DE10133930A1 - Verfahren zur spezifischen Detektion, Isolation und Charakterisierung von Zellen aus Körperproben durch Transfektion von Nukleinsäurekonstrukten - Google Patents
Verfahren zur spezifischen Detektion, Isolation und Charakterisierung von Zellen aus Körperproben durch Transfektion von NukleinsäurekonstruktenInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion krankheits-assoziierter Zellen aus Körperproben, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Zellen der Körperprobe mit Nukleinsäurekonstrukten transfiziert oder infiziert werden, die folgende Komponenten beinhalten: a) ein Promoter-Element mit mindestens einer DNA-Bindungsstelle für Traskriptionsfaktoren, die auf Grund der krankhaften Veränderung der Zellen eine veränderte Aktivität aufweisen und b) ein Reportergen, das die Detektion der krankhaften Zellen ermöglicht und anschließend die transfizierten oder infizierten Zellen detektiert.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion krankheits-assoziierter Zellen aus
Körperproben, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Zellen der Körperprobe mit
Nukleinsäurekonstrukten transfiziert oder infiziert werden, die folgende Kompo
nenten beinhalten: a) ein Promoter-Element mit mindestens einer DNA-Bindungs
stelle für Transkriptionsfaktoren, die auf Grund der krankhaften Veränderung der
Zellen eine veränderte Aktivität aufweisen und b) ein Reportergen, das die Detektion
der krankhaften Zellen ermöglicht und anschliessend die transfizierten oder
infizierten Zellen detektiert.
Krebs und bösartige Neoplasien sind nach Herz- und Kreislauferkrankungen mit
deutlichem Abstand die zweithäufigste Todesursache in Deutschland und anderen
Industriestaaten dieser Welt. Die Mehrzahl aller Krebsneuerkrankungen sowie der
malignombedingten Todesfälle in den westlichen Industrieländern wird durch maligne
epitheliale Tumore verursacht. In der EU erkranken jährlich ca. 577 000 Menschen an
Krebs und ca. 376 000 Menschen sterben jedes Jahr an den häufigsten soliden
Tumorarten (Brust-, Prostata-, Lunge- und Kolonkarzinom). Sollte sich die rasante
Verringerung der Mortalität bei Herz- und Kreislauferkrankungen fortsetzen, so ist
damit zu rechnen, dass in etwa 15-20 Jahren Krebs zur häufigsten Todesursache in
Deutschland wird.
Auf Grund der verbesserten Resektabilitätsmöglichkeiten im Laufe der letzten
Jahrzehnte wird die Mortalitätsrate zunehmend durch das Metastasierungsverhalten
sowie eine frühzeitige okkulte Tumorzelldissemination bestimmt, welche auf Grund
der insensitiven Nachweismethodiken bzw. konventionellen histopathologischen
Stagingmethoden schwer oder nicht nachzuweisen ist. Dabei ist speziell die Detektion
von Tumorzellen im Blut von großer prognostischer Aussagekraft. So gilt der Nach
weis von metastatischen Zellen im Blut bzw. in Lymphknoten als Hinweis auf die
Bösartigkeit einer krebsartigen Veränderung. Darüber hinaus ist eine genauere
Charakterisierung der im Blut befindlichen Tumorzellen auch für eine angepasste
Therapieentscheidung interessant.
Allerdings ist die Identifizierung, Charakterisierung und Isolierung von Tumorzellen
durch Detektion tumorspezifisch exprimierter Gene auf Grund von Spezifitäts
problemen herkömmlicher Nachweismethodiken (i. e. Immuncytochemie, in situ
Hybridisierung, PCR) überaus schwierig. Dies liegt unter anderem daran, dass die
Expression spezifischer Tumormarker häufig auf bestimmte Tumorarten begrenzt ist
oder in den heterogenen Zellpopulationen eines Tumors variiert, so dass nur ein Teil
der Tumorzellen erkannt werden kann. Ebenso stößt die Detektion seltener Ereignisse
im Blut (z. B. von metastatischen Zellen) auf technische Schwierigkeiten (zu geringe
Sensitivität, Spezifitätsprobleme von Antikörpern, technischer Aufwand, Kosten). Eine
möglichst effiziente Detektion abnormaler Zellen bzw. die Trennung lebender Tumor
zellen von normalen Zellen aus einem Gemisch beider Zelltypen wäre dabei nicht nur
für diagnostische, sondern auch für therapeutische Zwecke von hohem Wert. So ist es
wichtig möglichst genau bestimmen zu können zu welchem Zeitpunkt beispielsweise
Chemotherapien begonnen oder beendet werden sollten. Andererseits ist es auch von
hohem Interesse die Wirksamkeit von Medikamenten im Therapieverlauf zu ermitteln.
Hierzu ist es notwendig ein möglichst sensitives und schnelles Verfahren zur Ver
fügung zu haben, um die Anwesenheit selbst sehr geringer Mengen metastatischer
Zellen qualitativ nachzuweisen.
Besonders sinnvoll wäre darüber hinaus die routinemäßige Isolierung von lebenden
Tumorzellen aus dem Blut mit anschließenden Analysemethodiken, um zu unter
suchen ob die in Frage kommenden Therapeutika tatsächlich die Tumorzellen
abtöten können. Einfache Verfahren, die dies routinemäßig und mit hoher Sensitivität
ermöglichen können, existieren in der klinischen Diagnostik jedoch noch nicht.
Am weitesten fortgeschritten auf diesem Gebiet sind die Verfahren der Firmen
Immunicon und Miltenyi Biotec, die für ihre magnetischen Zellseparierungs
verfahren Antikörper gegen epitheliale Oberflächenantigene (EpCAM bzw. HEA)
verwenden. Diese Antigene werden von allen epithelialen Zellen, also sowohl von
gesunden als auch von malignen Zellen, in einem unterschiedlichem Expressionsgrad
auf den Zelloberflächen exprimiert. Da Blutzellen diese Antigene nicht besitzen
ermöglichen diese Verfahren eine circa 5 bis 10fache Anreicherung von Epithelzellen
aus dem Blut. Auf Grund der geringen Zahl an malignen Zellen in der Tumorprobe
besteht der Großteil der Zellen nach magnetischer Separierung immer noch aus
peripheren Blutzellen. So beschreiben Krüger et al. (1999; Cytotherapy 1: 135-139)
eine Anreicherung epithelialer Zellen mittels der HEA-immunobead-Methodik von
2,6 pro 106 Zellen auf 10,6 pro 106 Zellen, wobei ein signifikanter Verlust an
Tumorzellen bemängelt wird. Darüber hinaus können Tumorarten nicht epithelialen
Ursprungs mit dieser Methodik nicht angereichert werden. Andere Verfahren zur
Erkennung von Karzinomzellen in Blutproben beinhalten Schritte zur Permeabil
isierung und Fixierung der Zellen, so dass keine lebenden Tumorzellen isoliert
werden können. Dabei werden die positiv selektionierten Zellen mittels immun
cytochemischer Verfahren gefärbt, wobei zumeist Antikörper gegen Cytokeratine für
den Nachweis von epithelialen Zellen verwendet werden. Da die entsprechenden
Cytokeratine in Blutzellen nicht vorhanden sind, gilt der Nachweis dieses Proteins,
das in sämtlichen epithelialen Zellen vorhanden ist, als Nachweis von metastatischen
Tumorzellen. Diese Verfahren stoßen nicht nur auf technische Schwierigkeiten,
sondern sind zudem auch kostenaufwendig, personal- und zeitintensiv.
Ein vollkommen neuer Ansatz in diesem Gebiet ist die Ausnutzung tumorzell
spezifischer Signalaktivitäten durch Transfektion von Reportergenkonstrukten zur
spezifischen Isolierung lebender Tumorzellen aus einem Gemisch mit gesunden Zellen
(z. B. Blutzellen). Dabei wird die vielfach beschriebene Tatsache ausgenutzt, dass
Tumorzellen Signalaktivitäten aufweisen, die in gesunden Zellen nicht vorhanden sind.
Die Vermehrung von Körperzellen wird normalerweise durch zahlreiche Regulations
mechanismen innerhalb der Zelle kontrolliert, so dass sich jede Zelle abgestimmt auf
den Gesamtorganismus nur im Bedarfsfall zu teilen beginnt. Diese Prozesse werden
durch Signalmoleküle reguliert, die von "Senderzellen" sezerniert werden, bei den
"Empfängerzellen" an spezifische Rezeptormoleküle an der Oberfläche binden und
nachfolgend sogenannte Signaltransduktionswege aktivieren, die letztendlich verän
derte Genexpressionen zur Folge haben. In Tumorzellen sind dabei häufig aktivierende
oder aber hemmende Regulationsmoleküle mutiert, die diese Signalaktivitäten kontrol
lieren (ihnen entsprechen die Onkogene bzw. Tumorsuppressorgene). Tumorzellen
besitzen demzufolge Aktivitäten in ihrem Zellkern, die sonst nur in bestimmten Ent
wicklungsstadien der Embryonalentwicklung oder aber in genau definierten Gewebe
bereichen vorkommen.
Beispiele für solche Signalaktivitäten, die mit dem Krebswachstum in Verbindung
stehen, sind der Wnt- und Ras-Signaltransduktionsweg, sowie der Funktionsverlust
des Tumorsuppressors p53. Im Krebsgeschehen humaner Kolontumore spielen diese
Signalaktivitäten in unterschiedlichen Stadien der Tumorentstehung eine Rolle
(Kinzler, K. W. & Vogelstein, B. (1996). Lessons from hereditary cancer. Cell
87: 159-70), so dass sie sich diagnostisch für ein Staging der Tumorzellen bzw. für die
simultane Analyse mehrerer krebsassoziierter Signalaktivitäten (auch bei therapeu
tischen Ansätzen) eignen. Komponenten des Wnt-Signaltransduktionsweges sind in
nahezu allen Kolonkarzinomzellen bereits in einem sehr frühen Stadium mutiert, wobei
das Tumorsuppressorgen APC (= "Adenomatöse Polyposis Coli") in 80% der spon
tanen Tumore durch Mutationen inaktiviert ist, während das Onkogen β-Catenin in
10% der Tumore durch Mutation aktiviert ist. Die restlichen 10% der Tumore besitzen
aller Wahrscheinlichkeit nach Mutationen in anderen Komponenten des Wnt-Signal
transduktionsweges, so dass allgemein davon ausgegangen wird, dass diese Mutationen
als frühes Ereignis bei der Initiation der Tumorgenese auftreten. Demzufolge ist in
allen Kolonkarzinomzellen Wnt-Signalaktivität vorhanden, die letztendlich auf die
Wechselwirkung des Onkogens β-Catenin an TCF/LEF-Transkriptionsfaktoren im
Zellkern zurückzuführen ist. In fortgeschritteneren Stadien der Kolonkarzinogenese ist
auch das Onkogen K-ras in ca. 70% der Fälle durch Mutation aktiviert. Normaler
weise werden die Ras-Proteine nach Bindung von spezifischen Liganden an unter
schiedliche Zelloberflächenmoleküle (z. B. Rezeptor-tyrosinkinasen, Integrine, Ionen
kanäle) über Adaptorproteine (z. B. Shc, Grb2, Crk, . . .) und nachgeschaltete Guanin-
Nukleotid-Austausch-Faktoren (z. B. Sos, C3G, . . .) stimuliert. In Kolontumorzellen
werden auf Grund von Mutationen des Ras-Gens konstitutiv aktive Ras-Proteine
expremiert, die auch ohne die vorgeschalteten Komponenten des Ras-Signaltrans
duktionsweges aktiv sind. Dies bewirkt letztendlich die Aktivierung nachgeschalteter
Komponenten des Signalweges, die die Überaktivität zahlreicher Transkrip
tionsfaktoren (CREB, SRF, cFos, c-Jun, PPAR, ER, ETS, ELK-1, STAT, Myc, Max,
DPC4, p53, NFAT4, CHOP, MEF2, ATF-2, . . .) im Zellkern zur Folge hat, die
daraufhin u. a. das Teilungswachstum der Zellen induzieren können. In einem noch
weiter fortgeschrittenen Kolontumorstadium kommt es in mehr als 80% der Tumore
zur Mutation des Tumorsuppressorgens p53, das in gesunden Zellen als aktiver
Transkriptionsfaktor bei Auftreten von krankheitsassoziierten Veränderungen das
Teilungswachstum von Zellen verhindert bzw. zum programmierten Zelltod der Zelle
führt, indem es an spezifische DNA-Sequenzen (PuPuC(A/T)(A/T)GpyPyPy) bindet
und wachstumsinhibitorische Gene (z. B. p21CIP1) aktiviert.
Diese Tumor-assoziierten Signalaktivitäten führen neben einer direkten Aktivierung
von Transkriptionsfaktoren auch häufig zur verstärkten Expression von Trans
kriptionsfaktoren, die ihrerseits andere Gene aktivieren oder repremieren können und
somit erst sekundär bzw. indirekt aktiviert werden. Ein hervorragendes Beispiel
hierfür ist der PPARB Transkriptionsfaktor ("Peroxisome Proliferator Activated
Receptor Delta"), der in Kolonkarzinomzellen auf Grund der Überaktivität der Wnt-
Signaltransduktionskaskade expremiert wird. Es konnte gezeigt werden, dass
Inhibitoren dieses Transkriptionsfaktors, sogenannte "Non-Steroidal Anti-
Inflammatory Drugs" (= NSAIDS), wie zum Beispiel Sulindac oder Aspirin, durch
Hemmung dieses Transkriptionsfaktors das Wachstum von Tumorzellen hemmen
können (He, T. C., Chan, T. A., Vogelstein, B. & Kinzler, K. W. (1999). PPARdelta is
an APC-regulated target of nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Cell 99: 335-45).
Ein weiteres Beispiel für einen sekundär induzierten Transkriptionsfaktor ist c-myc,
der beispielsweise auch in Zellen mit aktiver Wnt-Signalaktivität überexprimiert
wird (He, T. C. et al. (1998). Identification of c-myc as a target of the APC pathway.
Science 281: 1509-12). Der Synergismus unterschiedlicher Signalaktivitäten bei der
Progression von Tumoren wurde am Beispiel der Onkogene myc und ras bereits
1987 von Sinn et al. beschrieben (Sinn, E., Muller, W., Pattengale, P., Tepler, I,
Wallace, R. & Leder, P. (1987). Coexpression of MMTV/v-Ha-ras and MMTV/c-myc
Genes in transgenic mice: Synergistic action of oncogenes in vivo. Cell 49: 465-475).
Das Zusammenwirken von Proto-Onkogenen (wie z. B. β-Catenin, Ras, Myc,
Fos) und Tumorsuppressorgenen (wie z. B. APC, Rb, p53) wird in dem Über
sichtsartikel von Hanahan et al. anschaulich beschrieben (Hanahan, D. & Weinberg,
R. A. (2000). The hallmarks of cancer. Cell 100: 57-70).
Die oben beschriebenen Signalaktivitäten spielen in zahlreichen anderen Tumorarten
eine wichtige Rolle. So ist die Zahl der Befunde, nach denen Komponenten der Wnt-
Signaltransduktionskaskade in vielen Tumoren mutiert sind bzw. kernlokalisiertes
β-Catenin immunhistochemisch in Tumorgeweben nachweisbar ist, in den letzten
Jahren exponentiell angewachsen. Dies unterstreicht die zentrale und generelle
Bedeutung dieser Signalaktivitäten im Krebsgeschehen humaner Tumore. So werden
aktivierende Mutationen des Onkogens β-Catenin unter anderem in Tumoren der
Leber, der Niere, des Pankreas, des Magens, der Prostata, der Schilddrüse, der
Gebärmutter, der Haut und Medulloblastomen gefunden. Beispielsweise ist β-
Catenin in 75% humaner Hauttumore (Chan, E. F., Gat, U., McNiff, J. M. & Fuchs,
E. (1999). A common human skin tumour is caused by activating mutations in beta-
catenin. Nat Genet 21: 410-3) und in 89% humaner Lebertumore (Jeng, Y. M., Wu,
M. Z., Mao, T. L., Chang, M. H. & Hsu, H. C. (2000). Somatic mutations of beta-
catenin play a crucial role in the tumorigenesis of sporadic hepatoblastoma. Cancer
Lett. 152: 45-51) mutiert. Darüber hinaus werden Mutationen in anderen Kompo
nenten der Wnt-Signaltransduktionskaskade gefunden, die einen identischen Effekt
hinsichtlich der Krebsentstehung haben (siehe oben; Satoh, S., Daigo, Y., Furukawa,
Y., Kato, T., Miwa, N., Nishiwaki, T., Kawasoe, T., Ishiguro, H., Fujita, M., Tokino,
T., Sasaki, Y., Imaoka, S., Murata, M., Shimano, T., Yamaoka, Y. & Nakamura, Y.
