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Gebiet der Erfindung
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Die nach den methodischen Entwicklungen
der letzten Jahre in der Molekularbiologie gut studierten Beobachtungsebenen
sind die Gene selbst, die Übersetzung
dieser Gene in RNA und die daraus entstehenden Proteine. Wann im
Laufe der Entwicklung eines Individuums welches Gen angeschaltet
wird und wie Aktivieren und Inhibieren bestimmter Gene in bestimmten
Zellen und Geweben gesteuert wird, ist mit Ausmaß und Charakter der Methylierung
der Gene bzw. des Genoms korrelierbar. Insofern äußern sich pathogene Zustände in einem
veränderten
Methylierungsmuster einzelner Gene oder des Genoms.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
Nukleinsäuren,
Oligonukleotide, PNA-Oligomere und ein Verfahren zur Diagnose von
Erkrankungen, die mit dem genetischen und/oder epigenetischen Parametern
von Genen, die mit Tumor-Suppressorgenen und Onkogenen assoziiert
sind und insbesondere deren Methylierungsstatus in Zusammenhang
stehen.
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Stand der Technik
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Es besteht ein Bedarf für die Entwicklung
von alternativen Verfahren der Behandlung und Diagnose von Krebspatienten.
Augenblickliche Verfahren der Behandlung, wie zum Beispiel Radiotherapie
und Chemotherapie, sind oft von unangenehmen Nebenwirkungen begleitet
und gegen viele Formen von Krebs ineffektiv.
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Die Genetik von Krebs ist kompliziert
und schließt
viel dominante positive Regulatoren des transformierten Zustands
(Onkogene) sowie viele rezessive negative Regulatoren (Tumorsuppressorgene)
ein. Ungefähr
100 Onkogene wurden identifiziert. Die Onkogene fallen in mehrere
Gruppen, die verschiedene Typen von Aktivitäten repräsentieren, die von Transmembranproteinen
zu Transkriptionsfaktoren reichen. Im Augenblick sind ungefähr 10 Tumorsuppressorgene
bekannt. Sie stellen den Verlust von Funktionen in Genen dar, die
gewöhnlicher
Weise einige Unterdrückung
auf Tumorsuppressorgene und Onkogene oder das Zellwachstum ausüben, wobei
ein Loslassen der Unterdrückung
tumorigen ist. Zusätzlich
zu den Verlust von Heterozygozität und
spontaner Mutation in Genen existiert ein weiterer Mechanismus,
der zu Tumorbildung führen
kann. Von der epigenetischen Fehlregulation von Genen wurde gezeigt,
dass sie an der Bildung von Tumoren beteiligt ist. Der am besten
charakterisierte epigenetische Parameter ist der von genomischer
Methylierung, der kovalenten Modifikation der CS-Position von Cytosin.
Methylierungsanomalien bei Krebs schließen Punktmutationen, globale
Hypomethylierung, Hypomethylierung von einzelnen Genen, Hypermethylierung
von CpG Inseln und den Verlust von Imprinting ein.
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Die hohe Rate von Mutationen innerhalb
der CpG Inseln kann zu Krebs führen.
Methylierte Cytosinbasen können
spontan deaminieren, um Uracil zu bilden. Die Mismatchreparatur
kann dann durch DNA-MTase beeinträchtigt werden, was zu einer
Cytosin zu Thiamidin Transition führt. Ein gutes Beispiel davon
ist das p53 Gen. eine Mutationen in diesem Genen ist in mehr als
50 % aller Tumore vorhanden, von denen abgeschätzte 24 % Cytosin zu Thymidin
Transitionen an CpG Dinucleotiden sind.
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Abnehmende Spiegel von globaler Methylierung
ist in vielen Formen von Tumoren verbreitet. Eine Hypomethylierung
von einzelnen Genen wurde auch beobachtet. Eine inverse Beziehung
zwischen Spiegeln von Methylierung und der Zellteilung wurde in
dem bcl-2 Gen (lymphocytische Leukämie) und dem k-ras Proto-Onkogen
in Lungen- und Colonkarzinomen beobachtet.
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Das p16 Gen ist ein Schlüssel-Tumorsuppressorgene
und Onkogene regulatorisches Gen. Das p16 Protein stoppt das Fortschreiten
des Zellzyklus an der G1/S Grenze, und der Verlust der p16 Funktionen
kann zum Fortschreiten von Krebs führen, durch ein Ermöglichen
von nicht regulierter Zellteilung. Die Hypermethylierungs vermittelte
Inaktivierung des p16 Gens wurde in Hirn-, Brust-, Colon-, Kopf-
und Nacken-, und nicht-kleine Zellen Lungenkrebs und in hochgradigem
nicht-Hodgkin's
Lymphom gezeigt.
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Die Rolle der Methylierung bei der
Tumorgenese wird durch Singal und Ginder 'DNA Methylation' Blood, Vol. 93 No. 12 (June 15), 1999:
pp. 4059-4070 zusammenfassend beschrieben. Weitere Beispiele von Methylierungs-gekoppelter
Onkogenese schließen
ein:
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Kopf- und Nackenkrebs (Sanchez-Cespedes
M et al. „Gene
promoter hypermethylation in tumours and serum of head and neck
cancer patients" Cancer
Res. 2000 Feb. 15;60 (4):892-5).
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Hodgkin's Erkrankung (Garcia JF et al „Loss of
p16 protein expression associated with methylation of the p16INK4A
gene is a frequent finding in Hodgkin's disease" Lab invest 1999 Dec; 79 (12):1453-9):
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Magenkrebs (Yanagisawa Y et al. „ Methylation
of the hMLH1 promoter in familial gastric cancer with microsatellite
instability" Int
J Cancer 2000 Jan 1; 85 (1):50-3).
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Die Identifizierung der Methylierungs-abhängigen Regulation
von Krebsgenen hat die Möglichkeit
eröffnet,
alternativen Verfahren der Krebsbehandlung und Diagnose zu entwickeln.
