Hintergrund der Erfindung
und Stand der Technik
Viele
Erkrankungen, insbesondere Krebserkrankungen, gehen einher mit veränderter
Genexpression. Hierbei kann es sich einerseits um Mutationen der
Gene selbst handeln, welche zu einer Expression veränderter
Proteine oder zur Inhibierung oder Überexpression der Proteine
oder Enzyme führen.
Eine Modulation der Expression kann aber auch durch epigenetische
Veränderungen,
insbesondere DNA-Methylierung, erfolgen. Solche epigenetischen Veränderungen
berühren
die eigentliche DNA-Codierungssequenz nicht. Es hat sich herausgestellt,
dass DNA-Methylierungsprozesse weitreichende Implikationen für die Gesundheit
aufweisen, und es scheint klar, dass Kenntnisse über Methylierungsprozesse und Änderungen
im Methyl-Metabolismus sowie DNA-Methylierung
wesentlich zum Verständnis
von Erkrankungen, der Prophylaxe, Diagnose, sowie Therapie von Erkrankungen
sind.
Die
präzise
Kontrolle von Genen, welche nur einen kleinen Anteil des gesamten
Genoms von Säugetieren
darstellen, ist eine Frage der Regulation im Lichte des Umstandes,
dass der überwiegende
Anteil der DNA im Genom nicht kodierend ist. Die Anwesenheit solcher
Rumpf-DNA, welche Introns, repetetive Elemente und potenziell aktiv
transposierbare Elemente enthält,
erfordert effektive Mechanismen für ihre dauerhafte Unterdrückung (Silencing).
Es scheint, dass die Methylierung von Cytosin durch S-Adenosylmethionin(SAM)abhängige DNA
Methyltransferasen, welche 5-Methylcytosin bilden, einen solchen
Mechanismus für
die Änderung
von DNA-Protein-Interaktionen
darstellt. Gene können von
methylierungsfreien Promotern selbst dann transkribiert werden,
wenn benachbarte transkribierte oder nichttranskribierte Regionen
umfangreich methyliert sind. Dies erlaubt die Nutzung und Regulierung
von Promotern funktionaler Gene, während die Rumpf-DNA, einschließlich transposierbarer
Elemente, unterdrückt
wird. Methylierung findet auch statt für die langfristige Unterdrückung von
X-gelinkten Genen
und kann entweder zur Abnahme oder zum Anstieg des Ausmaßes der
Transkription führen, abhängig davon,
wo die Methylierung in der Transkriptionseinheit stattfindet.
Nahezu
die gesamte natürliche
DNA-Methylierung in Säugetieren
ist beschränkt
auf Cytosin-Guanosin (CpG) Dinukleotid-Palindromsequenzen, welche
durch DNA-Methyltransferasen
kontrolliert werden. CpG Dinukleotide machen ca. 1 bis 2 % aller
Dinukleotide aus und sind in sog. CpG-Inseln konzentriert. Diese
CpG-Inseln sind normaler Weise hypomethyliert und oft mit Promoter-Gebieten
von Genen gekoppelt. Veränderungen
der Genexpression, beispielsweise im Zusammenhang mit Krebs, können durch
Abweichungen der CpG-Inselmethylierung bedingt sein. Die Folgen
solcher DNA-Methylierungsabweichungen sind oft die Unterdrückung der
Expression von Tumor-Suppressorgenen und Cytosin zu Thymin-Mutationen,
welche aus der Deaminierung von 5-Methylcytosin zu Thymin resultieren.
Aber auch Hypermethylierung kann mit der Entstehung von Krankheiten
assoziiert sein.
Die
effiziente Detektion von DNA-Methylierungsmustern ist folglich ein
wichtiges Werkzeug zur Entwicklung neuer Ansätze zur Verhinderung, Diagnose
und Behandlung von Krankheiten sowie zum Screening nach Targets.
Insbesondere können
auch personenspezifische Methylierungsprofile erstellt und eine
maßgeschneiderte
Therapie für
die betreffende Person hieraus hergeleitet werden. Schließlich kann
hiermit die Wirkung einer Therapie überwacht werden.
