DE10133930A1 - Verfahren zur spezifischen Detektion, Isolation und Charakterisierung von Zellen aus Körperproben durch Transfektion von Nukleinsäurekonstrukten - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion krankheits-assoziierter Zellen aus Körperproben, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Zellen der Körperprobe mit Nukleinsäurekonstrukten transfiziert oder infiziert werden, die folgende Komponenten beinhalten: a) ein Promoter-Element mit mindestens einer DNA-Bindungsstelle für Traskriptionsfaktoren, die auf Grund der krankhaften Veränderung der Zellen eine veränderte Aktivität aufweisen und b) ein Reportergen, das die Detektion der krankhaften Zellen ermöglicht und anschließend die transfizierten oder infizierten Zellen detektiert.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion krankheits-assoziierter Zellen aus Körperproben, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Zellen der Körperprobe mit Nukleinsäurekonstrukten transfiziert oder infiziert werden, die folgende Kompo­ nenten beinhalten: a) ein Promoter-Element mit mindestens einer DNA-Bindungs­ stelle für Transkriptionsfaktoren, die auf Grund der krankhaften Veränderung der Zellen eine veränderte Aktivität aufweisen und b) ein Reportergen, das die Detektion der krankhaften Zellen ermöglicht und anschliessend die transfizierten oder infizierten Zellen detektiert.

Krebs und bösartige Neoplasien sind nach Herz- und Kreislauferkrankungen mit deutlichem Abstand die zweithäufigste Todesursache in Deutschland und anderen Industriestaaten dieser Welt. Die Mehrzahl aller Krebsneuerkrankungen sowie der malignombedingten Todesfälle in den westlichen Industrieländern wird durch maligne epitheliale Tumore verursacht. In der EU erkranken jährlich ca. 577 000 Menschen an Krebs und ca. 376 000 Menschen sterben jedes Jahr an den häufigsten soliden Tumorarten (Brust-, Prostata-, Lunge- und Kolonkarzinom). Sollte sich die rasante Verringerung der Mortalität bei Herz- und Kreislauferkrankungen fortsetzen, so ist damit zu rechnen, dass in etwa 15-20 Jahren Krebs zur häufigsten Todesursache in Deutschland wird.

Auf Grund der verbesserten Resektabilitätsmöglichkeiten im Laufe der letzten Jahrzehnte wird die Mortalitätsrate zunehmend durch das Metastasierungsverhalten sowie eine frühzeitige okkulte Tumorzelldissemination bestimmt, welche auf Grund der insensitiven Nachweismethodiken bzw. konventionellen histopathologischen Stagingmethoden schwer oder nicht nachzuweisen ist. Dabei ist speziell die Detektion von Tumorzellen im Blut von großer prognostischer Aussagekraft. So gilt der Nach­ weis von metastatischen Zellen im Blut bzw. in Lymphknoten als Hinweis auf die Bösartigkeit einer krebsartigen Veränderung. Darüber hinaus ist eine genauere Charakterisierung der im Blut befindlichen Tumorzellen auch für eine angepasste Therapieentscheidung interessant.

Allerdings ist die Identifizierung, Charakterisierung und Isolierung von Tumorzellen durch Detektion tumorspezifisch exprimierter Gene auf Grund von Spezifitäts­ problemen herkömmlicher Nachweismethodiken (i. e. Immuncytochemie, in situ Hybridisierung, PCR) überaus schwierig. Dies liegt unter anderem daran, dass die Expression spezifischer Tumormarker häufig auf bestimmte Tumorarten begrenzt ist oder in den heterogenen Zellpopulationen eines Tumors variiert, so dass nur ein Teil der Tumorzellen erkannt werden kann. Ebenso stößt die Detektion seltener Ereignisse im Blut (z. B. von metastatischen Zellen) auf technische Schwierigkeiten (zu geringe Sensitivität, Spezifitätsprobleme von Antikörpern, technischer Aufwand, Kosten). Eine möglichst effiziente Detektion abnormaler Zellen bzw. die Trennung lebender Tumor­ zellen von normalen Zellen aus einem Gemisch beider Zelltypen wäre dabei nicht nur für diagnostische, sondern auch für therapeutische Zwecke von hohem Wert. So ist es wichtig möglichst genau bestimmen zu können zu welchem Zeitpunkt beispielsweise Chemotherapien begonnen oder beendet werden sollten. Andererseits ist es auch von hohem Interesse die Wirksamkeit von Medikamenten im Therapieverlauf zu ermitteln. Hierzu ist es notwendig ein möglichst sensitives und schnelles Verfahren zur Ver­ fügung zu haben, um die Anwesenheit selbst sehr geringer Mengen metastatischer Zellen qualitativ nachzuweisen.

Besonders sinnvoll wäre darüber hinaus die routinemäßige Isolierung von lebenden Tumorzellen aus dem Blut mit anschließenden Analysemethodiken, um zu unter­ suchen ob die in Frage kommenden Therapeutika tatsächlich die Tumorzellen abtöten können. Einfache Verfahren, die dies routinemäßig und mit hoher Sensitivität ermöglichen können, existieren in der klinischen Diagnostik jedoch noch nicht.

Am weitesten fortgeschritten auf diesem Gebiet sind die Verfahren der Firmen Immunicon und Miltenyi Biotec, die für ihre magnetischen Zellseparierungs­ verfahren Antikörper gegen epitheliale Oberflächenantigene (EpCAM bzw. HEA) verwenden. Diese Antigene werden von allen epithelialen Zellen, also sowohl von gesunden als auch von malignen Zellen, in einem unterschiedlichem Expressionsgrad auf den Zelloberflächen exprimiert. Da Blutzellen diese Antigene nicht besitzen ermöglichen diese Verfahren eine circa 5 bis 10fache Anreicherung von Epithelzellen aus dem Blut. Auf Grund der geringen Zahl an malignen Zellen in der Tumorprobe besteht der Großteil der Zellen nach magnetischer Separierung immer noch aus peripheren Blutzellen. So beschreiben Krüger et al. (1999; Cytotherapy 1: 135-139) eine Anreicherung epithelialer Zellen mittels der HEA-immunobead-Methodik von 2,6 pro 10⁶ Zellen auf 10,6 pro 10⁶ Zellen, wobei ein signifikanter Verlust an Tumorzellen bemängelt wird. Darüber hinaus können Tumorarten nicht epithelialen Ursprungs mit dieser Methodik nicht angereichert werden. Andere Verfahren zur Erkennung von Karzinomzellen in Blutproben beinhalten Schritte zur Permeabil­ isierung und Fixierung der Zellen, so dass keine lebenden Tumorzellen isoliert werden können. Dabei werden die positiv selektionierten Zellen mittels immun­ cytochemischer Verfahren gefärbt, wobei zumeist Antikörper gegen Cytokeratine für den Nachweis von epithelialen Zellen verwendet werden. Da die entsprechenden Cytokeratine in Blutzellen nicht vorhanden sind, gilt der Nachweis dieses Proteins, das in sämtlichen epithelialen Zellen vorhanden ist, als Nachweis von metastatischen Tumorzellen. Diese Verfahren stoßen nicht nur auf technische Schwierigkeiten, sondern sind zudem auch kostenaufwendig, personal- und zeitintensiv.

Ein vollkommen neuer Ansatz in diesem Gebiet ist die Ausnutzung tumorzell­ spezifischer Signalaktivitäten durch Transfektion von Reportergenkonstrukten zur spezifischen Isolierung lebender Tumorzellen aus einem Gemisch mit gesunden Zellen (z. B. Blutzellen). Dabei wird die vielfach beschriebene Tatsache ausgenutzt, dass Tumorzellen Signalaktivitäten aufweisen, die in gesunden Zellen nicht vorhanden sind.

Die Vermehrung von Körperzellen wird normalerweise durch zahlreiche Regulations­ mechanismen innerhalb der Zelle kontrolliert, so dass sich jede Zelle abgestimmt auf den Gesamtorganismus nur im Bedarfsfall zu teilen beginnt. Diese Prozesse werden durch Signalmoleküle reguliert, die von "Senderzellen" sezerniert werden, bei den "Empfängerzellen" an spezifische Rezeptormoleküle an der Oberfläche binden und nachfolgend sogenannte Signaltransduktionswege aktivieren, die letztendlich verän­ derte Genexpressionen zur Folge haben. In Tumorzellen sind dabei häufig aktivierende oder aber hemmende Regulationsmoleküle mutiert, die diese Signalaktivitäten kontrol­ lieren (ihnen entsprechen die Onkogene bzw. Tumorsuppressorgene). Tumorzellen besitzen demzufolge Aktivitäten in ihrem Zellkern, die sonst nur in bestimmten Ent­ wicklungsstadien der Embryonalentwicklung oder aber in genau definierten Gewebe­ bereichen vorkommen.

Beispiele für solche Signalaktivitäten, die mit dem Krebswachstum in Verbindung stehen, sind der Wnt- und Ras-Signaltransduktionsweg, sowie der Funktionsverlust des Tumorsuppressors p53. Im Krebsgeschehen humaner Kolontumore spielen diese Signalaktivitäten in unterschiedlichen Stadien der Tumorentstehung eine Rolle (Kinzler, K. W. & Vogelstein, B. (1996). Lessons from hereditary cancer. Cell 87: 159-70), so dass sie sich diagnostisch für ein Staging der Tumorzellen bzw. für die simultane Analyse mehrerer krebsassoziierter Signalaktivitäten (auch bei therapeu­ tischen Ansätzen) eignen. Komponenten des Wnt-Signaltransduktionsweges sind in nahezu allen Kolonkarzinomzellen bereits in einem sehr frühen Stadium mutiert, wobei das Tumorsuppressorgen APC (= "Adenomatöse Polyposis Coli") in 80% der spon­ tanen Tumore durch Mutationen inaktiviert ist, während das Onkogen β-Catenin in 10% der Tumore durch Mutation aktiviert ist. Die restlichen 10% der Tumore besitzen aller Wahrscheinlichkeit nach Mutationen in anderen Komponenten des Wnt-Signal­ transduktionsweges, so dass allgemein davon ausgegangen wird, dass diese Mutationen als frühes Ereignis bei der Initiation der Tumorgenese auftreten. Demzufolge ist in allen Kolonkarzinomzellen Wnt-Signalaktivität vorhanden, die letztendlich auf die Wechselwirkung des Onkogens β-Catenin an TCF/LEF-Transkriptionsfaktoren im Zellkern zurückzuführen ist. In fortgeschritteneren Stadien der Kolonkarzinogenese ist auch das Onkogen K-ras in ca. 70% der Fälle durch Mutation aktiviert. Normaler­ weise werden die Ras-Proteine nach Bindung von spezifischen Liganden an unter­ schiedliche Zelloberflächenmoleküle (z. B. Rezeptor-tyrosinkinasen, Integrine, Ionen­ kanäle) über Adaptorproteine (z. B. Shc, Grb2, Crk, . . .) und nachgeschaltete Guanin- Nukleotid-Austausch-Faktoren (z. B. Sos, C3G, . . .) stimuliert. In Kolontumorzellen werden auf Grund von Mutationen des Ras-Gens konstitutiv aktive Ras-Proteine expremiert, die auch ohne die vorgeschalteten Komponenten des Ras-Signaltrans­ duktionsweges aktiv sind. Dies bewirkt letztendlich die Aktivierung nachgeschalteter Komponenten des Signalweges, die die Überaktivität zahlreicher Transkrip­ tionsfaktoren (CREB, SRF, cFos, c-Jun, PPAR, ER, ETS, ELK-1, STAT, Myc, Max, DPC4, p53, NFAT4, CHOP, MEF2, ATF-2, . . .) im Zellkern zur Folge hat, die daraufhin u. a. das Teilungswachstum der Zellen induzieren können. In einem noch weiter fortgeschrittenen Kolontumorstadium kommt es in mehr als 80% der Tumore zur Mutation des Tumorsuppressorgens p53, das in gesunden Zellen als aktiver Transkriptionsfaktor bei Auftreten von krankheitsassoziierten Veränderungen das Teilungswachstum von Zellen verhindert bzw. zum programmierten Zelltod der Zelle führt, indem es an spezifische DNA-Sequenzen (PuPuC(A/T)(A/T)GpyPyPy) bindet und wachstumsinhibitorische Gene (z. B. p21^CIP1) aktiviert.

Diese Tumor-assoziierten Signalaktivitäten führen neben einer direkten Aktivierung von Transkriptionsfaktoren auch häufig zur verstärkten Expression von Trans­ kriptionsfaktoren, die ihrerseits andere Gene aktivieren oder repremieren können und somit erst sekundär bzw. indirekt aktiviert werden. Ein hervorragendes Beispiel hierfür ist der PPARB Transkriptionsfaktor ("Peroxisome Proliferator Activated Receptor Delta"), der in Kolonkarzinomzellen auf Grund der Überaktivität der Wnt- Signaltransduktionskaskade expremiert wird. Es konnte gezeigt werden, dass Inhibitoren dieses Transkriptionsfaktors, sogenannte "Non-Steroidal Anti- Inflammatory Drugs" (= NSAIDS), wie zum Beispiel Sulindac oder Aspirin, durch Hemmung dieses Transkriptionsfaktors das Wachstum von Tumorzellen hemmen können (He, T. C., Chan, T. A., Vogelstein, B. & Kinzler, K. W. (1999). PPARdelta is an APC-regulated target of nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Cell 99: 335-45). Ein weiteres Beispiel für einen sekundär induzierten Transkriptionsfaktor ist c-myc, der beispielsweise auch in Zellen mit aktiver Wnt-Signalaktivität überexprimiert wird (He, T. C. et al. (1998). Identification of c-myc as a target of the APC pathway. Science 281: 1509-12). Der Synergismus unterschiedlicher Signalaktivitäten bei der Progression von Tumoren wurde am Beispiel der Onkogene myc und ras bereits 1987 von Sinn et al. beschrieben (Sinn, E., Muller, W., Pattengale, P., Tepler, I, Wallace, R. & Leder, P. (1987). Coexpression of MMTV/v-Ha-ras and MMTV/c-myc Genes in transgenic mice: Synergistic action of oncogenes in vivo. Cell 49: 465-475). Das Zusammenwirken von Proto-Onkogenen (wie z. B. β-Catenin, Ras, Myc, Fos) und Tumorsuppressorgenen (wie z. B. APC, Rb, p53) wird in dem Über­ sichtsartikel von Hanahan et al. anschaulich beschrieben (Hanahan, D. & Weinberg, R. A. (2000). The hallmarks of cancer. Cell 100: 57-70).

