ES2564659T3 - Método para proveer fragmentos de ADN derivados de una muestra archivada - Google Patents

Abstract

Un método para amplificar ADN derivado de una muestra archivados por reacción en cadena de la polimerasa, que comprende amplificar ADN en una etapa de amplificación de ADN que comprende el uso de una concentración de polimerasa en el rango de 0.15 a 0.3 U/μl y al menos un parámetro de amplificación de ADN seleccionado del grupo que consiste de: una concentración de cada nucleótido en el rango de 200 a 800 μmo/l; y un tiempo de una etapa de elongación en el rango de 0.1 a 1.0 s / pb.

Description

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En una realización preferida de la invención la etapa de amplificación se lleva a cabo con el uso de ADN polimerasa y comprende lo siguiente: A) La concentración de ADN polimerasa está en el rango de 0.15-0.3 U/µl de la mezcla de reacción. B) La concentración de cada nucleótido está en el rango de 200-800 µmol/l. Por lo tanto la concentración de cloruro de magnesio (MgCl2) en la mezcla de reacción se ajusta a la concentración de nucleótidos como es bien conocido por los experimentados en la técnica. C) El tiempo para elongar el ADN de plantilla está en el rango de 0.1

1.0 s/bp del ADN de plantilla. Este tiempo usualmente comprende para un PCR la etapa de elongación así como la etapa de fusión si el caso. Si la fusión se lleva a cabo a una temperatura por debajo de 53ºC, este tiempo corresponde solamente a la etapa de elongación.

En una realización, el método de la invención incluye un método para amplificar ADN derivado de una muestra archivada, que comprende lo siguientes:

-la concentración de polimerasa está en el rango de 0.15-0.3 U/µl,

-la concentración de cada nucleótido está en el rango de 200-800 µmol/l,;

-el tiempo de la etapa de elongación está en el rango de 0.1-1.0 s/bp.

En una realización particularmente preferida la etapa de amplificación comprende uno o más de los siguientes: A) Una concentración de polimerasa en el rango de 0.08-0.25 U/µl, preferiblemente la concentración es 0.15 U/µl en la mezcla de reacción. B) La concentración de cada nucleótido está en el rango de 350-650 µmol/l, preferiblemente la concentración de cada nucleótido es 400 µmol/l en la mezcla de reacción. Como ya se explicó anteriormente la concentración de cloruro de magnesio (MgCl2) en la mezcla de reacción se ajusta por lo tanto a la concentración de los nucleótidos como es bien conocido por los expertos en la técnica. C) El tiempo para elongar el ADN de plantilla está en el rango de 0.25-0.75 s/bp del ADN de plantilla, preferiblemente es 0.5 s/bp del ADN de plantilla. Como ya se describió, este tiempo comprende usualmente para un PCR en la etapa de elongación así como la etapa de fusión si el caso. Si la fusión se lleva a cabo a temperaturas por debajo de 53ºC, este tiempo corresponde solamente a la etapa de elongación.

En una realización preferida, la etapa de amplificación comprende uno o más de los siguientes:

-la concentración de polimerasa es 0.15 U/µl,

-la concentración de cada nucleótido es 400 µmol/l,

-el tiempo de la etapa de elongación es 0.5 s/bp.

En una realización preferida de la invención, la etapa de amplificación se lleva a cabo con el fin de amplificar un fragmento definido, una subfracción de fragmentos o para amplificar el genoma completo. Para esto, puede usarse uno o más de los métodos tal como son conocidos para los experimentados en la técnica. Para esto, la etapa de amplificación puede ser llevada a cabo mediante reacciones de amplificación que no son métodos basados en PCR por ejemplo, por la técnica NASBA/TMA. Pero más preferiblemente, se usan los métodos de reacción en cadena mediada por ligasa (LCR), y en particular la reacción en cadena de polimerasa (PCR).

Preferiblemente, tal amplificación se utiliza para un enriquecimiento del ADN de interés que lleva la información epigenómica de la muestra archivada. Después de esto puede ejecutarse cualquier método para análisis por metilación, en particular, el método de secuenciación por bisulfito, el método COBRA, el método Ms-SNuPE (Extensión de Cebador de Nucleótido Individual Sensible a Metilación), el método MSP (metilación Específico para Metilación), el método MSP anidado, el método HeavyMetil™, el método MetiLight™, o el ensayo QM.

Adicionalmente, también se prefiere que después de una amplificación de un fragmento definido, una subfracción de fragmentos o el genoma completo el ADN amplificado es sometido a análisis adicionales, por ejemplo el análisis de mutaciones puntuales o SNP.

En principio, de acuerdo con la invención es posible que las mezclas de reacción de la amplificación comprendan más de dos cebadores. Por lo tanto la amplificación dará como resultado más de un amplicón. En caso de que la amplificación se lleve a cabo por PCR, tal procedimiento es conocido como PCR multiplex por los experimentados en la técnica. Tal procedimiento es en particular ventajoso si solamente hay disponibles pequeñas cantidades de ADN. Adicionalmente tiene también la ventaja de una reducción de costes, disminución del esfuerzo de manipulación y acortamiento del experimento, por ejemplo, resultados obtenidos más tempranamente.

Tratamiento con bisulfito

En una realización, la muestra lisada es sometida entonces directamente a tratamiento con bisulfito debido a la pequeña cantidad de material de partida y por lo tanto de ADN. Para el tratamiento con bisulfito, se agregan a la tapa 9-70 µl, preferiblemente 12-52 µl, y lo más preferiblemente 38 µl de solución de bisulfito. Se utiliza una solución de

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que simultáneamente el ADN no metilado y el ADN metilado son enriquecidos mientras que el ADN sin o con solo unas pocas posiciones CpG es removido.

Puede lograrse un enriquecimiento por proteínas cuya metilación enlace específicamente a ADN y también mediante el uso de sus dominios o péptidos. Tales proteínas pueden ser, por ejemplo MeCP2, MBD1, MBD2, MBD4 y Kaiso. Esta última enlaza la secuencia específicamente a saber sobre posiciones CpGpCpG simétricas metiladas. A manera de ejemplo, el dominio de enlazamiento Metilo-CpG de la proteína MeCP2 o el dominio CXXC-3 de la proteína MBD1 se mencionan como dominios adecuados para enriquecimiento (para una revisión: Shiraishi et al., Anal Biochem. 2004 Jun 1; 329 (1):1-10; Hendrich and Tweedie, Trends Genet. 2003 May, 19 (5): 269-77; Jørgensen et al., Molecular and Cellular Biology, 2004, 3387-3395).

Típicamente, las proteínas, dominios o péptidos son enlazados a una superficie sólida por ejemplo sobre perlas que permiten una separación por medio de procedimientos por lotes o por una cromatografía de columna (Cross et al., Nature Genetics, 1994 (6) 236-244; Shiraishi et al., Anal Biochem. 2004 Jun 1; 329 (1):1-10). Los métodos bioquímicos que tienen que ser aplicados son conocidos por los experimentados en la técnica. Estos puede incluir por ejemplo el uso de marcadores de biotina o histidina (por ejemplo, Gretch et al., Anal Biochem., 1987, (163) 270-7; Janknecht et al., Prc Nat. Acad Sci, 1991, (88) 8972-6).

Además, un enriquecimiento también puede ser logrado por anticuerpos específicos de la metilación por ejemplo por medio del anticuerpo 5-metilcitosina disponible de Abcam Inc. De nuevo el enriquecimiento puede ser llevado a cabo en un procedimiento por lotes o por cromatografía de columna. Los detalles son conocidos por las personas experimentadas en el arte (por ejemplo: Fisher et al., Nucleic Acids Res. 2004, 32(1), 287-97). Por otro lado, un enriquecimiento también puede ser logrado por inmunoprecipitación con anticuerpos específicos de la metilación y anticuerpos secundarios adecuados, seguido por un tratamiento con proteinasa K.

Otra variante de enriquecimiento es la inmunoprecipitación por cromatina (CHIP). Los detalles son conocidos por los expertos en la técnica (por ejemplo: Matarazzo et al., Biotechniques, 2004, 37(4), 666-8, 670, 672-3.) De acuerdo con esto, un inmunoprecipitación se lleva a cabo con anticuerpos que son específicos para proteínas que enlazan 5metilcitosina como MeCP2, MBD1, MBD2, MBD4 o Kaiso. Por lo tanto las proteínas se fijan sobre el ADN antes de que se agreguen los anticuerpos. En particular se prefiere purificar el ADN primero y luego agregar las proteínas enlazantes al ADN. También se prefiere particularmente aplicar un método físico adecuado tal como ultracentrifugación antes de la segunda etapa de precipitación. Un kit adecuado está disponible de Panomics, Inc.

Adicionalmente, puede lograrse un enriquecimiento mediante oligómeros de enlazamiento triple, los cuales pueden ser oligómeros APN o ADN. Este método está descrito en detalle en WO04/113564. En principio, un oligómero de enlazamiento triple se pone en contacto con ADN. Después de esto forma preferencialmente una hélice triple con ADN no metilado en comparación con el ADN metilado. De esto se toma ventaja para el enriquecimiento.

En principio, un ADN puede ser fragmentado aleatoriamente o no aleatoriamente antes de ser sometido a enriquecimiento por cualquier método usando proteínas, péptidos u oligómeros. Esto se hace como es conocido por los experimentados en la técnica. La fragmentación puede ser llevada a cabo aleatoriamente por ejemplo con sonicación o desgarramiento. Pero también puede ser llevada a cabo no aleatoriamente, preferiblemente mediante el uso de endonucleasas de restricción específicas de la metilación, en particular del grupo de "BisI, BstUI, BshI236I, AccII, BstFNI, McrBC, MvnI, HpaII (HapII), HhaI, AciI, SmaI, HinP1I, HpyCH4IV y cualquier mezcla de dos o más de las enzimas antes mocionadas".

Una reducción adicional de la complejidad puede lograrse por métodos físicos los cuales se aplican antes o después de una amplificación. Tales métodos físicos pueden ser por ejemplo electroforesis en gel, cromatografía de exclusión por tamaño o filtración.

Después del enriquecimiento del ADN, los fragmentos son marcados preferencialmente con un colorante fluorescente adecuado. Tal colorante permite un barrido selectivo mono o bidimensional. Típicamente se usan Cy3 y/o Cy5 como colorantes. Pero también son conocidos otros colorantes adecuados por los experimentados en la técnica. Adicionalmente, se prefiere que los fragmentos sean marcados con biotina, la cual interactúa con otra sustancia en el proceso de detección realmente. Por lo tanto es necesario llevar a cabo dos disposiciones las cuales se comparan una con otra.

La marcación es llevada a cabo preferencialmente por medio de una amplificación, en particular amplificaciones del genoma completo. Varios métodos adecuados son conocidos por los experimentados en la técnica.

Los fragmentos marcados son sometidos entonces a una disposición de ADN la cual puede ser bien una disposición de islas CpG clonadas o una disposición de oligonucleótidos. Los oligonucleótidos de la microdispoción de oligonucleótidos pueden ser cualquier oligonucleótido adecuado para la detección de la metilación o no metilación de dinucleótidos CpG. Preferiblemente los oligonucleótidos son diseñados después de los fragmentos derivados de acuerdo con las siguientes dos estrategias:

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De acuerdo con la primera estrategia, A) el genoma de un organismo deseado es analizado en cuanto a sus primeros fragmentos, los cuales son flanqueados por sitios de reconocimiento de enzimas de restricción específicas de no metilación de interés y que están en el rango de 100-1,200 bp. B) Segundos fragmentos son seleccionados entonces bajo aquellos primeros fragmentos que tienen no más de 50%, preferiblemente no más de 20% de repeticiones. Estas dos etapas A) y B) pueden llevarse a cabo en orden arbitrario. Adicionalmente, C) los segundos fragmentos seleccionados son analizados en cuanto a la presencia de sitios de reconocimiento de endonucleasas de restricción específicas de metilación de interés. Esos segundos fragmentos que incluyen tal sitio de reconocimiento son seleccionados como terceros fragmentos. De nuevo, las etapas A), B) y C) pueden ejecutarse en orden arbitrario.

De acuerdo con la segunda estrategia, A) el genoma de un organismo deseado es analizado en cuanto a primeros fragmentos, los cuales son flanqueados por sitios de reconocimiento de enzimas de restricción específicas de la metilación de interés y que están en el rango de 100-1,200 bp. B) Segundos fragmentos son seleccionados entonces bajo estos primeros fragmentos que no tienen más de 50%, preferiblemente no más de 20% de repeticiones. C) Los segundos fragmentos seleccionados son analizados en cuanto a la presencia de sitios de reconocimiento de endonucleasas de restricción específicas de la metilación de interés. Estos segundos fragmentos que incluyen tal sitio de reconocimiento son seleccionados entonces como terceros fragmentos. De nuevo, las etapas A), B) y C) pueden llevarse a cabo en orden arbitrario.

Los fragmentos seleccionados de acuerdo a estas estrategias pueden coincidir con fragmentos obtenidos por procedimientos de enriquecimiento. La secuencia de los oligonucleótidos de la matriz disposición se escoge a partir de los fragmentos seleccionados, de tal manera que hibriden a los fragmentos seleccionados o que sean idénticos a ellos y por lo tanto hibriden a la contracadena. Estos oligonucleótidos son sintetizados entonces sobre la disposición

o son enlazados a ella después de la síntesis. Típicamente se derivan 3-30 oligonucleótidos de un fragmento, con lo cual es posible que las secuencias de oligonucleótidos se superpongan. Preferiblemente los oligonucleótidos tienen una distancia definida entre uno y otro de tal forma que da como resultado la llamada "disposición de arado", similares a la descrita por Kapranov et al., Science, 2002, 296(5569):916-9.

