DE10054972A1

DE10054972A1 - Diagnose von mit humos assoziierten Krankheiten

Info

Publication number: DE10054972A1
Application number: DE2000154972
Authority: DE
Inventors: Alexander Olek; Christian Piepenbrock; Kurt Berlin
Original assignee: Epigenomics AG
Current assignee: Epigenomics AG
Priority date: 2000-11-06
Filing date: 2000-11-06
Publication date: 2002-06-06
Also published as: US20040048278A1; WO2002036604A3; WO2002036604A2; AU2002214041A1; EP1339873A2; ATE350489T1; EP1339873B1; DE50111824D1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die chemisch modifizierte genomische Sequenz des humos-Gens, gegen die Sequenz gerichtete Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere zur Detektion des Cytosin-Methylierungszustandes des humos-Gens sowie ein Verfahren zur Ermittlung von genetischen und/oder epigenetischen Parametern des humos-Gens.

Description

Gebiet der Erfindung

Die nach den methodischen Entwicklungen der letzten Jahre in der Molekularbiologie gut studierten Beobachtungsebenen sind die Gene selbst, die Übersetzung dieser Gene in RNA und die daraus entstehenden Proteine. Wann im Laufe der Entwicklung eines Individuums welches Gen angeschaltet wird und wie Aktivieren und Inhibieren bestimmter Gene in be stimmten Zellen und Geweben gesteuert wird, ist mit Ausmaß und Charakter der Methylie rung der Gene bzw. des Genoms korrelierbar. Insofern äußern sich pathogene Zustände in einem veränderten Methylierungsmuster einzelner Gene oder des Genoms.

Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuren, Oligonukleotide, PNA-Oligomere und ein Verfahren zur Diagnose von Erkrankungen, die mit dem genetischen und/oder epigenetischen Parametern des Onkogens humos und insbesondere dessen Methylierungsstatus in Zusam menhang stehen.

Stand der Technik

Das Moloney murine sarcoma virus (MSV) gehört zu den Replikations-inaktiven Retroviren, die Fibroblasten in Kultur transformieren und Sarkome in vivo induzieren. Entstanden ist das Virus durch die Rekombination zwischen dem Moloney murine leukemia virus und einer aus Maus-Zellen entstammenden Sequenz. Das aus Maus-Zellen stammende Segment des MSV, auch als v-mos bezeichnet, wird für die Induktion und Aufrechterhaltung der viralen Trans formation benötigt. Homologe Gene zu v-mos sind das ebenfalls aus der Maus stammende c- mos und das humane c-mos (humos), welches dank der evolutionären Konservierung von viralen Onkogenen unter den Vertebratenarten auf dem menschlichen Chromosom 8q11-12 kartiert werden konnte (Prakash K, McBride OW, Swan DC, Devare SG, Tronick SR, Aaronson SA. Molecular cloning and chromosomal mapping of a human locus related to the trans forming gene of Moloney murine sarcoma virus. Proc Natl Acad Sci USA. 1982 Sep; 79(17): 5210-4; Watson R, Oskarsson M, Vande Woude GF. Human DNA sequence ho mologous to the transforming gene (mos) of Moloney murine sarcoma virus. Proc Natl Acad Sci USA. 1982 Jul; 79(13): 4078-82.). Das c-mos Proto-Onkogen wird bei einer signifikanten Anzahl von Lungenkarzinomen exprimiert und spielt möglicherweise bei deren Entwicklung eine Rolle (Athanasiou A, Gorgoulis VG, Zacharatos P, Mariatos G, Kotsinas A, Liloglou T, Karameris A, Foukas P, Manolis EN, Field JK, Kittas C. c-mos immunoreactivity is an indi cator of good prognosis in lung cancer. Histopathology. 2000 Jul; 37(1): 45-54). Eine Assozia tion mit Kehlkopfkrebs wird ebenfalls vermutet (Dolcetti R, Pelucchi S, Maestro R, Rizzo S, Pastore A, Boiocchi M. Proto-oncogene allelic variations in human squamous cell carcinomas of the larynx. Eur Arch Otorhinolaryngol. 1991; 248(5): 279-85). Die Beteiligung von c-mos an akuter myeloblastischer Leukämie wird dagegen kontrovers diskutiert (Morris cm, Bowen J, Fitzgerald PH. Localization of human c-mos to chromosome band 8q11 in leukemic cells with the t(8; 21) (q22; q22). Hum Genet. 1989 Mar; 81(4): 339-42). Weiterhin wird eine Beteili gung von c-mos an chronischer myelocystischer Leukämie (Huerre C, Despoisse S. Gilgen krantz S. Lenoir GM, Junien C. c-Ha-ras1 is not deleted in aniridia-Wilms' tumour associati on. Nature. 1983 Oct 13-19; 305(5935): 638-41) sowie an dem Burkitt's Lymphom vermutet (Klein G. The role of gene dosage and genetic transpositions in carcinogenesis. Nature. 1981 Nov 26; 294(5839): 313-8).

5-Methylcytosin ist die häufigste kovalent modifizierte Base in der DNA eukaryotischer Zel len. Sie spielt beispielsweise eine Rolle in der Regulation der Transkription, beim genetischen Imprinting und in der Tumorgenese. Die Identifizierung von 5-Methylcytosin als Bestandteil genetischer Information ist daher von erheblichem Interesse. 5-Methylcytosin-Positionen können jedoch nicht durch Sequenzierung identifiziert werden, da 5-Methylcytosin das glei che Basenpaarungsverhalten aufweist wie Cytosin. Darüber hinaus geht bei einer PCR- Amplifikation die epigenetische Information, welche die 5-Methylcytosine tragen, vollständig verloren.

