JP2002360255A

JP2002360255A - ＰＣＡ３ｄｄ３、新規前立腺抗原のためのプロモーターを含む核酸分子、及びその使用

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Publication number: JP2002360255A
Application number: JP2001164963A
Authority: JP
Inventors: Marion J G Bussemakers; イェー．ヘー．ブッセマーケルスマリオン; Beruhooku Gerard; ベルホークゲラルド; Jack A Schalken; アー．シャルケンジャック
Original assignee: HOSPITAL NIJMEGEN, University of
Current assignee: HOSPITAL NIJMEGEN, University of
Priority date: 2001-05-31
Filing date: 2001-05-31
Publication date: 2002-12-17
Also published as: CA2357073C; CA2357073A1

Abstract

(57)【要約】【課題】ＰＣＡ３^dd3 遺伝子のためのプロモーター領
域のクローニング及び特徴付けの提供。【解決手段】本プロモーター領域は、ユニークな前立
腺特異的転写メカニズムによりＰＣＡ３^dd3 遺伝子の発
現を調節する。本発明は、前立腺癌治療及び診断のため
の、そしてＰＣＡ３の発現を調節する作用物質のスクリ
ーニングのためのツールとして本プロモーター領域の使
用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明の分野本発明は、前立腺癌に関する。より特に、本発明は、Ｐ
ＣＡ３^dd3 、新規前立腺癌抗原のためのプロモーターと
して単離され、かつ、特徴付けされた核酸分子に関す
る。本発明は、前立腺腫瘍の診断、予防、治療その他の
ための、組換えＤＮＡ技術の使用に基づくさまざまな方
法にも関する。

【０００２】本発明の背景米国においては、Landis et al. (CA Cancer J.Clin. 1
999 ）により１９９９年に公表された統計データによれ
ば、前立腺癌は最も一般的に診断される癌であり、そし
て男性においては肺癌に続き第２の癌による死亡の原因
である。これらの結果は、西欧国の全てにおいてそれら
が特徴を示すように、米国に特別なものではない。さら
に、この癌の発症率は、低リスク集団、すなわちアジア
の国々からの集団を含むほとんどの国において急速に高
まっている（Hsing et al., Int.J.Cancer 2000 ）。

【０００３】現在、進行及び／又はホルモン無感応前立
腺癌をもつ患者のために利用されうる有効な治療法は存
在しない。進行した前立腺癌のための治療モダリティー
は、かなりの毒性をもつ医薬に限定されている。その増
殖速度は上記の癌においては低いので、多くの細胞毒性
剤は有効ではない（Millikan, Semin.Oncol. 1999 ）。
従って、進行性前立腺癌をもつ患者を治療するための新
規アプローチを開発する緊急の必要性が在る。例えば、
遺伝子治療は、腫瘍細胞の成長を抑制し、アポトーシス
を誘導し、そして／又は腫瘍細胞を殺す遺伝子に連結さ
れた、前立腺特異的遺伝子プロモーターを用いて行われ
ることができる（Taneja et al., Cancer Surv. 1995；
及びBoulikas, Anticancer Res. 1997）。いくつかの遺
伝子の前立腺特異的発現に責任を負うプロモーター配列
はクローン化されており、そしてそれらの転写調節の解
明は進行中である。ＰＳＡ遺伝子プロモーターは最も詳
しく研究されており、そして上流の前立腺特異的エンハ
ンサーをもつ近位前立腺特異的プロモーターの存在を明
らかにした。両配列が、ＰＳＡ発現の高い、アンドロゲ
ン調節活性化のために要求される（Schuur et al., J.B
iol.Chim. 1996; Cleutjens et al., Mol. Endocrinol.
1997a; Cleutjens et al., Mol. Endocrinol. 1997b;
Pang et al., Cancer Res. 1997 ；及びWei et al., Pr
oc.Natl.Acad.Sci. USA 1997）。プロドラッグ変換酵素
をコードし、かつ、ヒト・アデノウイルスにより、ヌー
ド・マウスにおいて皮下増殖する前立腺腫瘍細胞内にデ
リベリーされる、ＨＳＫ−ｔｋ遺伝子まで連結されたＰ
ＳＡエンハンー−プロモーターを用いて、前立腺腫瘍細
胞の増殖は有意に抑制されること、そしてその動物の生
存寿命が延長されたことが示された（Gotoh et al., J.
Urol. 1998；及びMartiniello-Wilks et al., Hum.Gen
e.Ther. 1998 ）。この原理の証明は、前立腺癌患者の
ためのプロモーター−ベースの遺伝子治療の適用に向け
ての道を切り開いた。

【０００４】前立腺癌のための新規候補マーカーが、数
年前、前立腺癌の発達に関連する遺伝子を際立たせるこ
とを意図された示差ディスプレイ・アッセイにより発見
された。この新規遺伝子はＰＣＡ３、そしてまたＤＤ３
と命名された（Bussemakers,PCT/CA98/00346 1998, Sch
alken, Eur.Urol. 1998, Bussemakers et al., Cancer
Res. 1999a 、及びBussemakers Eur.Urol. 1999b ）。
ＰＣＡ３^dd3 は第９染色体上に位置し、そしてより正確
には領域９ｑ２１−２２にある。それは４つのエクソン
から成り、それらは、二者択一スプライシングと二者択
一ポリ−アデニレーションの両者により、異なるサイズ
の転写産物を生じる。ＲＴ−ＰＣＲにより、ＰＣＡ３
^dd3 発現は、前立腺組織に限定されず、そしてテストさ
れた他の全ての組織であって精巣、精嚢、卵巣、胎盤、
及び膀胱を含むもの中に存在していないことが発見され
た。さらに、ノーザン・ブロット分析は、ＰＣＡ３^dd3
が検査された前立腺癌のほとんど（５０中４７）で高発
現され、一方、同一患者からのＢＰＨ又は正常前立腺細
胞内ではひじょうに低く発現されるか又は全く発現され
ないことを示した。注意すべきは、正常又はＢＰＨ組織
に比較して前立腺癌腫内ではＰＣＡ３^dd3 の少なくとも
２０倍の過剰発現が存在しているということである。Ｐ
ＣＡ３^dd3 発現は、腫瘍等級とともに増加するようであ
り、そして転移性病変において検出される。

【０００５】従って、ＰＣＡ３^dd3 の調節及び発現に責
任を負うプロモーターを同定する必要性が未だ存在す
る。前立腺癌組織特異的である調節配列を提供し、そし
てこのような配列を前立腺癌を診断、予防又は治療する
ために使用する必要性も未だ存在する。

【０００６】本発明は、上記のそして他の必要性の充足
を求めるものである。

【０００７】本明細書は多くの文献に言及するが、その
内容を全体として本明細書中に援用する。

【０００８】ヌクレオチド配列の寄託ＰＣＡ３^dd3 プロモーター領域に関するヌクレオチド配
列を、受託番号ＡＦ２７９２９０の下、ＧｅｎＢａｎｋ
（商標）データ・ベースに寄託した。

【０００９】本発明の要約本発明は、ＰＣＡ３^dd3 遺伝子のためのプロモーターの
同定に関する。この遺伝子は、新規前立腺癌マーカーで
あり、従来技術の前立腺マーカーの欠点の全てではない
が多くを克服する。このプロモーターの特徴付けは、例
えば前立腺細胞に欠陥、疾患又は損傷をもつ患者、そし
て特に進行前立腺癌、そして特にアンドロゲン無感応性
前立腺癌をもつ患者を治療するための新たな戦略の開発
のためにひじょうに有用なツールである。前立腺癌のマ
ーカーとしてＰＣＡ３^dd3 が同定され、そして今般、そ
のプロモーターが同定されたので、本発明は、上記癌が
より高い等級に進行することを防止し、そしてその前立
腺腫瘍の癌の状態を逆転させるための手段を提供する。

【００１０】本発明は、さらに、異種配列の前立腺組織
特異的発現を可能にする、ＰＣＡ３ ^dd3 遺伝子の新規前
立腺特異的プロモーター配列の発見及び特徴付けに関す
る。

【００１１】本発明は、さらに、５′〜３′方向に、前
立腺宿主細胞内で転写を開始させるのに有効な前立腺特
異的プロモーター、及び着目の異種ＤＮＡ配列を含む組
換え核酸分子を提供する。本発明の１の態様において
は、上記前立腺癌特異的プロモーターは、−４６０位〜
＋６２位間の、図１に示すＰＣＡ３^dd3 プロモーターで
ある。しかしながら、配列多型が存在しうる。さらに、
上記配列のサブ領域及び変異体も本発明に従って使用さ
れうる。但し、このようなサブ領域又は変異体は、それ
に作用可能な状態で連結された配列の前立腺癌特異的組
織発現の発現におけるそれらの生物学的活性を保持す
る。事実、以下に例示するように、上記−４６０〜＋６
２核酸領域のサブ領域は未だ前立腺組織プロモーター活
性を保持している。

【００１２】本発明は、上記ＰＣＡ３^dd3 プロモーター
配列の中の１、及びそれに作用可能な状態で連結された
異種配列を含む組換えベクターも提供する。

【００１３】本発明は、上記組換えベクターを含む細胞
をも提供する。

【００１４】本発明は、さらに、ＰＣＡ３^dd3 プロモー
ターの、そしてそれによるそれに作用可能な状態で連結
された配列（例えば、ＰＣＡ３コーディング配列）の発
現の調節を可能にするように、本発明のＰＣＡ３^dd3 プ
ロモーター配列に特異的なアンチセンス核酸分子又はリ
ボザイムを含む。１の特別な態様においては、上記アン
チセンスは、図１に示すヌクレオチド−７０〜−３０に
わたる配列に相補的な配列を含む。本発明の他のプロモ
ーター配列に相補的なアンチセンス配列も本発明の範囲
内にある。

【００１５】本発明は、さらに、上記組換えベクターを
含む非ヒト生物にも関する。特に、本発明は、異種配列
に作用可能な状態で連結されたＰＣＡ３^dd3 プロモータ
ー配列を含む組換えベクターを含む非ヒト生物に関す
る。特別な態様においては、上記プロモーター配列は、
−４６０〜＋６２位間の、図１に示す配列、又はその部
分の変異体を含む。

【００１６】本発明は、一般に、その前立腺組織特異的
発現を可能にするそれらの能力を保持しつつ、異種配列
の前立腺組織特異的発現を可能にする単離核酸分子、及
びその変異体又は部分を提供する。

【００１７】本発明は、異種配列に作用可能な状態で連
結された、本発明に係るＰＣＡ３^dd ³ プロモーターをコ
ードする核酸配列の全部又は一部、その変異体又は部分
を含む、治療用途のための方法をも提供する。

