DE10230692A1

DE10230692A1 - Verfahren und Nukleinsäuren für die Analyse von Methylierungsmustern innerhalb des DD3-Gens

Info

Publication number: DE10230692A1
Application number: DE10230692A
Authority: DE
Inventors: Torsten Dr. Horns
Original assignee: Epigenomics AG
Current assignee: Epigenomics AG
Priority date: 2002-07-08
Filing date: 2002-07-08
Publication date: 2004-02-12
Also published as: EP1527198A1; AU2003281281A1; WO2004005543A1; US20060210976A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Sequenzen zur Analyse von Methylierungsmustern innerhalb der 5'- und Promoter-Regionen des Gens DD3 zur Verfügung.

Description

Das Gen DD3, auch als PCA3 bekannt, ist bei 9p21-22 lokalisiert und seine Sequenz ist öffentlich in der GenBank (Zugangs-Nummer AF103907) zugänglich. Die Struktur dieses Gens wurde früher beschrieben (Bussemakers MJ, van Bokhoven A, Verhaegh GW, Smit FP, Karthaus HF, Schalken, JA, Debruyne FM, Ru N, Isaacs WB. DD3: a new prostate-specific gene, highly overexpressed in prostate cancer. Cancer Res 1999 Dec 1; 59(23): 5975–9). Die mRNA-Expressionsanalyse des Gens zeigt eine starke Korrelation zwischen erhöhten Spiegeln von DD3 und dem Auftreten von Krebs. Die biologische Aktivität des Gens ist bis jetzt noch nicht geklärt, es wurde spekuliert, daß es vielleicht eine nicht-kodierende RNA ist. Nichts desto trotz weist die Analyse des Gens ein Potential auf, ein ausgezeichneter Krebsmarker zu sein. Jedoch ist die mRNA-Analyse keine Technik, die zur Anwendung in einem klinischen und/oder mittleren/großen Durchsatz-Laboransatz geeignet ist. Ihre Brauchbarkeit als ein diagnostisches Routine-Werkzeug wird durch die extreme Instabilität von mRNA, schnell auftretenden Expressionsveränderungen im Anschluß an bestimmte auslösende Faktoren (z. B. die Probensammlung) begrenzt. Weiterhin, und am meisten bemerkenswert, werden große Menge von mRNA für die Analyse benötigt (Lipschutz, R.J. et al., Nature Genetics 21: 20–24, 1999; Bowtell, D. D. L. Nature genetics suppl. 21: 25–32, 1999), die oftmals nicht aus einer Routine-Biopsie erhalten werden können.
Weiterhin, falls es bestätigt werden sollte, daß DD3 in der Tat eine nicht-kodierende RNA ist, dann würden Protein- und/oder Antikörper-Tests keine brauchbaren diagnostischen Tests sein. Daraus folgt, daß ein Bedarf an der weiteren Untersuchung an der Regulation von DD3 erforderlich ist, um einen brauchbaren genomischen Marker zu identifizieren, der in einem klinischen und/oder Labor-Aufbau verwendet werden kann. Jedoch sind bis heute keine Ein zel-Nukleotidpolymorphismen oder andere genetische Mutationen von dem Typ bekannt, der als Marker für die Entwicklung von DNA-basierten Tests verwendet werden kann.
Es wird vorgesehen, daß die Entwicklung von solch einem Test von besonderem Wert bei dem verbesserten Nachweis und dem Management von Prostatakrebs wäre. Prostatakrebs ist ein signifikantes Gesundheitsproblem in westlichen Ländern, das 1999 in 180 pro 100.000 in den USA auftrat (Cancer J Clin 1999; 49: 8). Verschiedene Screening Strategien werden aufgewendet, um den frühen Nachweis zu verbessern, einschließlich des Nachweis von Spiegeln von Prostata-spezifischem Antigen (PSA) und digitaler rektaler Untersuchung. Falls ein Prostata-Karzinom in einem Patienten vermutet wird, wird die Krebsdiagnose bestätigt oder ausgeschlossen durch histologische und zytologische Analyse von Biopsie-Proben auf Merkmale, die mit maligner Transformation assoziiert sind. Insbesondere frühe Phasen von Prostatakarzinomen sind oftmals schwer von benigner Hyperplasmie der Prostata durch Routinehistologische Untersuchung zu unterscheiden, auch wenn eine geeignete Biopsie erhalten wird (McNeal JE et al., Hum Pathol 2001, 32: 441–6). Weiterhin behindern kleine oder anders unzureichende Biopsie-Proben manchmal die Routine-Analyse.
Der im Augenblick am meisten informative Test zum Nachweis von Prostatakarzinomen ist die Analyse von Prostata-spezifischem Antigen-Spiegeln. Jedoch ist die Brauchbarkeit des Tests von begrenztem Wert, weil die Antigene als ein Ergebnis einer generellen Prostata-Immunantwort induziert werden. Insbesondere wenn ein gering abnormaler PSA-Wert (4–10 ng/ml) im Kontext einer negativen digitalen rektalen Untersuchung (DRE) ermittelt wird, werden nur 20-30% der Individuen mit solchen Ergebnissen ein Karzinom in der Biopsie zeigen (Kantoff and Talcott, 8(3) Hematoll Oncol Clinics N Amer 555 (1994)). Innerhalb des letzten Jahrzehnts wurde von zahlreichen Genen gezeigt, daß sie zwischen Prostata-Tumoren benigner Hyperplasie und verschiedenen Graden von Prostatakrebs verschieden exprimiert werden. Jedoch wurde bis jetzt kein einzelner Marker als ausreichend für die Unterscheidung zwischen den zwei Läsionen gezeigt.
5-Methylcytosin ist die häufigste kovalente Basenmodifikation in der DNA eukaryontischer Zellen. Sie spielt beispielsweise eine Rolle in der Regulation der Transkription, beim genetischem Imprinting und in der Tumorgenese. Die Identifizierung von 5-Methylcytosin als Bestandteil genetischer Information ist daher von erheblichem Interesse. 5-Methylcytosin- Positionen können jedoch nicht durch Sequenzierung identifiziert werden, da 5-Methylcytosin das gleiche Basenpaarungsverhalten aufweist wie Cytosin. Darüber hinaus geht bei einer PCR-Amplifikation die vom 5-Methylcytosin getragene epigenetische Information vollständig verloren.
Eine relativ neue und die mittlerweile am häufigsten angewandte Methode zur Untersuchung von DNA auf 5-Methylcytosin beruht auf der spezifischen Reaktion von Bisulfit mit Cytosin, das nach anschließender alkalischer Hydrolyse in Uracil umgewandelt wird, welches in seinem Basenpaarungsverhalten dem Thymidin entspricht. 5-Methylcytosin wird dagegen unter diesen Bedingungen nicht modifiziert. Damit wird die ursprüngliche DNA so umgewandelt, daß Methylcytosin, welches ursprünglich durch sein Hybridisierungsverhalten vom Cytosin nicht unterschieden werden konnte, jetzt durch „normale" molekularbiologische Techniken als einzig verbliebenes Cytosin, beispielsweise durch Amplifikation und Hybridisierung oder Sequenzierung, nachgewiesen werden kann. Alle diese Techniken beruhen auf Basenpaarung, welche jetzt voll ausgenutzt werden kann. Der Stand der Technik, was die Empfindlichkeit betrifft, wird durch ein Verfahren definiert, welches die zu untersuchende DNA in einer Agarose-Matrix einschließt, dadurch die Diffusion und Renaturierung der DNA (Bisulfit reagiert nur mit einzelsträngiger DNA) verhindert und alle Fällungs- und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse ersetzt (Olek A, Oswald J, Walter J. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 Dec 15; 24(24): 50646). Mit dieser Methode können einzelne Zellen untersucht werden, was das Potential der Methode veranschaulicht. Allerdings werden gegenwärtig nur einzelne Regionen bis etwa 3000 Basenpaare Länge untersucht, eine globale Untersuchung von Zellen auf Tausende von möglichen Methylierungsereignisse ist nicht möglich. Allerdings kann auch dieses Verfahren keine sehr kleinen Fragmente aus geringen Probenmengen zuverlässig analysieren. Diese gehen trotz Diffusionsschutz durch die Matrix verloren.