Von der Behandlung mit DNA Methylierungsinhibitoren wurde gezeigt,
daß sie
die Genexpression des Schlüssel-Tumorsuppressorgene
and Onkogens Gen p16 wiederherstellen, Bender et. al. "Inhibition of DNA
methylation by 5-aza-2'-deoxycytidine suppresses
the growth of human tumor cell lines." Cancer research 58; 95-101 (1998).
Dies führte
zu erheblichen Spiegeln an Genexpression, was zur Suppression von
Wachstum in Tumorzellinien führte.
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Methylierungs-basierte Therapien
könnten
beträchtliche
Vorteile über
die augenblicklichen Verfahren der Behandlung, wie z. B. Chemotherapie,
Chirurgie und Radiotherapien aufweisen. Sie könnten sogar ein Mittel zur
Verfügung
stellen, Tumore zu behandeln, die gegenüber herkömmlichen Verfahren der Behandlung
resistent sind, wie durch Soengas et al "Inactivation of the apoptosis effector
Apaf-1 in malignant melanoma" Nature
409; 207-211(2001) gezeigt. Zusätzlich
zu der Entwicklung von Methylierungs-spezifischen Therapien, haben
Experimente mit Min-Mäusen
gezeigt, daß die
Inhibierung der DNA Methylierung die Tumorinitiation unterdrücken kann,
Laird et. al. 'Suppression
of intestinal neoplasia by DNA hypomethylation' Cell 81; 197-205 (1995). Weiterhin
kann die DNA Methylierungsanalyse neue Mittel zur Krebsdiagnose
zur Verfügung
stellen.
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5-Methylcytosin ist die häufigste
kovalent modifizierte Base in der DNA eukaryontischer Zellen. Sie spielt
beispielsweise eine Rolle in der Regulation der Transkription, beim
genetischen Imprinting und in der Tumorgenese. Die Identifizierung
von 5-Methylcytosin als Bestandteil genetischer Information ist
daher von erheblichem Interesse. 5-Methylcytosin- Positionen können jedoch nicht durch Sequenzierung
identifiziert werden, da 5-Methylcytosin das gleiche Basenpaarungsverhalten
aufweist wie Cytosin. Darüber
hinaus geht bei einer PCR-Amplifikation die epigenetische Information,
welche die 5-Methylcytosine tragen, vollständig verloren.
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Eine relativ neue und die mittlerweile
am häufigsten
angewandte Methode zur Untersuchung von DNA auf 5-Methylcytosin
beruht auf der spezifischen Reaktion von Bisulfit mit Cytosin, das
nach anschließender
alkalischer Hydrolyse in Uracil umgewandelt wird, welches in seinem
Basenpaarungsverhalten dem Thymidin entspricht. 5-Methylcytosin
wird dagegen unter diesen Bedingungen nicht modifiziert. Damit wird
die ursprüngliche
DNA so umgewandelt, daß Methylcytosin,
welches ursprünglich
durch sein Hybridisierungsverhalten vom Cytosin nicht unterschieden
werden kann, jetzt durch „normale" molekularbiologische
Techniken als einzig verbliebenes Cytosin beispielsweise durch Amplifikation
und Hybridisierung oder Sequenzierung nachgewiesen werden kann.
Alle diese Techniken beruhen auf Basenpaarung, welche jetzt voll
ausgenutzt wird. Der Stand der Technik, was die Empfindlichkeit
betrifft, wird durch ein Verfahren definiert, welches die zu untersuchende DNA
in einer Agarose-Matrix
einschließt,
dadurch die Diffusion und Renaturierung der DNA (Bisulfit reagiert nur
an einzelsträngiger
DNA) verhindert und alle Fällungs-
und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse ersetzt (Olek A, Oswald
J, Walter J. A modified and improved method for bisulphite based
cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 Dec 15;24(24):5064-6).
Mit dieser Methode können
einzelne Zellen untersucht werden, was das Potential der Methode
veranschaulicht. Allerdings werden bisher nur einzelne Regionen
bis etwa 3000 Basenpaare Länge
untersucht, eine globale Untersuchung von Zellen auf Tausenden von möglichen
Methylierungsanalysen ist nicht möglich. Allerdings kann auch
dieses Verfahren keine sehr kleinen Fragmente aus geringen Probenmengen
zuverlässig
analysieren. Diese gehen trotz Diffusionsschutz durch die Matrix
verloren.
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Eine Übersicht über die weiteren bekannten
Möglichkeiten,
5-Methylcytosine nachzuweisen, kann aus dem folgenden Übersichtsartikel
entnommen werden: Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic
Acids Res. 1998, 26, 2255.
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Die Bisulfit-Technik wird bisher
bis auf wenige Ausnahmen (z.B. Zeschnigk M, Lich C, Buiting K, Doerfler
W, Horsthemke B. A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman
and Prader-Willi syndrome based on allelic methylation differences
at the SNRPN locus. Eur J Hum Genet. 1997 Mar-Apr;S(2):94-8) nur in
der Forschung angewendet. Immer aber werden kurze, spezifische Stücke eines
bekannten Gens nach einer Bisulfit-Behandlung amplifiziert und entweder
komplett sequenziert (Olek A, Walter J. The pre-implantation ontogeny
of the H19 methylation imprint. Nat Genet. 1997 Nov;17(3):275-6)
oder einzelne Cytosin-Positionen durch
eine „Primer-Extension-Reaktion" (Gonzalgo ML, Jones
PA. Rapid quantitation of methylation differences at specific sites
using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE).
Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15;25(12):2529-31, WO 95/00669) oder
einen Enzymschnitt (Xiong Z, Laird PW. COBRA: a sensitive and quantitative
DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15;25(12):2532-4)
nachgewiesen. Zudem ist auch der Nachweis durch Hybridisierung beschrieben
worden (Olek et al., WO 99/28498).