Die oben beschriebenen Signalaktivitäten spielen in zahlreichen anderen Tumorarten eine wichtige Rolle. So ist die Zahl der Befunde, nach denen Komponenten der Wnt- Signaltransduktionskaskade in vielen Tumoren mutiert sind bzw. kernlokalisiertes β-Catenin immunhistochemisch in Tumorgeweben nachweisbar ist, in den letzten Jahren exponentiell angewachsen. Dies unterstreicht die zentrale und generelle Bedeutung dieser Signalaktivitäten im Krebsgeschehen humaner Tumore. So werden aktivierende Mutationen des Onkogens β-Catenin unter anderem in Tumoren der Leber, der Niere, des Pankreas, des Magens, der Prostata, der Schilddrüse, der Gebärmutter, der Haut und Medulloblastomen gefunden. Beispielsweise ist β- Catenin in 75% humaner Hauttumore (Chan, E. F., Gat, U., McNiff, J. M. & Fuchs, E. (1999). A common human skin tumour is caused by activating mutations in beta- catenin. Nat Genet 21: 410-3) und in 89% humaner Lebertumore (Jeng, Y. M., Wu, M. Z., Mao, T. L., Chang, M. H. & Hsu, H. C. (2000). Somatic mutations of beta- catenin play a crucial role in the tumorigenesis of sporadic hepatoblastoma. Cancer Lett. 152: 45-51) mutiert. Darüber hinaus werden Mutationen in anderen Kompo­ nenten der Wnt-Signaltransduktionskaskade gefunden, die einen identischen Effekt hinsichtlich der Krebsentstehung haben (siehe oben; Satoh, S., Daigo, Y., Furukawa, Y., Kato, T., Miwa, N., Nishiwaki, T., Kawasoe, T., Ishiguro, H., Fujita, M., Tokino, T., Sasaki, Y., Imaoka, S., Murata, M., Shimano, T., Yamaoka, Y. & Nakamura, Y. (2000). AXIN1 mutations in hepatocellular carcinomas, and growth suppression in cancer cells by virus-mediated transfer of AXIN1. Nat Genet 24: 245-50). Auch in Tumoren der Brust spielt die Aktivierung der Wnt-Signaltransduktionskaskade eine zentrale Rolle und ist darüber hinaus von prognostischer Aussagekraft (Lin, S. Y., Xia, W., Wang, J. C., Kwong, K. Y., Spohn, B., Wen, Y., Pestell, R. G. & Hung, M. C. (2000). Beta-catenin, a novel prognostic marker for breast cancer: its roles in cyclin D1 expression and cancer progression. Proc Natl Acad Sci USA 97: 4262-6).

Die zentrale Bedeutung von p53 bei der Entstehung zahlreicher Tumore ist vielfach beschrieben. p53 ist das am häufigsten mutierte Tumorsuppressorgen in humanen Tumoren (mehr als 10 000 Mutationen sind in der Literatur beschrieben worden; Hernandez-Boussard, T., Rodriguez-Tome, P., Montesano, R. & Hainaut, P. (1999). IARC p53 mutation database: a relational database to compile and analyze p53 mutations in human tumors and cell lines. International Agency for Research on Cancer. Hum Mutat 14: 1-8). p53 reguliert Zellzykluskontrolle und Apoptose­ vorgänge im Zusammenhang mit Reparaturmechanismen nach DNA-Schädigungen. Demzufolge wird p53 auch als Wächter des Genoms ("Guardian of the Genome") bezeichnet, wobei die Funktionalität von p53 als Transkriptionsfaktor von ent­ scheidender Bedeutung ist (siehe oben). Mutationen von p53 wurden in sehr vielen Tumorarten gefunden, z. B. in Tumoren des Kolons, der Leber, der Brust, des Magens, des Pankreas, des Blutes, der Lunge, der Schilddrüse. Die generelle Tumor­ suppressorfunktion von p53 zeigt sich auch bei Patienten mit vererbten Mutationen des p53 Gens, die zahlreiche unterschiedliche Tumore entwickeln (Mazoyer, S., Lalle, P., Moyret-Lalle, C., Marcais, C., Schraub, S., Frappaz, D., Sobol, H. & Ozturk, M. (1994). Two germ-line mutations affecting the same nucleotide at codon 257 of p53 gene, a rare site for mutations. Oncogene 9: 1237-1239 / / Akashi, M. & Koeffler, H. P. (1998). Li-Fraumeni syndrome and the role of the p53 tumor suppressor gene in cancer susceptibility. Clin Obstet Gynecol 41: 172-99). Darüber hinaus sind Mutationen in p53 u. a. auch für Resistenzen gegenüber Chemo­ therapeutika verantwortlich (Aas, T., Borresen, A.-L., Geisler, S., Smith-Sorenson, B., Johnsen, H., Varhaug, J. E., Akslen, L. A. & Lonning, P. E. (1996). Specific P53 mutations are associated with de novo resistance to doxorubicin in breast cancer patients. Nature Med 2: 811-814).

Die zentrale Bedeutung der Ras-Signaltransduktionskaskade, die auch als SOS-Ras- Raf-MAPK-Kaskade bezeichnet wird, ist in der Literatur vielfältig beschrieben worden. In circa 25% humaner Tumore konnten strukturell veränderte Ras-Proteine nachgewiesen werden, die einem andauernden, wachstumsfördernden Signal gleich­ kommen (Hanahan, D. & Weinberg, R. A. (2000). The hallmarks of cancer. Cell 100: 57-70). Speziell in Kolontumoren ist Mutationshäufigkeit in bestimmten Krebs­ stadien sehr hoch (siehe oben). Es wurden jedoch auch in zahlreichen anderen Geweben Mutationen von Ras-Genen nachgewiesen, z. B. in Tumoren der Lunge, des Magens, des Pankreas, der Gallenblase, der Brust, der Gebärmutter, Sarkome.

Der Nachweis der Signalaktivitäten von aktivierten Transkriptionsfaktoren bzw. sekundär induzierten Transkriptionsfaktoren unter Verwendung sogenannter Reporter­ genkonstrukte wird in der Grundlagenforschung dazu verwendet, um biochemische Prozesse in etablierten Tumorzellinien zu untersuchen. Die Reportergenkonstrukte bestehen dabei aus einer Promotorregion, an die bestimmte Transkriptionsfaktoren binden können, und einem Reportergen, das in den Zellen normalerweise nicht vorhanden ist und bei Expression relativ leicht auf Grund der enzymatischen Aktivität bzw. der Fluoreszenz des Genprodukts nachgewiesen werden kann. So bietet die Firma Clontech in ihrem Katalog für das Jahr 2001 auf den Seiten 210 bis 212 ein sogenanntes "Mercury™ Pathway Profiling System" an, mit dem die Aktivitäten der Transkriptionsfaktoren NFAT, AP1, NFκB, CREB, ATF, c-Jun, c-Fos und ELK nachgewiesen werden können. Mit diesem System sollen Signalaktivitäten in etablier­ ten Tumorzellinien untersucht und quantifiziert werden. Dabei werden die Signal­ aktivitäten durch Zugabe von externen Stimuli wie z. B. PMA, Ionomycin und Forskolin induziert und mittels der Reportergene Luciferase, SEAP (= sezernierte Form der Alkalischen Phosphatase) oder d2EGFP (= destabilisierte Form des "Enhanced Green Fluorescent Protein") gemessen. In diesen Assays werden die Reportergen­ konstrukte mittels der Kalzium-Phosphat-Präzipitationsmethodik transient in die Tumorzellinienzellen transfiziert, um die Wirksamkeit von zusätzlich in die Zellen transfizierten Genkonstrukten, deren Genprodukte mit den Signalaktivitäten wechsel­ wirken könnten, zu untersuchen. Diese Untersuchungsansätze haben demnach das Ziel den molekularen Mechanismus der Signaltransduktionskaskaden aufzuklären.

Auffällig ist, dass ein solcher Ansatz bisher nicht zur Detektion primärer Tumor­ zellen, wie sie z. B. aus Tumoren und vor allem zur Detektion von metastatischen Zellen aus dem Blut von Tumorpatienten beschrieben wurde. Darüber hinaus fällt auf, dass meist nur die biochemische Aktivität eines spezifischen Signalweges durch ein Reportergenkonstrukt abgefragt wird. Eine simultane Analyse mehrerer Signal­ aktivitäten in einer einzelnen Zelle, die für die klinische Diagnostik von großer Bedeutung wäre, wird bei den Zellinienexperimenten nicht adressiert.

Eine Anwendung solcher Reportergensysteme in der klinischen Diagnostik ist mit derartigen Systemen weder beabsichtigt noch möglich, da die Transfektionseffi­ zienzen dieses Systems für die Transfektion (= DNA-vermittelter Gentransfer) von primären Tumorzellen unzureichend sind. Die Promotorstrukturen sind darüber hinaus nicht dergestalt optimiert, dass sie als sensitives Meßsystem auch ohne externe Stimuli eine ausreichende Expression des Reportergens in primären Tumorzellen ermöglichen. Ebenso vergleichen die experimentellen Ansätze stets Aktivitäten von induzierten und nicht-induzierten Tumorzellinien, enthalten jedoch keinen Vergleich zwischen "gesunden" Zellen und Tumorzellen. Die Zielrichtung derartiger Reportergensysteme ist ganz offensichtlich nicht die klinische Diagnostik von Tumorzellen, sondern vielmehr die Aufklärung von generellen Signaltransduktions-mechanismen in Tumorzelliniensystemen.

Der elementare Mangel der bisherigen Reportergensysteme wird auch in dem Patent von Hans Clevers und Bert Vogelstein (US 5851775; Anmeldung 20/03/1997) evident. Diese Arbeitsgruppe weist die tumor-assoziierte Wnt-Signalaktivität in Kolonkarzinomzellinien mittels eines Luciferase-Reportersystems in Zellkultur­ systemen nach (Korinek, V. et al. (1997). Constitutive Transcriptional Activation by a beta-catenin-Tcf complex in APC-/- Colon Carcinoma. Science 275: 1784-1787). Das Patent beschreibt eine Methodik zur Identifizierung potentieller Therapeutika unter Verwendung von TCF-Transkriptionsfaktor-responsiven Reportergenkon­ strukten. Dabei wird die Untersuchung von Zellen beansprucht, die Mutationen in den Signaltransduktionskomponenten APC oder β-Catenin aufweisen. Ein derartiges Screening-System geht auf die spezifischen Gegebenheiten der Kolonkarzinogenese ein, in denen APC und β-Catenin häufig mutiert sind (siehe oben). Substanzen, die die Wnt-Signalkaskade auf Grund der Wechselwirkung mit anderen Komponenten der Kaskade beeinflussen, können mit diesem System jedoch nicht gefunden werden. Hierfür wäre es sinnvoll ein zelluläres System (z. B. unter Verwendung von Brust­ tumorzellen) zu etablieren, bei der die Wnt-Signalaktivität z. B. auf die Über­ expression des extrazellulären Liganden Wnt zurückzuführen ist. Die in dem Patent beanspruchten Reportergenkonstrukte werden darüber hinaus weder zur Detektion noch Isolierung von primären Tumorzellen beansprucht, noch wird an eine derartige Anwendung in der klinischen Diagnostik in diesem Zusammenhang gedacht.

In einem Patent von Bert Vogelstein und Kenneth Kinzler (US 6140052; Anmeldung 20/08/1998) wird ein Reportergenkonstrukt zur Bestimmung der Wnt-Signalaktivität beansprucht, das eine genau festgelegte Basenabfolge der Bindungsstelle von TCF- Transkriptionsfaktoren in den Promotorstrukturen enthält (CTTTGAT und ATCAAAG), die sich aus dem von ihnen entdeckten c-myc-Zielgenpromotor ableitet. Dies steht im augenscheinlichen Widerspruch zu der Tatsache, dass die hier untersuchten TCF-Faktoren gegenüber Veränderungen in der Basenabfolge ihrer DNA-Bindungsstellen unempfindlich sind. So wird die DNA-Bindungsaktivität des sehr nah verwandten LEF-1-Transkriptionsfaktors bereits 1995 von Love et al. (Love, J. J. et al. (1995). Structural basis for DNA bending by the architectural transcription factor LEF-1. Nature 376: 791-795) durch Kokristallisierungsexperi­ mente beschrieben, wobei die Basenabfolge der verwendeten DNA-Bindungsstelle (CCTTTGAA) intensive Kontakte mit der DNA-Bindungsdomäne des Transkrip­ tionsfaktors macht. Dabei wird beschrieben, dass die Position des mittleren Thymidins für die Bindungsaffinität kritisch ist, während die Transversion ("T → A") des benachbarten Thymidins keinen Einfluss auf die Bindungsaktivität hat. Demnach wären auch andere Basenabfolgen ähnlich effizient in ihren Bindungsaffinitäten (z. B. CCATTGAA). Da LEF-1 und TCF-Faktoren einander nicht nur strukturell sehr ver­ wandt sind sondern sich auch funktionell gegenseitig ersetzen können, macht es wenig Sinn eine spezifische Basenabfolge für LEF-1/TCF-Faktoren, wie im US-Patent 6140052 geschehen, zu beanspruchen. Darüber hinaus diskutierten die Patentinhaber bereits im Oktober 1996 die Bedeutung dieser Faktoren in der Kolon­ karzinogenese (Kinzler, K. W. & Vogelstein, B. (1996). Lessons from hereditary cancer. Cell 87: 159-70).

Als Reportergen zur Isolierung lebender Tumorzellen aus Blutproben bietet sich das Grün-Fluoreszinierende-Protein GFP an, das auf Grund seines Fluoreszenzverhaltens bei Expression zu einem Aufleuchten der Zellen nach entsprechender Belichtung führt. GFP ist in vielfältiger Form bereits patentiert worden. Das nächstliegende Patent (US 5968738) beschreibt unter anderem die Verwendung von zwei GFP Varianten und FACS bzw. Durchflusszytometrie zur "Analyse von Signaltransduktionsaktivitäten". Ein spezifisches Patent zur Diagnostik von metastatischen Zellen aus dem Blut existiert jedoch nicht. Fast alle Patente befassen sich bisher mit therapeutischer Nutzanwendung oder beschreiben die Zellsortierung von Zelliniengemischen in vitro. Für die diesem Patent zu Grunde liegenden Experimente wurde eine GFP-Variante verwendet ("alphaGFPT204I"), die unseres Wissens nach bisher nicht für eine Verwendung als Reportergen beansprucht wurde. Das erhöhte Fluoreszenzverhalten dieser GFP- Variante wurde bereits 1996 veröffentlicht (Crameri, A., Whitehorn, E. A., Tate, E. & Stemmer, W. P. C. (1996). Improved Green Fluorescent Protein by molecular evolution using DNA shuffling. Nature Biotechnology 14: 315-319). Darüber hinaus wurde als Transfektionskontrolle ein konstitutiv expremiertes, rot fluoreszinierendes Protein aus Discosoma sp. (= "DsRed") der Firma Clontech verwendet (Kat. Nr. 6921-1).