【００１８】ＰＣＡ３^dd3 プロモーターを同定し、か
つ、特徴付け、そしてそれらの組織特異的プロモーター
発現を保持するそれらの領域を決定し、かつ、特徴付け
ることは、ＰＣＡ３^dd3 のプロモーター活性を、そして
これ故、そのプロモーター活性がそれから評価されると
ころのサンプルの癌素因又は癌症状を、測定するための
診断方法の設計を可能にする。プロモーター活性を測定
するための多くの方法が利用可能であり、そして当業者
に知られている。患者からのサンプル中の、ＰＣＡ３
^dd3 プロモーターのプロモーター活性を測定するため
の、上記診断方法の非限定的な例は、配列の異なるメチ
ル化状態の間を区別することができるプライマーを用い
たＰＣＡ３^dd3 プロモーターのＰＣＲ分析により行われ
ることができる（すなわち、CpG; Jarrard et al. 198
8, Cancer Res. 58: 5310-5314 ）。このような方法
は、患者における前立腺癌の診断／予後を可能にするで
あろう。重亜硫酸水素ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍｂｉ
ｓｕｌｆｉｔｅ）は、非メチル化シトシンをチミジンに
変換し（メチル化シトシンはチミジンに変換されな
い）、上記プロモーターの低−対高−メチル化状態の間
を識別することができるＰＣＲプライマーの設計が、当
業者により行われることができる。（上記プロモーター
の活性状態と相関する）プロモーターの低メチル化状態
は、上記前立腺サンプルの癌症状又はそれに対する素因
を示すであろう（例えば、上記プライマーは、ＣがＴに
変更されているであろう配列に結合するであろう）。も
ちろん、プロモーターの活性を測定するための他の方法
を行うこともできる。

【００１９】本発明は、さらに、候補作用物質の不存在
下に対して存在下でのその発現レベルを比較することを
含む。本発明のＰＣＡ３^dd3 プロモーターを調節する作
用物質を同定するためのスクリーニング・アッセイに関
する。当業者により改作されることができるこのような
アッセイは、上記プロモーター配列の構造の働きをさら
に分析するために使用されうる。このようなアッセイの
１のタイプを、以下に、ＰＣＡ３^dd3 プロモーターの配
列及び／又は境界をより正確に定めるために、説明す
る。

【００２０】本明細書中に教示するように、ＰＣＡ３
^dd3 プロモーターからの多数の配列は、前立腺特異的プ
ロモーター活性を保持することが示されている（図
７）。従って、本発明は、選ばれた異種配列の発現を指
令するために使用されることができる多数のＰＣＡ３
^dd3 プロモーター配列を提供する。本分野において周知
であるが、プロモーターは、転写を開始させるためのＲ
ＮＡポリメラーゼの結合に関係するＤＮＡ領域として定
義されるので、本明細書中に特徴付けられるＰＣＡ３^dd
³ プロモーター配列は、図１の＋２〜＋６２領域を含む
ＤＮＡ配列に限定されるべきではない。実際、上記プロ
モーター配列を特徴付けるために使用された構築物のほ
とんどが、＋２〜＋６２領域、そしてこれ故、ｍＲＮＡ
開始部位及びその先（全てエクソン１の部分）を含んで
いたので、当業者にとって、上記プロモーター配列が図
１に示すように−１位（又は転写開始部位が含まれる場
合、＋１位）で終了することができるということは、明
らかである。従って、本発明のＰＣＡ３^dd3 プロモータ
ー配列の非限定的例は、図１を参照して、ヌクレオチド
−８９〜−１、−８９〜＋１、−８９〜＋６２；−１５
２〜−１、−１５２〜＋１、−１５２〜＋６２；−２５
４〜−１、−２５４〜＋１、−２５４〜＋６２；−３６
６〜−１、−３６６〜＋１、−３６６〜＋６２；又は−
４３３〜−１、−４３３〜＋１、−４３３〜＋６２を含
むＰＣＡ３^dd3 配列を含む。もちろん、配列番号１、並
びに−４６０〜−１、−４６０〜＋１又は−４６０〜＋
６２にわたるＰＣＡ３^dd3 配列も本発明の範囲内にあ
る。

【００２１】本明細書中に使用される用語の明確、か
つ、一貫した理解を提供するために、以下に、多くの定
義を提供する。

【００２２】本明細書中に使用するとき、用語“非悪性
前立腺又は症状”とは、非癌性の前立腺状態を包含する
と意味される。従って、これらの用語は、正常な状態、
並びに良性な前立腺症状（例えば、ＢＰＨなど）を含む
と意味される。

【００２３】用語“治療（的）用配列”とは、それがそ
の内で発現されているところの宿主細胞に対してある効
果を間接的又は直接的に有するＤＮＡ配列をいう。好ま
しくは、この治療的配列は、その内でＰＣＡ３^dd3 プロ
モーターの機能的プロモーター活性が上記治療的タンパ
ク質の発現を可能にし、そして上記タンパク質の治療的
効果が直接又は間接的に発揮されているところの宿主細
胞内で治療的効果を示すことができる機能的タンパク質
をコードするアミノ酸配列をコードしている。

【００２４】用語“ＰＣＡ３^dd3 プロモーター”とは、
図１又は図５中に示すＰＣＡ３^dd3プロモーターからの
配列、又はその断片又は誘導体であって、それらの前立
腺組織特異的プロモーター活性を保持しているものをい
う。

【００２５】用語“エンハンサー要素”とは、プロモー
ターの活性を高める（すなわち、上記プロモーターから
下流の配列の転写率を増加させるが、プロモーターとは
違って、プロモーター活性を有しておらず、かつ、上記
プロモーターに対してのその位置に拘らず（すなわち、
上記プロモーターの上流、又は下流で）通常働くことが
できる配列を定めると意味される。１の態様において
は、本明細書中に教示するように、プロモーター活性を
もつ単離核酸配列は、ＰＣＡ３^dd3 プロモーターの転写
活性を高めるように、エンハンサー要素と併合されるこ
とができる。エンハンサー要素は、本分野において周知
である。ＰＣＡ３^dd3 プロモーターのプロモーター活性
を高めるために使用されることができるであろうエンハ
ンサー要素（又はその部分）の非限定的な例は、レトロ
ウイルスのＬＴＲｓ（例えば、ＭＭＴＶＬＴＲ）、又は
ＳＶ４０エンハンサー配列などに在るエンハンサー要素
を含む。

【００２６】本分野において周知であり、前立腺組織特
異的プロモーター活性をもつ配列、及びＰＣＡ３^dd3 プ
ロモーターの重要な領域（例えば、ＮＦ−１ボックス、
及びＥ−ボックス）が同定されているので、当業者は、
その転写活性をさらに高めるために、上記プロモーター
を修飾することができるであろう。例えば、（１）図１
中四角（ボックス）で囲んだ、前立腺細胞特異的そして
特に前立腺癌細胞特異的又は異なる要素に結合する調節
タンパク質又は因子に結合する配列の数を増幅するこ
と；（２）１以上のエンハンサーを添加することが、Ｐ
ＣＡ３^dd3 プロモーターの強度（すなわち、その転写活
性）を有意に高めることができるであろう。もちろん、
このような修飾は、ＰＣＡ３^dd3 プロモーター配列の前
立腺組織特異的プロモーター活性を保持しなければなら
ない。

【００２７】多くの治療的遺伝子が本分野において周知
である。その非限定的リストは、例えば、米国特許第
５，９１９，６５２号中に見ることができる。治療的遺
伝子は、それに限定されないが、生産されるとき、その
内でそれが発現されるところの宿主細胞を殺すであろう
自殺遺伝子を含む。自殺遺伝子は、例えば、酵素、毒
素、腫瘍抑制遺伝子、及び癌遺伝子を含む。上記自殺遺
伝子の主要な目的は、その内でそれが発現されるところ
の宿主細胞を殺すことであるけれども、自殺遺伝子は、
宿主細胞の成長を抑制することもできる。上記自殺遺伝
子の抑制又は殺生効果は、直接的又は間接的であること
ができるということが理解されるであろう。

【００２８】本発明に従って使用されることができる治
療的配列の非限定的な例は、ＴＫ、好適な癌遺伝子及び
腫瘍抑制遺伝子、例えば、Ｒａｓ，ｐ５３，Ｒｂ，Ｗｉ
ｌｍ’ｓ腫瘍遺伝子、毒素、例えば、ジフテリア毒素、
バクテリアの毒素、腫瘍壊死因子、インターフェロンそ
の他を含む。

【００２９】さまざまなベクターが、ＰＣＡ３^dd3 プロ
モーターの影響下で、選ばれた異種配列、及びより特に
治療用配列を発現させるために、本発明に従って、使用
されることができる。このようなベクターは、本分野に
おいて周知である。その非限定的な例は：アデノウイル
ス−ベースのベクター、レトロウイルスのベクター、ア
デノ随伴ウイルスのベクター（ＡＡＶ）、他のヒト及び
動物ウイルス、ＳＶ４０、及びＨＳＶ−１を含む（本発
明に従って使用されることができるであろう非限定的ベ
クターのより詳しいリストについては米国特許第５，９
１９，６５２号を参照のこと）。

【００３０】ヌクレオチド配列は、IUPAC-IUB Biochemi
cal Nomenclature Commission の推奨に従って本分野に
おいて一般に使用される１文字ヌクレオチド記号を用い
て、５′〜３′の方向で、左から右に向かって、１本鎖
により、本明細書中提供される。

【００３１】別段の定めなき場合、本明細書中に使用す
る科学技術用語及び命名法は、本発明の属する当業者に
より一般に理解されるものと同じ意味をもつ。一般に、
細胞培養、感染、分子生物学的方法その他の手段は、本
分野において使用される一般的方法である。このような
標準的な技術は、参考マニュアル、例えば、Sambrooket
al. (1989, Moleculer Cloning-A Laboratory Manual,
Cold Spring HarborLaboratories ）、及びAusubel et
al. (1994, Current Protocols in Molecular Biolog
y, Wiley, New York ）中に見られる。

【００３２】本明細書は、多数の日常的に使用される組
換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）技術用語に言及する。しかしな
がな、このようなｒＤＮＡ用語の選択された例の定義
は、明確さ、及び一貫性を目的として提供される。

【００３３】本明細書中に使用するとき、“核酸分子”
とは、ヌクレオチドのポリマーをいう。その非限定的な
例は、ＤＮＡ（すなわち、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ）、
及びＲＮＡ分子（すなわち、ｍＲＮＡ）、並びにそれら
のキメラを含む。上記核酸分子は、クローニング技術に
より得られ又は合成されることができる。ＤＮＡは、２
本鎖又は１本鎖（コーディング鎖又は非コーディング鎖
〔アンチセンス〕）であることができる。

