DE10061338A1 - Diagnose von mit Angiogenese assoziierten Krankheiten - Google Patents
Diagnose von mit Angiogenese assoziierten KrankheitenInfo
- Publication number
- DE10061338A1 DE10061338A1 DE10061338A DE10061338A DE10061338A1 DE 10061338 A1 DE10061338 A1 DE 10061338A1 DE 10061338 A DE10061338 A DE 10061338A DE 10061338 A DE10061338 A DE 10061338A DE 10061338 A1 DE10061338 A1 DE 10061338A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- seq
- dna
- oligonucleotide
- oligomer
- oligomers
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Ceased
Links
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 title claims abstract description 60
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title claims description 20
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title claims description 20
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title claims description 17
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 66
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 48
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 48
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 31
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims abstract description 19
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- 230000030933 DNA methylation on cytosine Effects 0.000 claims abstract description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 49
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 claims description 40
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 40
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 29
- 230000011987 methylation Effects 0.000 claims description 28
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 claims description 28
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 23
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 22
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 21
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 21
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 20
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 19
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 19
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 claims description 17
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 15
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 15
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 14
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 14
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 14
- 108091029430 CpG site Proteins 0.000 claims description 13
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 11
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 8
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims description 7
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 claims description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 7
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 claims description 6
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 claims description 6
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 claims description 6
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 208000030533 eye disease Diseases 0.000 claims description 6
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 6
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 claims description 5
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 claims description 5
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 claims description 5
- 206010038934 Retinopathy proliferative Diseases 0.000 claims description 5
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 claims description 5
- 238000003795 desorption Methods 0.000 claims description 5
- WBZKQQHYRPRKNJ-UHFFFAOYSA-L disulfite Chemical compound [O-]S(=O)S([O-])(=O)=O WBZKQQHYRPRKNJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 claims description 5
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 201000009240 nasopharyngitis Diseases 0.000 claims description 5
- 201000003142 neovascular glaucoma Diseases 0.000 claims description 5
- NOOLISFMXDJSKH-UHFFFAOYSA-N p-menthan-3-ol Chemical compound CC(C)C1CCC(C)CC1O NOOLISFMXDJSKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 5
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 claims description 5
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 claims description 4
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 claims description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 4
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 4
- 229940079826 hydrogen sulfite Drugs 0.000 claims description 4
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 claims description 4
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 claims description 4
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 3
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000010949 copper Substances 0.000 claims description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 3
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 3
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims description 3
- 239000010703 silicon Substances 0.000 claims description 3
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000004332 silver Substances 0.000 claims description 3
- 239000010959 steel Substances 0.000 claims description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 2
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 claims description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 claims description 2
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 2
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims description 2
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 claims description 2
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 claims description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 2
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 claims 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims 2
- LOGFVTREOLYCPF-KXNHARMFSA-N (2s,3r)-2-[[(2r)-1-[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxybutanoic acid Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CCCCN LOGFVTREOLYCPF-KXNHARMFSA-N 0.000 claims 1
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 claims 1
- 102100026802 72 kDa type IV collagenase Human genes 0.000 claims 1
- 101710151806 72 kDa type IV collagenase Proteins 0.000 claims 1
- 102100033402 Angiopoietin-4 Human genes 0.000 claims 1
- 102000004881 Angiotensinogen Human genes 0.000 claims 1
- 108090001067 Angiotensinogen Proteins 0.000 claims 1
- 108010059108 CD18 Antigens Proteins 0.000 claims 1
- 102000053028 CD36 Antigens Human genes 0.000 claims 1
- 108010045374 CD36 Antigens Proteins 0.000 claims 1
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 claims 1
- 102100037904 CD9 antigen Human genes 0.000 claims 1
- 102100037182 Cation-independent mannose-6-phosphate receptor Human genes 0.000 claims 1
- 102000016950 Chemokine CXCL1 Human genes 0.000 claims 1
- 108010014419 Chemokine CXCL1 Proteins 0.000 claims 1
- 102000004266 Collagen Type IV Human genes 0.000 claims 1
- 108010042086 Collagen Type IV Proteins 0.000 claims 1
- 101100481408 Danio rerio tie2 gene Proteins 0.000 claims 1
- 108010003751 Elongin Proteins 0.000 claims 1
- 102000004662 Elongin Human genes 0.000 claims 1
- 102100028075 Fibroblast growth factor 6 Human genes 0.000 claims 1
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 claims 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 claims 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 claims 1
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 claims 1
- 101001028831 Homo sapiens Cation-independent mannose-6-phosphate receptor Proteins 0.000 claims 1
- 101001060265 Homo sapiens Fibroblast growth factor 6 Proteins 0.000 claims 1
- 101001035237 Homo sapiens Integrin alpha-D Proteins 0.000 claims 1
- 101001033249 Homo sapiens Interleukin-1 beta Proteins 0.000 claims 1
- 101001091610 Homo sapiens Krev interaction trapped protein 1 Proteins 0.000 claims 1
- 101000990912 Homo sapiens Matrilysin Proteins 0.000 claims 1
- 101001087358 Homo sapiens Securin-2 Proteins 0.000 claims 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 claims 1
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 claims 1
- 102100032825 Integrin alpha-8 Human genes 0.000 claims 1
- 102100039903 Integrin alpha-9 Human genes 0.000 claims 1
- 102100039904 Integrin alpha-D Human genes 0.000 claims 1
- 108010042918 Integrin alpha5beta1 Proteins 0.000 claims 1
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 claims 1
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 claims 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 claims 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 claims 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 claims 1
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 claims 1
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 claims 1
- 102000004125 Interleukin-1alpha Human genes 0.000 claims 1
- 108010082786 Interleukin-1alpha Proteins 0.000 claims 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims 1
- 102100026019 Interleukin-6 Human genes 0.000 claims 1
- 108010038501 Interleukin-6 Receptors Proteins 0.000 claims 1
- 102100037792 Interleukin-6 receptor subunit alpha Human genes 0.000 claims 1
- 102100035878 Krev interaction trapped protein 1 Human genes 0.000 claims 1
- 102100027020 Latent-transforming growth factor beta-binding protein 3 Human genes 0.000 claims 1
- 101710178976 Latent-transforming growth factor beta-binding protein 3 Proteins 0.000 claims 1
- 102100030417 Matrilysin Human genes 0.000 claims 1
- 102000001776 Matrix metalloproteinase-9 Human genes 0.000 claims 1
- 108010015302 Matrix metalloproteinase-9 Proteins 0.000 claims 1
- 101100481410 Mus musculus Tek gene Proteins 0.000 claims 1
- 102000008052 Nitric Oxide Synthase Type III Human genes 0.000 claims 1
- 108010075520 Nitric Oxide Synthase Type III Proteins 0.000 claims 1
- 102100028452 Nitric oxide synthase, endothelial Human genes 0.000 claims 1