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Weitere Publikationen, die sich mit
der Anwendung der Bisulfit-Technik zum Methylierungsnachweis bei
einzelnen Genen befassen, sind: Grigg G, Clark S. Sequencing 5-methylcytosine
residues in genomic DNA. Bioessays. 1994 Jun;16(6):431-6, 431; Zeschnigk
M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke B, Doerfler W. Imprinted
segments in the human genome: different DNA methylation patterns
in the Prader-Willi/Angelman syndrome region as determined by the
genomic sequencing method. Hum Mol Genet. 1997 Mar;6(3):387-95;
Feil R, Charlton J, Bird AP, Walter J, Reik W. Methylation analysis
on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic
sequencing. Nucleic Acids Res. 1994 Feb 25;22(4):695-6; Martin V,
Ribieras S, Song-Wang X, Rio MC, Dante R. Genomic sequencing indicates
a correlation between DNA hypomethylation in the 5' region of the pS2
gene and its expression in human breast cancer cell lines. Gene. 1995
May 19;157(1-2):261-4; WO 97/46705, WO 95/15373 und WO 98/45560.
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Eine Übersicht über den Stand der Technik in
der Oligomer Array Herstellung läßt sich
aus einer im Januar 1999 erschienenen Sonderausgabe von Nature Genetics
(Nature Genetics Supplement, Volume 21, January 1999) und der dort
zitierten Literatur entnehmen.
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Für
die Abtastung eines immobilisierten DNA-Arrays sind vielfach fluoreszenzmarkierte
Sonden verwendet worden. Besonders geeignet für Fluoreszenzmarkierungen ist
das einfache Anbringen von Cy3 und Cy5 Farbstoffen am 5'-OH der jeweiligen
Sonde. Die Detektion der Fluoreszenz der hybridisierten Sonden erfolgt
beispielsweise über
ein Konfokalmikroskop. Die Farbstoffe Cy3 und Cy5 sind, neben vielen
anderen, kommerziell erhältlich.
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Matrix-assistierte Laser Desorptions/Ionisations-Massenspektrometrie
(MALDI-TOF) ist eine sehr leistungsfähige Entwicklung für die Analyse
von Biomolekülen
(Karas M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins
with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem. 1988
Oct 15;60(20):2299-301). Ein Analyt wird in eine lichtabsorbierende
Matrix eingebettet. Durch einen kurzen Laserpuls wird die Matrix
verdampft und das Analytmolekül
so unfragmentiert in die Gasphase befördert. Durch Stöße mit Matrixmolekülen wird
die Ionisation des Analyten erreicht. Eine angelegte Spannung beschleunigt
die Ionen in ein feldfreies Flugrohr. Auf Grund ihrer verschiedenen
Massen werden Ionen unterschiedlich stark beschleunigt. Kleinere Ionen
erreichen den Detektor früher
als größere.
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MALDI-TOF Spektrometrie eignet sich
ausgezeichnet zur Analyse von Peptiden und Proteinen. Die Analyse
von Nukleinsäuren
ist etwas schwieriger (Gut I G, Beck S. DNA and Matrix Assisted
Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Current Innovations
and Future Trends. 1995, 1; 147-57). Für Nukleinsäuren ist die Empfindlichkeit
etwa 100 mal schlechter als für
Peptide und nimmt mit zunehmender Fragmentgröße überproportional ab. Für Nukleinsäuren, die
ein vielfach negativ geladenes Rückgrat
haben, ist der Ionisationsprozeß durch
die Matrix wesentlich ineffizienter. In der MALDI-TOF Spektrometrie
spielt die Wahl der Matrix eine eminent wichtige Rolle. Für die Desorption
von Peptiden sind einige sehr leistungsfähige Matrizes gefunden worden,
die eine sehr feine Kristallisation ergeben. Für DNA gibt es zwar mittlerweile
einige ansprechende Matrizes, jedoch wurde dadurch der Empfindlichkeitsunterschied
nicht verringert. Der Empfindlichkeitsunterschied kann verringert
werden, indem die DNA chemisch so modifiziert wird, dass sie einem
Peptid ähnlicher wird.
Phosphorothioatnukleinsäuren,
bei denen die gewöhnlichen
Phosphate des Rückgrats
durch Thiophosphate substituiert sind, lassen sich durch einfache
Alkylierungschemie in eine ladungsneutrale DNA umwandeln (Gut IG,
Beck S. A procedure for selective DNA alkylation and detection by
mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 1995 Apr 25;23(8):1367-73).
Die Kopplung eines „charge
tags" an diese modifizierte
DNA resultiert in der Steigerung der Empfindlichkeit um den gleichen
Betrag, wie er für
Peptide gefunden wird. Ein weiterer Vorteil von „charge tagging" ist die erhöhte Stabilität der Analyse
gegen Verunreinigungen, die den Nachweis unmodifizierter Substrate
stark erschweren.
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Genomische DNA wird durch Standardmethoden
aus DNA von Zell-, Gewebe- oder sonstigen Versuchsproben gewonnen.
Diese Standardmethodik findet sich in Referenzen wie Fritsch und
Maniatis eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.
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Definition der
Aufgabe
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Die vorliegende Erfindung ist dazu
gedacht, Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere zur Detektion von
Cytosin-Methylierungen sowie ein Verfahren bereitzustellen, welches
sich zur Diagnose von genetischen und epigenetischen Parametern
von Genen, die mit Tumor-Suppressorgenen
und Onkogenen assoziiert sind, besonders eignet. Der Erfindung liegt
die Erkenntnis zugrunde, daß sich
die Cytosin-Methylierungsmuster zur Diagnose und/oder der Therapie
von mit Tumor-Suppressorgenen und Onkogenen assoziierten Erkrankungen besonders
eignen.