Ein
Verfahren zur Untersuchung von Methylierungsmustern bzw. zur Bestimmung
von hypermethylierten CpG-Inseln ist die Differenzielle Methylierungs
Hybridisierung (DMH, Differential Methylation Hybridization [Huang
et al, Hum Mol Genet, 8:459-470, 1999]). Im Rahmen dieser Technologie wird
das eingangs genannte Verfahren eingesetzt, wobei die erhaltenen
Fragmente auf einen DNA-Chip, welcher geklonte CpG-Inseln trägt, hybridisiert
werden. Bei dem insoweit bekannten Verfahren wird die aus einer
Gewebeprobe stammende DNA zunächst
mit einem nicht-methylierungsspezifischen Restriktionsenzym, beispielsweise
MseI, geschnitten. Die erhaltenen Fragmente werden dann mit Linkern
ligiert. Die so erhaltene Mischung von Fragmenten wird dann mit
methylierungsspezifischen Endonukleasen, beispielsweise BstUI und/oder
HpaII, geschnitten und mittels PCR amplifiziert. Nach einem Reinigungsschritt
werden die Amplicons mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt. Die
vorstehenden Schritte werden einerseits mit DNA aus erkranktem Gewebe
und andererseits mit DNA aus benachbartem gesunden Gewebe gleichen
Gewebetyps durchgeführt,
wobei die jeweils erhaltenen Fragmente mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen
markiert werden. Beide Fragmentlösungen werden
dann auf den DNA-Chip mit CpG-Inseln cohybridisiert. Nach Waschverfahrensstufen
wird schließlich
ein Abbild des DNA-Chips mit einem handelsüblichen und für die Fluoreszenz-strahlung
sensitiven Scanner durchgeführt.
Das Abbild bzw. das darin erkennbare Muster floureszierender Punkte lässt sich
dann dahingehend analysieren, für
welche CpG-Clone Unterschiede in der Methylierung vorliegen. Hierzu
wird lediglich beispielhaft ergänzend
auf die Literaturstelle Wei et al, Clinical Cancer Research, 8:2246-2252
(2002) verwiesen.
Bei
den insoweit bekannten DNA-Experimenten werden zur Reduktion der
Komplexität
der erhaltenen Fragmentlösung
typischer Weise Fragmente mit einer Länge von < 100 Basen ausgefiltert bzw. nicht
amplifiziert und so abgereichert (Huang et al., Hum Mol Genet, 8:459-470
(1999). Dabei wird eine Reduktion der Komplexität der Mischung an Fragmenten
auf maximal 1/10 erreicht. Zudem ist es nachteilig, dass durch den
Einsatz nicht-methylierungs-spezifischer Restriktionsenzyme potenziell
interessante Fragmente, nämlich
Fragmente mit potentiell für
eine Erkrankung spezifischen Methylierungen, zuvor bereits methylierungsunspezifisch
geschnitten werden und folglich der nachfolgenden Analyse nicht
mehr zur Verfügung
stehen, wenn sie kleiner als 100 Basenpaare werden. Schließlich ist der
Einsatz einer Mehrzahl verschiedener Restriktionsenzyme erforderlich,
was den gesamten Prozess aufwändig
macht.
In
dem Verfahren des Standes der Technik werden theoretische alle Fragmente,
die nicht durch methylierungsspezifische Restriktionsenzyme geschnitten
werden, im letzten Schritt amplifiziert. Da die Anzahl der Fragmente,
die zugleich eine Restriktionserkennungssequenz haben und heruntermethyliert
sind, verschwindend gering sind, ist die Komplexität der Mischung
extrem hoch, und es wird praktisch versucht, den größten Teil
des gesamten Genoms zu amplifizieren. Die Reduktion der Komplexität wäre in diesen
Zusammenhängen
besonders wünschenswert,
da eine sehr grosse Anzahl unterschiedlicher Fragmente zu vergleichsweise
kleinen Amplifikationsfaktoren führt,
i.e. jedes einzelne Fragment wird für sich betrachtet nur sehr
geringfügig
amplifiziert, insbesondere ist der Unterschied in der Kopienzahl
von methylierten und unmethylierten Fragmenten gering. Aber selbst
wenn der Amplifikationsfaktor erhöht werden könnte, so wäre die Detektion von einzelnen
Fragmenten aus der sehr großen
Population verschiedener Fragmente auf Grund von Kreuzhybridisierungseffekten
nicht oder allenfalls sehr unsicher möglich. Zu der Problematik (zu)
hoher Komplexität
wird ergänzend
auf die Literaturstelle Lucito et al., Genetic Research (2000) verwiesen.
