： 即時型初期遺伝子プロモーター （ｘｉ） 配列明細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１：
ニストを同定するための試験法 （ｉｉｉ） 配列の数： ４ （ｉｖ） コンピュータで読取り可能な形： （Ａ） データ媒体：フロッピィ・ディスク （Ｂ） コンピュータ：ＩＢＭ ＰＣ 互換性有 （Ｃ） オペレーティング・システム：ＰＣ−ＤＯＳ／
ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ） ソフトウェア：パテント・イン・レリース＃
１．０、バージョン＃１．２５（ＥＰＡ） （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対する情報 （ｉ） 配列特性： （Ａ） 長さ：７５塩基対 （Ｂ） 種類：核酸 （Ｃ） 鎖型：一体鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （ｉｉ） 分子の種類：ＤＮＳ（ゲノム） （ｉｉｉ） 仮説： なし （ｉｖ） アンチセンス：なし （ｖｉ） 原出所： （Ａ） 生物：ヒト・サイトメガロ・ウイルス （ｖｉｉ） ゲノム中の位置： （Ｂ） 地図の位置： 即時型初期遺伝子プロモーター （ｘｉ） 配列明細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１：
【００３９】
【化１】
【００４０】（２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に対する
情報： （ｉ） 配列特性： （Ａ） 長さ： ７５塩基対 （Ｂ） 種類： 核酸 （Ｃ） 鎖型：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （ｉｉ） 分子の種類：ＤＮＳ（ゲノム） （ｉｉｉ） 仮説： なし （ｉｖ） アンチセンス：あり （ｖｉ） 原出所： （Ａ） 生物：ヒト・サイトメガロ・ウイルス （ｖｉｉｉ） ゲノム中の位置： （Ｂ） 地図の位置： 即時型初期遺伝子プロモーター （ｘｉ） 配列明細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２：
情報： （ｉ） 配列特性： （Ａ） 長さ： ７５塩基対 （Ｂ） 種類： 核酸 （Ｃ） 鎖型：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （ｉｉ） 分子の種類：ＤＮＳ（ゲノム） （ｉｉｉ） 仮説： なし （ｉｖ） アンチセンス：あり （ｖｉ） 原出所： （Ａ） 生物：ヒト・サイトメガロ・ウイルス （ｖｉｉｉ） ゲノム中の位置： （Ｂ） 地図の位置： 即時型初期遺伝子プロモーター （ｘｉ） 配列明細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２：
【００４１】
【化２】
【００４２】（２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に対する
情報： （ｉ） 配列特性： （Ａ） 長さ： １０６塩基対 （Ｂ） 種類： 核酸 （Ｃ） 鎖型：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （ｉｉ） 分子の種類：ＤＮＳ（ゲノム） （ｉｉｉ） 仮説： なし （ｉｖ） アンチセンス： なし （ｖｉ） 原出所： （Ａ） 生物：ホモ・サピエンス （ｘｉ） 配列明細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３：
情報： （ｉ） 配列特性： （Ａ） 長さ： １０６塩基対 （Ｂ） 種類： 核酸 （Ｃ） 鎖型：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （ｉｉ） 分子の種類：ＤＮＳ（ゲノム） （ｉｉｉ） 仮説： なし （ｉｖ） アンチセンス： なし （ｖｉ） 原出所： （Ａ） 生物：ホモ・サピエンス （ｘｉ） 配列明細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３：
【００４３】
【化３】
【００４４】（２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に対する
情報： （ｉ） 配列特性： （Ａ） 長さ： １０８塩基対 （Ｂ） 種類： 核酸 （Ｃ） 鎖型：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （ｉｉ） 分子の種類：ＤＮＳ（ゲノム） （ｉｉｉ） 仮説： なし （ｉｖ） アンチセンス： あり （ｖｉ） 原出所： （Ａ） 生物：ホモ・サピエンス （ｘｉ） 配列明細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４：
情報： （ｉ） 配列特性： （Ａ） 長さ： １０８塩基対 （Ｂ） 種類： 核酸 （Ｃ） 鎖型：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （ｉｉ） 分子の種類：ＤＮＳ（ゲノム） （ｉｉｉ） 仮説： なし （ｉｖ） アンチセンス： あり （ｖｉ） 原出所： （Ａ） 生物：ホモ・サピエンス （ｘｉ） 配列明細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４：
【００４５】
【化４】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/02 6807−4Ｂ 1/66 6807−4Ｂ (72)発明者 アンニ バルバラ エンドレル−ヨープス ト ドイツ連邦共和国 ヴァインハイム ベル クヴァルトシュトラーセ ５
Claims (3)