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Beschreibung
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Es ist die Aufgabe der vorliegenden
Erfindung, die chemisch modifizierte DNA von Genen zur Verfügung zu
stellen, die mit Tumor-Suppressorgenen und Onkogenen assoziiert
sind, sowie Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere zur Detektion
von Cytosin-Methylierungen sowie ein Verfahren bereitzustellen,
welches sich zur Diagnose und/oder der Therapie von genetischen
und epigenetischen Parametern von Genen, die mit Tumor-Suppressorgenen
und Onkogenen assoziiert sind, besonders eignet. Der Erfindung liegt
die Erkenntnis zugrunde, daß genetische
und epigenetische Parameter und insbesondere die Cytosin-Methylierungsmuster
von Genen, die mit Tumor-Suppressorgenen und Onkogenen assoziiert
sind, zur Diagnose und/oder der Therapie von mit Tumor-Suppressorgenen
und Onkogenen assoziierten Erkrankungen besonders eignen.
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Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch
das zur Verfügung
stellen einer Nukleinsäure,
die einen mindestens 18 Basen langen Sequenzabschnitt der chemisch
vorbehandelten DNA von Genen, die mit Tumor-Suppressorgenen und
Onkogenen assoziiert sind gemäß einer
der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 536 und dazu komplementären Sequenzen
und/oder der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die mit Tumor-Suppressorgenen
und Onkogenen assoziiert sind gemäß einer der Sequenzen der in
Tabelle 1 aufgelisteten Gene enthält, gelöst. In der Tabelle sind nach
den aufgelisteten Gen-Bezeichnungen die jeweiligen Datenban knummern
(Zugangsnummern) angegeben, die die dazugehörigen Gensequenzen als einmalig
definieren. GenBank am National Institute of Health wurde als die
zu Grunde liegende Datenbank unter der Internet Adresse www.ncbi.nlm.nih.gov
verwendet.
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Die chemisch modifizierte Nukleinsäure konnte
bisher nicht in Zusammenhang mit der Ermittlung von genetischen
und epigenetische Parametern gebracht werden.
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Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung
wird weiterhin durch ein Oligonukleotid oder Oligomer zur Detektion
des Cytosin-Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter DNA,
umfassend mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von
mindestens 13 Nukleotiden gelöst,
die an eine chemisch vorbehandelte DNA von Genen, die mit Tumor-Suppressorgenen
und Onkogenen assoziiert sind gemäß einer der Seq. ID No. 1 bis
Seq. ID No. 536 und dazu komplementären Sequenzen und/oder der
chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die mit Tumor-Suppressorgenen
und Onkogenen assoziiert sind gemäß einer der Sequenzen der in
Tabelle 1 aufgelisteten Gene hybridisiert. Die erfindungsgemäßen Oligomersonden
stellen wichtige und effektive Werkzeuge dar, welche die Ermittlung
der genetischen und epigenetischen Parameter von Genen, die mit
Tumor-Suppressorgenen und Onkogenen assoziiert sind, erst ermöglichen.
Bevorzugterweise umfaßt
die Basensequenz der Oligomere mindestens ein CpG Dinukleotid. Die
Sonden können
auch in Form einer PNA (Peptide Nucleic Acid) vorliegen, die besonders
bevorzugte Paarungseigenschaften aufweist. Besonders bevorzugt sind
erfindungsgemäße Oligonukleotide,
bei denen das Cytosin des CpG Dinukleotids das 5. – 9. Nukleotid
vom 5'-Ende des
13-mers ist, im Falle von PNA-Oligomeren ist es bevorzugt, dass
das Cytosin des CpG Dinukleotids das 4. – 6. Nukleotid vom 5'-Ende des 9-mers
ist.
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Die erfindungsgemäßen Oligomere werden normalerweise
in sogenannten Sets eingesetzt, die für jedes der CpG Dinukleotide
eine der Sequenzen der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 536 und dazu
komplementären
Sequenzen und/oder der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die
mit Tumor-Suppressorgenen und Onkogenen assoziiert sind gemäß einer
der Sequenzen der in Tabelle 1 aufgelisteten Gene mindestens ein
Oligomer umfassen. Bevorzugt ist ein Set, das für jedes der CpG Dinukleotide
aus einer der Seq ID No. 1 bis Seq ID No. 536 und dazu komplementären Sequenzen
und/oder der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die mit Tumor-Suppressorgenen
und Onkogenen assoziiert sind gemäß einer der Sequenzen der in Tabelle
1 aufgelisteten Gene mindestens ein Oligomer umfaßt.
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Darüber hinaus stellt die Erfindung
ein Set von mindestens zwei Oligonukleotiden zur Verfügung, die als
sogenannte „Primer-Oligonukleotide" zur Amplifikation
von DNA-Sequenzen einer der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 536 und
dazu komplementären
Sequenzen und/oder der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die
mit Tumor-Suppressorgenen und Onkogenen assoziiert sind gemäß einer
der Sequenzen der in Tabelle 1 aufgelisteten Gene oder Abschnitten
davon eingesetzt werden können.
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Im Falle der erfindungsgemäßen Sets
von Oligonukleotiden ist es bevorzugt, daß mindestens ein Oligonukleotid
an eine Festphase gebunden ist.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
weiterhin einen Satz von mindestens 10 n (Oligonukleotiden und/oder
PNA-Oligomeren), die zur Detektion des Cytosin-Methylierungszustandes
in chemisch vorbehandelter genomischer DNA (Seq. ID No. 1 bis Seq.
ID No. 536 und dazu komplementären
Sequenzen und/oder der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die
mit Tumor-Suppressorgenen und Onkogenen assoziiert sind gemäß einer
der Sequenzen der in Tabelle 1 aufgelisteten Gene) dienen. Mit diesen
Sonden ist die Diagnose von genetischen und epigenetischen Parametern
von Genen, die mit Tumor-Suppressorgenen und Onkogenen assoziiert
sind möglich.
