ES2305305T3

ES2305305T3 - Procedimiento para la deteccion de una metilacion de citosina en islotes de cpg.

Info

Publication number: ES2305305T3
Application number: ES02776809T
Authority: ES
Inventors: Kurt Berlin
Original assignee: Epigenomics AG
Current assignee: Epigenomics AG
Priority date: 2001-10-05
Filing date: 2002-10-04
Publication date: 2008-11-01
Anticipated expiration: 2022-10-04
Also published as: WO2003031649A2; DE10151055A1; EP1432828A2; DE50212159D1; US20050053937A1; DE10151055B4; EP1432828B1; WO2003031649A3; ATE393239T1; US8029996B2

Abstract

Procedimiento para el análisis del grado de metilación dentro de un islote de CpG en muestras de ADN, caracterizado porque se realizan las siguientes etapas de procedimiento: a) a partir de una muestra se extrae el ADN, b) el ADN se trata, preferiblemente con un bisulfito (= disulfito, hidrógeno-sulfito), de tal manera que la citosina es transformada en una base diferente en cuanto al comportamiento de apareamiento de bases en el dúplex de ADN, mientras que la 5-metilcitosina permanece inalterada, c) uno o varios cebadores de oligonucleótidos se hibridan con el ADN tratado, d) los cebadores hibridados se prolongan en una reacción de polimerasa, siendo incorporados nucleótidos marcados en lo esencial solamente cuando en el ADN tratado, después de la etapa b), se presentaban todavía bases de citosina, y suponiéndose como similar el estado de metilación en las posiciones que se han de investigar, y estando el grado de la incorporación de los nucleótidos marcados correlacionado con la metilación en la muestra de ADN que se ha de investigar; e) se eliminan los nucleótidos marcados no han sido incorporados en la reacción de polimerasa; f) se determina de un modo aproximado el número de las marcaciones en el fragmento producido mediante la prolongación con un cebador, midiendo una intensidad de señal que sale de estas marcaciones.

Description

Procedimiento para la detección de una metilación de citosina en islotes de CPG.

El presente invento se refiere a un procedimiento para la detección especialmente sensible de una metilación de citosina en muestras de ADN.

Los planos de observación, bien estudiados en la biología molecular después de los desarrollos metodológicos de los últimos años, son los genes propiamente dichos, la traducción de estos genes en ARN y las proteínas resultantes a partir de ésta. El momento en el transcurso del desarrollo de un individuo en que se conecta un determinado gen y la manera cómo se regulan la activación y la inhibición de determinados genes en diferentes células y tejidos, se pueden correlacionar con la magnitud y el carácter de la metilación de los genes o respectivamente del genoma. Esto es así, por cuanto que ciertos estados patógenos se exteriorizan en un modelo modificado de metilación de genes individuales o del genoma.

La 5-metilcitosina es la base modificada covalentemente más frecuente en el ADN de células eucarióticas. Ella desempeña por ejemplo un cierto cometido en la regulación de la transcripción, al realizar la impresión genética y en la génesis de tumores. La identificación de la 5-metilcitosina como componente de una información genética presenta por lo tanto un considerable interés. Las posiciones con 5-metilcitosina, sin embargo, no se pueden identificar por secuenciación, puesto que la 5-metilcitosina tiene el mismo comportamiento de apareamiento de bases que la citosina. Además de esto, en el caso de una amplificación por PCR, se pierde totalmente la información epigenética, que llevan las 5-metilcitosinas.

Un método relativamente nuevo, y que entretanto se está utilizando con la máxima frecuencia, para la investigación de un ADN en cuanto a la presencia de 5-metilcitosina, se basa en la reacción específica de un bisulfito con citosina, que después de una subsiguiente hidrólisis en condiciones alcalinas es transformada en uracilo, que en su comportamiento de apareamiento de bases corresponde a la timidina. Por el contrario, la 5-metilcitosina no es modificada en estas condiciones. Por consiguiente, el ADN original es transformado de tal manera que la metilcitosina, que originalmente no se puede diferenciar de la citosina por medio de su comportamiento de hibridación, ahora se puede detectar mediante técnicas "normales" de biología molecular como la única citosina que ha quedado, por ejemplo por amplificación e hibridación o secuenciación. Todas estas técnicas se basan en un apareamiento de bases, que ahora se aprovecha totalmente. El estado de la técnica, en lo que concierne a la sensibilidad, es definido mediante un procedimiento, que encierra al ADN que se ha de investigar dentro de una matriz de agarosa, de esta manera impide la difusión y la renaturalización del ADN (el bisulfito reacciona solamente con un ADN monocatenario) y reemplaza a todas las etapas de precipitación y purificación por una rápida diálisis (Olek A, Oswald J, Walter J. A modified and improved method for bisulphate based cytosine methylation analysis [Un método modificado y mejorado para el análisis de la metilación de citosina basándose en un bisulfato]. Nucleic Acids Res. 15 de Diciembre de 1996; 24(24): 5064-6). Con este método se pueden investigar células individuales, lo cual explica el potencial del método. No obstante, hasta ahora se investigan solamente regiones individuales con una longitud hasta de aproximadamente 3.000 pares de bases, y no es posible una investigación global de células en millares de posibles análisis de metilación. No obstante, tampoco este procedimiento puede analizar de una manera confiable ningún fragmento que sea muy pequeño, a partir de pequeñas cantidades de muestras. Éstas se pierden a pesar de una protección contra la difusión a través de la
matriz.

Una recopilación acerca de las otras posibilidades conocidas de detectar 5-metilcitosinas, puede tomarse del siguiente artículo de compendio: Rein T, DePamphilis ML, Zorbas H. Identifying 5-methylcytosine and related modifications in DNA genomes [Identificación de 5-metilcitosina y modificaciones afines en genomas de ADN]. Nucleic Acids Res. 15 de Mayo de 1998; 26(10): 2255-64.