De acuerdo con el método DMH, los fragmentos hibridados sobre los oligonucleótidos inmovilizados contienen preferiblemente secuencias de ácido nucleico, cuyas posiciones de metilación son no metiladas o metiladas en caso de una enfermedad definida en comparación a la condición normal Los oligonucleótidos no tienen que codificar necesariamente para las posiciones de metilación por sí mismos, aunque es posible. Además, es posible que la disposición de oligonucleótidos porte diferentes conjuntos de oligonucleótidos, adecuados para la detección de diferentes enfermedades o de predisposiciones para una enfermedad o de la susceptibilidad a efectos secundarios para un tratamiento médico definitivo. Adicionalmente, también es posible predecir el tipo, la agresividad o la progresión de una enfermedad o la efectividad de un tratamiento médico, en caso de que se base sobre las diferencias de metilación. Pueden hacerse conclusiones adicionales por comparación de los resultados obtenidos por medio de una disposición de oligonucleótidos de acuerdo con el método DMH con un resultado obtenido con las disposiciones con diferentes conjuntos de oligonucleótidos, por ejemplo conjuntos de oligonucleótidos adecuados para análisis SNP.

SECUENCIACIÓN CON BISULFITO. Los patrones de metilación de ADN y distribución de 5-metilcitosina pueden analizarse por análisis de secuenciación de un fragmento amplificado previamente del ADN genómico tratado con bisulfito, como lo describe Frommer et al. (Frommer et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1827-1831, 1992). Puesto que el ADN tratado con bisulfito es amplificado antes de la secuenciación, el procedimiento de amplificación de acuerdo con la invención puede ser utilizado en combinación con este método de detección.

COBRA. El análisis COBRA es un ensayo de metilación cuantitativo útil para determinar los niveles de metilación de ADN en loci de genes específicos en pequeñas cantidades de ADN genómico (Xiong & Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534, 1997). En resumen, la digestión con enzimas de restricción se utiliza para revelar diferencias en la secuencia dependientes de la metilación en productos de PCR de ADN tratado con bisulfito de sodio. Las diferencias en las secuencias dependientes de la metilación son introducidas primero en el ADN genómico por tratamiento estándar con bisulfito de acuerdo con el procedimiento descrito por Frommer et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:18271831, 1992) o como la describe Olek et al (Olek A, Oswald J, Walter J. (1996) Nucleic Acids Res. 24: 5064-6). Amplificación por PCR del ADN convertido con bisulfito se lleva a cabo entonces utilizando cebadores no específicos de la metilación seguidos por digestión con endonucleasas de restricción, electroforesis en gel, y detección utilizando sondas de hibridación marcadas específicas. Los niveles de metilación en la muestra de ADN original están representados por cantidades relativas de producto de PCR digerido y no digerido en una forma linealmente cuantitativa a través de un amplio espectro de niveles de metilación de ADN. Además, esta técnica puede ser aplicada confiablemente a ADN obtenido de muestras de tejido microdiseccionado embebido en parafina. Reactivos típicos (por ejemplo como pueden encontrarse en un kit basado en COBRA típico) para el análisis COBRA pueden incluir, pero no se limitan a: cebadores PCR para genes específicos (o secuencia de ADN alterada por metilo o isla CpG); enzima de restricción y de regulador apropiado; oligo de hibridación de gen; oligo de hibridación de control; kit de marcación de quinasa para sonda oligo; y nucleótidos radiactivos. Adicionalmente, los reactivos de conversión por bisulfito pueden incluir: regulador para desnaturalización de ADN; regulador de sulfonación; reactivos o kits para recuperación de ADN (por ejemplo, precipitación, ultrafiltración, columna por afinidad); regulador de desulfonación; y componentes para recuperación de ADN.

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Adicionalmente, la digestión con enzimas de restricción de productos de PCR amplificados a partir de ADN convertido por bisulfito también se usa, en el método descrito por Sadri & Hornsby (Nucl. Acids Res. 24:5058-5059, 1996).

El procedimiento de conversión por bisulfito y amplificación de acuerdo con la divulgación puede ser utilizada en combinación con este método de detección.

Ms-SNuPE (Extensión por Cebador de Nucleótido Individual Sensible a Metilación). La técnica Ms-SNuPE es un método cuantitativo para establecer las diferencias en metilación en sitios CpG específicos con base en el tratamiento con bisulfito del ADN, seguido por extensión con cebador de nucleótido individual (Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997). En resumen, el ADN genómico se hace reaccionar con bisulfito de sodio para convertir la citosina no metilada en uracilo, con 5-metilcitosina saliente sin cambios. La amplificación de la secuencia objetivo deseada se lleva a cabo entonces utilizando cebadores de PCR específicos para ADN convertido por bisulfito, y el producto resultante es aislado y usado como una plantilla para el análisis de metilación en los sitios CpG de interés. Pueden analizarse cantidades pequeñas de ADN (por ejemplo, secciones de patología microdiseccionadas), y evita la utilización de enzimas de restricción para determinar el estado de metilación en sitios CpG.

Reactivos típicos (por ejemplo, con los que podrían encontrarse en un kit típico basado en Ms-SNuPE) para el análisis por Ms-SNuPE pueden incluir, pero no se limitan a: cebadores para PCR para genes específicos (o secuencia de ADN alterada por metilación o isla de CpG); reguladores y desoxinucleótidos para PCR optimizados; kit para extracciones en gel; cebadores de control positivo; cebadores para Ms-SNuPE para genes específicos; reguladores de reacción (para la reacción de Ms-SNuPE); y nucleótidos radiactivos. Adicionalmente, los reactivos de conversión con bisulfito pueden incluir: regulador de desnaturalización de ADN; regulador de sulfonación; reactivos o kits para recuperación de ADN (por ejemplo, precipitación, ultrafiltración, columna de afinidad); regulador de desulfonación; y componentes para recuperación de ADN.

El procedimiento de conversión y amplificación por bisulfito de acuerdo con la divulgación puede usarse en combinación con este método de detección.

MSP. El MSP (PCR específico para metilación) permite el establecimiento del estado de metilación de virtualmente cualquier grupo de sitios CpG dentro de una isla CpG, independientemente del uso de enzimas de restricción sensibles a la metilación (Herman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996; Patente de los Estados Unidos No. 5,786,146). En resumen, el ADN es modificado por bisulfito de sodio convirtiéndolo todo en no metilado, pero la citosina no metilada en uracilo, y amplificado subsecuentemente con cebadores específicos para ADN metilado versus no metilado.

Los pares de cebador MSP contienen al menos un cebador, el cual hibrida a un dinucleótido CpG tratado con bisulfito. Por lo tanto, la secuencia de dichos cebadores comprende al menos un dinucleótido CpG. Los cebadores MSP específicos para ADN no metilado contienen una "T" en la posición 3' de la posición C en el CpG. Preferiblemente, por lo tanto, se requiere que la secuencia base de dichos cebadores comprenda una secuencia que tiene una longitud de al menos 9 nucleótidos la cual hibrida a la secuencia de ácido nucleico convertida con bisulfito, en donde la secuencia base de dichos oligómeros comprende al menos un dinucleótido CpG. El MSP requiere solamente pequeñas cantidades de ADN, es sensible a 0.1% de alelos metilados de un locus de una isla de CpG dada, y puede ser ejecutado sobre el ADN extraído a partir de muestras embebidas en parafina. Reactivos típicos (por ejemplo como los que podrían encontrarse en un kit típico basado en MSP) para análisis por MSP pueden incluir, pero no se limitan a: cebadores para PCR metilados y no metilados para un gen específico (o secuencia de ADN alterada por metilación o isla CpG), reguladores y desoxinucleótidos para PCR optimizados, y sondas específicas. El procedimiento de conversión y amplificación por bisulfito de acuerdo con la divulgación pueden ser utilizado en combinación con este método de detección.

MSP ANIDADO (Belinsky and Palmisano en la solicitud de los Estados Unidos 20040038245). Considerando el conflicto aparente de requerir alta especificidad del cebador MSP para diferenciar suficientemente entre posiciones CG y TG, pero que permite una no coincidencia con el fin de crear un sitio de restricción único, se prefiere utilizar una versión enmendada de MSP, conocida como MSP anidado, tal como se describe en WO 02/18649 y la solicitud de patente de los Estados Unidos 20040038245 de Belinsky y Palmisano. Este método para detectar la presencia de metilación del promotor específico del gen comprende las etapas de: expandir el número de copias de la región genética de interés utilizando una reacción en cadena de polimerasa para amplificar una porción de dicha región en donde reside la metilación del promotor, generando por lo tanto un producto de amplificación; y utilizar una alícuota del producto de amplificación generado por la primera reacción en cadena de polimerasa en una segunda reacción en cadena de polimerasa específica de la metilación para detectar la presencia de metilación. En otras palabras un PCR específico de no metilación se lleva a cabo antes del PCR específico de la metilación. El procedimiento de conversión y amplificación por bisulfito de acuerdo con la divulgación puede ser utilizado en combinación con este método de detección.

HEAVYMETILTM. (WO 02/072880 ; Cottrell SE et al. Nucleic Acids Res. 2004 Jan 13;32(1):e10) Una realización adicional preferida del método comprende el uso de oligonucleótidos bloqueadores. En el ensayo HeavyMetilTM se hibridan oligonucleótidos de sonda de bloqueo al ácido nucleico tratado con bisulfito concurrentemente con los

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metilación de CpG conocidos), o en una reacción "desplazada" (con cebadores de PCR que se superponen con dinucleótidos CpG conocidos). La discriminación de secuencia puede ocurrir bien sea en el nivel del proceso de amplificación o en el nivel del proceso de detección por fluorescencia, o en ambos.

El ensayo MetiLight™ puede ser utilizado como prueba cuantitativa para patrones de metilación en la muestra de ADN genómico, en donde la discriminación de secuencia ocurre al nivel de la hibridación con sonda. En esta versión cuantitativa, la reacción de PCR provee una amplificación no desplazada en la presencia de una sonda fluorescente que se superpone con sitio de metilación putativo particular. Se provee un control no desplazado de la cantidad de ADN ingresado por una reacción en la cual ni los cebadores, ni la sonda se depositan sobre ningún dinucleótido CpG. Alternativamente, se logra una prueba cualitativa para metilación genómica sondeando la reserva de PCR desplazada bien sea con oligonucleótidos de control que no "cubren" sitios de metilación conocidos (una versión basada en fluorescencia de la técnica "MSP"), o con oligonucleótidos que cubren sitios de metilación potenciales.

El proceso MetiLight™ puede ser utilizado con una sonda "TaqMan®" en el proceso de amplificación. Por ejemplo, el ADN genómico de doble cadena es tratado con bisulfito de sodio y luego sometido a uno de dos conjuntos de reacciones de PCR utilizando sondas TaqMan ®; por ejemplo, bien sea con cebadores desplazados y sondas TaqMan® o cebadores no desplazados y sondas TaqMan®. La sonda TaqMan® tiene marcación doble con moléculas fluorescentes "informadoras" y "de detención", y está diseñada para ser específica para una región de contenido relativamente alto de GC de tal forma que se funde a una temperatura de aproximadamente 10ºC por encima en el ciclo de PCR con respecto a los cebadores de avance o retroceso. Esto permite que la sonda TaqMan® permanezca completamente hibridada durante la etapa de fusión/extensión en PCR. Puesto que la Taq polimerasa sintetiza enzimáticamente una nueva cadena durante el PCR, eventualmente alcanzará la sonda TaqMan® fusionada. La actividad de endonucleasa de la Taq polimerasa 5' a 3' desplazará entonces la sonda TaqMan® digiriéndola para liberar la molécula informadora fluorescente para detección cuantitativa de su señal ahora no detenida utilizando un sistema de detección fluorescente en tiempo real.

Las variaciones de la metodología de detección por TaqMan™, que también son adecuadas para uso con la invención descrita incluyen el uso de tecnología de sonda dual (LightCycler™) o de cebadores de amplificación fluorescentes (tecnología Sunrise™). Ambas de estas técnicas pueden ser adaptadas de una manera adecuada para uso con el ADN tratado con bisulfito y además para el análisis de metilación dentro de dinucleótidos CpG. Reactivos típicos (por ejemplo, como los que podrían encontrarse en un kit típico basado en MetiLight™) para el análisis MetiLight™ pueden incluir, pero no se limitan a: cebadores de PCR para secuencias por bisulfito específicas, esto es, regiones genéticas convertidas con bisulfito (o ADN convertido con bisulfito o islas de CPG convertidas con bisulfito); sondas (por ejemplo TaqMan® o LightCycler™) específicas para dichas secuencias convertidas con bisulfito amplificadas; reguladores y desoxinucleótidos optimizados para PCR; y una polimerasa, tal como Taq polimerasa.

El procedimiento de conversión y amplificación con bisulfito de acuerdo con la divulgación puede ser utilizado en combinación con este método de detección.