Eine Übersicht über die weiteren bekannten Verfahren zum Nachweis von 5-Methylcytosin kann dem folgenden Übersichtsartikel entnommen werden: Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2255.
Die Bisulfit-Technik wird bisher bis auf wenige Ausnahmen (z.B. Zeschnigk M, Lich C, Buiting K, Doerfler W, Horsthemke B. A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman and Prader-Willi syndrome based on allelic methylation differences at the SNRPN locus. Eur J Hum Genet. 1997 Mar-Apr; 5(2): 94–8) nur in der Forschung angewendet. Immer aber werden kurze, spezifische Stücke eines bekannten Gens nach einer Bisulfit-Behandlung amplifiziert und entweder komplett sequenziert (Olek A, Walter J. The pre-implantation ontogeny of the H 19 methylation imprint. 1997 Nov; 17(3): 275–6) oder einzelne Cytosin-Positionen durch eine „Primer-Extension-Reaktion" (Gonzalgo ML, Jones PA. Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE) Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15;25(12): 2529–31, WO 95/00669) oder durch enzymatischen Verdau (Xiong Z, Laird PW. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15;25(12): 2532–4) nachgewiesen. Zudem ist auch der Nachweis durch Hybridisierung beschrieben worden (Olek et al., WO 99/28498).
Weitere Publikationen, die sich mit der Anwendung der Bisulfit-Technik zum Methylierungsnachweis bei einzelnen Genen befassen, sind: Grigg G, Clark S. Sequencing 5-methylcytosine residues in genomic DNA. Bioessays. 1994 Jun; 16(6): 431–6, 431; Zeschnigk M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke B, Doerfler W. Imprinted segments in the human genome: different DNA methylation patterns in the Prader-Willi/Angeluran syndrome region as determined by the genomic sequencing method. Hum Mol Genet. 1997 Mar;6(3):387-95; Feil R, Charlton J, Bird AP, Walter J, Reik W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 1994 Feb 25; 22(4): 695–6; Martin V, Ribieras S, Song-Wang X, Rio MC, Dante R. Genomic sequencing indicates a correlation between DNA hypomethylation in the 5' region of the pS2 gene and its expression in human breast cancer cell lines. Gene. 1995 May 19; 157(1-2): 261–4; WO 97/46705 und WO 95/15373.
Eine Übersicht über den Stand der Technik in der Oligomer Array Herstellung 1äßt sich aus einer im Januar 1999 erschienenen Sonderausgabe von Nature Genetics (Nature Genetics Supplement, Volume 21, January 1999) und der dort zitierten Literatur entnehmen.
Für die Abtastung immobilisierter DNA-Arrays werden vielfach fluoreszenzmarkierte Sonden verwendet. Besonders geeignet für Fluoreszenzmarkierungen ist das einfache Anbringen von Cy3 und Cy5 Farbstoffen am 5'-OH der jeweiligen Sonde. Die Detektion der Fluoreszenz der hybridisierten Sonden kann beispielsweise über ein Konfokalmikroskop erfolgen. Die Farbstoffe Cy3 und Cy5 sind, neben vielen anderen, kommerziell erhältlich.
Matrix-unterstützte Laser Desorptions/Ionisations-Massenspektrometrie (MALDI-TOF) ist eine sehr leistungsfähige Entwicklung für die Analyse von Biomolekülen (Karas M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem. 1988 Oct 15; 60(20): 2299–301). Ein Analyt wird in eine lichtabsorbierende Matrix eingebettet. Durch einen kurzen Laserpuls wird die Matrix verdampft und das Analytmolekül so unfragmentiert in die Gasphase befördert. Durch Stöße mit Matrixmolekülen wird die Ionisation des Analyten erreicht. Eine angelegte Spannung beschleunigt die Ionen in ein feldfreies Flugrohr. Auf Grund ihrer verschiedenen Massen werden die Ionen unterschiedlich stark beschleunigt. Kleinere Ionen erreichen den Detektor früher als größere.
MALDI-TOF Spektrometrie eignet sich ausgezeichnet zur Analyse von Peptiden und Proteinen. Die Analyse von Nukleinsäuren ist etwas schwieriger (Gut I G, Beck S. DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Current Innovations and Future Trends. 1995, 1; 147–57). Für Nukleinsäuren ist die Empfindlichkeit etwa 100 mal schlechter als für Peptide und nimmt mit zunehmender Fragmentgröße überproportional ab. Für Nukleinsäuren, die ein vielfach negativ geladenes Rückgrat haben, ist der Ionisationsprozeß durch die Matrix wesentlich ineffizienter. In der MALDI-TOF Spektrometrie spielt die Wahl der Matrix eine eminent wichtige Rolle. Für die Desorption von Peptiden sind einige sehr leistungsfähige Matrizes gefunden worden, die eine sehr feine Kristallisation ergeben. Mittlerweile gibt es einige ansprechende Matrizes für DNA, der Empfindlichkeitsunterschied wurde jedoch nicht verringert. Der Empfindlichkeitsunterschied kann verringert werden, indem die DNA chemisch so modifiziert wird, daß sie einem Peptid ähnlicher wird. Phosphorothioatnukleinsäuren, bei denen die gewöhnlichen Phosphate des Rückgrats durch Thiophosphate substituiert sind, lassen sich durch einfache Alkylierungschemie in eine ladungsneutrale DNA umwandeln (Gut IG, Beck S. A procedure for selective DNA alkylation and detection by mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 1995 Apr 25;23(8):1367-73). Die Kopplung eines „charge tags" an diese modifizierte DNA resultiert in der Steigerung der Empfindlichkeit auf das gleiche Niveau, wie es für Peptide gefunden wird. Ein weiterer Vorteil von „charge tagging" ist die erhöhte Stabilität der Analyse gegen Verunreinigungen, die den Nachweis unmodifizierter Substrate stark erschweren.
Die aberrante DNA Methylierung innerhalb der CpG-Positionen („Inseln") ist die früheste und am meisten verbreitete Veränderung bei menschlichen malignen Erkrankungen, die zu einem Stummschalten oder der Überexpression eines breiten Spektrums von Genen führt. Zusätzlich wurde von abnormaler Methylierung gezeigt, daß sie in CpG-reichen regulatorischen Elementen in intronischen und kodierenden Teilen von Genen für bestimmte Tumore auftritt. Im Unterschied zu der spezifischen Hypermethylierung von Tumor-Suppressor-Genen kann eine gesamte Hypomethylierung von DNA in Tumorzellen beobachtet werden. Diese Abnahme in der globalen Methylierung kann früh nachgewiesen werden, weit vor der Entwicklung von deutlicher Tumorbildung. Auch wurde ein Zusammenhang zwischen Hypomethylierung und erhöhter Genexpression für viele Onkogene berichtet. Bei Darmkrebs stellt aberrante DNA-Methylierung eine der am meisten vorherrschenden Veränderungen dar und inaktiviert viele Tumor-Supressor-Gene, wie zum Beispiel p14ARF, p16INK4a, THBS1, MINT2, und MINT31 und "DNA Mismatch-Repair-Gene", wie zum Beispiel hMLHl.
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Analyse des Methylierungsstatus des Promotors und der 5'-Region des Gens DD3 zur Verfügung. Weiterhin beschreibt die Erfindung genomische und chemisch modifizierte Nukleinsäuresequenzen, die von dem Gen DD3 abgeleitet sind, sowie Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere für die Analyse von Cytosin-Methylierungsmustern innerhalb des Gens. Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, daß genetische und epigenetische Parameter, insbesondere die Cytosin-Methylierungsmuster des Gens DD3 besonders für die Diagnose und/oder Therapie von Zellteilungs-Erkrankungen geeignet sind.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Analyse von Zellteilungs-Erkrankungen mittels der Analyse der Methylierung von CpG-Dinukleotidpositionen, die bis jetzt nicht mit der Entwicklung von Krebs assoziiert waren, zur Verfügung. Weiterhin beschreibt die Erfindung genomische und chemisch modifizierte Nukleinsäuresequenzen, sowie Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere für die Analyse von Cytosin-Methylierungsmustern innerhalb dieser Region.