La técnica del bisulfito es utilizada hasta ahora, salvo unas pocas excepciones (p.ej. Zeschnigk M, Lich C, Buiting K, Dörfler W, Horsthemke B. A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman and Prader-Willi syndrome based on allelic methylation differences at the SNRPN locus [Un ensayo de PCR en único tubo para el diagnóstico del síndrome de Angelman y Prader-Willi basándose en diferencias de metilación alélicas en el locus de SNRPN]. Eur J Hum Genet. Marzo-Abril de 1997; 5(2):94-8), solamente en la investigación. Sin embargo, siempre se amplifican unos cortos trozos específicos de un gen conocido después de un tratamiento con un bisulfito, y o bien se secuencian completamente (Olek A, Walter J. The pre-implantation ontogeny of the H19 methylation imprint [La ontogenia previa a la implantación de la impresión por metilación de H19]. Nat Genet. Noviembre de 1997; 17(3): 275-6) o se detectan posiciones individuales con citosina mediante una "reacción de prolongación con cebadores" (Gonzalgo ML, Jones PA. Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE) [Cuantificación rápida de diferencias de metilación en sitios específicos usando una prolongación de cebador de un único nucleótido sensible a la metilación (Ms-SNuPE)]. Nucleic Acids Res. 15 de Junio de 1997; 25(12):2529-31, documento de solicitud de patente internacional WO 9500669) o un corte con enzimas (Xiong Z, Laird PW. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay [COBRA: un análisis sensible y cuantitativo de la metilación de ADN]. Nucleic Acids Res. 15 de Junio de 1997; 25(12):2532-4). Además, también se ha descrito la detección mediante una hibridación (Olek y colaboradores, documento WO 99/ 28498).

La urea mejora la eficiencia del tratamiento con un bisulfito antes de la secuenciación de 5-metilcitosina en un ADN genómico (Paulin R, Grigg GW, Davey MW, Piper AA. Urea improves efficiency of bisulphate-mediated sequencing of 5'-methylcytosine in genomic DNA [La urea mejora la eficiencia de la secuenciación de 5'-metilcitosina mediada por bisulfato en un ADN genómico]. Nucleic Acids Res., 1 de Noviembre de 1998; 26 (21):5009-10).

Otras publicaciones, que se ocupan de la aplicación de la técnica del bisulfito para la detección de una metilación en el caso de genes individuales, son:

Grigg G, Clark S. Sequencing 5-methylcytosine residues in genomic DNA [Secuenciación de residuos de 5-meticitosina en un ADN genómico]. Bioassays. Junio de 1994; 16(6): 431-6, 431; Zeschnigk M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke B, Dörfler W. Imprinted segments in the human genome: different DNA methylation

\hbox{patterns}

in the Prader-Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method [Segmentos impresos en el genoma humano: diferentes modelos de metilación de ADN en la región del síndrome de Prader-Willi/Angelman, tal como se determinan por el método de secuenciación genómica]. Hum Mol Genet. Marzo de 1997; 6(3):387-95; Feil R, Charlton J, Bird AP, Walter J, Reik W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol fort bisulphate genomic sequencing [análisis de la metilación en cromosomas individuales, protocolo mejorado para la secuenciación genómica con bisulfato]. Nucleic Acids Res. 25 de Febrero de 1994; 22(4):695-6; Martin V, Ribieras S, Song-Wang X, Rio MC, Dante R. Genomic sequencing indicates a correlation between DNA hypomethylation in the 5' region of the pS2 gene and in its expression in human breast cancer cell lines [La secuenciación genómica indica una correlación entre una hipometilación de ADN en la región de 5' del gen pS2 y en su expresión en linajes de células de cáncer de mama humanas]. Gene. 19 de Mayo de 1995; 157(1-2): 261-4; documentos WO 97 46705, WO 95 15373 y WO 45560.

Otro procedimiento conocido adicional es la denominada PCR sensible a la metilación (Herman JG, Graff JR, Myohanen S, Nelkin BD, Baylin SB. (1996), Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands [PCR específica para una metilación: un nuevo análisis por PCR del estado de metilación de islotes de CpG]. Proc Natl Acad Sci U S A. 3 de Septiembre; 93(18): 9821-6). Para este procedimiento se emplean unos cebadores, los cuales o bien se hibridan solamente con una secuencia, que resulta mediante el tratamiento con un bisulfito de un ADN sin metilar en la correspondiente posición, o sino, a la inversa, un cebador que solamente se une a un ácido nucleico, que resulta mediante el tratamiento con un bisulfito de un ADN sin metilar en la correspondiente posición. Con estos cebadores se pueden producir por consiguiente unos materiales amplificados, cuya detección suministra a su vez indicios acerca de la presencia de una posición metilada o sin metilar en la muestra, a la que se unen los cebadores.

Un procedimiento más reciente es también la detección de la metilación de citosina mediante una PCR de Taqman, que ha sido conocida como "luz de metilo" [del inglés "Methyl-Light" (documento WO 00/70090). Con este procedimiento es posible detectar el estado de metilación de posiciones individuales o de unas pocas posiciones directamente en la evolución de la PCR, de manera tal que se hace innecesario un análisis subsiguiente de los productos.

Un compendio acerca del estado de la técnica en la producción de conjuntos de oligómeros se puede tomar a partir de una edición especial de Nature Genetics, aparecida en Enero de 1999 (suplemento de Nature Genetics, volumen 21, Enero de 1999), de la bibliografía allí citada y del documento de patente de los EE.UU. 5.994.065 acerca de métodos para la producción de soportes sólidos para moléculas dianas, tales como oligonucleótidos en el caso de una señal de fondo no específica disminuida.

Para la exploración de un conjunto de ADN inmovilizado se han utilizado en muchos casos unas sondas marcadas fluorescentemente. Es especialmente apropiada para marcaciones fluorescentes la simple colocación de los colorantes Cy3 y Cy5 junto al OH en 5' de la respectiva sonda. La detección de la fluorescencia de las sondas hibridadas se efectúa por ejemplo por medio de un microscopio confocal. Los colorantes Cy3 y Cy5 son obtenibles comercialmente, junto a muchos otros.

La espectrometría de masas por desorción/ionización mediante láser, asistida por una matriz (MALDI-TOF, de Matrix Assistierte Laser Desorption / Ionisation - Time Of Flight), es un nuevo desarrollo muy eficiente para el análisis de biomoléculas (Karas, M., Hillenkamp, F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10.000 daltons [Ionización y desorción por láser de proteínas con unas masas moleculares que superan los 10.000 daltons]. Anal Chem. 15 de Octubre de 1988; 60(20): 2299-301). Un analito es embebido en una matriz absorbente de la luz. Mediante un corto impulso de láser, la matriz es evaporada y la molécula del analito es transportada de esta manera sin fragmentar a la fase gaseosa. Mediante choques con moléculas de la matriz se alcanza la ionización del analito. Una tensión eléctrica aplicada acelera a los iones en un tubo de vuelo exento de campo. A causa de sus diferentes
masas, los iones se aceleran con diversa intensidad. Los iones más pequeños llegan al detector antes que los mayores.