- 【請求項１】 トロンビンレセプターの活性化を阻止す
る物質を同定するための試験法において、 ａ） トロンビンレセプターを内因的に発現する細胞系
を選択するかまたはトロンビンレセプター組換え体を安
定に発現する細胞系を製造する工程、 ｂ） 工程ａ）による宿主細胞を、 ｂ１） 細胞内メッセンジャー物質の増加により活性化
されるプロモーターを含有し、かつ ｂ２） ｂ１）に記載したプロモーターと機能的に結合
するリポーター遺伝子を担持する組換えベクターでトラ
ンスフェクションする工程、 ｃ） 工程ｂ）による細胞、即ち ｃ１） 工程ｂ）に記載されたベクターを過渡的に含有
するかまたは ｃ２） 工程ｂ）に記載されたベクターを安定に組込ん
で含有する細胞を樹立する工程、 ｄ） 工程ｃ）からの細胞に被験物質を暴露する工程、 ｅ） 工程ｄ）による細胞内でのリポーター遺伝子の発
現を測定する工程を包含する、トロンビンレセプターの
活性化を阻止する物質を同定するための試験法。 - 【請求項２】 工程ｂ２）におけるリポーター遺伝子と
してルシフェラーゼ遺伝子を使用することを特徴とする
請求項１記載の試験法。 - 【請求項３】 工程ａ）における細胞として細胞ＣＨＯ
−Ｋｌを使用することを特徴とする請求項１または２記
載の試験法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4408891.4 | 1994-03-16 | ||
| DE4408891A DE4408891A1 (de) | 1994-03-16 | 1994-03-16 | Funktionelles Testverfahren zur Identifizierung von Thrombinrezeptor-Antagonisten |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07255500A true JPH07255500A (ja) | 1995-10-09 |
Family
ID=6512924
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7054690A Withdrawn JPH07255500A (ja) | 1994-03-16 | 1995-03-14 | トロンビンレセプターの活性化を阻止する物質を同定するための試験法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0672757A1 (ja) |
| JP (1) | JPH07255500A (ja) |
| DE (1) | DE4408891A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5686597A (en) * | 1995-06-06 | 1997-11-11 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Thrombin receptor homolog |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5401629A (en) * | 1990-08-07 | 1995-03-28 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Assay methods and compositions useful for measuring the transduction of an intracellular signal |
| US5688768A (en) * | 1991-02-19 | 1997-11-18 | Cor Therapeutics, Inc. | Recombinant thrombin receptor and related pharmaceuticals |
| EP0668930B1 (en) * | 1991-10-01 | 2002-12-18 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the SECRETARY OF THE DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES | A method of identifying ligands and antagonists of ligands |
| DE4138621A1 (de) * | 1991-11-25 | 1993-06-17 | Boehringer Ingelheim Int | Verfahren zum screenen von substanzen mit modulierender wirkung auf einen rezeptorabhaengigen zellulaeren signaluebertragungsweg |
-
1994
- 1994-03-16 DE DE4408891A patent/DE4408891A1/de not_active Withdrawn
-
1995
- 1995-03-10 EP EP95103463A patent/EP0672757A1/de not_active Withdrawn
- 1995-03-14 JP JP7054690A patent/JPH07255500A/ja not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE4408891A1 (de) | 1995-09-21 |
| EP0672757A1 (de) | 1995-09-20 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20020604 |