Technisches Problem der
Erfindung
Der
Erfindung liegt daher das technische Problem zugrunde, die Komplexität einer
erhaltenen DNA-Fragmentlösung
stärker
zu reduzieren, und zwar bei gleichzeitigem Erhalt potenziell interessierender
Fragmente und zusätzlich
vereinfachtem Prozess.
Grundzüge der Erfindung
und bevorzugte Ausführungsbeispiele
Zur
Lösung
dieses technischen Problems lehrt die Erfindung ein Verfahren zur
Herstellung einer Mischung von Fragmenten einer Polynukleinsäure mit
den folgenden Verfahrensstufen: a) es wird eine Lösung enthaltend
die Polynukleinsäure
hergestellt, b) optional erfolgt eine Aufbereitungsverfahrensstufe,
in welcher Substanzen, die keine Polynukleinsäure sind, abgereichert werden
und/oder die Polynukleinsäure
angereichert wird, c) es wird der Lösung ohne vorherige Zugabe
eines nicht-methylierungsspezifischen Restriktionsenzyms ein methylierungsspezifisches
Restriktionsenzym zugegeben, wobei die Polynukleinsäure an methylierbaren,
jedoch nicht methylierten Schnittstellen zu den Fragmenten geschnitten
wird, und d) die in Stufe c) erhaltenen Fragmente werden einer Amplifikationsverfahrensstufe
unterzogen, wobei Fragmente von einer Länge im Bereich 50 Basen bis
5.000 Basen selektiv angereichert werden.
Mit
dem erfindungsgemäßen Verfahren
wird eine Lösung
mit einer Mischung von Fragmenten einer Polynukleinsäure erhalten,
welche beispielsweise für
die DMH geeignet ist. Dabei ist durch den Verzicht auf den Einsatz
eines nicht-methylierungspezifischen
Restriktionsenzyms in Verbindung mit der selektiven Amplifikation
des angegebenen Längenfensters
eine Reduktion der Komplexität
der Mischung auf 1/100 erreichbar, i.e. um einen Faktor 10 besser als
im Stand der Technik. Dies beruht auch darauf, dass methylierte
Sequenzbereiche und Sequenzbereiche ohne cgcg Elemente (recognition
sites für
Methylierungsstellen) nicht geschnitten werden und folglich Fragmente
bilden, deren Länge
in aller Regel oberhalb der Obergrenzen des Amplifikationsfensters
liegt. Dagegen werden Bereiche mit recognition sites, sofern nicht
methyliert, geschnitten und bilden Fragmente mit einer Länge unterhalb
der Obergrenze des Amplifikationsfensters. Zudem werden keine potentiell
interessanten Fragmente nicht-methylierungsspezifisch geschnitten
und dadurch auf eine Länge
unterhalb der Untergrenze des Fensters reduziert. Folglich stehen
alle interessanten Fragmente, also solche mit potentiell hyper- oder hypomethylierten
Stellen, den folgenden Analysen zur Verfügung. Schließlich ist
der Gesamtprozess vereinfacht, da mit weniger verschiedenen Restriktionsenzymen
gearbeitet wird. Es ist sogar möglich,
alle Reaktionen bis zur Hybridisierung auf einem DMH Chip in einem
Gefäß durchzuführen (one
tube prozess). Folglich ist die Aufbereitung vereinfacht und beachtlich
beschleunigt. Schließlich
ist die Anzahl potentieller Fehlerquellen im Prozess deutlich reduziert.
Besonders
bevorzugt ist es folglich, dass in keiner Verfahrensstufe ein nicht-methylierungsspezifisches
Restriktionsenzym eingesetzt wird.