Das Set von Oligomeren kann auch zur Detektion von Single Nucleotide
Polymorphismen (SNPs) in der chemisch vorbehandelten DNA von Genen,
die mit Tumor-Suppressorgenen und Onkogenen assoziiert sind gemäß einer
der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 536 und dazu komplementären Sequenzen
und/oder der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die mit Tumor-Suppressorgenen
und Onkogenen assoziiert sind gemäß einer der Sequenzen der in
Tabelle 1 aufgelisteten Gene verwendet werden.
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Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, daß eine von
der Erfindung zur Verfügung
gestellte Anordnung aus unterschiedlichen Oligonukleotiden und/oder
PNA-Oligomeren (ein sogenanntes "Array") ebenfalls an eine Festphase
gebunden vorliegt. Dieses Array von unterschiedlichen Oligonukleotid-
und/oder PNA-Oligomersequenzen kann dadurch gekennzeichnet sein,
dass es auf der Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen
Gitters angeordnet ist. Bevorzugterweise besteht die Festphasenoberfläche aus
Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel,
Silber oder Gold. Möglich
sind jedoch auch Nitrocellulose sowie Kunststoffe wie zum Beispiel
Nylon, die in Form von Kugeln oder auch als Harz-Matrizes vorliegen können.
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Ein weiterer Gegenstand der Erfindung
ist daher ein Verfahren zur Herstellung eines auf einem Trägermaterial
fixierten Arrays zur Analyse in Zusammenhang mit Tumor-Suppressorgenen und
Onkogenen assoziierten Erkrankungen, bei dem mindestens ein Oligomer
gemäß der Erfindung
an eine feste Phase gekoppelt wird. Verfahren zur Herstellung von
solchen Arrays sind zum Beispiel aus der
US 5,744,305 mittels Festphasenchemie
und photolabilen Schutzgruppen bekannt.
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Ein weiterer Gegenstand der Erfindung
betrifft einen DNA-Chip zur Analyse in Zusammenhang mit Tumor-Suppressorgenen
und Onkogenen assoziierten Erkrankungen, der mindestens eine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden
Erfindung umfaßt.
DNA-Chips sind zum Beispiel aus der
US
5,837,832 bekannt.
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Gegenstand der vorliegenden Erfindung
ist zudem ein Kit, das zum Beispiel aus einer Bisulfit enthaltenden
Reagenz, einem Satz von Primeroligonukleotiden umfassend mindestens
zwei Oligonukleotide, deren Sequenzen jeweils mindestens einen 18
Basenpaaren langen Abschnitt der im Anhang aufgeführten Basensequenzen
(Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 536 und dazu komplementären Sequenzen
und/oder der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die mit Tumor-Suppressorgenen
und Onkogenen assoziiert sind gemäß einer der Sequenzen der in
Tabelle 1 aufgelisteten Gene), Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren
sowie einer Anleitung zur Durchführung
und Auswertung des beschriebenen Verfahrens bestehen kann. Ein Kit
im Sinne der Erfindung kann jedoch auch nur Teile der vorgenannten
Bestandteile enthalten.
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Die Erfindung stellt weiterhin ein
Verfahren zur Ermittlung von genetischen und/oder epigenetischen Parametern
von Genen, die mit Tumor-Suppressorgenen und Onkogenen assoziiert
sind durch Analyse von Cytosin-Methylierungen und Single Nucleotide
Polymorphismen zur Verfügung,
das folgende Schritte umfaßt:
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In einem ersten Verfahrensschritt
wird eine genomische DNA-Probe derart chemisch behandelt, daß an der
5'-Position nicht-methylierte
Cytosinbasen in Uracil, Thymin oder eine andere vom Hybridisierungsverhalten
her dem Cytosin unähnliche
Base umgewandelt werden. Dies wird im folgenden unter „chemischer
Vorbehandlung" verstanden.
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Die zu analysierende genomische DNA
wird bevorzugt aus den üblichen
Quellen für
DNA erhalten, wie Zellen oder Zellbestandteilen, zum Beispiel Zellinien,
Biopsine, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit,
in Paraffin eingebettetes Gewebe, beispielsweise Gewebe von Augen,
Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologische
Objektträger
oder Kombinationen davon.
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Bevorzugt wird dazu die oben beschriebene
Behandlung genomischer DNA mit Bisulfit (Hydrogensulfit, Disulfit)
und anschließender
alkalischer Hydrolyse angewendet, die zu einer Umwandlung nicht
methylierter Cytosin-Nukleobasen in Uracil oder eine andere vom
Basenpaarungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base führt.
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Aus dieser chemisch vorbehandelten
genomischen DNA werden Fragmente unter Verwendung von Sätzen von
erfindungsgemäßen Primer-Oligonukleotiden
und einer bevorzugterweise hitzestabilen Polymerase amplifiziert.
Aus statistischen und praktikablen Erwägungen werden bevorzugterweise
mehr als zehn unterschiedliche Fragmente amplifiziert, die 100 – 2000 Basenpaare
lang sind. Die Amplifikation von mehreren DNA-Abschnitten kann simultan
in ein und demselben Reaktionsgefäß durchgeführt werden. Üblicherweise wird
die Amplifikation mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt.
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In einer bevorzugten Ausführungsform
des Verfahrens umfaßt
der Satz von Primer-Oligonukleotiden mindestens
zwei Oligonukleotide, deren Sequenzen jeweils revers komplementär oder identisch
zu einem mindestens 18 Basenpaare langen Abschnitt der im Anhang
(Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 536 und dazu komplementären Sequenzen
und/oder der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die mit Tumor-Suppressorgenen
und Onkogenen assoziiert sind gemäß einer der Sequenzen der in
Tabelle 1 aufgelisteten Gene) aufgelisteten Basensequenzen sind.
Die Primer-Oligonukleotide sind vorzugsweise dadurch gekennzeichnet,
daß sie
kein CpG Dinukleotid enthalten.
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Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, daß bei der
Amplifikation mindestens ein Primer-Oligonukleotid an eine Festphase gebunden
ist. Die unterschiedlichen Oligonukleotid und/oder PNA-Oligomersequenzen
können
auf einer ebenen Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen
Gitters angeordnet sein, wobei die Festphasenoberfläche bevorzugt
aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer,
Nickel, Silber oder Gold besteht, wobei auch andere Materialien,
wie Nitrocellulose oder Kunststoffe verwendet werden können.