- 108010022233 Plasminogen Activator Inhibitor 1 Proteins 0.000 claims 1
- 102100039418 Plasminogen activator inhibitor 1 Human genes 0.000 claims 1
- 102000008866 Prostaglandin E receptors Human genes 0.000 claims 1
- 108010088540 Prostaglandin E receptors Proteins 0.000 claims 1
- 108090000783 Renin Proteins 0.000 claims 1
- 101001070647 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) 60S ribosomal protein L20-A Proteins 0.000 claims 1
- 101001070655 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) 60S ribosomal protein L20-B Proteins 0.000 claims 1
- 102000012152 Securin Human genes 0.000 claims 1
- 108010061477 Securin Proteins 0.000 claims 1
- 102100033002 Securin-2 Human genes 0.000 claims 1
- 101710082813 Serine/threonine-protein kinase receptor R3 Proteins 0.000 claims 1
- 108090000054 Syndecan-2 Proteins 0.000 claims 1
- 102000003711 Syndecan-2 Human genes 0.000 claims 1
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 claims 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 claims 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 claims 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 claims 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 claims 1
- 208000036815 beta tubulin Diseases 0.000 claims 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 claims 1
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 claims 1
- 108010024081 integrin alpha8 Proteins 0.000 claims 1
- 108010024069 integrin alpha9 Proteins 0.000 claims 1
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 claims 1
- 108010066052 multidrug resistance-associated protein 1 Proteins 0.000 claims 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 12
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 5
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 5
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 4
- 229940121369 angiogenesis inhibitor Drugs 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 108010031429 Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-3 Proteins 0.000 description 3
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 3
- 238000003491 array Methods 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 3
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 3
- 208000009575 Angelman syndrome Diseases 0.000 description 2
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 2
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 2
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 201000010769 Prader-Willi syndrome Diseases 0.000 description 2
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 102000005406 Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-3 Human genes 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 2
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 2
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- HWPZZUQOWRWFDB-UHFFFAOYSA-N 1-methylcytosine Chemical compound CN1C=CC(N)=NC1=O HWPZZUQOWRWFDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108010064733 Angiotensins Proteins 0.000 description 1
- 102000015427 Angiotensins Human genes 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101000573882 Coccidioides posadasii (strain C735) Neutral protease 2 homolog MEP3 Proteins 0.000 description 1
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000007118 DNA alkylation Effects 0.000 description 1
- 230000006429 DNA hypomethylation Effects 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000003971 Fibroblast Growth Factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102100026236 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 208000002180 Laurin-Sandrow syndrome Diseases 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- -1 Phosphorothioate nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical group OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 1
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 1
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002416 angiotensin derivative Substances 0.000 description 1
- JYPVVOOBQVVUQV-CGHBYZBKSA-N angiotensinamide Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 JYPVVOOBQVVUQV-CGHBYZBKSA-N 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000006326 desulfonation Effects 0.000 description 1
- 238000005869 desulfonation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 229940029303 fibroblast growth factor-1 Drugs 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 230000011365 genetic imprinting Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N interleukin-8 Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@@H](NC(C)=O)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(N)=O)C1=CC=CC=C1 XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N 0.000 description 1
- 229940096397 interleukin-8 Drugs 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000000752 ionisation method Methods 0.000 description 1
- 238000001698 laser desorption ionisation Methods 0.000 description 1
- 230000035168 lymphangiogenesis Effects 0.000 description 1
- 208000006178 malignant mesothelioma Diseases 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000004001 molecular interaction Effects 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 230000014399 negative regulation of angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 230000005868 ontogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000028742 placenta development Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 1
- 230000037425 regulation of transcription Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 102000015380 snRNP Core Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010039827 snRNP Core Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 1
- 230000002100 tumorsuppressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000007998 vessel formation Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/154—Methylation markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft die chemisch modifizierte genomische Sequenzen von mit Angiogenese assoziierten Genen, gegen die Sequenz gerichtete Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere zur Detektion des Cytosin-Methylierungszustandes von mit Angiogenese assoziierten Genen sowie ein Verfahren zur Ermittlung von genetischen und/oder epigenetischen Parametern von mit Angiogenese assoziierten Genen.
Description
Die nach den methodischen Entwicklungen der letzten Jahre in der Molekularbiologie gut studierten
Beobachtungsebenen sind die Gene selbst, die Übersetzung dieser Gene in RNA und die daraus
entstehenden Proteine. Wann im Laufe der Entwicklung eines Individuums, welches Gen
angeschaltet wird und wie Aktivieren und Inhibieren bestimmter Gene in bestimmten Zellen und
Geweben gesteuert wird, ist mit Ausmaß und Charakter der Methylierung der Gene bzw. des
Genoms korrelierbar. Insofern äußern sich pathogene Zustände in einem veränderten
Methylierungsmuster einzelner Gene oder des Genoms.
Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuren, Oligonukleotide, PNA-Oligomere und ein
Verfahren zur Diagnose und/oder Therapie von Erkrankungen, die mit dem genetischen und/oder
epigenetischen Parametern von mit Angiogenese assoziierten Genen und insbesondere deren
Methylierungsstatus in Zusammenhang stehen.
Die Angiogenese beschreibt den Prozess der Bildung neuer Blutgefäße. Dieser auch als
Neovascularisation bezeichnete Prozess findet normalerweise während der Embryogenese und der
plazentalen Entwicklung statt, aber auch im adulten Organismus und während der Wundheilung.
Eine Stimulation durch ein oder mehrere bekannte Wachstumsfaktoren initiiert die Angiogenese,
doch sind möglicherweise auch andere, bis jetzt nicht identifizierte Faktoren, daran beteiligt. Die
Angiogenese wird kontrolliert durch das Gleichgewicht zwischen Stimulatoren und Inhibitoren und
wird unter normalen physiologischen Bedingungen unterdrückt. Eine Verschiebung dieses
Gleichgewichts spielt eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung einer Vielzahl von
Erkrankungen, wobei die Unterschiede dieses Gleichgewichts in den unterschiedlichen Organen
variieren.
Zu den pathogenen Zuständen, mit denen die Angiogenese in Zusammenhang steht gehören zum
Beispiel Augenerkrankungen, proliferative Retinopathie, neovasculares Glaukom, solide Tumoren
und Erkrankungen, die mit Gewebsentzündungen wie Rheumatischer Arthritis zusammenhängen
(Moses MA, Langer R. Inhibitors of angiogenesis. Biotechnology (N Y). 1991 Jul; 9(7): 630-4):
Weiterhin diabetische Retinopathie, maculare Degeneration aufgrund von Neovascularisation,
Psoriasis oder Artheriosklerose (Cherrington JM, Strawn LM, Shawver LK. New paradigms for the
treatment of cancer: the role of anti-angiogenesis agents. Adv Cancer Res. 2000; 79: 1-38),
ulcerativer Darmkatarrh (Thorn M, Raab Y, Larsson A, Gerdin B, Hallgren R. Intestinal mucosal
secretion of basic fibroblast growth factor in patients with ulcerative colitis. Scand J Gastroenterol.
2000 Apr; 35(4): 408-12) oder entzündliche Darmerkrankungen, wie Morbus Crohn (Bousvaros A,
Leichtner A, Zurakowski D, Kwon 3, Law T, Keough K, Fishman S. Elevated serum vascular
endothelial growth factor in children and young adults with Crohn's disease. Dig Dis Sci. 1999
Feb; 44(2): 424-30). Auch bei Krebs spielt die Angiogenese eine entscheidende Rolle (Papac RJ.
Spontaneous regression of cancer: possible mechanisms. In Vivo. 1998 Nov-Dec; 12(6): 571-8;
Giavazzi R, Taraboletti G. Angiogenesis and angiogenesis inhibitors in cancer. Forum (Genova).
1999 Jul-Sep; 9(3): 261-72). Hier werden durch die Blutgefäßformation in dem wachsenden
Tumorgewebe Sauerstoff und Nährstoffe zu den Tumorzellen geliefert; ebenso wird gewissermaßen
ein Leitungssystem bereitgestellt, über das Tumorzellen überall im Körper metastasieren können.
Die Beteiligung der Angiogenese an solch unterschiedlichen Erkrankungen wie Krebs,
Augenerkrankungen und entzündlichen Erkrankungen hat dazu geführt, Methoden zu entwickeln,
die sich speziell mit der Inhibierung von Angiogenese beschäftigen. Für Krebspatienten stellen
solche Methoden einen erheblichen Vorteil gegenüber herkömmlichen Methoden, wie z. B.