Eine relativ neue und die mittlerweile am häufigsten angewandte Methode zur Untersuchung von DNA auf 5-Methylcytosin beruht auf der spezifischen Reaktion von Bisulfit mit Cytosin, das nach anschließender alkalischer Hydrolyse in Uracil umgewandelt wird, welches in sei nem Basenpaarungsverhalten dem Thymidin entspricht. 5-Methylcytosin wird dagegen unter diesen Bedingungen nicht modifiziert. Damit wird die ursprüngliche DNA so umgewandelt, dass Methylcytosin, welches ursprünglich durch sein Hybridisierungsverhalten vom Cytosin nicht unterschieden werden kann, jetzt durch "normale" molekularbiologische Techniken als einzig verbliebenes Cytosin beispielsweise durch Amplifikation und Hybridisierung oder Se quenzierung nachgewiesen werden kann. Alle diese Techniken beruhen auf Basenpaarung, welche jetzt voll ausgenutzt wird. Der Stand der Technik, was die Empfindlichkeit betrifft, wird durch ein Verfahren definiert, welches die zu untersuchende DNA in einer Agarose- Matrix einschließt, dadurch die Diffusion und Renaturierung der DNA (Bisulfit reagiert nur an einzelsträngiger DNA) verhindert und alle Fällungs- und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse ersetzt (Olek A, Oswald J, Walter J. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 Dec 15; 24(24): 5064-6). Mit dieser Methode können einzelne Zellen untersucht werden, was das Potential der Methode veranschaulicht. Allerdings werden bisher nur einzelne Regionen bis etwa 3000 Basenpaare Länge untersucht, eine globale Untersuchung von Zellen auf Tausenden von möglichen Me thylierungsanalysen ist nicht möglich. Allerdings kann auch dieses Verfahren keine sehr klei nen Fragmente aus geringen Probenmengen zuverlässig analysieren. Diese gehen trotz Diffu sionsschutz durch die Matrix verloren.

Eine Übersicht über die weiteren bekannten Möglichkeiten, 5-Methylcytosine nachzuweisen, kann aus dem folgenden Übersichtsartikel entnommen werden: Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2255.

Die Bisulfit-Technik wird bisher bis auf wenige Ausnahmen (z. B. Zeschnigk M, Lich C, Bui ting K, Doerfler W, Horsthemke B. A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman and Prader-Willi syndrome based on allelic methylation differences at the SNRPN locus. Eur J Hum Genet. 1997 Mar-Apr; 5(2): 94-8) nur in der Forschung angewendet. Immer aber werden kurze, spezifische Stücke eines bekannten Gens nach einer Bisulfit-Behandlung amplifiziert und entweder komplett sequenziert (Olek A, Walter J. The pre-implantation ontogeny of the H19 methylation imprint. Nat Genet. 1997 Nov; 17(3):275-6) oder einzelne Cytosin- Positionen durch eine "Primer-Extension-Reaktion" (Gonzalgo ML, Jones PA. Rapid quanti tation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE). Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15; 25(12): 2529-31, WO 95/00669) oder einen Enzymschnitt (Xiong Z, Laird PW. COBRA: a sensitive and quantitati ve DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15; 25(12): 2532-4) nachgewiesen.

dem ist auch der Nachweis durch Hybridisierung beschrieben worden (Olek et al., WO 99 28498).

Weitere Publikationen, die sich mit der Anwendung der Bisulfit-Technik zum Methylierungs nachweis bei einzelnen Genen befassen, sind: Grigg G, Clark S. Sequencing 5-methylcytosine residues in genomic DNA. Bioessays. 1994 Jun; 16(6): 431-6, 431; Zeschnigk M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke B, Doerfler W. Imprinted segments in the human genome: different DNA methylation patterns in the Prader-Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method. Hum Mol Genet. 1997 Mar; 6(3): 387-95; Feil R, Charlton J, Bird AP, Walter J, Reik W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 1994 Feb 25; 22(4): 695-6; Martin V, Ribieras S. Song-Wang X, Rio MC, Dante R. Genomic sequencing indicates a correlation between DNA hypomethylation in the 5' region of the pS2 gene and its expression in human breast cancer cell lines. Gene. 1995 May 19; 157(1-2): 261-4; WO 97 46705, WO 95 15373 und WO 97/45560.

Eine Übersicht über den Stand der Technik in der Oligomer Array Herstellung läßt sich aus einer im Januar 1999 erschienenen Sonderausgabe von Nature Genetics (Nature Genetics Supplement, Volume 21, January 1999) und der dort zitierten Literatur entnehmen.

Für die Abtastung eines immobilisierten DNA-Arrays sind vielfach fluoreszenzmarkierte Sonden verwendet worden. Besonders geeignet für Fluoreszenzmarkierungen ist das einfache Anbringen von Cy3 und Cy5 Farbstoffen am 5'-OH der jeweiligen Sonde. Die Detektion der Fluoreszenz der hybridisierten Sonden erfolgt beispielsweise über ein Konfokalmikroskop. Die Farbstoffe Cy3 und Cy5 sind, neben vielen anderen, kommerziell erhältlich.

Matrix-assistierte Laser Desorptions/Ionisations-Massenspektrometrie (MALDI-TOF) ist eine sehr leistungsfähige Entwicklung für die Analyse von Biomolekülen (Karas M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem. 1988 Oct 15; 60(20): 2299-301). Ein Analyt wird in eine lichtabsorbierende Matrix ein gebettet. Durch einen kurzen Laserpuls wird die Matrix verdampft und das Analytmolekül so unfragmentiert in die Gasphase befördert. Durch Stöße mit Matrixmolekülen wird die Ionisa tion des Analyten erreicht. Eine angelegte Spannung beschleunigt die Ionen in ein feldfreies Flugrohr. Auf Grund ihrer verschiedenen Massen werden Ionen unterschiedlich stark be schleunigt. Kleinere Ionen erreichen den Detektor früher als größere.