Für die Isolierung lebender Tumorzellen aus Körperproben können neben fluoreszenten Reportergenprodukten jedoch auch zahlreiche andere Gene verwendet werden, die zum Beispiel auf Grund von strukturellen Eigenschaften nachgewiesen werden können. Von besonderem Interesse sind dabei Gensequenzen, die für Produkte kodieren, die extrazellulär nachweisbar sind. Ganz besonders geeignet sind dabei Transmembranproteine, die antigene Strukturen auf der Oberfläche der Zellen exponieren, die von entsprechenden Antikörpern erkannt werden. Dabei sind antigene Sequenzen nicht humanen Ursprungs von Vorteil, deren Nachweis auf Grund der fehlenden Kreuzreaktivitäten der Antikörper eine erhöhte Spezifität ermöglicht, da keine endogenen, humanen Genexpressionen detektiert werden. Die antigenen Strukturen können dabei mittels molekularbiologischer Verfahren in unterschiedlichster Form mit natürlichen Gensequenzen rekombiniert werden, so dass die antigenen Strukturen vorzugsweise extrazellulär präsentiert werden.

Für die Detektion krankheits-assoziierter Signalaktivitäten eignen sich darüber hinaus auch Reportergene, die enzymatische Aktivitäten vermitteln, wie z. B. Luciferasen, β-Galaktosidasen, Proteasen, Glykosidasen, Acetylasen, Phosphatasen, die intrazellulär vorliegen können oder sekretiert werden. Zur Detektion seltener Ereignisse ist es dabei von Vorteil ein möglichst sensitives Nachweisverfahren unter Einbeziehung von Verstärkungssystemen zu verwenden. In der Immunhisto- und Immuncytochemie sind solche Verstärkungssysteme weit verbreitet und beinhalten in der Regel die Verwendung von Sekundärantikörpern oder des Biotin-Streptavidin­ systems in Kombination mit enzymatischen Nachweisreaktionen um die Signalinten­ sität zu erhöhen.

Bei der Detektion seltener Ereignisse im Blut (z. B. metastatischer Zellen) bietet es sich an ein natürliche Verstärkungssysteme zu verwenden, die im Blut natürlicherweise vor­ handen sind. Insbesondere wäre es interessant aktive Komponenten der Blutge­ rinnungskaskade spezifisch von metastatischen Tumorzellen in Patientenblutproben sekretieren zu lassen, die zur Gerinnung tumorzellhaltiger Blutproben fuhren würde. Normalerweise schützt sich der Organismus durch den Vorgang der Blutstillung (Hämostase) bei Verletzungen gegen Blutverluste. Dabei wird in Anwesenheit unterschiedlicher aktivierender Substanzen eine Kaskade enzymatischer Reaktionen in Gang gesetzt. Von besonderer Bedeutung für dieses Patent ist die beschriebene exogene Aktivierung des Gerinnungssystems durch Faktor VII mit Gewebs­ thromboplastin als Protein-Cofaktor. Das im Blut zirkulierende Zymogen des Faktors VII hat im Gegensatz zu allen anderen inaktiven Vorstufen Gerinnungsfaktoren bereits proteolytische Aktivität, die jedoch nicht zu einer Gerinnungsaktivierung führt, wenn kein Gewebsthromboplastin vorhanden ist. Gewebsthromboplastin wird bei Gewebeverletzungen aus den Mikrosomen verletzter Zellen freigesetzt. Es ist (in der natürlichen Form) ein Komplex aus einem Protein und einem Phospholipid. Freigesetztes Gewebsthromboplastin verleiht dem einkettigen Faktor-VII-Zymogen ohne proteolytische Aktivität eine größere Aktivität. Der Gewebsthromboplastin- Faktor-VII-Komplex bildet in Gegenwart von Kalzium-Ionen an Phospholipidpartikeln (Plättchenfaktor 3) einen Komplex, an dem die Aktivierung der Faktoren IX und X erfolgt. Im Zuge der fortschreitenden Aktivierung des plasmatischen Gerinnungs­ systems kommt es bei der Aktivierung jeder nachfolgenden Enzymreaktion zu einer enormen Verstärkung des Ausgangssignals. Am Ende dieser lawinenartigen Reaktions­ kaskade, die auch als plasmatische Gerinnung bezeichnet wird, steht die Umwandlung von Fibrinogen zu Fibrin, dessen dreidimensionales Netzwerk den losen Thrombozytenpfropf an der verletzten Stelle durchdringt und ihn verfestigt. Ent­ scheidend bei der exogenen Aktivierung der Gerinnungskaskade ist die Bindung von Anteilen der extrazellulären Domäne des Gewebsthromboplastins mit dem Zymogen des Faktors VII. Natürlich vorkommendes Gewebsthromboplastin ist ein integrales Membranprotein, das in intakten Zellen im Zellinnern (im Endoplasmatische Reti­ kulum) verborgen vorliegt und erst bei Verletzung der Zellintegrität freigesetzt wird, so dass es zu keiner vorzeitigen Aktivierung der Blutgerinnungskaskade kommen kann. Von klinischer Relevanz ist Bestimmung der klinisch-chemischen Kenngröße der Thromboplastinzeit (= "Qick-Wert", TPZ, Prothrombinzeit). Die Thromboplastinzeit gehört zu den Gerinnungsanalysen, die vor allen operativen Eingriffen durchgeführt werden müssen, um eine mögliche Verminderung der Faktoren II, V, VII, X und von Fibrinogen zu ermitteln. Hierzu wird die Fibrinbildung durch Zugabe von Gewebs­ thromboplastin und Kalzium-Ionen in Plasma aus Citrat-Vollblut ausgelöst und die Gerinnungszeiten gegenüber Kontrollblutplasma bestimmt, wobei die Thromboplastinzeit unter der Applikation von Heparin vermindert ist.

Auf Grund der molekularen Beschaffenheit von natürlichem Gewebsthromboplastin ist die Gewinnung und Aufreinigung eines funktionellen Protein/Phospholipidpartikels zur Bestimmung der Thromboplastinzeit technisch aufwendig. Inzwischen ist es jedoch gelungen eine natürlicherweise nicht vorkommende, wasserlösliche Variante von Thromboplastin rekombinant in Bakterien und anderen Expressionssystemen herzu­ stellen (Übersichtsartikel: Morrissey, JH. (1995). Tissue factor modulation of factor VIIa activity: use in measuring trace levels of factor VIIa in plasma. Thromb Haemost. 74: 185-8). Diese wasserlöslichen Formen des Gewebsthromboplastins ("soluble Tissue Factor" = sTF) bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 219 sind kommerziell erhältlich (z. B. als Bestandteil eines Kits zur Bestimmung der Faktor VIIa Menge der Firma Diagnostica Stago (Kat. # 00281)) und können in Anwesenheit von Phopholipid- Vesikeln und Faktor VIIa die Aktivierung von Faktot X bewirken (Ruf, W., Rehem­ tulla, A., Morrissey, J. H., Edgington, T. S. (1991). Phospholipid-independent and - dependent interactions required for tissue factor receptor and cofactor function. J Biol Chem. 266: 16256). Für diese Experimente wurde die isolierte extrazelluläre Domäne von Thromboplastin in Säugerzellen expremiert und ähnlich wie in Experimenten von Neuenschwander et al. als sezeniertes Protein aus Zellkulturüberständen isoliert. Dabei zeigte sich, dass der Verlust der Transmembranregion für die Autoaktivierung von Faktor VII von Bedeutung ist, was eine stark verlängerte Gerinnungsdauer in Standart Blutgerinnungsassays zur Folge hat (Neuenschwander, P. F. & Mornssey, J. H. (1992). Deletion of the membrane anchoring region of tissue factor abolishes autoactivation of factor VII but not cofactor function. Analysis of a mutant with a selective deficiency in activity. J Biol Chem 267: 14477-82). Inzwischen ist es jedoch durch Fusion einer synthetischen Leucin-Reißverschluss-Dimerisierungsdomäne gelungen, eine rekom­ binante Form der isolierten extrazellulären Domäne von Thromboplastin zu generieren, die auch in Abwesenheit von Phospholipiden zur Autoaktivierung von Faktor VII befähigt ist und ähnliche biochemische Aktivitäten wie das aufgereinigte Wild-Typ Thromboplastin bei der Aktivierung von Faktor X besitzt (Donate, F., Kelly, C. R., Ruf, W. & Edgington, T. S. (2000). Dimerization of tissue factor supports solution-phase autoactivation of factor VII without influencing proteolytic activation of factor X. Biochemistry 39: 11467-76).

Erfindungsgemäß können jedoch auch andere aktive Komponenten der Blut­ gerinnungskaskade als Reportergen verwendet werden (z. B. Thrombin, Faktor Va, Faktor VIIa, Faktor IXa, Faktor Xa oder Faktor XIIa) oder Komponenten anderer biologischer Kaskaden (z. B. des Komplement Systems, des Kinin Systems) oder generell aktive Substanzen, die Fibrin oder andere Substrate umsetzen (wie z. B. tPA, uPA, Plasminogen/Plasmin, oder Derivate bzw. Hybride derselben). Umgekehrt können auch Varianten der Komponenten verwendet werden, die diese biologischen Kaskaden inhibieren. So erscheint z. B. die Verwendung von Plasmin, der aktiven Komponente von Plasminogen, als skretiertes Reportergen sinnvoll zu sein, da es (durch Veränderung der FaktorX-Aktivität) die Blutgerinnung hemmt und gleich­ zeitig die Fibrinolyse stimuliert (Pryzdial, E. L., Lavigne, N., Dupuis, N. & Kessler, G. E. (1999). Plasmin converts factor X from coagulation zymogen to fibrinolysis cofactor. J Biol Chem 274: 8500-5) und somit unter entsprechenden, experimentellen Bedingungen meßbar ist (Blutgerinnungsassays, Umsatz chromogener bzw. fluoreszenter Substrate).

Die diagnostische Verwendung von Komponenten biologischer Kaskaden als Reportergen in Blutproben ist neu. In dem nächstliegenden US-Patent 6080575 wird die Verwendung von Nukleinsäurekonstrukten beschrieben, die für ein Fusions­ produkt aus einer aktiven Komponente, einem Protease-sensitiven Bereich und einer inhibitorischen Komponente bestehen. Dabei kann die aktive Komponente des Fusionsproteins u. a. auch Bestandteil der Blutgerinnungskaskade (i. e. Faktor X) sein. Diese aktive Komponente ist jedoch im Kontext des intakten Fusionsproteins auf Grund der Anwesenheit der inhibitorischen Komponente in ihrer Aktivität gehemmt. Erst die Anwesenheit bestimmter Proteasen im umgebenden Milieu, z. B. durch Zugabe von PSA zu Zellkulturüberständen von Zellen, die mit dem Nuklein­ säurekonstrukt stabil transfiziert wurden, setzt die aktive Komponente frei, und führt in Blutgerinnungsassays zu kürzeren Blutgerinnungszeiten nach Rekalzifikation. Ziel dieses Patentes ist es die Sekretion von Proteasen durch Tumorzellen oder durch Zellen, die an entzündlichen Prozessen beteiligt sind, auszunutzen. Dabei beab­ sichtigt dieses Patent eine therapeutische Nutzanwendung des beschriebenen Verfahrens zur Zielzell-spezifischen Therapie von Tumoren und entzündlichen Regionen.

In dem US-Patent 4784950 wird die Expression von Proteinen in Säugerzellen patentiert, die biologische Aktivität im Sinne der Aktivierung der Blutgerinnung haben. Dabei dient das beschriebene Verfahren der Produktion großer und hochreiner Mengen von Faktor VIIa und Faktor IX zur Behandlung von Patienten, die entsprechende Defizienzen aufweisen. Wiederum handelt es sich bei diesem Patent also um eine rein therapeutische Nutzanwendung.

Die Isolierung bestimmter Zellen aus heterogenen Zellgemischen ist nicht nur für die Detektion und Charakterisierung von krankhaft veränderten Zellen interessant. Auch die Isolierung von gesunden Zellen ist von diagnostischer und therapeutischer Be­ deutung. Beispielsweise ist die Isolierung adulter Stammzellen, die zu unter­ schiedlichen organ- oder gewebsspezifischen Zellen ausdifferenzieren können, von großem medizinischem Interesse. So könnten Stammzellen, nach ihrer Isolation und Vermehrung ex vivo, zur Heranzüchtung und autologen Transplantation von Ersatz­ organen verwendet werden. Die hierzu benötigten Stammzellen könnten dabei nach entsprechender "Transdifferenzierung" auch aus anderen Ursprungsorganen stammen. Die medizinische Bedeutung pluripotenter Stammzellen geht nicht zuletzt aus den Erfahrungen mit hämatopoetischen Stammzellen bei der Behandlung von Blutkrebspatienten hervor. Die Verwendung von adulten Stammzellen aus anderen Organen erwies sich jedoch als äusserst komplex, da die Isolation der seltenen Stammzellen in nicht-differenziertem Zustand und hoher Reinheit sehr schwierig ist.

Das Vorhandensein derartiger, pluripotenter Zellen konnte jedoch inzwischen in zahlreichen Organen nachgewiesen werden. So konnten Stammzellen z. B. aus schnell regenerierenden Organen (Haut, Darm, Skelettmuskel) unter selektiven Wachstumsbedingungen angereichert werden. Neueren Untersuchungen zufolge benötigen adulte Stammzellen jeweils spezifische biochemische Aktivitäten für die Aufrechterhaltung ihres dedifferenzierten Zustandes. Besonders eindrucksvoll zeigt sich dies am Beispiel der Dünndarmepithel-Stammzellen, die bei Deletion des Transkriptionsfaktors TCF4 verloren gehen (Korinek, V., Barker, N., Moerer, P., van Donselaar, E., Huls, G., Peters, P. J. & Clevers, H. (1998). Depletion of epithelial stem-cell compartments in the small intestine of mice lacking Tcf-4. Nat Genet 19: 379-83). Dieser Untersuchung zufolge benötigen die Stammzellen des Dünndarms Wnt-Signalaktivität, die in den Krypten der Dünndarmmikrovilli mittels TCF4 vermittelt wird, für ihr Fortbestehen im adulten Organismus. Ähnliche Schluss­ folgerungen für andere Organsysteme lassen sich aus Untersuchungen ableiten, bei denen Komponenten der Wnt-Signalkaskade in der Haut spezifisch deletiert oder in aktiver Form expremiert wurden. Auch bei Vorläuferzellen des hämatopoetischen Systems scheint die Wnt-Signalkaskade von Bedeutung zu sein. Demnach regulieren Wnt-Faktoren die Expansion und Aufrechterhaltung von hämatopoietischen Vorläuferzellen (Austin, T. W., Solar, G. P., Ziegler, F. C., Liem, L. & Matthews, W. (1997). A role for the Wnt gene family in hematopoiesis: Expansion of multilineage progenitor cells. Blood 89: 3624-3635). Dieser Befund ist vor allem auch auf Grund neuerer Untersuchungen von großem therapeutischen Interesse. So konnte gezeigt werden, dass adultes Knochenmarksgewebe Stammzellen hoher Plastizität bzw. eines breiten Differenzierungspotentials enthält (Krause, D. S., Theise, N. D., Collector, M. I, Henegariu, O., Hwang, S., Gardner, R., Neutzel, S. & Sharkis, S. J. (2001). Multi-Organ, multilineage engraftment by a single bone marrow-derived stem cell. Cell 105: 369-77). Bestimmte Knochenmarksstammzellen übernahmen nach Transplantatiom im Empfängerorganismus die Funktion von Stammzellen der Lunge, der Haut, der Leber und des Verdauungstraktes. Zur Anreicherung der entsprechenden Stammzellen verwendeten die Autoren einen sogenannten "Homing Assay", der eine serielle Tansplantation von aufgereinigten und markierten Knochenmarkszellen in Röntgen-bestrahlte Empfängertiere beinhaltet. Diese Art der Isolierung der adulten Stammzellen ist für eine klinische Anwendungen beim Menschen nicht geeignet.