Chemotherapie mit ihren massiven Nebenwirkungen, die teilweise in einer inakzeptablen Morbidität
resultieren oder bis zum Tod des Patienten führen, dar. In der Praxis limitieren diese mit
Krebstherapien assoziierten unerwünschten Nebenwirkungen, oftmals die Behandlung, die einem
Patienten helfen könnte.
Für andere pathologische Zustände, die mit abnormaler Angiogenese assoziiert sind, wie z. B.
diabetische Retinopathie, gibt es in Ermangelung an Retina Transplantaten keine effektiven
Behandlungen. Sollte dennoch eine Netzhaut transplantiert werden, würde die neue Retina den
gleichen Bedingungen unterworfen sein wie die Original Retina. Dies verdeutlicht die
Notwendigkeit, die molekularen Interaktionen zu identifizieren, die in Zusammenhang mit der bei
bestimmten pathologischen Zuständen vorkommenden Angiogenese stehen, um Methoden zur
Diagnose und spezielle Therapien zu entwickeln. Bisher wurden im Prinzip zwei Hauptansätze zur
Detektion und Inhibierung von pathogener Angiogenese verfolgt: erstens die Inhibierung des
Prozesses der Angiogenese und der Gefäßanordnung (Anti-Antiangiogense) und zweitens die
direkte Eingrenzung und Zerstörung der Tumorgefässbildung (vascular-targeting) (Giavazzi R,
Taraboletti G. Angiogenesis and angiogenesis inhibitors in cancer. Forum (Genova). 1999 Jul-
Sep; 9(3): 261-72).
Kürzlich durchgeführte Untersuchungen haben verdeutlicht, dass ein genetisches Umschalten die
Angiogenese reguliert (Hanahan D, Folkman J. Patterns and emerging mechanisms of the
angiogenic switch during tumorigenesis. Cell. 1996 Aug 9; 86(3): 353-64). Onkogene, Tumor
suppressive oder mutierte Formen mitogener Signalstoffwechselwege und Umschaltmechanismen in
der Kontrolle des Zellzyklus regulieren wahrscheinlich Gene, die in die Angiogenese involviert
sind (Folkman J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nat Med. 1995
Jan; l(1): 27-31). Allerdings sind die detaillierten genetischen Veränderungen und ihre Effekte auf
die Angiogenese noch nicht identifiziert. Als putative Kandidatengene für die Angiogenese werden
zum Beispiel vasculare endothele Wachstumsfaktoren (VEGFs) (Ohta Y, Shridhar V, Bright RK,
Kalemkerian GP, Du W, Carbone M, Watanabe Y, Pass HI. VEGF and VEGF type C play an
important role in angiogenesis and lymphangiogenesis in human malignant mesothelioma tumours.
Br J Cancer. 1999 Sep; 81(1): 54-61), Angiotensine (Machado RD, Santos RA, Andrade SP.
Opposing actions of angiotensins on angiogenesis. Life Sci. 2000; 66(1): 67-76.), Interleukine
(Anderson IC, Mari SE, Broderick RJ, Mari BP, Shipp MA. The angiogenic factor interleukin 8 is
induced in non-small cell lung cancer/pulmonary fibroblast cocultures. Cancer Res. 2000 Jan
15; 60(2): 269-72); oder Fibroblasten- Wachstumsfaktoren (FGFs) (Dikov mm, Reich MB, Dworkin
L, Thomas JW, Miller GG. A functional fibroblast growth factor-1 immunoglobulin fusion protein.
J Biol Chem. 1998 Jun 19; 273(25): 15811-7) angesehen.
5-Methylcytosin ist die häufigste kovalent modifizierte Base in der DNA eukaryotischer Zellen. Sie
spielt beispielsweise eine Rolle in der Regulation der Transkription, beim genetischen Imprinting
und in der Tumorgenese. Die Identifizierung von 5-Methylcytosin als Bestandteil genetischer
Information ist daher von erheblichem Interesse. 5-Methylcytosin-Positionen können jedoch nicht
durch Sequenzierung identifiziert werden, da 5-Methylcytosin das gleiche Basenpaarungsverhalten
aufweist wie Cytosin. Darüber hinaus geht bei einer PCR-Amplifikation die epigenetische
Information, welche die 5-Methylcytosine tragen, vollständig verloren.
Eine relativ neue und die mittlerweile am häufigsten angewandte Methode zur Untersuchung von
DNA auf 5-Methylcytosin beruht auf der spezifischen Reaktion von Bisulfit mit Cytosin, das nach
anschließender alkalischer Hydrolyse in Uracil umgewandelt wird, welches in seinem
Basenpaarungsverhalten dem Thymidin entspricht. 5-Methylcytosin wird dagegen unter diesen
Bedingungen nicht modifiziert. Damit wird die ursprüngliche DNA so umgewandelt, dass
Methylcytosin, welches ursprünglich durch sein Hybridisierungsverhalten vom Cytosin nicht
unterschieden werden kann, jetzt durch "normale" molekularbiologische Techniken als einzig
verbliebenes Cytosin beispielsweise durch Amplifikation und Hybridisierung oder Sequenzierung
nachgewiesen werden kann. Alle diese Techniken beruhen auf Basenpaarung, welche jetzt voll
ausgenutzt wird. Der Stand der Technik, was die Empfindlichkeit betrifft, wird durch ein Verfahren
definiert, welches die zu untersuchende DNA in einer Agarose-Matrix einschließt, dadurch die
Diffusion und Renaturierung der DNA (Bisulfit reagiert nur an einzelsträngiger DNA) verhindert
und alle Fällungs- und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse ersetzt (Olek A, Oswald J, Walter
J. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic
Acids Res. 1996 Dec 15; 24(24): 5064-6). Mit dieser Methode können einzelne Zellen untersucht
werden, was das Potential der Methode veranschaulicht. Allerdings werden bisher nur einzelne
Regionen bis etwa 3000 Basenpaare Länge untersucht, eine globale Untersuchung von Zellen auf
Tausenden von möglichen Methylierungsanalysen ist nicht möglich. Allerdings kann auch dieses
Verfahren keine sehr kleinen Fragmente aus geringen Probenmengen zuverlässig analysieren. Diese
gehen trotz Diffusionsschutz durch die Matrix verloren.
Eine Übersicht über die weiteren bekannten Möglichkeiten, 5-Methylcytosine nachzuweisen, kann
aus dem folgenden Übersichtsartikel entnommen werden: Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H.,
Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2255.
Die Bisulfit-Technik wird bisher bis auf wenige Ausnahmen (z. B. Zeschnigk M, Lich C, Buiting K,
Doerfler W, Horsthemke B. A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman and Prader-Willi
syndrome based on allelic methylation differences at the SNRPN locus. Eur J Hum Genet. 1997
Mar-Apr; 5(2): 94-8) nur in der Forschung angewendet. Immer aber werden kurze, spezifische Stücke
eines bekannten Gens nach einer Bisulfit-Behandlung amplifiziert und entweder komplett
sequenziert (Olek A, Walter J. The pre-implantation ontogeny of the H19 methylation imprint. Nat
Genet. 1997 Nov; 17(3): 275-6) oder einzelne Cytosin-Positionen durch eine "Primer-Extension-
Reaktion" (Gonzalgo ML, Jones PA. Rapid quantitation of methylation differences at specific sites
using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE). Nucleic Acids Res.
1997 Jun 15; 25(12): 2529-31, WO-Patent 9500669) oder einen Enzymschnitt (Xiong Z, Laird PW.
COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 1997 Jun
15; 25(12):2532-4) nachgewiesen. Zudem ist auch der Nachweis durch Hybridisierung beschrieben
worden (Olek et al., WO 99 28498).