Die Aufgabe der folgenden Erfindung kann durch die Analyse des Methylierungszustands der CpG-Dinukleotide innerhalb der genomischen Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 und dazu komplementären Sequenzen gelöst werden. SEQ ID Nr. 1 offenbart ein Fragment des Promotors und die 5'-Region des Gens DD3, wobei diese Region CpG-Dinukleotide enthält, die ein Erkrankungsspezifisches Methylierungsmuster zeigen. Das Methylierungsmuster des Fragments des Gens DD3 wurde bis jetzt nicht im Hinblick auf Zellteilungs-Erkrankungen analysiert. Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes sollte die Sequenz, wie sie in SEQ ID Nr. 1 angegeben ist, so ausgelegt werden, daß diese auch alle im wesentlichen ähnlichen und äquivalenten Sequenzen stromaufwärts der Promoter-Region eines Gens einschließt, das für ein Molekül mit der biologischen Aktivität und den Charakteristika von DD3 kodiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird die Aufgabe durch die Analyse einer chemisch modifizierten Nukleinsäure gelöst, die eine Sequenz von einer Länge von mindestens 18 Basen gemäß einer der SEQ ID Nr. 2 bis SEQ ID Nr. 5 und dazu komplementären Sequenzen enthält. SEQ ID Nr. 2 bis 5 stellen eine modifizierte Version der Nukleinsäure gemäß SEQ ID Nr. 1 zur Verfügung, wobei die Modifikation der Sequenz aus der Synthese einer Sequenz resultiert, die einmalig und unterschiedlich ist von SEQ ID Nr. 1. Die Nukleinsäuremoleküle von SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 5 konnten bis jetzt nicht mit der Ermittlung von genetischen und epigenetischen Parametern in Zusammenhang gebracht werden, die für Zellteilungs-Erkrankungen relevant sind.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung kann weiterhin durch ein Oligonukleotid oder Oligomer zum Nachweis des Cytosin-Methylierungszustands innerhalb von vorbehandelter DNA oder genomischer DNA gemäß SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 5 gelöst werden. Dies Oligonukleotid oder Oligomer enthält mindestens eine Basensequenz, die eine Länge von mindestens 9 Nukleotiden aufweist, die an eine vorbehandelte Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 2 bis SEQ ID Nr. 5 und dazu komplementärer Sequenzen oder an eine genomische Sequenz umfassend SEQ ID Nr. 1 und dazu komplementärer Sequenzen hybridisiert. Die Oligonukleotide oder Oligomere gemäß der vorliegenden Erfindung stellen wichtige und effektive Werkzeuge dar, die es zum ersten Mal möglich machen, genetische und epigenetische Parameter der neuen Region, wie durch Erfindung beschrieben, zu ermitteln. Die Basensequenz der Oligomere enthält bevorzugterweise mindestens ein CG-, TG- oder CA-Dinukleotid. Die Sonden können auch in der Form einer PNA (Peptidnukleinsäure) vorliegen, die besonders bevorzugte Paarungseigenschaften aufweist. Insbesondere bevorzugt sind Oligonukleotide gemäß der vorliegenden Erfindung, in denen das Cytosin des CpG-Dinukleotids innerhalb des mittleren Drittels des Oligonukleotids liegt, z. B. worin das Oligonukleotid 13 Base lang ist und das CG-, TG- oder CA-Dinukleotid innerhalb des 5. – 9. Nukleotids vom 5'-Ende positioniert ist.
In einer besonderen Ausführungsform ist die Sequenz des Oligonukleotids ausgewählt aus der Gruppe umfassend SEQ ID Nr. 6 bis SEQ ID Nr. 92.
Die Oligomere der vorliegenden Erfindung werden normalerweise in sogenannten „Sets" verwendet, die mindestens ein Oligomer für die Analyse von jedem der CpG-Dinukleotide einer genomischen Sequenz, die SEQ ID Nr. 1 und dazu komplementärer Sequenzen umfaßt, oder zu dem korrespondierenden CG-, TG- oder CA-Dinukleotid innerhalb der vorbehandelten Nukleinsäuren gemäß SEQ ID Nr. 2 bis SEQ ID Nr. 5 und dazu komplementärer Sequenzen enthält. Bevorzugt ist ein Set, das mindestens ein Oligomer für jedes der CpG-Dinukleotide innerhalb des Gens DD3 in sowohl den vorbehandelten und genomischen Versionen des Gens, jeweils SEQ ID Nrn. 2 bis 5 und SEQ ID Nr. 1, enthält. Jedoch ist es vorgesehen, daß es aus ökonomischen oder anderen Faktoren bevorzugt sein kann, eine begrenzte Auswahl an CpG-Dinukleotiden innerhalb der Sequenzen zu analysieren und der Umgebung des Sets von Oligonukleotiden sollte entsprechend verändert werden. Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung darüber hinaus ein Set von mindestens 3 n (Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere), die für den Nachweis des Cytosin-Methylierungszustands in vorbehandelter genomischer DNA (SEQ ID Nr. 2 bis SEQ ID Nr. 5 und dazu komplementärer Sequenzen) und genomischer DNA (SEQ ID Nr. 1 und dazu komplementärer Sequenzen) verwendet werden. Diese Sonden ermöglichen die Diagnose und/oder Therapie von genetischen und epigenetischen Parametern von Zellteilungs-Erkrankungen. Das Set von Oligomeren kann auch dazu verwendet werden, um Einzel-Nukleotidpolymorphismen (SNPs) in vorbehandelter genomischer DNA (SEQ ID Nr. 2 bis SEQ ID Nr. 5 und Sequenzen komplementär dazu) und genomischer DNA (SEQ ID Nr. 1 und dazu komplementärer Sequenzen) nachzuweisen.
Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung ein Set von mindestens zwei Oligonukleotiden zur Verfügung, die als sogenannte „Primer-Oligonukleotide" zur Amplifizierung von DNA-Sequenzen einer der SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 5 und Sequenzen kömplementär dazu oder Abschnitten davon verwendet werden können.
Im Fall der Sets von Oligonukleotiden gemäß der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, daß mindestens ein und am meisten bevorzugt alle Mitglieder des Sets der Oligonukleotide an eine feste Phase gebunden sind.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, daß eine Anordnung von verschiedenen Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren (ein sogenannter „Array") durch die vorliegende Erfindung zur Verfügung gestellt wird und auf eine Weise vorhanden ist, daß diese ebenfalls an eine feste Phase gebunden ist. Dieses Array aus verschiedenen Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomer-Sequenzen kann dadurch gekennzeichnet sein, daß es auf der festen Phase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet ist. Die Oberfläche der festen Phase ist bevorzugterweise zusammengesetzt aus Silicium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold. Jedoch können ebenfalls Nitrozellulose sowie Plastik, wie zum Beispiel Nylon, die in Form von Pellets oder auch als Harz-Matrices vorhanden sein können, verwendet werden.
Daher ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines auf einem Trägermaterial angebrachten Arrays zur Analyse im Zusammenhang mit Zellteilungs-Erkrankungen, wobei in dem Verfahren zumindest ein Oligomer gemäß der vorliegenden Erfindung an eine feste Phase gekoppelt wird. Verfahren zur Herstellung von solchen Arrays sind zum Beispiel aus U.S.-Patent 5,744,305 mittels Festphasenchemie und photolabilen Schutzgruppen bekannt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft einen DNA-Chip zur Analyse von Zellteilungs-Erkrankungen. DNA-Chips sind zum Beispiel aus U.S.-Patent 5,837,832 bekannt.