Neueren Untersuchungen zufolge scheinen sich zahlreiche Tumore aus adulten bzw. "somatischen" Stammzellen zu entwickeln. Dies ergibt sich zum einem aus dem Befund, dass die aberrante Aktivierung bestimmter Signalkaskaden (Wnt, Hedgehog) nicht nur zu einem sehr hohen Prozentsatz zur Enstehung bestimmter Tumore beiträgt, sondern in denselben Geweben auch für die Aufrechterhaltung von Stamm­ zellpopulationen benötigt wird (Taipale, J. & Beachy, P. A. (2001). The Hedgehog and Wnt signalling pathways in cancer. Nature 411: 349-354). Die Tatsache, dass in einer einzelnen somatischen Zelle zwischen 4 und sieben Mutationen stattfinden müssen, damit sich ein Tumor bildet, deutet ebenfalls daraufhin, dass die ent­ standenen Tumorzellen selbst in sich rasch erneuernden Geweben (Darm Haut, Blut) längere Zeit vorhanden gewesen ein müssen. Signalaktivitäten, die an der Tumor­ entstehung ursächlich mitwirken (und in diesem Patent beispielhaft aufgeführt werden), sind demnach potentiell auch in Stammzellen aktiv. Verfahren zur Iso­ lierung von Tumorzellen können auch für die Isolierung bestimmter Stammzellen verwendet werden.

In diesem Zusammenhang sind die Arbeiten von Tannishtha Reya interessant, die sie auf dem Wnt Meeting 2001 in New York vorstellte. Sie konnte zeigen, dass die retrovirale Expression von β-Catenin hämatopoietische Stammzellen langfristig in einem undifferenzierten Zustand konserviert und ihre Fähigkeit steigert sich im Knochenmark letal-bestrahlter Mäuse anzusiedeln um ein vollständiges hämato­ poietisches System aufzubauen. Dies verdeutlicht die Funktion und Bedeutung der Wnt-Signalkaskade bei der Aufrechterhaltung hämatopoietischer Stammzellen und legt nahe, dass die Isolierung von Blutzellen aus dem Knochenmark auf Grund einer aktiven Wnt-Signalkaskade zur Anreicherung von adulten Stammzellen verwendet werden kann, wobei serielle Transplantationen zur Anreicherung der Stammzellen umgangen würden. Zusammenfassend lässt sich für bestimmte Signalkaskaden (Wnt, hedgehog) festhalten, dass sie für die Aufrechterhaltung sowie Expansion von zumindest einigen Stamzellpopulationen notwendig sind.

Erfindungsgemäß lässt sich das Vorhandensein spezifischer Signalaktivitäten in adulten Stammzellen zu deren Isolation ausnutzen. Prinzipiell werden dabei ähnliche Nukleinsäurekonstrukte wie die zur Detektion und Isolation von Tumorzellen beschriebenen verwendet. Hierzu werden die jeweiligen Reportergene hinter die für die biochemischen Aktivitäten in adulten Stammzellen sensitiven Promotorstrukturen kloniert. Vorzugsweise werden Reportergenkonstrukte verwendet, die für fluores­ zinierende oder transmembrane Reportergenprodukte kodieren und mittels viraler Expressionssysteme in die Zellen der Körperproben eingeschleust werden. Prinzipiell können jedoch auch andere Reportergene verwendet werden. Die Isolation der Zellen erfolgt anschliessend vorzugsweise mittels Durchflusszytometrie in Anwesenheit von Differenzierungsinhibitoren. Es können jedoch auch andere Verfahren Anwendung finden, die beispielsweise auf der Detektion induzierter Oberflächenstrukturen basieren und mittels "Beads" isoliert werden. Prinzipiell kann es auch sinnvoll sein zusätzlich zu den für die Zellisolation notwendigen Reportergenen Inhibitoren von Differenzierungsvorgängen (z. B. Transkriptionsfaktoren mit entsprechender Wirkung auf die Genexpressionen der jeweiligen Stammzellen) konstitutiv, induziert oder zelltyp-spezifisch expremieren zu lassen. Die isolierten, adulten Stammzellen eines Patienten können nach operativen bzw. anderen medizinischen Eingriffen für die Neubildung oder Regeneration des identischen oder (nach entsprechender Trans­ differenzierung) zur Regeneration anderer Organe verwendet werden. Beispielsweise könnten adulte Stammzellen des Darms für die Regeneration der Langerhansschen Inselzellen des Pankreas von Diabetes-Patienten verwendet werden.

Auch der Kontakt von gesunden Körperzellen mit pathohenen Agentien (z. B. Infek­ tion durch Viren, Kontakt mit Bakterien oder bakteriellen Substanzen, Anwesenheit von allergenen Stoffen) oder mit stimulierenden oder reprimierenden Substanzen (Wachstumsfaktoren, Wachstumsfaktorantagonisten, Toxine, chemische Substanzen) kann Veränderungen in den biochemischen Aktivitäten von Zellgemischen führen, die die Isolierung bestimmter Zellen erleichtert. So ist es beispielsweise denkbar, dass der Kontakt mit wachstumshemmenden Stoffen bestimmte biochemische Aktivitäten in bestimmten (z. B. gesunden) Zellen reprimiert, in anderen Zellen (z. B. krankhaft veränderten) jedoch ohne Wirkung bleibt. Die nicht-repremierten Akti­ vitäten in diesen Zellen könnten dann zur Zellisolation ausgenutzt werden. Auch die veränderte Aufnahme von bestimmten Stoffen kann zur Detektion spezifischer Zellen aus heterogenen Zellgemischen verwendet werden. Dies gilt nicht nur für den Fall, dass Transportproteine in Zielzellen als Reportergene expremiert werden. So ist es beispielsweise auch denkbar die vermehrte Expression von Glutamat-Transportern in Lebertumorzellen für die Isolation der Zellen auszunutzen. So könnte der vermehrte Transport von detektierbaren (z. B. fluoreszinierenden) Transportsubstratanaloga zur Markierung der veränderten Zellen verwendet werden.

Aufgabe

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, ein Verfahren bereit­ zustellen, mit dem spezifische Zellen detektiert und ggf. auch aus Blutproben oder anderen Körperproben in lebendem Zustand isoliert werden können, so dass sie nachfolgenden Untersuchungen oder für therapeutische Nutzanwendungen zur Verfügung stehen.

Summarische Beschreibung/Lösung

Die vorliegende Erfindung beruht auf Erkenntnissen, dass sich Signalaktivitäten in den Zellkernen von bestimmten Zellen durch Transfektion von Reportergen­ konstrukten mit synthetischen Promotorstrukturen zur spezifischen Expression von Reportergenen ausnutzen lassen. Nach Transfektion eines heterogenen Zellgemisches mit synthetischen Reportergenkonstrukten kommt es auf Grund der konkatemeren Aneinanderreihung optimierter Transkriptionsfaktorbindungsstellen bzw. auf Grund der Kombination von unterschiedlichen Transkriptionsfaktorbindungsstellen in spezifischen Zellen zu einer starken Überexpression bzw. Sekretion von Reporter­ genprodukten, die unterschiedliche Nachweisverfahren ermöglichen.

In einem Verfahren werden die Signalaktivitäten in krankhaft veränderten Zellen (z. B. Tumorzellen) zur spezifischen Expression von fluoreszinierenden Proteinen ausgenutzt. Da die gesunden Zellen in der Blutprobe diese Signalaktivitäten nicht besitzen; ist die Spezifität des Tumorzellnachweises hoch und ermöglicht die Isolierung lebender, fluoreszinierender Tumorzellen mittels Durchflusszytometrie. Die isolierten Tumorzellen können anschließend in Kultur genommen werden und stehen weiteren Analysen zur Verfügung. Die Reportergenkonstrukte lassen sich dabei auch für Zellkultursysteme verwenden, die die Reportergenexpression vor und nach Kontakt von transfizierten Zellen mit potentiellen Wirksubstanzen messen. Dies kann einerseits für individualisierte Therapieentscheidungen verwendet werden, wenn die untersuchten Zellen aus Patienten stammen, andererseits auch Screening- Verfahren dienen, die Aktivitäten in Zellinienzellen analysieren.

In einem anderen Verfahren kodieren Teilbereiche der Reportergene für eine biolo­ gische Aktivität, die die Initiation bzw. Progression von biologischen Kaskaden positiv oder negativ beeinflusst. Da die gesunden Zellen in der Blutprobe die zur Expression des Reportergens benötigten Signalaktivitäten nicht oder in signifikant unterschiedlicher Ausprägung besitzen, werden die biologischen Kaskaden nur in Anwesenheit krankhaft-veränderter Zellen induziert bzw. gehemmt, so dass eine außerordentlich hohe Spezifität des Tumorzellnachweises erzielt wird. Darüber hinaus ist die Sensitivität des Tumorzellnachweises auf Grund der Ausnutzung natürlicher Verstärkungssysteme bzw. von im Blut zumindest partiell vorhandenen, biologischen Kaskaden sehr hoch. Der Nachweis der tumorzellspezifischen Ex­ pression der Reportergene erfolgt anschließend durch Messung der Aktivierung bzw. Aktivierbarkeit der jeweiligen biologischen Kaskaden, z. B. nach Art der klassischen Blutgerinnungsassays ("quick-test", TPZ).

In einem weiteren Verfahren werden Signalaktivitäten in gesunden Zellen (z. B. adulten Stammzellen) zur Isolation der Zellen aus heterogenen Zellgemischen ausgenutzt. Dabei werden die Zellen der jeweiligen Körperproben, wie z. B. Biopsien, zunächst mittels zellbiologischer Standartmethodiken vereinzelt, bevor sie mit den Nukleinsäurekonstrukten transfiziert werden. Die Funktionalität der isolierten (vorzugsweise humanen) Stammzellen kann ggf. in immunsuppremierten Tier­ modellen nach entsprechenden operativen Eingriffen in vivo getestet werden, bevor sie in den Patienten, aus denen sie ursprünglich stammten, zurückgeführt werden.

Detaillierte Beschreibung

Die Erfindung bezieht sich auf Nukleinsäurekonstrukte zur zellspezifischen Expression von Reportergenen in Körperproben, wobei die Reportergenkonstrukte folgende Komponenten beinhalten: a) ein Promoter-Element mit mindestens einer, bevorzugt jedoch mehreren DNA-Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren, die auf Grund ihrer zellspezifischen Aktivitäten oder aber auf Grund der konkatemeren Anordnung oder spezifischen Kombination von DNA-Bindungsstellen in bestimmten Zellen überaktiv sind, oder aber gentechnisch relevante Regionen, die die Insertion bzw. Integration von Nukleinsäurekonstrukten in Zielregionen beeinflussen; b) ein Reportergen, das die Detektion der spezifischen Zellen ermöglicht. Die Transfektion der Zellen erfolgt vor­ zugsweise mittels viraler Expressionssysteme, die eine effiziente Transfektion der im Blut befindlichen Zellen mit Reportergenkonstrukten ermöglichen. Besonders bevor­ zugt sind dabei solche Transfektionssysteme, die auf Grund ihrer Zelltyp-Präferenzen eine zusätzliche Spezifität der Reportergenexpression bewirken. Die Expressionslevel der Reportergene können anschließend manuell, aber auch mittels automatisierbarer Verfahren ermittelt werden.

Die Beschaffenheit der Promotorstrukturen lässt sich auf die jeweils zu detektierende Signalaktivität anpassen. In der Regel werden Transkriptionsfaktorbindungsstellen einer spezifischen Signalaktivität, räumlich durch kurze DNA-Sequenzen getrennt ("Spacer"), als Konkatemere vor Minimalpromotoren (z. B. aus dem c-Fos oder Thymi­ dinkinasegenpromotor) positioniert. Darüber hinaus können gleichzeitig mehrere Signalaktivitäten gemessen werden, wenn DNA-Bindungsstellen für Trans­ kriptionsfaktoren unterschiedlicher Signaltransduktionswege miteinander kombiniert werden. Eine gleichzeitige und voneinander unabhängige Messung verschiedener Signalaktivitäten in einer Zelle lässt sich durch Transfektion von Reportergen­ konstrukten erreichen, die unterschiedliche Reportergene mit jeweils verschiedenen Promotorstrukturen enthalten. Dabei können diese Transkriptionseinheiten aus dem jeweiligen Promotor und dem nachgeschaltetem Reportergen entweder auf einem DNA-Konstrukt oder auf getrennten DNA-Konstrukten enthalten sein. Besonders sinnvoll erscheint dabei auch die gleichzeitige Verwendung von induzierbaren (mit Wildtyp-Transkriptionsfaktorbindungsstellen) und nicht-induzierbaren (mit mutierten Transkriptionsfaktorbindungsstellen) bzw. konstitutiv aktiven Reportergenkonstrukten, da hiermit die spezifische Aktivierung des Reportergens durch bestimmte Transkriptionsfaktoren analysiert werden kann, bzw. Transfektionseffizienzen und Zytotoxizitäten erfasst werden. Andererseits kann ein Promotor auch gleichzeitig die Expression von zwei verschiedenen Reportergenen regulieren, wenn die Reportergene durch ein zwischengeschaltete IRES-Sequenz (z. B. der "Internal Ribosomal Entry Site"-Sequenz aus dem Encephalomyocarditis Virus) getrennt vorliegen.