La espectroscopia por MALDI-TOF es apropiada excelentemente para el análisis de péptidos y proteínas. El análisis de ácidos nucleicos es algo más difícil (Gut, I. G. y Beck, S. (1995), DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Molecular Biology: Current Innovations and Future Trends [ADN y espectrometría de masas con ionización y desorción por láser asistida por la matriz. Biología molecular: actuales innovaciones y tendencias futuras] 1: 147-157). Para los ácidos nucleicos la sensibilidad es aproximadamente 100 veces peor que para los péptidos y disminuye por encima de la razón proporcional al crecer el tamaño de los fragmentos. Para los ácidos nucleicos, que tienen un entramado cargado negativamente múltiples veces, el proceso de ionización mediante la matriz es esencialmente más ineficaz. En la espectroscopia por MALDI-TOF la elección de la matriz desempeña un cometido importante eminentemente. Para la desorción de péptidos se han encontrado algunas matrices muy eficientes, que proporcionan una cristalización muy fina. Para los ADN han habido ciertamente entretanto algunas matrices interesantes, pero de esta manera no se disminuía la diferencia de sensibilidades. La diferencia de sensibilidades puede ser disminuida, modificando químicamente el ADN de tal manera, que éste sea similar a un péptido. Los
fosforotioato - ácidos nucleicos, en los cuales los fosfatos habituales del entramado han sido sustituidos por tiofosfatos, se pueden transformar mediante una sencilla química de alquilación en un ADN que es neutro en cuanto a las cargas eléctricas (Gut, I. G. y Beck, S. (1995), A procedure for selective DNA alkylation and detection by mass spectrometry [Un procedimiento para una alquilación selectiva de ADN y detección mediante espectrometría de masas]. Nucleic Acids Res. 23: 1367-1373). El acoplamiento de una marca de cargas [en inglés "charge tag"] con este ADN modificado da como resultado el aumento de la sensibilidad por la misma magnitud, que se encontró para los péptidos. Una ventaja adicional de la marcación con cargas (en inglés "charge tagging") es la estabilidad aumentada de los análisis frente a unas impurezas, que dificultan en gran manera la detección de substratos no modificados.

Un ADN genómico se obtiene mediante métodos clásicos a partir de un ADN de muestras de células, de tejidos o de otras muestras de ensayo. Esta metodología clásica se encuentra en citas de referencia tales como la de Fritsch y Maniatis, coordinadores de edición, Molecular Cloning: A Laboratory Manual [Clonación molecular: un manual de Laboratorio], 1989.

Después del descubrimiento de la PCR se han conocido en los años subsiguientes numerosas variantes que refinan esta tecnología para la amplificación de los ADN. En particular hay que mencionar en este contexto la multiplexación de la PCR (Múltiplex PCR), empleándose más de 2 cebadores específicos, y pudiéndose producir en este caso en un recipiente de reacción un gran número de diferentes amplificaciones específicas. Es especialmente interesante también la denominada PCR anidada (en inglés nested PCR), que entre cosas se utiliza para la detección de cantidades especialmente pequeñas de un ADN. Este tipo de la PCR se compone de dos amplificaciones consecutivas, estando situados los cebadores de la segunda amplificación dentro de la primera amplificación y no siendo idénticos con los cebadores de la primera amplificación. De esta manera se consigue una especificidad especial, puesto que los cebadores de la segunda amplificación funcionan solamente cuando en la primera amplificación se hubiera producido el fragmento pretendido. Por el contrario, está poco menos que excluida la multiplicación de eventuales productos secundarios de la primera amplificación en la segunda.

El documento WO 01/62064 describe un procedimiento para la detección de 5-metilcitosina en muestras de ADN genómico. En este caso, en una primera etapa, un ADN genómico procedente de una muestra de ADN se hace reaccionar químicamente con un reactivo, reaccionando de maneras diferentes la 5-metilcitosina y la citosina, y a continuación el ADN previamente tratado se amplifica mediando utilización de una polimerasa y de por lo menos un cebador. En la siguiente etapa el ADN genómico amplificado se hibrida con por lo menos un oligonucleótido mediando formación de un dúplex y el mismo es prolongado en por lo menos un nucleótido, llevando el nucleótido una marcación detectable y siendo la prolongación dependiente del estado de metilación de la respectiva citosina en la muestra de ADN genómico. En la siguiente etapa, los oligonucleótidos prolongados se investigan en cuanto a la presencia de la marcación.

Además, el documento de solicitud de patente alemana DE 199 51 189 A1 describe un procedimiento para la diferenciación de modificaciones de la metilación en posición 5 de bases de citosina y de mutaciones de citosina a timidina, y para la detección de polimorfismos de un único nucleótido (SNP's de Single Nucleotide Polymorphisms) o de una mutación puntual en un ADN genómico.

Por consiguiente, hasta ahora se han convertido en estado de la técnica numerosos procedimientos para el análisis de la metilación. El presente invento debe de poner a disposición, sin embargo, una posibilidad para el análisis del grado de metilación, en total, en un islote de CpG. En este contexto, no es necesario preferentemente llevar a cabo una reacción con una polimerasa, lo cual facilita la realización del procedimiento. En el marco de un análisis de la metilación en el sector del diagnóstico clínico, es esencial que los resultados de las investigaciones se puedan poner a disposición con la mayor rapidez posible y que el gasto experimental se mantenga dentro de unos límites lo más estrechos que sean posibles. Para esto, es apropiado en una medida especial el procedimiento que aquí se describe, que mide el grado de la metilación en un islote de CpG total. Al contrario que en la mayor parte de los procedimientos descritos hasta ahora para el análisis de la metilación, no se determina en este caso el estado de metilación de una posición individual, o de varias posiciones individuales, de CpG. En muchos casos, esto tampoco aportará ninguna ventaja, puesto que a veces se presentan concomitantemente metiladas regiones enteras de promotores, es decir que muchas posiciones consecutivas de CpG poseen el mismo estado de metilación.

El presente invento se aprovecha ahora del hecho de que se supone que este estado de metilación es similar en numerosas posiciones que se han de investigar y se puede generar una señal, que resulta a partir de la suma de estas posiciones individuales. Esto hace posible una sensibilidad, que puede hacer innecesaria la realización de una reacción de PCR.