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Die mittels der Amplifikation erhaltenen
Fragmente können
eine direkt oder indirekt nachweisbare Markierung tragen. Bevorzugt
sind Markierungen in Form von Fluoreszenzmarkierungen, Radionukliden
oder ablösbaren
Molekülfragmenten
mit typischer Masse, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen
werden können,
wobei bevorzugt ist, dass die erzeugten Fragmente zur besseren Detektierbarkeit
im Massenspektrometer eine einzelne positive oder negative Nettoladung
aufweisen. Der Nachweis kann mittels Matrix assistierter Laser Desorptions/Ionisations
Massenspektrometrie (MALDI) oder mittels Elektrospray Massenspektrometrie
(ESI) durchgeführt
und visualisiert werden.
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Die im zweiten Verfahrensschritt
erhaltenen Amplifikate werden anschließend an einen Satz von Oligonukleotiden
und/oder PNA- Sonden der oder an ein Array hybridisiert. Die Hybridisierung
erfolgt dabei auf die unten angegebene Art und Weise. Der bei der
Hybridisierung verwendete Satz besteht bevorzugterweise aus mindestens
10 Oligonukleotid oder PNA-Oligomer
Sonden. Die Amplifikate dienen dabei als Sonden, die an vorher an
einer Festphase gebundene Oligonukleotide hybridisieren. Die nicht
hybridisierten Fragmente werden anschließend entfernt. Die besagten
Oligonukleotide umfassen mindestens eine Basensequenz mit einer
Länge von
13 Nukleotiden, die revers komplementär oder identisch zu einem Abschnitt
der im Anhang aufgeführten
Basensequenzen ist, der mindestens ein CpG Dinukleotid enthält. Das
Cytosin des CpG Dinukleotids ist das 5. bis 9. Nukleotid vom 5'-Ende des 13 mers
aus betrachtet. Für
jedes CpG Dinukleotid ist ein Oligonukleotid vorhanden. Die besagten
PNA-Oligomere umfassen mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von
9 Nukleotiden, die revers komplementär oder identisch zu einem Abschnitt
der im Anhang aufgeführten
Basensequenzen ist, der mindestens ein CpG Dinukleotid enthält. Das
Cytosin des CpG Dinukleotids ist das 4. bis 6. Nukleotid vom 5'-Ende des 9-mers
aus gesehen. Für
jedes CpG Dinukleotid ist ein Oligonukleotid vorhanden.
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Im vierten Verfahrensschritt entfernt
man die nicht hybridisierten Amplifikate.
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Im letzten Verfahrensschritt detektiert
man die hybridisierten Amplifikate. Dabei ist bevorzugt, daß an den
Amplifikaten angebrachte Markierungen an jeder Position der Festphase,
an der sich eine Oligonukleotidsequenz befindet, identifizierbar
sind.
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Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, daß die Markierungen
der Amplifikate Fluoreszenzmarkierungen, Radionuklide oder ablösbare Molekülfragmente
mit typischer Masse sind, die in ei nem Massenspektrometer nachgewiesen
werden können.
Der Nachweis der Amplifikate, Fragmente der Amplifikate oder zu
den Amplifikaten komplementäre
Sonden im Massenspektrometer ist bevorzugt, wobei man die Detektion
mittels Matrix assistierter Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie
(MALDI) oder mittels Elektrospray Massenspektrometrie (ESI) durchführen und
visualisieren kann.
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Zur besseren Detektierbarkeit im
Massenspektrometer können
die erzeugten Fragmente eine einzelne positive oder negative Nettoladung
aufweisen. Bevorzugt wird das vorgenannte Verfahren zur Ermittlung
von genetischen und/oder epigenetischen Parametern von Genen, die
mit Tumor-Suppressorgenen und Onkogenen assoziiert sind, verwendet.
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Die erfindungsgemäßen Oligomere oder Arrays derselben
sowie ein erfindungsgemäßes Kit
sollen zur Diagnose und/oder Therapie einer mit Tumor-Suppressorgenen
und Onkogenen assoziierten Krankheit durch Analyse von Methylierungsmustern
von Genen, die mit Tumor-Suppressorgenen
und Onkogenen assoziiert sind, verwendet werden. Erfindungsgemäss bevorzugt
ist die Verwendung des Verfahrens zur Diagnose und/oder Therapie
bedeutender genetischer und/oder epigenetischer Parameter innerhalb
von Genen, die mit Tumor-Suppressorgenen
und Onkogenen assoziiert sind.
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Das erfindungsgemäße Verfahren dient zum Beispiel
der Diagnose und/oder der Therapie von soliden Tumoren und Krebsarten.
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Auch die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren der
Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 536 und dazu komplementäre Sequenzen
und/oder die chemisch vorbehandelte DNA von Genen, die mit Tumor-Suppressorgenen und
Onkogenen assoziiert sind gemäß einer
der Sequenzen der in Tabelle 1 aufgelisteten Gene können für die Diagnose
und/oder der Therapie von genetischen und/oder epigenetischen Parametern
von Genen, die mit Tumor-Suppressorgenen und Onkogenen assoziiert
sind, verwendet werden.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Diagnostikums und/oder
Therapeutikums zur Diagnose und/oder der Therapie von Krankheiten,
die mit Tumor-Suppressorgenen und Onkogenen assoziiert sind durch
Analyse von Methylierungsmustern von Genen, die mit Tumor-Suppressorgenen
und Onkogenen assoziiert sind, wobei das Diagnostikum und/oder das
Therapeutikum dadurch gekennzeichnet ist, dass mindestens eine Nukleinsäure, gemäß der vorliegenden
Erfindung, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen
zu dessen Herstellung verwendet wird.