Grundsätzlich ist
jedes methylierungsspezifische Restriktionsenzym im Rahmen der Erfindung verwendbar.
Vorzugsweise ist das methylierungsspezifische Restriktionsenzym
ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus "BstUI,
BshI236I, AccII, BstFNI, MvnI, HpaII (HapII), HhaI, AciI, SmaI,
HinP1I, HpyCH4IV und Mischungen aus zwei oder mehr der vorstehenden
Enzyme".
Das
erfindungsgemäße Verfahren
wird in der Regel auf eine Polynukleinsäure angewandt werden, die eine
natürlich
vorkommende DNA ist. Dabei kann es sich insbesondere um eine genomische
DNA, beispielsweise eine humane genomische DNA, handeln.
Bevorzugterweise
werden in Verfahrensstufe d) Fragmente mit einer Länge im Bereich
von 100 Basen bis 1.000 Basen selektiv angereichert. Hierdurch wird
die optimale Reduktion der Komplexität erreicht, wobei gleichzeitig
dennoch praktisch alle potentiell interessanten Fragmente angereichert
werden.
Die
Erfindung betrifft des weiteren ein Verfahren zur Untersuchung des
Methylierungsmusters einer Polynukleinsäure, insbesondere einer genomischen
DNA aus einer Gewebeprobe eines Patienten, mit den folgenden Verfahrensstufen:
A) es wird ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 durchgeführt, B)
anschließend
werden die selektiv angereicherten Fragmente mit einer mittels eines
physikalischen Detektionsverfahrens detektierbaren Substanz gekoppelt,
C) eine Lösung
enthaltend die Fragmente aus Stufe B) wird unter Bedingungen mit
einem DNA-Microarray, das eine Mehrzahl von verschiedenen immobilisierten
Nukleinsäuren
mit jeweils zumindest einer Methylierungsstelle an jeweils zugeordneten
verschiedenen Orten auf dem DNA-Microarray trägt, kontaktiert, unter welchen
eine Hybridisierung von Fragmenten mit korrelierten immobilisierten
Nukleinsäuren
unter definierter Stringenz erfolgt, D) optional wird eine Waschverfahrensstufe
durchgeführt,
E) mittels des physikalischen Detektionsverfahrens werden ortsaufgelöst diejenigen immobilisierten
Nukleinsäuren
detektiert, an welchen Fragmente aus der Lösung hybridisiert sind.
Dabei
kann die detektierbare Substanz beispielsweise ein Fluoreszenzfarbstoff
sein, wobei das Detektionsverfahren dann ein für die von dem Fluoreszenzfarbstoff
emittierte Fluoreszenzstrahlung selektives Scannen (eindimensional
oder zweidimensional, je nach Anordnung der verschiedenen immobilisierten
Nukleinsäuren
auf dem Chip) umfasst. Der Fluoreszenzfarbstoff kann beispielsweise
Cy3 und/oder Cy5 sein. Dem Durchschnittsfachmann sind selbstverständlich viele
weitere geeignete Fluoreszenzfarbstoffe bekannt.
Dieses
erfindungsgemäße Verfahren
kann für
verschiedene Zwecke eingesetzt werden. Einerseits kann damit die
DMH durchgeführt
werden, wozu später
weitere Erläuterungen
erfolgen. Es ist aber auch für
diagnostische Zwecke einsetzbar. In letzterem Falle enthalten die
immobilisierten Nukleinsäuren
beispielsweise Nukleinsäuresequenzen,
deren Methylierungsstellen bei Vorliegen einer definierten Erkrankung
gegenüber
dem Normalzustand nicht methyliert sind. Dann werden hiermit hybridisierende Fragmente
der untersuchten DNA indiziell dafür sein, dass die Erkrankung
vorliegt, da die Fragmente ausschließlich solche sind, die in der
untersuchten DNA nicht methyliert sind. Selbstverständlich kann
auch bzw. zusätzlich
umgekehrt mit immobilisierten Nukleinsäuren gearbeitet werden, die
im Krankheitsfall methyliert sind. Dann wird durch Nicht-Hybridisierung eine
Ausschlussinformation erhalten.