También, el procedimiento se aprovecha del hecho de que en un ADN tratado con bisulfito en una cadena, en una subsiguiente reacción de polimerasa, se incorporan bases de guanina solamente cuando en la correspondiente muestra de ADN genómico se presentaba una citosina metilada. Si el ADN de una muestra no contiene metilaciones en las correspondientes posiciones, entonces no tiene lugar ninguna incorporación de guanina en la reacción de polimerasa.

A la inversa, cuando en una reacción de PCR para el ADN tratado con un bisulfito se había producido también una cadena opuesta (después del tratamiento con un bisulfito, las cadenas de ADN de la muestra ya no son complementarias, como lo eran originalmente), con esta cadena opuesta como molde en una subsiguiente reacción de polimerasa, se incorpora una citosina solamente cuando originalmente se presentaba una citosina metilada en la correspondiente muestra de ADN genómico.

A partir de esto se deduce que se incorporan guaninas y respectivamente citosinas, solamente cuando en la muestra de ADN genómico se presentaba una metilación. El grado de la incorporación de las guaninas y respectivamente citosinas (dependiendo de cual sea el procedimiento, véase más arriba) se correlaciona directamente con el grado de la metilación en el correspondiente segmento de ADN genómico investigado en cada caso.

El procedimiento conforme al invento se compone por lo tanto de las siguientes etapas parciales:

Primeramente, a partir de una muestra se extrae el ADN genómico y de este modo se une preferiblemente a una superficie, de modo especialmente preferido esta unión se efectúa por hibridación con un oligonucleótido inmovilizado y, de modo de nuevo especialmente preferido, el ADN genómico es disociado mediante enzimas de restricción antes de la unión.

Se prefiere conforme al invento que los ADN de las muestras se obtengan a partir de un suero o de otros líquidos corporales de un individuo.

Se prefiere además conforme al invento que el ADN de una muestra se obtenga a partir de linajes celulares, sangre, esputo, defecación, orina, líquido cefalorraquídeo, tejidos embebidos en parafina, por ejemplo tejidos de intestino, riñón, cerebro, corazón, próstata, pulmón, ojo, mama o hígado, portaobjetos histológicos y todas las combinaciones posibles de los mismos.

El corte enzimático del ADN se realiza de manera especialmente preferida con una endonucleasa de restricción o con varias enzimas de restricción diferentes. Si se utilizan varias endonucleasas de restricción, entonces depende de los respectivos tampones el que éstos pasen a emplearse de manera consecutiva o simultánea. Para un experto en la especialidad es conocida la utilización de enzimas de restricción de acuerdo con los protocolos suministrados conjuntamente por los fabricantes.

En la segunda etapa, una muestra de ADN genómico se trata preferentemente con un bisulfito (= disulfito, hidrógeno-sulfito), de tal manera que todas las bases de citosina no metiladas se transforman en uracilo, mientras que permanecen inalteradas las bases de 5-metilcitosina. Esto tiene lugar de manera especialmente preferida junto a la superficie, con la que se había unido ya en la primera etapa el ADN de la muestra.

Es muy especialmente preferido de acuerdo con el invento que el tratamiento químico se lleve a cabo con un bisulfito (= disulfito, hidrógeno-sulfito). Se prefiere también que el tratamiento químico se efectúe después de una imbibición del ADN en agarosa. Es preferido también, y además, que durante el tratamiento químico estén presentes un reactivo que desnaturalice al dúplex de ADN y/o un captador de radicales.

En la tercera etapa del procedimiento, junto al ADN tratado se hibridan uno o varios oligonucleótidos como cebadores.

En la cuarta etapa del procedimiento, el o los cebador(es) hibridado(s) se prolonga(n) en una reacción de polimerasa. En este caso se emplean nucleótidos de guanina marcados, que en lo esencial se incorporan solamente cuando en el ADN tratado se presentaban todavía bases de citosina. Por consiguiente, el grado de la incorporación de las bases de guanina, y por consiguiente también el número de las marcaciones incorporadas, es proporcional a la metilación en la muestra de ADN que se ha de investigar. De manera especialmente preferida, la reacción de polimerasa termina junto a la posición que había sido cortada en la primera etapa mediante el empleo de una endonucleasa de restricción.

En la quinta etapa del procedimiento, se eliminan los nucleótidos marcados que no han sido incorporados en la reacción de polimerasa. De manera especialmente preferida, esto se efectúa mediante sencillas etapas de lavado, en el caso de que el ADN se presente unido con una superficie.

En la sexta etapa del procedimiento, se determina de un modo aproximado el número de las marcaciones en el fragmento producido por la prolongación con un cebador, siendo medida directa o indirectamente una intensidad de señal que sale de estas marcaciones.

A partir de la intensidad de señal se sacan conclusiones acerca del estado de metilación de la muestra de ADN en el fragmento en cada caso investigado.

Las marcaciones pueden ser por ejemplo marcaciones fluorescentes, radionúclidos, o marcaciones de masas separables, que se detectan en un espectrómetro de masas. Sin embargo, ellas pueden ser también marcaciones tales como péptidos, que se detectan indirectamente por unión de un anticuerpo que a su vez está marcado de una manera distinta. Se pueden concebir también unas marcaciones químicas, que pueden ser hechas visibles tan solo mediante una subsiguiente reacción con una molécula marcadora, a su vez marcada de una manera distinta, que puede ser por ejemplo un colorante fluorescente. Para un experto en la especialidad son habituales numerosas posibilidades de proveer de marcaciones a las moléculas. Las posibilidades aquí expuestas deben ser entendidas por lo tanto como ejemplos, y otras posibilidades de la marcación, que sean habituales para un experto en la especialidad, deben de ser consideradas como parte componente de este invento.

En las etapas precedentemente mencionadas se prescinde de la amplificación de la muestra de ADN que ha sido tratada. El procedimiento es aplicable por lo tanto sobre todo cuando la cantidad de la muestra no es limitativa y las marcaciones utilizadas son detectables con suficiente sensibilidad. Puesto que, sin embargo, al realizar la investigación por ejemplo de un islote de CpG de acuerdo con el procedimiento arriba descrito, se incorporan un gran número de marcaciones en la reacción de polimerasa, cuando el islote de CpG se presentaba en estado metilado, también mediante el tipo del procedimiento realizado se consigue un considerable aumento de la sensibilidad.