Los fragmentos obtenidos por medio de la amplificación pueden llevar un marcador directa o indirectamente detectable. Se prefieren marcadores en la forma de marcadores fluorescentes, radionúclidos o fragmentos de moléculas desprendibles que tienen una masa típica, los cuales pueden ser detectados en un espectrómetro de masas. Cuando dichos marcadores son marcadores de masa, se prefiere que los amplificados marcados tengan una carga neta individual positiva o negativa, permitiendo una mejor detección en el espectrómetro de masas. La detección puede llevarse a cabo y visualizarse por medio de, por ejemplo, espectrometría de masas de matriz de desorción/ionización asistida por láser (MALDI) o utilizando espectrometría de masas con aspersión de electrones (ESI).

La espectrometría de masas de matriz de desorción/ionización asistida por (MALDI-TOF) es un desarrollo muy eficiente para el análisis de biomoléculas (Karas & Hillenkamp, Anal Chem., 60:2299-301, 1988). Un analito es embebido en una matriz absorbente de luz. La matriz es evaporada mediante un pulso corto de láser transportando así la molécula del analito hacia la fase de vapor de una manera no fragmentada. El analito es ionizado por colisiones con moléculas de la matriz. Un voltaje aplicado acelera los iones hacia un tubo de vuelo libre de campo. Debido a sus diferentes masas, los iones son acelerados a diferentes velocidades. Los iones más pequeños alcanzan el detector más pronto que los más grandes. La espectrometría MALDI-TOF es muy adecuada para el análisis de péptidos y proteínas. El análisis de ácidos nucleicos es de alguna manera más difícil (Gut & Beck, Current Innovations and Future Trends, 1:147-57, 1995). La sensibilidad con respecto al análisis de ácidos nucleicos es aproximadamente 100 veces menos que para péptidos, y disminuye de manera no proporcional con el incremento del tamaño del fragmento. Además, para ácidos nucleicos que tienen un esqueleto cargado negativamente de manera múltiple, el proceso de ionización a través de la matriz es considerablemente menos eficiente. En la espectrometría MALDI-TOF, la selección de la matriz juega un papel eminentemente importante. Para la desorción de péptidos, de han encontrado varias matrices muy eficientes que producen una cristalización muy fina. Hay ahora varias matrices que responde al ADN, sin embargo, la diferencia en sensibilidad entre los péptidos y los ácidos nucleicos no ha sido reducida. Esta diferencia en sensibilidad puede ser reducida, sin embargo, modificando químicamente el ADN de tal manera que se haga más similar a un péptido. Por ejemplo, los ácidos nucleicos fosforotioato, en los cuales los fosfatos usuales del esqueleto

son sustituidos con tiofosfatos, pueden ser convertidos en un ADN de carga neutra utilizando química de alquilación sencilla (Gut & Beck, Nucleic Acids Res. 23: 1367-73, 1995). El acoplamiento de una etiqueta de carga a este ADN modificado da como resultado un incremento en la sensibilidad por MALDI-TOF al mismo nivel que la encontrada para péptidos.

Los amplificados también pueden ser detectados y/o analizados adicionalmente por medio de oligonucleótidos que constituyen todo o parte de un "arreglo" o "chip de ADN" (esto es, una disposición de diferentes oligonucleótidos y/o oligómeros de APN enlazados a una fase sólida). Tal disposición de diferentes secuencias de oligonucleótidos y/o oligómeros de APN puede ser caracterizada, por ejemplo, de tal forma de que se disponga sobre la fase sólida en la forma de una red rectangular o hexagonal. La superficie de fase sólida puede estar compuesta de silicio, vidrio, poliestireno, aluminio, acero, hierro, cobre, níquel, plata u oro. También pueden usarse nitrocelulosa así como plásticos tales como nilón, que pueden existir en la forma de pellas o también como matrices de resina. Una revisión de la técnica anterior en la manufactura de disposiciones de oligómeros puede ser obtenida de una edición especial de Nature Genetics (Nature Genetics Supplement, Volume 21, January 1999, y de la literatura citada allí). Se usan frecuentemente sondas marcadas fluorescentemente para el barrido de disposiciones de ADN inmovilizado. La unión simple de colorante Cy3 y Cy5 al 5'-OH de la sonda específica es particularmente adecuada para marcas de fluorescencia. La detección de la fluorescencia de las sondas hibridadas puede ser llevada a cabo, por ejemplo, con un microscopio confocal. Los colorantes Cy3 y Cy5, además de muchos otros, están disponibles comercialmente. La conversión con bisulfito y el proceso de amplificación de acuerdo con la invención pueden ser utilizados en combinación con este método de detección.

Además, métodos adicionales para análisis de metilación son conocidos por personas experimentadas en la técnica. Tales métodos son por ejemplo métodos en los cuales el ADN tratado con bisulfito es sometido a métodos de análisis basados en disposición de ADN tal como los descritos en WO 99/28498, WO 01/38565, o en WO 02/18632.

EJEMPLOS.

Ejemplo 1.

a) Etapa de remoción de parafina

Reactivos químicos necesarios:

Limoneno145, Fluka Chemika, Art Nr. 89188

Procedimiento:

1.

Tubos de reacción giratorios de cierre seguro o tapa de rosca (que contienen 1-5 secciones de un tejido embebido en parafina fijado con formalina) durante 1 minuto a 5,000 x g

2.

Agregar 1 ml de limoneno a cada tubo. Introducir todas las piezas en el líquido. En algunos casos el material de muestra es muy frágil con piezas pequeñas de parafina/tejido en el tubo -asegurarse de que el material que se adhiere a la tapa del tubo caiga dentro del tubo.

3.

1 hora de incubación a temperatura ambiente a 1,000 rpm en termomezclador, con vórtex vigoroso al menos 3 veces durante la incubación.

4.

Cloque los tubos en centrífuga y hágalos girar a 16,000 rcf (= 16,000 x g) durante 5 minutos, el tejido se aglomerará en el fondo del tubo.

5.

Use una pipeta de 1 ml para succionar el limoneno de cada muestra. ¡Debe tenerse gran cuidado de no perturbar la pella!

Coloque la punta de la pipeta opuesta a la pella sobre el tubo y permita que limoneno entre suavemente a la punta de la pipeta; para retirar las últimas gotitas debe utilizarse una punta amarilla.

6.

Si el tejido se deposita sólo débilmente en el fondo (es decir, no forma una pella definida) haga lo siguiente:

•

repita la centrifugación otra vez durante 5 minutos en una centrífuga Eppendorf 5417 a velocidad máxima (> 20,000 rcf)

•

repita entonces la remoción del limoneno: asegúrese de que la punta de la pipeta está presionada contra el fondo del tubo y el limoneno es retirado muy lentamente de tal forma que no succione el tejido. Retire tanto limoneno como sea posible.

b) Etapa de lisis

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Almacenamiento:

Las muestras sometidas a lisis pueden ser almacenadas bien sea a -20ºC, o -80ºC (dependiendo del tiempo de almacenamiento) o ser usadas inmediatamente para continuación del procesamiento. c) Etapa de extracción de ADN Equipo necesario

•

centrífuga de placas (Sigma o Qiagen, capaz de hasta 5,758 x g (6,000 rpm))

•

pipeteadores para volúmenes de 10 µl hasta 1, 000 µ l (multicanal para volúmenes grandes)

•

Contenedor de residuos para flujo de ADN (por ejemplo, recipiente con eliminación de ADN) Material requerido:

•

Dneasy 96 Tissue Kit (Qiagen # 69581 o 69582)

•

puntas de pipeta (100 µl, 1000 µl)

•

tubos Falcon de 15 µl y 50 µl Reactivos químicos necesarios:

•

etanol, grado biología molecular Procedimiento: Asegúrese con marcación respectiva que todas las placas en un ensamble están giradas en la misma dirección (pozo

A1 sobre pozo A1 etc.).

1.

Distribuya 400 µl de AL/E en microtubos de recolección y transfiera el lisado (200 µl) a los tubos; selle los tubos con tapas para tubos de recolección; utilice la tapa de la placa para fijar los tubos en la gradilla

2.

Mezcle agitando 15 segundos con AMBAS manos; gire por un período corto (deje que la centrífuga alcance 1,450 x g y detenga);

3.

Coloque la placa DNeasy 96 sobre un bloque S (selle los pozos no usados de la placa DNeasy con lámina AirPore Tape). Cuidadosamente aplique la mezcla de la etapa 2 sobre las columnas. Selle con AirPore Tape. Centrifugue a 5,790 x g durante 10 minutos. Si hay todavía fluido visible en las membranas, agregue una etapa de centrifugación.

4.

Remueva la cinta. Agregue 500 µl de AW1. Selle con una lámina AirPore Tape. Vacíe el bloque S. Haga rotar durante 5 minutos a 5,790 x g.

5.

Retire la cinta. Agregue 500 µl de AW2. Selle con nueva lámina AirPore Tape. Vacíe el bloque S. HAga rotar durante 15 minutos a 5,790 x g, esto debería dejar la membrana seca.

6.

Coloque la placa DNeasy sobre una placa de microtubos de elución. Para eluir el ADN agregue 120 µl de regulador AE o ddH2O precalentados a 70°C a cada pozo. Selle la placa con una nueva lamina de AirPore Tape. Incube durante 5 minutos a temperatura ambiente. Haga rotar durante 2 minutos a 5,790 x g.

7.

Selle los microtubos de elución con las tapas provistas. Almacene a -20°C o -80°C (dependiendo del tiempo de almacenamiento)

d) Etapa de tratamiento con bisulfito y e) etapa de purificación de ADN Equipo necesario:

•

Termociclador (por ejemplo Eppendorf, Tetrad)

•

Centrífuga de placas (Sigma o Qiagen, capaz de hasta 5,700 x g)

•

Pipeteadores para volúmenes desde 10 µl hasta 1000 µl (Eppendorf multicanal + pipeteadores Matrix) Material necesario:

•

Placas de PCR + tiras de tapas

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•

QIAamp 96 DNA Blood Kit (Qiagen #51161 para 4 placas o 51162 para 12)

•

Bloques y tapas de pozos redondos adicionales (1 adicional necesario para cada purificación de 96 muestras; #19576 para 24 placas)

•

Regulador QIA AVL (#19073 para 155 µl, 560 µl por muestra requerida)

•

puntas de pipeta (100 µl, 1,000 µl, Eppendorf + Matrix)

•

Tubos Falcon de 15 ml y 50 ml

•

contenedor de residuos para fluido de ADN (por ejemplo recipiente con eliminación de ADN) Reactivos químicos necesarios:

•

bisulfito de sodio (Na2S2O5, 190. 1 g/mol), Merck 1.06528.0500

•

sulfito de sodio, anhidro (Na2SO3, 126.04 g/mol), Fluka 71988

•

ddH2O grado biología molecular (filtrada por 0.2 µm, tratada con DEPC, sometida a autoclave, libre de DNasas y RNasas)

•

dietilenglicoldimetiléter (DME), Merck 8.02934.0250

•

ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico (250.29 g/mol), Aldrich 23, 881-3

•

etanol, grado biología molecular

•

pellas de hidróxido de sodio (NaOH, 40.0 g/mol), Merck 1.06482.1000

Preparación de soluciones (suficiente para 80 reacciones, !siempre para ser preparadas frescas¡):

Solución de bisulfito: se disuelven disulfito de sodio (4.708 g) y sulfito de sodio (1.128 g) agregando 10 ml de ddH2O (la solución es 4.9 M). El volumen final es alrededor de 12 ml. Verifique el pH de la solución -si no está entre 5.45 y 5.5, descarte la solución y repita su preparación. Agite vigorosamente y si es necesario, caliente la solución a 50ºC en un baño de agua con vórtex a una velocidad máxima durante 30 segundos. Repita este procedimiento tantas veces como sea necesario hasta que la sal se haya disuelto completamente.

Solución de DME -depurador de radicales Disuelva 125.3 mg del ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-cromano-2carboxílico agregando 1.0 ml de DME. Someta a vórtex rigurosamente con el fin de asegurar que todas las partículas no disueltas permanezcan. El DME es peligroso y potencialmente carcinogénico. Por lo tanto, tome precauciones apropiadas cuando maneje este reactivo químico. Si sólo se van a tratar pocas muestras con bisulfito, prepare volúmenes menores.

Regulador de desulfonación: Disuelva 0.8 g de hidróxido de sodio en 10 ml de ddH2O para preparar una solución de reserva 2 mol/l. Para el regulador de desulfonación mezcle 1.0 ml de hidróxido de sodio 2 mol/l y 9.0 ml de etanol. ¡La solución tiene que ser preparada fresca antes de cada purificación¡

Procedimiento de reacción con bisulfito (volumen final de 140 µl):

Transfiera con una pipeta las siguientes soluciones en placas de PCR en el orden mostrado.

1.

44 µl de regulador/agua que contiene el ADN que va a ser tratado con bisulfito

2.

83 µl de solución de bisulfito (la aplicación con pipeteado del bisulfito y la muestra pueden ser intercambiadas)

3.