Im
Rahmen dieser Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens kann das DNA-Microarray grundsätzlich immobiliserte
Nukleinsäuren
tragen, deren Methylierung oder Nichtmethylierung mit einer Mehrzahl
verschiedener definierter Erkrankungen korreliert sind. Dann wird
die DNA des Patienten gleichzeitig auf die Mehrzahl der verschiedenen
Erkrankungen untersucht. Auf Grund der Komplexität solcher Untersuchungen kann
es sich jedoch auch empfehlen, wenn das DNA-Microarray ausschließlich Nukleinsäuren trägt, welche
Nukleinsäuresequenzen enthalten,
die bei einer einzigen definierten Erkrankung gegenüber dem
Normalzustand nicht methyliert oder methyliert sind.
Anschließend an
diese Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens
betrifft die Erfindung des Weiteren ein Test-Kit zur Durchführung des
erfindungsgemäßen Verfahrens
mit den folgenden Komponenten: i) einer einzigen Restriktionsenzymkomponente,
welche ausschließlich
ein methylierungsspezifisches Restriktionsenzym oder mehrere solcher
Enzyme umfasst, und ii) einem DNA-Microarray, welches eine Mehrzahl
von verschiedenen immobilisierten Nukleinsäuren mit jeweils einer Methylierungsstelle
an jeweils zugeordneten verschiedenen Orten auf dem DNA-Microarray trägt. Dabei
enthalten die Nukleinsäuren
Nukleinsäuresequenzen,
die bei einer Mehrzahl von verschiedenen definierten Erkrankungen
oder einer einzigen definierten Erkrankung gegenüber dem Normalzustand nicht
methyliert oder methyliert sind. Die definierte Erkrankung kann beispielsweise
eine spezifische Krebserkrankung sein. Eine spezifische Krebserkrankung
meint hierbei eine organspezifische Krebserkrankung, wie beispielsweise
Lungenkrebs, Ovarkrebs, Hodenkrebs, Prostatakrebs, Pankreaskrebs,
Krebs eines Organs des Verdauungstraktes, usw.. Geeignete Sequenzen im
Rahmen aller Aspekte der vorliegenden Erfindung sind beispielsweise
in den Literaturstellen
DE 20121979
U1 ,
DE 20121978
U1 ,
DE 20121977
U1 ,
DE 20121975
U1 ,
DE 20121974
U1 ,
DE 20121973 U1 ,
DE 20121972 U1 ,
DE 20121971 U1 ,
DE 20121970 U1 ,
DE 20121969 U1 ,
DE 20121968 U1 ,
DE 20121967 U1 ,
DE 20121966 U1 ,
DE 20121965 U1 ,
DE 20121964 U1 ,
DE 20121963 U1 ,
DE 20121961 U1 ,
DE 20121960 U1 ,
DE 10019173 A1 ,
DE 10019058 A1 ,
DE 10013847 A1 ,
DE 10032529 A1 ,
DE 10054974 A1 ,
DE 10043826 A1 ,
DE 10054972 A1 ,
DE 10037769 A1 ,
DE 10061338 A1 ,
DE 10245779 A1 ,
DE 10164501 A1 ,
DE 10161625 A1 ,
DE 10230692 ,
DE 10255104 ,
EP 1268855 ,
EP 1283905 ,
EP 1268857 ,
EP 1294947 ,
EP 1370685 ,
EP 1395686 ,
EP 1421220 ,
EP 1451354 ,
EP 1458893 ,
EP 1340818 ,
EP 1399589 ,
EP 1478784 , WO 2004/035803, und WO
2005/001141 beschrieben, auf welche hiermit ausdrücklich Bezug
genommen wird.
In
dem Test-Kit können
eine oder mehrere der folgenden Komponenten zusätzlich enthalten sein: i) ein
Linker oder mehrere Linker, ggf. in geeigneter Lösung, ii) Substanzen oder Lösungen zur Durchführung einer
PCR, iii) ein Farbstoff oder mehrere Farbstoffe, ggf. mit Kopplungsreagenz,
ggf. in Lösung,
iv) Substanzen oder Lösungen
zur Durchführung
einer Hybridisierung, und/oder v) Substanzen oder Lösungen zur
Durchführung
einer Waschverfahrensstufe.