Unter Umständen ist es sinnvoll die Promotoren zusätzlich durch Bindungsstellen von basalen Transkriptionsaktivatoren zu ergänzen, deren Transaktivierungspotential erst bei Anwesenheit der spezifischen, krankheitsassoziierten Transkriptionsfaktoren ihre volle Aktivität entfalten. Dieses Prinzip der Kooperativität von Transkriptionsfaktoren bei der Aktivierung von Promotoren beruht auf Erkenntnissen, die bei der Unter­ suchung des MMTV-Promotors erzielt wurden. So konnte gezeigt werden, dass die maximale Stimulierung des Promotors nach Bindung des Liganden-stimulierten Glucocorticoidrezeptors erst durch die Bindung des basalen Transkriptionsaktivatoren NF1 erzielt wird. Die Aktivierung der Reportergenexpression kann durch Etablierung eines positiven Rückkopplungsmechanismusses verstärkt werden. Beispielsweise ist es sinnvoll, wenn zur Messung der Wnt-Signaltransduktionsaktivität Nukleinsäure­ konstrukte verwendet werden, bei denen Wnt-sensitive Promotoren sowohl die Expression eines positiven Effektors (z. B. Fusionskonstrukt aus LEF-1 und der trans­ aktivierenden, C-terminalen Region von β-Catenin; Vleminckx, K., Kemler, R. & Hecht, A. (1999). The C-terminal transactivation domain of beta-catenin is necessary and sufficient for signaling by the LEF-1/beta-catenin complex in Xenopus laevis. Mech Dev 81: 65-74), als auch die Expression des eigentlichen Reportergens bedingen. Darüber hinaus kann die basale Aktivität der synthetischen Promotorstrukturen auch durch Ergänzung von DNA-Bindungsstellen für transkriptionelle Repressoren unter­ drückt werden. Dabei kann der entsprechende transkriptionelle Repressor endogen vorhanden sein oder durch ein zusätzlich eingebrachtes Repressorgen, das konstitutiv expremiert wird, bereitgestellt werden. Hierfür können auch Nukleinsäurekonstrukte verwendet werden, die für rekombinante Proteine bestehend aus einer DNA- Bindungsdomäne eines beliebigen Transkriptionsfaktors (z. B. der HMG-Domäne von LEF-1/TCF-Transkriptionsfaktoren, Carboxy-terminale Region (die letzten 90 Amino­ säuren) von c-myc) und einer heterologen Repressordomäne (z. B. des Tet Repressors, Carboxy-terminale Region (Aminosäure 179-281) von E2F6) bestehen. Erst in Anwesenheit eines starken transkriptionellen Aktivators auf demselben cis-wirkenden Promotorelement kommt es demnach zur Aktivierung des nachgeschalteten Reporter­ gens, während das Reportergen in Abwesenheit des Transkriptionsaktivators reprimiert ist. Besonders interessant sind in diesem Zusammenhang Systeme, bei denen die transkriptionellen Repressoren durch endogene Aktivitäten reguliert sind, wenn also neben den eigentlich meßbaren Reportergenen ein Repressorgen als weiteres Reportergen verwendet wird. So kann die Expression des exogen eingebrachten Repressorgens durch die Aktivität des in gesunden Zellen vorhandenen p53-Trans­ kriptionsfaktors reguliert werden. Demzufolge wird der Repressor nur in gesunden Zellen, nicht aber in Zellen mit mutiertem p53 expremiert, wozu unter Umständen zusätzlich eine Induktion der p53-Aktivität durch entsprechende Behandlungen der Zellen (UV-Bestrahlung oder Verwendung von DNA-schädigenden Substanzen) benötigt wird. In Zellen mit mutierten p53 wird demnach die Expression eines z. B. Wnt-regulierten Reportergens mit Transkriptionsrepressorbindungsstellen in der Promotorregion (z. B. GFP-Varianten, Luciferase, Thromboplastin, etc.) auf Grund der Abwesenheit der p53-regulierten Repressorgenexpression nicht repremiert, so dass die synergistische Wirkung von Wnt-Signalaktivität und p53-Defizienz gleichzeitig oder aufeinanderfolgend meßbar wird.

Für die Messung von Signalaktivitäten in Zellen sind unter anderem folgende Transkriptionsfaktoren bzw. Familien von Transkriptionsfaktoren und/oder respon­ siven Elemente interessant: TCF/LEF-1, jun, fos, myc, max, myb, E2F, DP1, CREB, p53, NFkB, NFAT, PPAR, ETS, ELK1, ATF, DPC, SMAD, CHOP, MEF, MADH4, GR, ER, STAT, SRF, ISRE, SRE, HSE, AP1, CRE. Die DNA-Bindungsstellen der Transkriptionsfaktoren sind vielfach beschrieben und öffentlich zugänglich. Von besonderem Interesse sind dabei Bindungsstellen für die Transkriptionsfaktoren TCF (5'-CCTTTGAA-3'; LOVE, J. J. et al. (1995). Structural basis for DNA bending by the architectural transcription factor LEF-1. Nature 376: 791-795), p53 (5'- PuPuPuC(A/T)(T/A)GpyPyPy-3'; el-Deiry, W. S., Kern, S. E., Pietenpol, J. A., Kinzler, K. W. & Vogelstein, B. (1992). Definition of a consensus binding site for p53. Nat Genet 1: 45-49), PPARδ (5'-CGCTCAC-3'; He, T. C., Chan, T. A., Vogelstein, B. & Kinzler, K. W. (1999). PPARdelta is an APC-regulated target of nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Cell 99: 335-45), myc (5'-CACGTG-3' oder 5'-TCTCTTA-3'; Blackwell, T. K., Kretzner, L., Blackwood, E. M., Eisenman, R. N. & Weintraub, H. (1990). Sequence-specific DNA binding by the c-Myc protein. Science 250: 1149-1151), E2F (5'-TTTTSSCGS-3' bzw. 5'-TTTCGCGC-3'; Mudryj, M., Hiebert, S. W. & Nevins, J. R. (1990). A role for the adenovirus inducible E2F transcription factor in a proliferation dependent signal transduction pathway. EMBO J 9: 2179-84), AP1 (5'-TGA(C/G)TCA; Fisch, T. M., Prywes, R. & Roeder, R. G. (1989). An AP1-binding site in the c-fos gene can mediate induction by epidermal growth factor and 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate. Mol Cell Biol 9: 1327-31), SMAD (5'-CAGACA-3'; Jonk, L. J., Itoh, S., Heldin, C. H., ten Dijke, P. & Kruijer, W. (1989). Identification and functional characterization of a Smad binding element (SBE) in the JunB promoter that acts as a transforming growth factor-beta, activin, and bone morphogenetic protein-inducible enhancer. J Biol Chem 273: 21145-52), SRE und ATF (Fisch, T. M., Prywes, R., Simon, M. C. & Roeder, R. G. (1989). Multiple sequence elements in the c-fos promoter mediate induction by cAMP. Genes Dev 3: 198-211).

Zur Detektion bzw. Isolierung von fluoreszinierenden Zellen ist es notwendig Reportergene zu verwenden, die für fluoreszinierende Proteine kodieren. Prinzipiell eignen sich hierfür sämtliche Gene, die für direkt oder indirekt fluoreszinierende Proteine kodieren. Insbesondere geeignet sind Varianten der Gene: GFP, BFP, YFP, CFP, DS-Red, Obilin, Aequorin. Darüber hinaus können auch Gene verwendet werden, die für Fluoreszenzfarbstoff-bindende Proteine kodieren, z. B. für Anti-Caline, die den Fluoreszenzfarbstoff FITC binden. Alternativ hierzu können jedoch auch kodierende Nukleinsäureabschnitte verwendet werden, deren translatierte Produkte an der Zell­ oberfläche exponiert vorliegen, und somit für sekundäre Nachweisverfahren zugänglich sind. Insbesondere sind solche Nukleinsäureabschnitte gemeint, die für Trans­ membranproteine oder extrazellulär präsentierte Moleküle kodieren oder zu deren Exposition führen. Beispielsweise können auf Grund der Signalaktivitäten Antigene, Rezeptoren oder Liganden auf der Zelloberfäche präsentiert werden, für die spezifische Nachweismoleküle (z. B. Antikörper, Anticaline, Liganden oder Rezeptoren) vorhanden sind. Für diagnostische Verfahren sind dabei solche kodierenden Nukleinsäure­ abschnitte bevorzugt, die nicht humanen Ursprungs sind. Beispielsweise können homo­ loge Genabschnitte von auch im Menschen vorkommenden Transmembranproteinen aus der Maus, Ratte, etc. verwendet werden, um Kreuzreaktivitäten bei immuno­ logischen Nachweismethodiken zu unterdrücken, die auf endogene Expressionen nicht- transfizierter Zellen zurückzuführen sind. Es können jedoch auch synthetische Sequenzen verwendet werden, für die entsprechende Nachweismoleküle hergestellt werden. Zum Beispiel können mittels molekularbiologischer Methoden nahezu beliebige, synthetische Peptidsequenzen mit Transmembranproteinen rekombiniert werden, um so in isolierter oder konkatemerer Form auf der Zelloberfläche präsentiert zu werden. Gleichzeitig können gegen diese Peptide hochspezifische Antikörper generiert werden. Durch Kopplung solcher Nachweismoleküle an unterschiedliche, magnetische oder nicht-magnetische Beads können die krankhaft veränderten Zellen auf Grund der spezifischen Expression des exogenen Nukleinsäurebereichs durch Anlegen magnetischer Felder oder Zentrifugationsschritte auf Grund ihrer Assoziation mit den Beads isoliert werden.

Zur Detektion der spezifischen Signalaktivitäten unter Ausnutzung biologischer Kaskaden ist es notwendig Reportergene zu verwenden, die aktivierenden oder inhibie­ renden Komponenten der biologischen Kaskaden gleichkommen. Prinzipiell können hierfür Sequenzbereiche der Gene Pro-/Thrombin, Faktor XIIa, Faktor XIa, Faktor Xa, Faktor IXa, Faktor VIIIa, Faktor VIIa, Faktor Va, Fibrin/Fibrinogen, Plasmin/Plasminogen, Pro-/Kallikrein, Urokinase, tPA, CVF, C3b, Protein C, C-1 S Inhibitor, Hirudin, alpha-1-antitrypsin, AT-III, TFPI, PAI-1, PAI-2, PAI-3. Darüber hinaus können auch enzymatische Proteine expremiert oder entsprechende Fusions­ proteine durch die biologischen Kaskaden aktiviert werden.

Zur zellspezifischen Expression von Reportergenen müssen die DNA-Konstrukte in die Zellen eingeschleust werden. Hierzu sind zahlreiche, kommerziell erhältliche Trans­ fektionstechnologien entwickelt worden. Neben der klassischen Kalzium-Phosphat- Präzipitation, dem direkten Transfer durch Mikroprojektile ("Schrotschuss") und Elektroporationsmethodiken ist es möglich Säugerzellen mit Liposomentechnologien (z. B. Lipofectin und Lipofectamin der Firma GibcoBRL) zu transfizieren. Besonders effizient lassen sich Säugerzellen jedoch mit viralen Systemen transfizieren. Insbeson­ dere sind Systeme etabliert, die auf retroviralen, adenoviralen oder Adeno-Asso­ ziierten-viralen (AAV) Vektoren basieren. Ein interessanter Ansatz in diesem Zusammenhang ist die Verwendung von Transfektionssystemen, die eine unterschied­ liche Transfektionseffizienz bei unterschiedlichen Zelltypen erzielen und somit der Spezifität der Reportergenexpression zuträglich sind. Beispielsweise infizieren Adeno­ viren die meisten humanen Zellen mit der Ausnahme hämatopoietischer Zellen mit einer extrem hohen Effizienz. Diese Tatsache lässt sich durch Wahl entsprechender Inkubationsbedingungen gerade bei der Isolierung von epithelialen Zellen aus dem Blut ausnutzen, so dass selbst bei Verwendung konstitutiver Reportergenexpressionen eine Anreicherung der Tumorzellen ermöglicht wird.

Erfindungsgemäß werden die Erkenntnisse des Anmelders für ein Verfahren zur Diagnose krankheits-assoziierter Zellen genutzt, das die Transfektion von Reporter­ genkonstrukten mit induzierbaren Promotorstrukturen umfasst, die eine auto­ matisierbare Detektion und Isolation von Tumorzellen in Gemischen mit gesunden Zellen ermöglichen. Darüber hinaus können die Erkenntnisse des Erfinders auch für Verfahren eingesetzt werden, die der Isolation spezifischer, gesunder Zellen (z. B. Stammzellen) aus heterogenen Zellgemischen dienen. Die automatisierbare und spezifische Detektion der Zellen kann durch folgendes Verfahren gewährleistet werden:
Die Reportergenkonstrukte beinhalten zum einen Promotorstrukturen mit Bindungs­ stellen für Transkriptionsfaktoren, die für veränderte Genexpressionen in krankhaften Zellen bzw. differierende Genexpression in gesunden Zellen mitverantwortlich sind, zum anderen leicht meßbare Reportergene, die in den anderen Körperzellen in dieser Form bzw. in dieser Menge normalerweise nicht vorhanden sind. Durch die Kom­ bination und Vielzahl der Transkriptionsfaktorbindungsstellen wird die Spezifität und Sensitivität der induzierbaren Reportergenaktivierung gewährleistet. Durch die Expression eines in humanen Zellen endogen nicht vorhandenen Fluoreszenzproteins wird die spezifische und mittels Durchflusszytometrie automatisierbare Methodik qualitativ und quantitativ meßbar. Die Durchflusszytometrie erlaubt darüber hinaus durch Festlegen von Schwellwerten für Fluoreszenzintensitäten die Isolierung von Zellen mit bestimmten Reportergenexpressionsleveln. Die gleichzeitige Messung von zwei verschiedenen Fluoreszenzproteinen, die durch jeweils unterschiedliche biochemische Aktivitäten induziert werden können, ermöglicht zudem eine genauere Charakterisierung einzelner Tumorzellen hinsichtlich ihres Entartungsgrades ("Staging"). Dies trifft insbesondere auf solche Tumorarten zu, bei denen die entsprechenden biochemischen Aktivitäten in unterschiedlichen Stadien der Tumorprogression auftreten (wie oben am Beispiel des Kolonkarzinoms erläutert). Die gleichzeitige Verwendung von zwei ähnlichen, aber nicht identischen Reportergenen kann auch der Bestimmung der Spezifität der Reportergenexpression dienen. So können Promotoren mit intakten oder mutierten Transkriptionsfaktorbindungsstellen z. B. die Expression von unterschiedlich fluoreszinierenden Reportergenen oder Enzymen mit unterschiedlicher Substratspezifität regulieren. Der Vergleich der Expressionslevel lässt demnach Rückschlüsse auf die Aktivität spezifischer Signalaktivitäten zu. Darüber hinaus kann es sinnvoll sein zusätzlich zu induzierbaren Promotoren auch konstitutiv aktive Promotoren, die unterschiedliche Reportergene regulieren, zu verwenden, um Transfektionseffizienzen oder Zytotoxizitäten kontrollieren zu können.

Der Ausdruck "Signalaktivität" umfasst biochemische Aktivitäten in Zellen, die letztendlich die Expression von Genen im Zellkern regulieren. Die biochemischen Aktivitäten die zu veränderten Genexpressionen führen, können dabei an unterschied­ lichsten Stellen in der Zelle stattfinden und sind meist Teil des komplexen Netz­ werkgeschehens sogenannter Signaltransduktionswege. In Tumorzellen können bei­ spielsweise Rezeptoren auf der Zelloberfläche durch überhöhte Präsenz von Liganden, durch Mutation in kodierenden Genbereichen oder durch Mutationen in gen- regulatorischen Bereichen überaktiv sein. Andererseits können auch Proteine im Zyto­ plasma auf Grund von Mutationen der entsprechenden Gene eine veränderte Aktivität aufweisen, so dass es zu veränderten posttranslationalen Modifikationen (z. B. Phos­ phorylierung, Dephosphorylierung, Acetylierung, Deacetylierung, Ubiquitinylierung) und daraus resultierenden regulatorischen Geschehnissen (z. B. Stabilisierung, Destabi­ lisierung, erhöhte oder verminderte enzymatische Aktivität, verminderte oder verstärkte Bindungsaffinitäten) von Komponenten des Signaltransduktionsgeschehens kommt. Letztendlich werden so Signalaktivitäten hervorgerufen die die Expression von Ziel­ genen erhöhen oder hemmen können.