13 µl de solución de DME, que contiene el depurador de radicales

4.

mezcle exhaustivamente

5.

coloque en pozos de 0.2 ml del termociclador. ¡Utilice tiras de tapas para cerrar los pozos¡ Programa de temperatura en un termociclador

• 5:00 minutos desnaturalización de ADN a 99ºC

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•

Coloque la placa QIAamp 96 sobre la parte superior de un bloque S

•

Aplique 630 µl del primer pozo por muestra de placa QIAamp 96

•

Selle la placa con una lámina de AirPore Tape, haga rotar a 5,790 x g durante 4 minutos

•

Vacíe el bloque S

•

Repita el enlazamiento con un segundo pozo de cada muestra sobre la misma columna como con el primer pozo (carga, sellamiento, rotación, vaciamiento de bloque S)

4. Lavado y 5. desulfonación

•

Coloque la placa QIAamp 96 del bloque S

•

Agregue 500 µl de regulador AW1

•

Selle la placa con nueva lámina AirPore Tape

•

Haga rotar a 5,90 x g durante 2 minutos

•

Vacíe el bloque S, coloque la placa sobre el bloque S

•

Agregue 500 µl de NaOH 0.2 mol/l sobre la placa QIAamp 96

•

Selle con una lámina nueva de AirPore Tape, incubación durante 15 minutos a temperatura ambiente.

•

Centrifugue a 5,90 x g durante 1 minuto.

•

Vacíe el bloque S

•

Agregue 500 µl de AW2

•

Selle la placa con nueva lámina AirPore Tape

•

Haga rotar a 5,90 x g durante 15 minutos

6. Elución

•

Coloque la placa QIAqmp 96 sobre la gradilla de microtubos de elución.

•

Agregue 100 µl de AE o ddH2O precalentados a 70ºC.

•

Sella la placa con una nueva lámina de AirPore e incube a temperatura ambiente durante 5 minutos

•

Haga rotar a 5,790 x g durante 4 minutos

•

Selle los tubos con tapas

El ADN puede ser entonces amplificado y analizado posteriormente por medio de los métodos sensibles para el análisis de metilación de ADN. Ejemplo 2. Todas las etapas se harán en los tubos en los que se proveen las muestras, esto es, los tubos provistos por el

proveedor de las muestras, estos pueden ser tubos tanto de 1.5 como de 2.0 ml (preferidos). Por favor, reconfirme que los formatos de tubo encajan en la centrífuga. Los solventes y reguladores pueden ser suministrados bien sea con pipetas de canal sencillo o multipipetas a) Remoción de parafina Reactivo químico necesario: Limoneno145, Fluka Chemika, Art Nr. 89188

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Procedimiento:

1.

Agregue 1 ml de limoneno a cada tubo (que contiene 1 a 5 láminas de muestra de cirugía embebida en parafina fijada con formalina). Coloque todas las piezas en el líquido. En algunos casos el material de la muestra es ya muy frágil con pequeñas piezas de parafina/tejido en el tubo -asegurarse de que el material que se adhiera a la tapa del tubo cae dentro del tubo.

2.

Incubación durante 1 hora a temperatura ambiente a 1000 rpm, vórtex vigorosamente al menos durante 3 veces durante la incubación.

3.

Coloque los tubos en la centrífuga y haga rotar a 16,000 rcf (= 16,000 x g) durante 5 minutos, el tejido formará pellas en el fondo del tubo.

4.

Usa una pipeta de 1 ml para succionar el limoneno de cada muestra. ¡Tenga gran cuidado para no perturbar la pella! Coloque la punta de la pipeta opuesta a la pastilla sobre el tubo y permita que el limoneno entre suavemente a la punta de la pipeta, en algunos casos puede ser más fácil retirar el volumen completo en dos más bien que en una etapa de pipeta. Es correcto si permanecen pequeñas cantidades (hasta 50 µl) de limoneno en el tubo.

5.

Si el tejido se deposita sólo débilmente en el fondo (esto es, no forma una pella definida) haga lo siguiente:

•

repita la centrifugación de nuevo durante 5 minutos en una centrífuga Eppendorf 5417 a velocidad máxima (> 20,000 rcf)

•

entonces repita la remoción de limoneno: asegúrese de que la punta de la pipeta es presionada contra el fondo del tubo y que el limoneno es retirado muy lentamente de tal manera que no succione el tejido. Retire tanto limoneno como sea posible.

Obvie la etapa del etanol, si fue posible retirar casi todo el limoneno (si quedan 50 µl, esto estará bien)

6.

Agregue 1 ml de etanol (pureza > 99%).

7.

Someta a vórtex, 10 minutos de incubación a temperatura ambiente a 1,00 rpm.

8.

Coloque los tubos en la centrífuga y hágalos rotar a 16,000 rcf durante 5 minutos, el tejido se depositará de nuevo en el fondo del tubo.

9.

Utilice la pipeta para succionar el etanol, ¡debe tenerse gran cuidado para no perturbar las pellas! Coloque la punta de la pipeta opuesta a la pella sobre la pared del tubo y permita que suavemente etanol entre a la punta de la pipeta.

10.

retire tanto etanol como sea posible con la pipeta.

11.

el etanol residual no retirado por la pipeta debe ser evaporado por incubación en un termomezclador a 50ºC. Esto puede tomar entre 10 a 30 minutos, pero tenga cuidado de no sobresecar las muestras. No es necesario el secado, si la etapa del etanol fue obviada.

b) Etapa de lisis Prepare un volumen más grande del regulador de lisis (0.5 o 1 l), dependiendo del número de muestras que se van a procesar para un proyecto. Este regulador puede ser almacenado a temperatura ambiente durante 3 meses. Después de este tiempo es prudente preparar un regulador fresco.

Reactivos químicos: TRIS (tris-hidroximetil-amino-metano), Merck, Art. Nr. 1.01549.0500, MW = 121.14 g/ml Prepare una solución de reserva de 1 mol/l: Disuelva 121.14 g en 800 ml de H2O y ajuste a pH 8.0 con HCl y complete hasta 1 l. EDTA (ácido etilendiaminotetraacético), EDTA de sodio (Titriplex III) de Merck, Art. Nr. 159294 MW = 372.24 g/mol

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Prepare una solución de reserve de 0.5 mol/l: Disuelva 186.1 g en 800 ml de H2O y ajuste a pH 8.0 con NaOH, complete hasta 1 l. Tween (Tween 20), Fluka, Chemika Art Nr. 93773 Este detergente se agrega al regulador en porcentaje en volumen. Para agregar Tween al regulador tome 1 ml de

Tween (en un tubo de 2 ml), caliéntelo a 50ºC y agregue el volumen deseado al regulador con una punta de pipeta ancha. Composición de regulador de lisis: 50 mmol/l TrisHCl, pH 8.0, 1 mmol/l EDTA, 0.5% Tween (volume %)

Proteinasa K, Roth Preparare una solución de reserva de 30 mg/ml en H2O. El tamaño de la solución de reserva debe ser ajustado al número de muestras que se van a procesar. Por ejemplo: 300 mg de proteinasa K disueltos en 10 ml de H2O serán suficientes para ~ 400 muestras. La proteinasa K puede ser almacenada a 4ºC durante hasta una semana con seguridad. Si se van a procesar más muestras se recomienda preparar soluciones frescas repetidamente.

Procedimiento:

1.

Agregue 190 µl del regulador de lisis preparado a cada muestra. Es importante asegurarse de que todo el material de muestra es cubierto por el regulador de lisis.

2.

Agregue 20 µl de la solución de proteinasa K preparada.

3.

Someta a vórtex el tubo rigurosamente para asegurar una mezcla apropiada de la muestra con el regulador de lisis y la proteinasa K. Asegúrese de que las tapas de los tubos están cerradas herméticamente -¡de otra manera habrá pérdida de líquido¡

4.

Incubar a 50ºC, con agitación a 1,000 rpm (termoagitador).

5.

Incubar durante 40 a 48 horas, no son necesarias adiciones posteriores de proteinasa K.

6.

Haga rotar en la mañana y en la tarde de cada día para eliminar las gotitas de la tapa, someta a vórtex vigorosamente.

Verificación de la calidad de la lisis (durante la lisis):

Después de estas etapas de lisis, debe haber una solución homogénea, tal vez turbia en el tubo sin piezas visibles de tejido remanente. Sin embargo, debería haber piezas visibles de tejido en MUCHAS de las muestras dejadas después de la primera etapa de incubación adicional con proteinasa K y debería tenerse en consideración el incremento del volumen de la lisis. Si sólo las muestras individuales tienen algún material no digerido remanente este puede ser despreciado. ¡Tenga mucho cuidado!

7.

Incube las muestras Incubar a > 95ºC durante 10 minutos con el fin de inactivar la proteinasa K. Para esto fije la temperatura del termomezclador a 99ºC, puesto que la temperatura real en la fijación más alta está algunos grados por debajo de la temperatura indicada (La proteinasa K activa en el lisado reducirá el rendimiento del PCR, especialmente si el lisado se usa directamente para la cuantificación de ADN genómico por RT-PCR).

8.

Las muestras sometidas a lisis pueden ser almacenadas bien sea a -20ºC o -80ºC (dependiendo del tiempo de almacenamiento) o ser usadas inmediatamente para continuación del procesamiento. c) Extracción de ADN con el kit QIAGEN DNeasy Tissue Duración aproximada para 30 muestras: Preparación de dispositivos y materiales: 15 minutos; Preparación: 30 min; Procedimiento: 1.5 horas

Se necesitan los siguientes dispositivos: centrífuga, por ejemplo modelo Eppendorf 5417R; Pipetas y/o multipipetas Eppendorf; 1tubos de reacción de 1.5 ml y 2 ml; termomezclador.

Se necesitan los siguientes reactivos:

Lisados de muestras en parafina (-210 µl o más, si se agregaron regulador de lisis + proteinasa K, los volúmenes actuales pueden diferir ligeramente, pueden presentarse volúmenes inferiores porque fueron tomadas alícuotas para cuantificación, pérdida por evaporación. También pueden presentarse volúmenes más grandes porque la cantidad de tejido lisado fue mayor que el promedio)

Etanol para biología molecular (96-100%)

Kit de DNeasy (Qiagen cat nr. 69504 [50 columns] o 69506 [250 columnas])

Preparación (antes de incoar la extracción real):

1.

Mezcle el regulador AL exhaustivamente agitando antes del uso. El regulador AL es estable durante 1 año cuando se almacena a temperatura ambiente. Si se ha formado un precipitado en el regulador AL, disuelva incubando a 70ºC.

2.

Se suministra regulador AW como concentrado. Agregue la cantidad apropiada de etanol (96-100%) antes de un primer uso (estas cantidades difieren para los kits 69504 y 69506, respectivamente). El regulador AW 1 es estable durante 1 año cuando se almacena cerrado a temperatura ambiente.

3.

El regulador AW 2 se suministra como concentrado, la cantidad apropiada de etanol (96-100%) antes del primer uso (estas cantidades difieren para los kits 69504 y 69506, respectivamente). El regulador AW 2 es estable durante 1 año cuando se almacena cerrado a temperatura ambiente.

4.

Si las muestras fueron congeladas después de la lisis del tejido asegúrese de que las muestras están equilibradas a temperatura ambiente.

5.

Caliente un termomezclador a 70ºC.

6.

Todos las etapas de centrifugación deben llevarse a cabo a temperatura ambiente.

7.

Sea cuidados de no causar derrames cuando utilice la multipipeta en lugar de pipeteadores individuales.

Procedimiento de extracción:

1.

Agregue 210 µl (si el lisado tiene un volumen mayor: 1 volumen de regulador de lisis + volumen de proteinasa K usados) de regulador AL al tubo (1.5 o 2.0 ml) que contiene el lisado, mezcle exhaustivamente vórtex. Coloque el tubo en un termomezclador e incube a 70ºC, agitando a 1000 rpm durante 10 minutos.

2.

Agregue 210 µl (si el lisado tiene un volumen mayor: de nuevo 1 volumen de regulador de lisis + volumen de proteinasa K usados) de etanol (96-100%) a la muestra, y mezcle por vórtex con pulso durante 15 segundos. Después de la mezcla, centrifugue brevemente el tubo para eliminar las gotas del interior de la tapa.

3.

Aplique cuidadosamente la mezcla de la etapa 2 (hasta 700 µl cabrán dentro de la columna, ¡incluyendo los precipitados!) sobre una columna de rotación DNeasy la cual ya está colocada en un tubo de recolección de 2 ml (provisto por Qiagen) sin humedecer el borde. Cierre la tapa y centrifugue a 6,000 x g (= rcf, u 8,000 rpm) durante 1 minuto. Coloque la columna de rotación DNeasy en un tubo de recolección de 2 ml limpio (provisto por Qiagen), y descarte el tubo que contiene el filtrado.

4.

Si los lisados fueran mayores de 210 µl la columna tiene que ser cargada una segunda vez: colóquela en un tubo de 2 ml nuevo, agregue el volumen remanente de la mezcla de la etapa 2, haga rotar como en la etapa 3.

5.

Abra cuidadosamente la columna de rotación y agregue 500 µl de regulador AW 1 (este es el mismo para grandes lisados, también) sin humedecer el borde. Cierre la tapa y centrifugue a 6,000 x g durante 1 minuto. Coloque la columna de rotación en un tubo de recolección de 2 ml limpio (provisto), y descarte el tubo de recolección que contiene el filtrado.

6.

Abra cuidadosamente la columna de rotación y agregue 500 µl de regulador AW 2 sin humedecer el borde. Cierre la tapa y centrifugue a velocidad completa 20,000 x g (14,000 rpm) durante 3 minutos.

7.

Opcional: Descarte el filtrado. Con el fin de evitar el arrastre de etanol, deben usarse nuevos tubos (no provistos por Qiagen). Centrifugue de nuevo durante 1 minuto a 20,000 x g (14,000 rpm).

8.