Si se necesita una sensibilidad elevada a causa de una cantidad de ADN solamente pequeña, entonces el procedimiento arriba descrito es complementado por una reacción de PCR o por otra reacción de polimerasa que no solamente amplifica de modo lineal, la cual se lleva a cabo después del tratamiento de acuerdo con la segunda etapa del procedimiento. De manera preferida, en este caso la muestra de ADN tratada (químicamente) se amplifica mediando utilización de preferiblemente por lo menos 2 oligonucleótidos cebadores mediante una reacción de polimerasa, utilizándose preferentemente una polimerasa estable frente al calor, nucleótidos así como un apropiado tampón de reacción, tal como se suministra en la mayor parte de los casos junto con la polimerasa y como es conocido para un experto en la especialidad.

Es especialmente preferido también llevar a cabo las amplificaciones de varios fragmentos diferentes con más de 2 cebadores diferentes en un recipiente de reacción, y por consiguiente realizar las etapas de amplificación como PCR Múltiplex. Por lo general es especialmente preferido realizar las amplificaciones como una reacción en cadena de polimerasa.

Además, si se debe de trabajar, también mediando utilización de una PCR adicional, junto a una superficie, entonces, o bien se efectúa una PCR en fase sólida de modo tal que unos cebadores para la etapa de PCR sean unidos adicionalmente a la superficie, o después de la PCR se efectúa preferiblemente una etapa de purificación mediante unos estuches de purificación usuales en el comercio (tales como, por ejemplo, los de las entidades Promega o Qiagen) y una subsiguiente unión del producto de la PCR con una superficie, junto a la cual se debe efectuar seguidamente la ulterior reacción de polimerasa para la incorporación de las marcaciones.

Se prefiere que, al realizar la amplificación, uno de los cebadores esté unido a una fase sólida. En el caso de estas fases sólidas puede tratarse por ejemplo de polímeros funcionalizados, metales, vidrio o semiconductores, tales como silicio. La unión de los cebadores se efectúa de manera preferida a través de moléculas engarzadoras bifuncionales, que son unidas a una superficie silanizada o sino, por ejemplo, a través de unos tioatos en el cebador o de modificaciones con tioles junto a superficies derivatizadas con bromoacetilo u oro.

En una variante adicional alternativa preferida del procedimiento, la incorporación de las marcaciones propiamente dichas se efectúa en una reacción de PCR. En este caso, la reacción tiene lugar preferentemente sin unión de los cebadores a una fase sólida. En vez de esto, se efectúa una separación del producto de la PCR, por ejemplo mediante una electroforesis en gel, con respecto de otros productos secundarios y eductos (productos de partida). Se determina la intensidad de las señales que salen desde las marcaciones en las bandas o modelos de bandas que así se han obtenido, y de este modo se sacan conclusiones acerca del estado de metilación en el fragmento investigado del ADN de muestra.

Si se produce también en una amplificación la cadena opuesta complementaria con respecto de los fragmentos de ADN tratados, entonces en esta cadena opuesta, en el caso de un tratamiento con un bisulfito, la adenina corresponde a una posición de citosina no metilada y la guanina corresponde a una posición de citosina metilada en la muestra de ADN. Por lo tanto, después de una amplificación, también es posible realizar el procedimiento convenientemente también con una citosina marcada.

Los cebadores utilizados en las reacciones de polimerasa no amplifican de manera especialmente preferida a ningún fragmento procedente de un ADN genómico no tratado con un bisulfito (o solamente en un grado despreciable), por lo que ellos son específicos para el ADN transformado con un bisulfito. Esto protege contra resultados erróneos en el caso de una reacción de transformación incompleta, por ejemplo con bisulfito de sodio.

Se prefiere además que el análisis se efectúe mediante una hibridación con conjuntos de oligómeros, pudiendo los oligómeros ser ácidos nucleicos o moléculas similares en sus propiedades de hibridación, tales como PNA's (ácidos nucleicos peptídicos).

Se prefiere que en un experimento se detecte el estado de la metilación de más de 10 posiciones de metilación del ADN que se ha de analizar.

También es preferido conforme al invento que el análisis se efectúe mediante una medición adicional de las longitudes de los ADN amplificados que se han de investigar, comprendiendo los métodos para la medición de las longitudes una electroforesis en gel, una electroforesis en gel capilar, una cromatografía (p.ej. HPLC = cromatografía de fase líquida de alto rendimiento), una espectrometría de masas y otros métodos apropiados. Los fragmentos son detectados en tal caso a través de las marcaciones incorporadas en la reacción de polimerasa.

Además, se prefiere que a partir del grado de metilación en islotes de CpG individuales o en varios islotes de CpG diferentes investigados, se saque la conclusión acerca de la presencia de una enfermedad o de otro estado médico distinto del paciente.

De manera preferida, las marcaciones se incorporan en los fragmentos marcados producidos o bien mediante una marcación de los nucleótidos durante la reacción de polimerasa o mediante una amplificación.

Además, es especialmente ventajoso que las marcaciones sean marcaciones fluorescentes o/y que las marcaciones sean radionúclidos o/y que las marcaciones sean marcaciones de masas desprendibles, que se pueden detectar en un espectrómetro de masas.

Se prefiere conforme al invento también que los fragmentos sean detectados en total en el espectrómetro de masas y por consiguiente estén caracterizados inequívocamente por su masa. En este caso, cada marcación incorporada contribuye con una masa adicional específicamente para la metilación, de manera tal que a partir de la masa molecular medida se puedan sacar conclusiones acerca del número de las metilaciones en el islote de CpG.

Un objeto adicional del presente invento es también la utilización de un procedimiento conforme al invento para el diagnóstico y/o pronóstico de sucesos desfavorables para pacientes o individuos, perteneciendo estos sucesos desventajosos a por lo menos una de las siguientes categorías: efectos indeseados de medicamentos; enfermedades de cáncer; fallos funcionales, daños o una enfermedad del SNC (sistema nervioso central); síntomas de agresión o trastornos del comportamiento; consecuencias clínicas, psicológicas y sociales de daños cerebrales; trastornos psicóticos y trastornos de la personalidad; demencia y/o síndromes asociados; una enfermedad, un fallo funcional y un daño cardiovascular; un fallo funcional, un daño o una enfermedad del tracto gastrointestinal; un fallo funcional, un daño o una enfermedad del sistema respiratorio; una lesión, inflamación, infección, inmunidad y/o reconvalecencia; un fallo funcional, un daño o una enfermedad del cuerpo como desviación en el proceso de desarrollo; un fallo funcional, un daño o una enfermedad de la piel, de los músculos, del tejido conjuntivo o de los huesos; un fallo funcional, un daño o una enfermedad endocrino/a y metabólico/a; dolores de cabeza o un fallo funcional sexual.