Weitere Publikationen, die sich mit der Anwendung der Bisulfit-Technik zum
Methylierungsnachweis bei einzelnen Genen befassen, sind: Grigg G, Clark S. Sequencing 5-
methylcytosine residues in genomic DNA. Bioessays. 1994 Jun; 16(6): 431-6, 431; Zeschnigk M,
Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke B, Doerfler W. Imprinted segments in the human
genome: different DNA methylation patterns in the Prader-Willi/Angelman syndrome region as
determined by the genomic sequencing method. Hum Mol Genet. 1997 Mar; 6(3): 387-95; Feil R,
Charlton J, Bird AP, Walter J, Reik W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved
protocol for bisulphite genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 1994 Feb 25; 22(4): 695-6; Martin
V, Ribieras S, Song-Wang X, Rio MC, Dante R. Genomic sequencing indicates a correlation
between DNA hypomethylation in the 5' region of the pS2 gene and its expression in human breast
cancer cell lines. Gene. 1995 May 19; 157(1-2): 261-4; WO 97 46705, WO 95 15373 und
WO 45560.
Eine Übersicht über den Stand der Technik in der Oligomer Array Herstellung läßt sich aus einer im
Januar 1999 erschienenen Sonderausgabe von Nature Genetics (Nature Genetics Supplement,
Volume 21, January 1999) und der dort zitierten Literatur entnehmen.
Für die Abtastung eines immobilisierten DNA-Arrays sind vielfach fluoreszenzmarkierte Sonden
verwendet worden. Besonders geeignet für Fluoreszenzmarkierungen ist das einfache Anbringen
von Cy3 und Cy5 Farbstoffen am 5'-OH der jeweiligen Sonde. Die Detektion der Fluoreszenz der
hybridisierten Sonden erfolgt beispielsweise über ein Konfokalmikroskop. Die Farbstoffe Cy3 und
Cy5 sind, neben vielen anderen, kommerziell erhältlich.
Matrix-assistierte Laser Desorptions/Ionisations-Massenspektrometrie (MALDI-TOF) ist eine sehr
leistungsfähige Entwicklung für die Analyse von Biomolekülen (Karas M, Hillenkamp F. Laser
desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem.
1988 Oct 15; 60(20): 2299-301). Ein Analyt wird in eine lichtabsorbierende Matrix eingebettet.
Durch einen kurzen Laserpuls wird die Matrix verdampft und das Analytmolekül so unfragmentiert
in die Gasphase befördert. Durch Stöße mit Matrixmolekülen wird die Ionisation des Analyten
erreicht. Eine angelegte Spannung beschleunigt die Ionen in ein feldfreies Flugrohr. Auf Grund
ihrer verschiedenen Massen werden Ionen unterschiedlich stark beschleunigt. Kleinere Ionen
erreichen den Detektor früher als größere.
MALDI-TOF Spektrometrie eignet sich ausgezeichnet zur Analyse von Peptiden und Proteinen. Die
Analyse von Nukleinsäuren ist etwas schwieriger (Gut I G, Beck S. DNA and Matrix Assisted Laser
Desorption Ionization Mass Spectrometry. Current Innovations and Future Trends. 1995, 1;
147-57). Für Nukleinsäuren ist die Empfindlichkeit etwa 100mal schlechter als für Peptide und nimmt
mit zunehmender Fragmentgröße überproportional ab. Für Nukleinsäuren, die ein vielfach negativ
geladenes Rückgrat haben, ist der Ionisationsprozeß durch die Matrix wesentlich ineffizienter. In
der MALDI-TOF Spektrometrie spielt die Wahl der Matrix eine eminent wichtige Rolle. Für die
Desorption von Peptiden sind einige sehr leistungsfähige Matrices gefunden worden, die eine sehr
feine Kristallisation ergeben. Für DNA gibt es zwar mittlerweile einige ansprechende Matrices,
jedoch wurde dadurch der Empfindlichkeitsunterschied nicht verringert. Der
Empfindlichkeitsunterschied kann verringert werden, indem die DNA chemisch so modifiziert wird,
dass sie einem Peptid ähnlicher wird. Phosphorothioatnukleinsäuren, bei denen die gewöhnlichen
Phosphate des Rückgrats durch Thiophosphate substituiert sind, lassen sich durch einfache
Alkylierungschemie in eine ladungsneutrale DNA umwandeln (Gut IG, Beck S. A procedure for
selective DNA alkylation and detection by mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 1995 Apr
25; 23(8): 1367-73). Die Kopplung eines "charge tags" an diese modifizierte DNA resultiert in der
Steigerung der Empfindlichkeit um den gleichen Betrag, wie er für Peptide gefunden wird. Ein
weiterer Vorteil von "charge tagging" ist die erhöhte Stabilität der Analyse gegen
Verunreinigungen, die den Nachweis unmodifizierter Substrate stark erschweren.
Genonische DNA wird durch Standardmethoden aus DNA von Zell-, Gewebe- oder sonstigen
Versuchsproben gewonnen. Diese Standardmethodik findet sich in Referenzen wie Fritsch und
Maniatis eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.
Die vorliegende Erfindung soll Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere zur Detektion von
Cytosin-Methylierungen und ein Verfahren bereitstellen, welches sich zur Diagnose und/oder
Therapie von genetischen und epigenetischen Parametern von mit Angiogenese assoziierten Genen
besonders eignet. Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, dass sich insbesondere Cytosin-
Methylierungsmuster zur Diagnose und/oder Therapie von mit Angiogenese assoziierten
Erkrankungen besonders eignen.
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die chemisch modifizierte DNA von mit Angiogenese
assoziierten Genen, sowie Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere zur Detektion von Cytosin-
Methylierungen, sowie ein Verfahren bereit zu stellen, welches sich zur Diagnose und/oder
Therapie von genetischen und epigenetischen Parametern von mit Angiogenese assoziierten Genen
besonders eignet. Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, dass sich genetische und
epigenetische Parameter und insbesondere das Cytosin-Methylierungsmuster von mit Angiogenese
assoziierten Genen zur Diagnose und/oder Therapie von mit Angiogenese assoziierten
Erkrankungen besonders eignen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch eine Nukleinsäure, umfassend einen mindestens 18
Basen langen Sequenzabschnitt der chemisch vorbehandelten DNA von mit Angiogenese
assoziierten Genen gemäß einer der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 206 und zu deren komplementären
Sequenzen und/oder Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomere gemäß Tabelle 1 gelöst. In der
Tabelle werden hinter den aufgeführten Genbezeichnungen jeweils die Datenbank-Nummern
(Accession-Nummern) aufgeführt, welche die zugehörigen Gensequenzen als einzigartig definieren.
Als zugrunde liegende Datenbank wurde GenBank verwendet.
Die chemisch modifizierte Nukleinsäure konnte bisher nicht in Zusammenhang mit der Ermittlung
von genetischen und epigenetische Parametern gebracht werden.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird weiterhin durch ein Oligonukleotid oder Oligomer
zur Detektion des Cytosin-Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter DNA, umfassend
mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von mindestens 13 Nukleotiden gelöst, die an eine
chemisch vorbehandelte DNA von mit Angiogenese assoziierten Genen gemäß einer der Seq. ID
No. 1 bis Seq. ID No. 206 und zu deren komplementären Sequenzen und/oder Oligonukleotid-
und/oder PNA-Oligomeren gemäß Tabelle 1 hybridisiert. Die erfindungsgemäßen Oligomersonden
stellen wichtige und effektive Werkzeuge dar, welche die Ermittlung der genetischen und
epigenetischen Parameter von mit Angiogenese assoziierten Genen erst ermöglichen.