【００３４】本分野において知られる“組換えＤＮＡ”
は、ＤＮＡセグメントの連結から生じたＤＮＡ分子をい
う。これは、しばしば遺伝子工学といわれる。

【００３５】用語“ＤＮＡセグメント”は、本明細書
中、ヌクレオチドが線状に延たもの又はその配列を含む
ＤＮＡをいうために使用される。この配列は、その遺伝
子コードに従って読むとき、ポリペプチド、タンパク
質、タンパク質断片その他といわれることができるアミ
ノ酸の線状ストレッチ又は配列をコードすることができ
る。

【００３６】本明細書中、用語“増幅対”は、多くのタ
イプの増幅方法の中の１、好ましくはポリメラーゼ連鎖
反応による選ばれた核酸配列の増幅において共に使用さ
れるべく選択された、本発明のオリゴヌクレオチド（オ
リゴ）の対をいう。増幅方法の他のタイプは、以下によ
り詳細に説明するような、リガーゼ連鎖反応、鎖変位増
幅（ｓｔｒａｎｄｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔａｍｐ
ｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、核酸配列に基づく増幅を含
む。

【００３７】本分野において一般に知られているよう
に、上記オリゴは、選択された条件下で、相補配列に結
合するように設計される。

【００３８】本発明を実施するための核酸（すなわち、
ＤＮＡ又はＲＮＡ）は、周知の方法に従って得られう
る。

【００３９】本発明のオリゴヌクレオチド・プローブ又
はプライマーは、使用される特定のアッセイ形式並びに
特定のニーズ及び標的化されたゲノムに依存して、いず
れかの好適な長さをもつことができる。一般に、上記オ
リゴヌクレオチド・プローブ又はプライマーは、長さ少
なくとも１２ヌクレオチド、好ましくは１５〜２４の間
であり、そしてそれらは、選択された核酸増幅系に特に
好適であるように改作される。本分野において一般に知
られているように、上記オリゴヌクレオチド・プローブ
及びプライマーは、その標的配列とのそのハイブリダイ
ゼーションの融点を考慮することにより設計されること
ができる（以下、及びSambrook et al.,1989, Molecula
r Cloning-A Laboratory Manual, 2nd Edition, CSH La
boratories; Ausubel et al., 1989, in Current Proto
cols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc.,
N.Y.を参照のこと）。

【００４０】用語“オリゴヌクレオチド”又は“ＤＮ
Ａ”分子又は配列は、一般に、デオキシリボヌクレオチ
ド、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、
及び／又はシトリン（Ｃ）から構成される分子をいう
（修飾され又は稀なヌクレオチドも使用されうる）。２
本鎖型にあるとき、その用語が本明細書中に定義される
ように、それは、本発明に係る“調節要素”を含む（ｃ
ｏｍｐｒｉｓｅｏｒｉｎｃｌｕｄｅ）ことができ
る。用語“オリゴヌクレオチド”又は“ＤＮＡ”は、線
状ＤＮＡ分子又は断片、ウイルス、プラスミド、ベクタ
ー、染色体又は合成誘導ＤＮＡ内に在ることができる。
本明細書中に使用するとき、特定の２本鎖ＤＮＡ配列
が、５′から３′方向でだけ配列を記載する通常のやり
方に従って、記載されることができる。“オリゴヌクレ
オチド”は１本鎖形態にあることができ（そして通常そ
うである）ことも理解されるであろう。

【００４１】本発明のプローブは、天然の糖−リン酸骨
格、並びにホスホロチオエート、ジチオネート、アルキ
ル・ホスホネート、及び−ヌクレオチドその他を含む修
飾された骨格とともに、使用されることができる。修飾
された糖−リン酸骨格は、一般に、Miller, 1988, Ann.
Reports Med.Chem. 23: 295 、及びMoran et al., 198
7, Nucleic acid molecule.Acids Res., 14: 5019によ
り教示されている。本発明のプローブは、リボ核酸（Ｒ
ＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のいずれかか
ら、そして好ましくはＤＮＡから構築されることができ
る。

【００４２】それにおいてプローブが使用されることが
できるところの検出のタイプは、サザン・ブロット（Ｄ
ＮＡ検出）、ドット又はスロット・ブロット（ＤＮＡ，
ＲＮＡ）、及びノーザン・ブロット（ＲＮＡ検出）を含
む。あまり好ましくないけれども、標識されたタンパク
質は、それにそれが結合するところの特定の核酸配列を
検出するためにも使用されることができるであろう。よ
り最近、ＰＮＡｓが記載された（Nielsen et al. 1999,
Current Opin.Biotechnol. 10: 71-75 ）。ＰＮＡｓ
も、本発明のｍＲＮＡを検出するために使用されること
ができるであろう。他の検出方法は、ディップスティッ
ク・セットアップ上にプローブを含むキットその他を含
む。

【００４３】本発明は、特定の核酸配列の検出のための
標識の使用に特別に依存しないけれども、このような標
識は、検出の感度を高めることにより、有益であるかも
しれない。さらに、それは自動化を可能にする。プロー
ブは、多くの周知の方法に従って標識付けされることが
できる（Sambrook et al., 1989 、前掲）。標識の非限
定的な例は、 ³Ｈ，¹⁴Ｃ，³²Ｐ、及び³⁵Ｓを含む。検出
可能なマーカーの非限定的な例は、リガンド、蛍光団
（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅｓ）、化学発光剤、酵素、及
び抗体を含む、本発明の方法の感度上昇を可能にするこ
とができる、プローブと共に使用されるための他の検出
マーカーは、ビオチンと放射性核種を含む。当業者にと
って、特定の標識の選択が、それがプローブに結合する
やり方を決定することは明らかとなるであろう。

【００４４】一般に知られているように、放射性核種
は、いくつかの方法により本発明のプローブ内に取り込
まれることができる。その非限定的に例は、ガンマ³²Ｐ
ＡＴＰとポリヌクレオチド・キナーゼを用いた、放射
性ｄＮＴＰの存在下Ｅ．ｃｏｌｉのＰｏｌＩのＫｌｅｎ
ｏｗ断片（すなわち、低融点ゲル中でのランダム・オリ
ゴヌクレオチド・プライマーを用いた均一に標識付けさ
れたＤＮＡプローブ）を用いた、１以上の放射性ＮＴＰ
の存在下ＤＮＡセグメントを転写するためのＳＰ６／Ｔ
７、などを用いた、上記プローブの５′末端キナーゼ処
理を含む。

【００４５】本明細書中に使用するとき、“オリゴヌク
レオチド”又は“オリゴ”は、２以上のヌクレオチド
（リボ又はデオキシリボヌクレオチド）をもつ分子を定
義する。上記オリゴのサイズは、特定の状況により、そ
して最終的には、その特定の使用に基づいて決められる
であろうし、そしてそれ故当業者により改作されるであ
ろう。オリゴヌクレオチドは、周知の方法に従って化学
的に合成され、そしてクローニングにより得られること
ができる。

【００４６】本明細書中に使用するとき、“プライマ
ー”は、好適な条件下、標的配列にアリーリングするこ
とができ、それによりＤＮＡ合成のための開始点として
役立つことができる２本鎖領域を作り出すことができる
オリゴヌクレオチドを定義する。

【００４７】選択された、又は標的の、核酸配列の増幅
は、多くの好適な方法により、行われることができる。
一般に、Kwoh et al., 1990, Am.Biotechnol.Lab. 8: 1
4-25を参照のこと。多くの増幅技術が記載されており、
そして当業者に特定の要求に合うように容易に改作され
うる。増幅技術の非限定的な例は、ポリメラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖変位増
幅（ＳＤＡ）、転写ベースの増幅、Ｑ−レプリカーゼ
系、及びＮＡＳＢＡを含む（Kwoh et al., 1989,Proc.N
atl.Acad.Sci. USA 86, 1173-1177; Lizardi et al., 1
988, Bio Technology 6: 1197-1202; Malek et al., 19
94, Methods Mol.Biol., 28: 253-260;及びSambrook et
al., 1989、前掲）。好ましくは、増幅は、ＰＣＲを用
いて行われるであろう。

【００４８】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、知ら
れた技術に従って行われる。例えば、米国特許第４，６
８３，１９５号；同第４，６８３，２０２号；同第４，
８００，１５９号；及び同第４，９６５，１８８号（上
記全４つの米国特許の開示を本明細書中に援用する）を
参照のこと。一般に、ＰＣＲは、検出されるべき特定の
配列の各々のストランドのための１のオリゴヌクレオチ
ド・プライマーを用いた、ハイブリダイジング条件下で
の（例えば、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下での）
核酸サンプルの処理を含む。合成されている各プライマ
ーの伸張生成物は、上記２つの核酸ストランドの各々に
相補的であり、そして上記プライマーは特定の配列の各
々のストランドに十分に相補的でありそれとハイブリダ
イズする。各プライマーから合成された伸張生成物は、
同一プライマーを用いた伸張生成物のさらなる合成ため
の鋳型としても役立つことができる。十分な数の、伸張
生成物の合成ラウンドの後、上記サンプルを分析して、
検出されるべき配列（単数又は複数）が存在するかどう
かを評価する。増幅された配列の検出は、ゲル電気泳動
後のＤＮＡのＥｔＢｒ染色後の可視可により、又は知ら
れた技術に従う検出ラベル等を用いて、行われることが
できる。ＰＣＲ技術についての文献に関しては、PCR Pr
otocols, A Guide to Methods and Amplications, Mich
ael et al. Eds, Acad.Press, 1990を参照のこと。

【００４９】本明細書中に使用するとき、用語“遺伝
子”は、本分野において周知であり、そして単一のタン
パク質又はポリペプチドを定める核酸をいう。“構造遺
伝子”は、ＲＮＡに転写され、そして特定のアミノ酸配
列をもつタンパク質に翻訳され、それにより特定のポリ
ペプチド又はタンパク質を生じるＤＮＡ配列を定義す
る。当業者により、本発明の核酸配列は本分野において
周知の多くの確立されたキット形式のいずれか１に取り
込まれうることが容易に理解されるであろう。

【００５０】ＤＮＡ分子の“異種”（すなわち、異種遺
伝子）領域は、天然においてはそれと会合していないこ
とが判っている、より大きなセグメント内のＤＮＡのそ
の後のセグメントである。用語“異種（ｈｅｔｅｒｏｌ
ｏｇｏｕｓ）”は、天然において一緒に連結されていな
い２つのポリペプチドセグメントを定義するためにも同
様に使用されることができる。異種遺伝子の非限定的な
例は、リポーター遺伝子（ｒｅｐｏｒｔｅｒｇｅｎｅ
ｓ）、例えば、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコール
・アセチル・トランスフェラーゼ、ベータ−ガラクトシ
ダーゼ、成長ホルモン、緑色蛍光タンパク質（米国特許
第５，９６８，８７５号）その他であって、異種制御領
域又は異種ポリペプチドに隣接し又は連結されることが
できるものを含む。１の態様によれば又は特に上記スク
リーニング・アッセイのためには、このようなリポータ
ー遺伝子は、ＰＣＡ３^dd3 プロモーター活性の定量を可
能にすることができる。好ましくは、上記異種配列は、
治療的配列をコードする。