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Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden
Erfindung betrifft ein Diagnostikum und/oder Therapeutikum für Krankheiten,
die mit Tumor-Suppressorgenen und Onkogenen assoziiert sind, durch
Analyse von Methylierungsmustern von Genen, die mit Tumor-Suppressorgenen
und Onkogenen assoziiert sind, wobei das Diagnostikum und/oder Therapeutikum
dadurch gekennzeichnet ist, das es mindestens eine Nukleinsäure gemäß der Erfindung,
gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen
enthält.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
weiterhin die Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten
oder Individuen, bei dem die mittels der Erfindung erhaltenen bedeutenden
genetischen und/oder epigenetischen Parameter innerhalb von Genen,
die mit Tumor-Suppressorgenen und Onkogenen assoziiert sind mit
einem anderen Satz genetischen und/oder epigenetischen Parameter
verglichen werden können
und die so erhaltenen Unterschiede als Basis für eine Diagnose und/oder Prognose
nachteiliger Ereignisse für
Patienten oder Individuen dienen.
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Unter dem Begriff "Hybridisierung" im Sinne der vorliegenden
Erfindung ist eine Bindung unter Ausbildung einer Duplex-Struktur
eines Oligonukleotids an eine vollständig komplementäre Sequenz
im Sinne der Watson-Crick Basenpaarungen in der Proben DNA zu verstehen.
Unter "stringenten
Hybridisierungsbedingungen" sind
solche Bedingungen zu verstehen, bei denen eine Hybridisierung bei
60°C in
2,5 x SSC-Puffer, gefolgt von mehreren Waschschritten bei 37°C in einer
geringeren Pufferkonzentration erfolgt und stabil bleibt.
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Mit dem Begriff "funktionelle Varianten" sind alle DNA-Sequenzen
bezeichnet, die komplementär
zu einer DNA-Sequenz sind, die unter stringenten Bedingungen mit
der Referenzsequenz hybridisieren und eine zu dem entsprechenden
erfindungsgemäßen Polypeptid ähnliche
Aktivität
aufweisen.
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"Genetische
Parameter" im Sinne
dieser Erfindung sind Mutationen und Polymorphismen von Genen, die
mit Tumor-Suppressorgenen und Onkogenen assoziiert sind und zu deren
Regulation weiterhin erforderlicher Sequenzen. Insbesondere sind
als Mutationen Insertionen, Dele tionen, Punktmutationen, Inversionen und
Polymorphismen und besonders bevorzugt SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms)
zu bezeichnen.
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"Epigenetische
Parameter" im Sinne
dieser Erfindung sind insbesondere Cytosin-Methylierungen und weitere chemische
Modifikationen von DNA-Basen von Genen, die mit Tumor-Suppressorgenen
und Onkogenen assoziiert sind und zu deren Regulation weiterhin
erforderliche Sequenzen. Weitere epigenetische Parameter sind beispielsweise
die Acetylierung von Histonen, die jedoch mit dem beschriebenen
Verfahren nicht direkt analysiert werden kann, sondern wiederum
mit der DNA-Methylierung korreliert.
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Die Erfindung soll nun im folgenden
anhand der Sequenzen und Beispiele unter Bezugnahme auf die beigefügte Figur
weiter verdeutlicht werden, ohne daß die Erfindung hierauf eingeschränkt wird.
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Figur 1
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1 zeigte
die Hybridisierung von Fluoreszenz-markierten Amplifikaten an ein
Oberflächen-gebundenes
Oligonukleotid. Probe I stammt von pilocytischem Astrocytom (Hirntumor)-Gewebe
und Probe II stammt von Astrocytom Grad II (Hirntumor)-Gewebe. Die
Fluoreszenz an einem Punkt zeigt die Hybridisierung des Amplifikats
an. Die Hybridisierung an ein CG Oligonukleotid zeigt an, daß die Methylierung
an der Cytosin-Position analysiert wird, die Hybridisierung an ein
TG Oligonukleotid zeigt an, daß keine
Methylierung an der Cytosin-Position analysiert wird.
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Seq ID No. 1 bis Seq ID
No. 536
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Die Seq ID No. 1 bis Seq ID No. 536
zeigen Sequenzen der chemisch vorbehandelten genomischen DNAs von
verschiedenen Genen, die mit Tumor-Suppressorgenen und Onkogenen
assoziiert sind, gemäß der Erfindung.
Sequenzen, die ungerade Sequenznummern haben (z.B., Seq. ID No.
1, 3, 5,...) zeigen in jedem Fall Sequenzen der chemisch vorbehandelten
genomischen DNAs von verschiedenen Genen, die mit Tumor-Suppressorgenen
und Onkogenen assoziiert sind. Sequenzen, die gerade Sequenznummern
aufweisen (z.B., Seq. ID No. 2, 4, 6, ...) zeigen in jedem Fall
Sequenzen der chemisch vorbehandelten genomischen DNAs von verschiedenen
Genen, die mit Tumor-Suppressorgenen und Onkogenen assoziiert sind,
die komplementär
zu den voranstehenden Sequenzen sind (z.B., die komplementäre Sequenz
zu Seq. ID No. 1 ist Seq. ID No. 2, die komplementäre Sequenz
zu Seq. ID No. 3 ist Seq. ID No. 4, usw.)
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Seg. ID No. 537 bis Seq.
ID No. 540
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Seq. ID No. 537 bis Seq. ID No. 540
zeigen spezifische Oligonukleotid-Sequenzen, wie in Beispiel 1 verwendet.
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Das folgende Beispiel betrifft ein
Fragment eines Gens, das mit Tumor-Suppressorgenen und Onkogenen
assoziiert ist, in diesem Fall MYC, wobei eine spezifische CG-Position
auf ihren Methylierungsstatus hin analysiert wird.
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Beispiel 1: Methylierungsanalyse
in dem mit Tumor-Suppressorgenen und Onkogenen assoziierten Gen
MYC
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Das folgende Beispiel betrifft ein
Fragment des Gens MYC, worin eine spezifische CG-Position auf ihren Methylierungsstatus
hin analysiert wird.