(2000). AXIN1 mutations in hepatocellular carcinomas, and growth suppression in
cancer cells by virus-mediated transfer of AXIN1. Nat Genet 24: 245-50). Auch in
Tumoren der Brust spielt die Aktivierung der Wnt-Signaltransduktionskaskade eine
zentrale Rolle und ist darüber hinaus von prognostischer Aussagekraft (Lin, S. Y.,
Xia, W., Wang, J. C., Kwong, K. Y., Spohn, B., Wen, Y., Pestell, R. G. & Hung,
M. C. (2000). Beta-catenin, a novel prognostic marker for breast cancer: its roles in
cyclin D1 expression and cancer progression. Proc Natl Acad Sci USA 97: 4262-6).
Die zentrale Bedeutung von p53 bei der Entstehung zahlreicher Tumore ist vielfach
beschrieben. p53 ist das am häufigsten mutierte Tumorsuppressorgen in humanen
Tumoren (mehr als 10 000 Mutationen sind in der Literatur beschrieben worden;
Hernandez-Boussard, T., Rodriguez-Tome, P., Montesano, R. & Hainaut, P. (1999).
IARC p53 mutation database: a relational database to compile and analyze p53
mutations in human tumors and cell lines. International Agency for Research on
Cancer. Hum Mutat 14: 1-8). p53 reguliert Zellzykluskontrolle und Apoptose
vorgänge im Zusammenhang mit Reparaturmechanismen nach DNA-Schädigungen.
Demzufolge wird p53 auch als Wächter des Genoms ("Guardian of the Genome")
bezeichnet, wobei die Funktionalität von p53 als Transkriptionsfaktor von ent
scheidender Bedeutung ist (siehe oben). Mutationen von p53 wurden in sehr vielen
Tumorarten gefunden, z. B. in Tumoren des Kolons, der Leber, der Brust, des
Magens, des Pankreas, des Blutes, der Lunge, der Schilddrüse. Die generelle Tumor
suppressorfunktion von p53 zeigt sich auch bei Patienten mit vererbten Mutationen
des p53 Gens, die zahlreiche unterschiedliche Tumore entwickeln (Mazoyer,
S., Lalle, P., Moyret-Lalle, C., Marcais, C., Schraub, S., Frappaz, D., Sobol, H. &
Ozturk, M. (1994). Two germ-line mutations affecting the same nucleotide at codon
257 of p53 gene, a rare site for mutations. Oncogene 9: 1237-1239 / / Akashi, M. &
Koeffler, H. P. (1998). Li-Fraumeni syndrome and the role of the p53 tumor
suppressor gene in cancer susceptibility. Clin Obstet Gynecol 41: 172-99). Darüber
hinaus sind Mutationen in p53 u. a. auch für Resistenzen gegenüber Chemo
therapeutika verantwortlich (Aas, T., Borresen, A.-L., Geisler, S., Smith-Sorenson,
B., Johnsen, H., Varhaug, J. E., Akslen, L. A. & Lonning, P. E. (1996). Specific P53
mutations are associated with de novo resistance to doxorubicin in breast cancer
patients. Nature Med 2: 811-814).
Die zentrale Bedeutung der Ras-Signaltransduktionskaskade, die auch als SOS-Ras-
Raf-MAPK-Kaskade bezeichnet wird, ist in der Literatur vielfältig beschrieben
worden. In circa 25% humaner Tumore konnten strukturell veränderte Ras-Proteine
nachgewiesen werden, die einem andauernden, wachstumsfördernden Signal gleich
kommen (Hanahan, D. & Weinberg, R. A. (2000). The hallmarks of cancer. Cell
100: 57-70). Speziell in Kolontumoren ist Mutationshäufigkeit in bestimmten Krebs
stadien sehr hoch (siehe oben). Es wurden jedoch auch in zahlreichen anderen
Geweben Mutationen von Ras-Genen nachgewiesen, z. B. in Tumoren der Lunge, des
Magens, des Pankreas, der Gallenblase, der Brust, der Gebärmutter, Sarkome.
Der Nachweis der Signalaktivitäten von aktivierten Transkriptionsfaktoren bzw.
sekundär induzierten Transkriptionsfaktoren unter Verwendung sogenannter Reporter
genkonstrukte wird in der Grundlagenforschung dazu verwendet, um biochemische
Prozesse in etablierten Tumorzellinien zu untersuchen. Die Reportergenkonstrukte
bestehen dabei aus einer Promotorregion, an die bestimmte Transkriptionsfaktoren
binden können, und einem Reportergen, das in den Zellen normalerweise nicht
vorhanden ist und bei Expression relativ leicht auf Grund der enzymatischen Aktivität
bzw. der Fluoreszenz des Genprodukts nachgewiesen werden kann. So bietet die Firma
Clontech in ihrem Katalog für das Jahr 2001 auf den Seiten 210 bis 212 ein
sogenanntes "Mercury™ Pathway Profiling System" an, mit dem die Aktivitäten der
Transkriptionsfaktoren NFAT, AP1, NFκB, CREB, ATF, c-Jun, c-Fos und ELK
nachgewiesen werden können. Mit diesem System sollen Signalaktivitäten in etablier
ten Tumorzellinien untersucht und quantifiziert werden. Dabei werden die Signal
aktivitäten durch Zugabe von externen Stimuli wie z. B. PMA, Ionomycin und
Forskolin induziert und mittels der Reportergene Luciferase, SEAP (= sezernierte Form
der Alkalischen Phosphatase) oder d2EGFP (= destabilisierte Form des "Enhanced
Green Fluorescent Protein") gemessen. In diesen Assays werden die Reportergen
konstrukte mittels der Kalzium-Phosphat-Präzipitationsmethodik transient in die
Tumorzellinienzellen transfiziert, um die Wirksamkeit von zusätzlich in die Zellen
transfizierten Genkonstrukten, deren Genprodukte mit den Signalaktivitäten wechsel
wirken könnten, zu untersuchen. Diese Untersuchungsansätze haben demnach das Ziel
den molekularen Mechanismus der Signaltransduktionskaskaden aufzuklären.
Auffällig ist, dass ein solcher Ansatz bisher nicht zur Detektion primärer Tumor
zellen, wie sie z. B. aus Tumoren und vor allem zur Detektion von metastatischen
Zellen aus dem Blut von Tumorpatienten beschrieben wurde. Darüber hinaus fällt
auf, dass meist nur die biochemische Aktivität eines spezifischen Signalweges durch
ein Reportergenkonstrukt abgefragt wird. Eine simultane Analyse mehrerer Signal
aktivitäten in einer einzelnen Zelle, die für die klinische Diagnostik von großer
Bedeutung wäre, wird bei den Zellinienexperimenten nicht adressiert.
Eine Anwendung solcher Reportergensysteme in der klinischen Diagnostik ist mit
derartigen Systemen weder beabsichtigt noch möglich, da die Transfektionseffi
zienzen dieses Systems für die Transfektion (= DNA-vermittelter Gentransfer) von
primären Tumorzellen unzureichend sind. Die Promotorstrukturen sind darüber
hinaus nicht dergestalt optimiert, dass sie als sensitives Meßsystem auch ohne
externe Stimuli eine ausreichende Expression des Reportergens in primären
Tumorzellen ermöglichen. Ebenso vergleichen die experimentellen Ansätze stets
Aktivitäten von induzierten und nicht-induzierten Tumorzellinien, enthalten jedoch
keinen Vergleich zwischen "gesunden" Zellen und Tumorzellen. Die Zielrichtung
derartiger Reportergensysteme ist ganz offensichtlich nicht die klinische Diagnostik
von Tumorzellen, sondern vielmehr die Aufklärung von generellen
Signaltransduktions-mechanismen in Tumorzelliniensystemen.
Der elementare Mangel der bisherigen Reportergensysteme wird auch in dem Patent
von Hans Clevers und Bert Vogelstein (US 5851775; Anmeldung 20/03/1997)
evident. Diese Arbeitsgruppe weist die tumor-assoziierte Wnt-Signalaktivität in
Kolonkarzinomzellinien mittels eines Luciferase-Reportersystems in Zellkultur
systemen nach (Korinek, V. et al. (1997). Constitutive Transcriptional Activation by
a beta-catenin-Tcf complex in APC-/- Colon Carcinoma. Science 275: 1784-1787).
Das Patent beschreibt eine Methodik zur Identifizierung potentieller Therapeutika
unter Verwendung von TCF-Transkriptionsfaktor-responsiven Reportergenkon
strukten. Dabei wird die Untersuchung von Zellen beansprucht, die Mutationen in
den Signaltransduktionskomponenten APC oder β-Catenin aufweisen. Ein derartiges
Screening-System geht auf die spezifischen Gegebenheiten der Kolonkarzinogenese
ein, in denen APC und β-Catenin häufig mutiert sind (siehe oben). Substanzen, die
die Wnt-Signalkaskade auf Grund der Wechselwirkung mit anderen Komponenten
der Kaskade beeinflussen, können mit diesem System jedoch nicht gefunden werden.
Hierfür wäre es sinnvoll ein zelluläres System (z. B. unter Verwendung von Brust
tumorzellen) zu etablieren, bei der die Wnt-Signalaktivität z. B. auf die Über
expression des extrazellulären Liganden Wnt zurückzuführen ist. Die in dem Patent
beanspruchten Reportergenkonstrukte werden darüber hinaus weder zur Detektion
noch Isolierung von primären Tumorzellen beansprucht, noch wird an eine derartige
Anwendung in der klinischen Diagnostik in diesem Zusammenhang gedacht.
In einem Patent von Bert Vogelstein und Kenneth Kinzler (US 6140052; Anmeldung
20/08/1998) wird ein Reportergenkonstrukt zur Bestimmung der Wnt-Signalaktivität
beansprucht, das eine genau festgelegte Basenabfolge der Bindungsstelle von TCF-
Transkriptionsfaktoren in den Promotorstrukturen enthält (CTTTGAT und
ATCAAAG), die sich aus dem von ihnen entdeckten c-myc-Zielgenpromotor
ableitet. Dies steht im augenscheinlichen Widerspruch zu der Tatsache, dass die hier
untersuchten TCF-Faktoren gegenüber Veränderungen in der Basenabfolge ihrer
DNA-Bindungsstellen unempfindlich sind. So wird die DNA-Bindungsaktivität des
sehr nah verwandten LEF-1-Transkriptionsfaktors bereits 1995 von Love et al.
(Love, J. J. et al. (1995). Structural basis for DNA bending by the architectural
transcription factor LEF-1. Nature 376: 791-795) durch Kokristallisierungsexperi
mente beschrieben, wobei die Basenabfolge der verwendeten DNA-Bindungsstelle
(CCTTTGAA) intensive Kontakte mit der DNA-Bindungsdomäne des Transkrip
tionsfaktors macht. Dabei wird beschrieben, dass die Position des mittleren
Thymidins für die Bindungsaffinität kritisch ist, während die Transversion ("T → A")
des benachbarten Thymidins keinen Einfluss auf die Bindungsaktivität hat. Demnach
wären auch andere Basenabfolgen ähnlich effizient in ihren Bindungsaffinitäten (z. B.
CCATTGAA). Da LEF-1 und TCF-Faktoren einander nicht nur strukturell sehr ver
wandt sind sondern sich auch funktionell gegenseitig ersetzen können, macht es
wenig Sinn eine spezifische Basenabfolge für LEF-1/TCF-Faktoren, wie im
US-Patent 6140052 geschehen, zu beanspruchen. Darüber hinaus diskutierten die
Patentinhaber bereits im Oktober 1996 die Bedeutung dieser Faktoren in der Kolon
karzinogenese (Kinzler, K. W. & Vogelstein, B. (1996). Lessons from hereditary
cancer. Cell 87: 159-70).
Als Reportergen zur Isolierung lebender Tumorzellen aus Blutproben bietet sich das
Grün-Fluoreszinierende-Protein GFP an, das auf Grund seines Fluoreszenzverhaltens
bei Expression zu einem Aufleuchten der Zellen nach entsprechender Belichtung
führt. GFP ist in vielfältiger Form bereits patentiert worden. Das nächstliegende Patent
(US 5968738) beschreibt unter anderem die Verwendung von zwei GFP Varianten und
FACS bzw. Durchflusszytometrie zur "Analyse von Signaltransduktionsaktivitäten".
Ein spezifisches Patent zur Diagnostik von metastatischen Zellen aus dem Blut existiert
jedoch nicht. Fast alle Patente befassen sich bisher mit therapeutischer Nutzanwendung
oder beschreiben die Zellsortierung von Zelliniengemischen in vitro. Für die diesem
Patent zu Grunde liegenden Experimente wurde eine GFP-Variante verwendet
("alphaGFPT204I"), die unseres Wissens nach bisher nicht für eine Verwendung als
Reportergen beansprucht wurde. Das erhöhte Fluoreszenzverhalten dieser GFP-
Variante wurde bereits 1996 veröffentlicht (Crameri, A., Whitehorn, E. A., Tate, E. &
Stemmer, W. P. C. (1996). Improved Green Fluorescent Protein by molecular
evolution using DNA shuffling. Nature Biotechnology 14: 315-319). Darüber hinaus
wurde als Transfektionskontrolle ein konstitutiv expremiertes, rot fluoreszinierendes
Protein aus Discosoma sp. (= "DsRed") der Firma Clontech verwendet (Kat. Nr.
6921-1).
Für die Isolierung lebender Tumorzellen aus Körperproben können neben
fluoreszenten Reportergenprodukten jedoch auch zahlreiche andere Gene verwendet
werden, die zum Beispiel auf Grund von strukturellen Eigenschaften nachgewiesen
werden können. Von besonderem Interesse sind dabei Gensequenzen, die für
Produkte kodieren, die extrazellulär nachweisbar sind. Ganz besonders geeignet sind
dabei Transmembranproteine, die antigene Strukturen auf der Oberfläche der Zellen
exponieren, die von entsprechenden Antikörpern erkannt werden. Dabei sind
antigene Sequenzen nicht humanen Ursprungs von Vorteil, deren Nachweis auf
Grund der fehlenden Kreuzreaktivitäten der Antikörper eine erhöhte Spezifität
ermöglicht, da keine endogenen, humanen Genexpressionen detektiert werden. Die
antigenen Strukturen können dabei mittels molekularbiologischer Verfahren in
unterschiedlichster Form mit natürlichen Gensequenzen rekombiniert werden, so
dass die antigenen Strukturen vorzugsweise extrazellulär präsentiert werden.
Für die Detektion krankheits-assoziierter Signalaktivitäten eignen sich darüber
hinaus auch Reportergene, die enzymatische Aktivitäten vermitteln, wie z. B.