【００５１】用語“ベクター”は、本分野において一般
に知られており、そして、プラスミドＤＮＡ、ファージ
ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡその他であって、その中に本発
明のＤＮＡがクローニングされることができるところの
ＤＮＡベクターとして役立つことができるものを定着す
る。多くのタイプのベクターが存在し、そして本分野に
おいて周知である。

【００５２】用語“発現”は、それにより遺伝子がｍＲ
ＮＡに転写され（転写）、そして次にそのｍＲＮＡが１
以上のポリペプチド（又はタンパク質）に翻訳される
（翻訳）ところのプロセスを定義する。

【００５３】用語“発現ベクター”は、上記のようなも
のであるが、宿主内への形質転換後に挿入された配列の
発現を可能にするようにデザインされたベクター又は媒
体を定める。クローン化された遺伝子（挿入された配
列）は、通常、制御要素配列、例えば、プロモーター配
列の制御下に置かれる。このような制御配列の下にクロ
ーン化遺伝子を配置することを、ときどき、制御要素又
は配列に作用可能な状態で連結されているという。

【００５４】作用可能な状態で連結された配列は、同一
のＲＮＡ転写産物上に転写される２つのセグメントを含
むこともできる。従って、２つの配列、例えば、プロモ
ーターと“リポーター配列”又は“治療的配列”は、上
記プロモーターにおける転写開始が上記リポーター配列
又は治療的配列のＲＮＡ転写産物を作り出すである場合
に、作用可能な状態で連結されている。“作用可能な状
態で連結される”ためには、２つの配列が互いにじかに
隣接している必要はない。

【００５５】発現制御配列は、上記ベクターが原核又は
真核宿主又は両者（シャトル・ベクター）内で作用可能
に連結された遺伝子を発現するように設計されているか
どうかに依存して変化するであろうし、そしてさらに、
転写要素、エンハンサー要素、終止配列、組織特異性要
素、及び／又は翻訳開始及び終結部位を含むことができ
る。本発明の好ましい態様に従えば、本発明のプロモー
ター配列は、前立腺細胞又はより好ましくは前立腺癌細
胞内での異種配列の発現において用途がある。もちろ
ん、本発明は、前立腺癌組織由来細胞（例えば、転移）
においても利用される。

【００５６】上記ＤＮＡ構築物は、本発明のオリゴヌク
レオチド配列に作用可能な状態で連結されたプロモータ
ーを含むベクターであることができ、そして本発明のオ
リゴヌクレオチド配列は、次に、異種遺伝子、例えば、
ルシフェラーゼ・リポーター分子のための遺伝子に作用
可能な状態で連結される。“プロモーター”は、細胞内
でＲＮＡポリメラーゼに直接又は間接的に結合すること
ができ、そして下流（３′方向）に向かうコーディング
配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域をい
う。本発明の目的のためには、上記プロモーターは、そ
の３′末端において転写開始部位により境界を画され、
そしてバックグラウンドを上廻って検出されることがで
きるレベルにおける転写を開始させるために必要な最少
数の塩基又は要素を含むよう上流（５′方向に）延びて
いる。上記プロモーター内には、（便利には、Ｓ１ヌク
レアーゼを用いたマッピングにより定められる）転写開
始部位、及びＲＮＡポリメラーゼの結合に責任を負うタ
ンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が在るであ
ろう。真核プロモーターは、常時ではないが、しばし
ば、“ＴＡＴＡ”ボックス、及び“ＣＣＡＴ”ボックス
を含む。

【００５７】本明細書中に使用するとき、用語“機能性
誘導体”とは、核酸配列であるかアミノ酸配列であるか
を問わず配列の機能的な誘導体という意味で、その元の
配列のものに実質的に類似の生物学的活性（機能又は構
造のいずれか）を保持する分子を表す。この機能性誘導
体又は等価物は、天然の誘導体であることができ又は合
成により製造されることができる。このような誘導体
は、より正確には、１以上のヌクレオチド（２本鎖）の
置換、欠失、又は付加をもつが、そのプロモーター活性
及び前立腺特異的活性は保存されているようなＰＣＡ３
^dd3 配列を含む。用語“機能的誘導体”は、本発明の対
象の、“断片”、“セグメント”、“変異体（ｖａｒｉ
ａｎｔｓ）”、“アナログ”又は“化学的誘導体”を含
むと意図される。

【００５８】従って、用語“変異体”は、本明細書中、
本発明の核酸に、構造及び生物学的活性において実質的
に類似する核酸分子をいう。

【００５９】本発明の機能的誘導体は化学的に合成され
又は組換えＤＮＡ技術を通じて製造されることができ
る。これらの方法の全てが本分野において周知である。

【００６０】当業者は、ゲノムがしばしば個体間に僅か
な対立遺伝子変化を含むことを理解するであろう。それ
故、上記単離核酸分子は、その配列がＰＣＡ３^dd3 プロ
モーター配列の機能的誘導体である限り、対立遺伝子変
化をも含むと意図される。ＰＣＡ３対立遺伝子が配列番
号１内に存在する配列と同一の配列をコードしていない
とき、それは、本明細書中に使用するものと同じ技術を
用いて、そして特に、本明細書中に開示する配列に基づ
くプライマーを用いて適当な領域を増幅するためのＰＣ
Ｒ技術を用いてＰＣＡ３^dd3 プロモーターとして単離及
び同定されることができる。

【００６１】本明細書中に使用するとき、“化学的誘導
体”とは、通常、本発明の対象の一部ではない追加の化
学的成分を包含することを意味される。このような成分
は、その誘導体の物理−化学特性（すなわち、溶解度、
吸収、半減期その他、毒性の低下）に影響を及ぼすこと
ができるであろう。

【００６２】このような成分は、Remington's Pharmace
utical Sciences (1980)中に例示されている。このよう
な化学−物理成分をポリペプチドにカップリングさせる
方法は、本分野において周知である。

【００６３】用語“対立遺伝子”は、染色体上の所定の
座を占有する遺伝子の代替形態である。

【００６４】一般に知られているように、“突然変異”
は、娘細胞に伝達されることができる遺伝子材料におけ
る検出可能な変化である。周知であるが、例えば、突然
変異は、１以上のデオキシリボヌクレオチドにおける検
出可能な変化であることができる。例えば、ヌクレオチ
ドは、付加され、欠失され、置換され、逆位され、又は
転位されることができる。自然発生の突然変異と実験的
に誘導された突然変異が存在する。核酸分子の突然変異
の結果は、突然変異体核酸分子である。突然変異体ポリ
ペプチドは、その突然変異体核酸分子からコードされる
ことができる。

【００６５】本明細書中に使用するとき、用語“精製さ
れた”とは、細胞成分から分離されている分子をいう。
従って、例えば、“精製されたタンパク質”は、天然に
は存在しないレベルまで精製されている。“実質的に純
粋な”分子は、他の全ての細胞成分を欠いている分子で
ある。

【００６６】本明細書中に使用するとき、用語“分
子”、“化合物”、又は“作用物質（ａｇｅｎｔ）”
は、互換使用され、そして広く、天然、合成又は半合成
の分子又は化合物を指す。それ故、用語“分子”は、例
えば、化学物質、巨大分子、（植物又は動物からの）細
胞又は組織抽出物、その他を表す。分子の非限定的な例
は、核酸分子、ペプチド、リガンド、抗体、炭水化物、
及び医薬作用物質を含む。上記作用物質は、ランダム・
スクリーニング、理論的選択（ｒａｔｉｏｎａｌｓｅ
ｌｅｃｔｉｏｎ）を含むさまざまな手段により、そして
例えば、タンパク質又はリガンド・モデリング方法、例
えば、コンピュータ・モデリングを用いた理論的設計に
より、選択され、そしてスクリーニングされることがで
きる。用語“理論的に選択された”又は“理論的に設計
された”とは、本発明の相互作用ドメインの立体形状に
基づき選択された化合物を定義すると意味される。当業
者により理解されるように、非天然の修飾をもつ巨大分
子も、用語“分子”の範囲内にある。例えば、医薬産業
において周知であり、かつ、一般にペプチド・アナログ
といわれる、ペプチド擬態は、上述のようなモデリング
により作製されることができる。本発明の技術に従って
同定された分子は、前立腺細胞及び／又はそれから誘導
された組織又は細胞の病因又は恒常性が損われている疾
患又は症状において治療的価値をもつ。好ましい態様に
おいては、細胞又は組織の欠陥は、ＰＣＡ３ｍＲＮＡの
発現における欠陥に関係している。あるいは、本発明の
教示に従って同定される分子は、ＰＣＡ３^dd3 プロモー
ター配列の活性を調節することができる化合物の開発に
おいて有用である。

【００６７】本発明は、例えば、ＰＣＡ３^dd3 プロモー
ターの活性を低下させ又は抑止するために使用されるこ
とができるアンチセンス核酸分子をも提供する。本発明
に係るアンチセンス核酸分子は、その標的化された核酸
配列（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の部分と安定した２本鎖又は
３本鎖を形成することができる分子をいう。アンチセン
ス核酸分子の使用並びにこのような分子の設計及び修飾
は、例えば、ＷＯ９６／３２９６６，ＷＯ９６／１
１２６６，ＷＯ９４／１５６４６，ＷＯ９３／０８
８４５、及びＵＳＰ５，５９３，９７４中に記載され
ているように本分野において周知である。本発明に係る
アンチセンス核酸分子は上記核酸配列から誘導され、そ
して周知の方法に従って修飾されることができる。例え
ば、いくつかのアンチセンス分子は、本分野において一
般に知られているように、ヌクレオチド・アナログを用
いて及び／又はその選ばれた化学断片を置換することに
より、分解に対してより抵抗性であるように、それらの
標的配列に対するそれらのアフィニティーを高めるよう
に、選ばれた細胞タイプ又は細胞区画へのそれらの輸送
に影響を及ぼすように、そして／又はそれらの脂質安定
性を高めるように、デザインされることができる。

【００６８】本発明に係る指標細胞は、アンタゴニスト
を同定するために使用されることができる。例えば、テ
スト分子（単数又は複数）が、固定された濃度に保たれ
た１以上のアゴニストとともに上記宿主細胞とともにイ
ンキュベートされる。上記分子のアンタゴニスティック
特性の指示及び相対強度は、テスト分子の不存在下対存
在下で、上記アゴニストの存在下で上記指標細胞内での
遺伝子発現のレベルを比較することにより、提供される
ことができる。もちろん、分子のアンタゴニスティック
効果は、上記テスト分子の存在下と不存在下で上記リポ
ーター遺伝子産物の発現レベルを単に比較することによ
り、アゴニストの不存在下で測定されることもできる。