Darüber hinaus ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Kit, das zum Beispiel aus einem Bisulfit-enthaltenden Reagenz, einem Set von Primer-Oligonukleotiden, das mindestens zwei Oligonukleotide enthält deren Sequenzen in jedem Fall einem 18 Basen langen Segment der im Appendix angegebenen Sequenzen (SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 5 und dazu komplementärer Sequenzen) entsprechen oder komplementär dazu sind, Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere, sowie Anweisungen zur Durchführung und Evaluierung des beschriebenen Verfahrens besteht. Jedoch kann ein Kit gemäß den Richtlinien der vorliegenden Erfindung auch nur einen Teil der vorgenannten Komponenten enthalten.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zur Ermittlung von genetischen und/oder epigenetischen Parametern des Gens DD3 innerhalb eines Subjekts, durch Analysieren von Cytosin-Methylierung und einzelnen Nukleotidpolymorphismen zur Verfügung. Das Verfahren umfaßt in Kontakt bringen einer Nukleinsäure umfassend eine oder mehrere Sequenzen aus der Gruppe umfassend SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 5 in einer biologischen Probe, die von dem Subjekt erhalten wurde, mit mindestens einem Reagenz oder einer Serie von Reagenzien, wobei das Reagenz oder die Serie von Reagenzien zwischen methylierten und nichtmethylierten CpG-Dinukleotiden innerhalb der Zielnukleinsäure unterscheidet.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Verfahren die folgenden Schritte: Im ersten Schritt des Verfahrens wird eine Probe des zu analysierenden Gewebes erhalten, dies kann aus jeder geeigneter Quelle erfolgen, wie zum Beispiel Zellen oder Zellbestandteile, zum Beispiel Zellinien, Biopsien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, cerebrospinale Flüssigkeit, in Paraffin eingebettetes Gewebe, wie zum Beispiel Gewebe von Augen, Innereien, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Colon, Brust oder Leber, histologische Objektträger oder Kombinationen davon.
In einem zweiten Schritt wird die DNA aus der Probe isoliert. Die Extraktion kann durch für den Fachmann übliche Mittel erfolgen, diese schließen die Verwendung von Detergens-Lysaten, Beschallung mit Ultraschall und Vortexen mit Glasperlen ein. Sobald die Nukleinsäuren extrahiert worden sind, wird die genomische Doppelstrang-DNA bei der Untersuchung verwendet.
In einem dritten Schritt des Verfahrens wird die genomische DNA-Probe dann derart behandelt, daß an der 5'-Position unmethylierte Cytosinbasen in Uracil, Thymin oder eine andere vom Hybridisierungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base umgewandelt werden. Dies wird im folgenden unter „Vorbehandlung" verstanden.
Die oben beschriebene Behandlung genomischer DNA erfolgt bevorzugt mit Bisulfit (Sulfat, Disulfit) und anschließender alkalischer Hydrolyse, was zur Umwandlung nicht methylierter Cytosin-Nukleobasen in Uracil oder eine andere vom Basenpaarungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base führt.
In einem vierten Schritt des Verfahrens werden Fragmente aus der chemisch vorbehandelten DNA unter Verwendung von Sets von Primer-Oligonukleotiden gemäß der vorliegenden Erfindung und einer bevorzugterweise hitzestabilen Polymerase amplifiziert. Aus statistischen und praktischen Erwägungen werden bevorzugterweise mehr als zehn unterschiedliche Fragmente amplifiziert, die 100 – 2000 Basenpaare lang sind. Die Amplifikation von mehreren DNA-Abschnitten kann simultan in ein- und demselben Reaktionsgefäß durchgeführt werden. Üblicherweise wird die Amplifikation mittels einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchgeführt. Das Set der Primer-Oligonukleotide enthält mindestens zwei Oligonukleotide, deren Sequenzen jeweils revers komplementär oder identisch zu einem mindestens 18 Basenpaare langen Abschnitt der im Anhang (SEQ. ID Nr. 1 bis SEQ. ID Nr. 5) aufgelisteten Basensequenzen sind.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann der Methylierungszustand von ausgewählten CpG-Positionen innerhalb der Nukleinsäuren umfassend SEQ ID Nr. 2 bis SEQ ID Nr. 5 durch die Verwendung von Methylierungs-spezifischen Primeroligonukleotide nachgewiesen werden. Diese Technik wurde im US Patent 6,265,171 von Herman beschrieben. Die Verwendung von Methylierungsstatus-spezifischen Primeroligonukleotiden zur Amplifikation von Bisulfit-behandelter DNA erlaubt die Differenzierung zwischen methylierten und nichtmethylierten Nukleinsäuren. MSP-Primer Paare enthalten mindestens einen Primer, der an ein Bisulfit-behandeltes CpG-Dinukleotid hybridisiert. Daher umfaßt die Sequenz der Primer mindestens ein CG-, TG- oder CA-Dinukleotid. Für nicht methylierte DNA spezifische MSP-Primer enthalten ein „T" an der 3'-Position von der C-Position im CpG. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es daher bevorzugt, daß die Basensequenz dieser Primer erforderlicherweise, eine Basensequenz umfaßt, die eine Länge von mindestens 9 Nukleotiden aufweist, die an eine vorbehandelte Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 2 bis SEQ ID Nr. 5 und dazu komplementärer Sequenzen hybridisiert, wobei die Basensequenz mindestens ein CG-, TG- oder CA-Dinukleotid umfaßt.
Die mittels der Amplifikation erhaltenen Fragmente können eine direkt oder indirekt nachweisbare Markierung tragen. Bevorzugt sind Markierungen in Form von Fluoreszenzmarkierungen, Radionukliden oder ablösbaren Molekülfragmenten mit typischer Masse, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden können. Wenn die Markierungen Masse-Markierungen sind, ist es bevorzugt, daß die markierten Fragmente zur besseren Detektierbarkeit im Massenspektrometer eine einzelne positive oder negative Nettoladung aufweisen. Der Nachweis kann mittels Matrix unterstützter Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI) oder mittels Elektronenspray-Massenspektrometrie (ESI) durchgeführt und visualisiert werden.
In einem fünften Schritt des Verfahrens werden die während des vierten Schritts des Verfahrens erhaltenen Amplifikate analysiert, um den Methylierungsstatus der CpG-Dinukleotide vor der Behandlung zu ermitteln.
Wenn die Amplifikate mittels einer MSP-Amplifikation erhalten wurden, zeigt die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Amplifikats in sich selber den Methylierungszustand der durch den Primer abgedeckten CpG-Positionen an, gemäß den Basensequenzen des Primers.
Amplifikate, die mittels sowohl Standard- oder Methylierungs-spezifischer PCR erhalten wurden, können weiter mittels Hybridisierungs-basierten Verfahren weiter analysiert werden, wie zum Beispiel, jedoch nicht begrenzt auf, Array-Technologie und Sonden-basierten Technologien sowie mittels Techniken, wie zum Beispiel Sequenzierung und Templat-gesteuerter Verlängerung.
In einer Ausführungsform des Verfahrens werden die in Schritt 4 synthetisierten Amplifikate anschließen an ein Array oder ein Set von Oligonukleotiden und/oder PNA-Sonden hybridisiert. In diesem Zusammenhang findet die Hybridisierung auf die im folgenden beschriebene Weise statt. Das Set von während der Hybridisierung verwendeten Sonden setzt sich bevorzugterweise aus mindestens zwei Oligonukleotiden oder PNA-Oligomeren zusammen. In dem Verfahren dienen die Amplifikate als Sonden, die an vorher an eine feste Phase gebundene Oligonukleotide hybridisieren. Die nicht-hybridisierten Fragmente werden anschließend entfernt. Die Oligonukleotide enthalten mindestens eine Basensequenz, die mindestens eine Länge von 9 Nukleotiden aufweist, die revers komplementär oder identisch zu einem Abschnitt Appendix angegebenen Basensequenzen ist, wobei der Abschnitt ein CG-, CT- oder CA-Dinukleotid umfaßt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist dieses Dinukleotid im mittleren Drittel des Oligomers vorhanden. Zum Beispiel, wenn das Oligomer ein CG-Dinukleotid umfaßt, ist dieses Dinukleotid bevorzugterweise das 5. bis 9. Nukleotid vom 5'-Ende eines 13-Mers. Ein Oligonukleotid existiert für die Analyse von jedem CpG-Dinukleotid innerhalb der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 und den äquivalenten Positionen innerhalb von SEQ ID Nr. 2 bis 5. Die Oligonukleotide können auch in Form von Peptidnukleinsäuren vorliegen. Die nicht-hybridisierten Amplifikate werden dann entfernt.