Das
erfindungsgemäße Verfahren
ist aber auch im Rahmen der Discovery von Targets geeignet. Targets
sind Proteine oder Enzyme deren Modulation mit definierten Erkrankungen
korreliert sind. Mit der Feststellung einer solchen Korrelation
kann dann eine Substanz ausgewählt
oder geschaffen werden, die das Target oder Target-Vorläufer oder
Target-Nachfolger (up-stream oder down-stream des festgestellten
Targets in einem biologischen Pathway) so moduliert, dass die krankheitskorrelierte Modulation
des Targets aufgehoben wird. Solche Substanzen sind dann zur Herstellung
pharmazeutischer Zusammensetzungen zur Prophylaxe oder Therapie
der Erkrankung geeignet.
Daher
betrifft die Erfindung des Weiteren die Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur
Identifizierung eines indikationsspezifischen Targets, wobei eine
erste Lösung
mit DNA, welche aus einer Gewebeprobe mit erkranktem Gewebe entstammt,
dem erstgenannten erfindungsgemäßen Verfahren
unterworfen wird, wobei eine zweite Lösung mit DNA, welche aus einer
zum erkrankten Gewebe benachbarten Gewebeprobe mit gesundem Gewebe
gleicher Gewebeart entstammt, ebenfalls dem erstgenannten erfindungsgemäßen Verfahren unterworfen
wird, wobei die erste Lösung
und die zweite Lösung
gleichzeitig oder nacheinander mit zwei gleichen DNA-Microarrays
oder einem einzigen DNA-Microarray kontaktiert und hierauf hybridisiert werden,
wobei solche immobilisierten Nukleinsäuren selektiert werden, an
welche ausschließlich
die Fragmente der ersten Lösung
oder der zweiten Lösung hybridisiert
sind, und wobei für
eine selektierte Nukleinsäure
das von dieser selektierten Nukleinsäure codierte Protein, Peptid
oder Enzym identifiziert wird. Hierbei wird das DNA-Microarray typischerweise eine
Vielzahl verschiedener Klone tragen, die bekannte Methylierungstellen
enthalten. Diese sind beispielsweise aus Gendatenbanken erhältlich.
Die Herstellung solcher DNA-Microarrays ist dem Fachmann wohl vertraut
und braucht daher hier nicht näher
erläutert
zu werden.
Im
Rahmen dieses Verfahren kann des Weiteren ein bekannter Modulator
des vorstehend ermittelten codierten Proteins, Peptids oder Enzyms
der spezifischen Indikation des erkrankten Gewebes zugeordnet werden.
Daher umfasst die Erfindung auch die Verwendung eines mit einem
solchen Verfahren zugeordneten Modulators zur Herstellung einer
pharmazeutischen Zusammensetzung mit der spezifischen Indikation,
insbesondere einer spezifischen Krebsindikation.
Für die USA
betrifft die Erfindung schließlich die
Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens
oder eines erfindungsgemäßen Test-Kits
zur Diagnose einer Erkrankung, insbesondere einer Krebserkrankung.
Hierbei wird einem Patienten eine Gewebeprobe entnommen, welche
dann in fachüblicher
Weise aufbereitet und mittels des Testkits dem Verfahren unterworfen
wird.
Definitionen
Der
Begriff der Behandlung umfasst auch die Prophylaxe sowie die Nachbehandlung
(z.B. bei nicht mehr detektierbarem Tumor oder bei stabilem Tumor).
Der Begriff der Prophylaxe umfasst im Zusammenhang mit der Detektion
auch die Vorsorgeuntersuchung. Die Begriffe der Detektion bzw. Diagnose und/oder
der Behandlung bzw. Therapie einer Krebserkrankung umfassen optional
auch die Detektion und/oder Behandlung von Metastasen aus Primärtumoren
in sonstigen Geweben
Geeignete
Targets bzw. für
geeignete Targets codierende Nukleinsäuresequenzen sind den in der
Beschreibung angegebenen Literaturstellen entnehmbar.
Die
Amplifikation eines Fragments einer Polynukleinsäure kann beispielsweise mittels
der PCR Technologie durchgeführt
werden.