Bevorzugterweise umfaßt die Basensequenz der Oligomere mindestens ein CpG Dinukleotid. Die
Sonden können auch in Form einer PNA (Peptide Nucleic Acid) vorliegen, die besonders
bevorzugte Paarungseigenschaften aufweist. Besonders bevorzugt sind erfindungsgemäße
Oligonukleotide, bei denen das Cytosin des CpG Dinukleotids das 5.-9. Nukleotid vom 5'-Ende
des 13 mers ist, im Falle von PNA-Oligomeren ist es bevorzugt, dass das Cytosin des CpG
Dinukleotids das 4.-6. Nukleotid vom 5'-Ende des 9 mers ist.
Die erfindungsgemäßen Oligomere werden normalerweise in sogenannten Sets eingesetzt, die für
jedes der CpG Dinukleotide eine der Sequenzen der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 206 und zu deren
komplementären Sequenzen und/oder Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomere gemäß Tabelle 1
mindestens ein Oligomer umfassen. Bevorzugt ist ein Set, das für jedes der CpG Dinukleotide aus
einer der Seq ID No. 1 bis Seq ID No. 206 und zu deren komplementären Sequenzen und/oder
Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomere gemäß Tabelle 1 mindestens ein Oligomer umfasst.
Weiterhin stellt die Erfindung ein Set von mindestens zwei Oligonukleotiden zur Verfügung, die als
sogenannte Primeroligonukleotide zur Amplifikation von DNA-Sequenzen einer der Seq. ID No. 1
bis Seq. ID No. 206 und zu deren komplementären Sequenzen und/oder Oligonukleotid- und/oder
PNA-Oligomere gemäß Tabelle 1 oder Abschnitten davon eingesetzt werden können.
Im Falle der erfindungsgemäßen Sets von Oligonukleotiden ist es bevorzugt, dass mindestens ein
Oligonukleotid an eine Festphase gebunden ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen Satz von mindestens 10 n (Oligonukleotiden
und/oder PNA-Oligomeren), die zur Detektion des Cytosin-Methylierungszustandes in chemisch
vorbehandelter genomischer DNA (Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 206 und zu deren komplementären
Sequenzen und/oder Oligonukleotid- und/oder PNA-Qligomere gemäß Tabelle 1) dienen. Mit
diesen Sonden ist die Diagnose und/oder Therapie von genetischen und epigenetischen Parametern
von mit Angiogenese assoziierten Genen möglich. Das Set von Oligomeren kann auch zur
Detektion von Single Nucleotide Polymorphismen (SNPs) in der chemisch vorbehandelten DNA
von mit Angiogenese assoziierten Genen gemäß einer der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 206 und zu
deren komplementären Sequenzen und/oder Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomere gemäß
Tabelle 1 verwendet werden.
Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, dass eine von der Erfindung zur Verfügung gestellte Anordnung
aus unterschiedlichen Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren (ein sogenanntes "Array")
ebenfalls an eine Festphase gebunden vorliegt. Dieses Array von unterschiedlichen Oligonukleotid-
und/oder PNA-Oligomersequenzen kann dadurch gekennzeichnet sein, dass es auf der Festphase in
Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet ist. Bevorzugterweise besteht die
Festphasenoberfläche aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel,
Silber oder Gold. Möglich sind jedoch auch Nitrocellulose sowie Kunststoffe wie zum Beispiel
Nylon, die in Form von Kugeln oder auch als Harz-Matrizes vorliegen können.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung eines auf einem
Trägermaterial fixierten Arrays zur Analyse in Zusammenhang von mit Angiogenese assoziierten
Erkrankungen, bei dem mindestens ein Oligomer gemäß der Erfindung an eine feste Phase
gekoppelt wird. Verfahren zur Herstellung von solchen Arrays sind zum Beispiel aus der US
5,744,305 mittels Festphasenchemie und photolabilen Schutzgruppen bekannt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft einen DNA-Chip zur Analyse in Zusammenhang
von mit Angiogenese assoziierten Erkrankungen, der mindestens eine Nukleinsäure gemäß der
vorliegenden Erfindung umfasst. DNA-Chips sind zum Beispiel aus der US 5,837,832 bekannt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist zudem ein Kit, das zum Beispiel aus einer Bisulfit
enthaltenden Reagenz, einem Satz von Primeroligonukleotiden umfassend mindestens zwei
Oligonukleotide, deren Sequenzen jeweils mindestens einen 18 Basenpaaren langen Abschnitt der
im Anhang aufgeführten Basensequenzen (Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 206 und zu deren
komplementären Sequenzen und/oder Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomere gemäß Tabelle 1)
entsprechen oder zu ihnen komplementär sind, Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren sowie
einer Anleitung zur Durchführung und Auswertung des beschriebenen Verfahrens bestehen kann.
Ein Kit im Sinne der Erfindung kann jedoch auch nur Teile der vorgenannten Bestandteile
enthalten.
Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Ermittlung von genetischen und/oder
epigenetischen Parametern von mit Angiogenese assoziierten Genen durch Analyse von Cytosin-
Methylierungen und Single Nucleotide Polymorphismen zur Verfügung, das folgende Schritte
umfasst:
In einem ersten Verfahrensschritt wird eine genomische DNA-Probe derart chemisch behandelt,
dass an der 5'-Position unmethylierte Cytosinbasen in Uracil, Thymin oder eine andere vom
Hybridisierungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base verwandelt werden. Dies wird im
folgenden unter chemischer Vorbehandlung verstanden.
Die zu analysierende genomische DNA wird bevorzugt aus den üblichen Quellen für DNA erhalten,
wie Zellen oder Zellbestandteilen, zum Beispiel Zelllinien, Biopsine, Blut, Sputum, Stuhl, Urin,
Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit, in Paraffin eingebettetes Gewebe, beispielsweise Gewebe von
Augen, Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologische Objektträger oder
Kombinationen davon.
Bevorzugt wird dazu die oben beschriebene Behandlung genomischer DNA mit Bisulfit
(Hydrogensulfit, Disulfit) und anschließender alkalischer Hydrolyse verwendet, die zu einer
Umwandlung nicht methylierter Cytosin-Nukleobasen in Uracil oder eine andere vom
Basenpaarungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base führt.
Aus dieser chemisch vorbehandelten genomischen DNA werden Fragmente unter Verwendung von
Sätzen von erfindungsgemäßen Primeroligonukleotiden und einer bevorzugterweise hitzestabilen
Polymerase amplifiziert. Aus statistischen und praktikablen Erwägungen werden bevorzugterweise
mehr als zehn unterschiedliche Fragmente amplifiziert, die 100-2000 Basenpaare lang sind. Die
Amplifikation von mehreren DNA-Abschnitten kann simultan in ein und demselben Reaktionsgefäß
durchgeführt werden. Üblicherweise wird die Amplifikation mittels der Polymerasekettenreaktion
(PCR) durchgeführt.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens umfasst der Satz von Primeroligonukleotiden
mindestens zwei Oligonukleotide, deren Sequenzen jeweils revers komplementär oder identisch zu
einem mindestens 18 Basenpaare langen Abschnitt der im Anhang (Seq. ID No. 1 bis Seq. ID
No. 206 und zu deren komplementären Sequenzen und/oder Oligonukleotid- und/oder PNA-
Oligomere gemäß Tabelle 1) aufgelisteten Basensequenzen sind. Die Primeroligonukleotide sind
vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass sie kein CpG Dinukleotid enthalten.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass bei der Amplifikation mindestens ein Primeroligonukleotid
an eine Festphase gebunden ist. Die unterschiedlichen Oligonukleotid und/oder PNA-
Oligomersequenzen können auf einer ebenen Festphase in Form eines rechtwinkligen oder
hexagonalen Gitters angeordnet sein, wobei die Festphasenoberfläche bevorzugt aus Silizium, Glas,
Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold besteht, wobei auch andere
Materialien, wie Nitrocellulose oder Kunststoffe verwendet werden können.