Es ventajosa en este contexto la utilización de un procedimiento conforme al invento para la diferenciación de tipos de células o tejidos o para la investigación de la diferenciación celular.

Es objeto del presente invento también un estuche (en inglés kit) que se compone de un reactivo que contiene un bisulfito, de unos cebadores para la reacción de polimerasa, así como opcionalmente unas instrucciones para la realización de un ensayo conforme al invento. Adicionalmente, también una placa de microtitulación, que para la inmovilización del ADN de la muestra posee una superficie activada, y en la que se pueden realizar también las siguientes etapas de reacción, es parte componente preferida de este estuche.

El procedimiento conforme al invento se compone por consiguiente de las siguientes etapas parciales:

a): a partir de una muestra se extrae el ADN,

b): el ADN se trata, preferiblemente con un bisulfito (= disulfito, hidrógeno-sulfito), de tal manera que la citosina es transformada en una base diferente en cuanto al comportamiento de apareamiento de bases en el dúplex de ADN, mientras que la 5-metilcitosina permanece inalterada,

c): uno o varios cebadores de oligonucleótidos se hibridan con el ADN tratado,

d): los cebadores hibridados se prolongan en una reacción de polimerasa, siendo incorporados nucleótidos marcados en lo esencial solamente cuando en el ADN tratado, después de la etapa b), se presentaban todavía bases de citosina, y estando correlacionado el grado de la incorporación de los nucleótidos marcados con la metilación en la muestra de ADN que se ha de investigar,

e): se eliminan los nucleótidos marcados que no han sido incorporados en la reacción de polimerasa,

f): se determina de un modo aproximado el número de las marcaciones en el fragmento producido mediante la prolongación con un cebador, midiendo una intensidad de señal que sale de estas marcaciones.

Es especialmente preferido que el ADN de la muestra se obtenga a partir de un suero o de otros líquidos corporales de un individuo.

Es especialmente preferido que el ADN de muestra se obtenga a partir de linajes celulares, sangre, esputo, defecación, orina, líquido cefalorraquídeo, tejidos embebidos en parafina, por ejemplo tejidos de ojo, intestino, riñón, cerebro, corazón, próstata, pulmón, mama o hígado, portaobjetos histológicos y todas las combinaciones posibles de éstos.

Además es especialmente preferido que el tratamiento de acuerdo con la reivindicación 1b) se lleve a cabo con un bisulfito (= disulfito, hidrógeno-sulfito). Es especialmente preferido también que el tratamiento químico se efectúe después de una imbibición del ADN en agarosa o de modo especialmente preferido después de una unión del ADN con una superficie. En otra variante especialmente preferida del procedimiento, al realizar el tratamiento químico están presentes un reactivo que desnaturaliza al dúplex de ADN y/o un agente captador de radicales.

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Además, se prefiere especialmente que a partir de una muestra se extraiga un ADN genómico y se una en este caso con una superficie. Se prefiere especialmente también que esta unión se efectúe por hibridación con un oligonucleótido inmovilizado. Se prefiere además que el ADN extraído sea disociado, antes de la unión, mediante enzimas de restricción.

En una forma de realización especialmente preferida del procedimiento, se hibridan con el ADN tratado varios oligonucleótidos diferentes como cebadores.

De manera especialmente preferida, los nucleótidos marcados son derivados de guanina, siendo incorporados éstos en la reacción de polimerasa esencialmente tan sólo cuando en la muestra de ADN se presentaba una metilación de citosina en las posiciones correspondientes. Además, se prefiere que el grado de la incorporación de las bases de guanina y, por consiguiente, también el número de las marcaciones incorporadas, sean proporcionales a la metilación en la muestra de ADN que se ha de investigar.

En una variante especialmente preferida del procedimiento, la reacción de polimerasa termina preferiblemente junto a la posición, que antes del aislamiento del ADN había sido cortada mediante el empleo de una endonucleasa de restricción.

En otra variante preferida adicional del procedimiento, los nucleótidos marcados, que no han sido incorporados en la reacción de polimerasa, son eliminados mediante unas etapas de lavado, y el ADN se presenta unido con una superficie.

Las marcaciones son preferentemente marcaciones fluorescentes, radionúclidos, marcaciones quimioluminiscentes o marcaciones de masas desprendibles, que se detectan en un espectrómetro de masas. También se prefiere que las marcaciones se detecten indirectamente por unión de un anticuerpo que por su parte está marcado de manera diferente.

En una variante adicional, especialmente preferida, del procedimiento, la muestra de ADN tratada es amplificada mediando utilización de preferiblemente por lo menos dos oligonucleótidos cebadores, de manera preferida mediante una reacción en cadena de polimerasa. En otra variante adicional especialmente preferida del procedimiento, los nucleótidos marcados son derivados de citosina, siendo incorporados éstos en la reacción de polimerasa esencialmente tan sólo cuando en la muestra de ADN se presentaba una metilación de citosina en las correspondientes posiciones.

Se prefiere también un procedimiento, en el que la amplificación de varios fragmentos se lleva a cabo en un recipiente de reacción en forma de una PCR Múltiplex.

En una variante adicional especialmente preferida del procedimiento, por lo menos en una de las amplificaciones uno de los correspondientes cebadores es unido con una fase sólida.

El procedimiento de acuerdo con una de las precedentes reivindicaciones, está caracterizado porque los materiales amplificados se detectan en total en el espectrómetro de masas, y por consiguiente son caracterizados inequívocamente por su masa.

Es objeto del presente invento también la utilización de uno de los procedimientos descritos para el diagnóstico y/o el pronóstico de sucesos desventajosos para pacientes o individuos, perteneciendo estos sucesos desventajosos por lo menos a una de las siguientes categorías: efectos indeseados de medicamentos; enfermedades de cáncer; fallos funcionales, daños, o una enfermedad del SNC; síntomas de agresión o trastornos del comportamiento; consecuencias clínicas, psicológicas y sociales de daños cerebrales; trastornos psicóticos y trastornos de la personalidad; demencia y/o síndromes asociados; una enfermedad, un fallo funcional y un daño cardiovascular; un fallo funcional, un daño o una enfermedad del tracto gastrointestinal; un fallo funcional, un daño o una enfermedad del sistema respiratorio; una lesión, inflamación, infección, inmunidad y/o reconvalecencia; un fallo funcional, un daño o una enfermedad del cuerpo como desviación en el proceso de desarrollo, un fallo funcional, un daño o una enfermedad de la piel, de los músculos, del tejido conjuntivo o de los huesos; un fallo funcional, un daño o una enfermedad endocrino/a y metabólico/a; dolores de cabeza o un fallo funcional sexual.