MALDI-TOF Spektrometrie eignet sich ausgezeichnet zur Analyse von Peptiden und Protei nen. Die Analyse von Nukleinsäuren ist etwas schwieriger (Gut I G, Beck S. DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Current Innovations and Future Trends. 1995, 1; 147-57). Für Nukleinsäuren ist die Empfindlichkeit etwa 100 mal schlechter als für Peptide und nimmt mit zunehmender Fragmentgröße überproportional ab. Für Nu kleinsäuren, die ein vielfach negativ geladenes Rückgrat haben, ist der Ionisationsprozeß durch die Matrix wesentlich ineffizienter. In der MALDI-TOF Spektrometrie spielt die Wahl der Matrix eine eminent wichtige Rolle. Für die Desorption von Peptiden sind einige sehr leistungsfähige Matrices gefunden worden, die eine sehr feine Kristallisation ergeben. Für DNA gibt es zwar mittlerweile einige ansprechende Matrices, jedoch wurde dadurch der Empfindlichkeitsunterschied nicht verringert. Der Empfindlichkeitsunterschied kann verrin gert werden, indem die DNA chemisch so modifiziert wird, dass sie einem Peptid ähnlicher wird. Phosphorothioatnukleinsäuren, bei denen die gewöhnlichen Phosphate des Rückgrats durch Thiophosphate substituiert sind, lassen sich durch einfache Alkylierungschemie in eine ladungsneutrale DNA umwandeln (Gut IG, Beck S. A procedure for selective DNA alkylation and detection by mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 1995 Apr 25; 23(8): 1367-73). Die Kopplung eines "charge tags" an diese modifizierte DNA resultiert in der Steigerung der Empfindlichkeit um den gleichen Betrag, wie er für Peptide gefunden wird. Ein weiterer Vorteil von "charge tagging" ist die erhöhte Stabilität der Analyse gegen Verunreinigungen, die den Nachweis unmodifizierter Substrate stark erschweren.

Genomische DNA wird durch Standardmethoden aus DNA von Zell-, Gewebe- oder sonsti gen Versuchsproben gewonnen. Diese Standardmethodik findet sich in Referenzen wie Fritsch und Maniatis eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.

Aufgabenstellung

Die vorliegende Erfindung soll Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere zur Detektion von Cytosin-Methylierungen und ein Verfahren bereitstellen, welches sich zur Diagnose von ge netischen und epigenetischen Parametern des humos-Gens besonders eignet. Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, dass sich insbesondere Cytosin-Methylierungsmuster zur Dia gnose von mit humos assoziierten Erkrankungen besonders eignen.

Beschreibung

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die chemisch modifizierte DNA des Gens humos, sowie Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere zur Detektion von Cytosin-Methylierungen, sowie ein Verfahren bereit zu stellen, welches sich zur Diagnose von genetischen und epige netischen Parametern des humos-Gens besonders eignet. Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, dass sich genetische und epigenetische Parameter und insbesondere das Cytosin- Methylierungsmuster des humos-Gens zur Diagnose von mit humos assoziierten Erkrankun gen besonders eignen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch eine Nukleinsäure, umfassend einen mindestens 18 Basen langen Sequenzabschnitt der chemisch vorbehandelten DNA des Gens humos ge mäß einer der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 4 gelöst. Die chemisch modifizierte Nukleinsäure konnte bisher nicht in Zusammenhang mit der Ermittlung von genetischen und epigenetische Parametern gebracht werden.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird weiterhin durch ein Oligonukleotid oder Oli gomer zur Detektion des Cytosin-Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter DNA, umfassend mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von mindestens 13 Nukleotiden gelöst, die an eine chemisch vorbehandelte DNA des Gens humos gemäß einer der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 4 hybridisiert. Die erfindungsgemäßen Oligomersonden stellen wichtige und effektive Werkzeuge dar, welche die Ermittlung der genetischen und epigenetischen Pa rameter des humos-Gens erst ermöglichen. Bevorzugterweise umfaßt die Basensequenz der Oligomere mindestens ein CpG Dinukleotid. Die Sonden können auch in Form einer PNA (Peptide Nucleic Acid) vorliegen, die besonders bevorzugte Paarungseigenschaften aufweist. Besonders bevorzugt sind erfindungsgemäße Oligonukleotide, bei denen das Cytosin des CpG Dinukleotids das 5.-9. Nukleotid vom 5'-Ende des 13 mers ist, im Falle von PNA- Oligomeren ist es bevorzugt, dass das Cytosin des CpG Dinukleotids das 4.-6. Nukleotid vom 5'-Ende des 9 mers ist.

Die erfindungsgemäßen Oligomere werden normalerweise in sogenannten Sets eingesetzt, die für jedes der CpG Dinukleotide eine der Sequenzen der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 4 minde stens ein Oligomer umfassen. Bevorzugt ist ein Set, das für jedes der CpG Dinukleotide aus einer der Seq ID No. 1 bis Seq ID No. 4 mindestens ein Oligomer umfaßt.

Weiterhin stellt die Erfindung ein Set von mindestens zwei Oligonukleotiden zur Verfügung, die als sogenannte Primeroligonukleotide zur Amplifikation von DNA-Sequenzen einer der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 4 oder Abschnitten davon eingesetzt werden können.

Im Falle der erfindungsgemäßen Sets von Oligonukleotiden ist es bevorzugt, dass mindestens ein Oligonukleotid an eine Festphase gebunden ist.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen Satz von mindestens 10 Oligomeren (Oli gonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren), die zur Detektion des Cytosin- Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter genomischer DNA (Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 4) dienen. Mit diesen Sonden ist die Diagnose von genetischen und epigeneti schen Parametern des humos-Gens möglich. Das Set von Oligomeren kann auch zur Detekti on von Single Nucleotide Polymorphismen (SNPs) in der chemisch vorbehandelten DNA des Gens humos gemäß einer der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 4 verwendet werden.

Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, dass eine von der Erfindung zur Verfügung gestellte An ordnung aus unterschiedlichen Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren (ein sogenanntes "Array") ebenfalls an eine Festphase gebunden vorliegt. Dieses Array von unterschiedlichen Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomersequenzen kann dadurch gekennzeichnet sein, dass es auf der Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet ist. Bevorzugterweise besteht die Festphasenoberfläche aus Silizium, Glas, Polystyrol, Alumini um, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold. Möglich sind jedoch auch Nitrocellulose sowie Kunststoffe wie zum Beispiel Nylon, die in Form von Kugeln oder auch als Harz- Matrizes vorliegen können.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung eines auf ei nem Trägermaterial fixierten Arrays zur Analyse in Zusammenhang mit humos assoziierten Erkrankungen, bei dem mindestens ein Oligomer gemäß der Erfindung an eine feste Phase gekoppelt wird. Verfahren zur Herstellung von solchen Arrays sind zum Beispiel aus der US 5,744,305 mittels Festphasenchemie und photolabilen Schutzgruppen bekannt.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft einen DNA-Chip zur Analyse in Zusammen hang mit humos assoziierten Erkrankungen, der mindestens eine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt. DNA-Chips sind zum Beispiel aus der US 5,837,832 be kannt.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist zudem ein Kit, das zum Beispiel aus einer Bisulfit enthaltenden Reagenz, einem Satz von Primeroligonukleotiden umfassend mindestens zwei Oligonukleotide, deren Sequenzen jeweils mindestens einen 18 Basenpaaren langen Abschnitt der im Anhang aufgeführten Basensequenzen (Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 4) entsprechen oder zu ihnen komplementär sind, Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren sowie einer Anleitung zur Durchführung und Auswertung des beschriebenen Verfahrens bestehen kann. Ein Kit im Sinne der Erfindung kann jedoch auch nur Teile der vorgenannten Bestandteile enthalten.

Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Ermittlung von genetischen und/oder epige netischen Parametern des humos-Gens durch Analyse von Cytosin-Methylierungen und Sin gle Nucleotide Polymorphismen zur Verfügung, das folgende Schritte umfaßt:
In einem ersten Verfahrensschritt wird eine genomische DNA-Probe derart chemisch behan delt, dass an der 5'-Position unmethylierte Cytosinbasen in Uracil, Thymin oder eine andere vom Hybridisierungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base verwandelt werden. Dies wird im folgenden unter chemischer Vorbehandlung verstanden.

Die zu analysierende genomische DNA wird bevorzugt aus den üblichen Quellen für DNA erhalten, wie Zellen oder Zellbestandteilen, zum Beispiel Zeillinien, Biopsine, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit, in Paraffin eingebettetes Gewebe, beispiels weise Gewebe von Augen, Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, hi stologische Objektträger oder Kombinationen davon.

Bevorzugt wird dazu die oben beschriebene Behandlung genomischer DNA mit Bisulfit (Hy drogensulfit, Disulfit) und anschließender alkalischer Hydrolyse verwendet, die zu einer Umwandlung nicht methylierter Cytosin-Nukleobasen in Uracil oder eine andere vom Basenpaa rungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base führt.

Aus dieser chemisch vorbehandelten genomischen DNA werden Fragmente unter Verwen dung von Sätzen von erfindungsgemäßen Primeroligonukleotiden und einer bevorzugterweise hitzestabilen Polymerase amplifiziert. Aus statistischen und praktikablen Erwägungen werden bevorzugterweise mehr als zehn unterschiedliche Fragmente amplifiziert, die 100-2000 Ba senpaare lang sind. Die Amplifikation von mehreren DNA-Abschnitten kann simultan in ein und demselben Reaktionsgefäß durchgeführt werden. Üblicherweise wird die Amplifikation mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens umfasst der Satz von Primeroligonu kleotiden mindestens zwei Oligonukleotide, deren Sequenzen jeweils revers komplementär oder identisch zu einem mindestens 18 Basenpaare langen Abschnitt der im Anhang (Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 4) aufgelisteten Basensequenzen sind. Die Primeroligonukleotide sind vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass sie kein CpG Dinukleotid enthalten.

Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass bei der Amplifikation mindestens ein Primeroligonu kleotid an eine Festphase gebunden ist. Die unterschiedlichen Oligonukleotid und/oder PNA- Oligomersequenzen können auf einer ebenen Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet sein, wobei die Festphasenoberfläche bevorzugt aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold besteht, wobei auch andere Materialien, wie Nitrocellulose oder Kunststoffe verwendet werden können.

Die mittels der Amplifikation erhaltenen Fragmente können eine direkt oder indirekt nach weisbare Markierung tragen. Bevorzugt sind Markierungen in Form von Fluoreszenzmarkie rungen, Radionukliden oder ablösbaren Molekülfragmenten mit typischer Masse, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden können, wobei bevorzugt ist, dass die erzeugten Fragmente zur besseren Detektierbarkeit im Massenspektrometer eine einzelne positive oder negative Nettoladung aufweisen. Der Nachweis kann mittels Matrix assistierter Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI) oder mittels Elektrospray Massen spektrometrie (ESI) durchgeführt und visualisiert werden.