Luciferasen, β-Galaktosidasen, Proteasen, Glykosidasen, Acetylasen, Phosphatasen,
die intrazellulär vorliegen können oder sekretiert werden. Zur Detektion seltener
Ereignisse ist es dabei von Vorteil ein möglichst sensitives Nachweisverfahren unter
Einbeziehung von Verstärkungssystemen zu verwenden. In der Immunhisto- und
Immuncytochemie sind solche Verstärkungssysteme weit verbreitet und beinhalten in
der Regel die Verwendung von Sekundärantikörpern oder des Biotin-Streptavidin
systems in Kombination mit enzymatischen Nachweisreaktionen um die Signalinten
sität zu erhöhen.
Bei der Detektion seltener Ereignisse im Blut (z. B. metastatischer Zellen) bietet es sich
an ein natürliche Verstärkungssysteme zu verwenden, die im Blut natürlicherweise vor
handen sind. Insbesondere wäre es interessant aktive Komponenten der Blutge
rinnungskaskade spezifisch von metastatischen Tumorzellen in Patientenblutproben
sekretieren zu lassen, die zur Gerinnung tumorzellhaltiger Blutproben fuhren würde.
Normalerweise schützt sich der Organismus durch den Vorgang der Blutstillung
(Hämostase) bei Verletzungen gegen Blutverluste. Dabei wird in Anwesenheit
unterschiedlicher aktivierender Substanzen eine Kaskade enzymatischer Reaktionen in
Gang gesetzt. Von besonderer Bedeutung für dieses Patent ist die beschriebene
exogene Aktivierung des Gerinnungssystems durch Faktor VII mit Gewebs
thromboplastin als Protein-Cofaktor. Das im Blut zirkulierende Zymogen des Faktors
VII hat im Gegensatz zu allen anderen inaktiven Vorstufen Gerinnungsfaktoren bereits
proteolytische Aktivität, die jedoch nicht zu einer Gerinnungsaktivierung führt, wenn
kein Gewebsthromboplastin vorhanden ist. Gewebsthromboplastin wird bei
Gewebeverletzungen aus den Mikrosomen verletzter Zellen freigesetzt. Es ist (in der
natürlichen Form) ein Komplex aus einem Protein und einem Phospholipid.
Freigesetztes Gewebsthromboplastin verleiht dem einkettigen Faktor-VII-Zymogen
ohne proteolytische Aktivität eine größere Aktivität. Der Gewebsthromboplastin-
Faktor-VII-Komplex bildet in Gegenwart von Kalzium-Ionen an Phospholipidpartikeln
(Plättchenfaktor 3) einen Komplex, an dem die Aktivierung der Faktoren IX und X
erfolgt. Im Zuge der fortschreitenden Aktivierung des plasmatischen Gerinnungs
systems kommt es bei der Aktivierung jeder nachfolgenden Enzymreaktion zu einer
enormen Verstärkung des Ausgangssignals. Am Ende dieser lawinenartigen Reaktions
kaskade, die auch als plasmatische Gerinnung bezeichnet wird, steht die Umwandlung
von Fibrinogen zu Fibrin, dessen dreidimensionales Netzwerk den losen
Thrombozytenpfropf an der verletzten Stelle durchdringt und ihn verfestigt. Ent
scheidend bei der exogenen Aktivierung der Gerinnungskaskade ist die Bindung von
Anteilen der extrazellulären Domäne des Gewebsthromboplastins mit dem Zymogen
des Faktors VII. Natürlich vorkommendes Gewebsthromboplastin ist ein integrales
Membranprotein, das in intakten Zellen im Zellinnern (im Endoplasmatische Reti
kulum) verborgen vorliegt und erst bei Verletzung der Zellintegrität freigesetzt wird, so
dass es zu keiner vorzeitigen Aktivierung der Blutgerinnungskaskade kommen kann.
Von klinischer Relevanz ist Bestimmung der klinisch-chemischen Kenngröße der
Thromboplastinzeit (= "Qick-Wert", TPZ, Prothrombinzeit). Die Thromboplastinzeit
gehört zu den Gerinnungsanalysen, die vor allen operativen Eingriffen durchgeführt
werden müssen, um eine mögliche Verminderung der Faktoren II, V, VII, X und von
Fibrinogen zu ermitteln. Hierzu wird die Fibrinbildung durch Zugabe von Gewebs
thromboplastin und Kalzium-Ionen in Plasma aus Citrat-Vollblut ausgelöst und die
Gerinnungszeiten gegenüber Kontrollblutplasma bestimmt, wobei die
Thromboplastinzeit unter der Applikation von Heparin vermindert ist.
Auf Grund der molekularen Beschaffenheit von natürlichem Gewebsthromboplastin ist
die Gewinnung und Aufreinigung eines funktionellen Protein/Phospholipidpartikels
zur Bestimmung der Thromboplastinzeit technisch aufwendig. Inzwischen ist es jedoch
gelungen eine natürlicherweise nicht vorkommende, wasserlösliche Variante von
Thromboplastin rekombinant in Bakterien und anderen Expressionssystemen herzu
stellen (Übersichtsartikel: Morrissey, JH. (1995). Tissue factor modulation of factor
VIIa activity: use in measuring trace levels of factor VIIa in plasma. Thromb Haemost.
74: 185-8). Diese wasserlöslichen Formen des Gewebsthromboplastins ("soluble
Tissue Factor" = sTF) bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 219 sind kommerziell
erhältlich (z. B. als Bestandteil eines Kits zur Bestimmung der Faktor VIIa Menge der
Firma Diagnostica Stago (Kat. # 00281)) und können in Anwesenheit von Phopholipid-
Vesikeln und Faktor VIIa die Aktivierung von Faktot X bewirken (Ruf, W., Rehem
tulla, A., Morrissey, J. H., Edgington, T. S. (1991). Phospholipid-independent and -
dependent interactions required for tissue factor receptor and cofactor function. J Biol
Chem. 266: 16256). Für diese Experimente wurde die isolierte extrazelluläre Domäne
von Thromboplastin in Säugerzellen expremiert und ähnlich wie in Experimenten von
Neuenschwander et al. als sezeniertes Protein aus Zellkulturüberständen isoliert. Dabei
zeigte sich, dass der Verlust der Transmembranregion für die Autoaktivierung von
Faktor VII von Bedeutung ist, was eine stark verlängerte Gerinnungsdauer in Standart
Blutgerinnungsassays zur Folge hat (Neuenschwander, P. F. & Mornssey, J. H. (1992).
Deletion of the membrane anchoring region of tissue factor abolishes autoactivation of
factor VII but not cofactor function. Analysis of a mutant with a selective deficiency in
activity. J Biol Chem 267: 14477-82). Inzwischen ist es jedoch durch Fusion einer
synthetischen Leucin-Reißverschluss-Dimerisierungsdomäne gelungen, eine rekom
binante Form der isolierten extrazellulären Domäne von Thromboplastin zu generieren,
die auch in Abwesenheit von Phospholipiden zur Autoaktivierung von Faktor VII
befähigt ist und ähnliche biochemische Aktivitäten wie das aufgereinigte Wild-Typ
Thromboplastin bei der Aktivierung von Faktor X besitzt (Donate, F., Kelly, C. R., Ruf,
W. & Edgington, T. S. (2000). Dimerization of tissue factor supports solution-phase
autoactivation of factor VII without influencing proteolytic activation of factor X.
Biochemistry 39: 11467-76).
Erfindungsgemäß können jedoch auch andere aktive Komponenten der Blut
gerinnungskaskade als Reportergen verwendet werden (z. B. Thrombin, Faktor Va,
Faktor VIIa, Faktor IXa, Faktor Xa oder Faktor XIIa) oder Komponenten anderer
biologischer Kaskaden (z. B. des Komplement Systems, des Kinin Systems) oder
generell aktive Substanzen, die Fibrin oder andere Substrate umsetzen (wie z. B. tPA,
uPA, Plasminogen/Plasmin, oder Derivate bzw. Hybride derselben). Umgekehrt
können auch Varianten der Komponenten verwendet werden, die diese biologischen
Kaskaden inhibieren. So erscheint z. B. die Verwendung von Plasmin, der aktiven
Komponente von Plasminogen, als skretiertes Reportergen sinnvoll zu sein, da es
(durch Veränderung der FaktorX-Aktivität) die Blutgerinnung hemmt und gleich
zeitig die Fibrinolyse stimuliert (Pryzdial, E. L., Lavigne, N., Dupuis, N. & Kessler,
G. E. (1999). Plasmin converts factor X from coagulation zymogen to fibrinolysis
cofactor. J Biol Chem 274: 8500-5) und somit unter entsprechenden, experimentellen
Bedingungen meßbar ist (Blutgerinnungsassays, Umsatz chromogener bzw.
fluoreszenter Substrate).
Die diagnostische Verwendung von Komponenten biologischer Kaskaden als
Reportergen in Blutproben ist neu. In dem nächstliegenden US-Patent 6080575 wird
die Verwendung von Nukleinsäurekonstrukten beschrieben, die für ein Fusions
produkt aus einer aktiven Komponente, einem Protease-sensitiven Bereich und einer
inhibitorischen Komponente bestehen. Dabei kann die aktive Komponente des
Fusionsproteins u. a. auch Bestandteil der Blutgerinnungskaskade (i. e. Faktor X) sein.
Diese aktive Komponente ist jedoch im Kontext des intakten Fusionsproteins auf
Grund der Anwesenheit der inhibitorischen Komponente in ihrer Aktivität gehemmt.
Erst die Anwesenheit bestimmter Proteasen im umgebenden Milieu, z. B. durch
Zugabe von PSA zu Zellkulturüberständen von Zellen, die mit dem Nuklein
säurekonstrukt stabil transfiziert wurden, setzt die aktive Komponente frei, und führt
in Blutgerinnungsassays zu kürzeren Blutgerinnungszeiten nach Rekalzifikation. Ziel
dieses Patentes ist es die Sekretion von Proteasen durch Tumorzellen oder durch
Zellen, die an entzündlichen Prozessen beteiligt sind, auszunutzen. Dabei beab
sichtigt dieses Patent eine therapeutische Nutzanwendung des beschriebenen
Verfahrens zur Zielzell-spezifischen Therapie von Tumoren und entzündlichen
Regionen.
In dem US-Patent 4784950 wird die Expression von Proteinen in Säugerzellen
patentiert, die biologische Aktivität im Sinne der Aktivierung der Blutgerinnung
haben. Dabei dient das beschriebene Verfahren der Produktion großer und hochreiner
Mengen von Faktor VIIa und Faktor IX zur Behandlung von Patienten, die
entsprechende Defizienzen aufweisen. Wiederum handelt es sich bei diesem Patent
also um eine rein therapeutische Nutzanwendung.
Die Isolierung bestimmter Zellen aus heterogenen Zellgemischen ist nicht nur für die
Detektion und Charakterisierung von krankhaft veränderten Zellen interessant. Auch
die Isolierung von gesunden Zellen ist von diagnostischer und therapeutischer Be
deutung. Beispielsweise ist die Isolierung adulter Stammzellen, die zu unter
schiedlichen organ- oder gewebsspezifischen Zellen ausdifferenzieren können, von
großem medizinischem Interesse. So könnten Stammzellen, nach ihrer Isolation und
Vermehrung ex vivo, zur Heranzüchtung und autologen Transplantation von Ersatz
organen verwendet werden. Die hierzu benötigten Stammzellen könnten dabei nach
entsprechender "Transdifferenzierung" auch aus anderen Ursprungsorganen
stammen. Die medizinische Bedeutung pluripotenter Stammzellen geht nicht zuletzt
aus den Erfahrungen mit hämatopoetischen Stammzellen bei der Behandlung von
Blutkrebspatienten hervor. Die Verwendung von adulten Stammzellen aus anderen
Organen erwies sich jedoch als äusserst komplex, da die Isolation der seltenen
Stammzellen in nicht-differenziertem Zustand und hoher Reinheit sehr schwierig ist.
Das Vorhandensein derartiger, pluripotenter Zellen konnte jedoch inzwischen in
zahlreichen Organen nachgewiesen werden. So konnten Stammzellen z. B. aus
schnell regenerierenden Organen (Haut, Darm, Skelettmuskel) unter selektiven
Wachstumsbedingungen angereichert werden. Neueren Untersuchungen zufolge
benötigen adulte Stammzellen jeweils spezifische biochemische Aktivitäten für die
Aufrechterhaltung ihres dedifferenzierten Zustandes. Besonders eindrucksvoll zeigt
sich dies am Beispiel der Dünndarmepithel-Stammzellen, die bei Deletion des
Transkriptionsfaktors TCF4 verloren gehen (Korinek, V., Barker, N., Moerer, P., van
Donselaar, E., Huls, G., Peters, P. J. & Clevers, H. (1998). Depletion of epithelial
stem-cell compartments in the small intestine of mice lacking Tcf-4. Nat Genet
19: 379-83). Dieser Untersuchung zufolge benötigen die Stammzellen des Dünndarms
Wnt-Signalaktivität, die in den Krypten der Dünndarmmikrovilli mittels TCF4
vermittelt wird, für ihr Fortbestehen im adulten Organismus. Ähnliche Schluss
folgerungen für andere Organsysteme lassen sich aus Untersuchungen ableiten, bei
denen Komponenten der Wnt-Signalkaskade in der Haut spezifisch deletiert oder in
aktiver Form expremiert wurden. Auch bei Vorläuferzellen des hämatopoetischen
Systems scheint die Wnt-Signalkaskade von Bedeutung zu sein. Demnach regulieren
Wnt-Faktoren die Expansion und Aufrechterhaltung von hämatopoietischen
Vorläuferzellen (Austin, T. W., Solar, G. P., Ziegler, F. C., Liem, L. & Matthews, W.
(1997). A role for the Wnt gene family in hematopoiesis: Expansion of multilineage
progenitor cells. Blood 89: 3624-3635). Dieser Befund ist vor allem auch auf Grund
neuerer Untersuchungen von großem therapeutischen Interesse. So konnte gezeigt
werden, dass adultes Knochenmarksgewebe Stammzellen hoher Plastizität bzw. eines
breiten Differenzierungspotentials enthält (Krause, D. S., Theise, N. D., Collector,
M. I, Henegariu, O., Hwang, S., Gardner, R., Neutzel, S. & Sharkis, S. J. (2001).
Multi-Organ, multilineage engraftment by a single bone marrow-derived stem cell.
Cell 105: 369-77). Bestimmte Knochenmarksstammzellen übernahmen nach
Transplantatiom im Empfängerorganismus die Funktion von Stammzellen der
Lunge, der Haut, der Leber und des Verdauungstraktes. Zur Anreicherung der
entsprechenden Stammzellen verwendeten die Autoren einen sogenannten "Homing
Assay", der eine serielle Tansplantation von aufgereinigten und markierten
Knochenmarkszellen in Röntgen-bestrahlte Empfängertiere beinhaltet. Diese Art der
Isolierung der adulten Stammzellen ist für eine klinische Anwendungen beim
Menschen nicht geeignet.
Neueren Untersuchungen zufolge scheinen sich zahlreiche Tumore aus adulten bzw.
"somatischen" Stammzellen zu entwickeln. Dies ergibt sich zum einem aus dem
Befund, dass die aberrante Aktivierung bestimmter Signalkaskaden (Wnt, Hedgehog)
nicht nur zu einem sehr hohen Prozentsatz zur Enstehung bestimmter Tumore
beiträgt, sondern in denselben Geweben auch für die Aufrechterhaltung von Stamm
zellpopulationen benötigt wird (Taipale, J. & Beachy, P. A. (2001). The Hedgehog
and Wnt signalling pathways in cancer. Nature 411: 349-354). Die Tatsache, dass in
einer einzelnen somatischen Zelle zwischen 4 und sieben Mutationen stattfinden
müssen, damit sich ein Tumor bildet, deutet ebenfalls daraufhin, dass die ent
standenen Tumorzellen selbst in sich rasch erneuernden Geweben (Darm Haut, Blut)
längere Zeit vorhanden gewesen ein müssen. Signalaktivitäten, die an der Tumor
entstehung ursächlich mitwirken (und in diesem Patent beispielhaft aufgeführt
werden), sind demnach potentiell auch in Stammzellen aktiv. Verfahren zur Iso
lierung von Tumorzellen können auch für die Isolierung bestimmter Stammzellen
verwendet werden.