Es asimismo objeto del invento la utilización de un procedimiento de acuerdo con una de las precedentes reivindicaciones para la diferenciación de tipos de células o tejidos o para la investigación de la diferenciación celular.

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1 explica una variante especialmente preferida del invento:

a): un ADN de muestra cortado enzimáticamente es unido con una superficie y separado de este modo del material acompañante;

b): el ADN unido a la superficie es desnaturalizado y a continuación tratado por ejemplo químicamente con un bisulfito,

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c): un cebador es unido al ADN,

d): se lleva a cabo una reacción enzimática de prolongación con cebadores (nucleótidos representados como líneas de trazos: - - -), y se incorporan marcaciones solamente cuando con anterioridad en el ADN de muestra se presentaban (*) metilaciones de citosina en las correspondientes posiciones;

e): los demás nucleótidos marcados y componentes de la reacción se eliminan en una etapa de lavado;

f): se mide la intensidad de fluorescencia partiendo de las marcaciones incorporadas.

Los siguientes Ejemplos explican el invento con mayor detalle.

Ejemplo 1 Tratamiento con un bisulfito de un ADN junto a superficies sólidas

A continuación se describen dos procedimientos para unir un ADN con una fase sólida:

a) Utilización de recipientes de reacción

Para la unión de un ADN a la superficie de los recipientes de reacción se utilizó un ADN genómico cortado con EcoR1 (de Promega). 160 ng fueron añadidos con pipeta a los correspondientes recipientes de reacción, se completaron con agua hasta un volumen total de 20 \mul, se mezclaron brevemente en un dispositivo agitador (en inglés shaker) y se incubaron a la temperatura ambiente durante 15 minutos. A continuación la solución se retiró y el recipiente se lavó dos veces con 50 \mul de agua. Con el fin de disminuir la actividad de los sitios de unión remanentes sobre la superficie del tubo, se añadieron a esto con pipeta 10 \mul de una solución al 5% de albúmina de suero bovino, se completaron con 40 \mul de agua y asimismo se incubaron durante 15 minutos a la temperatura ambiente. Finalmente, el recipiente se lavó una vez con 50 \mul de agua.

Tratamiento con un bisulfito

El ADN unido se desnaturaliza a 96ºC durante 20 minutos en un aparato ciclador Mastercycler de Eppendorf. Para la reacción con un bisulfito se utilizó una solución de bisulfito de sodio. Los recipientes de reacción se incubaron durante cinco horas a 50ºC en el aparato ciclador Mastercycler de Eppendorf. Después de haberse efectuado la reacción con un bisulfito, la solución se extrajo con pipeta y los recipientes se lavaron con agua y, de modo preparatorio para la desulfonación, con una solución 50 mM de Tris-HCl. La desulfonación se efectúa con 50 \mul de una solución 50 mM de Tris-HCl a un pH de 9 durante 20 minutos a 96ºC. Después de haber lavado tres veces, cada vez con 50 \mul de agua, los recipientes de reacción están prestos para su empleo para una amplificación mediante PCR.

b) Utilización de portaobjetos con lisina

Los portaobjetos (en inglés slides) se incuban, en común con las moléculas de ADN que se han de colocar, durante 3 minutos a 42ºC en un medio acuoso. De este modo, las moléculas de ADN son distribuidas uniformemente sobre la superficie del portaobjetos. Después de esto, los portaobjetos se incubaron durante 10 segundos sobre una placa calefactora a una temperatura de 150ºC, con lo cual el ADN es unido a la superficie. Con el fin de poder eliminar el ADN no unido, los portaobjetos se lavan luego durante 5 minutos con NH_{4}OH. Para la desnaturalización, los portaobjetos se incuban a continuación durante 1 minuto a 95ºC (en H_{2}O) y después de esto se transfieren inmediatamente a EtOH al 95%, después de lo cual son secados.

Tratamiento con un bisulfito

El ADN unido es desnaturalizado a 96ºC durante 20 minutos mediando utilización de un adaptador en un aparato ciclador Mastercycler de Eppendorf. Para la reacción con un bisulfito se utilizó una solución de bisulfito de sodio. Los portaobjetos se incubaron durante cinco horas a 50ºC en el aparato ciclador Mastercycler de Eppendorf. Después de haberse efectuado la reacción con un bisulfito, los portaobjetos se lavaron con agua y, de modo preparatorio para la desulfonación, se lavaron con una solución 50 mM de Tris-HCl. La desulfonación se efectúa con 50 \mul de una solución 50 mM de Tris-HCl a un pH de 9 durante 20 minutos a 96ºC. Después de haber lavado tres veces, cada vez con 50 \mul de agua, los recipientes de reacción están prestos para su empleo para una amplificación mediante PCR.

Ejemplo 2 Prolongación (en inglés extension) con un cebador mediando utilización del ADN del gen p15

El ADN del gen p15 (número de acceso NM_004936) unido con una fase sólida, sirvió, después de que él hubo sido tratado con un bisulfito tal como arriba se describe, como material de partida para la prolongación con un cebador. Para la prolongación con un cebador se emplearon 2 pmol del cebador con la secuencia GTTTAGGTTTTTTAGGAAG
GAGAGAGTG (SEQ-ID 1). Si junto al ADN que se había de prolongar en el correspondiente sitio, se presentaba una guanina, entonces en el caso del cebador prolongado se incorporó una citosina marcada (estado metilado); si, por el contrario, se presentaba una adenina, entonces se incorporó una timina marcada (diferentemente) (estado no metilado). De acuerdo con los datos del fabricante (Amersham-Pharmacia) se utilizó para la prolongación una mezcla de didesoxinucleótidos con nucleótidos en cada caso marcados diferentemente. Las condiciones eran: 96ºC, 10 s (segundos); 55ºC, 5 s y 60ºC, 10 s. Se llevaron a cabo 25 ciclos. Para los portaobjetos con polisina la detección de la secuencia prolongada se efectuó con el explorador Scanner Axxon 4000A (de Axxon Instruments) mediante uso del programa lógico Software GenePix Pro V. 3.0. La realización de la prolongación en el cebador en el recipiente de reacción se efectuó de una manera análoga.