Die im zweiten Verfahrensschritt erhaltenen Amplifikate werden anschließend an einen Satz von Oligonukleotiden und/oder PNA-Sonden der oder an ein Array hybridisiert. Die Hybridi sierung erfolgt dabei auf die unten angegebene Art und Weise. Der bei der Hybridisierung verwendete Satz besteht bevorzugterweise aus mindestens 10 Oligonukleotid oder PNA- Oligomer Sonden. Die Amplifikate dienen dabei als Sonden, die an vorher an einer Festphase gebundene Oligonukleotide hybridisieren. Die nicht hybridisierten Fragmente werden an schließend entfernt. Die besagten Oligonukleotide umfassen mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von 13 Nukleotiden, die revers komplementär oder identisch zu einem Ab schnitt der im Anhang aufgeführten Basensequenzen ist, der mindestens ein CpG Dinukleotid enthält. Das Cytosin des CpG Dinukleotids ist das 5. bis 9. Nukleotid vom 5'-Ende des 13 mers aus betrachtet. Für jedes CpG Dinukleotid ist ein Oligonukleotid vorhanden. Die besag ten PNA-Oligomere umfassen mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von 9 Nukleo tiden, die revers komplementär oder identisch zu einem Abschnitt der im Anhang aufgeführ ten Basensequenzen ist, der mindestens ein CpG Dinukleotid enthält. Das Cytosin des CpG Dinukleotids ist das 4. bis 6. Nukleotid vom 5'-Ende des 9 mers aus gesehen. Für jedes CpG Dinukleotid ist ein Oligonukleotid vorhanden.

Im vierten Verfahrensschritt entfernt man die nicht hybridisierten Amplifikate.

Im letzten Verfahrensschritt detektiert man die hybridisierten Amplifikate. Dabei ist bevor zugt, dass an den Amplifikaten angebrachte Markierungen an jeder Position der Festphase, an der sich eine Oligonukleotidsequenz befindet, identifizierbar sind.

Erfindungsgemäss bevorzugt ist es, dass die Markierungen der Amplifikate Fluoreszenzmar kierungen, Radionuklide oder ablösbare Molekülfragmente mit typischer Masse sind, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden können. Der Nachweis der Amplifikate, Fragmente der Amplifikate oder zu den Amplifikaten komplementäre Sonden im Massen spektrometer ist bevorzugt, wobei man die Detektion mittels Matrix assistierter Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI) oder mittels Elektrospray Massen spektrometrie (ESI) durchführen und visualisieren kann.

Zur besseren Detektierbarkeit im Massenspektrometer können die erzeugten Fragmente eine einzelne positive oder negative Nettoladung aufweisen. Bevorzugt wird das vorgenannte Verfahren zur Ermittlung von genetischen und/oder epigenetischen Parametern des humos-Gens verwendet.

Die erfindungsgemäßen Oligomere oder Arrays derselben sowie ein erfindungsgemäßes Kit sollen zur Diagnose einer mit humos assoziierten Krankheit durch Analyse von Methylie rungsmustern des humos-Gens verwendet werden. Erfindungsgemäss bevorzugt ist die Ver wendung des Verfahrens zur Diagnose bedeutender genetischer und/oder epigenetischer Pa rameter innerhalb des humos-Gens.

Das erfindungsgemäße Verfahren dient zum Beispiel der Diagnose von Krebserkrankungen, wie Lungenkarzinom, Kehlkopfkrebs, akuter myoblastischer Leukämie, chromischer mye loischer Leukämie oder dem Burkitt's Lymphom.

Auch die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 4 können für die Diagnose von genetischen und/oder epigenetischen Parametern des humos-Gens verwen det werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Diagnosti kums zur Diagnose von mit humos assoziierten Krankheiten durch Analyse von Methylie rungsmustern des humos-Gens, wobei das Diagnostikum dadurch gekennzeichnet ist, dass mindestens eine Nukleinsäure, gemäß der vorliegenden Erfindung, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen zu dessen Herstellung verwendet wird.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Diagnostikum zur von mit humos assoziierten Krankheiten durch Analyse von Methylierungsmustern des humos-Gens, das mindestens eine Nukleinsäure gemäß der Erfindung, gegebenenfalls zusammen mit ge eigneten Zusatz- und Hilfsstoffen umfaßt.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen, bei dem die mittels der Erfindung erhaltenen be deutenden genetischen und/oder epigenetischen Parameter innerhalb des humos-Gens mit einem anderen Satz genetischen und/oder epigenetischen Parameter verglichen werden kön nen und die so erhaltenen Unterschiede als Basis für eine Diagnose und/oder Prognose nach teiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen dienen.

Unter dem Begriff "Hybridisierung" im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine Bindung unter Ausbildung einer Duplex-Struktur eines Oligonukleotids an eine vollständig komple mentäre Sequenz im Sinne der Watson-Crick Basenpaarungen in der Proben DNA zu verste hen. Unter "stringenten Hybridisierungsbedingungen" sind solche Bedingungen zu verstehen, bei denen eine Hybridisierung bei 60°C in 2,5 × SSC-Puffer, gefolgt von mehreren Wasch schritten bei 37°C in einer geringeren Pufferkonzentration erfolgt und stabil bleibt.

Mit dem Begriff "funktionelle Varianten" sind alle DNA-Sequenzen bezeichnet, die komple mentär zu einer DNA-Sequenz sind, die unter stringenten Bedingungen mit der Referenzse quenz hybridisieren und eine zu dem entsprechenden erfindungsgemäßen Polypeptid ähnliche Aktivität aufweisen.

"Genetische Parameter" im Sinne dieser Erfindung sind Mutationen und Polymorphismen des humos-Gens und zu seiner Regulation weiterhin erforderlicher Sequenzen. Insbesondere sind als Mutationen Insertionen, Deletionen, Punktmutationen, Inversionen und Polymorphismen und besonders bevorzugt SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) zu bezeichnen. Polymor phismen können aber ebenso Insertionen, Deletionen oder Inversionen sein.