In diesem Zusammenhang sind die Arbeiten von Tannishtha Reya interessant, die sie
auf dem Wnt Meeting 2001 in New York vorstellte. Sie konnte zeigen, dass die
retrovirale Expression von β-Catenin hämatopoietische Stammzellen langfristig in
einem undifferenzierten Zustand konserviert und ihre Fähigkeit steigert sich im
Knochenmark letal-bestrahlter Mäuse anzusiedeln um ein vollständiges hämato
poietisches System aufzubauen. Dies verdeutlicht die Funktion und Bedeutung der
Wnt-Signalkaskade bei der Aufrechterhaltung hämatopoietischer Stammzellen und
legt nahe, dass die Isolierung von Blutzellen aus dem Knochenmark auf Grund einer
aktiven Wnt-Signalkaskade zur Anreicherung von adulten Stammzellen verwendet
werden kann, wobei serielle Transplantationen zur Anreicherung der Stammzellen
umgangen würden. Zusammenfassend lässt sich für bestimmte Signalkaskaden (Wnt,
hedgehog) festhalten, dass sie für die Aufrechterhaltung sowie Expansion von
zumindest einigen Stamzellpopulationen notwendig sind.
Erfindungsgemäß lässt sich das Vorhandensein spezifischer Signalaktivitäten in
adulten Stammzellen zu deren Isolation ausnutzen. Prinzipiell werden dabei ähnliche
Nukleinsäurekonstrukte wie die zur Detektion und Isolation von Tumorzellen
beschriebenen verwendet. Hierzu werden die jeweiligen Reportergene hinter die für
die biochemischen Aktivitäten in adulten Stammzellen sensitiven Promotorstrukturen
kloniert. Vorzugsweise werden Reportergenkonstrukte verwendet, die für fluores
zinierende oder transmembrane Reportergenprodukte kodieren und mittels viraler
Expressionssysteme in die Zellen der Körperproben eingeschleust werden. Prinzipiell
können jedoch auch andere Reportergene verwendet werden. Die Isolation der Zellen
erfolgt anschliessend vorzugsweise mittels Durchflusszytometrie in Anwesenheit von
Differenzierungsinhibitoren. Es können jedoch auch andere Verfahren Anwendung
finden, die beispielsweise auf der Detektion induzierter Oberflächenstrukturen
basieren und mittels "Beads" isoliert werden. Prinzipiell kann es auch sinnvoll sein
zusätzlich zu den für die Zellisolation notwendigen Reportergenen Inhibitoren von
Differenzierungsvorgängen (z. B. Transkriptionsfaktoren mit entsprechender Wirkung
auf die Genexpressionen der jeweiligen Stammzellen) konstitutiv, induziert oder
zelltyp-spezifisch expremieren zu lassen. Die isolierten, adulten Stammzellen eines
Patienten können nach operativen bzw. anderen medizinischen Eingriffen für die
Neubildung oder Regeneration des identischen oder (nach entsprechender Trans
differenzierung) zur Regeneration anderer Organe verwendet werden. Beispielsweise
könnten adulte Stammzellen des Darms für die Regeneration der Langerhansschen
Inselzellen des Pankreas von Diabetes-Patienten verwendet werden.
Auch der Kontakt von gesunden Körperzellen mit pathohenen Agentien (z. B. Infek
tion durch Viren, Kontakt mit Bakterien oder bakteriellen Substanzen, Anwesenheit
von allergenen Stoffen) oder mit stimulierenden oder reprimierenden Substanzen
(Wachstumsfaktoren, Wachstumsfaktorantagonisten, Toxine, chemische Substanzen)
kann Veränderungen in den biochemischen Aktivitäten von Zellgemischen führen,
die die Isolierung bestimmter Zellen erleichtert. So ist es beispielsweise denkbar,
dass der Kontakt mit wachstumshemmenden Stoffen bestimmte biochemische
Aktivitäten in bestimmten (z. B. gesunden) Zellen reprimiert, in anderen Zellen (z. B.
krankhaft veränderten) jedoch ohne Wirkung bleibt. Die nicht-repremierten Akti
vitäten in diesen Zellen könnten dann zur Zellisolation ausgenutzt werden. Auch die
veränderte Aufnahme von bestimmten Stoffen kann zur Detektion spezifischer Zellen
aus heterogenen Zellgemischen verwendet werden. Dies gilt nicht nur für den Fall,
dass Transportproteine in Zielzellen als Reportergene expremiert werden. So ist es
beispielsweise auch denkbar die vermehrte Expression von Glutamat-Transportern in
Lebertumorzellen für die Isolation der Zellen auszunutzen. So könnte der vermehrte
Transport von detektierbaren (z. B. fluoreszinierenden) Transportsubstratanaloga zur
Markierung der veränderten Zellen verwendet werden.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, ein Verfahren bereit
zustellen, mit dem spezifische Zellen detektiert und ggf. auch aus Blutproben oder
anderen Körperproben in lebendem Zustand isoliert werden können, so dass sie
nachfolgenden Untersuchungen oder für therapeutische Nutzanwendungen zur
Verfügung stehen.
Die vorliegende Erfindung beruht auf Erkenntnissen, dass sich Signalaktivitäten in
den Zellkernen von bestimmten Zellen durch Transfektion von Reportergen
konstrukten mit synthetischen Promotorstrukturen zur spezifischen Expression von
Reportergenen ausnutzen lassen. Nach Transfektion eines heterogenen Zellgemisches
mit synthetischen Reportergenkonstrukten kommt es auf Grund der konkatemeren
Aneinanderreihung optimierter Transkriptionsfaktorbindungsstellen bzw. auf Grund
der Kombination von unterschiedlichen Transkriptionsfaktorbindungsstellen in
spezifischen Zellen zu einer starken Überexpression bzw. Sekretion von Reporter
genprodukten, die unterschiedliche Nachweisverfahren ermöglichen.
In einem Verfahren werden die Signalaktivitäten in krankhaft veränderten Zellen
(z. B. Tumorzellen) zur spezifischen Expression von fluoreszinierenden Proteinen
ausgenutzt. Da die gesunden Zellen in der Blutprobe diese Signalaktivitäten nicht
besitzen; ist die Spezifität des Tumorzellnachweises hoch und ermöglicht die
Isolierung lebender, fluoreszinierender Tumorzellen mittels Durchflusszytometrie.
Die isolierten Tumorzellen können anschließend in Kultur genommen werden und
stehen weiteren Analysen zur Verfügung. Die Reportergenkonstrukte lassen sich
dabei auch für Zellkultursysteme verwenden, die die Reportergenexpression vor und
nach Kontakt von transfizierten Zellen mit potentiellen Wirksubstanzen messen. Dies
kann einerseits für individualisierte Therapieentscheidungen verwendet werden,
wenn die untersuchten Zellen aus Patienten stammen, andererseits auch Screening-
Verfahren dienen, die Aktivitäten in Zellinienzellen analysieren.
In einem anderen Verfahren kodieren Teilbereiche der Reportergene für eine biolo
gische Aktivität, die die Initiation bzw. Progression von biologischen Kaskaden
positiv oder negativ beeinflusst. Da die gesunden Zellen in der Blutprobe die zur
Expression des Reportergens benötigten Signalaktivitäten nicht oder in signifikant
unterschiedlicher Ausprägung besitzen, werden die biologischen Kaskaden nur in
Anwesenheit krankhaft-veränderter Zellen induziert bzw. gehemmt, so dass eine
außerordentlich hohe Spezifität des Tumorzellnachweises erzielt wird. Darüber
hinaus ist die Sensitivität des Tumorzellnachweises auf Grund der Ausnutzung
natürlicher Verstärkungssysteme bzw. von im Blut zumindest partiell vorhandenen,
biologischen Kaskaden sehr hoch. Der Nachweis der tumorzellspezifischen Ex
pression der Reportergene erfolgt anschließend durch Messung der Aktivierung bzw.
Aktivierbarkeit der jeweiligen biologischen Kaskaden, z. B. nach Art der klassischen
Blutgerinnungsassays ("quick-test", TPZ).
In einem weiteren Verfahren werden Signalaktivitäten in gesunden Zellen (z. B.
adulten Stammzellen) zur Isolation der Zellen aus heterogenen Zellgemischen
ausgenutzt. Dabei werden die Zellen der jeweiligen Körperproben, wie z. B. Biopsien,
zunächst mittels zellbiologischer Standartmethodiken vereinzelt, bevor sie mit den
Nukleinsäurekonstrukten transfiziert werden. Die Funktionalität der isolierten
(vorzugsweise humanen) Stammzellen kann ggf. in immunsuppremierten Tier
modellen nach entsprechenden operativen Eingriffen in vivo getestet werden, bevor
sie in den Patienten, aus denen sie ursprünglich stammten, zurückgeführt werden.
Die Erfindung bezieht sich auf Nukleinsäurekonstrukte zur zellspezifischen Expression
von Reportergenen in Körperproben, wobei die Reportergenkonstrukte folgende
Komponenten beinhalten: a) ein Promoter-Element mit mindestens einer, bevorzugt
jedoch mehreren DNA-Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren, die auf Grund ihrer
zellspezifischen Aktivitäten oder aber auf Grund der konkatemeren Anordnung oder
spezifischen Kombination von DNA-Bindungsstellen in bestimmten Zellen überaktiv
sind, oder aber gentechnisch relevante Regionen, die die Insertion bzw. Integration von
Nukleinsäurekonstrukten in Zielregionen beeinflussen; b) ein Reportergen, das die
Detektion der spezifischen Zellen ermöglicht. Die Transfektion der Zellen erfolgt vor
zugsweise mittels viraler Expressionssysteme, die eine effiziente Transfektion der im
Blut befindlichen Zellen mit Reportergenkonstrukten ermöglichen. Besonders bevor
zugt sind dabei solche Transfektionssysteme, die auf Grund ihrer Zelltyp-Präferenzen
eine zusätzliche Spezifität der Reportergenexpression bewirken. Die Expressionslevel
der Reportergene können anschließend manuell, aber auch mittels automatisierbarer
Verfahren ermittelt werden.
Die Beschaffenheit der Promotorstrukturen lässt sich auf die jeweils zu detektierende
Signalaktivität anpassen. In der Regel werden Transkriptionsfaktorbindungsstellen
einer spezifischen Signalaktivität, räumlich durch kurze DNA-Sequenzen getrennt
("Spacer"), als Konkatemere vor Minimalpromotoren (z. B. aus dem c-Fos oder Thymi
dinkinasegenpromotor) positioniert. Darüber hinaus können gleichzeitig mehrere
Signalaktivitäten gemessen werden, wenn DNA-Bindungsstellen für Trans
kriptionsfaktoren unterschiedlicher Signaltransduktionswege miteinander kombiniert
werden. Eine gleichzeitige und voneinander unabhängige Messung verschiedener
Signalaktivitäten in einer Zelle lässt sich durch Transfektion von Reportergen
konstrukten erreichen, die unterschiedliche Reportergene mit jeweils verschiedenen
Promotorstrukturen enthalten. Dabei können diese Transkriptionseinheiten aus dem
jeweiligen Promotor und dem nachgeschaltetem Reportergen entweder auf einem
DNA-Konstrukt oder auf getrennten DNA-Konstrukten enthalten sein. Besonders
sinnvoll erscheint dabei auch die gleichzeitige Verwendung von induzierbaren (mit
Wildtyp-Transkriptionsfaktorbindungsstellen) und nicht-induzierbaren (mit mutierten
Transkriptionsfaktorbindungsstellen) bzw. konstitutiv aktiven Reportergenkonstrukten,
da hiermit die spezifische Aktivierung des Reportergens durch bestimmte
Transkriptionsfaktoren analysiert werden kann, bzw. Transfektionseffizienzen und
Zytotoxizitäten erfasst werden. Andererseits kann ein Promotor auch gleichzeitig die
Expression von zwei verschiedenen Reportergenen regulieren, wenn die Reportergene
durch ein zwischengeschaltete IRES-Sequenz (z. B. der "Internal Ribosomal Entry
Site"-Sequenz aus dem Encephalomyocarditis Virus) getrennt vorliegen.
Unter Umständen ist es sinnvoll die Promotoren zusätzlich durch Bindungsstellen von
basalen Transkriptionsaktivatoren zu ergänzen, deren Transaktivierungspotential erst
bei Anwesenheit der spezifischen, krankheitsassoziierten Transkriptionsfaktoren ihre
volle Aktivität entfalten. Dieses Prinzip der Kooperativität von Transkriptionsfaktoren
bei der Aktivierung von Promotoren beruht auf Erkenntnissen, die bei der Unter
suchung des MMTV-Promotors erzielt wurden. So konnte gezeigt werden, dass die
maximale Stimulierung des Promotors nach Bindung des Liganden-stimulierten
Glucocorticoidrezeptors erst durch die Bindung des basalen Transkriptionsaktivatoren
NF1 erzielt wird. Die Aktivierung der Reportergenexpression kann durch Etablierung
eines positiven Rückkopplungsmechanismusses verstärkt werden. Beispielsweise ist es
sinnvoll, wenn zur Messung der Wnt-Signaltransduktionsaktivität Nukleinsäure
konstrukte verwendet werden, bei denen Wnt-sensitive Promotoren sowohl die
Expression eines positiven Effektors (z. B. Fusionskonstrukt aus LEF-1 und der trans
aktivierenden, C-terminalen Region von β-Catenin; Vleminckx, K., Kemler, R. &
Hecht, A. (1999). The C-terminal transactivation domain of beta-catenin is necessary
and sufficient for signaling by the LEF-1/beta-catenin complex in Xenopus laevis.
Mech Dev 81: 65-74), als auch die Expression des eigentlichen Reportergens bedingen.
Darüber hinaus kann die basale Aktivität der synthetischen Promotorstrukturen auch
durch Ergänzung von DNA-Bindungsstellen für transkriptionelle Repressoren unter
drückt werden. Dabei kann der entsprechende transkriptionelle Repressor endogen
vorhanden sein oder durch ein zusätzlich eingebrachtes Repressorgen, das konstitutiv
expremiert wird, bereitgestellt werden. Hierfür können auch Nukleinsäurekonstrukte
verwendet werden, die für rekombinante Proteine bestehend aus einer DNA-
Bindungsdomäne eines beliebigen Transkriptionsfaktors (z. B. der HMG-Domäne von
LEF-1/TCF-Transkriptionsfaktoren, Carboxy-terminale Region (die letzten 90 Amino
säuren) von c-myc) und einer heterologen Repressordomäne (z. B. des Tet Repressors,
Carboxy-terminale Region (Aminosäure 179-281) von E2F6) bestehen. Erst in
Anwesenheit eines starken transkriptionellen Aktivators auf demselben cis-wirkenden
Promotorelement kommt es demnach zur Aktivierung des nachgeschalteten Reporter
gens, während das Reportergen in Abwesenheit des Transkriptionsaktivators reprimiert
ist. Besonders interessant sind in diesem Zusammenhang Systeme, bei denen die
transkriptionellen Repressoren durch endogene Aktivitäten reguliert sind, wenn also
neben den eigentlich meßbaren Reportergenen ein Repressorgen als weiteres
Reportergen verwendet wird. So kann die Expression des exogen eingebrachten
Repressorgens durch die Aktivität des in gesunden Zellen vorhandenen p53-Trans
kriptionsfaktors reguliert werden. Demzufolge wird der Repressor nur in gesunden
Zellen, nicht aber in Zellen mit mutiertem p53 expremiert, wozu unter Umständen
zusätzlich eine Induktion der p53-Aktivität durch entsprechende Behandlungen der
Zellen (UV-Bestrahlung oder Verwendung von DNA-schädigenden Substanzen)
benötigt wird. In Zellen mit mutierten p53 wird demnach die Expression eines z. B.