Die mittels der Amplifikation erhaltenen Fragmente können eine direkt oder indirekt nachweisbare
Markierung tragen. Bevorzugt sind Markierungen in Form von Fluoreszenzmarkierungen,
Radionukliden oder ablösbaren Molekülfragmenten mit typischer Masse, die in einem
Massenspektrometer nachgewiesen werden können, wobei bevorzugt ist, dass die erzeugten
Fragmente zur besseren Detektierbarkeit im Massenspektrometer eine einzelne positive oder
negative Nettoladung aufweisen. Der Nachweis kann mittels Matrix assistierter Laser
Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI) oder mittels Elektrospray
Massenspektrometrie (ESI) durchgeführt und visualisiert werden.
Die im zweiten Verfahrensschritt erhaltenen Amplifikate werden anschließend an einen Satz von
Oligonukleotiden und/oder PNA-Sonden der oder an ein Array hybridisiert. Die Hybridisierung
erfolgt dabei auf die unten angegebene Art und Weise. Der bei der Hybridisierung verwendete Satz
besteht bevorzugterweise aus mindestens 10 Oligonukleotid oder PNA-Oligomer Sonden. Die
Amplifikate dienen dabei als Sonden, die an vorher an einer Festphase gebundene Oligonukleotide
hybridisieren. Die nicht hybridisierten Fragmente werden anschließend entfernt. Die besagten
Oligonukleotide umfassen mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von 13 Nukleotiden, die
revers komplementär oder identisch zu einem Abschnitt der im Anhang aufgeführten
Basensequenzen ist, der mindestens ein CpG Dinukleotid enthält. Das Cytosin des CpG
Dinukleotids ist das 5. bis 9. Nukleotid vom 5'-Ende des 13 mers aus betrachtet. Für jedes CpG
Dinukleotid ist ein Oligonukleotid vorhanden. Die besagten PNA-Oligomere umfassen mindestens
eine Basensequenz mit einer Länge von 9 Nukleotiden, die revers komplementär oder identisch zu
einem Abschnitt der im Anhang aufgeführten Basensequenzen ist, der mindestens ein CpG
Dinukleotid enthält. Das Cytosin des CpG Dinukleotids ist das 4. bis 6. Nukleotid vom 5'-Ende des
9 mers aus gesehen. Für jedes CpG Dinukleotid ist ein Oligonukleotid vorhanden.
Im vierten Verfahrensschritt entfernt man die nicht hybridisierten Amplifikate.
Im letzten Verfahrensschritt detektiert man die hybridisierten Amplifikate. Dabei ist bevorzugt, dass
an den Amplifikaten angebrachte Markierungen an jeder Position der Festphase, an der sich eine
Oligonukleotidsequenz befindet, identifizierbar sind.
Erfindungsgemäss bevorzugt ist es, dass die Markierungen der Amplifikate
Fluoreszenzmarkierungen, Radionuklide oder ablösbare Molekülfragmente mit typischer Masse
sind, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden können. Der Nachweis der
Amplifikate, Fragmente der Amplifikate oder zu den Amplifikaten komplementäre Sonden im
Massenspektrometer ist bevorzugt, wobei man die Detektion mittels Matrix assistierter Laser
Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI) oder mittels Elektrospray
Massenspektrometrie (ESI) durchführen und visualisieren kann.
Zur besseren Detektierbarkeit im Massenspektrometer können die erzeugten Fragmente eine
einzelne positive oder negative Nettoladung aufweisen. Bevorzugt wird das vorgenannte Verfahren
zur Ermittlung von genetischen und/oder epigenetischen Parametern von mit Angiogenese
assoziierten Genen verwendet.
Die erfindungsgemäßen Oligomere oder Arrays derselben sowie ein erfindungsgemäßes Kit sollen
zur Diagnose und/oder Therapie von mit Angiogenese assoziierten Krankheiten durch Analyse von
Methylierungsmustern von mit Angiogenese assoziierten Genen verwendet werden.
Erfindungsgemäss bevorzugt ist die Verwendung des Verfahrens zur Diagnose und/oder Therapie
bedeutender genetischer und/oder epigenetischer Parameter innerhalb von mit Angiogenese
assoziierten Genen.
Das erfindungsgemäße Verfahren dient zum Beispiel der Diagnose und/oder Therapie von
Augenerkrankungen, proliferativer Retinopathie, neovascularem Glaukom, soliden Tumoren,
Gewebsentzündungen, rheumatischer Arthritis, diabetischer Retinopathie, macularer Degeneration
aufgrund von Neovascularisation, Psoriasis, Artheriosklerose, entzündliche Darmerkrankungen,
ulcerativem Darmkatarrh, Morbus Crohn und Krebserkrankungen.
Auch die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 206 und zu deren
komplementären Sequenzen und/oder Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomere gemäß Tabelle 1
können für die Diagnose und/oder Therapie von genetischen und/oder epigenetischen Parametern
von mit Angiogenese assoziierten Genen verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Diagnostikums
und/oder Therapeutikums zur Diagnose und/oder Therapie von mit Angiogenese assoziierten
Krankheiten durch Analyse von Methylierungsmustern von mit Angiogenese assoziierten Gene,
wobei das Diagnostikum und/oder Therapeutikums dadurch gekennzeichnet ist, dass mindestens
eine Nukleinsäure, gemäß der vorliegenden Erfindung, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten
Zusatz- und Hilfsstoffen zu dessen Herstellung verwendet wird.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Diagnostikum und/oder
Therapeutikums zur von mit Angiogenese assoziierten Krankheiten durch Analyse von
Methylierungsmustern von mit Angiogenese assoziierten Genen, das mindestens eine Nukleinsäure
gemäß der Erfindung, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Diagnose und/oder Prognose nachteiliger
Ereignisse für Patienten oder Individuen, bei dem die mittels der Erfindung erhaltenen bedeutenden
genetischen und/oder epigenetischen Parameter innerhalb von mit Angiogenese assoziierten Genen
mit einem anderen Satz genetischen und/oder epigenetischen Parameter verglichen werden können
und die so erhaltenen Unterschiede als Basis für eine Diagnose und/oder Prognose nachteiliger
Ereignisse für Patienten oder Individuen dienen.
Unter dem Begriff "Hybridisierung" im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine Bindung unter
Ausbildung einer Duplex-Struktur eines Oligonukleotids an eine vollständig komplementäre
Sequenz im Sinne der Watson-Crick Basenpaarungen in der Proben DNA zu verstehen. Unter
"stringenten Hybridisierungsbedingungen" sind solche Bedingungen zu verstehen, bei denen eine
Hybridisierung bei 60°C in 2,5 × SSC-Puffer, gefolgt von mehreren Waschschritten bei 37°C in
einer geringeren Pufferkonzentration erfolgt und stabil bleibt.
Mit dem Begriff "funktionelle Varianten" sind alle DNA-Sequenzen bezeichnet, die komplementär
zu einer DNA-Sequenz sind, die unter stringenten Bedingungen mit der Referenzsequenz
hybridisieren und eine zu dem entsprechenden erfindungsgemäßen Polypeptid ähnliche Aktivität
aufweisen.
"Genetische Parameter" im Sinne dieser Erfindung sind Mutationen und Polymorphismen von mit
Angiogenese assoziierten Genen und zu seiner Regulation weiterhin erforderlicher Sequenzen.