"Epigenetische Parameter" im Sinne dieser Erfindung sind insbesondere Cytosin- Methylierungen und weitere chemische Modifikationen von DNA-Basen des humos-Gens und zu seiner Regulation weiterhin erforderliche Sequenzen. Weitere epigenetische Parameter sind beispielsweise die Acetylierung von Histonen, die jedoch mit dem beschriebenen Verfah ren nicht direkt analysiert werden kann, sondern wiederum mit der DNA-Methylierung korre liert.

Die Erfindung soll nun im folgenden anhand der Sequenzen und Beispiele weiter verdeutlicht werden, ohne dass die Erfindung hierauf eingeschränkt wird.

Seq. ID No. 1 zeigt die Sequenz der chemisch vorbehandelten genomischen DNA des Gens humos

Seq. ID No. 2 zeigt die Sequenz einer zweiten chemisch vorbehandelten genomischen DNA des Gens humos

Seq. ID No. 3 zeigt die revers komplementäre Sequenz der Seq. ID 1 der chemisch vorbehan delten genomischen DNA des Gens humos

Seq. ID No. 4 zeigt die revers komplementäre Sequenz der Seq. ID 2 der chemisch vorbehan delten genomischen DNA des Gens humos

Seq. ID No. 5 zeigt die Sequenz eines Oligonukleotids zur Amplifizierung von humos aus Beispiel 1

Seq. ID No. 6 zeigt die Sequenz eines zweiten Oligonukleotids zur Amplifizierung von humos aus Beispiel 1

Seq. ID No. 7 zeigt die Sequenz eines Oligonukleotids zur Hybridisierung des Amplifikats von humos aus Beispiel 1

Seq. ID No. 8 zeigt die Sequenz eines zweiten Oligonukleotids zur Hybridisierung des Ampli fikats von humos aus Beispiel 1

Seq. ID No. 9 zeigt die Sequenz eines dritten Oligonukleotids zur Hybridisierung des Amplifi kats von humos aus Beispiel 1

Seq. ID No. 10 zeigt die Sequenz eines vierten Oligonukleotids zur Hybridisierung des Ampli fikats von humos aus Beispiel 1

Seq. ID No. 11 zeigt die Sequenz eines Oligonukleotids zur Hybridisierung des Amplifikats von humos aus Beispiel 1

Seq. ID No. 12 zeigt die Sequenz eines fünften Oligonukleotids zur Hybridisierung des Ampli fikats von humos aus Beispiel 1

Seq. ID No. 13 zeigt die Sequenz eines Oligonukleotids zur Hybridisierung des Amplifikats von humos aus Beispiel 1

Seq. ID No. 14 zeigt die Sequenz eines sechsten Oligonukleotids zur Hybridisierung des Am plifikats von humos aus Beispiel 1

Seq. ID No. 15 zeigt die Sequenz eines siebten Oligonukleotids zur Hybridisierung des Ampli fikats von humos aus Beispiel 1

Seq. ID No. 16 zeigt die Sequenz eines achten Oligonukleotids zur Hybridisierung des Ampli fikats von humos aus Beispiel 1

Das folgende Beispiel bezieht sich auf ein Fragment des Gens humos, in dem eine bestimmte CG-Position auf ihren Methylierungsstatus hin untersucht wird.

Beispiel 1 Durchführung der Methylierungsanalyse im humos-Gen Beispiel 1 Durchführung der Methylierungsanalyse im humos-Gen

Im ersten Schritt wird eine genomische Sequenz unter Verwendung von Bisulfit (Hydrogen sulfit, Disulfit) derart behandelt, dass alle nicht an der 5-Position der Base methylierten Cyto sine so verändert werden, dass eine hinsichtlich dem Basenpaarungsverhalten unterschiedli che Base entsteht, während die in 5-Position methylierten Cytosine unverändert bleiben. Wird für die Reaktion Bisulfit im Konzentrationsbereich zwischen 0.1 und 6 M verwendet, so fin det an den nicht methylierten Cytosinbasen eine Addition statt. Zudem müssen ein denaturie rendes Reagenz oder Lösungsmittel sowie ein Radikalfänger zugegen sein. Eine anschließen de alkalische Hydrolyse führt dann zur Umwandlung von nicht methylierten Cytosin- Nukleobasen in Uracil. Diese umgewandelte DNA dient dazu, methylierte Cytosine nachzu weisen. Im zweiten Verfahrensschritt verdünnt man die behandelte DNA-Probe mit Wasser oder einer wässrigen Lösung. Bevorzugt wird anschliessend eine Desulfonierung der DNA (10-30 min. 90-100°C) bei alkalischem pH-Wert durchgeführt. Im dritten Schritt des Verfah rens amplifiziert man die DNA-Probe in einer Polymerasekettenreaktion, bevorzugt mit einer hitzebeständigen DNA-Polymerase.