Methylierungsspezifische
Restriktionsenzyme sind Enzyme, welche eine Nukleinsäuresequenz schneiden,
wenn die Erkennungsstelle nicht methyliert oder hemimethyliert ist.
Ist die Erkennungsstelle dagegen methyliert, erfolgt der Schnitt
nicht oder mit verringerter Effizienz. Bevorzugt sind methylierungsspezifische
Restriktionsenzyme, deren Erkennungssequenz ein cg Dinukleotid enthält (beispielsweise cgcg
oder cccggg) und nicht schneiden, wenn das Cytosin in diesem Dinukleotid
am Kohlenstoffatom C5 methyliert ist. Die Erkennungssequenz ist
vorzugsweise 4 bis 6 Basenpaare lang und bei dem Restriktionsenzym
handelt es sich dann um einen Vierer-Cutter oder Sechser-Cutter.
Nicht-methylierungsspezifische
Restriktionsenzyme sind Restriktionsenzyme, welche eine Nukleinsäuresequenz
unabhängig
von dem Methylierungsstatus mit nahezu gleicher Effizienz schneiden.
Ein
Methylierungsmuster einer Polynukleinsäure bezeichnet die Charakterisierung
der Nukleinsäuresequenz
dahingehend, welche methylierbaren Nukleotide methyliert sind und
welche methylierbaren Nukleotide nicht methyliert sind. Ein Methylierungsmuster
kann für
definierte Teilbereiche der Polynukleinsäure oder für die gesamte Polynukleinsäure bestimmt
sein.
Ein
Testkit bezeichnet ein Konvolut von zumindest einer chemischen,
biologischen und/oder physikalischen Kitkomponente zusammen mit
einer Anleitung bzw. Beschreibung, worin angegeben ist, für die Detektion
welcher Erkrankung das Testkit bestimmt ist. Im Rahmen eines Testkits
können
auch Standardreagenzien und/oder Standardkurven in beliebiger Form
(gedruckt, auf Datenträger
gespeichert, Link zu einer Datenbank) enthalten sein.
Ein
DNA-Microarray ist ein beliebiges Konstrukt mit einem Substrat bzw.
Träger,
auf oder in welchem verschiedene Nukleinsäurespezies, wie Gene, Genfragmente,
oder sonstige Oligonukleotide oder Polynukleotide, jeweils an unterschiedlichen
definierten und den jeweiligen Nukleinsäurenspezies zugeordneten Orten
angeordnet sind. Hierbei ist an jeweils einem Ort eine Nukleinsäurespezies
angeordnet, es kann aber auch an jeweils einem Ort ein definiertes
Gemisch verschiedener Nukleinsäurespezies angeordnet
sein, wobei dann jeder Ort ein anderes Gemisch trägt. Dabei
können
die Nukleinsäuren
immobilisiert sein, dies ist aber nicht zwingend notwendig, je nach
verwendetem Substrat bzw. Träger.
Nicht beschränkende
Beispiele für
Microarrays sind: Nukleinsäure-Chips,
Gen-Chips, Microtiterplatten mit Nukleinsäurelösungen in den Wells, wobei
die Nukleinsäuren
immobilisiert oder nicht immobilisiert sein können, und Membranen mit darauf
immobilisierten Nukleinsäuren.
Als
Modulator eines Targets ist eine Verbindung oder Substanz bezeichnet,
welche entweder die Bildung des Targets inhibiert oder induziert,
oder gebildetes Target in der Aktivität reduziert oder aktiviert,
bezogen auf die in vitro oder in vivo Aktivität in Abwesenheit der Substanz.