Insbesondere sind als Mutationen Insertionen, Deletionen, Punktmutationen, Inversionen und
Polymorphismen und besonders bevorzugt SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) zu
bezeichnen. Polymorphismen können aber ebenso Insertionen, Deletionen oder Inversionen sein.
"Epigenetische Parameter" im Sinne dieser Erfindung sind insbesondere Cytosin-Methylierungen
und weitere chemische Modifikationen von DNA-Basen von mit Angiogenese assoziierten Genen
und zu deren Regulation weiterhin erforderliche Sequenzen. Weitere epigenetische Parameter sind
beispielsweise die Acetylierung von Histonen, die jedoch mit dem beschriebenen Verfahren nicht
direkt analysiert werden kann, sondern wiederum mit der DNA-Methylierung korreliert.
Die Erfindung soll nun im folgenden anhand der Sequenzen und Beispiele weiter verdeutlicht
werden, ohne dass die Erfindung hierauf eingeschränkt wird.
Sequenzen mit ungeraden Sequenznummern (z. B. Seq. ID No. 1, 3, 5, . . . ) zeigen jeweils
unterschiedliche Sequenzen der chemisch vorbehandelten genomischen DNAs von mit Angiogenese
assoziierten Genen.
Sequenzen mit geraden Sequenznummern (z. B. Seq. ID No. 2, 4, 6, . . .) zeigen jeweils die zu den
unterschiedlichen Sequenzen, komplementären Sequenzen (z. B. ist die zu Seq. ID No. 1
komplementäre Sequenz Seq. ID No. 2, zu Seq. ID No. 3 die komplementäre Sequenz Seq. ID No. 4
usw.) der chemisch vorbehandelten genomischen DNAs von mit Angiogenese assoziierten Genen.
Das folgende Beispiel bezieht sich auf ein Fragment von einem mit Angiogenese assoziierten Gen,
hier TIMP-3 in dem eine bestimmte CG-Position auf ihren Methylierungsstatus hin untersucht wird.
Das folgende Beispiel bezieht sich auf ein Fragment des Gens Metalloproteinase-3 (TMIP-3), in
dem eine bestimmte CG-Position auf Methylierung zu untersuchen ist.
Im ersten Schritt wird eine genomische Sequenz unter Verwendung von Bisulfit (Hydrogensulfit,
Disulfit) derart behandelt, dass alle nicht an der 5-Position der Base methylierten Cytosine so
verändert werden, dass eine hinsichtlich dem Basenpaarungsverhalten unterschiedliche Base
entsteht, während die in 5-Position methylierten Cytosine unverändert bleiben. Wird für die
Reaktion Bisulfit im Konzentrationsbereich zwischen 0.1 M und 6 M verwendet, so findet an den
nicht methylierten Cytosinbasen eine Addition statt. Zudem müssen ein denaturierendes Reagenz
oder Lösungsmittel sowie ein Radikalfänger zugegen sein. Eine anschließende alkalische Hydrolyse
führt dann zur Umwandlung von nicht methylierten Cytosin-Nukleobasen in Uracil. Diese
umgewandelte DNA dient dazu, methylierte Cytosine nachzuweisen. Im zweiten Verfahrensschritt
verdünnt man die behandelte DNA-Probe mit Wasser oder einer wässrigen Lösung. Bevorzugt wird
anschliessend eine Desulfonierung der DNA (10-30 min. 90-100°C) bei alkalischem pH-Wert
durchgeführt. Im dritten Schritt des Verfahrens amplifiziert man die DNA-Probe in einer
Polymerasekettenreaktion, bevorzugt mit einer hitzebeständigen DNA-Polymerase. Im vorliegenden
Fall werden Cytosine des Gens TIMP-3 untersucht. Dazu wird mit den spezifischen
Primeroligonukleotiden AGAGAAATTGGAGGGGTAGT und CCCTCAAACCAATAACAAAA
ein definiertes Fragment der Länge 401 bp amplifiziert. Dieses Amplifikat dient als Probe, die an
ein vorher an einer Festphase gebundenes Oligonukleotid unter Ausbildung einer Duplexstruktur
hybridisiert, beispielsweise GGATTTAGCGGTAAGTAT, wobei sich das nachzuweisende Cytosin
an Position 223 des Amplifikats befindet. Der Nachweis des Hybridisierungsprodukts beruht auf
Cy3 und Cy5 fluoreszenzmarkierten Primeroligonukleotiden, die für die Amplifikation verwendet
wurden. Nur wenn in der Bisulfit behandelten DNA an dieser Stelle ein methyliertes Cytosin
vorgelegen hat, kommt es zu einer Hybridisierungsreaktion der amplifizierten DNA mit dem
Oligonukleotid. Somit entscheidet der Methylierungsstatus des jeweiligen zu untersuchenden
Cytosins über das Hybridisierungsprodukt.
Um einen Bezug der Methylierungsmuster zu einer der mit Angiogenese assoziierten Erkrankungen
durchzuführen, bedarf es zunächst der Untersuchung der DNA-Methylierungsmuster einer Gruppe
von erkrankten und einer Gruppe von gesunden Patienten. Diese Untersuchungen werden zum
Beispiel analog dem Beispiel 1 durchgeführt. Die so erhaltenen Ergebnisse werden in einer
Datenbank abgespeichert und die CpG Dinukleotide identifiziert, die zwischen den beiden Gruppen
unterschiedlich methyliert sind. Dies kann durch Bestimmung einzelner CpG Methylierungsraten
erfolgen, wie dies z. B. durch Sequenzieren relativ ungenau oder aber durch eine
methylierungssensitive "Primer-Extension-Reaktion" sehr genau möglich ist. Auch gleichzeitige
Analyse des gesamten Methylierungsstatus ist möglich, und die Muster können z. B. mittels
Clustering-Analysen, die z. B. durch einen Rechner durchgeführt werden können, verglichen
werden.
Nachfolgend ist es möglich, untersuchte Patienten einer bestimmten Therapiegruppe zuzuordnen
und diese Patienten gezielt zu mit einer individualisierten Therapie zu behandeln.
Das Beispiel 2 läßt sich zum Beispiel für die folgenden Erkrankungen ausführen:
Augenerkrankungen, proliferative Retinopathie, neovasculares Glaukom, solide Tumoren, rheumatische Arthritis, diabetische Retinopathie, maculare Degeneration aufgrund von Neovascularisation, Psoriasis, Artheriosklerose, ulcerativer Darmkatarrh, Morbus Crohn und Krebserkrankungen.
Augenerkrankungen, proliferative Retinopathie, neovasculares Glaukom, solide Tumoren, rheumatische Arthritis, diabetische Retinopathie, maculare Degeneration aufgrund von Neovascularisation, Psoriasis, Artheriosklerose, ulcerativer Darmkatarrh, Morbus Crohn und Krebserkrankungen.
Claims (32)
1. Nukleinsäure, umfassend einen mindestens 18 Basen langen Sequenzabschnitt der chemisch
vorbehandelten DNA von mit Angiogenese assoziierten Genen gemäß einer der Seq. ID 1 bis Seq.
ID 206 und zu deren komplementären Sequenzen.
2. Oligomer (Oligonukleotid oder Peptide Nucleic Acid (PNA)-Oligomer) zur Detektion des
Cytosin-Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter DNA, umfassend jeweils mindestens
eine Basensequenz mit einer Länge von mindestens 9 Nukleotiden, die an eine chemisch
vorbehandelte DNA von mit Angiogenese assoziierten Genen gemäß einer der Seq. ID 1 bis Seq. ID
206 und zu deren komplementären Sequenzen hybridisiert.