Wnt-regulierten Reportergens mit Transkriptionsrepressorbindungsstellen in der
Promotorregion (z. B. GFP-Varianten, Luciferase, Thromboplastin, etc.) auf Grund der
Abwesenheit der p53-regulierten Repressorgenexpression nicht repremiert, so dass die
synergistische Wirkung von Wnt-Signalaktivität und p53-Defizienz gleichzeitig oder
aufeinanderfolgend meßbar wird.
Für die Messung von Signalaktivitäten in Zellen sind unter anderem folgende
Transkriptionsfaktoren bzw. Familien von Transkriptionsfaktoren und/oder respon
siven Elemente interessant: TCF/LEF-1, jun, fos, myc, max, myb, E2F, DP1, CREB,
p53, NFkB, NFAT, PPAR, ETS, ELK1, ATF, DPC, SMAD, CHOP, MEF, MADH4,
GR, ER, STAT, SRF, ISRE, SRE, HSE, AP1, CRE. Die DNA-Bindungsstellen der
Transkriptionsfaktoren sind vielfach beschrieben und öffentlich zugänglich. Von
besonderem Interesse sind dabei Bindungsstellen für die Transkriptionsfaktoren TCF
(5'-CCTTTGAA-3'; LOVE, J. J. et al. (1995). Structural basis for DNA bending by
the architectural transcription factor LEF-1. Nature 376: 791-795), p53 (5'-
PuPuPuC(A/T)(T/A)GpyPyPy-3'; el-Deiry, W. S., Kern, S. E., Pietenpol, J. A.,
Kinzler, K. W. & Vogelstein, B. (1992). Definition of a consensus binding site for
p53. Nat Genet 1: 45-49), PPARδ (5'-CGCTCAC-3'; He, T. C., Chan, T. A.,
Vogelstein, B. & Kinzler, K. W. (1999). PPARdelta is an APC-regulated target of
nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Cell 99: 335-45), myc (5'-CACGTG-3' oder
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& Weintraub, H. (1990). Sequence-specific DNA binding by the c-Myc protein.
Science 250: 1149-1151), E2F (5'-TTTTSSCGS-3' bzw. 5'-TTTCGCGC-3'; Mudryj,
M., Hiebert, S. W. & Nevins, J. R. (1990). A role for the adenovirus inducible E2F
transcription factor in a proliferation dependent signal transduction pathway. EMBO
J 9: 2179-84), AP1 (5'-TGA(C/G)TCA; Fisch, T. M., Prywes, R. & Roeder, R. G.
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growth factor and 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate. Mol Cell Biol 9: 1327-31),
SMAD (5'-CAGACA-3'; Jonk, L. J., Itoh, S., Heldin, C. H., ten Dijke, P. & Kruijer,
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SRE und ATF (Fisch, T. M., Prywes, R., Simon, M. C. & Roeder, R. G. (1989).
Multiple sequence elements in the c-fos promoter mediate induction by cAMP.
Genes Dev 3: 198-211).
Zur Detektion bzw. Isolierung von fluoreszinierenden Zellen ist es notwendig
Reportergene zu verwenden, die für fluoreszinierende Proteine kodieren. Prinzipiell
eignen sich hierfür sämtliche Gene, die für direkt oder indirekt fluoreszinierende
Proteine kodieren. Insbesondere geeignet sind Varianten der Gene: GFP, BFP, YFP,
CFP, DS-Red, Obilin, Aequorin. Darüber hinaus können auch Gene verwendet werden,
die für Fluoreszenzfarbstoff-bindende Proteine kodieren, z. B. für Anti-Caline, die den
Fluoreszenzfarbstoff FITC binden. Alternativ hierzu können jedoch auch kodierende
Nukleinsäureabschnitte verwendet werden, deren translatierte Produkte an der Zell
oberfläche exponiert vorliegen, und somit für sekundäre Nachweisverfahren zugänglich
sind. Insbesondere sind solche Nukleinsäureabschnitte gemeint, die für Trans
membranproteine oder extrazellulär präsentierte Moleküle kodieren oder zu deren
Exposition führen. Beispielsweise können auf Grund der Signalaktivitäten Antigene,
Rezeptoren oder Liganden auf der Zelloberfäche präsentiert werden, für die spezifische
Nachweismoleküle (z. B. Antikörper, Anticaline, Liganden oder Rezeptoren) vorhanden
sind. Für diagnostische Verfahren sind dabei solche kodierenden Nukleinsäure
abschnitte bevorzugt, die nicht humanen Ursprungs sind. Beispielsweise können homo
loge Genabschnitte von auch im Menschen vorkommenden Transmembranproteinen
aus der Maus, Ratte, etc. verwendet werden, um Kreuzreaktivitäten bei immuno
logischen Nachweismethodiken zu unterdrücken, die auf endogene Expressionen nicht-
transfizierter Zellen zurückzuführen sind. Es können jedoch auch synthetische
Sequenzen verwendet werden, für die entsprechende Nachweismoleküle hergestellt
werden. Zum Beispiel können mittels molekularbiologischer Methoden nahezu
beliebige, synthetische Peptidsequenzen mit Transmembranproteinen rekombiniert
werden, um so in isolierter oder konkatemerer Form auf der Zelloberfläche präsentiert
zu werden. Gleichzeitig können gegen diese Peptide hochspezifische Antikörper
generiert werden. Durch Kopplung solcher Nachweismoleküle an unterschiedliche,
magnetische oder nicht-magnetische Beads können die krankhaft veränderten Zellen
auf Grund der spezifischen Expression des exogenen Nukleinsäurebereichs durch
Anlegen magnetischer Felder oder Zentrifugationsschritte auf Grund ihrer Assoziation
mit den Beads isoliert werden.
Zur Detektion der spezifischen Signalaktivitäten unter Ausnutzung biologischer
Kaskaden ist es notwendig Reportergene zu verwenden, die aktivierenden oder inhibie
renden Komponenten der biologischen Kaskaden gleichkommen. Prinzipiell können
hierfür Sequenzbereiche der Gene Pro-/Thrombin, Faktor XIIa, Faktor XIa, Faktor Xa,
Faktor IXa, Faktor VIIIa, Faktor VIIa, Faktor Va, Fibrin/Fibrinogen,
Plasmin/Plasminogen, Pro-/Kallikrein, Urokinase, tPA, CVF, C3b, Protein C, C-1 S
Inhibitor, Hirudin, alpha-1-antitrypsin, AT-III, TFPI, PAI-1, PAI-2, PAI-3. Darüber
hinaus können auch enzymatische Proteine expremiert oder entsprechende Fusions
proteine durch die biologischen Kaskaden aktiviert werden.
Zur zellspezifischen Expression von Reportergenen müssen die DNA-Konstrukte in die
Zellen eingeschleust werden. Hierzu sind zahlreiche, kommerziell erhältliche Trans
fektionstechnologien entwickelt worden. Neben der klassischen Kalzium-Phosphat-
Präzipitation, dem direkten Transfer durch Mikroprojektile ("Schrotschuss") und
Elektroporationsmethodiken ist es möglich Säugerzellen mit Liposomentechnologien
(z. B. Lipofectin und Lipofectamin der Firma GibcoBRL) zu transfizieren. Besonders
effizient lassen sich Säugerzellen jedoch mit viralen Systemen transfizieren. Insbeson
dere sind Systeme etabliert, die auf retroviralen, adenoviralen oder Adeno-Asso
ziierten-viralen (AAV) Vektoren basieren. Ein interessanter Ansatz in diesem
Zusammenhang ist die Verwendung von Transfektionssystemen, die eine unterschied
liche Transfektionseffizienz bei unterschiedlichen Zelltypen erzielen und somit der
Spezifität der Reportergenexpression zuträglich sind. Beispielsweise infizieren Adeno
viren die meisten humanen Zellen mit der Ausnahme hämatopoietischer Zellen mit
einer extrem hohen Effizienz. Diese Tatsache lässt sich durch Wahl entsprechender
Inkubationsbedingungen gerade bei der Isolierung von epithelialen Zellen aus dem
Blut ausnutzen, so dass selbst bei Verwendung konstitutiver Reportergenexpressionen
eine Anreicherung der Tumorzellen ermöglicht wird.
Erfindungsgemäß werden die Erkenntnisse des Anmelders für ein Verfahren zur
Diagnose krankheits-assoziierter Zellen genutzt, das die Transfektion von Reporter
genkonstrukten mit induzierbaren Promotorstrukturen umfasst, die eine auto
matisierbare Detektion und Isolation von Tumorzellen in Gemischen mit gesunden
Zellen ermöglichen. Darüber hinaus können die Erkenntnisse des Erfinders auch für
Verfahren eingesetzt werden, die der Isolation spezifischer, gesunder Zellen (z. B.
Stammzellen) aus heterogenen Zellgemischen dienen. Die automatisierbare und
spezifische Detektion der Zellen kann durch folgendes Verfahren gewährleistet werden:
Die Reportergenkonstrukte beinhalten zum einen Promotorstrukturen mit Bindungs stellen für Transkriptionsfaktoren, die für veränderte Genexpressionen in krankhaften Zellen bzw. differierende Genexpression in gesunden Zellen mitverantwortlich sind, zum anderen leicht meßbare Reportergene, die in den anderen Körperzellen in dieser Form bzw. in dieser Menge normalerweise nicht vorhanden sind. Durch die Kom bination und Vielzahl der Transkriptionsfaktorbindungsstellen wird die Spezifität und Sensitivität der induzierbaren Reportergenaktivierung gewährleistet. Durch die Expression eines in humanen Zellen endogen nicht vorhandenen Fluoreszenzproteins wird die spezifische und mittels Durchflusszytometrie automatisierbare Methodik qualitativ und quantitativ meßbar. Die Durchflusszytometrie erlaubt darüber hinaus durch Festlegen von Schwellwerten für Fluoreszenzintensitäten die Isolierung von Zellen mit bestimmten Reportergenexpressionsleveln. Die gleichzeitige Messung von zwei verschiedenen Fluoreszenzproteinen, die durch jeweils unterschiedliche biochemische Aktivitäten induziert werden können, ermöglicht zudem eine genauere Charakterisierung einzelner Tumorzellen hinsichtlich ihres Entartungsgrades ("Staging"). Dies trifft insbesondere auf solche Tumorarten zu, bei denen die entsprechenden biochemischen Aktivitäten in unterschiedlichen Stadien der Tumorprogression auftreten (wie oben am Beispiel des Kolonkarzinoms erläutert). Die gleichzeitige Verwendung von zwei ähnlichen, aber nicht identischen Reportergenen kann auch der Bestimmung der Spezifität der Reportergenexpression dienen. So können Promotoren mit intakten oder mutierten Transkriptionsfaktorbindungsstellen z. B. die Expression von unterschiedlich fluoreszinierenden Reportergenen oder Enzymen mit unterschiedlicher Substratspezifität regulieren. Der Vergleich der Expressionslevel lässt demnach Rückschlüsse auf die Aktivität spezifischer Signalaktivitäten zu. Darüber hinaus kann es sinnvoll sein zusätzlich zu induzierbaren Promotoren auch konstitutiv aktive Promotoren, die unterschiedliche Reportergene regulieren, zu verwenden, um Transfektionseffizienzen oder Zytotoxizitäten kontrollieren zu können.
Die Reportergenkonstrukte beinhalten zum einen Promotorstrukturen mit Bindungs stellen für Transkriptionsfaktoren, die für veränderte Genexpressionen in krankhaften Zellen bzw. differierende Genexpression in gesunden Zellen mitverantwortlich sind, zum anderen leicht meßbare Reportergene, die in den anderen Körperzellen in dieser Form bzw. in dieser Menge normalerweise nicht vorhanden sind. Durch die Kom bination und Vielzahl der Transkriptionsfaktorbindungsstellen wird die Spezifität und Sensitivität der induzierbaren Reportergenaktivierung gewährleistet. Durch die Expression eines in humanen Zellen endogen nicht vorhandenen Fluoreszenzproteins wird die spezifische und mittels Durchflusszytometrie automatisierbare Methodik qualitativ und quantitativ meßbar. Die Durchflusszytometrie erlaubt darüber hinaus durch Festlegen von Schwellwerten für Fluoreszenzintensitäten die Isolierung von Zellen mit bestimmten Reportergenexpressionsleveln. Die gleichzeitige Messung von zwei verschiedenen Fluoreszenzproteinen, die durch jeweils unterschiedliche biochemische Aktivitäten induziert werden können, ermöglicht zudem eine genauere Charakterisierung einzelner Tumorzellen hinsichtlich ihres Entartungsgrades ("Staging"). Dies trifft insbesondere auf solche Tumorarten zu, bei denen die entsprechenden biochemischen Aktivitäten in unterschiedlichen Stadien der Tumorprogression auftreten (wie oben am Beispiel des Kolonkarzinoms erläutert). Die gleichzeitige Verwendung von zwei ähnlichen, aber nicht identischen Reportergenen kann auch der Bestimmung der Spezifität der Reportergenexpression dienen. So können Promotoren mit intakten oder mutierten Transkriptionsfaktorbindungsstellen z. B. die Expression von unterschiedlich fluoreszinierenden Reportergenen oder Enzymen mit unterschiedlicher Substratspezifität regulieren. Der Vergleich der Expressionslevel lässt demnach Rückschlüsse auf die Aktivität spezifischer Signalaktivitäten zu. Darüber hinaus kann es sinnvoll sein zusätzlich zu induzierbaren Promotoren auch konstitutiv aktive Promotoren, die unterschiedliche Reportergene regulieren, zu verwenden, um Transfektionseffizienzen oder Zytotoxizitäten kontrollieren zu können.
Der Ausdruck "Signalaktivität" umfasst biochemische Aktivitäten in Zellen, die
letztendlich die Expression von Genen im Zellkern regulieren. Die biochemischen
Aktivitäten die zu veränderten Genexpressionen führen, können dabei an unterschied
lichsten Stellen in der Zelle stattfinden und sind meist Teil des komplexen Netz
werkgeschehens sogenannter Signaltransduktionswege. In Tumorzellen können bei
spielsweise Rezeptoren auf der Zelloberfläche durch überhöhte Präsenz von Liganden,
durch Mutation in kodierenden Genbereichen oder durch Mutationen in gen-
regulatorischen Bereichen überaktiv sein. Andererseits können auch Proteine im Zyto
plasma auf Grund von Mutationen der entsprechenden Gene eine veränderte Aktivität
aufweisen, so dass es zu veränderten posttranslationalen Modifikationen (z. B. Phos
phorylierung, Dephosphorylierung, Acetylierung, Deacetylierung, Ubiquitinylierung)
und daraus resultierenden regulatorischen Geschehnissen (z. B. Stabilisierung, Destabi
lisierung, erhöhte oder verminderte enzymatische Aktivität, verminderte oder verstärkte
Bindungsaffinitäten) von Komponenten des Signaltransduktionsgeschehens kommt.
Letztendlich werden so Signalaktivitäten hervorgerufen die die Expression von Ziel
genen erhöhen oder hemmen können.