Der Ausdruck "Reportergenkonstrukt" umfasst Nukleinsäurekonstrukte, die zumindest aus einer genregulatorischen oder gentechnisch funktionellen Sequenz und einem kodierenden Sequenzbereich bestehen. Insbesondere sind DNA-Konstrukte gemeint, die eine genregulatorische Sequenz enthalten, die die Expression des kodierenden Bereichs direkt (auf Grund der enthaltenen Transkriptionsfaktorbindungsstellen) oder indirekt (z. B. durch die Ermöglichung einer gezielten Integration, Insertion bzw. Rekombination des Reportergens in genomische DNA-Abschnitte) beeinflusst. Bei den genregulatorischen Sequenzen, die die Expression des Reportergens direkt beein­ flussen, handelt es sich meist um Promotor-, Enhancer- oder Silencer-Regionen, die auf Grund der Wechselwirkung mit Eiweißmolekülen die Transkription kodierender Nukleinsäurebereiche sowohl positiv als auch negativ beeinflussen können. Verfahren, bei denen genregulatorische Sequenzen die Expression von Reportergenen indirekt beeinflussen, umfassen die gezielte Integration des Reportergens in Stamm­ zellpopulationen, bei denen die Zielregionen für die Integrationen zuvor durch Rekom­ binationsschritte gezielt markiert werden (wie z. B. mit loxP Rekombinationssequenzen für die Cre-Rekombinase) und die endogenen Zielgene u. U. zusätzlich zu den Rekombinationssequenzen durch eine oder mehrere IRES-Sequenzen ergänzt werden bzw. die Reportergene IRES-Sequenzen enthalten, so dass bei Induktion der Expression des endogenen Genlokus zusätzlich Reportergensequenzen transkribiert werden. Werden für diese Zwecke embryonale oder partiell differenzierte Stammzellen von Säugetieren verwendet, so ist es möglich die Anwesenheit spezifischer Signal­ aktivitäten durch synthetische oder endogene genregulatorische Sequenzen zu visualisieren bzw. meßbar zu machen. Je nach Beschaffenheit des Reportergens können somit sehr frühe Stadien krankhafter Veränderungen, aber auch gesunder physiologischer Prozesse (wie z. B. Differenzierungsvorgänge, apoptotische oder proliferative Prozesse in Gewebebereichen), detektiert werden. Organoide Modellsysteme bis hin zu ganzen gentechnisch veränderten Organismen können so Testsubstanzen ausgesetzt werden, wobei pathologische Veränderungen auf Grund der Reportergenexpression frühzeitig erkannt werden bzw. pathologisch veränderte Zellen zu unterschiedlichen Zeitpunkten isoliert werden können bzw. der Effekt der Wirksubstanzen analysiert werden kann.

Der Ausdruck "zellspezifische Expression" umfasst die Transkription und/oder Trans­ lation von kodierenden Sequenzbereichen in bestimmten Zellen einer hetrogenen Zellpopulation. Beispielsweise können es krankhaft veränderte Zellen sein, die in einer Körperprobe mit gesunden Zellen vorhanden sind. Insbesondere ist die spezifische Expression von Genen in Tumorzellen gemeint, die auf besondere biochemische Aktivitäten in den Tumorzellen zurückzuführen sind, die in gesunden Zellen in dieser Ausprägung nicht vorkommen. Spezifität kann die Reportergenexpression dabei durch zellspezifische Transkription, Translation oder Degradation des Reportergenproduktes oder aber durch zellspezifische Transfektion des Nukleinsäurekonstruktes erreichen.

Der Ausdruck "Reportergen" umfasst kodierende Nukleinsäureabschnitte, die in Zellen eingebracht werden müssen, da sie in dieser Form in den zu analysierenden Zielzellen natürlicherweise endogen nicht vorkommen. Dabei sind auch Teilabschnitte oder ganze Bereiche von ursprünglich endogen vorkommenden Sequenzen eingeschlossen, die auf Grund einer veränderten Sequenz oder eines neuen Kontextes innerhalb des synthetischen Nukleinsäurekonstruktes funktionell veränderte Eigenschaften gegenüber den endogenen Genprodukten besitzen oder verändert expremiert werden.

Der Ausdruck "Körperprobe" umfasst jegliche Körperproben, in denen vitale Zellen zur Transfektion von Nukleinsäurekonstrukten enthalten sind. Beispiele solcher Körperproben sind Blut, Lymphflüssigkeit, Stuhl, Organpunktate und Biopsien. Insbesondere sind Blutproben gemeint, in denen krankhaft veränderte Zellen vermutet werden. Darüber hinaus sind auch Biopsien mit eingeschlossen, da sie sich nach Vereinzelung der Zellen aus dem Gewebeverband mittels üblicher Standartmethodiken (Zerschneiden, Resuspendieren mit immer enger werdenden Kanülen, Proteasebehandlung, etc.) zur Transfektion von Nukleinsäurekonstrukten eignen.

Der Ausdruck "krankhafte Veränderung" umfasst biochemische Aktivitäten in Zellen, die in vergleichbaren Zellen desselben Gewebes zu diesem Zeitpunkt nicht vorhanden sind bzw. in anderen Bereichen des Gewebes oder in anderen Differenzierungsphasen oder Entwicklungsstadien aktiv sind.

Der Ausdruck "Transkriptionsfaktor" umfasst Eiweißmoleküle, die direkt oder indirekt mit Nukleinsäurebereichen assoziieren und dadurch veränderte Aktivitäten der Nukleinsäurebereiche hervorrufen.

Der Ausdruck "Expressionslevel" umfasst transkriptionelle oder translationale Veränderungen, die Nukleinsäurebereiche betreffen, die für eine Abfolge von Aminosäuren kodieren oder einer kodierenden Nukleinsäuresequenz komplementär sind. Darüber hinaus sind jedoch auch Veränderungen gemeint, die posttranslationale Modifikationen von Aminosäuresequenzen betreffen und eine veränderte Stabilität, Lokalisierung oder Aktivität zur Folge haben.

Der Ausdruck "automatisierbares Verfahren" umfasst Methodiken, die die manuelle Arbeitskraft von menschlichem Personal ganz oder auch nur in Teilschritten ersetzt und insbesondere bei Schritten der Transfektion, Detektion, Isolation, Dokumentation oder Informationsverarbeitung Verwendung finden. Die Detektion ist dabei von den Eigen­ schaften des verwendeten Reportergens abhängig.

Die Ausnutzung von Signalaktivitäten in Säugerzellen zur Expression von Reporter­ genen, die die Detektion und Isolation bestimmter Zellen erlaubt, ist sowohl für diagnostische als auch therapeutische Fragestellungen von Vorteil. Mögliche An­ wendungsgebiete dieser Technologie sind Detektion und Isolation krankhafter Zellen aus Körperproben, Therapie-begleitendes Monitoring, Drug-Screening und ex vivo Therapietest von Patientenproben. Weitere Anwendungsgebiete sind Verfahren in der Stammzelltechnologie, wobei die Stammzellen isoliert, ggf. differenziert bzw. trans­ differenziert und zur Heranzüchtung von Ersatzorganen oder aber für regenerative Prozesse verwendet werden.

1. Überexpression von alphaGFPT204I in SW480 Kolonkarzinomzellen auf Grund der tumor-assoziierten Wnt-Signalaktivität in diesen Zellen

Zur tumorspezifischen Expression einer Variante des Grün-Fluoreszinierenden- Proteins (alphaGFPT204I), werden in einem ersten Schritt Wnt-responsive Reporter­ genkonstrukte hergestellt. Die Promotorregionen enthalten drei funktionelle oder drei nicht-funktionelle Bindungsstellen für LEF-1/TCF-Transkriptionsfaktoren (CCTTTGATC bzw. CCTTTGGCC), oder Varianten dieser Bindungsstellen (CCTTTGAA oder CCATTGAA bzw. CCTTTGGA oder CCATTGGA). Zur Generierung von Wntresponsiven GFP-Reportergenkonstrukten werden in den ersten Experimenten die beschriebenen Ausgangsvektoren pTOPFLASH-, pFOPFLASH-, pTOPCAT- und pFOPCAT-Vektoren verwendet (Van De Wetering, M., Cavallo, R., Dooijes, D., Van Beest, M., Van Es, J., Loureiro, J., Ypma, A., Hursch, D., Jones, T., Brjsovec, A., Peifer, M., Mortin, M. & Clevers, H. (1997). Armadillo coactivates transcription driven by the product of the drosophila segmant polarity gene dTCF. Cell 88: 789-99; Van De Wetering, M., Oosterwegel, M., Dooijes, D. & Clevers, H. (1991). Identification and cloning of TCF-1, a T lymphocyte specific transcription factor containing a sequence-specific HMG box. EMBO J 10: 123-32). In weiteren Experimenten wird die Promotorregion durch Ligation von speziell synthetisierten, doppelsträngigen Oligonukleotiden mit den Bindungsstellen für LEF-1, PPARδ, myc, etc. ergänzt (siehe unten).

Alle im Folgenden erwähnten, jedoch nicht näher ausgeführten, molekular- biologischen Standardmethoden wie z. B. Plasmid-DNA Präparationen in analy­ tischem Maßstab, Spaltung von DNA mit Restriktionsendonucleasen, Dephosphory­ lierung linearisierter DNA, Auffüllen überstehender Enden, Ligation von DNA- Molekülen, Transformation von Bakterien, Auftrennung von Nukleinsäuren über Agarosegele, etc., sind prinzipiell in dem Laborbuch von SAMBROCK et al. beschrieben (Sambrock, J., Fritsch, E. F. & Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York).

Im Falle der pTOP-FLASH- und pFOP-FLASH-Vektoren wird das Luciferase-Gen durch Verdau mit den Restriktionsenzymen NCO1 und NOT1 herausgeschnitten und die Vektoren anschließend durch Inkubation mit alkalischer Phosphatase dephos­ phoryliert. Daraufhin werden die Reaktionsprodukte in Ethidiumbromid-haltigen Agarosegelen gelelektrophoretisch aufgetrennt, die ca. 3,8 kb große Vektorbande aus dem Gel ausgeschnitten und die DNA mittels des "Qiaex®II Gel Extraction Kit" der Firma Qiagen isoliert. Das alphaGFPT204I-Gen wird mittels PCR-Reaktion unter Einführung der entsprechenden Restriktionsschnittstellen für NCO1 (für den 5'- gelegenen Primer (5'-CCC GGG CC ATG GCT AGC AAA GGA GAA GAA CTT TTC AC-3') und NOT1 für den 3'-gelegenen Primer (5'-GGC CGC GGC CGC TTA TTT GTA GAG CTC ATC CAT GCC-3')) aus dem pKU23-Vektor bzw. dem alpha+GFPcycle3-Vektor der Firma Maxygen (siehe (Crameri, A., Whitehorn, E. A., Tate, E. & Stemmer, W. P. C. (1996). Improved Green Fluorescent Protein by molecular evolution using DNA shuffling. Nature Biotechnology 14: 315-319), der das alphaGFPT204I Gen enthält, amplifiziert, mit den Restriktionsendonukleasen NCO1 und Not1 verdaut, durch Phenol/Chloroform-Behandlung aufgereinigt, präzipitiert (Zugabe von 1/10 Vol 3M NaAc und 2,5 Vol 100% Ethanol), mit 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und in 1 × Tris/EDTA-Puffer aufgenommen. Anschließend wird das ca. 700 bp große Reaktionsprodukt gelelektrophoretisch aufgetrennt und aus dem Agarosegel isoliert (siehe oben). Die Ligation des TOP- bzw. FOP-Vektors mit der amplifizierten alphaGFPT204I-cDNA erfolgte mittels T4- DNA-Ligase in entsprechendem Mg²⁺- und ATP-haltigem Puffer. Die Ligationsansätze werden in Bakterien ("DH5α™ Competent Cells" der Firma GibcoBRL Life Technologies) transformiert, auf Ampicillin-haltigen LB-Agarplatten ausgestrichen, gewachsene, Ampicillin-resistente Einzelkolonien wurden zur An­ impfung von 5 ml LB-Flüssigkulturen verwendet, die Plasmid-DNA aus ge­ wachsenen Einzelkolonien isoliert ("Concert™ Rapid Plasmid Mini Prep System" der Firma GibcoBRL Life Technologies) durch Restriktionsverdau mit NOT1 und NCO1 und Sequenzierung ("Big Dye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction" der Firma PE Applied Biosystems) mit mehreren "Sense-" und "Anti- Sense" Primern analysiert und verifiziert. Die Plasmid-DNA der gewünschten Sequenz wird anschließend in größeren Mengen produziert und aufgereinigt ("QIAfilter Plasmid Maxi Kit" der Firma Qiagen) und zur Transfektion von SW480 Kolonkarzinomzellen verwendet.

Die Transfektion der Reportergenkonstrukte erfolgt wahlweise mit "Lipofectin® Reagent", "Lipofectamine Plus™ Reagent" oder "Lipofectamine™ 2000 Reagent" nach Herstellerangaben der Firma GibcoBRL Life Technologies, wobei die SW480 Zellen vor der Transfektion in 6-well Platten (ca. 300 000 Zellen pro well) ausgesäht und über Nacht in DMEM, 10% fötales Kälber Serum, 100 µg Penicillin bei 37°C, 90% Luftfeuchtigkeit und 7,5% CO₂-Gehalt inkubiert werden. Es werden zwischen 1 µg und 10 µg DNA der Vektoren TOP- und FOP-alphaGFPT204I, sowie zur Kontrolle des Alpha+GFPcycle3-Vektors mit 10 µl Lipofectin oder Lipofectamin und 90 µl Optimem in Polystyrenröhrchen durchmischt und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird 800 µl Optimem hinzugegeben und nach einstündiger Inkubation zu den mehrfach mit PBS gewaschenen Zellen gegeben und über Nacht inkubiert. Am nächsten Morgen werden die transfizierten SW480 Zellen erneut mit PBS gewaschen und wieder in DMEM + 10% FKS inkubiert. Dien mit Alpha+GFPcycle3 und TOP-alphaGFPT204I transfizierten Zellen beginnen nach entsprechender Anregung unter dem Fluoreszenzmikroskop (Olympus AX70 mit Multicontrol-Box 200-3 und analySIS Treibersoftware "Modul Stage") zu leuchten, während die mit FOP-alphaGFPT204I transfizierten Zellen keine signifikant erhöhte Fluoreszenz aufwiesen. Diese Befunde bestätigten sich bei der Vermessung der Fluoreszenzintensitäten im Durchflusszytometer (FACSscan, Becton Dickinson), welches mit Laser-Anregung für die grüne Fluoreszenz ausgestattet ist. Die Fluoreszenzintensitäten werden graphisch dargetellt, indem den positiven Signalen definierte Schwellwerte für Fluoreszenzintensitäten zugeordnet werden. Zur Optimierung der GFP-Fluoreszenz-Detektion wird der Standart-Fluorescein-Filter gegebenenfalls durch Breitband-Violett-Filter ersetzt (z. B. U-MBV der Firma Olympus), die eine Anregung zwischen 340-440 nm und die Detektion ab 475 bzw. 490 nm ermöglichen.