In einem finalen Schritt des Verfahrens werden die hybridisierten Amplifikate nachgewiesen. In diesem Zusammenhang ist es bevorzugt, daß die an die Amplifikate angebrachten Marker an jeder Position der festen Phase nachweisbar sind, an der eine Oligonukleotidsequenz lokalisiert ist.
In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens kann der Methylierungszustand der CpG-Positionen (vor der Behandlung) mittels Oligonukleotidsonden ermittelt werden, die an die Bisulfit-behandelte DNA zusammen mit den PCR-Amplifikationsprimern hybridisiert werden (wobei diese Primer entweder Methylierungs-spezifisch oder Standard sein können).
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens ist die Verwendung von Fluoreszenz-basierter Echtzeit-quantitativer PCR (Heid et al., Genome Res. 6:986-994, 1996), die eine dual-markierte Fluoreszenz-Oligonukleotidsonde verwendet (TaqMan^TM PCR, unter Verwendung eines ABI Prism 7700 Sequenz-Nachweis-System, Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, California). Die TaqMan^TM PCR-Reaktion nutzt die Verwendung eines nicht-verlängerbaren Untersuchungsoligonukleotids, genannt TaqMan^TM-Sonde, die so aufgebaut ist, um an eine CpG-reiche Sequenz zu hybridisieren, die zwischen den Vorwärts- und Rückwärts-Amplifikationsprimern lokalisiert ist. Die TaqMan^TM-Sonde umfaßt weiterhin eine fluoreszente „Reportergruppe" und eine „Quenchergruppe", die kovalent an Linkergruppen (z. B. Phosphoramidite) gebunden sind, die an die Nukleotide des TaqMan^TM-Oligonukleotids angebracht sind. Zur Analyse von Methylierung innerhalb von Nukleinsäuren im Anschluß an die Bisulfidbehandlung ist es erforderlich, daß die Sonde Methylierungs-spezifisch ist, wie beschrieben in U.S. 6,331,393 (hier durch Bezugnahme aufgenommen), auch als der Methy-Light-Test bekannt. Variantionen der TaqMan^TM-Nachweismethodologie sind ebenfalls zur Verwendung mit der beschriebenen Erfindung geeignet, und schließen die Verwendung von dualer Sondentechnologie (Lightcycler^TM) oder fluoreszenten Amplifikationsprimern (Sunrise^TM-Technologie) ein. Beide diese Techniken können auf eine Weise angepasst werden, die zur Verwendung mit Bisulfit-behandelter DNA geeignet ist und darüber hinaus zur Methylierungsanalyse innerhalb von CpG-Dinukleotiden.
Ein weiter geeignetes Verfahren zur Verwendung von Sonden-Oligonukleotiden zur Ermittlung von Methylierung durch Analyse von Bislulfid-behandelten Nukleinsäuren ist die Verwendung von „Blocking"-Oligonukleotiden (auch bekannt als der „Heavy Methyl"-Test). Die Verwendung von solchen Oligonukleotiden wurde in BioTechniques 23(4), 1997, 714–720 D. Yu, M.Mukai, Q. Liu, C. Steinman beschrieben. Blocking-Sonden-Oligonukleotide werden an die Bisulfit-behandelte Nukleinsäure zusammen mit den PCR-Primern hybridisiert. Die PCR-Amplifikation der Nukleinsäure wird an der 5'-Position der Blocking-Sonde beendet, wodurch die Amplifikation einer Nukleinsäure unterdrückt wird, wenn die komplementäre Sequenz zu der Blocking-Sonde vorhanden ist. Diese Sonden können so gestaltet werden, um an die Bisulfit-behandelte Nukleinsäure auf eine Methylierungsstatus-spezifische Weise zu hybridisieren. Zum Beispiel würde für den Nachweis von methylierten Nukleinsäuren innerhalb einer Population von nicht-methylierten Nukleinsäuren die Unterdrückung der Amplifikation von Nukleinsäuren, die an der fraglichen Position nicht methyliert sind durch die Verwendung von Blocking-Sonden, die ein „CG" an der fraglichen Position enthalten, im Gegensatz zu „CA" enthalten, durchgeführt werden.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird der fünfte Schritt des Verfahrens durch die Verwendung von Templat-vermittelter Oligonukleotid-Verlängerung durchgeführt, wie zum Beispiel MsSNuPE, wie durch Gonzalgo und Jones (Nucleic Acids Res. 25: 2529–2531) beschrieben.
In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens wird der fünfte Schritt des Verfahrens durch Sequenzieren und anschließende Sequenzanalyse des im dritten Schritt des Verfahrens erzeugten Amplifikats durchgeführt (Sanger F., et a1., 1977 PNAS USA 74: 5463–5467).
Eine weitere Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Analyse des Methylierungsstatus von genomischer DNA gemäß der Erfindung (SEQ ID Nr. 1) ohne den Bedarf an Vorbehandlung.
Im ersten Schritt des Verfahrens muß die genomische DNA-Probe aus Gewebe oder zellulären Quellen isoliert werden. Solche Quellen können Zellinien, histologische Schnitte, Körperflüssigkeiten oder in Paraffin eingebettete Gewebe einschließen. Die Extraktion kann durch Mittel erfolgen, die Standard für einen Durchschnittsfachmann sind, diese schließen die Verwendung von Detergens-Lysaten, Beschallung und Vortexen mit Glasperlen ein. Sobald die Nukleinsäuren extrahiert wurden, wird die genomische Doppelstrang-DNA in der Analyse verwendet.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann die DNA vor der Behandlung gespalten werden, dies kann durch jedes Standard im Stand der Technik erfolgen, insbesondere mittels Restriktionsendonukleasen. Im zweiten Schritt wird die DNA dann mit einem oder mehreren Methylierungs-sensitiven Restriktionsenzymen verdaut. Der Verdau wird so durchgeführt, daß die Hydrolyse der DNA an der Restriktionsstelle für den Methylierungsstatus eines spezifischen CpG-Dinukleotids informativ ist.
Im dritten Schritt, der optional ist, jedoch eine bevorzugte Ausführungsform darstellt, werden die Restriktionsfragmente amplifiziert. Dies wird bevorzugterweise unter der Verwendung einer Polymerase-Kettenreaktion durchgeführt.
Im finalen Schritt werden die Amplifikate nachgewiesen. Der Nachweis kann durch jedes Standardmittel im Stand der Technik, wie zum Beispiel, jedoch nicht begrenzt auf, Gelelektrophorese-Analyse, Hybridisierungsanalyse, Einbau von nachweisbaren Markern innerhalb des PCR-Produkts, DNA-Array-Analyse, MALDI- oder ESI-Analyse erfolgen. Geeignete Marker zur Verwendung bei dem Nachweis der verdauten Nukleinsäurefragmente schließen fluorophore Marker, Radionuklide und Masse-Marker, wie oben beschrieben, ein.
Die Oligomere gemäß der vorliegenden Erfindung oder Arrays davon sowie ein Kit gemäß der vorliegenden Erfindung sind zur Verwendung für die Diagnose und/oder Therapie von Zellteilungs-Erkrankungen vorgesehen. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das Verfah ren bevorzugterweise zur Diagnose und/oder Therapie von Zellteilungs-Erkrankungen durch Analyse von wichtigen genetischen und/oder epigenetischen Parametern innerhalb der offenbarten 5' und Promotor-Region des Gens DD3 verwendet.