Im vorliegenden Fall werden Cytosine des Gens humos, hier aus der Promotorregion bzw. Exon 1, untersucht. Mit Sequenzen dieses Gens können die Zeillinien MHH-Call2, MHH- Call4, BV-173, 380, NALM-6 und REH (alle vom Typ human B cell precursor leukemia) von CD19+ B-Zellen bzw. CCRF-CEM, Jurkat, Molt-17, P12-Ichikawa (alles human T cell leu kemia), RPMI-8402 (human T cell acute lymphoblastic leukemia) und Karpas-299 (human T cell lymphoma) von CD4+CD8-T-Zellen unterschieden werden. Dazu wird mit den spezifi schen Primeroligonukleotiden TTTATTGATTGGGAGTAGGT (Seq. ID 5) und CTAATTTTACAAACATCCTA (Seq. ID 6) ein deiniertes Fragment der Länge 494 bp am plifiziert. Dieses Amplifikat dient als Probe, die an ein vorher an einer Festphase gebundenes Oligonukleotid unter Ausbildung einer Duplexstruktur hybridisiert, beispielsweise CCTTACTACGTTAAACTC (Seq. ID 7) oder CCTTACTACATTAAACTC (Seq. ID 8), wobei sich das nachzuweisende Cytosin an Position 164 des Amplifikats befindet. Das me thylierte Cytosin wird mit dem Oligonukleotid (Seq. ID 7), welches an der betreffenden kom plementären Stelle ein Guanin aufweist, nachgewiesen wogegen die unmethylierte Zustands form, die durch ein Thymin repräsentiert wird, mit dem Oligonukleotid (Seq. ID 8), welches an der betreffenden komplementären Stelle ein Adenin aufweist, nachgewiesen wird. Weitere Oligonukleotide, die zur Hybridisierung verwendet werden können beinhalten nachfolgende Sequenzen: GTTACCACCGAACTCCAT (Seq. ID 9) und GTTACCACCAAACTCCAT (Seq. ID 10) mit dem nachzuweisenden Cytosin an Position 263 des Amplifikats, CTCCCCTACGTCCCCCTC (Seq. ID 11) und CTCCCCTACATCCCCCTC (Seq. ID 12) mit dem nachzuweisenden Cytosin an Position 323 des Amplifikats, CTCCAATACGACAATAAA (Seq. ID 13) und CTCCAATACAACAATAAA (Seq. ID 14) mit dem nachzuweisenden Cytosin an Position 89 des Amplifikats, AAACAAACCGTTCACAAC (Seq. ID 15) und AAACAAACCATTCACAAC (Seq. ID 16) mit dem nachzuweisenden Cytosin an Position 401 des Amplifikats.

Der Nachweis des Hybridisierungsprodukts beruht auf Cy5 fluoreszenzmarkierten Primeroli gonukleotiden, die für die Amplifikation verwendet wurden. Nur wenn in der Bisulfit behan delten DNA an dieser Stelle ein methyliertes Cytosin vorgelegen hat, kommt es zu einer Hy bridisierungsreaktion der amplifizierten DNA mit dem Oligonukleotid. Somit entscheidet der Methylierungsstatus des jeweiligen zu untersuchenden Cytosins über das Hybridisierungspro dukt.

Beispiel 2 Diagnose von humos assoziierten Erkrankungen

Um einen Bezug der Methylierungsmuster zu einer der mit humos assoziierten Erkrankungen, beispielsweise Kehlkopfkrebs, akute myeloische Leukämie, chronische myeloische Leukämie und Burkitt's Lymphom, durchzuführen, bedarf es zunächst der Untersuchung der DNA- Methylierungsmuster einer Gruppe von erkrankten und einer Gruppe von gesunden Personen. Diese Untersuchungen werden zum Beispiel analog dem Beispiel 1 durchgeführt. Die so er haltenen Ergebnisse werden in einer Datenbank abgespeichert und die CpG Dinukleotide identifiziert, die zwischen den beiden Gruppen unterschiedlich methyliert sind. Dies kann durch Bestimmung einzelner CpG Methylierungsraten erfolgen, wie dies z. B. durch Sequen zieren relativ ungenau oder aber durch eine methylierungssensitive "Primer-Extension- Reaktion" sehr genau möglich ist. Auch gleichzeitige Analyse des gesamten Methylierungs status ist möglich, und die Muster können z. B. mittels Clustering-Analysen, die z. B. durch einen Rechner durchgeführt werden können, verglichen werden.

Nachfolgend ist es möglich, untersuchte Patienten einer bestimmten Therapiegruppe zuzuord nen und diese Patienten gezielt mit einer individualisierten Therapie zu behandeln.

Claims

1. Nukleinsäure, umfassend einen mindestens 18 Basen langen Sequenzabschnitt der che misch vorbehandelten DNA des humos-Gens gemäß einer der Seq. ID 1 bis Seq. ID 4.

2. Oligomer (Oligonukleotid oder Peptide Nucleic Acid (PNA)-Oligomer) zur Detektion des Cytosin-Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter DNA, umfassend jeweils min destens eine Basensequenz mit einer Länge von mindestens 9 Nukleotiden, die an eine che misch vorbehandelte DNA des humos-Gens gemäß einer der Seq. ID 1 bis Seq. ID 4 hybridi siert.

3. Oligomer gemäß Anspruch 2, wobei die Basensequenz mindestens ein CpG Dinukleotid umfaßt.

4. Oligomer gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass sich das Cytosin des CpG Dinukleotids in etwa im mittleren Drittel des Oligomers befindet.

5. Satz von Oligomeren gemäß Anspruch 3, umfassend mindestens ein Oligomer zur Detekti on des Methylierungszustandes zumindest eines der CpG Dinukleotide aus einer der Sequen zen der Seq. ID 1 bis Seq. ID 4.

6. Satz von Oligomeren gemäß Anspruch 3, umfassend mindestens ein Oligomer zur Detekti on des Methylierungszustandes aller CpG Dinukleotide aus einer der Sequenzen der Seq. ID 1 bis Seq. ID 4.

7. Satz von mindestens zwei Oligonukleotiden gemäß Anspruch 2, die als Primeroligonu kleotide zur Amplifikation von DNA-Sequenzen einer der Seq. ID 1 bis Seq. ID 4 oder Ab schnitten davon eingesetzt werden können.

8. Satz von Oligonukleotiden gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Oligonukleotid an eine Festphase gebunden ist.

9. Satz von Oligomersonden zur Detektion des Cytosin-Methylierungszustandes und/oder von Single Nucleotide Polymorphismen (SNPs) in chemisch vorbehandelter genomischer DNA gemäß einer der Seq. ID 1 bis Seq. ID 4, umfassend mindestens zehn der Oligomere gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4.