2. Überexpression von alphaGFPT204I in SW480 Zellen auf Grund der kombinatorischen Verwendung von Transkriptionsfaktorbindungsstellen für LEF-1/TCF und PPARδ

SW480 Zellen überexpremieren auf Grund der Wnt-Signalaktivität den Transkriptionsfaktor PPARδ (HE T. C., CHAN T. A., VOGELSTEIN B. & KINZLER K. W. (1999). PPARdelta is an APC-regulated target of nonsteroidal anti­ inflammatory drugs. Cell 99: 335-45). Zur Messung der synergistischen Wirkung von Transkriptionsfaktorbindungsstellen bei der Expression von Reportergenen werden PPARdelta responsive Elemente in den TOP-alphaGFPT204I- und FOP- alphaGFPT204I-Vektor kloniert. Hierzu wurden die Oligonukleotide 5'- CTAGCGTGAGCGCTCACAGGTCAATTCGGTGAGCGCTCACAGG
TCAATTCG-3' (= funktionelle PPARδ-DNA-Bindungsstellen) bzw. 5'- CTAGCGGA
CCAGGACAAAGGTCACGTTCGGACCAGGACAAAGGTCACGTTCG-3'
(= funktionelle PPARα- und PPARγ-DNA-Bindungsstellen) nach Durchmischung mit entsprechend synthetisierten, komplementären Gegenstrang-Oligonukleotiden gleicher Mengen durch Erhitzen und Abkühlen dimerisiert und stromaufwärts, 5'- gelegen von den funktionellen bzw. nicht-funktionellen LEF-1/TCF-Bindungsstellen durch "Blunt-end"-Ligation in die Promotor-Region des Reportergenkonstruktes inseriert. Die Ligationsansätze werden in Bakterien transformiert, auf Ampicillin- haltigen LB-Agarplatten ausgestrichen, die Plasmid-DNA von gewachsenen Einzelkolonien isoliert, durch Restriktionsverdaus mit NOT1 und NCO1 und Sequenzierung mit mehreren "Sense-" und "Anti-Sense"-Primern analysiert und verifiziert. Die Plasmid-DNA der gewünschten Sequenz wird anschließend in größeren Mengen produziert und aufgereinigt und zur Transfektion von SW480 Kolonkarzinomzellen mit Lipofectin oder Lipofectamin in der oben beschriebenen Art und Weise verwendet. Die Vermessung der Fluoreszenzintensitäten im Durchflusszytometer ergibt einen meßbaren synergistischen Effekt hinsichtlich einer gesteigerten alphaGFPT204I-Expression bzw. Fluoreszenzintensität in Anwesenheit funktioneller LEF-1/TCF- und PPARδ-DNA-Bindungsstellen. Darüber hinaus zeigt sich, dass eine 10-stündige Inkubation transfizierter Zellen mit Nicht-Steroidalen Anti-Inflammatorischen Substanzen (i. e. 300 µM Sulindac Sulfid, Indomethacin und Aspirin) die beobachtete Aktivierung des FOP-alphaGFPT204I-Reportergens in Anwesenheit funktioneller PPARδ-DNA-Bindungsstellen signifikant inhibiert, so dass die alphaGFPT204I-Expression nahezu auf den Hintergrundslevel der FOP- alphaGFPT204I-Reportergenaktivität ohne funktionelle PPARδ-DNA-Bindungs­ stellen zurückgeht.

3. Isolierung von Kolonkarzinomzellen aus heterogenen Zellgemischen mittels Durchflusszytometrie

Zur Isolierung von fluoreszinierenden SW480 Zellen, die in der oben beschriebenen Art und Weise mit TOP-alphaGFPT204I oder Alpha+GFPcycle3 transfiziert werden, werden die SW480 Zellen durch Zugabe von Trypsinlösung (0,5 mM EDTA und 2‰ Trypsin in PBS) von der Unterlage abgelöst und in DMEM + 10% FKS resuspendiert. Die Zellen werden anschliessend wahlweise in ISOTON II (Coulter) aufgenommen oder direkt in einem Durchflusszytometer (FACSscan, Becton Dickinson) vermessen. Fluoreszinierende Zellen ab einer definierten Signalintensität werden isoliert und in definiertem Zahlenverhältnis mit Zeilsuspensionen von transfizierten oder nicht-transfizierten Zellen anderer Ursprungsgewebe (i. e. nicht Kolon; z. B. IIA1.6 B Zellen, C57MG Brusttumorzellen, Jurkat Zellen, BW5147 T Zellen) gemischt, die keine Wnt-Signalaktivität besitzen und demzufolge in Experimenten (wie in Beispiel 1 dargelegt) keine signifikant erhöhten Fluoreszenzen nach Transfektion mit TOP-alphaGFPT204I im Vergleich zur Fluoreszenz nach Transfektion mit FOP-alphaGFPT204I aufweisen. Diese heterogenen Zellgemische werden anschließend erneut in dem Durchflusszytometer vermessen und die Zahl der detektierten, fluoreszinierenden Zellen mit der Zahl der ursprünglich zugesetzten Anzahl fluoreszinierender SW480 Zellen verglichen (= "Recovery Rate").

4. Isolierung von Kolonkarzinomzellen aus heterogenen Zellgemischen mittels Durchflusszytometrie nach Transfektion von heterogenen Zellpopulationen

HeLa Zervixkarzinomzellen, 3T3 Fibroblasten oder SV40-transformierte COS Zellen werden in unterschiedlichen Mengenverhältnissen mit SW480 Kolonkarzinomzellen gemischt oder zur Kontrolle als homogene Zellpopulation belassen. Danach werden je 300 000 Zellen des heterogenen Zellgemisches bzw. der homogenen Zell­ populationen in die Vertiefungen von 6-well Platten ausgesäht und über Nacht in DMEM, 10% Fötales Kälber Serum, 100 µg Pennicillin bei 37°C, 90% Luft­ feuchtigkeit und 7,5% CO₂-Gehalt inkubiert. Die anschließende Transfektion der Plasmide TOP-, FOP-alphaGFPT204I und Alpha+GFPcycle3 erfolgt, wie in Beispiel 1 beschrieben, mittels der Lipofectin und Lipofectamin Reagentien. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Transfektion (4 Stunden, 16 Stunden, 24 Stunden und 48 Stunden) werden die Zellen durch Trypsin-Behandlung abgelöst und mittels Durchflusszytometrie vermessen. Die Zahl der detektierten, fluoreszinierenden Zellen je Ansatz wird mit der Zahl der ursprünglich zugesetzten Anzahl SW480 Zellen verglichen, um die Spezifität und Sensitivität des Tumorzellnachweises zu bestimmen.

5. Adenovirale Transfektion von heterogenen Zellpopulationen aus Kolonkarzinom­ zellen mit Wnt-Signalaktivität und Kontrollzellen ohne Wnt-Signalaktivität und anschließende Durchflusszytometrie

Zur Erhöhung der Transfektionseffizienzen werden adenovirale Reportergenkonstrukte mittels des "Adeno-X™ Expression Systems" der Firma Clontech (Kat. Nr. K1650- 1) hergestellt. Hierzu werden die Promotorregion einschließlich der alphaGFPT204I- Sequenz mittels PCR-Reaktion aus den Vektoren TOP- und FOP-alphaGFPT204I amplifiziert. Dabei werden Primer verwendet, die in die Restriktionsschnittstellen für die Enzyme I-CEU I und NOT1 an das 5'- bzw. 3'-Ende des Reaktionsproduktes einführen (5'-gelegener "Sense"-Primer: 5'-CCC GGG TAA CTA TAA CGG TCC TAA GGT AGC GAG CAA TTG TTG TTA ACT TGT TTA TTG CAG CTT ATA ATG G-3'; 3'-gelegener "Anti-Sense"-Primer: 5'-GGC CGC GGC CGC TTA TTT GTA GAG CTC ATC CAT GCC-3'). Die Reaktionsprodukte werden anschließend mit den Restriktionsendonukleasen I-CEU I und NOT1 verdaut, durch Phenol/Chloro­ form-Behandlung aufgereinigt, präzipitiert (Zugabe von 1/10 Vol 3M NaAc und 2,5 Vol 100% Ethanol), mit 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und in 1 × Tris/EDTA- Puffer aufgenommen. Nach gelelektrophoretischer Aufreinigung wird das Reaktions­ produkt aus dem Agarosegel isoliert. Der von der Firma Clontech bereitgestellte pShuttle-Vektor wird entsprechend mit den Enzymen I-CEU I und NOT1 verdaut, dephosphoryliert, gelelektrophoretisch aufgetrennt und der Vektor (wie in Beispiel 1 beschrieben) aus dem Gel extrahiert. Die Ligation des pShuttle-Vektors mit der ampli­ fizierten TOP- bzw. FOP-alphaGFPT204I-Sequenz erfolgt mittels T4-DNA-Ligase in entsprechendem Mg²⁺- und ATP-haltigem Puffer. Die Ligationsansätze werden anschließend in Bakterien transformiert, auf Ampicillin-haltigen LB-Agarplatten ausgestrichen, die Plasmid-DNA aus gewachsenen Einzelkolonien isoliert durch Restriktionsverdaus und Sequenzierung mit mehreren "Sense-" und "Anti-Sense"- Primern analysiert und verifiziert. Die Plasmid-DNA der gewünschten Sequenz wird in größeren Mengen produziert und aufgereinigt.

Die anschließenden Schritte erfolgen gemäß Herstellerangaben der Firma Clontech (siehe "Adeno-X™ Expression System User Manual"). Die TOP- bzw. FOP- alphaGFPT204I-Sequenz wird aus dem pShuttle-Vektor mittels der Restriktions­ enzyme I-CEUI und PI-SCEI herausgeschnitten und mit der entsprechend verdauten Adeno-X Virus DNA (nach den üblichen molekularbiologischen Zwischenschritten wie oben beschrieben) ligiert. Die in vitro Ligation wird anschließend mit dem Restriktionsenzym SWAI verdaut und der entsprechende Ansatz zur Transformation von Bakterien verwendet. DNA-Präparationen von Ampicillin-resistenten Trans­ formanden werden mittels geeigneter Restriktionsverdaus und Sequenzierungen mit mehreren "Sense-" und "Anti-Sense" Primern analysiert und verifiziert. Die rekom­ binante adenovirale Plasmid DNA der gewünschten Sequenz wird anschließend entsprechend den Angaben im Clontech Handbuch in kleinem Maßstab präpariert und mit dem NucleoBond® Plasmid Maxi Kit gemäß den Angaben der Firma Clontech in größerem Maßstab produziert und aufgereinigt. Die aufgereinigte Plasmid-DNA wird mit dem Restriktionsenzym PACI verdaut und nach Aufreinigung des Restriktions­ ansatzes zur Transfektion von HEK 293 Zellen mittels Lipofectamin oder Lipofectin verwendet. Nach 4 bis 7 Tagen löst sich ein Großteil der Zellen ab, so dass der Über­ stand, der rekombinante Adenoviren mit der TOP- bzw. FOP-alphaGFPT204I- Sequenz enthält, nach Zentrifugation zur Infektion der Zielzellen verwendet werden kann.

Entsprechend den Beispielen 2 und 3 werden zunächst homogene Zellpopulationen von SW480 Zellen mit den rekombinanten Adenoviren inkubiert. Hierzu werden ca. 5×10⁵ SW480 Zellen in 100 mm Zellkulturschalen ausgesäht, so dass sie über Nacht (oder auch für bis zu 48 Stunden) an den Zellkulturschalenboden adhärieren können. An­ schließend wird 1 ml des Virus-haltigen Mediums für ca. 1 Stunde zu den Zellen gegeben. Danach werden die Zellen einmal mit DMEM + 10% FKS gewaschen und für bis zu 48 Stunden im Brutschrank inkubiert. Nach 2, 4, 8, 16, 24 und 48 Stunden wird die GFP-Expression mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie ver­ messen. Die Zahl der GFP-expremierenden Zellen nach Infektion mit der TOP- alphaGFPT204I-Sequenz ist extrem hoch (70-95% nach 24 Stunden), während Zellen, die mit der FOP-alphaGFPT204I-Sequenz infiziert werden keine signifikante GFP- Expression aufweisen. Die Infektion von heterogenen Zellgemischen (siehe oben) führt zur spezifischen Überexpression des GFP-Gens, nach Infektion mit der TOP- alphaGFPT204I-Sequenz, in den Kolonkarzinomzellen, die eine aktive Wnt-Signal­ aktivität besitzen. In einem nächsten Schritt werden SW480 Zellen in unterschiedlichen Mengen zu jeweils 1 ml von humaner Vollblutproben von gesunden Menschen gegeben und die Zellsuspension für 1 Stunde mit 1 ml Virus-haltigem Medium versetzt. Die Proben werden durch mehrere vorsichtige Zentrifugationsschritte und Medienwechsel gewaschen und für weitere 12 bis 18 Stunden bei 37°C unter leichter Bewegung im Brutschrank inkubiert. Anschließend wird die GFP-Expression mittels Durchfluss­ zytometrie vermessen und die Zahl der positiven Fluoreszenzsignale mit der Zahl der jeweils zugegebenen SW480 Zellen korelliert. Darüber hinaus werden die fluoreszierenden Zellen mittels entsprechender Schwellwertsetzungen isoliert und durch rein morphologische Betrachtung, bzw. mittels eines immuncytochemischen Standartverfahrens der Firma Miltenyi Biotec (Kat. Nr. 603-01) unter Verwendung hochspezifischer Cytokeratin-FITC Antikörper und Anti-Fitc Alkalischer Phosphatase gemäß den Herstellerangaben als epitheliale (i. e. Kolonkarzinonizellen) identifiziert.