Der Ausdruck "Reportergenkonstrukt" umfasst Nukleinsäurekonstrukte, die zumindest
aus einer genregulatorischen oder gentechnisch funktionellen Sequenz und einem
kodierenden Sequenzbereich bestehen. Insbesondere sind DNA-Konstrukte gemeint,
die eine genregulatorische Sequenz enthalten, die die Expression des kodierenden
Bereichs direkt (auf Grund der enthaltenen Transkriptionsfaktorbindungsstellen) oder
indirekt (z. B. durch die Ermöglichung einer gezielten Integration, Insertion bzw.
Rekombination des Reportergens in genomische DNA-Abschnitte) beeinflusst. Bei den
genregulatorischen Sequenzen, die die Expression des Reportergens direkt beein
flussen, handelt es sich meist um Promotor-, Enhancer- oder Silencer-Regionen, die auf
Grund der Wechselwirkung mit Eiweißmolekülen die Transkription kodierender
Nukleinsäurebereiche sowohl positiv als auch negativ beeinflussen können. Verfahren,
bei denen genregulatorische Sequenzen die Expression von Reportergenen indirekt
beeinflussen, umfassen die gezielte Integration des Reportergens in Stamm
zellpopulationen, bei denen die Zielregionen für die Integrationen zuvor durch Rekom
binationsschritte gezielt markiert werden (wie z. B. mit loxP Rekombinationssequenzen
für die Cre-Rekombinase) und die endogenen Zielgene u. U. zusätzlich zu den
Rekombinationssequenzen durch eine oder mehrere IRES-Sequenzen ergänzt werden
bzw. die Reportergene IRES-Sequenzen enthalten, so dass bei Induktion der
Expression des endogenen Genlokus zusätzlich Reportergensequenzen transkribiert
werden. Werden für diese Zwecke embryonale oder partiell differenzierte Stammzellen
von Säugetieren verwendet, so ist es möglich die Anwesenheit spezifischer Signal
aktivitäten durch synthetische oder endogene genregulatorische Sequenzen zu
visualisieren bzw. meßbar zu machen. Je nach Beschaffenheit des Reportergens können
somit sehr frühe Stadien krankhafter Veränderungen, aber auch gesunder
physiologischer Prozesse (wie z. B. Differenzierungsvorgänge, apoptotische oder
proliferative Prozesse in Gewebebereichen), detektiert werden. Organoide
Modellsysteme bis hin zu ganzen gentechnisch veränderten Organismen können so
Testsubstanzen ausgesetzt werden, wobei pathologische Veränderungen auf Grund der
Reportergenexpression frühzeitig erkannt werden bzw. pathologisch veränderte Zellen
zu unterschiedlichen Zeitpunkten isoliert werden können bzw. der Effekt der
Wirksubstanzen analysiert werden kann.
Der Ausdruck "zellspezifische Expression" umfasst die Transkription und/oder Trans
lation von kodierenden Sequenzbereichen in bestimmten Zellen einer hetrogenen
Zellpopulation. Beispielsweise können es krankhaft veränderte Zellen sein, die in einer
Körperprobe mit gesunden Zellen vorhanden sind. Insbesondere ist die spezifische
Expression von Genen in Tumorzellen gemeint, die auf besondere biochemische
Aktivitäten in den Tumorzellen zurückzuführen sind, die in gesunden Zellen in dieser
Ausprägung nicht vorkommen. Spezifität kann die Reportergenexpression dabei durch
zellspezifische Transkription, Translation oder Degradation des Reportergenproduktes
oder aber durch zellspezifische Transfektion des Nukleinsäurekonstruktes erreichen.
Der Ausdruck "Reportergen" umfasst kodierende Nukleinsäureabschnitte, die in Zellen
eingebracht werden müssen, da sie in dieser Form in den zu analysierenden Zielzellen
natürlicherweise endogen nicht vorkommen. Dabei sind auch Teilabschnitte oder ganze
Bereiche von ursprünglich endogen vorkommenden Sequenzen eingeschlossen, die auf
Grund einer veränderten Sequenz oder eines neuen Kontextes innerhalb des
synthetischen Nukleinsäurekonstruktes funktionell veränderte Eigenschaften gegenüber
den endogenen Genprodukten besitzen oder verändert expremiert werden.
Der Ausdruck "Körperprobe" umfasst jegliche Körperproben, in denen vitale Zellen
zur Transfektion von Nukleinsäurekonstrukten enthalten sind. Beispiele solcher
Körperproben sind Blut, Lymphflüssigkeit, Stuhl, Organpunktate und Biopsien.
Insbesondere sind Blutproben gemeint, in denen krankhaft veränderte Zellen vermutet
werden. Darüber hinaus sind auch Biopsien mit eingeschlossen, da sie sich nach
Vereinzelung der Zellen aus dem Gewebeverband mittels üblicher Standartmethodiken
(Zerschneiden, Resuspendieren mit immer enger werdenden Kanülen,
Proteasebehandlung, etc.) zur Transfektion von Nukleinsäurekonstrukten eignen.
Der Ausdruck "krankhafte Veränderung" umfasst biochemische Aktivitäten in Zellen,
die in vergleichbaren Zellen desselben Gewebes zu diesem Zeitpunkt nicht vorhanden
sind bzw. in anderen Bereichen des Gewebes oder in anderen Differenzierungsphasen
oder Entwicklungsstadien aktiv sind.
Der Ausdruck "Transkriptionsfaktor" umfasst Eiweißmoleküle, die direkt oder indirekt
mit Nukleinsäurebereichen assoziieren und dadurch veränderte Aktivitäten der
Nukleinsäurebereiche hervorrufen.
Der Ausdruck "Expressionslevel" umfasst transkriptionelle oder translationale
Veränderungen, die Nukleinsäurebereiche betreffen, die für eine Abfolge von
Aminosäuren kodieren oder einer kodierenden Nukleinsäuresequenz komplementär
sind. Darüber hinaus sind jedoch auch Veränderungen gemeint, die posttranslationale
Modifikationen von Aminosäuresequenzen betreffen und eine veränderte Stabilität,
Lokalisierung oder Aktivität zur Folge haben.
Der Ausdruck "automatisierbares Verfahren" umfasst Methodiken, die die manuelle
Arbeitskraft von menschlichem Personal ganz oder auch nur in Teilschritten ersetzt und
insbesondere bei Schritten der Transfektion, Detektion, Isolation, Dokumentation oder
Informationsverarbeitung Verwendung finden. Die Detektion ist dabei von den Eigen
schaften des verwendeten Reportergens abhängig.
Die Ausnutzung von Signalaktivitäten in Säugerzellen zur Expression von Reporter
genen, die die Detektion und Isolation bestimmter Zellen erlaubt, ist sowohl für
diagnostische als auch therapeutische Fragestellungen von Vorteil. Mögliche An
wendungsgebiete dieser Technologie sind Detektion und Isolation krankhafter Zellen
aus Körperproben, Therapie-begleitendes Monitoring, Drug-Screening und ex vivo
Therapietest von Patientenproben. Weitere Anwendungsgebiete sind Verfahren in der
Stammzelltechnologie, wobei die Stammzellen isoliert, ggf. differenziert bzw. trans
differenziert und zur Heranzüchtung von Ersatzorganen oder aber für regenerative
Prozesse verwendet werden.
Zur tumorspezifischen Expression einer Variante des Grün-Fluoreszinierenden-
Proteins (alphaGFPT204I), werden in einem ersten Schritt Wnt-responsive Reporter
genkonstrukte hergestellt. Die Promotorregionen enthalten drei funktionelle oder
drei nicht-funktionelle Bindungsstellen für LEF-1/TCF-Transkriptionsfaktoren
(CCTTTGATC bzw. CCTTTGGCC), oder Varianten dieser Bindungsstellen
(CCTTTGAA oder CCATTGAA bzw. CCTTTGGA oder CCATTGGA). Zur
Generierung von Wntresponsiven GFP-Reportergenkonstrukten werden in den
ersten Experimenten die beschriebenen Ausgangsvektoren pTOPFLASH-,
pFOPFLASH-, pTOPCAT- und pFOPCAT-Vektoren verwendet (Van De Wetering,
M., Cavallo, R., Dooijes, D., Van Beest, M., Van Es, J., Loureiro, J., Ypma, A.,
Hursch, D., Jones, T., Brjsovec, A., Peifer, M., Mortin, M. & Clevers, H. (1997).
Armadillo coactivates transcription driven by the product of the drosophila segmant
polarity gene dTCF. Cell 88: 789-99; Van De Wetering, M., Oosterwegel, M.,
Dooijes, D. & Clevers, H. (1991). Identification and cloning of TCF-1, a T
lymphocyte specific transcription factor containing a sequence-specific HMG box.
EMBO J 10: 123-32). In weiteren Experimenten wird die Promotorregion durch
Ligation von speziell synthetisierten, doppelsträngigen Oligonukleotiden mit den
Bindungsstellen für LEF-1, PPARδ, myc, etc. ergänzt (siehe unten).
Alle im Folgenden erwähnten, jedoch nicht näher ausgeführten, molekular-
biologischen Standardmethoden wie z. B. Plasmid-DNA Präparationen in analy
tischem Maßstab, Spaltung von DNA mit Restriktionsendonucleasen, Dephosphory
lierung linearisierter DNA, Auffüllen überstehender Enden, Ligation von DNA-
Molekülen, Transformation von Bakterien, Auftrennung von Nukleinsäuren über
Agarosegele, etc., sind prinzipiell in dem Laborbuch von SAMBROCK et al.
beschrieben (Sambrock, J., Fritsch, E. F. & Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: A
laboratory manual. 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring
Harbor, New York).
Im Falle der pTOP-FLASH- und pFOP-FLASH-Vektoren wird das Luciferase-Gen
durch Verdau mit den Restriktionsenzymen NCO1 und NOT1 herausgeschnitten und
die Vektoren anschließend durch Inkubation mit alkalischer Phosphatase dephos
phoryliert. Daraufhin werden die Reaktionsprodukte in Ethidiumbromid-haltigen
Agarosegelen gelelektrophoretisch aufgetrennt, die ca. 3,8 kb große Vektorbande aus
dem Gel ausgeschnitten und die DNA mittels des "Qiaex®II Gel Extraction Kit"
der Firma Qiagen isoliert. Das alphaGFPT204I-Gen wird mittels PCR-Reaktion unter
Einführung der entsprechenden Restriktionsschnittstellen für NCO1 (für den 5'-
gelegenen Primer (5'-CCC GGG CC ATG GCT AGC AAA GGA GAA GAA CTT
TTC AC-3') und NOT1 für den 3'-gelegenen Primer (5'-GGC CGC GGC CGC
TTA TTT GTA GAG CTC ATC CAT GCC-3')) aus dem pKU23-Vektor bzw.
dem alpha+GFPcycle3-Vektor der Firma Maxygen (siehe (Crameri, A., Whitehorn,
E. A., Tate, E. & Stemmer, W. P. C. (1996). Improved Green Fluorescent Protein by
molecular evolution using DNA shuffling. Nature Biotechnology 14: 315-319), der
das alphaGFPT204I Gen enthält, amplifiziert, mit den Restriktionsendonukleasen
NCO1 und Not1 verdaut, durch Phenol/Chloroform-Behandlung aufgereinigt,
präzipitiert (Zugabe von 1/10 Vol 3M NaAc und 2,5 Vol 100% Ethanol), mit 70%
Ethanol gewaschen, getrocknet und in 1 × Tris/EDTA-Puffer aufgenommen.
Anschließend wird das ca. 700 bp große Reaktionsprodukt gelelektrophoretisch
aufgetrennt und aus dem Agarosegel isoliert (siehe oben). Die Ligation des TOP-
bzw. FOP-Vektors mit der amplifizierten alphaGFPT204I-cDNA erfolgte mittels T4-
DNA-Ligase in entsprechendem Mg2+- und ATP-haltigem Puffer. Die
Ligationsansätze werden in Bakterien ("DH5α™ Competent Cells" der Firma
GibcoBRL Life Technologies) transformiert, auf Ampicillin-haltigen LB-Agarplatten
ausgestrichen, gewachsene, Ampicillin-resistente Einzelkolonien wurden zur An
impfung von 5 ml LB-Flüssigkulturen verwendet, die Plasmid-DNA aus ge
wachsenen Einzelkolonien isoliert ("Concert™ Rapid Plasmid Mini Prep System"
der Firma GibcoBRL Life Technologies) durch Restriktionsverdau mit NOT1 und
NCO1 und Sequenzierung ("Big Dye™ Terminator Cycle Sequencing Ready
Reaction" der Firma PE Applied Biosystems) mit mehreren "Sense-" und "Anti-
Sense" Primern analysiert und verifiziert. Die Plasmid-DNA der gewünschten
Sequenz wird anschließend in größeren Mengen produziert und aufgereinigt
("QIAfilter Plasmid Maxi Kit" der Firma Qiagen) und zur Transfektion von SW480
Kolonkarzinomzellen verwendet.
Die Transfektion der Reportergenkonstrukte erfolgt wahlweise mit "Lipofectin®
Reagent", "Lipofectamine Plus™ Reagent" oder "Lipofectamine™ 2000 Reagent"
nach Herstellerangaben der Firma GibcoBRL Life Technologies, wobei die SW480
Zellen vor der Transfektion in 6-well Platten (ca. 300 000 Zellen pro well) ausgesäht
und über Nacht in DMEM, 10% fötales Kälber Serum, 100 µg Penicillin bei 37°C,
90% Luftfeuchtigkeit und 7,5% CO2-Gehalt inkubiert werden. Es werden zwischen
1 µg und 10 µg DNA der Vektoren TOP- und FOP-alphaGFPT204I, sowie zur
Kontrolle des Alpha+GFPcycle3-Vektors mit 10 µl Lipofectin oder Lipofectamin und
90 µl Optimem in Polystyrenröhrchen durchmischt und 1 Stunde bei Raumtemperatur
inkubiert. Anschließend wird 800 µl Optimem hinzugegeben und nach einstündiger
Inkubation zu den mehrfach mit PBS gewaschenen Zellen gegeben und über Nacht
inkubiert. Am nächsten Morgen werden die transfizierten SW480 Zellen erneut mit
PBS gewaschen und wieder in DMEM + 10% FKS inkubiert. Dien mit
Alpha+GFPcycle3 und TOP-alphaGFPT204I transfizierten Zellen beginnen nach
entsprechender Anregung unter dem Fluoreszenzmikroskop (Olympus AX70 mit
Multicontrol-Box 200-3 und analySIS Treibersoftware "Modul Stage") zu leuchten,
während die mit FOP-alphaGFPT204I transfizierten Zellen keine signifikant erhöhte
Fluoreszenz aufwiesen. Diese Befunde bestätigten sich bei der Vermessung der
Fluoreszenzintensitäten im Durchflusszytometer (FACSscan, Becton Dickinson),
welches mit Laser-Anregung für die grüne Fluoreszenz ausgestattet ist. Die
Fluoreszenzintensitäten werden graphisch dargetellt, indem den positiven Signalen
definierte Schwellwerte für Fluoreszenzintensitäten zugeordnet werden. Zur
Optimierung der GFP-Fluoreszenz-Detektion wird der Standart-Fluorescein-Filter
gegebenenfalls durch Breitband-Violett-Filter ersetzt (z. B. U-MBV der Firma
Olympus), die eine Anregung zwischen 340-440 nm und die Detektion ab 475 bzw.
490 nm ermöglichen.