Die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung werden zum Beispiel für die Diagnose und/oder Therapie von Zellteilungs-Erkrankungen verwendet.
Die Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung, SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 5 und dazu komplementäre Sequenzen können für die Diagnose und/oder Therapie von genetischen und/oder epigenetischen Parametern, die mit dem Gen DD3 assoziiert sind, verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus ein Verfahren zur Herstellung eines diagnostischen Mittels und/oder therapeutischen Mittels für die Diagnose und/oder Therapie von Erkrankungen, die mit dem Gen DD3 assoziiert sind, durch Analysieren von Methylierungsmustern des Gens, wobei das diagnostische Mittel und/oder therapeutische Mittel dadurch gekennzeichnet ist, daß mindestens eine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung zur Herstellung desselben verwendet wird, möglicherweise mit geeigneten Zusatzstoffen und Hilfsstoffen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein diagnostisches Mittel und/oder therapeutisches Mittel für Erkrankungen, die mit dem Gen DD3 assoziiert sind, durch Analysieren von Methylierungsmustern des Gens, wobei das diagnostische Mittel und/oder therapeutische Mittel mindestens eine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung enthält, möglicherweise zusammen mit geeigneten Zusatzstoffen und Hilfsstoffen.
Eine demgemäß bevorzugte Ausführungsform der beschriebenen Verfahren für die Analyse von Methylierung innerhalb der genomischen und behandelten Nukleinsäuren, die in Seq ID Nr. 1 bis 5 offenbart werden, ist die Anwendung der Verfahren in einem klinischen Aufbau. Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der offenbarten Verfahren und Nukleinsäuren für den verbesserten Nachweis und das Management von Prostatatumoren. Daher wird in einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens eine Analyse von Patienten-Methylierungsmustern in Kombination mit der Analyse von Prostata-Serum-Antigen- Spiegeln durchgeführt. PSA diagnostische Kits sind käuflich erhältlich, z.B. PROS-CHECK PSA, von Yan Laboratories, Inc. Bellevue, Wash.; Hybritech Tandem-E und Hybritech Tandem-R, von Hybritech, Inc., La Jolla, Calif.; Abbott Imx PSA Assay, von Abbott Laboratories, Abbott Park, Ill,; und ACS PSA Assay, von Ciba-Corning Diagnostics Corporation, East Walpole, Mass.
Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus die Diagnose und/oder Prognose von Ereignissen, die für Patienten oder Individuen nachteilig sind, in denen wichtige genetische und/oder epigenetische Parameter innerhalb des Gens DD3 als Marker verwendet werden können. Diese mittels der vorliegenden Erfindung erhaltenen Parameter können mit einem anderen Set von genetischen und/oder epigenetischen Parametern verglichen werden, wobei die Unterschiede als eine Basis für eine Diagnose und/oder Prognose von Ereignissen dienen, die für Patienten oder Individuen nachteilig sind.
Darüber hinaus ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Kit, das z.B. aus einem Bisulfit-enthaltenden Reagenz, einem Set von Primer-Oligonukleotiden, das mindestens zwei Oligonukleotide enthält, deren Sequenzen in jedem Fall entsprechen oder komplementär zu einem 18 Basen langen Segment der Basensequenzen sind, die im Appendix angegeben sind (Seq ID Nr. 1 bis Seq ID Nr. 5), Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere, sowie Anweisungen zur Durchführung und Evaluierung des beschriebenen Verfahrens, besteht. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform kann das Kit weiterhin Standardreagenzien zur Durchführung Bitter CpG-positionsspezifischen Methylierungsanalyse umfassen, wobei diese Analyse eine oder mehrere der folgenden Techniken umfaßt; MS-SnuPE, MSP, Methyl light, Heavy Methyl und Nukleinsäure-Sequenzierung. Jedoch kann ein Kit gemäß den Richtlinien der vorliegenden Erfindung auch nur einen Teil der vorgenannten Komponenten enthalten.
Unter dem Begriff "Hybridisierung" im Sinne der vorliegenden Erfindung soll eine Bindung eines Oligonukleotids unter Ausbildung einer Duplex-Struktur an eine vollständig komplementäre Sequenz im Sinne der Watson-Crick Basenpaarungen in der Proben-DNA verstanden werden. Unter „stringenten Hybridisierungsbedingungen" sollen diejenigen Bedingungen verstanden werden, bei denen eine Hybridisierung bei 60°C in 2,5 × SSC-Puffer, gefolgt von mehreren Waschschritten bei 37°C in einer geringen Pufferkonzentration, durchgeführt wird, und stabil bleibt.
"Genetische Parameter" im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Mutationen und Polymorphismen von genomischer DNA und zu ihrer Regulation weiterhin erforderliche Sequenzen. Insbesondere werden als Mutationen Insertionen, Deletionen, Punktmutationen, Inversionen und Polymorphismen und besonders bevorzugt SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) zu bezeichnet.
"Epigenetische Parameter" im Sinne der vorliegenden Erfindung sind insbesondere Cytosin-Methylierungen. Weitere epigenetische Parameter schließen beispielsweise die Acetylierung von Histonen ein, die jedoch mit dem beschriebenen Verfahren nicht direkt analysiert werden kann, sondern wiederum mit der DNA-Methylierung korreliert.
Obwohl die vorliegende Erfindung hier vollständig beschrieben wurde, ist zu bemerken, daß verschiedene Veränderungen und Modifikationen dem Fachmann im Stand der Technik ersichtlich sind. Solche Veränderungen und Modifikationen sollen als innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung eingeschlossen verstanden werden, wie durch die beigefügten Ansprüche definiert. Die Erfindung wird nun folgenden Beispiele weiter verdeutlicht werden, ohne auf diese begrenzt zu sein.
Beispiel 1:
Beispiel 1: Methylierungsanalyse der DD3 Gen-Promotorregion.
Das folgende Beispiel betrifft ein Fragment der Promotorregion des Gens DD3, worin der Methylierungsstatus einer spezifischen CG-Position unter der Verwendung von zwei verschiedenen Verfahren Bisulfit-behandelt und analysiert wird.
DNA-Isolierung und Bisulfit-Behandlung.
Kurz gesagt, wurde genomische DNA von menschlichen Prostatazellen durch Standardverfahren unter der Verwendung des Qiagen-Extraktions-Kits isoliert. Die DNA von jeder Probe wurde unter der Verwendung einer Bisulfit-Lösung (Hydrogensulfit, Disulfit) gemäß dem Agarose-Bead-Verfahren (Olek et al 1996) behandelt. Die Behandlung findet so statt, daß alle nicht methylierten Cytosine innerhalb der Probe in Thymin konvertiert werden, wobei umgekehrt 5-methylierte Cytosine innerhalb der Probe unmodifiziert bleiben. Nach Bisulfit- Behandlung wurde die DNA dann entweder mittels MS SNuPE, wie durch Gonzalgo und Jones (Nucleic Acids Res. 25: 2529–2531) beschrieben, analysiert oder mittels Fluoreszenz-Oligonukleotid-Hybridisierungs-Analyse.
MsSNuPE-Reaktionen.
Die PCR-Amplifizierung der Bisulfit-konvertierten DNA wurde unter der Verwendung von für die CpG-Inseln von Interesse spezifischen Primer durchgeführt, und der Nachweis wurde unter der Verwendung von weiteren spezifischen Primern (Verlängerungssonden) durchge-führt.
In dem ersten Schritt wurde ein 560 bp langes Fragment des DD3-Gens in einer Polymerase-Kettenreaktion mittels der Primer: tggttttaattttattgaatgg (Seq. ID Nr. 93) und aaacaaatacaccaccaactta (Seq. ID Nr. 94) amplifiziert.
Das Amplifikat wird dann mittels MsSNuPE Verlängerungssonden analysiert, die unmittelbar 5' des zu analysierenden CpG lokalisiert sind, wobei die Sequenzen waren: attggtgttatagagtta (Seq ID Nr. 95).