Claims

1. Procedimiento para el análisis del grado de metilación dentro de un islote de CpG en muestras de ADN, caracterizado porque se realizan las siguientes etapas de procedimiento:

a): a partir de una muestra se extrae el ADN,

d): los cebadores hibridados se prolongan en una reacción de polimerasa, siendo incorporados nucleótidos marcados en lo esencial solamente cuando en el ADN tratado, después de la etapa b), se presentaban todavía bases de citosina, y suponiéndose como similar el estado de metilación en las posiciones que se han de investigar, y estando el grado de la incorporación de los nucleótidos marcados correlacionado con la metilación en la muestra de ADN que se ha de investigar;

e): se eliminan los nucleótidos marcados no han sido incorporados en la reacción de polimerasa;

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el ADN de muestra se obtiene a partir de un suero o de otros líquidos corporales de un individuo.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el ADN de muestra se obtiene a partir de linajes celulares, sangre, esputo, defecación, orina, líquido cefalorraquídeo, tejidos embebidos en parafina, por ejemplo tejidos de ojo, intestino, riñón, cerebro, corazón, próstata, pulmón, mama o hígado, portaobjetos histológicos y todas las combinaciones posibles de los mismos.

4. Procedimiento de acuerdo con una de las precedentes reivindicaciones, caracterizado porque el tratamiento de acuerdo con la reivindicación 1b) se lleva a cabo con un bisulfito (= disulfito, hidrógeno-sulfito).

5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque el tratamiento químico se efectúa después de una imbibición del ADN en agarosa o, de manera especialmente preferida, después de una unión del ADN a una superficie.

6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque al realizar el tratamiento químico están presentes un reactivo que desnaturaliza al dúplex de ADN y/o un captador de radicales.

7. Procedimiento de acuerdo con una de las precedentes reivindicaciones, caracterizado porque a partir de una muestra se extrae el ADN genómico y en este caso se une con una superficie.

8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado porque esta unión se efectúa por hibridación con un oligonucleótido inmovilizado.

9. Procedimiento de acuerdo con una de las precedentes reivindicaciones, caracterizado porque el ADN extraído es disociado antes de la unión mediante enzimas de restricción.

10. Procedimiento de acuerdo con una de las precedentes reivindicaciones, caracterizado porque con el ADN tratado se hibridan varios diferentes oligonucleótidos como cebadores.

11. Procedimiento de acuerdo con una de las precedentes reivindicaciones, caracterizado porque los nucleótidos marcados son derivados de guanina, siendo incorporados éstos en la reacción de polimerasa esencialmente tan sólo cuando en la muestra de ADN se presentaba en las correspondientes posiciones una metilación de citosina.

12. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizado porque el grado de incorporación de las bases de guanina, y por consiguiente también el número de las marcaciones incorporadas, es proporcional a la metilación en la muestra de ADN que se ha de investigar.

13. Procedimiento de acuerdo con una de las precedentes reivindicaciones, caracterizado porque la reacción de polimerasa se termina preferiblemente en la posición, que se había cortado antes del aislamiento del ADN mediante el empleo de una endonucleasa de restricción.

\newpage

14. Procedimiento de acuerdo con una de las precedentes reivindicaciones, caracterizado porque los nucleótidos marcados, no incorporados en la reacción de polimerasa, se eliminan mediante etapas de lavado, y el ADN se presenta unido con una superficie.

15. Procedimiento de acuerdo con una de las precedentes reivindicaciones, caracterizado porque las marcaciones son marcaciones fluorescentes, radionúclidos, marcaciones quimioluminiscentes o marcaciones de masas desprendibles, que se detectan en un espectrómetro de masas.

16. Procedimiento de acuerdo con una de las precedentes reivindicaciones, caracterizado porque las marcaciones se detectan indirectamente por unión de un anticuerpo, que por su parte está marcado de manera diferente.

17. Procedimiento de acuerdo con una de las precedentes reivindicaciones, caracterizado porque la muestra de ADN tratada se amplifica después de la etapa 1b) de la reivindicación 1 mediando utilización preferiblemente de por lo menos dos oligonucleótidos cebadores por medio de una reacción en cadena de polimerasa.

18. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizado porque los nucleótidos marcados son derivados de citosina, siendo incorporados éstos en la reacción de polimerasa esencialmente tan sólo cuando en la muestra de ADN se presentaba en las correspondientes posiciones una metilación de citosina.

19. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizado porque la amplificación de varios fragmentos se lleva a cabo en un recipiente de reacción en forma de una PCR Múltiplex.

20. Procedimiento de acuerdo con una de las precedentes reivindicaciones, caracterizado porque se detecta en un experimento el estado de metilación de más de 10 posiciones de metilación del ADN que se ha de analizar.

21. Procedimiento de acuerdo con una de las precedentes reivindicaciones, caracterizado porque en el caso de por lo menos una de las amplificaciones uno de los cebadores respectivos está unido a una fase sólida.

22. Procedimiento de acuerdo con una de las precedentes reivindicaciones, caracterizado porque los materiales amplificados se detectan en total en el espectrómetro de masas y por consiguiente están caracterizados inequívocamente por su masa.

23. Utilización de un procedimiento de acuerdo con una de las precedentes reivindicaciones para el diagnóstico y/o pronóstico de sucesos desventajosos para pacientes o individuos, perteneciendo estos sucesos desventajosos por lo menos a una de las siguientes categorías: efectos indeseados de medicamentos; enfermedades de cáncer; fallos funcionales, daños o una enfermedad del SNC; síntomas de agresión o trastornos del comportamiento; consecuencias clínicas, psicológicas y sociales de daños cerebrales; trastornos psicóticos y trastornos de la personalidad; demencia y/o síndromes asociados; una enfermedad, un fallo funcional y un daño cardiovascular; un fallo funcional, un daño o una enfermedad del tracto gastrointestinal; un fallo funcional, un daño o una enfermedad del sistema respiratorio; una lesión, inflamación, infección, inmunidad y/o reconvalecencia; un fallo funcional, un daño o una enfermedad del cuerpo como desviación en el proceso de desarrollo; un fallo funcional, un daño o una enfermedad de la piel, de los músculos, del tejido conjuntivo o de los huesos; un fallo funcional, un daño o una enfermedad endocrino/a y metabólico/a; dolores de cabeza o un fallo funcional sexual.

24. Utilización de un procedimiento de acuerdo con una de las precedentes reivindicaciones para la diferenciación de tipos de células o tejidos o para la investigación de la diferenciación celular.