Coloque la columna de rotación DNeasy en un tubo de reacción de 1.5 ml tubo limpio y ya marcado (no provisto por Qiagen), y descarte el tubo de recolección que contiene el filtrado. Abra cuidadosamente la columna de rotación DNeasy y agregue 60 µl del regulador de elución AE (a temperatura ambiente) al centro de la columna. Incube a

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•

Coloque el ensamblaje en la centrífuga, alinee la cinta de la tapa hacia el centro del rotor y haga rotar durante 15 minutos a 14,000 x g.

•

Después de la rotación, extraiga el ensamblaje y descarte el fluido. POR FAVOR TOME NOTA: La eficacia de la centrifugación puede variar dependiendo del modelo de centrífuga en particular y del instrumento usado. ¡Por lo tanto para todas las etapas de centrifugación verifique siempre el volumen de muestra pasado a través de la membrana! Si es necesario, incremente los tiempos de rotación en etapas de 2 minutos.

•

Para desulfonación agregue 400 µl de 0.2 NaOH mol/l a la membrana

•

Coloque el ensamblaje de nuevo en la centrífuga y haga rotar durante 12 minutos a 14,000 x g. Extraiga el ensamblaje y descarte el fluido.

•

Para lavar agregue 400 µl de ddH2O

•

coloque el ensamblaje de nuevo en la centrífuga y haga rotarla durante 12 minutos a 14,000 g. Extraiga el ensamblaje y descarte el fluido.

•

¡Repita esta etapa dos veces adicionales! POR FAVOR TOME NOTA: Después de esto la membrana debería lucir húmeda, pero no debería estar cubierta por un volumen visible de líquido.

•

Para la elución saque el ensamblaje de filtro de la centrífuga.

•

Agregue 75 µl de regulador TE precalentado (50ºC) en el reservorio de la muestra. (Nota: Si la cantidad total es crítica, la elución debería llevarse a cabo durante 2 etapas de elución subsecuentes, por ejemplo 2 x 37.5 µl -debería definirse antes de cada estudio).

•

Incube durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación en un termomezclador a 1,000 rpm.

•

Invierta el dispositivo de filtración y colóquelo en un nuevo tubo Microcon de 1.5 ml.

•

Eluya el ADN de la membrana haciendo rotar durante 5 minutos a 1,000 g.

•

Opcional: Si se desea transfiera el ADN a un tubo nuevo – la tapa de los tubos Microcon tiende a abrirse rápidamente.

•

Almacene el ADN a -80ºC para almacenamiento a largo plazo o a +4ºC para uso inmediato. Ejemplo 3 a) Tratamiento con bisulfito y b) Purificación de ADN con dispositivo Microcon™ y uso de dioxano Equipo necesario:

•

termociclador (por ejemplo, Eppendorf, Tetrad)

•

centrífuga (capaz de hasta 14,000 x g)

•

pipeteadores para volúmenes de 100 µl y 1000 µl Material necesario:

•

Dispositivos Microcon Centrifugal Filter, Microcon® YM-30, Millipore/Amicon

•

Puntas de pipeta (100 µl, 1,000 µl)

•

Tubos de PCR de 200 ul, de pared delgada

•

Tubos de reacción de 1.5 ml

•

Tubos Falcon de 15 ml y 50 ml Reactivos químicos necesarios:

•

bisulfito de sodio (Na2S2O5, MW = 190.1 g/mol), Merck 1.06528.0500

•

sulfito de sodio, anhidro (Na2SO3, MW = 126.04 g/mol ), Fluka 71988

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•

ddH2O grado biología molecular (filtrada por 0,2 µm, tratada con DEPC, sometida a autoclave, libre de DNasas y RNasas)

•

1,4-dioxano, estabilizado (MW = 88.11 g/mol), Riedel de Haën 33147

•

ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico (MW = 250.29 g/mol), Aldrich 23,881-3

•

Tris-hidroximetil-aminometano (M=121.14 g/mol), Merck 1.01549.0500

•

pellas de hidróxido de sodio (MW = 40 g/mol), Merck 1.06482.1000

•

EDTA (Titriplex® III, MW = 372.24 g/mol), Merck 1.08418.0250

Preparación de soluciones:

Solución de bisulfito: Se disuelven disulfito de sodio (4.708 g) y sulfito de sodio (1.128 g) agregando 10 ml de ddH2O (la solución es 4.9 M). Se verifica el pH de la solución -si no está entre 5.45 y 5.5, descarte la solución y repita la preparación.

Agite vigorosamente y si es necesario, caliente la solución a 50ºC en un baño de agua que se somete a vórtex a una velocidad máxima durante 30 segundos. Repita este procedimiento tan frecuentemente como sea necesario hasta que la sal se haya disuelto completamente.

Dioxano solución depuradora de radicales: Disuelva 197.2 mg de ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-cromano-2carboxílico agregando 5 ml de 1,4-dioxano. Someta a vórtex rigurosamente con el fin de asegurarse que no permanezcan partículas sin disolver. El dioxano es peligroso. Por lo tanto tome las precauciones apropiadas cuando se manipule este reactivo químico. Si se van a tratar solamente unas pocas muestras con bisulfito, prepare volúmenes más pequeños.

NaOH 0.2 M: Disuelva 0.32 g de hidróxido de sodio en 40 ml de ddH2O.

Regulador TE: 10 mmol/l Tris, 0.1 mmol/l EDTA, pH 8

General:

•

Este procedimiento puede ser aplicado a una muestra individual o a muchas muestras en paralelo.

•

Las soluciones de trabajo no deben ser almacenadas por periodos prolongados de tiempo. Es mejor prepararlas frescas y escalar las soluciones de acuerdo con el número de muestras que se van a procesar.

•

Todas las soluciones recolectadas como residuos en este procedimiento deben ser recolectadas, por ejemplo en una botella de vidrio y descartadas finalmente como solventes orgánicos libres de halógenos.

Procedimiento: Transferir con pipeta las siguientes soluciones a un tubo de PCR de 200 ul en el orden mostrado:

1.

20 µl de regulador/agua que contiene el ADN que va a ser tratado con bisulfito.

2.

85 µl de solución de bisulfito.

3.

35 µl de solución de dioxano, que contiene el depurador de radicales (el volumen total de la mezcla de reacción es 140 µl)

Programa de temperatura:

•

5:00 minutos desnaturalización de ADN a 99°C

•

25 minutos incubación a 60°C

•

5:00 minutos desnaturalización de ADN a 95 °C

•

1:25 horas incubación a 60°C

•

5:00 minutos desnaturalización de ADN a 95°C

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6.

Haga caer por rotación todas las gotitas de la pared del tubo. Asegúrese de que las tapas del tubo están cerradas herméticamente – de otra manera habrá pérdida de líquido.

7.

Incube durante 40-48 horas a 60ºC en un termomezclador con agitación a 1,000 rpm.

8.

Incube las muestras a > 95ºC durante 10 minutos con el fin de inactivar la proteinasa K. Para esto, fije la temperatura del termomezclador en 99ºC. Transfiera los tubos INMEDIATAMENTE a otro termomezclador temperado a 50ºC, agite a 1,400 rpm e incube durante 5 minutos. Esto evita la formación de una película de parafina.

9.

Aplique 44 µl de este lisado directamente (sin extracción adicional) al ejemplo 8. Ejemplo 5. a) Tratamiento con bisulfito y b) Purificación de ADN por medio del dispositivo Microcon™ y utilizando DME. Equipo necesario:

•

termociclador (por ejemplo Eppendorf, Tetrad)

•

centrífuga (capaz de hasta 14,000 x g)

•

pipeteadores para volúmenes de 100 µl y 1,000 µl Material necesario

•

dispositivos Microcon Centrifugal Filter, Microcon® YM-30 (Millipore/Amicon 42410)

•

puntas para pipeta (100 µl, 1,000 µl)

•

tubos de PCR de 200 µl (por ejemplo Eppendorf 0030 124.359)

•

tubos de 1.5 ml (por ejemplo Eppendorf 0030 120.086)

•

tubos Falcon de 15 ml y 50 ml Reactivos químicos necesarios:

•

bisulfito de sodio (Na2S2O5, MW = 190.1 g/mol), Merck 1.06528.0500

•

sulfito de sodio, anhidro (Na2SO3, MW = 126.04 g/mol), Fluka 71988

•

ddH2O grado de biología molecular (filtrada por 0.2 µm, tratada con DEPC, sometida a autoclave, libre de DNasas y RNasas)

•

dietilenglicoldimetiléter (DME), Merck 8.02934.0250

•

ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico (MW = 250.29 g/mol), Aldrich 23,881-3

•

Tris-hidroximetil-aminometano (C4H8O2, MW = 121.14 g/mol), Merck 1.01549.0500

•

pellas de hidróxido de sodio (NaOH, MW = 40.0 g/mol), Merck 1.06482.1000

•

EDTA (Titriplex® III, C10H14N2O8Na2 * 2H2O, MW = 372.24 g/mol), Merck 1.08418.0250

Preparación de soluciones (suficiente para 80 reacciones):

Solución de bisulfito: Se disuelven bisulfito de sodio (4.708 g) y sulfito de sodio (1.128 g) agregando 10 ml de ddH2O (la solución es 4.9 M). El volumen final es alrededor de 12 ml. Verifique el pH de la solución -si no está entre 5.45 y 5.5, descarte la solución y repita la preparación. Agite vigorosamente y si es necesario, caliente la solución a 50ºC en un baño de agua y luego someta a vórtex a una velocidad máxima durante 30 segundos. Repita este procedimiento tan frecuentemente como sea necesario hasta que la sal se disuelva completamente.

Solución de DME-depurador de radicales: Disuelva 125.3 mg del ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-cromano-2carboxílico agregando 1.0 ml de DME. Someta a vórtex rigurosamente con el fin de asegurar que no permanezcan partículas no disueltas. Si se van a tratar con bisulfito solo pocas muestras, prepare volúmenes menores.

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30

35

NaOH 0.2 M: disuelva 0.32 g de hidróxido de sodio en 40 ml de ddH2O. Regulador TE: 10 mmol/l Tris, 0.1 mmol/l EDTA, pH 8. General:

•

Este procedimiento está diseñado para ser aplicado en tubos de PCR de 200 µl. El número total de muestras está limitado por el número de tubos que pueden ser manipulados en los termocicladores, centrífugas, etc.

•

Las soluciones de trabajo no deberían ser almacenadas durante periodos prolongados de tiempo. Es mejor prepararlas frescas y escalar las soluciones de acuerdo con el número de muestras que se van a procesar.

•

Todas las soluciones recolectadas como residuos en este procedimiento deberían ser recolectadas, por ejemplo, en una botella de vidrio y finalmente descartadas como solventes orgánicos libres de halógenos.

Procedimiento de tratamiento con bisulfito: Transfiera con pipeta las siguientes soluciones en los tubos de PCR en el orden mostrado.

1.

45 µl de regulador/ agua que contiene el ADN que va a ser tratado con bisulfito.

2.

83 µl de solución de bisulfito.

3.

13 µl de solución de DME, que contiene el depurador de radicales.

4.

Mezclar exhaustivamente.

5.

Colocar en pozos de 0,2 ml en el termociclador. ¡El volumen total de la mezcla de reacción es 141 µl! ¡Cierre herméticamente las tapas de los tubos de PCR! Protocolo de Temperatura:

•

5:00 minutos desnaturalización de ADN a 99°C.

•

22:00 minutos incubación a 60°C.

•

3:00 minutos desnaturalización de ADN a 99°C.

•

1:27:00 horas incubación a 60°C.

•

3:00 minutos desnaturalización de ADN a 99°C.

•

2:57:00 horas incubación a 60°C.

•

enfriar a 20°C.

Debido a la alta molaridad de las sales de bisulfito una parte de la sal puede precipitar. Estos precipitados no afectan la reacción del bisulfito. Procedimiento de purificación del ADN:

•

Después de que termina la incubación, transferir la solución de reacción (141 µl) a un tubo de recolección de 1.5 ml.

•

Agregar 260 µl de ddH2O al tubo de recolección.

•

Cierre las tapas, someter a vórtex intensamente y hacer rotar un tiempo corto para retirar las gotas de la tapa.

•

Tomar toda esta solución (400 µl) y transferirla con pipeta al reservorio de muestra de un dispositivo de filtro Microcon ensamblado -¡no toque la membrana con la punta de la pipeta!

•

Selle con la tapa anexa.

•

Coloque el ensamblaje en la centrífuga, alinee la tira de tapas hacia el centro del rotor y haga rotar durante 15 minutos a 14,000 x g (= rcf).

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5

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15

20

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45

El ADN genómico extraído fue modificado por tratamiento con bisulfito. Durante la reacción con bisulfito, se sulfonaron primero las citosinas no metiladas, durante una siguiente etapa las desaminadas, y finalmente las desulfonadas convirtiéndolas en uracilo mientras que las 5'-metilcitosina permaneció sin afectarse.