【００６９】本明細書中に使用するとき、用語“指標細
胞”とは、検出可能な異種配列に作用可能な状態で連結
されたＰＣＡ３^dd3 プロモーター配列を含む細胞をい
う。いくつかの態様においては、上記異種配列によりコ
ードされるタンパク質は、同定可能な又は選択可能な表
現型又は特性に結合されることができる。このような指
標細胞は、本発明のスクリーニング・アッセイにおいて
使用されることができる。ある態様においては、上記指
標細胞は、本発明のＰＣＡ３^dd3 プロモーターの選ばれ
た誘導体、断片、同族体、又は突然変異体を発現するよ
うに操作されている。上記細胞は、ＰＣＡ３^dd3 プロモ
ーターの検出可能なプロモーター活性を可能にするよう
に選ばれなければならない。好ましくは、上記細胞は前
立腺細胞であり、好ましくは、上記前立腺細胞は前立腺
癌細胞である。

【００７０】明確さのために、本発明を実施するために
有用な配列及びポリペプチドは、それに限定されない
が、突然変異体、同族体、サブタイプ、対立遺伝子その
他を含む。一般に、本発明に係る配列は（欠陥があるけ
れども）機能的なＰＣＡ３^dd3プロモーターをコードし
なければならないと理解される。当業者にとって、本発
明のＰＣＡ３^dd3 プロモーター配列、変異体、誘導体、
又はその断片がそのプロモーター活性を保持しているか
どうかが、本発明の教示及びアッセイ並びに本分野の一
般的技術を用いることにより容易に決定されることがで
きるということは、明らかであろう。

【００７１】本明細書中以下に例示するように、本発明
のＰＣＡ３^dd3 プロモーターは、その構造−機能関係を
分析し、そしてモデリング化合物のより良い設計及び同
定を可能にするために、例えば、インビトロ突然変異誘
発（例えば、点突然変異、実施例６）により又は欠失分
析（実施例４）により、修飾されることができる。

【００７２】宿主細胞又は指標細胞は、このようなＤＮ
Ａが上記細胞内に導入されているとき、外来又は異種Ｄ
ＮＡ（例えば、ＤＮＡ構築物）により“トランスフェク
ト”されている。このトランスフェクティングＤＮＡ
は、上記細胞のゲノムを作っている染色体ＤＮＡ内に組
み込まれ（共有結合され）てもされなくてもよい。安定
したトランスフェクトされた細胞は、それが染色体の複
製を通じて娘細胞により受け継がれるように上記トラン
スフェクティングＤＮＡが染色体内に組み込まれるよう
になっているような細胞である。この安定性は、上記ト
ランスフェクティングＤＮＡを含む娘細胞の集団から構
成される細胞系又はクローンを樹立する真核細胞の能力
により証明される。トランスフェクション方法は、本分
野において周知である（Sambrook et al., 1989 、前
掲；Ausubel et al., 1994 前掲）。

【００７３】本明細書及び添付クレームから、用語治療
剤は、少なくとも２つの上記治療剤の組合せ物をも含む
ように広義に解釈されるべきである。さらに、本発明に
係るＤＮＡセグメント又はタンパク質は、多くの方法で
個体内に導入されることができる。例えば、前立腺細胞
は、罹患した個体から単離され、本発明に係るＤＮＡ構
築物により形質転換され、そして多くの方法で罹患した
個体に再導入されることができる。あるいは、ＤＮＡ構
築物は上記の罹患した個体に直接投与されることができ
る。ＤＮＡ構築物は、リポソームの如き媒体を通じてデ
リバリーされることもでき、これらは、特定の細胞のタ
イプに標的化されるように設計され、そして異なる経路
を通して投与されることができる。

【００７４】ヒトへの投与のためには、処方医薬従事者
が、所定の患者のための適当な形態及び投与量を最終的
に決定するであろうし、そしてこれは、選ばれた治療養
生法（すなわち、ＤＮＡ構築物、タンパク質、細胞）、
患者の応答及び症状、並びに疾患の重度に従って変化す
ると予想されうる。

【００７５】本発明の範囲内の組成物は、有害な副作用
を回避しながら所望の治療効果を達成するために有効な
量で上記活性剤（すなわち、組換えベクター、核酸、及
び分子）を含むべきである。典型的には、本発明に係る
核酸は、処置される哺乳動物の体重１kg当り１日当り
０．００５〜１mgの範囲にわたる投与量で哺乳動物（す
なわち、ヒト）に投与されることができる。上記活性剤
の医薬として許容される調製物及び塩は、本発明の範囲
内にあり、そして本分野において周知である（Remingto
n's Pharmaceutical Science, 16th Ed., Mack Ed.）。
ポリペプチド、アンタゴニスト、アゴニストその他の投
与のためには、投与される量は、有害な副作用を回避す
るように選ばれるべきである。この投与量は、疾患の程
度及び患者からの異なるパラメーターの如き慣用の要因
に従って臨床医により適合されるであろう。典型的に
は、０．００１〜５０mg／kg／日が上記哺乳動物に投与
される。

【００７６】本発明は、本発のオリゴヌクレオチド・プ
ライマーを含むキットにも関し、そして上記プライマー
は、本発明の追加の配列を欠くＰＣＡ３ｍＲＮＡ又は
本発明の追加の配列を含むＰＣＡ３ｍＲＮＡの中のい
ずれか１に特異的である。

【００７７】従って、本発明は、前立腺細胞又は前立腺
由来細胞そしてより特に前立腺癌細胞内で、着目の異種
配列を特異的に発現するための手段を提供する。従っ
て、本発明は、前立腺又は前立腺由来細胞内で疾患状態
を直接的又は間接的に矯生するための手段を提供する。
ＰＣＡ３^dd3 プロモーターの高い前立腺特異的発現が本
明細書中に証明される。

【００７８】従って、本発明の好ましい態様に従えば、
前立腺細胞又は前立腺由来細胞内で、その前立腺細胞又
は前立腺由来細胞内での疾患を直接又は間接的に改善す
ることができる、選ばれた異種配列、及び好ましくは治
療的配列を、特異的に発現する方法が提供される。特に
好ましい態様においては、本発明は、自殺遺伝子に作用
可能な状態で連絡された本発明のＰＣＡ３^dd3 プロモー
ター配列を含む組換えベクターのそれへの導入を通じ
て、前立腺癌細胞又は前立腺癌由来細胞を特異的に殺す
手段を提供する。

【００７９】本発明のさらなる目的及び利点は、以下の
説明から明らかになるであろう。

【００８０】好ましい態様の説明ＰＣＡ３^dd3 遺伝子は、患者における前立腺癌の、高感
度、かつ、特異的な診断マーカーであることが示されて
いる。ＧｅｎＢａｎｋ（商標）データ・ベース中に寄託
されたそのプロモーター配列の特徴付けは、前立腺又は
前立腺由来細胞、そしてより特に前立腺癌細胞内での異
種配列の特異的発現、及び前立腺癌に対する治療法の開
発に向けての道を切り拓く。

【００８１】本発明を、以下の非限定的実施例により、
より詳細に説明する。

【００８２】実施例１ＰＣＡ３^dd3 プロモーター・クローンの単離及び配列分
析ヒトＰＣＡ３^dd3 ｃＤＮＡの５′末端を含むゲノム・
クローン・ラムダＦＩＸ−ＭＥ３，−ＭＥ４、及び−Ｉ
Ｈ１を先に得た（Bussemakers, PCT/CA98/00346 1998；
及びBussemakers et al., Cancer Res. 1999a ）。ラム
ダ・ファージＤＮＡをエンドヌクレアーゼにより消化
し、そしてプラスミド・ベクターｐＧＥＭ−３Ｚｆ
（＋）又はｐＴ₂ 内にサブクローニングした。２本鎖プ
ラスミドＤＮＡを、標準的な手順により単離し、そして
ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎｅｓｅサイクル・シークエ
ンシング・キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、及びＴｅｘａ
ｓＲｅｄ標識されたユニバーサル・プライマーを用い
て配列決定した。シークエンシング生成物を分離し、そ
してＶｉｓｔｒａＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｅｒ７２
５を用いて分析した。

【００８３】図１Ａに、ＰＣＡ３^dd3 エクソン１とその
５′−フランキング配列を含む得られたクローンｐＦＳ
２８，ｐＧＶ６１、及びｐＭＥ４．６の制限酵素地図を
示す。５′−フランキング領域のヌクレオチド配列を決
定し（図１Ｂ）、そしてＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ２
７９２９０の下ＧｅｎＢａｎｋデータベース中に寄託す
る。ＢＬＡＳＴ（Altschul et al., Nucleic Acids Re
s. 1997）を用いた上記ＰＣＡ３^dd3 ５′−フランキ
ング・ヌクレオチド配列と非冗長ヌクレオチド・データ
ベース及び真核プロモーター・データベース中の配列と
の比較は、いずれの遺伝子、記載されたプロモーター配
列に対するホモロジーを全く現わさなかった。ＴＲＡＮ
ＳＦＡＣ３．５マトリックス（Quandt et al., Nucle
ic Acids Res. 1995）を用いたＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏ
ｒプログラムによる潜在的な転写因子（ＴＦ）結合部位
の同定は、コンセンサス位置において正準の結合部位を
全く現わさなかった。すなわち、いずれの開始又はＴＡ
ＴＡボックスも同定されることができなかった。非コン
センサス位置（−３７４〜−３７８）においてたった１
つのＣＡＡＴ要素が発見された。他の可能性のあるＴＦ
結合部位を図１Ｂに示す。

【００８４】従って、ＰＣＡ３^dd3 プロモーターの構造
−機能関係が、以下に示すような分子生物学的方法を用
いて分析されなければならなかった。

【００８５】実施例２ＰＣＡ３^dd3 転写開始部位の決定において使用されたオ
リゴヌクレオチドの配列ＰＣＡ３^dd3 転写開始部位の決定において使用された特
異的オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を図２中に
示す（配列番号２〜４）。ＢＵＳ２（配列番号２）とＢ
ＵＳ７（配列番号３）の配列が、プライマー伸張分析の
ために使用されたＰＣＡ３^dd3 特異的アンチセンス・オ
リゴヌクレオチドである。ＢＵＳ２１（配列番号４）配
列が、ＲＮａｓｅ保護アッセイのために使用されるＰＣ
Ａ３^dd3特異的オリゴヌクレオチドである。