Ein Paar von Reaktionen wurden für jede Probe unter der Verwendung von entweder 2',3'-Didesoxycytidintriphosphat (ddCTP) oder 2',3'-Didesoxythymidintriphosphat (ddTTP) für einzelne Nukleotidverlängerung angesetzt. Die terminierenden Triphosphate können markiert werden, z.B. mit zwei verschiedenen Farbstoffen.
Dies macht die Velängerungsprodukte voneinander unterscheidbar. Diese verschiedenen Marker können z.B. absorbierende Farbstoffe, wie z.B. Megaprime^TM für ddTTP oder Rediprime II^TM für ddCTP sein.
Die MsSNuPE-Verlängerungssonden wurden an das Amplifikat hybridisiert. Die Verlängerung der Primer wurde dann mittels eines Polymerase-Enzyms durchgeführt. Wenn ein methyliertes Cytosin vorhanden war, wird das Verlängerungsprodukt attggtgttatagagttac produziert, wohingegen das Verlängerungsprodukt attggtgttatagagttat produziert wird, falls ein nicht-methyliertes Cytosin an der Stelle, die analysiert werden soll, vorhanden ist. Daher ent stehen verschiedene Verlängerungsprodukte, in Abhängigkeit von dem Methylierungszustand des spezifischen Cytosins.
Die verlängerten MsSNuPE-Primer (Sonden) wurden dann mittels Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese analysiert.
Hybridisierungsanalyse.
Im Anschluß an die Bisulfit-Behandlung wird die behandelte DNA-Probe mit Wasser oder einer wäßrigen Lösung verdünnt. Bevorzugterweise wird die DNA anschließend desulfoniert. Die DNA-Probe wird dann in einer Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert, bevorzugterweise unter der Verwendung einer Hitze-resistenten DNA-Polymerase. Im vorliegenden Fall wurden Cytosine des Gens DD3 analysiert. Zu diesem Zweck wurde ein definiertes Fragment, das eine Länge von 560 bp aufweist, mit den spezifischen Primer-Oligonukleotiden tggttttaattttattgaatgg (Seq. ID Nr. 93) und aaacaaatacaccaccaactta (Seq. ID Nr. 94) amplifiziert.
Das Amplifikat diente als eine Probe, die an ein vorher an die feste Phase gebundenes Oligonukleotid hybridisiert, wobei eine Duplexstruktur gebildet wurde, z.B. tgtgttaaacgatgtgaa (Seq. ID Nr. 32), wobei das nachzuweisende Cytosin an Position 139 des Amplifikats lokalisiert ist. Der Nachweis des Hybridisierungsprodukts basiert auf Cy3 und Cy5 Fluoreszenz markierten Primer-Oligonukleotiden, die für die Amplifikation verwendet wurden. Eine Hybridisierungsreaktion der amplifizierten DNA mit dem Oligonukleotid findet nur statt, wenn methyliertes Cytosin an dieser Stelle in der Bisulfit-behandelteri DNA vorhanden war. Daher kann der Methylierungszustand des spezifischen Cytosins, das analysiert werden soll, von dem Hybridisierungsprodukt abgeleitet werden.
Um den Methylisierungsstatus der Position zu überprüfen, wird eine Probe des Amplifikats weiterhin an ein anderes Oligonukleotid hybridisiert, das vorher an eine feste Phase gebunden wurde. Das Oligonukleotid ist identisch zu dem Oligonukleotid, das vorher dazu benutzt wurde, den Methylierungszustand der Probe zu analysieren, mit Ausnahme der fraglichen Position. An der Position, die analysiert werden soll, umfaßt das Oligonukleotid eine Thymin-Base im Gegensatz zu einer Cytosin-Base, d.h. tgtgttaaatgatgtgaa (SEQ ID Nr. 33). Daher findet die Hybridisierungsreaktion nur dann statt, falls ein nicht-methyliertes Cytosin an der zu analysierenden Position vorhanden war.
Beispiel 2: Identifizierung des Methylierungszustands einer CpG-Stelle innerhalb SEQ ID Nr. 1.
Ein Fragment der Stromaufwärts-Region des Gens DD3 (SEQ ID Nr. 1) wurde unter der Verwendung von Primern aagtgagccataacaagcat (SEQ ID Nr. 96) und CTTTTGTGTCATCCCAGTTC (SEQ ID Nr. 97) PCR-amplifiziert. Das erhaltenen Amplifikat (170 bp Länge) enthielt ein informatives CpG an Position 62. Die amplifizierte DNA wurde mit der Restriktionsendonuklease HgaI, Erkennungsstelle GACGC, verdaut. Die Hydrolyse durch diese Endunuklease wird durch die Methylierung des CpG an Position 62 des Amplifikats blockiert. Der Verdau wurde als eine Kontrolle verwendet.
Genomische DNA wurde dann aus Proben unter der Verwendung des DNA-Wizard DNA-Isolierungskit (Promega) isoliert. Jede Probe wurde HgaI gemäß den Empfehlungen des Herstellers verdaut (New England Biolabs).
10 ng eines jeden genomischen Verdaus wurden dann unter der Verwendung von PCR-Primern aagtgagccataacaagcat (SEQ ID Nr. 96) und cttttgtgtcatcccagttc (SEQ ID Nr. 97) amplifiziert. Die PCR-Reaktionen wurden unter der Verwendung eines Thermocyclers (Eppendorf GmbH) durchgeführt, unter der Verwendung von 10 ng DNA, 6 pMol eines jeden Primers, 200 μM jedes dNTP, 1,5 mM MgCl₂ und 1 U von HotstartTaq (Quiagen AG). Die anderen Bedingungen waren wie durch den Taq-Polymerase-Hersteller empfohlen. Unter der Verwendung der oben genannten Primer wurden Genfragmente durch PCR amplifiziert, durch Durchführen eines ersten Denaturierungsschritts für 14 Min bei 96°C, gefolgt von 30– 45 Zyklen (Schritt 2: 60 Sek bei 96°C, Schritt 3: 45 Sek bei 52°C, Schritt 4: 75 Sek bei 72°C) und einer anschließenden finalen Verlängerung von 10 Min bei 72°C. Die Anwesenheit von PCR-Produkten wurde durch Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Wenn die fragliche Position methyliert war, waren PCR-Produkte nach 30 Zyklen nachweisbar. Sequenzprotokoll

Claims

Verfahren zum Nachweis des Methylierungszustands der 5'- und Promotorregion des Gens DD3 innerhalb eines Subjekts, wobei das Verfahren das in Kontakt bringen einer Nukleinsäure, die eine oder mehrere Sequenzen aus der Gruppe der Sequenzen von SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 5 umfaßt, in einer biologischen Probe, die von dem Subjekt erhalten wurde, mit mindestens einem Reagenz oder einer Serie von Reagenzien umfaßt, wobei das Reagenz oder die Serie von Reagenzien zwischen methylierten und nicht-methylierten CpG Dinucleotiden innerhalb der Zielnukleinsäure unterscheidet.
Verfahren zur Analyse von Zellteilungs-Erkrankungen, umfassend den Nachweis des Methylierungszustands von einer oder mehrerer Sequenzen aus der Gruppe der Sequenzen von SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 5 gemäß Anspruch 1.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die biologische Probe Prostatazellen sind oder von Prostatazellen abgeleitet ist.
Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Sequenz mit einer Länge von mindestens 18 Basen gemäß einer der Sequenzen ausgewählt aus der Gruppe umfassend SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 5 und dazu komplementärer Sequenzen.
Oligomer, insbesondere Oligonukleotid oder Peptid Nukleinsäure (PNA)-Oligomer, wobei das Oligomer in jedem Fall im wesentlichen aus mindestens einer Basensequenz besteht, die eine Länge von mindestens 10 Nukleotiden aufweist, die hybridisiert an oder identisch ist zu einer der Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 5.
Oligomer nach Anspruch 5, wobei die Basensequenz im wesentlichen aus einer der Sequenzen, ausgewählt aus der Gruppe von SEQ ID Nr. 6 bis SEQ ID Nr. 92, besteht.