6. Überexpression von sTF-LZ in SW480 Kolonkarzinomzellen auf Grund der tumor-assoziierten Wnt-Signalaktivität in diesen Zellen

Zur tumorspezifischen Expression eines Fusionsproduktes aus löslichem Thrombo­ plastin (= soluble Tissue Factor; Aminosäure 1 bis 220) und der Leuzin-Reiß­ verschluss Domäne (= Leucin-Zipper) des Hefe Transkriptionsfaktors GCN4, werden in einem ersten Schritt Wnt-responsive Reportergenkonstrukte hergestellt. Die Promotorregionen enthalten drei funktionelle oder drei nicht-funktionelle Bindungsstellen für LEF-1/TCF-Transkriptionsfaktoren (CCTTTGATC bzw. CCTTTGGCC), oder Varianten dieser Bindungsstellen (CCTTTGAA oder CCATTGAA bzw. CCTTTGGA oder CCATTGGA). Zur Generierung von Wnt- responsiven sTF-LZ-Reportergenkonstrukten werden in den ersten Experimenten die beschriebenen Ausgangsvektoren pTOPFLASH-, pFOPFLASH-, pTOPCAT- und pFOPCAT-Vektoren verwendet (Van De Wetering, M., Cavallo, R., Dooijes, D., Van Beest, M., Van Es, J., Loureiro, J., Ypma, A., Hursch, D., Jones, T., Brjsovec, A., Peifer, M., Mortin, M. & Clevers, H. (1997). Armadillo coactivates transcription driven by the product of the drosophila segmant polarity gene dTCF. Cell 88: 789-99; Van De Wetering, M., Oosterwegel, M., Dooijes, D. & Clevers, H. (1991). Identification and cloning of TCF-1, a T lymphocyte specific transcription factor containing a sequence-specific HMG box. EMBO J 10: 123-32). Im Falle der pTOP- FLASH- und pFOP-FLASH-Vektoren wird das Luciferase-Gen durch Verdau mit den Restriktionsenzymen NCO1 und NOT1 herausgeschnitten und die Vektoren an­ schließend durch Inkubation mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliert. Daraufhin werden die Reaktionsprodukte in Ethidiumbromid-haltigen Agarosegelen gelelektrophoretisch aufgetrennt, die ca. 3,8 kb große Vektorbande aus dem Gel ausgeschnitten und die DNA mittels des "Qiaex®II Gel Extraction Kit" der Firma Qiagen isoliert.

Alle im Folgenden erwähnten, jedoch nicht näher ausgeführten, molekularbiolo­ gischen Standardmethoden wie z. B. Plasmid-DNA Präparationen in analytischem Maßstab, Spaltung von DNA mit Restriktionsendonucleasen, Dephosphorylierung linearisierter DNA, Auffüllen überstehender Enden, Ligation von DNA-Molekülen, Transformation von Bakterien, Auftrennung von Nukleinsäuren über Agarosegele, etc., sind prinzipiell in dem Laborbuch von SAMBROCK et al. beschrieben (Sambrock, J., Fritsch, E. F. & Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York).

Die cDNA der Leuzin-Reißverschluss Domäne wird mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) aus genomischer Hefe DNA unter Verwendung der Primerpaare 5'-ATC GGC GGC GCC GCC ATG AAA CAA CTT GAA GAC AAG-3' (kodierender Sense- Primer) und 5'-GAT CAA AGC TTG CGG CCG CTC AGC GTT CGC CAA CTA A- 3' (Anti-Sense-Primer) amplifiziert. Der kodierende Sense-Primer enthält dabei eine Nar1-Restriktionsenzymschnittstelle und kodiert darüber hinaus für eine kurze Linker- Sequenz Gly-Gly-Ala-Ala, die stromaufwärts von der Leuzin-Reißverschluss-Sequenz Met-Lys-Asn-Leu . . . liegt. Der Anti-Sense Primer enthält Schnittstellen für die Restriktionsenzyme Hind3 und Not1, für spätere Klonierungsschritte. Die cDNA für lösliches Thromboplastin (Aminosäure 1-220 mit und ohne Signalsequenz) wird mittels PCR unter Verwendung der kodierenden Sequenzprimer 5'-GAA GAA GGG ATC CTG GTG CCT CGT GGT TCT GCC ATG GGC ACT ACA AAT ACT GTG GCA GC-3', 5'-GAA GAA GGG ATC CTG GTG CCT CGT GGT TCT GCC ATG GAG ACC CCT GCC TGG CCC CGG G-3' und der Anti-Sense Primer 5'-GGC GGC GCC GCC TAT TTC TCG AAT TCC CC-3' (Codon 226 → F), 5'-GGC GGC GCC GCC TAT TTC TCG CCC ATA CAC TCT ACC GGG CTG TCT G-3' (Codon 220 → G), 5'-GGC GGC GCC GCC TAT TTC TCC TCT ACC GGG CTG TCT GTA CTC TTC CGG-3' (Codon 217 → E) amplifiziert. Die Sense-Primer enthalten dabei Schnittstellen für die Restriktionsenzyme BamH1 und Not1 für spätere Klonierungsschritte. Die Anti-Sense Primer enthalten eine Nar1-Schnittstelle für die Fusion mit der Leuzin-Reißverschluss Domäne von GCN4 (siehe oben). Die PCR- Fragmente wurden nach Verdau mit den entsprechenden Restriktionsenzymen, Aufreinigung durch Phenol/Chloroform-Behandlung, Präzipitation (Zugabe von 1/10 Vol 3M NaAc und 2,5 Vol 100% Ethanol) und Waschen mit 70% Ethanol, getrocknet und in 1 × Tris/EDTA-Puffer aufgenommen.

Anschließend werden die Reaktionsprodukte gelelektrophoretisch aufgetrennt und aus den Agarosegelen isoliert (siehe oben). Die Ligation mit dem BamH1- und Hind3-geschnittenen, dephosphorylierten, gelelektrophoretisch aufgetrennten und anschließend isolierten pTrcHisC-Vektor (siehe Stone, M. J., Ruf, M., Miles, D. J., Edgington, T. S. & Wright, P. E. (1995). Biochem J. 310: 605-614) mit den PCR- Produkten erfolgt mittels T4-DNA-Ligase in entsprechendem Mg²⁺- und ATP- haltigem Puffer. Die Ligationsansätze werden in Bakterien ("DH5α™ Competent Cells" der Firma GibcoBRL Life Technologies) transformiert, auf Ampicillin- haltigen LB-Agarplatten ausgestrichen, gewachsene, Ampicillin-resistente Einzelkolonien werden zur Animpfung von 5 ml LB-Flüssigkulturen verwendet, die Plasmid-DNA aus gewachsenen Einzelkolonien isoliert ("Concert™ Rapid Plasmid Mini Prep System" der Firma GibcoBRL Life Technologies) durch Restriktions­ verdaus und Sequenzierung ("Big Dye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction" der Firma PE Applied Biosystems) mit mehreren "Sense-" und "Anti- Sense" Primern analysiert und verifiziert. Die Plasmid-DNA der gewünschten Sequenz wird anschließend in größeren Mengen produziert, aufgereinigt ("QIAfilter Plasmid Maxi Kit" der Firma Qiagen) und zur Expression des Fusionsproteins in Escherichia coli verwendet.

Bakteriell expremiertes Protein wird mittels Guanidium Hydrochlorid (GuHCl) aus den Bakterien extrahiert und nach Aufreinigung durch Ni-Chelat Säulen (Ni-NTA von Qiagen) mittels eines linearen Gradientens von Puffer A (6 M GuHCl; 0,5 M NaCl; 20 mM Natriumphosphat; pH 8) und Puffer B (0,8 M GuHCl; 0,3 M NaCl; 50 mM Tris- HCl; 2,5 mM reduzierendes Glutathion; 0,5 M oxidierendes Glutathion; pH 8) auf der Säule gefaltet. Nach intensivem 04929 00070 552 001000280000000200012000285910481800040 0002010133930 00004 04810Waschen mit 10 mM Tris/20 mM NaCl/pH 7.5 wird das Protein in dem gleichen Puffer, der zusätzlich 50 mM Imidazol enthält, eluiert und dient dem Nachweis der Funktionalität des Fusionsproteins bzw. als Positiv-Kontrolle in Blutgerinnungsassays.

Durch Verdau mit den Restriktionsendonukleasen Nco1 und Not1 wird das Fusionsgen aus dem pTrcHisC-sTF-LZ-Expressionsvektors herausgeschnitten und in die entsprechend verdauten TOP-/FOP-Vektoren (siehe oben) ligiert. Nach Trans­ formation in Bakterien werden auf Agarplatten gewachsene Einzelkolonien in der oben beschriebenen Art und Weise vermehrt und analysiert. Bakterienklone, die die gewünschten Nukleinsäurekonstrukte enthalten, werden in größeren Mengen produ­ ziert, die jeweilige Plasmid-DNA aufgereinigt und zur Transfektion von SW480 Zellen verwendet.

Die Transfektion der Reportergenkonstrukte erfolgt wahlweise mit "Lipofectin® Reagent", "Lipofectamine Plus™ Reagent" oder "Lipofectamine™ 2000 Reagent" nach Herstellerangaben der Firma GibcoBRL Life Technologies, wobei die SW480 Zellen vor der Transfektion in 6-well Platten (ca. 300 000 Zellen pro well) ausgesät und über Nacht in DMEM, 10% Fötales Kälber Serum, 100 µg Penicillin bei 37°C, 90% Luftfeuchtigkeit und 7,5% CO₂-Gehalt inkubiert werden. Es werden zwischen 1 µg und 10 µg DNA der Vektoren TOP- und FOP-sTF-LZ mit 10 µl Lipofectin oder Lipofectamin und 90 µl Optimem in Polystyrenröhrchen durchmischt und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird 800 µl Optimem hinzugegeben und nach einstündiger Inkubation zu den mehrfach mit PBS gewaschenen Zellen gegeben und über Nacht inkubiert. Am nächsten Morgen werden die transfizierten SW480 Zellen erneut mit PBS gewaschen und wieder in DMEM + 10% FKS inkubiert. Die Zell­ kulturüberstände von Parallelansätzen der mit FOP-/-TOP-sTF-LZ transfizierten SW480 Zellen werden zu unterschiedlichen Zeitpunkten (12 Stunden, 24 Stunden und 36 Stunden nach Transfektion) abgenommen, durch Zentrifugation bei 10 000*g von Zellresten befreit. Anschließend werden die Überstände in ersten Experimenten durch Zugabe von TrisHCl (pH 7,4) und EDTA auf eine Konzentration von 50 mM bzw. 10 mM eingestellt, durch Filterzentrifugation ("S1Y10 spiral ultracentrifugation cartridge" der Firma Amicon) zehnfach aufkonzentriert. Diese aufkonzentrierten Zellkulturüberstände werden entweder bei -80°C gelagert oder direkt für Blutge­ rinnungsassays eingesetzt. Überstände, die sTF₂₁₇-LZ, sTF₂₂₀-LZ oder sTF₂₂₆-LZ ent­ hielten, werden zu Aliqots von gepoolten humanen Blutproben (Citrat-Vollblut) gegeben, die teilweise zusätzlichen Faktor VIIa und 28 µM eines Phosphatidyl­ serin/Phosphatidylcholin-Gemisches (40% PS zu 60% PC in TBS mit 0,1% BSA) enthalten. Die Zeiträume bis zur Gerinnung der unterschiedlichen Blutprobenansätze nach Rekalzifizierung werden manuell gemessen. Es zeigt sich, dass die Zugabe von Zellkulturüberständen der mit TOP-sTF-LZ transfizierten SW480 Zellen zu einer signifikant beschleunigten Blutgerinnung der jeweiligen Blutprobe führt, wobei sTF₂₁₇- LZ und sTF₂₂₀-LZ besonders aktiv sind. Im Gegensatz dazu sind die Blutgerinnungs­ zeiten nach Zugabe von Zellkulturüberständen der mit FOP-sTF-LZ transfizierten SW480 Zellen nicht signifikant gegenüber Kontrollansätzen verändert, denen keine Zellkulturüberstände zugesetzt werden.

7. Detektion von TOP-sTF-LZ transfizierten Zellen in Blutproben

Zunächst werden SW480 Zellen mit den Plasmiden Alpha+GFPcycle3 und TOP- sTF-LZ oder FOP-sTF-LZ in der in Beispiel 1 beschriebenen Art und Weise kotransfiziert. Danach werden die SW480 Zellen durch Zugabe von Trypsinlösung (0,5 mM EDTA und 2‰ Trypsin in PBS) von der Unterlage abgelöst und in DMEM + 10% FKS resuspendiert. Fluoreszinierende Zellen ab einer definierten Signalinten­ sität werden mittels Durchflusszytometrie isoliert (siehe oben) und in definiertem Zahlenverhältnis zu Aliquots von gepoolten, humanen Blutproben zugegeben. Die Zeiträume bis zur Gerinnung der unterschiedlichen Blutprobenansätze nach Rekalzifizierung werden manuell gemessen. Es zeigt sich, dass die Abnahme der Blutgerinnungszeiten in einem direkten Verhältnis zur zugesetzten, mit TOP-sTF-LZ transfizierten SW480-Zellmenge steht. Die Zugabe von FOP-sTF-LZ transfizierten SW480-Zellen zeigt hingegen keinen derart drastischen Effekt hinsichtlich der Ver­ kürzung der Blutgerinnungszeiten.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (8)

1. Verfahren zur Detektion krankheits-assoziierter Zellen aus Körperproben, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen der Körperprobe mit Nuklein­ säurekonstrukten transfiziert oder infiziert werden, die folgende Komponenten beinhalten:

• a) ein Promoter-Element mit mindestens einer DNA-Bindungsstelle für Transkriptionsfaktoren, die auf Grund der krankhaften Veränderung der Zellen eine veränderte Aktivität aufweisen und
• b) ein Reportergen, das die Detektion der krankhaften Zellen ermöglicht und anschliessend die transfizierten oder infizierten Zellen detektiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nuklein­ säurekonstrukte Bindungsstellen für die Transkriptionsfaktoren oder respon­ sive Elemente aus der Gruppe TCF/LEF-1, jun, fos, myc, max, myb, E2F, DP1, CREB, p53, NFkB, NFAT, PPAR, ETS, ELK1, ATF, DPC, SMAD, CHOP, MEF, MADH4, GR, ER, STAT, SRF, ISRE, SRE, HSE, AP1, CRE enthalten.

3. Verfahren nach Anspruch 1-2, dadurch gekennzeichnet, dass die Reporter­ gene auf Grund ihrer enzymatischen, fluoreszenten oder strukturellen Eigenschaften nachgewiesen werden können.

4. Verfahren nach Anspruch 1-2, dadurch gekennzeichnet, dass die Reporter­ gene auf Grund der Aktivierung oder Inhibierung von enzymatischen Kaskaden nachgewiesen werden können.

5. Verfahren nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass die isolierten Zellen mit Substanzen in Kontakt gebracht werden, die das Verhalten der Zellen hinsichtlich Proliferation, Differenzierung, Apoptose, Motilität und Stoffwechselaktivität verändern könnten.

6. Verfahren nach Anspruch 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass die Körper­ proben krebsartig veränderte Zellen enthalten.

7. Verfahren nach Anspruch 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass die Promotor­ region durch veränderte Aktivitäten der Wnt- oder Ras-Signaltrans­ duktionskaskade sowie durch die Transkriptionsfaktoren myc und p53 beeinflusst werden.

8. Kit enthaltend die Reagenzien zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1-6.