【００８６】実施例３ＰＣＡ３^dd3 開始部位の決定単離されたヒトＰＣＡ３^dd3 ｃＤＮＡｓは、それらの
異なる長さに関連して、異なる５′末端を有することが
示された（Bussemakers et al., Cancer Res.1999a）。
ＰＣＡ３^dd3 転写開始部位を正確に定めるために、ヒト
前立腺癌組織及びネガティブ・コントロールとして正常
ヒト肝及び肺組織からの全ＲＮＡを用いた、プライマー
伸張分析及びＲＮａｓｅ保護アッセイを行った。

【００８７】プライマー伸張分析のために、ＰＣＡ３
^dd3 エクソン１（ＢＵＳ２）とエクソン３（ＢＵＳ７）
−特異的オリゴヌクレオチドを、プライマーとして使用
した。このエクソン３−特異的プライマー、ＢＵＳ７の
使用は正当化される。なぜなら、エクソン２は、代替ス
プライシングに因りほんの小さな転写産物（５＜％）中
に存在するからである（Bussemakers et al., Cancer R
es. 1999a ）。簡単に言えば、ヒト組織の全ＲＮＡを、
標準的な手順によりグアニジウム・イソシアネートを用
いて単離した。ＰＣＡ３^dd3 特異的アンチセンス・オリ
ゴヌクレオチドＢＵＳ２（５′−CTCTGTATCATCAGGTCCTT
CC−３′、＋１２０〜＋９９位）、及びＢＵＳ７（５′
−CTGGAAATGTGCAAAAACAT−３′、＋４２０〜＋４０１
位）を、〔ガンマ−³²Ｐ〕ＡＴＰ末端ラベルし（３００
０mCi ／mmol、Ａｍｅｒｓｈａｍ）、そして３０マイク
ロリッターのハイブリダイゼーション・バッファー（４
０mMＰＩＰＥＳ pH６．７、１mM ＥＤＴＡ、０．５Ｍ
ＮａＣｌ、８０％ホルムアルデヒド）中３０℃で２０
マイクログラムのＲＮＡでアニールした。プライマー
を、４２℃で１．５時間にわたり、０．５mM ｄＮＴＰ
ｓ、１０mM ＤＴＴ、０．５マイクログラムのアクチノ
マイシンＤ、及び１ユニット／マイクロリッターのＲＮ
ａｓｅ阻害剤を補った、２５マイクロリッターのＲＴバ
ッファー（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）中の２００ユニットの
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ II−ＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｇ
ｉｂｃｏＢＲＬ）を用いて伸張させた。ＲＮａｓｅＡ
処理されたプライマー伸張生成物を、６％ポリアクリル
アミド−尿素ゲル電気泳動により分離した。同一のオリ
ゴヌクレオチド・プライマーを用いて生成されたＰＣＡ
３^dd ³ ゲノム配列ラダーを、サイズ・マーカーとして使
用した。ゲルを乾燥させ、そして約３日間−８０℃で２
つの増幅性スクリーンを用いてＨｙｐｅｒｆｉｌｍ（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ）に露出させた。

【００８８】上記ＲＮａｓｅ保護アッセイのために、推
定された転写開始部位を包含するＤＮＡ断片を、プロー
ブとして使用した。クローンｐＭＥ４．６からの５１７
bpsのＳａｕ３ＡＩＤＮＡ断片を、Ｍ１３ｍｐ１８の
ＢａｍＨＩ部位にライゲートした。１本鎖Ｍ１３ＤＮ
Ａを単離し、ＰＣＡ３^dd3 エクソン１−特異的オリゴヌ
クレオチドＢＵＳ２１（５′−CCTTCCCACCATGCAGATCTTC
CTGGTCTCCCTCGGCTGCAGCCA-CACAA −３′）とアニールさ
せ、そして〔ガンマ−³²Ｐ〕ｄＡＴＰとＫｌｅｎｏｗ
ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸張させた。この放射標識
されたプローブを、ＨｉｎｃIIにより線状化し、そして
変性５％ポリアクリルアミド−尿素ゲルから精製した。
全ての反応を、標準的なプロトコールに従って行った。
このプローブ（１０⁵cpm）を、３０マイクロリッターの
ハイブリダイゼーション・バッファー（４０mM ＰＩＰ
ＥＳ pH６．７、１mM ＥＤＴＡ、０．５ＭＮａＣ
ｌ、８０％ホルムアミド）中３０℃で４０マイクログラ
ムの全ＲＮＡと一夜アニールさせた。ＤＮＡ−ＲＮＡハ
イブリッドを、３０℃又は３７℃で６０分間３００マイ
クロリッターのＳ１バッファー（２０マイクログラム／
mlの１本鎖ニシン精子ＤＮＡを補った、０．２８ＭＮ
ａＣｌ、０．０５ＭＮａＡｃ pH４．５、４．５mM
ＺｎＳＯ₄ ）中３００ユニットのＳ１ヌクレアーゼ（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ）で消化した。消化を、停止バッファー
（４ＭＮＨ₄ Ａｃ、５０mM ＥＤＴＡ、５０マイクロ
グラム／ml＋ＲＮＡ）の添加により停止させた。保護さ
れたＤＮＡ断片を、６％ポリアクリルアミド−尿素ゲル
電気泳動により分離した。上記ＢＵＳ２１プライマーを
用いて生成されたＰＣＡ３^dd3 ゲノム配列ラダーを、サ
イズ・マーカーとして使用した。ゲルを乾燥させ、そし
て約３日間−８０℃において２つの増幅性スクリーンを
用いてＨｙｐｅｒｆｉｌｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に露出
させた。

【００８９】上記プライマー伸張分析のための代表的な
実験の結果を図３Ａ中に示す。２つの前立腺特異的伸張
生成物が図３Ａ中で同定されることができた（レーン
４，５，７，８、及び９）。最も長い伸張生成物から演
繹された転写開始部位を、＋１とし、そしてその結果、
最も小さい断片は、＋３４位における別の開始部位から
開始された。図３Ｂ中に示すように、Ｓ１ヌクレアーゼ
を用いたＲＮａｓｅ保護分析は、２つの前立腺特異的Ｓ
１−保護断片を現した（図３Ｂ、レーン１〜４）。最も
多量の生成物は、プライマー伸張分析により同定された
転写開始部位（＋１位）に対して＋３位から開始され
た。僅かなＳ１保護断片は、＋１２位にある別の開始部
位から開始された。同定された主要な及び僅かな転写開
始部位を図４中ＰＣＡ３^dd3 ヌクレオチド配列の上に示
す。

【００９０】実施例４ヒトＰＣＡ３^dd3 プロモーターの転写活性プロモーター活性を証明するために、ＰＣＡ３^dd3
５′−フランキング領域を、ヒト成長ホルモン（ｈＧ
Ｈ）リポーター遺伝子の上流にクローニングした（構築
物ｐＤＤＧＨ−１．９、−４３３〜＋６２位）。簡単に
言えば、プロモーターをもたないプラスミドｐ０ＧＨ
（ＮｉｃｈｏｌｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅ）を、上記ヒト
成長ホルモン遺伝子の上流のポリリンカー内にＰＣＡ３
^dd3 プロモーター断片をクローニングするために使用し
た。ＰＣＡ３^dd3 プロモーター断片を、５′ＨｉｎｄII
I −タグ付、及び３′ＢａｍＨＩ−タグ付プライマー、
並びにテンプレートとして正常ヒト・ゲノムＤＮＡを用
いて、ＰＣＲにより作製した。次に、これらの断片を、
ＨｉｎｄIII とＢａｍＨＩで解裂させ、そして標準的な
手順を用いて、ｐ０ＧＨ内にクローニングした。突然変
異体プロモーター構築物を、“ＧｅｎｅＥｄｉｔｏ
ｒ”インビトロ部位指定突然変異誘発系（Ｐｒｏｍｅｇ
ａ）を用いて作製した。異なる細胞系のｈＧＨ分泌能は
変動しうるので、各細胞系のために、ＰＣＡ３^dd3 −ｈ
ＧＨ構築物の活性を、ＨＳＶ−チミジン・キナーゼ遺伝
子の構成的プロモーターにより駆動されるヒト成長ホル
モン遺伝子を含むプラスミドｐＴＫＧＨ（Selden et a
l., Mol-Cell.Biol. 1986）の活性と比較した。

【００９１】次に、上記構築物を、以下の２つの細胞系
の一過性トランスフェクションにおいて使用した：ＰＣ
−３４６Ｃ、（Dr.W.van Weerden; Dept. of Urology,
Erasmus University Rotterdam, The Netherlands によ
り好意により提供された）ヒト前立腺腺癌細胞系ＬＮＣ
ａＰの誘導体、及びＴＳＵ−ｐｒ１。両細胞系を、５％
ＣＯ₂ 及び３７℃の雰囲気中、１０％胎児ウシ血清
（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を補った、ＲＰＭＩ１６４０培
地中で培養した。一過性トランスフェクションのため
に、ＬＮＣａＰ細胞を、トランスフェクションの２日前
に、１０cm皿当り１×１０⁶ 細胞の密度で接種し、そし
てＴＳＵ−ｐｒ１を、トランスフェクションの１日前
に、１０cm皿当り５×１０⁵ 細胞の密度で接種した。各
トランスフェクションのために、３マイクログラムの適
当なＰＣＡ３^dd3 −ｈＧＨ構築物と２．３マイクログラ
ムのｐＣＨ１１０（内部マーカー）を、室温で１５分間
無血清培地中、Ｆｕｇｅｎｅ−６試薬（Ｂｏｅｒｉｎｇ
ｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）と複合体化させた。このＦｕ
ｇｅｎｅ−６／ＤＮＡ複合体を、上記細胞培養物に添加
し、そして細胞を、さらに７２時間培養した。トランス
フェクションを、２連で少なくとも３回行った。トラン
スフェクション後、培地を集め、そして使用前−２０℃
で保存した。上記培地中のヒト成長ホルモンの分泌を、
製造者の指示に従って、２部位蛍光免疫計測Ｄｅｌｆｉ
ａｈＧＨアッセイ・キット（Wallac Oy, Turku, Finl
and ）を用いて測定した。ｈＧＨ値を、対応の細胞抽出
物中で計測されたベータ−ガラクトシダーゼ活性に対し
て正規化した。ｈＧＨ値、及び比誘導値を、平均とその
平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表す。