Con el fin de evitar desplazamientos potenciales del proceso, todas las muestras fueron aleatorizadas en lotes de aproximadamente 30 muestras observando su seguimiento clínico. Esta aleatorización fue transferida a la disposición de placas de 384 pozos de las placas de ensayo dando como resultado una aleatorización satisfactoria para estas placas también. El tratamiento con bisulfito del ADN genómico derivado del material congelado fresco fue llevado a cabo como se describe en lo que sigue. 15 µl de ADN genómico lisado fue transferido por pipeta a una placa de 96 pozos para cada lote de bisulfito de acuerdo con la aleatorización. Después de esto se agregaron a cada pozo 60 µl de solución de bisulfito (4.9 M, pH 5.5; bisulfito de sodio, Merck 1.06528.0500, sulfito de sodio, anhidro, Fluka 71988, ddH2O grado biología molecular) y 25 µl de solución de dioxano que contiene el depurador de radicales (solución dioxano-depurador de radicales: 98.6 mg de ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-cromano-2-carboxílico, Aldrich 23,8813 con 2.5 ml de 1,4-dioxano, Riedel de Haën 33147). El volumen total de 100 µl por pozo fue sellado mediante tiras de tapas.

La mezcla de reacción fue sometida a termociclización mediante el siguiente protocolo:

5:00 minutos desnaturalización de ADN a 99°C

1:30 minutos enfriamiento a 4°C

23:30 minutos incubación a 50°C

3:00 minutos desnaturalización de ADN a 99°C

1:30 minutos enfriamiento a 4°C

1:25:30 horas incubación a 50°C

3:00 minutos desnaturalización de ADN a 99°C

1:30 minutos enfriamiento a 4°C

2:55:30 horas incubación a 50°C

enfriamiento a 4°C

Después de la incubación, la reacción fue transferida a un tubo de recolección de 500 µl (Eppendorf No. 124502, Hamburg, Alemania) y se agregaron 300 µl de ddH2O para incrementar la solubilidad de las sales de bisulfito.

La mezcla completa de 400 µl fue transferida con pipeta a un reservorio de un dispositivo de filtro Microcon™ ensamblado (Microcon™ YM-30, 42410, Millipore, Estados Unidos de América) y se selló con la tapa anexa. El ensamblaje fue centrifugado a 14,000 x g durante 15 minutos. Después de descargar el fluido, se agregaron 400 µl de regulador TE y se centrifugaron de nuevo a la misma velocidad durante 12 minutos. La etapa de lavado fue repetida una vez. Para la desulfonación, se agregaron 100 µl de NaOH 0.2 mol/l (Merck No. 1.06482.1000) al ensamblaje de filtro sin tocar la membrana y se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. El ensamblaje fue centrifugado de nuevo a la misma velocidad durante 10 minutos. La solución residual de hidróxido de sodio fue retirada lavando la membrana con 400 µl de regulador TE y centrifugación a la misma velocidad durante 12 minutos. Para la elución del ADN convertido con bisulfito (bisADN), se transfirió con pipeta 50 µl del regulador TE precalentado (50ºC) (Tris 10 mmol/l, Merck No. 1.01549.0500; EDTA 0.1 mmol/l, pH 8, Merck No. 1.08418.0250) en cada reservorio de muestra y se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Subsecuentemente el dispositivo de filtro fue invertido y colocado en un nuevo tubo Microcon™ de 1.5 ml y centrifugado a 1,000 x g durante 5 minutos. Las muestras de ADN tratado con bisulfito fueron transferidas a una nueva placa de 96 pozos de acuerdo con su orden de muestra especificado. Las muestras de ADN tratado de bisulfito fueron almacenadas a -20ºC.

9.3.2. Tratamiento con bisulfito de muestras de tejido embebido en parafina fijado con formalina (PET)

El tratamiento con bisulfito del ADN genómico derivado de tejido embebido en parafina fijado con formalina fue hecho de acuerdo con el ejemplo 5. Para este proceso, las muestras fueron aleatorizadas no sólo con respecto a su seguimiento clínico, sino también con respecto a sus proveedores. Para las muestras embebidas en parafina fijadas con formalina (PET), se utilizó la mitad del volumen obtenido de la extracción de ADN para la reacción subsecuente con bisulfito.

El procedimiento fue diseñado especialmente para el tratamiento con bisulfito de muestras de tejido embebido en parafina fijado con formalina (muestras PET) para incrementar la cantidad de bisADN resultante. Por lo tanto, se

llevaron a cabo dos reacciones con bisulfito de la misma muestra de ADN y se purificaron sobre la columna de rotación Microcon™. Se llevaron a cabo las siguientes modificaciones en comparación con el protocolo para muestra fresca congelada (véase anteriormente). La primera etapa de transferir con pipeta 15 µl de ADN genómicos lisado a una placa de 96 pozos con 60 µl de solución de bisulfito (para ingredientes véase más arriba) y 25 µl de solución de dioxano (para ingredientes véase más arriba) que contenía el depurador de radicales se hizo dos veces para cada muestra de ADN. La etapa de incubación fue llevada a cabo con el mismo programa de termociclador que para las muestras frescas congeladas. Después de la incubación, ambas reacciones (200 µl en total) originadas de la misma muestra de ADN fueron transferidas a un tubo de recolección de 500 µl (Eppendorf No. 124.502, Hamburg, Alemania), mientras que cada pozo fue lavado con 100 µl de ddH2O y también transferido al tubo de recolección que contenía finalmente 400 µl de solución de reacción. Después de mezclar brevemente, la solución fue transferida con pipeta al reservorio de muestra de un dispositivo de filtro Microcon™ ensamblado y se purificó, desulfonó y eluyó el ADN de la muestra fresca congelada. Las muestras de ADN tratadas con bisulfito fueron almacenadas a -20ºC.

9.4. Preparación de estándares de ADN para ensayos QM:

9.4.1. Preparación de estándares de cuantificación

Se trataron lotes de 2,000 ng de ADN genómico humano (Promega) con bisulfito. Por esto se mezclan 100 µl de ADN (2,000 ng) con 354 µl de solución de bisulfito y 146 µl de solución de dioxano. Por lo tanto, se aplicó el siguiente programa de temperatura para la reacción con bisulfito: 1. Baño de agua a 95ºC durante 3 minutos; 2. Termomezclador a 50ºC durante 30 minutos, agitando a 1,000 rpm; 3. Baño de agua a 95ºC durante 3 minutos.; 4. Termomezclador a 50ºC, 1.5 horas, con agitación a 1,000 rpm; 5. Baño de agua a 95ºC, 3 minutos; 6. Termomezclador a 50ºC durante 3 horas, agitación a 1,000 rpm). La desalinización, lavado y desulfonación se hizo a través de columnas Microcon™ YM30 (Millipore/Amicon) siguiendo las instrucciones de trabajo. La cuantificación del ADN estándar se hizo con un espectrómetro UV.

9.4.2. Preparación de estándares de calibración

ADN por desplazamiento molecular (MDA)

El ADN por desplazamiento molecular (MDA) se genera de acuerdo con el kit de amplificación GenomiPhi™ DNA (Amersham Bioscience). En resumen, se aplica ADN genómico a una Phi-DNA-polimerasa en la presencia de cebadores aleatorios. Esto lleva a una amplificación del genoma completo de fragmentos de ADN que no están metilados.

Tratamiento Sss1

Para generar ADN MDA metilado, se trataron 13 tubos de 4.5 mg de ADN-MDA (700 ng/ml) con Sss1 en la siguiente reacción con un volumen total de 75 µl (manteniendo las soluciones de reacción sobre hielo):

4.5 µg MDA-DNA (6,3 µl)

57.3 µl H2O

0.375 µl 200 x SAM

3 µl (12 U) Sss1

7.5 µl NE-regulador2

La incubación se llevó a cabo a 37ºC en un baño de agua. Después de aproximadamente 3 horas, se agregaron 0.375 µl de SAM y después de otras 5 horas, se agregaron 3 µl de Sss1 (2 veces). Se incuba durante la noche y subsecuentemente se inactiva a 65ºC durante 10 minutos. Se reúnen los 13 tubos (975 µl) se toman 967 µl y se coloca ADN en un nuevo tubo Falcon de 10 ml. Se agregan 2 veces 967 µl de agua (20 ng/µl) y se toman alícuotas del ADN en 25 tubos Eppendorf de 1.5 ml que contienen cada uno 100 µl (2 µg).

Tratamiento con bisulfito del ADN-MDA tratado con Sss1

Se trataron con bisulfito 24 tubos cada uno de 2 µg. Esto se hizo mezclando 100 µl de ADN con 354 µl de solución de bisulfito y 146 µl de solución de dioxano. Después de esto se aplicó el siguiente programa de temperatura para la reacción con bisulfito: 1. Baño de agua a 95ºC, 3 minutos; 2. Termomezclador a 50ºC, 30 minutos, agitación a 1,000 rpm; 3. Baño de agua a 95ºC, 3 minutos; 4. Termomezclador a 50ºC, 1.5 horas, agitando a 1,000 rpm; 5. Baño de agua a 95ºC durante 3 minutos; 6. Termomezclador a 50ºC, agitando a 1,000 rpm, 3 horas. La desalinización, lavado y desulfonación se hizo a través de columnas Microcon™ YM-30 (Millipore/Amicon).

Tratamiento con bisulfito de ADN-MDA no tratado con Sss1

Para el tratamiento con bisulfito de ADN-MDA, se toma 82.9 µl de ADN-MDA (700 ng/µl), y se coloca en un nuevo tubo Falcon de 10 ml. Se agregan 3 veces 939 µl de agua (20 ng/µl), se toman alícuotas del ADN en 25 tubos Eppendorf de 1.5 ml que contienen 100 µl cada uno (2 µg), y se lleva a cabo 24 veces lo siguientes: Se mezclan 100 µl de ADN con 354 µl de solución de bisulfito y 146 µl de solución de dioxano y se aplica a continuación el siguiente programa de

5 temperatura para la reacción con bisulfito: 1. Baño de agua a 95ºC, 3 minutos; 2. Termomezclador a 50ºC, 30 minutos, agitando a 1,000 rpm; 3. Baño de agua a 95ºC 3 minutos; 4. Termomezclador a 50ºC, 1.5 horas, agitando a 1,000 rpm; 5. Baño de agua a 95ºC durante 3 minutos; 6. Termomezclador a 50ºC, agitando 1,000 rpm, 3 horas. La desalinización, lavado y desulfonación se hace a través de columnas Microcon™ YM-30 (Millipore/Amicon).

Cuantificación del ADN-MDA convertido con bisulfito tratada con Sss1-y ADN-MDA no tratado con Sss1

10 El ADN-MDA tratado con Sss1 y el ADN-MDA no tratado con Sss1 fue diluido hasta 1 a 2 y 1 a 10 cada muestra, y se determinó la concentración de ADN en duplicado utilizando el ensayo C3 y el estándar de cuantificación preparado de acuerdo con 9.4.1. Ambos estándares fueron diluidos 1 a 10 y 1 a 100. Después de esto, se utilizaron 10 µl para la cuantificación por UV.

La determinación del sulfito residual se llevó a cabo utilizando el Merck Sulfit-Küvettentest 1.1 (Merck, Darmstadt) de

15 acuerdo con el procedimiento descrito para la medición de muestras. Las concentraciones de sulfito estuvieron por debajo de 100 mg/l dando como resultado valores más abajo del valor crítico de 50 mg/l de sulfito en el PCR a través de la dilución de la solución de reserva.

Preparación de las mezclas estándar de calibración

Los estándares de calibración fueron preparados utilizando las soluciones de reserva de ADN-MDA tratadas con Sss1

20 y ADN-MDA no tratadas con Sss1 tratadas separadamente para los conjuntos de muestras de la población no tratada ER+ N0 y de la población tratada y ER+ N0 TAM de acuerdo con la Tabla 1a. Para eso, preparamos soluciones de ADN de 14 diferentes niveles de metilación (serie logarítmica) con la concentración de 1 ng/µl y se distribuyeron 40 µl de cada nivel a varias placas de 96 pozos (placa 05) para transferencia con pipeta automática en placas de ensayo de 384 pozos.

25 Tabla 1a: Preparación de estándares de calibración. ADN-MDA tratado con Sss1 y ADN-MDA no tratado con Sss1 fueron mezclados en las proporciones indicadas.

ADN ESTÁNDAR

ADN MDA 22.0 ng/µl ADN-MDA tratado con Sss1 28 µg/µl

% de metilación

arriba abajo ng necesarios ng arriba ng abajo µl arriba µl abajo + µl H2O -> 10ng/µl

0

0

1.00 1500 0 1500 0 75 90

4

0.04 0.98 1500 60 1440 2.36 72 90.64

10

0.1 0.90 1500 150 1350 5.89 67.5 91.61

17

0.17 0.83 1500 255 1245 10.02 62.25 92.73

25

0.25 0.75 1500 375 1125 14.73 56.25 94.02

34

0.34 0.66 1500 510 990 20.04 49.5 95.46

44

0.44 0.56 1500 660 840 25.93 42 97.07

50

0.5 0.50 1500 750 750 29.46 37.5 98.04

56

0.56 0.44 1500 840 660 33 33 99

66

0.66 0.34 1500 990 510 38.89 25.5 100.61

75

0.75 0.25 1500 1125 375 44.2 18.75 102.05

83

0.83 0.17 1500 1245 255 48.91 12.75 103.34

90

0.9 0.10 1500 1350 150 53.04 7.5 104.46

96

0.96 0.04 1500 1440 60 56.57 3 105.43

100

1 0.00 1500 1500 0 58.93 0 106.07

441.96

562.5

Verificación del estado de metilación de ADN tratado con bisulfito

Para verificar el estado de metilación del ADN-MDA tratado con Sss1 y ADN-MDA no tratado con Sss1, se llevó a cabo una secuenciación con bisulfito. Ambos tipos de ADN fueron amplificados utilizando los siguientes pares de cebadores que producen fragmentos que cubren las regiones que fueron amplificadas por los ensayos QM. La longitud de los productos de PCT para secuenciación está entre 200 y 500 bp.