SW480 Zellen überexpremieren auf Grund der Wnt-Signalaktivität den
Transkriptionsfaktor PPARδ (HE T. C., CHAN T. A., VOGELSTEIN B. &
KINZLER K. W. (1999). PPARdelta is an APC-regulated target of nonsteroidal anti
inflammatory drugs. Cell 99: 335-45). Zur Messung der synergistischen Wirkung
von Transkriptionsfaktorbindungsstellen bei der Expression von Reportergenen
werden PPARdelta responsive Elemente in den TOP-alphaGFPT204I- und FOP-
alphaGFPT204I-Vektor kloniert. Hierzu wurden die Oligonukleotide 5'-
CTAGCGTGAGCGCTCACAGGTCAATTCGGTGAGCGCTCACAGG
TCAATTCG-3' (= funktionelle PPARδ-DNA-Bindungsstellen) bzw. 5'- CTAGCGGA
CCAGGACAAAGGTCACGTTCGGACCAGGACAAAGGTCACGTTCG-3'
(= funktionelle PPARα- und PPARγ-DNA-Bindungsstellen) nach Durchmischung mit entsprechend synthetisierten, komplementären Gegenstrang-Oligonukleotiden gleicher Mengen durch Erhitzen und Abkühlen dimerisiert und stromaufwärts, 5'- gelegen von den funktionellen bzw. nicht-funktionellen LEF-1/TCF-Bindungsstellen durch "Blunt-end"-Ligation in die Promotor-Region des Reportergenkonstruktes inseriert. Die Ligationsansätze werden in Bakterien transformiert, auf Ampicillin- haltigen LB-Agarplatten ausgestrichen, die Plasmid-DNA von gewachsenen Einzelkolonien isoliert, durch Restriktionsverdaus mit NOT1 und NCO1 und Sequenzierung mit mehreren "Sense-" und "Anti-Sense"-Primern analysiert und verifiziert. Die Plasmid-DNA der gewünschten Sequenz wird anschließend in größeren Mengen produziert und aufgereinigt und zur Transfektion von SW480 Kolonkarzinomzellen mit Lipofectin oder Lipofectamin in der oben beschriebenen Art und Weise verwendet. Die Vermessung der Fluoreszenzintensitäten im Durchflusszytometer ergibt einen meßbaren synergistischen Effekt hinsichtlich einer gesteigerten alphaGFPT204I-Expression bzw. Fluoreszenzintensität in Anwesenheit funktioneller LEF-1/TCF- und PPARδ-DNA-Bindungsstellen. Darüber hinaus zeigt sich, dass eine 10-stündige Inkubation transfizierter Zellen mit Nicht-Steroidalen Anti-Inflammatorischen Substanzen (i. e. 300 µM Sulindac Sulfid, Indomethacin und Aspirin) die beobachtete Aktivierung des FOP-alphaGFPT204I-Reportergens in Anwesenheit funktioneller PPARδ-DNA-Bindungsstellen signifikant inhibiert, so dass die alphaGFPT204I-Expression nahezu auf den Hintergrundslevel der FOP- alphaGFPT204I-Reportergenaktivität ohne funktionelle PPARδ-DNA-Bindungs stellen zurückgeht.
TCAATTCG-3' (= funktionelle PPARδ-DNA-Bindungsstellen) bzw. 5'- CTAGCGGA
CCAGGACAAAGGTCACGTTCGGACCAGGACAAAGGTCACGTTCG-3'
(= funktionelle PPARα- und PPARγ-DNA-Bindungsstellen) nach Durchmischung mit entsprechend synthetisierten, komplementären Gegenstrang-Oligonukleotiden gleicher Mengen durch Erhitzen und Abkühlen dimerisiert und stromaufwärts, 5'- gelegen von den funktionellen bzw. nicht-funktionellen LEF-1/TCF-Bindungsstellen durch "Blunt-end"-Ligation in die Promotor-Region des Reportergenkonstruktes inseriert. Die Ligationsansätze werden in Bakterien transformiert, auf Ampicillin- haltigen LB-Agarplatten ausgestrichen, die Plasmid-DNA von gewachsenen Einzelkolonien isoliert, durch Restriktionsverdaus mit NOT1 und NCO1 und Sequenzierung mit mehreren "Sense-" und "Anti-Sense"-Primern analysiert und verifiziert. Die Plasmid-DNA der gewünschten Sequenz wird anschließend in größeren Mengen produziert und aufgereinigt und zur Transfektion von SW480 Kolonkarzinomzellen mit Lipofectin oder Lipofectamin in der oben beschriebenen Art und Weise verwendet. Die Vermessung der Fluoreszenzintensitäten im Durchflusszytometer ergibt einen meßbaren synergistischen Effekt hinsichtlich einer gesteigerten alphaGFPT204I-Expression bzw. Fluoreszenzintensität in Anwesenheit funktioneller LEF-1/TCF- und PPARδ-DNA-Bindungsstellen. Darüber hinaus zeigt sich, dass eine 10-stündige Inkubation transfizierter Zellen mit Nicht-Steroidalen Anti-Inflammatorischen Substanzen (i. e. 300 µM Sulindac Sulfid, Indomethacin und Aspirin) die beobachtete Aktivierung des FOP-alphaGFPT204I-Reportergens in Anwesenheit funktioneller PPARδ-DNA-Bindungsstellen signifikant inhibiert, so dass die alphaGFPT204I-Expression nahezu auf den Hintergrundslevel der FOP- alphaGFPT204I-Reportergenaktivität ohne funktionelle PPARδ-DNA-Bindungs stellen zurückgeht.
Zur Isolierung von fluoreszinierenden SW480 Zellen, die in der oben beschriebenen
Art und Weise mit TOP-alphaGFPT204I oder Alpha+GFPcycle3 transfiziert werden,
werden die SW480 Zellen durch Zugabe von Trypsinlösung (0,5 mM EDTA und 2‰
Trypsin in PBS) von der Unterlage abgelöst und in DMEM + 10% FKS resuspendiert.
Die Zellen werden anschliessend wahlweise in ISOTON II (Coulter) aufgenommen
oder direkt in einem Durchflusszytometer (FACSscan, Becton Dickinson)
vermessen. Fluoreszinierende Zellen ab einer definierten Signalintensität werden
isoliert und in definiertem Zahlenverhältnis mit Zeilsuspensionen von transfizierten
oder nicht-transfizierten Zellen anderer Ursprungsgewebe (i. e. nicht Kolon; z. B.
IIA1.6 B Zellen, C57MG Brusttumorzellen, Jurkat Zellen, BW5147 T Zellen)
gemischt, die keine Wnt-Signalaktivität besitzen und demzufolge in Experimenten
(wie in Beispiel 1 dargelegt) keine signifikant erhöhten Fluoreszenzen nach
Transfektion mit TOP-alphaGFPT204I im Vergleich zur Fluoreszenz nach
Transfektion mit FOP-alphaGFPT204I aufweisen. Diese heterogenen Zellgemische
werden anschließend erneut in dem Durchflusszytometer vermessen und die Zahl der
detektierten, fluoreszinierenden Zellen mit der Zahl der ursprünglich zugesetzten
Anzahl fluoreszinierender SW480 Zellen verglichen (= "Recovery Rate").
HeLa Zervixkarzinomzellen, 3T3 Fibroblasten oder SV40-transformierte COS Zellen
werden in unterschiedlichen Mengenverhältnissen mit SW480 Kolonkarzinomzellen
gemischt oder zur Kontrolle als homogene Zellpopulation belassen. Danach werden
je 300 000 Zellen des heterogenen Zellgemisches bzw. der homogenen Zell
populationen in die Vertiefungen von 6-well Platten ausgesäht und über Nacht in
DMEM, 10% Fötales Kälber Serum, 100 µg Pennicillin bei 37°C, 90% Luft
feuchtigkeit und 7,5% CO2-Gehalt inkubiert. Die anschließende Transfektion der
Plasmide TOP-, FOP-alphaGFPT204I und Alpha+GFPcycle3 erfolgt, wie in
Beispiel 1 beschrieben, mittels der Lipofectin und Lipofectamin Reagentien. Zu
unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Transfektion (4 Stunden, 16 Stunden, 24
Stunden und 48 Stunden) werden die Zellen durch Trypsin-Behandlung abgelöst und
mittels Durchflusszytometrie vermessen. Die Zahl der detektierten,
fluoreszinierenden Zellen je Ansatz wird mit der Zahl der ursprünglich zugesetzten
Anzahl SW480 Zellen verglichen, um die Spezifität und Sensitivität des
Tumorzellnachweises zu bestimmen.
Zur Erhöhung der Transfektionseffizienzen werden adenovirale Reportergenkonstrukte
mittels des "Adeno-X™ Expression Systems" der Firma Clontech (Kat. Nr. K1650-
1) hergestellt. Hierzu werden die Promotorregion einschließlich der alphaGFPT204I-
Sequenz mittels PCR-Reaktion aus den Vektoren TOP- und FOP-alphaGFPT204I
amplifiziert. Dabei werden Primer verwendet, die in die Restriktionsschnittstellen für
die Enzyme I-CEU I und NOT1 an das 5'- bzw. 3'-Ende des Reaktionsproduktes
einführen (5'-gelegener "Sense"-Primer: 5'-CCC GGG TAA CTA TAA CGG TCC
TAA GGT AGC GAG CAA TTG TTG TTA ACT TGT TTA TTG CAG CTT ATA
ATG G-3'; 3'-gelegener "Anti-Sense"-Primer: 5'-GGC CGC GGC CGC TTA TTT
GTA GAG CTC ATC CAT GCC-3'). Die Reaktionsprodukte werden anschließend
mit den Restriktionsendonukleasen I-CEU I und NOT1 verdaut, durch Phenol/Chloro
form-Behandlung aufgereinigt, präzipitiert (Zugabe von 1/10 Vol 3M NaAc und
2,5 Vol 100% Ethanol), mit 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und in 1 × Tris/EDTA-
Puffer aufgenommen. Nach gelelektrophoretischer Aufreinigung wird das Reaktions
produkt aus dem Agarosegel isoliert. Der von der Firma Clontech bereitgestellte
pShuttle-Vektor wird entsprechend mit den Enzymen I-CEU I und NOT1 verdaut,
dephosphoryliert, gelelektrophoretisch aufgetrennt und der Vektor (wie in Beispiel 1
beschrieben) aus dem Gel extrahiert. Die Ligation des pShuttle-Vektors mit der ampli
fizierten TOP- bzw. FOP-alphaGFPT204I-Sequenz erfolgt mittels T4-DNA-Ligase in
entsprechendem Mg2+- und ATP-haltigem Puffer. Die Ligationsansätze werden
anschließend in Bakterien transformiert, auf Ampicillin-haltigen LB-Agarplatten
ausgestrichen, die Plasmid-DNA aus gewachsenen Einzelkolonien isoliert durch
Restriktionsverdaus und Sequenzierung mit mehreren "Sense-" und "Anti-Sense"-
Primern analysiert und verifiziert. Die Plasmid-DNA der gewünschten Sequenz wird in
größeren Mengen produziert und aufgereinigt.
Die anschließenden Schritte erfolgen gemäß Herstellerangaben der Firma Clontech
(siehe "Adeno-X™ Expression System User Manual"). Die TOP- bzw. FOP-
alphaGFPT204I-Sequenz wird aus dem pShuttle-Vektor mittels der Restriktions
enzyme I-CEUI und PI-SCEI herausgeschnitten und mit der entsprechend verdauten
Adeno-X Virus DNA (nach den üblichen molekularbiologischen Zwischenschritten
wie oben beschrieben) ligiert. Die in vitro Ligation wird anschließend mit dem
Restriktionsenzym SWAI verdaut und der entsprechende Ansatz zur Transformation
von Bakterien verwendet. DNA-Präparationen von Ampicillin-resistenten Trans
formanden werden mittels geeigneter Restriktionsverdaus und Sequenzierungen mit
mehreren "Sense-" und "Anti-Sense" Primern analysiert und verifiziert. Die rekom
binante adenovirale Plasmid DNA der gewünschten Sequenz wird anschließend
entsprechend den Angaben im Clontech Handbuch in kleinem Maßstab präpariert und
mit dem NucleoBond® Plasmid Maxi Kit gemäß den Angaben der Firma Clontech in
größerem Maßstab produziert und aufgereinigt. Die aufgereinigte Plasmid-DNA wird
mit dem Restriktionsenzym PACI verdaut und nach Aufreinigung des Restriktions
ansatzes zur Transfektion von HEK 293 Zellen mittels Lipofectamin oder Lipofectin
verwendet. Nach 4 bis 7 Tagen löst sich ein Großteil der Zellen ab, so dass der Über
stand, der rekombinante Adenoviren mit der TOP- bzw. FOP-alphaGFPT204I-
Sequenz enthält, nach Zentrifugation zur Infektion der Zielzellen verwendet werden
kann.
Entsprechend den Beispielen 2 und 3 werden zunächst homogene Zellpopulationen von
SW480 Zellen mit den rekombinanten Adenoviren inkubiert. Hierzu werden ca. 5×105
SW480 Zellen in 100 mm Zellkulturschalen ausgesäht, so dass sie über Nacht (oder
auch für bis zu 48 Stunden) an den Zellkulturschalenboden adhärieren können. An
schließend wird 1 ml des Virus-haltigen Mediums für ca. 1 Stunde zu den Zellen
gegeben. Danach werden die Zellen einmal mit DMEM + 10% FKS gewaschen und für
bis zu 48 Stunden im Brutschrank inkubiert. Nach 2, 4, 8, 16, 24 und 48 Stunden wird
die GFP-Expression mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie ver
messen. Die Zahl der GFP-expremierenden Zellen nach Infektion mit der TOP-
alphaGFPT204I-Sequenz ist extrem hoch (70-95% nach 24 Stunden), während Zellen,
die mit der FOP-alphaGFPT204I-Sequenz infiziert werden keine signifikante GFP-
Expression aufweisen. Die Infektion von heterogenen Zellgemischen (siehe oben) führt
zur spezifischen Überexpression des GFP-Gens, nach Infektion mit der TOP-
alphaGFPT204I-Sequenz, in den Kolonkarzinomzellen, die eine aktive Wnt-Signal
aktivität besitzen. In einem nächsten Schritt werden SW480 Zellen in unterschiedlichen
Mengen zu jeweils 1 ml von humaner Vollblutproben von gesunden Menschen gegeben
und die Zellsuspension für 1 Stunde mit 1 ml Virus-haltigem Medium versetzt. Die
Proben werden durch mehrere vorsichtige Zentrifugationsschritte und Medienwechsel
gewaschen und für weitere 12 bis 18 Stunden bei 37°C unter leichter Bewegung im
Brutschrank inkubiert. Anschließend wird die GFP-Expression mittels Durchfluss
zytometrie vermessen und die Zahl der positiven Fluoreszenzsignale mit der Zahl der
jeweils zugegebenen SW480 Zellen korelliert. Darüber hinaus werden die
fluoreszierenden Zellen mittels entsprechender Schwellwertsetzungen isoliert und
durch rein morphologische Betrachtung, bzw. mittels eines immuncytochemischen
Standartverfahrens der Firma Miltenyi Biotec (Kat. Nr. 603-01) unter Verwendung
hochspezifischer Cytokeratin-FITC Antikörper und Anti-Fitc Alkalischer Phosphatase
gemäß den Herstellerangaben als epitheliale (i. e. Kolonkarzinonizellen) identifiziert.
Zur tumorspezifischen Expression eines Fusionsproduktes aus löslichem Thrombo
plastin (= soluble Tissue Factor; Aminosäure 1 bis 220) und der Leuzin-Reiß
verschluss Domäne (= Leucin-Zipper) des Hefe Transkriptionsfaktors GCN4,
werden in einem ersten Schritt Wnt-responsive Reportergenkonstrukte hergestellt.
Die Promotorregionen enthalten drei funktionelle oder drei nicht-funktionelle
Bindungsstellen für LEF-1/TCF-Transkriptionsfaktoren (CCTTTGATC bzw.