Insofern kann ein Modulator einerseits eine Substanz sein, welche
in der Entstehungskaskade des Targets modulierend eingreift. Auf
der anderen Seite kann ein Modulator eine Substanz sein, welche
mit gebildetem Target eine Bindung eingeht, und zwar dergestalt,
dass weitere physiologische Wechselwirkungen mit endogenen Substanzen
zumindest reduziert oder erhöht
sind. Als Modulatoren können
auch Moleküle
dienen, welche die Transkription des Zielgens beeinflussen und inhibieren
oder aktivieren. Solche Moleküle
können
beispielsweise Polyamide oder Zinkfingerproteine sein, die durch
Bindung an DNA-Regionen der basalen Transkriptionsmaschinerie die
Transkription verhindern. Die Transkription kann indirekt auch über die
Inhibierung von Transkriptionsfaktoren geschehen, die für die Transkription
des Zielgens essentiell sind. Die Inhibierung solcher Transkriptionsfaktoren
kann über die
Bindung an sogenannte Decoy-Aptamere gewährleistet werden.
Modulatoren
können
natürliche
oder synthetische Moleküle
sein, die spezifisch an ein Target oder einen Target-Vorläufer oder
Target-Nachfolger binden. Es kann sich auch um targetspezifische
Antikörper
handeln, beispielsweise humane, humanisierte und nicht-humanisierte
polyklonale oder monoklonale Antikörper. Der Begriff des Antikörpers umfasst desweiteren
Phage-Display-Antikörper,
Ribozym-Display
Antikörper
(kovalente Fusion zwischen RNA und Protein) und RNA-Display Antikörper (in
vitro hergestellt). Der Begriff umfasst auch Antikörper, welche
durch Chimerisierung, Humanisierung oder De-Immunisierung modifiziert
sind, sowie spezifische Fragmente der leichten und/oder der schweren
Kette des variablen Bereiches zu Grunde liegender Antikörper vorstehender
Art. Die Herstellung bzw. Gewinnung solcher Antikörper mit
vorgegebenen Immunogenen ist dem Durchschnittsfachmann wohl vertraut und
braucht nicht näher
erläutert
zu werden. Weiterhin umfaßt
sind bispezifische Antikörper,
welche einerseits an ein Auslösemolekül einer
Immun-Effektorzelle (z.B. CD3, CD16, CD64) und andererseits an ein
Antigen der Tumorzielzelle binden. Dies bewirkt letzendlich im Bindungsfall,
daß beispielsweise
eine Tumorzelle getötet
wird. Modulatoren können
beispielsweise auch geeignete targetspezifische Anticaline und Affibodies
sein, die einen Antikörper
mimikrieren.
Die
galenische Herrichtung einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung kann
in fachüblicher
Weise erfolgen. Als Gegenionen für
ionische Verbindungen kommen beispielsweise Na+,
K+, Li+ oder Cyclohexylammonium
infrage. Geeignete feste oder flüssige
galenische Zubereitungsformen sind beispielsweise Granulate, Pulver,
Dragees, Tabletten, (Mikro-) Kapseln, Suppositorien, Sirupe, Säfte, Suspensionen;
Emulsionen, Tropfen oder Lösungen
zur Injektion (i.v., i.p., i.m., s.c.) oder Vernebelung (Aerosole),
transdermale Systeme, sowie Präparate
mit protrahierter Wirkstoff-Freigabe, bei deren Herstellung übliche Hilfsmittel
wie Trägerstoffe,
Spreng-, Binde-, Überzugs-,
Quellungs-, Gleit- oder Schmiermittel, Geschmacksstoffe, Süßungsmittel
und Lösungsvermittler,
Verwendung finden. Als Hilfsstoffe sei Magnesiumcarbonat, Titandioxid,
Lactose, Mannit und andere Zucker, Talcum, Milcheiweiß, Gelatine,
Stärke,
Zellulose und ihre Derivate, tierische und pflanzliche Öle wie Lebertran,
Sonnenblumen-, Erdnuss- oder Sesamöl, Polyethylenglycole und Lösungsmittel,
wie etwa steriles Wasser und ein- oder mehrwertige Alkohole, beispielsweise
Glycerin, genannt. Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung
ist dadurch herstellbar, dass mindestens ein erfindungsgemäß verwendeter
Modulator in definierter Dosis mit einem pharmazeutisch geeigneten
und physiologisch verträglichen
Träger
und ggf. weiteren geeigneten Wirk-, Zusatz- oder Hilfsstoffen mit
definierter Inhibitordosis gemischt und zu der gewünschten
Darreichungsform hergerichtet ist.