Oligomer nach Anspruch 5, wobei die Basensequenz mindestens ein CpG-Dinukleotid enthält.
Oligomer nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Cytosin des CpG-Dinukleotids ungefähr im mittleren Drittel des Oligomers lokalisiert ist.
Set von Oligomeren, umfassend mindestens zwei Oligomeren nach einem der Ansprüche 5 bis 8.
Set von Oligomeren nach Anspruch 9, umfassend Oligomere zum Nachweis des Methylierungszustands von allen CpG-Nukleotiden innerhalb von SEQ ID Nr. 1 und dazu komplementärer Sequenzen.
Set von mindestens zwei Oligonukleotiden nach einem der Ansprüche 5 bis 10, das als Primer-Oligonukleotide zur Amplifikation von DNA Sequenzen einer der SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 5 und dazu komplementärer Sequenzen verwendet wird.
Set von Oligonukleotiden nach einem der Ansprüche 9 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Oligonukleotid an eine feste Phase gebunden ist.
Verwendung eines Sets von Oligonukleotiden, umfassend mindestens drei der Oligomere nach einem der Ansprüche 5 bis 12 zum Nachweis des Methylierungszustands und/oder Einzel-Nukleotidpolymorphismen (SNPs) innerhalb von Sequenzen, ausgewählt aus der Gruppe von SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 5 und dazu komplementärer Sequenzen.
Verfahren zur Herstellung einer Anordnung von verschiedenen auf ein Trägermaterial fixierten Oligomeren (Array) zur Analyse von Erkrankungen, die mit dem Methylierungszustand der CpG-Dinukleotide des Gens DD3 assoziiert sind, wobei mindestens ein Oligomer gemäß einem der Ansprüche 5 bis 12 an eine feste Phase gekoppelt wird.
Anordnung von verschiedenen Oligomeren (Array), erhältlich nach Anspruch 14.
Anordnung von verschiedenen Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomer-Sequenzen, nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß diese auf einer ebenen festen Phase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet sind.
Array nach einem der Ansprüche 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß die feste Phase-Oberfläche zusammengesetzt ist aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold.
DNA- und/oder PNA-Array zur Analyse von Erkrankungen, die mit dem Methylierungszustand des Gens DD3 assoziiert sind, umfassend mindestens eine Nukleinsäure nach einem der voranstehenden Ansprüche.
Verfahren zur Bestimmung des Methylierungszustands innerhalb mindestens eines Nukleinsäurenmoleküls gemäß einer der SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 5 [von Ansprüchen 1 bis 3, diese beziehen sich auf Verfahren], dadurch gekennzeichnet, daß die folgenden Schritte durchgeführt werden: a) Erhalten einer biologischen Probe, die genomische DNA enthält, b) Extrahieren der genomischen DNA, c) Konvertieren von Cytosin-Basen, die an der 5'-Position unmethyliert sind innerhalb der DNA-Probe durch chemische Behandlung zu Uracil oder einer anderen Base, die sich im Hinblick auf das Hybridisierungsverhalten von Cytosin unterscheidet; d) Amplifizieren von Fragmenten der chemisch vorbehandelten DNA unter der Verwendung von Primer-Oligonukleotiden gemäß einem der Ansprüche 11 oder 12 und einer Polymerase und e) Identifizieren des Methylierungszustands einer oder mehrerer Cytosin-Positionen.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt e) mittels Hybridisierung von mindestens einem Oligonukleotid gemäß Anspruch 5 bis 12 durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt e) mittels der Hybridisierung von mindestens einem Oligonukleotid nach Anspruch 5 bis 12 und Verlängerung der/des hybridisierten Oligonukleotid(s) mittels mindestens einer Nukleotidbase durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt e) mittels Sequenzierung durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt d) unter der Verwendung von Methylierungs-spezifischen Primern durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt e) mittels einer Kombination von mindestens zwei der in Ansprüchen 20 bis 23 beschriebenen Verfahren durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die chemische Behandlung mittels einer Lösung von Bisulfit, Hydrogensulfit oder Disulfit durchgeführt wird.
Verfahren zur Analyse von Methylierung innerhalb eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend SEQ ID Nr. 1, umfassend die folgenden Schritte: a) Erhalten einer biologischen Probe, die genomische DNA enthält, b) Extrahieren der genomischen DNA, c) Verdauen der genomischen DNA, umfassend SEQ ID Nr. 1, mit einem oder mehreren Methylierungs-sensitiven Restriktionsenzymen, und d) Nachweis der DNA-Fragmente, die in dem Verdau aus Schritt c) erzeugt wurden.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei der DNA-Verdau vor Schritt d) amplifiziert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 25 und 27, dadurch gekennzeichnet, daß mehr als zehn verschiedenen Fragmente, die eine Länge von 100 – 200 Basenpaaren aufweisen, amplifiziert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 25, 27 und 28, dadurch gekennzeichnet, daß die Amplifikation von verschiedenen DNA-Segmenten in einem Reaktionsgefäß durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 25 und 27 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerase eine Hitze-resistente DNA-Polymerase ist.
Verfahren nach Ansprüchen 19 bis 25 und 27 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß die Amplifikation mittels Polymerase-Kettenreaktion durchgeführt wird (PCR).
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 25 und 27 bis 32, dadurch gekennzeichnet, daß die Amplifikate nachweisbare Marker tragen.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei die Marker Fluoreszenz-Marker, Radionuklide und/oder ablösbare Molekül-Fragmente sind, die eine typische Masse haben, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden kann.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Amplifikate oder Fragmente in dem Massenspektrometer nachgewiesen werden können.
Verfahren nach einem der Ansprüche 29 und/oder 30 dadurch gekennzeichnet, daß die produzierten Fragmente eine einzelne positive oder negative Ladung zur besseren Nachweisbarkeit in dem Massenspektrometer aufweisen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis durchgeführt und visualisiert wird mittels Matrix-unterstützter Laser Desorptions/Ionisierungs-Massenspektrometrie (MALDI) oder unter der Verwendung von Elektronenspray-Massenspektrometrie (ESI).
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 32, dadurch gekennzeichnet, daß die genomische DNA von Zellen oder zellulären Komponenten erhalten wird, die DNA enthalten, wobei Quellen von DNA zum Beispiel umfassen, Zellinien, histologische Schnitte, Biopsien, in Paraffin eingebettetes Gewebe und alle möglichen Kombinationen davon.
Kit, umfassend ein Bisulfit (Bisulfit, Hydrogensulfit) Reagenz sowie Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 5 bis 13.
Kit nach Anspruch 38, weiter umfassend Standard-Reagenzien zur Durchführung eines Methylierungstests aus der Gruppe bestehend aus MS-SnuPE, MSP, Methyl light, Heavy Methyl, Nukleinsäuresequenzierung und Kombinationen davon.
Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüchen 1 bis 3, 14 und 19 bis 37, einer Nukleinsäure nach den Ansprüchen 3 bis 4, eines Oligonukleotids oder PNA-Oligomers nach einem der Ansprüche 5 bis 8, eines Kits nach einem der Ansprüche 38 oder 39, eines Arrays nach einem der Ansprüche 15 bis 18 oder eines Sets von Oligonukleotiden nach einem der Ansprüche 9 bis 13 zur Charakterisierung, Klassifizierung, Differenzierung, Einstufung, Phasen-Bewertung und/oder Diagnose von Zellteilungs-Erkrankungen oder der Prädisposition gegenüber Zellteilungs-Erkrankungen.
Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 3, 14 und 19 bis 37, einer Nukleinsäure nach den Ansprüchen 3 bis 4, eines Oligonukleotids oder PNA-Oligomers nach einem der Ansprüche 5 bis 8, eines Kits nach Anspruch 38 oder 39, eines Arrays nach einem der Ansprüche 15 bis 18 oder eines Sets von Oligonukleotiden nach einem der Ansprüche 9 bis 13 zur Therapie von Zellteilungs-Erkrankungen.