【００９２】ｐＤＤＧＨ−１．９がＬＮＣａＰ細胞、す
なわちＰＣＡ３^dd3 ｍＲＮＡを発現するヒト前立腺癌
腫細胞系内にトランスフェクトされたとき、弱いプロモ
ーター活性が見られた（図５）。すなわち、ｈＧＨの生
産は、ＨＳＶ−ｔｋ駆動ｈＧＨ生産の約２０％であっ
た。プロモーターは、方向性をもたないで機能すること
が知られている。それ故、上記ｐＤＤＧＨ−１．９プロ
モーター配列を、ｈＧＨ遺伝子の上流に逆方向でクロー
ニングした（ｐＤＤＧＨ−２．１、＋６２〜−４３３
位）。このｐＤＤＧＨ−２．１プロモーター構築物はＬ
ＮＣａＰ細胞内で不活性であり、そのうえ、ｈＧＨ生産
は、プロモーターをもたないｐ０ＧＨ構築物によりトラ
ンスフェクトされた細胞内で見られた生産を下廻った。
５００−bpsのＰＣＡ３^dd3 プロモーターの上流の配列
（−４３３〜＋６２）は、ＰＣＡ３^dd ³ プロモーター活
性に対し効果を全くもたなかった（図５、構築物ｐＤＤ
ＧＨ−１．５、−１，９００〜＋６２位）。

【００９３】５００bps のＰＣＡ３^dd3 プロモーター内
の領域がＰＣＡ３^dd3 プロモーター活性に寄与するかど
うかを調べるために、一連の５′欠失構築物を作製し
た。ＬＮＣａＰ細胞内への欠失構築物ｐＤＤＧＨ−１．
１０，−１．１１、及び−１．１２のトランスフェクシ
ョンは、ｐＤＤＧＨ−１．９において観察された活性に
比較して、上昇したプロモーター活性をもたらした（図
５）。構築物ｐＤＤＧＨ−１．１２（−１５２〜＋６
２）は、テストした全ての構築物の中で最も高いＰＣＡ
３^dd3 プロモーター活性を示した。後者の構築物の短縮
化は、低下したプロモーター活性を導き（ｐＤＤＧＨ−
１．１６）、そして構築物ｐＤＤＧＨ−１．１８（−４
１〜＋６２位）において完全な活性損失を導いた。

【００９４】実施例５ＰＣＡ３^dd3 プロモーター活性の細胞タイプ特異性観察されたＰＣＡ３^dd3 プロモーター活性の特異性を定
めるために、基本活性を示すプロモーター構築物ｐＤＤ
ＧＨ−１．９、及び最大活性を示すプロモーター構築物
ｐＤＤＧＨ−１．１２を、異なる組織起源をもつ細胞系
にトランスフェクトさせた。次に、ヒト成長ホルモンの
生産を、各細胞系において計測した。上記実験のための
プロトコールは、実施例４に記載した。上記実験のため
に使用された異なる細胞系は、以下のようなものであっ
た：ＰＣ−３４６Ｃ、ヒト前立腺腺癌細胞系ＬＮＣａＰ
の誘導体；ＴＳＵ−ｐｒ１、ヒト前立腺癌細胞系；ＳＷ
８００、ヒト膀胱癌細胞系；ＨＴ２９、ヒト結腸癌腫細
胞系；ＳＫＲＣ−７、腎細胞癌腫細胞系、及びＡ４３
１、外陰類表皮腫（ｖｕｌｖａｌｅｐｉｄｅｒｍｏｉ
ｄ）癌細胞系。

【００９５】ｐＤＤＧＨ−１．９のＰＣＡ３^dd3 プロモ
ーター活性は、ＬＮＣａＰ細胞内に見られたが（図
６）、Ａ４３１（外陰癌腫）、ＨＴ−２９（結腸癌
腫）、ＳＫＲＣ−７（腎細胞癌腫）、及びＳＷ８００
（膀胱癌腫）細胞内では見られなかった。重要なことに
は、このプロモーター構築物は、ＰＣＡ３^dd3 ｍＲＮ
Ａを発現しない前立腺癌腫細胞系内でもサイレントであ
る（ＴＳＵ−ｐｒ１、図６、及びＰＣ−３、データを示
さず）。しかしながら、短縮プロモーター構築物ｐＤＤ
ＧＨ−１．１２の上昇したプロモーター活性が、ＰＣＡ
３^dd3 −ネガティブ細胞系内でも観察された。但し、そ
の最大プロモーター活性は、ＬＮＣａＰ細胞内のものよ
りも有意に低かった。

【００９６】実施例６部位指定突然変異誘発、及びＰＣＡ３^dd3 プロモーター
活性に対する効果ＰＣＡ３^dd3 プロモーター要素をさらに分析し、そして
そのプロモーター活性の潜在的な意義を同定するため
に、リポーター構築物ｐＤＤＧＨ−１．９、及びｐＤＤ
ＧＨ−１．１２内でのいくつかの塩基置換突然変異体を
作製した。塩基置換を、１．００のコア類似性及び０．
９０のマトリックス類似性をもって、ＴＲＡＮＳＦＡＣ
３．５マトリックス（Quandt et al., Nucleic Acids
Res. 1995）を用いて、ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒプロ
グラムにより推定されたようなモチーフ内に導入した
（図１Ｂ参照）。上記塩基置換の位置、及び性質を図７
Ａ中に示す。プロモーター突然変異体を、ＬＮＣａＰ細
胞内に一過性トランスフェクトさせた。次に、ｈＧＨ生
産とプロモーター活性を、実施例４中に記載したように
計測した。上記プロモーターの近位領域内の塩基置換
は、その活性を明らかに低下させた（図７Ｂ）。ＮＦ−
１配列モチーフ（−６１〜−６０間）内の突然変異は、
１．９／６０ａ構築物と１．１２／６０ａ構築物のプロ
モーター活性を、それぞれ、２７％と１８％に低下さ
せ、そしてＥ−ボックス・モチーフ（−３５〜−３３
間）内の突然変異は、リポーター構築物１．９／６０ｃ
と１．１２／６０ｃからの転写を、それぞれ、４３％と
６７％に低下させた。これらのデータは、ＰＣＡ３^dd3
プロモーターの近位領域が、この遺伝子の転写の開始に
機能的に関係することを示し、これは、図５中に示すよ
うな、５′欠失分析、並びに−８９〜＋６２構築物（ｐ
ＤＤＧＨ−１．１６）のプロモーター活性における有意
な低下、及び−４１〜＋６２構築物（ｐＤＤＧＨ−１．
１８）内のプロモーター活性のスプライシングを確証す
る。同様に、これらの結果は、有意な前立腺特異的プロ
モーター活性をもつハーバリング配列として−７０〜−
３０の領域を際立たせる。

【００９７】ＰＣＡ３^dd3 遺伝子は、先に、前立腺腺癌
腫のほとんどに高く過剰発現されることが示された（Bu
ssemakers et al., Cancer Res. 1999a ）。これらのデ
ータは、ＰＣＡ３^dd3 ｍＲＮＡ発現が、ユニークな前
立腺癌特異的転写メカニズムにより調節されることを示
唆する。ヌクレオチド配列の分析は、いずれの自明のプ
ロモーター要求をも現わさなかった。知られたイニシエ
ーター・モチーフ、ＴＡＴＡ−ボックス、ＣＡＡＴ−ボ
ックス、及びＧＣ−リッチ領域のいずれも、ＰＣＡ３
^dd3 プロモーター内のコンセンサス位置に存在しなかっ
た。さらに、ＰＣＡ３^dd3 プロモーターは、主に単一部
位において転写を開始させるが、特徴付けされたイニシ
エーター要素を欠いている。ＰＣＡ３^dd3 プロモータ
ー、イニシエーターなし、そしてＧＣ−リッチでない特
性を示すいくつかのＴＡＴＡなしプロモーターが記載さ
れている（Brakebusch et al., J.Biol.Chem. 1997）。

【００９８】いずれにしても、本明細書に提供したデー
タは、ＰＣＡ３^dd3 遺伝子プロモーターが組織及び細胞
タイプに特異的であり、そしてそれ故、真正な前立腺癌
特異的プロモーターであることを示唆している。しかし
ながら、テストしたＰＣＡ３ ^dd3 プロモーター構築物の
絶対プロモーター活性は、ＨＳＶ−ｔｋプロモーター活
性に比較してむしろ低い。これは、前立腺癌細胞内での
高いＰＣＡ３^dd3 発現とは対照的に、ＬＮＣａＰ細胞内
で観察される低レベルの内因性ＰＣＡ３^dd3 ｍＲＮＡ発
現と互いに関連する。

【００９９】結論結論として、本発明は、ＰＣＡ３^dd3 遺伝子プロモータ
ーのクローニング、及び最初の特徴付けを示す。このプ
ロモーターは、治療用途のために興味深いツールであ
る。

【０１００】本発明を、以上、その好ましい態様により
記載してきたが、本発明は、添付クレームに定める本発
明の本質及び性質から逸脱せずに修正されうる。

【０１０１】

【化１】

【０１０２】

【化２】

【０１０３】

【化３】

【０１０４】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> UNIVERSITY HOSPITAL NIJMEGEN <120> NUCLEIC ACID MOLECULES COMPRISING THE PROMOTER FOR PCAdd3, A NEW PROSTATE ANTIGEN, AND USES THEREOF <130> B016163 <140> 2001-164963 <141> 2001-05-31 <160> 5 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 580 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 cactagagga gcaccttagg aattgacctg tggatctcaa cttcgttagg gttaaaagat 60 tatttgttgg gcaagggtag gaccaataac ctcattcaca atgcattcat tgattcgttg 120 attcacagag caaatacttc tgaacaactc ctgtgtttct ggcactgttc taggcaccag 180 tgatatagga gccaacaaga cagacatgtc actgctctca tggagctgca tttcagtgca 240 tggaggcaga aaacaaacaa acaaataaat aaataaataa ataaataaga taatttttaa 300 tagcaacgtg tcaacatagt gtgacgggaa ggagcatgat gagacagaag gaaggtttaa 360 actgggaaat ctgagaaatg gtatggttgt atgtgggttg gcattcttgc atgatgggag 420 tggccacctg ctttcatatt ctgaagtcag agtgttccag acagaagaaa tagcaagtgc 480 cgagaagctg gcatcagaaa aacagagggg agatttgtgt ggctgcagcc gagggagacc 540 aggaagatct gcatggtggg aaggacctga tgatacagag 580 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide <400> 2 ctctgtatca tcaggtcctt cc 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide <400> 3 ctggaaatgt gcaaaaacat 20 <210> 4 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide <400> 4 ccttcccacc atgcagatct tcctggtctc cctcggctgc agccacacaa 50 <210> 5 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide <400> 5 agtgttccag acagaagaaa tagcaagtgc cgagaagctg gcatcagaaa 50 本発明の他の目的、利点、及び特徴は、添付図面を参照
して上記の非限定的説明を読む間により明確になってい
るはずである。添付図面は、例示であり、本発明の範囲
を限定するものと解釈されてはならない。