CCTTTGGCC), oder Varianten dieser Bindungsstellen (CCTTTGAA oder
CCATTGAA bzw. CCTTTGGA oder CCATTGGA). Zur Generierung von Wnt-
responsiven sTF-LZ-Reportergenkonstrukten werden in den ersten Experimenten die
beschriebenen Ausgangsvektoren pTOPFLASH-, pFOPFLASH-, pTOPCAT- und
pFOPCAT-Vektoren verwendet (Van De Wetering, M., Cavallo, R., Dooijes, D.,
Van Beest, M., Van Es, J., Loureiro, J., Ypma, A., Hursch, D., Jones, T., Brjsovec,
A., Peifer, M., Mortin, M. & Clevers, H. (1997). Armadillo coactivates transcription
driven by the product of the drosophila segmant polarity gene dTCF. Cell 88: 789-99;
Van De Wetering, M., Oosterwegel, M., Dooijes, D. & Clevers, H. (1991).
Identification and cloning of TCF-1, a T lymphocyte specific transcription factor
containing a sequence-specific HMG box. EMBO J 10: 123-32). Im Falle der pTOP-
FLASH- und pFOP-FLASH-Vektoren wird das Luciferase-Gen durch Verdau mit
den Restriktionsenzymen NCO1 und NOT1 herausgeschnitten und die Vektoren an
schließend durch Inkubation mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliert.
Daraufhin werden die Reaktionsprodukte in Ethidiumbromid-haltigen Agarosegelen
gelelektrophoretisch aufgetrennt, die ca. 3,8 kb große Vektorbande aus dem Gel
ausgeschnitten und die DNA mittels des "Qiaex®II Gel Extraction Kit" der Firma
Qiagen isoliert.
Alle im Folgenden erwähnten, jedoch nicht näher ausgeführten, molekularbiolo
gischen Standardmethoden wie z. B. Plasmid-DNA Präparationen in analytischem
Maßstab, Spaltung von DNA mit Restriktionsendonucleasen, Dephosphorylierung
linearisierter DNA, Auffüllen überstehender Enden, Ligation von DNA-Molekülen,
Transformation von Bakterien, Auftrennung von Nukleinsäuren über Agarosegele,
etc., sind prinzipiell in dem Laborbuch von SAMBROCK et al. beschrieben
(Sambrock, J., Fritsch, E. F. & Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: A laboratory
manual. 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New
York).
Die cDNA der Leuzin-Reißverschluss Domäne wird mittels Polymerasekettenreaktion
(PCR) aus genomischer Hefe DNA unter Verwendung der Primerpaare 5'-ATC GGC
GGC GCC GCC ATG AAA CAA CTT GAA GAC AAG-3' (kodierender Sense-
Primer) und 5'-GAT CAA AGC TTG CGG CCG CTC AGC GTT CGC CAA CTA A-
3' (Anti-Sense-Primer) amplifiziert. Der kodierende Sense-Primer enthält dabei eine
Nar1-Restriktionsenzymschnittstelle und kodiert darüber hinaus für eine kurze Linker-
Sequenz Gly-Gly-Ala-Ala, die stromaufwärts von der Leuzin-Reißverschluss-Sequenz
Met-Lys-Asn-Leu . . . liegt. Der Anti-Sense Primer enthält Schnittstellen für die
Restriktionsenzyme Hind3 und Not1, für spätere Klonierungsschritte. Die cDNA für
lösliches Thromboplastin (Aminosäure 1-220 mit und ohne Signalsequenz) wird
mittels PCR unter Verwendung der kodierenden Sequenzprimer 5'-GAA GAA GGG
ATC CTG GTG CCT CGT GGT TCT GCC ATG GGC ACT ACA AAT ACT GTG
GCA GC-3', 5'-GAA GAA GGG ATC CTG GTG CCT CGT GGT TCT GCC ATG
GAG ACC CCT GCC TGG CCC CGG G-3' und der Anti-Sense Primer 5'-GGC
GGC GCC GCC TAT TTC TCG AAT TCC CC-3' (Codon 226 → F), 5'-GGC GGC
GCC GCC TAT TTC TCG CCC ATA CAC TCT ACC GGG CTG TCT G-3' (Codon
220 → G), 5'-GGC GGC GCC GCC TAT TTC TCC TCT ACC GGG CTG TCT
GTA CTC TTC CGG-3' (Codon 217 → E) amplifiziert. Die Sense-Primer enthalten
dabei Schnittstellen für die Restriktionsenzyme BamH1 und Not1 für spätere
Klonierungsschritte. Die Anti-Sense Primer enthalten eine Nar1-Schnittstelle für die
Fusion mit der Leuzin-Reißverschluss Domäne von GCN4 (siehe oben). Die PCR-
Fragmente wurden nach Verdau mit den entsprechenden Restriktionsenzymen,
Aufreinigung durch Phenol/Chloroform-Behandlung, Präzipitation (Zugabe von 1/10
Vol 3M NaAc und 2,5 Vol 100% Ethanol) und Waschen mit 70% Ethanol, getrocknet
und in 1 × Tris/EDTA-Puffer aufgenommen.
Anschließend werden die Reaktionsprodukte gelelektrophoretisch aufgetrennt und
aus den Agarosegelen isoliert (siehe oben). Die Ligation mit dem BamH1- und
Hind3-geschnittenen, dephosphorylierten, gelelektrophoretisch aufgetrennten und
anschließend isolierten pTrcHisC-Vektor (siehe Stone, M. J., Ruf, M., Miles, D. J.,
Edgington, T. S. & Wright, P. E. (1995). Biochem J. 310: 605-614) mit den PCR-
Produkten erfolgt mittels T4-DNA-Ligase in entsprechendem Mg2+- und ATP-
haltigem Puffer. Die Ligationsansätze werden in Bakterien ("DH5α™ Competent
Cells" der Firma GibcoBRL Life Technologies) transformiert, auf Ampicillin-
haltigen LB-Agarplatten ausgestrichen, gewachsene, Ampicillin-resistente
Einzelkolonien werden zur Animpfung von 5 ml LB-Flüssigkulturen verwendet, die
Plasmid-DNA aus gewachsenen Einzelkolonien isoliert ("Concert™ Rapid Plasmid
Mini Prep System" der Firma GibcoBRL Life Technologies) durch Restriktions
verdaus und Sequenzierung ("Big Dye™ Terminator Cycle Sequencing Ready
Reaction" der Firma PE Applied Biosystems) mit mehreren "Sense-" und "Anti-
Sense" Primern analysiert und verifiziert. Die Plasmid-DNA der gewünschten
Sequenz wird anschließend in größeren Mengen produziert, aufgereinigt ("QIAfilter
Plasmid Maxi Kit" der Firma Qiagen) und zur Expression des Fusionsproteins in
Escherichia coli verwendet.
Bakteriell expremiertes Protein wird mittels Guanidium Hydrochlorid (GuHCl) aus den
Bakterien extrahiert und nach Aufreinigung durch Ni-Chelat Säulen (Ni-NTA von
Qiagen) mittels eines linearen Gradientens von Puffer A (6 M GuHCl; 0,5 M NaCl;
20 mM Natriumphosphat; pH 8) und Puffer B (0,8 M GuHCl; 0,3 M NaCl; 50 mM Tris-
HCl; 2,5 mM reduzierendes Glutathion; 0,5 M oxidierendes Glutathion; pH 8) auf der
Säule gefaltet. Nach intensivem 04929 00070 552 001000280000000200012000285910481800040 0002010133930 00004 04810Waschen mit 10 mM Tris/20 mM NaCl/pH 7.5 wird das
Protein in dem gleichen Puffer, der zusätzlich 50 mM Imidazol enthält, eluiert und dient
dem Nachweis der Funktionalität des Fusionsproteins bzw. als Positiv-Kontrolle in
Blutgerinnungsassays.
Durch Verdau mit den Restriktionsendonukleasen Nco1 und Not1 wird das
Fusionsgen aus dem pTrcHisC-sTF-LZ-Expressionsvektors herausgeschnitten und in
die entsprechend verdauten TOP-/FOP-Vektoren (siehe oben) ligiert. Nach Trans
formation in Bakterien werden auf Agarplatten gewachsene Einzelkolonien in der
oben beschriebenen Art und Weise vermehrt und analysiert. Bakterienklone, die die
gewünschten Nukleinsäurekonstrukte enthalten, werden in größeren Mengen produ
ziert, die jeweilige Plasmid-DNA aufgereinigt und zur Transfektion von SW480
Zellen verwendet.
Die Transfektion der Reportergenkonstrukte erfolgt wahlweise mit "Lipofectin®
Reagent", "Lipofectamine Plus™ Reagent" oder "Lipofectamine™ 2000 Reagent"
nach Herstellerangaben der Firma GibcoBRL Life Technologies, wobei die SW480
Zellen vor der Transfektion in 6-well Platten (ca. 300 000 Zellen pro well) ausgesät
und über Nacht in DMEM, 10% Fötales Kälber Serum, 100 µg Penicillin bei 37°C,
90% Luftfeuchtigkeit und 7,5% CO2-Gehalt inkubiert werden. Es werden zwischen
1 µg und 10 µg DNA der Vektoren TOP- und FOP-sTF-LZ mit 10 µl Lipofectin oder
Lipofectamin und 90 µl Optimem in Polystyrenröhrchen durchmischt und 1 Stunde bei
Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird 800 µl Optimem hinzugegeben und nach
einstündiger Inkubation zu den mehrfach mit PBS gewaschenen Zellen gegeben und
über Nacht inkubiert. Am nächsten Morgen werden die transfizierten SW480 Zellen
erneut mit PBS gewaschen und wieder in DMEM + 10% FKS inkubiert. Die Zell
kulturüberstände von Parallelansätzen der mit FOP-/-TOP-sTF-LZ transfizierten
SW480 Zellen werden zu unterschiedlichen Zeitpunkten (12 Stunden, 24 Stunden und
36 Stunden nach Transfektion) abgenommen, durch Zentrifugation bei 10 000*g von
Zellresten befreit. Anschließend werden die Überstände in ersten Experimenten durch
Zugabe von TrisHCl (pH 7,4) und EDTA auf eine Konzentration von 50 mM bzw.
10 mM eingestellt, durch Filterzentrifugation ("S1Y10 spiral ultracentrifugation
cartridge" der Firma Amicon) zehnfach aufkonzentriert. Diese aufkonzentrierten
Zellkulturüberstände werden entweder bei -80°C gelagert oder direkt für Blutge
rinnungsassays eingesetzt. Überstände, die sTF217-LZ, sTF220-LZ oder sTF226-LZ ent
hielten, werden zu Aliqots von gepoolten humanen Blutproben (Citrat-Vollblut)
gegeben, die teilweise zusätzlichen Faktor VIIa und 28 µM eines Phosphatidyl
serin/Phosphatidylcholin-Gemisches (40% PS zu 60% PC in TBS mit 0,1% BSA)
enthalten. Die Zeiträume bis zur Gerinnung der unterschiedlichen Blutprobenansätze
nach Rekalzifizierung werden manuell gemessen. Es zeigt sich, dass die Zugabe von
Zellkulturüberständen der mit TOP-sTF-LZ transfizierten SW480 Zellen zu einer
signifikant beschleunigten Blutgerinnung der jeweiligen Blutprobe führt, wobei sTF217-
LZ und sTF220-LZ besonders aktiv sind. Im Gegensatz dazu sind die Blutgerinnungs
zeiten nach Zugabe von Zellkulturüberständen der mit FOP-sTF-LZ transfizierten
SW480 Zellen nicht signifikant gegenüber Kontrollansätzen verändert, denen keine
Zellkulturüberstände zugesetzt werden.
Zunächst werden SW480 Zellen mit den Plasmiden Alpha+GFPcycle3 und TOP-
sTF-LZ oder FOP-sTF-LZ in der in Beispiel 1 beschriebenen Art und Weise
kotransfiziert. Danach werden die SW480 Zellen durch Zugabe von Trypsinlösung
(0,5 mM EDTA und 2‰ Trypsin in PBS) von der Unterlage abgelöst und in DMEM
+ 10% FKS resuspendiert. Fluoreszinierende Zellen ab einer definierten Signalinten
sität werden mittels Durchflusszytometrie isoliert (siehe oben) und in definiertem
Zahlenverhältnis zu Aliquots von gepoolten, humanen Blutproben zugegeben. Die
Zeiträume bis zur Gerinnung der unterschiedlichen Blutprobenansätze nach
Rekalzifizierung werden manuell gemessen. Es zeigt sich, dass die Abnahme der
Blutgerinnungszeiten in einem direkten Verhältnis zur zugesetzten, mit TOP-sTF-LZ
transfizierten SW480-Zellmenge steht. Die Zugabe von FOP-sTF-LZ transfizierten
SW480-Zellen zeigt hingegen keinen derart drastischen Effekt hinsichtlich der Ver
kürzung der Blutgerinnungszeiten.
Claims (8)
1. Verfahren zur Detektion krankheits-assoziierter Zellen aus Körperproben,
dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen der Körperprobe mit Nuklein
säurekonstrukten transfiziert oder infiziert werden, die folgende Komponenten
beinhalten:
- a) ein Promoter-Element mit mindestens einer DNA-Bindungsstelle für Transkriptionsfaktoren, die auf Grund der krankhaften Veränderung der Zellen eine veränderte Aktivität aufweisen und
- b) ein Reportergen, das die Detektion der krankhaften Zellen ermöglicht und anschliessend die transfizierten oder infizierten Zellen detektiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nuklein
säurekonstrukte Bindungsstellen für die Transkriptionsfaktoren oder respon
sive Elemente aus der Gruppe TCF/LEF-1, jun, fos, myc, max, myb, E2F,
DP1, CREB, p53, NFkB, NFAT, PPAR, ETS, ELK1, ATF, DPC, SMAD,
CHOP, MEF, MADH4, GR, ER, STAT, SRF, ISRE, SRE, HSE, AP1, CRE
enthalten.
3. Verfahren nach Anspruch 1-2, dadurch gekennzeichnet, dass die Reporter
gene auf Grund ihrer enzymatischen, fluoreszenten oder strukturellen
Eigenschaften nachgewiesen werden können.
4. Verfahren nach Anspruch 1-2, dadurch gekennzeichnet, dass die Reporter
gene auf Grund der Aktivierung oder Inhibierung von enzymatischen
Kaskaden nachgewiesen werden können.
5. Verfahren nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass die isolierten
Zellen mit Substanzen in Kontakt gebracht werden, die das Verhalten der
Zellen hinsichtlich Proliferation, Differenzierung, Apoptose, Motilität und
Stoffwechselaktivität verändern könnten.
6. Verfahren nach Anspruch 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass die Körper
proben krebsartig veränderte Zellen enthalten.
7. Verfahren nach Anspruch 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass die Promotor
region durch veränderte Aktivitäten der Wnt- oder Ras-Signaltrans
duktionskaskade sowie durch die Transkriptionsfaktoren myc und p53
beeinflusst werden.
8. Kit enthaltend die Reagenzien zur Durchführung des Verfahrens nach einem
der Ansprüche 1-6.
Priority Applications (7)
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EP02712960A EP1385994A2 (de) | 2001-04-02 | 2002-03-28 | Verfahren zur spezifischen detektion, isolation und charakterisierung von zellen aus körperproben durch transfektion von nukleinsäurekonstrukten |
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AU2002244757A AU2002244757A1 (en) | 2001-04-02 | 2002-03-28 | Method for specifically detecting, isolating and characterizing cells from body samples by transfecting nucleic acid constructs |
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US12/578,618 US20100099108A1 (en) | 2001-04-02 | 2009-10-14 | Method for Detecting, Isolating, and Characterizing Cells from Body Samples by Transfection with Nucleic Acid Constructs |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8127 | New person/name/address of the applicant |
Owner name: BAYER HEALTHCARE AG, 51373 LEVERKUSEN, DE |
|
8139 | Disposal/non-payment of the annual fee |