Cebador 2064:300P22 Seq ID NO 1: GGAGGGGGTAGAGTTATTAGTT

Cebador 2064:514O22 Seq ID NO 2: TATACTTCCTCAAACAACCCTC

Cebador 4063:1431P22 Seq ID NO 3: GTGATATTTGGGGATTGTTATT

Cebador 4063:1868O20 Seq ID NO 4: ACTCCCTCCCCTATCTTACA

Cebador 15665:699P21

Cebador 15665:1124O22

Seq ID NO 5: TTTGTTGGGATTTGTTAGGAT

Seq ID NO 6: AAACATTTTACCCCTCTAAACC

Cebador 15947:907P24 Seq ID NO 7: TGATTGTGTAGATTATTTTTGGTT

Cebador 15947:1360O23 Seq ID NO 8: CAAACTCTCTAAACCTCAATCTC

Cebador 2265:176P22 Seq ID NO 9: TTGGTGATGTTGATTAGAGTTT

Cebador 2265:582O22 Seq ID NO 10: TAAAACACCTTACATTTTCCCT

Cebador 15908:782P22 Seq ID NO 11: GGTAGAGGAAGTAGTTGGTTTG

Cebador 15908:1228O23 Seq ID NO 12: CTTTTATATTTCTCCCAATCTCC

Cebador 0003522:2102Q21 Seq ID NO 13: GTAGGGGAGGGAAGTAGATGT

Cebador 0003522:1738R23 Seq ID NO 14: TCCTCAACTCTACAAACCTAAAA

La secuenciación con bisulfito fue hecha de acuerdo con protocolos estándar y se llevó a cabo en un secuenciador ABI 3770 (placa de 96 pozos). Las secuencias y las proporciones de metilación esperadas pudieron ser confirmados por los fragmentos usados (datos no mostrados).

10 9.5.Cuantificación y ajuste de la concentración de ADN con bisulfito

9.5.1. Determinación de la concentración de sulfito en el ADN con bisulfito

Las concentraciones incrementadas de sulfito residual influyen en el ensayo QM. Por lo tanto, decidimos determinar la concentración de sulfito para cada una de las muestras tratadas con bisulfito de ambos conjuntos de muestras. El sulfito incrementado (mayor de 50 mg/l en la reacción de PCR) afecta la amplificación por PCR del ADN con bisulfito

15 dando como resultado valores de CT más altos en comparación con las concentraciones de sulfito por debajo de este rango. Los valores de CT representan el ciclo de umbral del punto de entrecruzamiento de un PCR en tiempo real.

El sulfito de sodio fue utilizado para preparar una solución de reserva estándar de sulfito con 1 g/l de SO32-en 1x regulador TE. Produjimos soluciones estándar desde 100 mg/l a 1.56 mg/l de sulfito a través de dilución paso a paso y vórtex intensivo entre 2 etapas de dilución para producir la curva estándar.

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imagen22

Población ER+ N0 TAM tratada

Cantidad de ADN (ajustada) en el ensayo QM

Número de muestras

0 -1 ng

88

0 ng

20

9.6. Ejecuciones del ensayo QM

El ADN tratado con bisulfito y las muestras ajustadas en concentración de la población ER+ N0 no tratada fueron almacenadas en 7 placas de 96 pozos (placas 01-07) y la población ER + N0 no tratada en 8 placas de 96 pozos

5 (placa 01-08). Para medir el conjunto de muestra completo de ambas poblaciones ejecutamos 2 placas de reacción de PCR de 384 pozos para cada ensayo y población QM. Cada placa de ensayo QM contiene las muestras de 3 o 4 placas de 96 pozos (88 pozos usados realmente por placa) y 1 placa de 96 pozos con ADN estándar (14 mezclas del ADN de calibración y agua para la reacción de PCR de control sin plantilla, véase Tabla 15 más adelante). Las repeticiones de las mediciones de las muestras se hicieron repitiendo la ejecución del ensayo QM 3 veces.

10 Las placas de PCR de 384 pozos también fueron transferidas con pipeta con la estación de trabajo TECAN. El programa de transferencia con pipeta transfirió inicialmente 10 µl de la mezcla maestra y después 10 µl del ADN respectivo en el pozo designado. Como se describió para la etapa de cuantificación, los ADN de las placa 01 y 02 dieron como resultado colores naranja y de las placas 03 y 04 color azul sobre la placa de PCR de 384 pozos (véase 9.5.2.). Los pozos de ADN estándar fueron señalados en verde claro y las reacciones de PCR de control negativo en

15 verde oscuro sobre la placa final. Los componentes de la mezcla maestra para cada ensayo de QM fueron adaptados de acuerdo con la tabla 14. La mezcla fue transferida con pipeta en un tubo Falcon y distribuida en 8 viales de tapa de rosca de 500 µl para transferencia por pipeta automática con la estación de trabajo TECAN.

Tabla 14: Componentes de PCR para placa de PCR de 384 pozos (por ejemplo, para el ensayo QM 3522-II).

Número de reaciones:384

384 Factor: 1.1

Componente

Concentración de reserva µl/reacción µl en MM Concentración final

Regulador de reacción Ampli

10x 2 844.8 1x

Ampli MgCl2

25 mmol/l 2 844.8 2.5 µmol/l

dNTPs

25 mmol/l cada una 0.2 84.48 250 µmol/l

Mezcla de cebadores

6.25 mmol/l 2 844.8 625 nmol/l

Sonda cg

4 µmol/l 1 422.4 200 nmol/l

Sonda Tg

4 µmol/l 1 422.4 200 nmol/l

AmpliTaqGold

5U/µl 0.2 84.48 1U

Agua

1.6 675.84 Ad 10

10

4224

20 Tabla 15: Mezclas de ADN estándar de calibración y control sin plantilla (placa 05) (Ntc = Sin control de plantilla)

Placa de 96 pozos

1

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

0% 66% Ntc

imagen23

imagen24

Se analizaron secciones de 24 especímenes de biopsia de próstata diferentes embebidas en parafina fijadas con formalina (1-3 núcleos de biopsia por bloque de parafina). Se procesaron dos muestras (a y b) de cada espécimen consistiendo cada uno de 5 secciones (10 µm) dando como resultados 48 muestras en total. Las muestras fueron procesadas de acuerdo con el ejemplo 7 seguido por un tratamiento con bisulfito y purificación del ADN por medio del5 dispositivo Microcon™ como se describió en el ejemplo 8. El rendimiento de ADN después del tratamiento con bisulfito y la purificación subsecuente fue determinado de acuerdo con el ejemplo 10c. La Figura 5 muestra que el rendimiento del ADN purificado con bisulfito y tratado es más de 100 ng para al cada una de las dos muestras por espécimen, excepto para el espécimen 5 y 6. Las muestras del espécimen 6 dieron como resultado más de 500 ng de ADN con bisulfito. El ADN producido de ambas muestras de cada uno de los especímenes muestra una fuerte concordancia.

10 Esto ilustra la alta reproducibilidad y confiabilidad del método de acuerdo con la invención. La mayoría de las muestras comprenden 20%-50% de ADN amplificable (Figura 6) el cual está caracterizado por la relación de cantidades de ADN resultantes de la cuantificación por medio del ejemplo 10c y del valor UV (véase ejemplo 10a).

Ejemplo 10. Amplificación de los amplicones por PCR de diferentes longitudes a partir de tejidos embebidos en parafina fijados con formalina (PET)

15 Se procesaron varios especímenes diferentes de tejidos embebidos en parafina fijados con formalina (PET) (4 muestras de seno, 12 de vesícula, 12 de amígdalas) de acuerdo con el ejemplo 2. El ADN purificado después del tratamiento con bisulfito fue reunido y subsecuentemente sometido a PCR en el cual deberían amplificarse los amplicones de diferentes longitudes (185 bp -711 bp). El PCR fue llevado a cabo en un volumen total de 25 µl que contenían 1 U y 3 U de Hotstar Taq polimerasa (Qiagen), respectivamente, 12.5 pmol de cebadores de avance y

20 retroceso (secuencias de cebadores como se muestran en la Tabla 17a), un regulador para PCR (Qiagen), 0.2 mmol/l de cada uno de dNTP (Fermentas). La ciclización se realizó utilizando un Mastercycler (Eppendorf) con las siguientes condiciones: 15 minutos a 95ºC y 40 ciclos a 95ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 45 segundos y 72ºC durante

1:30 minutos. Cada PCR contenía 30 ng de ADN de plantilla. Esta cantidad está basada sobre una cuantificación por

PCR en tiempo real anterior según lo ejemplifica el ejemplo 10b (ensayo HB14), y por lo tanto refleja la partición 25 amplificable de la cantidad de ADN total presente físicamente.

Tabla 17a: Tamaños de amplicón y las respectivas secuencias cebadoras.

Tamaño del amplicón [bp]

Cebador de avance (5’->3’) Cebador de retroceso (5’->3’)

185

Seq ID No 29: TTTTTGTAGTTTAGAAGGAGGTTAG Seq ID No 30: ACACAATAAATTCAACCACCAA

210

Seq ID No 31: GGGAGATTTAATTTGGGG Seq ID No 32: CACCCTCTAATAACCAACCA

235

Seq ID No 33: TTAGGTATAAGTTGGTGGTGG Seq ID No 34: CCCATAAACAACCCCTAAAA

260

Seq ID No 35: AGGTATAGGATGGGGAATTAGT Seq ID No 36: AACCCAAACCCTTATACAAAC

285

Seq ID No 37: GTTTTTGGAGTTAATTGGGAG Seq ID No 38: CACCCCCATCATTACTATTC

310

Seq ID No 39: AGGGTAGAGGGTGTTGGT Seq ID No 40: CCAAAACTATAAACCTTCCCA

335

Seq ID No 41: TTTAGTATGGGTTGAGAGGAGT Seq ID No 42: CCTCTTTCCTAAAACTACACATTC

360

Seq ID No 43: GGATTATTGTTGGGTATTTGTT Seq ID No 44: ACACTTCCCTAAAATCTTCAAA

385

Seq ID No 45: GTTGGATTTGTTTAGAGAGAGG Seq ID No 46: ACATTTAACTCTTTATCCCAAAA

410

Seq ID No 47: TTATTTGATGGGGATAGAGATT Seq ID No 48: ACAAACAACACACCCTCATAC

435

Seq ID No 49: TGTAATGAAAGAAGGTGTTGAG Seq ID No 50: TTAACTAAACCATCCATAACCC

460

Seq ID No 51: GGATTATAGGAATTAGAATGGGT Seq ID No 52: TCTTTCCAACTCAACATCTTACT

485

Seq ID No 53: TGGTGGTATGGATTGGATAA Seq ID No 54: TCCCCCAAATAACACAATATAC

511

Seq ID No 55: AGAGGAAAGAGTAAGGAATTTTT Seq ID No 56: CTTATCCCCCACAAAACC

535

Seq ID No 57: GGTGGAGGGAGAGTTAAGG Seq ID No 58: CCAACAAAACGCCCTCTCC

561

Seq ID No 59: GATTGAGATTATTTTGGGTTTT Seq ID No 60: ACTTAAACCTTCCCTCTCCAC

586

Seq ID No 61: TTAAGTATTGGATTTGGGGTTA Seq ID No 62: ACCTACCCTCTAACTCTACAAAAA

imagen25

imagen26

imagen27

cantidad de ADN no convertido por el tratamiento con bisulfito y por lo tanto representa el ADN genómico) y de acuerdo con el ejemplo 10c (ensayo C3; determinación solamente del ADN convertido por el tratamiento con bisulfito). Los resultados de estas cuantificaciones se muestran en la Tabla 19, en la Figura 18 y en la Figura 19, respectivamente.

Tabla 19: Procesamiento de 24 especímenes de tejido embebidos en parafina fijados con formalina. Resultados de la cuantificación en los ensayos C3 y CFF1 (ejemplo 10c y 10d, respectivamente) y la relación entre ellos. Todos los datos son promedios de dos muestras procesadas independientemente por espécimen (ejemplo 16).

Muestra Rendimiento de ADN – ensayo CFF1 Desviación estándar

Rendimiento de ADN – ensayo C3 Desviación estándar

PET P1 31.51 5.35

26.85 3.73

PET P2 307.22 42.33

143.93 9.34

PET P4 167.69 23.03

103.21 2.18

PET P5 176.06 33.61

86.27 17.43

PET P6 598.59 37.35

358.71 28.01

PET P7 137.10 1.56

74.49 1.40

PET P8 511.88 79.05

219.63 25.52

PET P9 189.48 42.02

121.15 36.88

PET P10 158.89 4.36

83.30 8.25

PET B2 3.57 0.76

1.86 0.58

PET B5 1.88 0.03

0.83 0.67

PET B6 34.20 1.56

10.17 2.18

PET B7 48.11 15.50

21.81 5.51

PET B9 9.34 0.05

2.51 0.40

PET B10 2.57 2.18

0.56 0.61

ST-268 301.94 83.41

171.65 26.14

ST-269 304.14 151.26

173.86 93.37

ST-270 106.51 25.52

0.29 0.21

ST-271 125.88 16.18

1.23 0.03

ST-272 1422.66 1959.30

597.51 841.84

ST-273 205.11 6.22

3.83 0.75

ST-274 521.57 3.11

271.13 13.07

ST-275 264.96 1.24

169.23 16.50

ST-276 547.98 59.13

289.39 38.90

Ejemplo 14. Procesamiento de 24 muestras embebidas en parafina fijadas con formalina derivadas de tejido de próstata o seno, a escala de placa.