【０１０５】本発明をこれまで一般的に記載してきた
が、例示により、本発明の好ましい態様を示す、添付図
面を参照のこと。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ＰＣＡ３^dd3 プロモーターとエクソン
１領域のヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
（Ａ）ＰＣＡ３^dd3 ゲノム・クローンｐＦＳ２８，ｐＧ
Ｖ６１、及びｐＭＥ４．６の制限酵素地図。エクソン１
の位置を灰色ボックスにより示す。（Ｂ）ＰＣＡ３^dd3
遺伝子の転写開始部位（１位、^* ）を取り囲るゲノム領
域のヌクレオチド配列。エクソン１配列に下線を引く。
可能性のある転写因子結合部位は、１．００のコア類似
性と０．９０超のマトリックス類似体をもって、ＴＲＡ
ＮＳＦＡＣ３．５マトリックス（Quandt et al., Nuc
leic Acids Res. 1995）を用いたＭａｔＩｎｓｐｅｃｔ
ｏｒプログラムにより同定され、そしてボックスにより
示される。略号：ＣＣＡＡＴ：ＣＡＡＴ−ボックス；Ｃ
／ＥＢＰベータ：ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパ
ク質ベータ；Ｅ−ボックス：ｂＨＬＨ結合部位；ＦＫＨ
Ｌ：フォークヘッド同族体；ＦＲＥＡＣ：フォークヘッ
ド関連アクチベーター；ＮＦ−１：核因子１；Ｔｈ１／
Ｅ４７：シング１／Ｅ４７（ｂＨＬＨ）ヘテロダイマ
ー。

【図２】図２は、ＰＣＡ３^dd3 転写開始部位の決定にお
いて使用された特定のオリゴヌクレオチドのヌクレオチ
ド配列（配列番号２〜４）を示す。ＢＵＳ２とＢＵＳ７
配列は、プライマー伸張分析のために使用されたＰＣＡ
３^dd3 特異的アンチセンス・オリゴヌクレオチドであ
る。ＢＵＳ２１配列は、ＲＮａｓｅ保護アッセイのため
に使用されたＰＣＡ３^dd3 特異的オリゴヌクレオチドで
ある。

【図３】図３は、ＰＣＡ３^dd3 転写開始部位の決定のた
めの２つの相補実験（プライマー伸張分析とＲＮａｓｅ
保護アッセイ）の結果を示す。（Ａ）ＰＣＡ３^dd3
５′−フランキング領域のプライマー伸張分析。２０μ
ｇの、前立腺腺癌（レーン４，５，７，８、及び９）、
肝（レーン３、及び１０）、又は肺（レーン２、及び１
１）組織からの全ＲＮＡ又はｔＲＮＡ（レーン１、及び
６）を、図示したプライマーとしてオリゴヌクレオチド
ＢＵＳ７（レーン１、及び５）、及びＢＵＳ（レーン６
−１１）を用いてプライマー伸張のために使用した。プ
ライマー伸張生成物を、矢印により示す（←、ＢＵＳ、
及び←／／＋、ＢＵＳ７生成物）。ＢＵＳ７でプライム
したＰＣＡ３^dd3 ゲノム・クローンｐＭＥ１．５Ｓ３の
ＤＮＡ配列ラダーを、サイズ・マーカーとして使用し
た。（Ｂ）ＲＮａｓｅ（Ｓ１ヌクレアーゼ）保護分析の
ために、２５２bpの放射標識された１本鎖ＤＮＡプロー
ブを、プライマーとしてＢＵＳ２１を用いて、ＰＣＡ３
^dd3 のエクソン１とその５′−フランキング領域を含
む、プラスミドｐＭＥ４．６から合成した。ＨｉｎｃII
消化プローブを、前立腺腺癌（レーン１−４）、肝（レ
ーン５）、又は肺（レーン６）組織からの全ＲＮＡ又は
ｔＲＮＡ（レーン７）４０μｇにハイブリダイズさせ、
そして３７℃（レーン１−７）又は３０℃（データを示
さず）においてＳ１ヌクレアーゼで処理した。矢印は保
護された断片を指す。ＢＵＳ２１でプライムされたＰＣ
Ａ３^dd3 ゲノム・クローンｐＭＥ４．６のＤＮＡ配列ラ
ダーを、サイズ・マーカーとして使用した。

【図４】図４は、ＰＣＡ３^dd3 転写開始部位を取り囲む
ヌクレオチド配列（配列番号５）を示す。プライマー伸
張生成物を、三角により（黒三角、主要な開始部位；白
三角、僅かな部位）、そしてＳ１ヌクレアーゼ保護され
た断片を、菱形（黒菱形、主要な開始部位；白菱形、僅
かな部位）により示す。

【図５】図５は、一過性トランスフェクション後の、２
つのヒト前立腺癌細胞系ＴＳＵ−ｐｒ１とＬＮ−ＣａＰ
におけるＰＣＡ３^dd3 プロモーター活性を示す。一過性
トランスフェクションのために使用したＰＣＡ３^dd3 プ
ロモーター構築物を左側に示す。細い線はベクターの配
列を示し、ボックスはヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）遺伝
子を示し、そしてハッチングしたボックスはＰＣＡ３
^dd3 プロモーター断片を示す。転写開始部位に対する位
置を示す。ＬＮＣａＰ細胞（ＰＣＡ３^dd3 −ポジティ
ブ、黒バー）及びＴＳＵ−ｐｒ１細胞（ＰＣＡ３^dd3 −
ネガティブ、明バー）内におけるヒト成長ホルモンの生
産を、対照としてｐＴＫＧＨ（ＨＳＶ−ｔｋプロモータ
ーにより駆動されたｈＧＨ遺伝子の発現）を用いて計算
した。誤差バーは、２連で行った３回の独立した実験の
平均の標準誤差を示す。

【図６】図６は、異なる組織起源からの細胞系における
ＰＣＡ３^dd3 プロモーター活性の特異性を示す。ｐＤＤ
ＧＨ−１．９及びｐＤＤＧＨ−１．１２ＰＣＡ３^dd3
−プロモーター構築物を、ＬＮＣａＰ（Ｌ），ＴＳＵ−
ｐｒ１（Ｔ），Ａ４３１（Ａ），ＳＫＲＣ−７（Ｓ
Ｋ），ＨＴ−２９（Ｈ）、及びＳＷ８００（ＳＷ）細胞
内に一過性トランスフェクトさせた。ＰＣＡ３^dd3 プロ
モーター活性、すなわち、ｈＧＨ生産を、図５に記載し
たように測定した。

【図７】図７は、ＰＣＡ３^dd3 プロモーター活性に対す
る部位指定突然変異誘発の効果を示す。（Ａ）ＰＣＡ３
^dd3 最小プロモーター構築物（ｐＤＤＧＨ−１．９と−
１．１２）を、転写開始部位に対するそれらの位置に対
応する数とともに線として示す。突然変異体構築物を以
下に示す。転写開始部位に対する上記突然変異の位置、
及び置換された塩基を、各構築物の左側に示す。（Ｂ）
プロモーター突然変異体を、ＬＮＣａＰ細胞内に一過性
トランスフェクトさせ、そしてｈＧＨ生産とプロモータ
ー活性を図５中に記載したように測定した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 1/68 5/00 Ａ (72)発明者ゲラルドベルホークオランダ国，6581 エスエルマデン，ホイシェルフ 15 (72)発明者ジャックアー．シャルケンオランダ国，6524 エルハーニェメゲン，マドウーレルシュトラーセ 10 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA12 CA04 CA09 DA02 EA04 FA02 GA11 4B063 QA01 QA18 QQ20 QQ91 QR55 QR60 QR62 QR72 QR80 QS24 QS28 QS34 4B065 AA93X AA93Y AB01 BA02 CA44

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】図１のヌクレオチド位−８９〜−１間に
記載の配列を含む単離プロモーター配列であって前立腺
特異的転写調節を可能にするもの。
【請求項２】前記配列が以下の：ａ）図１の−８９〜＋１；ｂ）図１の−８９〜＋６２；ｃ）図１の−１５２〜−１；ｄ）図１の−１５２〜＋１；ｅ）図１の−１５２〜＋６２；ｆ）図１の−２５４〜−１；ｇ）図１の−２５４〜＋１；ｈ）図１の−２５４〜＋６２；ｉ）図１の−３６６〜−１；ｊ）図１の−３６６〜＋１；ｋ）図１の−３６６〜＋６２；ｌ）図１の−４３３〜−１；ｍ）図１の−４３３〜＋１；ｎ）図１の−４３３〜＋６２；ｏ）図１の−４６０〜−１；ｐ）図１の−４６０〜＋１；及びｑ）図１の−４６０〜＋６２；から成る群から選ばれる、請求項１に記載の単離プロモ
ーター配列。
【請求項３】異種配列に作用可能な状態で連結され
た、請求項１に記載のプロモーター配列を含むベクタ
ー。
【請求項４】異種配列に作用可能な状態で連結され
た、請求項２に記載のプロモーター配列を含むベクタ
ー。
【請求項５】請求項３に記載のベクターを含む細胞。
【請求項６】請求項４に記載のベクターを含む細胞。
【請求項７】前立腺細胞内の異種配列の転写を調節す
る方法であって、上記異種配列を請求項１に記載のプロ
モーター配列の制御に供するように請求項１に記載の上
記プロモーター配列の下流に上記異種配列を連結し、そ
のように連結された異種配列を、上記核酸のプロモータ
ー活性を促進することができる細胞内に導入し、そして
上記異種配列の転写レベルを評価する、前記方法。
【請求項８】インビトロにおいて前立腺癌細胞内の転
写の発現を調節する方法であって、請求項１に記載のプ
ロモーター配列の転写活性を調節することができる作用
物質を、上記細胞内に投与することを含む、前記方法。
【請求項９】インビトロにおいて前立腺細胞内の転写
の発現を調節する作用物質を同定する方法であって、候
補化合物の存在下での請求項１に記載のプロモーター配
列の転写活性対不存在下でのものと比較評価することを
含み、ここで、上記プロモーター配列の転写活性を調節
する作用物質が、その転写活性がその化合物の不存在下
に比較して存在下で有意差があるときに、選択される前
記方法。
【請求項１０】前記前立腺細胞が前立腺癌細胞であ
る、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】前記異種配列が、リポーター遺伝子を
コードする配列、及び治療用配列から選ばれる、請求項
３又は４に記載のベクター。
【請求項１２】前記治療用配列の発現が、その内でそ
れが発現されているところの細胞の増殖を阻害し又は殺
す、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】前記治療用配列が自殺遺伝子である、
請求項１１又は１２に記載のベクター。
【請求項１４】エンハンサー要素をさらに含む、請求
項１３に記載のベクター。
【請求項１５】患者のサンプル中の前立腺癌を診断す
るための、請求項１又は２に記載の核酸分子の使用方
法。