10. Verfahren zur Herstellung einer auf einem Trägermaterial fixierten Anordnung von unter schiedlichen Oligomeren (Array) zur Analyse von in Zusammenhang mit dem Methylie rungszustand der CpG Dinukleotide einer der Seq. ID 1 bis Seq. ID 4 stehenden Erkrankun gen, bei dem mindestens ein Oligomer gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4 an eine feste Pha se gekoppelt wird.

11. An eine Festphase gebundene Anordnung von unterschiedlichen Oligomeren (Array) nach einem der Ansprüche 2 bis 4.

12. Array von unterschiedlichen Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomersequenzen gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass diese auf einer ebenen Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet sind.

13. Array gemäß einem der Ansprüche 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Festpha senoberfläche aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold besteht.

14. DNA- und/oder PNA-Array zur Analyse von in Zusammenhang mit dem Methylierungs zustand von Genen stehenden Erkrankungen, der mindestens eine Nukleinsäure gemäß einem der voranstehenden Ansprüche umfaßt.

15. Verfahren zur Ermittlung von genetischen und/oder epigenetischen Parametern zur Dia gnose von bestehenden Erkrankungen oder der Prädisposition für bestimmte Erkrankungen durch Analyse von Cytosin-Methylierungen, dadurch gekennzeichnet, dass man folgende Schritte ausführt:

a) in einer genomischen DNA-Probe werden durch chemische Behandlung an der 5-Position unmethylierte Cytosinbasen in Uracil oder eine andere vom Basenpaarungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base umgewandelt;
b) aus dieser chemisch vorbehandelten genomischen DNA werden Fragmente unter Verwen dung von Sätzen von Primeroligonukleotiden gemäss Anspruch 7 oder 8 und einer Polymera se amplifiziert, wobei die Amplifikate eine nachweisbare Markierung tragen;
c) Amplifikate werden an einen Satz von Oligonukleotiden und/oder PNA-Sonden gemäß der Ansprüche 2 bis 4 oder aber an ein Array gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13; hybridisiert
d) die hybridisierten Amplifikate werden anschließend nachgewiesen.

16. Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass man die chemische Be handlung mittels einer Lösung eines Bisulfits, Hydrogensulfits oder Disulfits durchführt.

17. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass mehr als zehn unterschiedliche Fragmente amplifiziert werden, die 100-2000 Basenpaare lang sind.

18. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Am plifikation von mehreren DNA-Abschnitten in einem Reaktionsgefäß durchgeführt wird.

19. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Po lymerase eine hitzebeständige DNA-Polymerase ist.

20. Verfahren gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikation mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt wird.

21. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Mar kierungen der Amplifikate Fluoreszenzmarkierungen sind.

22. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungen der Amplifikate Radionuklide sind.

23. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 20, dadurch gekennzeichnet dass die Mar kierungen der Amplifikate ablösbare Molekülfragmente mit typischer Masse sind, die in ei nem Massenspektrometer nachgewiesen werden.

24. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Am plifikate oder Fragmente der Amplifikate im Massenspektrometer nachgewiesen werden.

25. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 23 und/oder 24, dadurch gekennzeichnet, dass zur besseren Detektierbarkeit im Massenspektrometer die erzeugten Fragmente eine einzelne po sitive oder negative Nettoladung aufweisen.

26. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 23 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass man die Detektion mittels Matrix assistierter Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI) oder mittels Elektrospray Massenspektrometrie (ESI) durchführt und visualisiert.

27. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass die ge nomische DNA aus Zellen oder Zellbestandteilen erhalten wurde, welche DNA enthalten, wobei Quellen von DNA z. B. Zelllinien, Biopsien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn- Rückenmarks-Flüssigkeit, in Paraffin eingebettetes Gewebe, beispielsweise Gewebe von Au gen, Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologische Objektträger und alle möglichen Kombinationen hiervon umfassen.

28. Kit, umfassend ein Bisulfit (= Disulfit, Hydrogensulfit) Reagenz sowie Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4.

29. Verwendung einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 1, eines Oligonukleotids oder PNA- Oligomers gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, eines Kits gemäß Anspruch 28, eines Arrays gemäß einem der Ansprüche 10 bis 13 oder eines Satz von Oligonukleotiden, umfassend min destens ein Oligomer für zumindest eines der CpG Dinukleotide einer der Sequenzen der Seq. ID 7 bis Seq. ID 16 zur Diagnose von Lungenkarzinomen, Kehlkopfkrebs, akuter myeloischer Leukämie, chronischer myelocystischer Leukämie und Burkitt's Lymphom oder einer anderen Tumorerkrankung.

30. Verwendung einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 1, eines Oligonukleotids oder PNA- Oligomers gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, eines Kits gemäß Anspruch 28, eines Arrays gemäß einem der Ansprüche 10 bis 13 oder eines Satz von Oligonukleotiden, umfassend min destens ein Oligomer für zumindest eines der CpG Dinukleotide einer der Sequenzen der Seq. ID 7 bis Seq. ID 16 zur Therapie von Lungenkarzinomen, Kehlkopfkrebs, akuter myeloischer Leukämie, chronischer myelocystischer Leukämie und Burkitt's Lymphom oder einer anderen Tumorerkrankung.

31. Kit, umfassend ein Bisulfit (= Disulfit, Hydrogensulfit) Reagenz sowie Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere gemäß Anspruch 30.

32. Verwendung einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 1, eines Oligonukleotids oder PNA- Oligomers gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, eines Kits gemäß Anspruch 28 oder eines Arrays gemäß einem der Ansprüche 10 bis 13 zur Unterscheidung von verschiedenen ALL (akute lymphatische Leukämie) Zustandsformen, Subtypen und Stadien.