10 Se procesaron 24 especímenes de tejido embebido en parafina fijado con formalina (próstata: PET P1 -P10 y ST-268 -ST-276] y seno: PET B2 -B10) de acuerdo con el ejemplo 1. Se procesaron cuatro muestras por espécimen dando como resultado 96 muestras en total. Cada muestra consistía de 3 secciones (10 µm cada una) provistas en tubos de

1.5 ml. El ADN resultante tratado con bisulfito y purificado fue caracterizado de acuerdo con el ejemplo 10d (ensayo CFF1; determinación de la cantidad de ADN convertido por tratamiento con bisulfito y la cantidad de ADN no convertida

15 por el tratamiento con bisulfito y por lo tanto representa el ADN genómico) y de acuerdo con el ejemplo 10c (ensayo C3; determinación de solamente el ADN convertido por el tratamiento con bisulfito).

Resultados de estas cuantificaciones se muestran en la Tabla 20, Figura 20 y Figura 21, respectivamente.

Tabla 20: Procesamiento de 24 especímenes de tejido embebido en parafina fijado con formalina. Los resultados de la cuantificación con los ensayos C3 y CFF1 (ejemplo 10c y 10d, respectivamente) y la relación entre ellos. Todos los

20 datos son promedio de cuatro muestras procesadas independientemente por espécimen

Muestra

Rendimiento de Aensayo CFF1 DN –Desviación estándar Rendimiento de ensayo C3 ADN –Desviación estándar

PET P1

71.03 3.65 85.42 7.50

Muestra

Rendimiento de Aensayo CFF1 DN –Desviación estándar Rendimiento de ensayo C3 ADN –Desviación estándar

PET P2

920.67 203.57 556.83 129.87

PET P4

311.33 41.97 173.67 36.73

PET P5

273.67 46.65 194.33 30.60

PET P6

263.33 31.26 181.50 17.29

PET P7

736.67 116.22 398.50 60.04

PET P8

411.00 29.14 225.83 23.96

PET P9

319.83 98.97 256.75 70.86

PET P10

230.00 44.73 139.50 15.17

PET B2

75.53 40.85 61.69 39.48

PET B5

2.72 1.99 2.19 1.87

PET B6

7.79 5.25 9.07 12.10

PET B7

10.27 6.96 9.40 5.90

PET B9

6.47 2.25 3.02 3.07

PET B10

42.92 24.85 15.53 9.48

ST-268

948.00 206.25 585.83 175.80

ST-269

969.00 135.27 515.83 92.15

ST-270

2973.33 363.52 1075.83 134.40

ST-271

2983.33 441.33 1054.17 207.50

ST-272

1641.67 307.50 980.83 227.73

ST-273

5263.33 848.62 2598.33 357.87

ST-274

479.67 47.60 259.58 70.33

ST-275

3856.67 896.37 1794.17 470.42

ST-276

871.67 220.93 320.08 94.72

Ejemplo 15. Procesamiento de muestras derivadas de 150 especímenes de cáncer de seno embebidos en parafina fijados con formalina

Se procesaron muestras de 150 muestras de cáncer de seno embebidos en parafina fijados con formalina (E001

5 E150) de acuerdo con el ejemplo 9. Cada muestra consistió de 3 secciones (10 µm cada una) las cuales fueron provistas en tubos de 1.5 ml. El rendimiento del ADN genómico después de la extracción fue determinado usando espectrofotometría UV (ejemplo 10a) y el ensayo CFF1 (ejemplo 10d). El rendimiento de ADN convertido por bisulfito después del tratamiento con bisulfito y la purificación subsecuente fue determinado utilizando el ensayo C3 (ejemplo 10c).

10 Tabla 21: Rendimientos de ADN convertido con bisulfito y no convertido con bisulfito derivado de especímenes de cáncer de seno embebidos en parafina fijados con formalina. El ADN fue cuantificado de acuerdo con el Ejemplo 10d (ensayo CFF1), de acuerdo con el ejemplo 10c (ensayo C3) y de acuerdo con el ejemplo 10a (espectrofotometría UV).

Muestra

ADN genómico [ng] total en 70 ul de extracto (basado en determinación con UV; ejemplo 10a) ADN genómico [ng] total en 70 ul de extracto (con base en el ensayo CFF1; ejemplo 10d) Rendimiento total [ng] de ADN convertido con bisulfito en 50 µl de eluido después de purificación (con base en el ensayo C3; ejemplo 10c)

E001

13545.0 1812.0 1760.6

E002

6125.0 688.6 215.8

E003

5760.0 348.9 140.0

E004

20160.0 338.6 174.5

E005

6852.6 1017.9 514.2

Muestra

ADN genómico [ng] total en 70 ul de extracto (basado en determinación con UV; ejemplo 10a) ADN genómico [ng] total en 70 ul de extracto (con base en el ensayo CFF1; ejemplo 10d) Rendimiento total [ng] de ADN convertido con bisulfito en 50 µl de eluido después de purificación (con base en el ensayo C3; ejemplo 10c)

E006

26460.0 11173.0 1541.6

E007

16905.0 8213.1 2410.4

E008

16012.5 9725.2 4452.0

E009

15866.7 8657.4 1749.4

E010

27195.0 14169.6 200.6

E011

7680.0 4115.0 1009.2

E012

16380.0 2102.2 1032.4

E013

1866.7 1962.8 1374.3

E014

15225.0 2430.8 1028.0

E015

13835.3 1779.8 857.2

E016

17684.2 1866.5 894.2

E017

10350.0 1240.1 240.1

E018

8085.0 1326.0 873.7

E019

16357.9 3256.2 1341.4

E020

21123.5 3401.2 1785.1

E021

10278.9 1395.2 1201.2

E022

20432.4 4540.2 2970.8

E023

22976.5 2506.7 1651.6

E024

5250.0 1691.7 1027.4

E025

24465.0 4408.7 2358.7

E026

17170.6 8749.5 3195.7

E027

17616.7 2819.4 1327.1

E028

4817.6 11498.9 4516.8

E029

30333.3 4922.3 2185.2

E030

16305.9 16442.2 6160.9

E031

7455.0 3703.1 1278.7

E032

10005.9 4757.4 2073.8

E033

9173.7 4922.1 1628.7

E034

8715.0 4010.9 1686.4

E035

10994.1 6841.9 1496.6

Muestra

ADN genómico [ng] total en 70 ul de extracto (basado en determinación con UV; ejemplo 10a) ADN genómico [ng] total en 70 ul de extracto (con base en el ensayo CFF1; ejemplo 10d) Rendimiento total [ng] de ADN convertido con bisulfito en 50 µl de eluido después de purificación (con base en el ensayo C3; ejemplo 10c)

E036

10500.0 4358.7 2828.2

E037

20650.0 5711.1 4439.0

E038

30333.3 3311.1 2801.3

E039

9240.0 2956.5 2325.2

E040

6930.0 2261.9 981.5

E041

8505.0 446.5 387.1

E042

4550.0 789.6 669.6

E043

3315.8 779.7 425.8

E044

4095.0 845.1 489.5

E045

4089.5 795.8 531.4

E046

6052.9 107.2 164.8

E047

11200.0 200.1 113.4

E048

5682.4 149.7 248.8

E049

3990.0 76.3 35.9

E050

4531.6 235.4 85.7

E051

13042.1 6107.0 2887.2

E052

8295.0 3162.3 1063.5

E053

11235.0 4412.9 3815.7

E054

8866.7 3196.3 2329.3

E055

7245.0 2458.7 1452.5

E056

14595.0 3257.7 5484.6

E057

11970.0 3005.9 2533.5

E058

17047.1 3892.1 2368.3

E059

13094.1 6094.4 4047.3

E060

35870.3 2849.6 3108.8

E061

22750.0 715.8 440.5

E062

13920.0 840.0 340.1

E063

14452.9 3292.1 3313.1

E064

4095.0 761.4 510.1

E065

3705.9 2855.2 3153.8

Muestra

ADN genómico [ng] total en 70 ul de extracto (basado en determinación con UV; ejemplo 10a) ADN genómico [ng] total en 70 ul de extracto (con base en el ensayo CFF1; ejemplo 10d) Rendimiento total [ng] de ADN convertido con bisulfito en 50 µl de eluido después de purificación (con base en el ensayo C3; ejemplo 10c)

E066

2625.0 244.7 11.2

E067

3383.3 417.2 362.6

E068

3088.2 718.6 321.9

E069

2216.7 118.0 17.3

E070

11520.0 214.8 71.5

E071

10623.5 1463.9 1361.2

E072

26950.0 2064.7 2121.6

E073

12723.5 2277.5 2169.1

E074

2333.3 3841.5 3249.4

E075

11488.2 1545.8 1235.2

E076

31360.0 14426.1 5108.5

E077

18060.0 8039.9 3387.0

E078

23415.0 14134.2 6859.3

E079

14000.0 10264.3 5371.6

E080

21735.0 9167.2 2812.9

E081

6883.3 31543.5 25884.0

E082

23730.0 12237.9 7183.1

E083

17541.2 7782.0 4135.6

E084

30836.8 19137.9 12754.5

E085

21466.7 13501.5 5589.2

E086

16026.3 3724.7 2177.5

E087

9173.7 1701.5 1091.9

E088

27176.5 3309.1 1072.5

E089

19950.0 3831.9 1739.0

E090

23566.7 3985.7 3139.2

E091

2594.1 5222.6 5906.1

E092

19600.0 2055.6 1131.1

E093

10500.0 2585.4 1223.6

E094

15093.8 4220.0 300.6

E095

9555.0 1630.1 840.0

Muestra

ADN genómico [ng] total en 70 ul de extracto (basado en determinación con UV; ejemplo 10a) ADN genómico [ng] total en 70 ul de extracto (con base en el ensayo CFF1; ejemplo 10d) Rendimiento total [ng] de ADN convertido con bisulfito en 50 µl de eluido después de purificación (con base en el ensayo C3; ejemplo 10c)

E096

14700.0 2675.9 1076.2

E097

21525.0 4163.3 1840.9

E098

13416.7 4691.0 883.6

E099

13230.0 2024.5 1765.6

E100

12250.0 1903.4 852.3

E101

4725.0 4695.8 1007.1

E102

14910.0 6633.8 2066.2

E103

19841.4 10410.8 3738.5

E104

22283.3 10963.4 4059.1

E105

31994.1 15319.9 3397.5

E106

6930.0 968.2 511.4

E107

5526.3 616.5 261.6

E108

5968.4 875.8 175.0

E109

5906.3 753.1 234.5

E110

4830.0 782.8 594.2

E111

2625.0 4344.9 2081.4

E112

14880.0 4266.1 2366.6

E113

6090.0 2727.2 1636.4

E114

10710.0 4280.6 2824.6

E115

7665.0 3166.8 3354.9

E116

6176.5 342.0 64.5

E117

2216.7 385.3 146.0

E118

50770.6 486.5 104.3

E119

4935.0 439.2 406.8

E120

10266.7 929.9 516.2

E121

8925.0 2893.5 259.9

E122

13533.3 7499.9 3242.3

E123

49411.8 16014.1 8003.4

E124

19010.5 6660.4 4336.0

E125

10383.3 2631.8 1100.9

Muestra

ADN genómico [ng] total en 70 ul de extracto (basado en determinación con UV; ejemplo 10a) ADN genómico [ng] total en 70 ul de extracto (con base en el ensayo CFF1; ejemplo 10d) Rendimiento total [ng] de ADN convertido con bisulfito en 50 µl de eluido después de purificación (con base en el ensayo C3; ejemplo 10c)

E126

23231.3 8386.5 3450.2

E127

8820.0 2078.4 2172.0

E128

2730.0 676.6 166.4

E129

32160.0 1465.8 606.5

E130

4083.3 Indeterminado 1068.5

E131

3045.0 396.5 181.0

E132

3780.0 507.3 515.9

E133

7669.6 526.0 570.5

E134

6650.0 896.0 561.3

E135

6052.9 903.1 314.5

E136

22260.0 6770.9 2886.7

E137

19600.0 4402.2 1359.9

E138

8400.0 10852.0 4979.4

E139

19635.0 6613.7 4495.2

E140

27650.0 9160.8 6587.8

E141

26194.7 8656.0 4678.9

E142

4550.0 10660.7 3116.2

E143

26600.0 9404.2 2983.5

E144

33705.0 12358.5 4073.3

E145

10252.9 5114.6 2774.1

E146

31850.0 19365.9 5729.1

E147

24780.0 11532.6 6048.3

E148

21000.0 11540.2 4106.7

E149

2400.0 13681.8 6231.2

E150

29750.0 18923.4 3814.9

Ejemplo 16. Procesamiento de células microdiseccionadas por captura de láser

Las células microdiseccionadas por captura de láser de un espécimen de cáncer de seno embebido en parafina fijado con formalina fueron tratadas con bisulfato a) Microdisección. La sección de 10 µm que fue montada sobre una lámina de microscópico fue sometida a un procedimiento de tinción

con azul de metileno y subsecuentemente microdiseccionada por captura de láser. La microdisección fue llevada a

imagen28

Claims (1)

1. imagen1