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Im ersten Schritt wird eine genomische
Sequenz unter Verwendung von Bisulfit (Hydrogensulfit, Disulfit)
derart behandelt, daß alle
nicht an der 5-Position der Base methylierten Cytosine so verändert werden,
daß eine
hinsichtlich dem Basenpaarungsverhalten unterschiedliche Base entsteht,
während
die in 5-Position methylierten Cytosine unverändert bleiben.
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Wird für die Reaktion Bisulfit verwendet,
so findet an den nicht methylierten Cytosinbasen eine Addition statt.
Zudem müssen
ein denaturierendes Reagenz oder Lösungsmittel sowie ein Radikalfänger zugegen sein.
Eine anschließende
alkalische Hydrolyse führt
dann zur Umwandlung von nicht methylierten Cytosin-Nukleobasen in
Uracil. Chemisch umgewandelte DNA dient dann dazu, methylierte Cytosine
nachzuweisen. Im zweiten Verfahrensschritt verdünnt man die behandelte DNA-Probe
mit Wasser oder einer wäßrigen Lösung. Bevorzugt
wird anschließend
eine Desulfonierung der DNA (10-30 min, 90-100 °C) bei alkalischem pH-Wert durchgeführt. Im
dritten Schritt des Verfahrens amplifiziert man die DNA-Probe in
einer Polymerasekettenreaktion, bevorzugt mit einer hitzebeständigen DNA-Polymerase.
Im vorliegenden Fall werden Cytosine des Gens MYC analysiert. Dazu
wird mit den spezifischen Primeroligonukleotiden TTTTGTGTGGAGGGTAGTTG (Seq.
ID No. 537) und CCCCAAATAAACAAAATAACC (Seq. ID No. 538) ein definiertes
Fragment der Länge 831
bp amplifiziert. Dieses Amplifikat dient als Probe, die an ein vorher
an einer Festphase gebundenes Oligonukleotid unter Ausbildung einer
Duplexstruktur hybridisiert, beispielsweise TAAGGATGCGGTTTGTTA (Seq.
ID No. 539), wobei sich das nachzuweisende Cytosin an Position 60
des Amplifikats befindet. Der Nachweis des Hybridisierungsprodukts
beruht auf Cy3 und Cy5 fluoreszenzmarkierten Primer-Oligonukleotiden,
die für
die Amplifikation verwendet wurden. Nur wenn in der Bisulfit behandelten
DNA an dieser Stelle ein methyliertes Cytosin vorgelegen hat, kommt
es zu einer Hybridisierungsreaktion der amplifizierten DNA mit dem
Oligonukleotid. Somit kann der Methylierungsstatus des jeweiligen
zu untersuchenden Cytosins über
das Hybridisierungsprodukt abgeleitet werden.
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Um den Methylierungsstatus der Position
zu überprüfen, wird
eine Probe des Amplifikats weiterhin an ein anderes Oligonukleotid
hybridisiert, das vorher an eine feste Phase gebunden wurde. Dieses
Oligonukleotid ist identisch zu dem Oligonukleotid, das vorher benutzt
wurde, um den Methylierungsstatus der Probe zu analysieren, mit
der Ausnahme der fraglichen Position. An der zu analysierenden Position
umfaßt
das Oligonukleotid eine Thymin-Base, im Gegensatz zu einer Cytosin-Base
d.h. die Sequenz TAAGGATGTGGTTTGTTA (Seq. ID No. 540). Daher findet
die Hybridisierungsreaktion nur statt, falls ein nicht-methyliertes
Cytosin an der zu analysierenden Positionen vorhanden ist.
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Die Analyse wurde an zwei Gewebeproben
durchgeführt,
Probe 1 aus pilocytischem Astrocytom (Hirntumor) und Probe 2 aus
Astrocytom Grad II (Hirntumor). Aus den Ergebnissen (1) kann gesehen werden, daß Probe
1 an Position 60 des Amplifikat nicht methyliert war, wohingegen
im Vergleich Probe 2 ein Gemisch von sowohl methylierten als auch
nicht-methylierten Zellen an derselben Position aufwies.
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Beispiel 2: Diagnose von
mit Tumor-Suppressorgenen und Onkogenen assoziierten Erkrankungen
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Um einen Bezug der Methylierungsmuster
zu einer der mit Tumor-Suppressorgenen und Onkogenen assoziierten
Erkrankungen herzustellen, bedarf es zunächst der Untersuchung der DNA-Methylierungsmuster einer
Gruppe von erkrankten und einer Gruppe von gesunden Personen. Diese
Untersuchungen werden zum Beispiel analog dem Beispiel 1 durchgeführt. Die
so erhaltenen Ergebnisse werden in einer Datenbank abgespeichert
und die CpG Dinukleotide identifiziert, die zwischen den beiden
Gruppen unterschiedlich methyliert sind. Dies kann durch Bestimmung
einzelner CpG Methylierungsraten erfolgen, wie dies z. B. durch
Sequenzieren relativ ungenau oder aber durch eine Methylierungs-sensitive „Primer- Extension-Reaktion" sehr genau möglich ist.
Auch gleichzeitige Analyse des gesamten Methylierungsstatus ist
möglich,
und die Muster können z.B.
mittels Clustering-Analysen, die z.B. durch einen Rechner durchgeführt werden
können,
verglichen werden.
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Nachfolgend ist es möglich, untersuchte
Patienten einer bestimmten Therapiegruppe zuzuordnen und diese Patienten
gezielt mit einer individualisierten Therapie zu behandeln.
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Beispiel 2 kann zum Beispiel für die folgenden
Erkrankungen durchgeführt
werden: Soliden Tumoren und Krebsarten.
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Tabelle 1
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Auflistung von bevorzugten Genen
der vorliegenden Erfindung, die mit Tumor-Suppressorgenen und Onkogenen assoziiert
sind.
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