3. Oligomer gemäß Anspruch 2, wobei die Basensequenz mindestens ein CpG Dinukleotid umfasst.
4. Oligomer gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass sich das Cytosin des CpG
Dinukleotids in etwa im mittleren Drittel des Oligomers befindet.
5. Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomere zur Detektion des Cytosin-Methylierungszustandes in
chemisch vorbehandelter DNA, umfassend jeweils mindestens eine Basensequenz mit einer Länge
von mindestens 9 Nukleotiden, die an eine chemisch vorbehandelte DNA gemäß einer der mit
Angiogenese assoziierten Gene ALK-1 (AH005451), Beta-Tubulin (J00314), CCM1 (AF198881),
CD44 (AJ251595), ERK (D31661), FGF6 (X57075), FGF receptor-1 (M34641), FLT (E13256),
GM-CSF (AJ224149), Platelet glycoprotein IV (AW613186), Gro-alpha (M65005), H-ras
(S64238), HGF (E02921), Human interleukin 1-beta IL1B (M15330), ICAM-1 (X84737), ID3
(X73428), IFN-gamma (J00219), IGF-1a (X56773), IGF-1b (X56774), IGF-I (X57025), IL-10
(X73536), IL-18 (E17135), 1L-1 (E00846), IL-6 (E02772), KDR (AF063658), KET (Y16961),
L18a (L05093), LPA (U92642), LTBP-1L (AF171934), LTBP-3 (AF011407), M6P IGF2R
(S80783), MMP-2 (U96098), MRP-1 (X60111), PDGF beta (AF169594), PTTG2 (AF095288),
PTTG (AF062649), Prorenin (E01074), TNF-alpha (X02910), TNF (E03416), Telomerase
(AF047386), Tie-2 (W46173), Type IV collagen (U47004), VPF (AA367822), Angiopoietin-4
ANG4 (AF113708), Angiotensinogen II type-1A receptor (M91464), Beta-2 integrin alphaD
subunit ITGAD (U40274), eNOS (AF032908), Elongin A (L47345), Endothelial nitric oxide
synthase (E16114), fgfr-1 (S76658), Fibronectin (X02761), Gelatinase B (S83357), Heparan sulfate
proteoglycan core protein (J04621), Integrin alpha 5 beta 1 (U48214), Integrin alpha 8 subunit
(L36531), Integrin alpha 9 (L24158), Interleukin-1 (E00909), Interleukin-2 IL-2 (X00695),
Interleukin-6 (M14584), Interleukin-6 receptor (E12979), Interleukin 1 alpha (E04022), Interleukin
1 beta (S61784), Lamin A (L12401), mac25 (L19182), Matrilysin MMP7 (L22524), p15 (575756),
Plasminogen activator inhibitor-1 PAI-1 (M16006) oder Prostaglandin E2 receptor (L25124)
hybridisiert, wobei die Basensequenz mindestens ein CpG Dinukleotid umfasst und wobei das
Oligomer dadurch gekennzeichnet ist, dass sich das Cytosin des CpG Dinukleotids in etwa im
mittleren Drittel des Oligomers befindet.
6. Satz von Oligomeren gemäß Anspruch 3 oder Anspruch 5, umfassend mindestens ein Oligomer
zur Detektion des Methylierungszustandes zumindest eines der CpG Dinukleotide aus einer der
Sequenzen der Seq. ID 1 bis Seq. ID 206 und zu deren komplementären Sequenzen und/oder
Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomere aus Anspruch 5.
7. Satz von Oligomeren gemäß Anspruch 3 oder Anspruch 5, umfassend Oligomere zur Detektion
des Methylierungszustandes aller CpG Dinukleotide aus einer der Sequenzen der Seq. ID 1 bis Seq.
ID 206 und zu deren komplementären Sequenzen und/oder Oligonukleotid- und/oder PNA-
Oligomere aus Anspruchs.
8. Satz von mindestens zwei Oligonukleotiden gemäß Anspruch 2, die als Primeroligonukleotide
zur Amplifikation von DNA-Sequenzen einer der Seq. ID 1 bis Seq. ID 206 und zu deren
komplementären Sequenzen und/oder Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomere aus Anspruch 5
oder Abschnitten davon eingesetzt werden können.
9. Satz von Oligonukleotiden gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein
Oligonukleotid an eine Festphase gebunden ist.
10. Satz von Oligomersonden zur Detektion des Cytosin-Methylierungszustandes und/oder von
Single Nucleotide Polymorphismen (SNPs) in chemisch vorbehandelter genomischer DNA gemäß
einer der Seq. ID 1 bis Seq. ID 206 und zu deren komplementären Sequenzen und/oder
Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomere aus Anspruch 5, umfassend mindestens zehn der
Oligomere gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4.
11. Verfahren zur Herstellung einer auf einem Trägermaterial fixierten Anordnung von
unterschiedlichen Oligomeren (Array) zur Analyse von in Zusammenhang mit dem
Methylierungszustand der CpG Dinukleotide einer der Seq. ID 1 bis Seq. ID 206 und zu deren
komplementären Sequenzen und/oder Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomere aus Anspruch 5
stehenden Erkrankungen, bei dem mindestens ein Oligomer gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4 an
eine feste Phase gekoppelt wird.
12. An eine Festphase gebundene Anordnung von unterschiedlichen Oligomeren (Array) nach
einem der Ansprüche 2 bis 4.
13. Array von unterschiedlichen Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomersequenzen gemäß
Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass diese auf einer ebenen Festphase in Form eines
rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet sind.
14. Array gemäß einem der Ansprüche 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die
Festphasenoberfläche aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel,
Silber oder Gold besteht.
15. DNA- und/oder PNA-Array zur Analyse von in Zusammenhang mit dem Methylierungszustand
von Genen stehenden Erkrankungen, der mindestens eine Nukleinsäure gemäß einem der
voranstehenden Ansprüche umfasst.
16. Verfahren zur Ermittlung von genetischen und/oder epigenetischen Parametern zur Diagnose
und/oder Therapie von bestehenden Erkrankungen oder der Prädisposition für bestimmte
Erkrankungen durch Analyse von Cytosin-Methylierungen, dadurch gekennzeichnet, dass man
folgende Schritte ausführt:
- a) in einer genomischen DNA-Probe werden durch chemische Behandlung an der 5-Position unmethylierte Cytosinbasen in Uracil oder eine andere vom Basenpaarungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base umgewandelt;
- b) aus dieser chemisch vorbehandelten genomischen DNA werden Fragmente unter Verwendung von Sätzen von Primeroligonukleotiden gemäß Anspruch 8 oder 9 und einer Polymerase amplifiziert, wobei die Amplifikate eine nachweisbare Markierung tragen;
- c) Amplifikate werden an einen Satz von Oligonukleotiden und/oder PNA- Sonden gemäß der Ansprüche 2 bis 4 oder aber an ein Array gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14; hybridisiert
- d) die hybridisierten Amplifikate werden anschließend nachgewiesen.
17. Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass man die chemische Behandlung
mittels einer Lösung eines Bisulfits, Hydrogensulfits oder Disulfits durchführt.
18. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass mehr als zehn
unterschiedliche Fragmente amplifiziert werden, die 100-2000 Basenpaare Lang sind.
19. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die
Amplifikation von mehreren DNA-Abschnitten in einem Reaktionsgefäß durchgeführt wird.
20. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerase
eine hitzebeständige DNA-Polymerase ist.
21. Verfahren gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikation mittels der
Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt wird.
22. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die
Markierungen der Amplifikate Fluoreszenzmarkierungen sind.
23. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die
Markierungen der Amplifikate Radionuklide sind.
24. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 bis 21, dadurch gekennzeichnet dass die
Markierungen der Amplifikate ablösbare Molekülfragmente mit typischer Masse sind, die in einem
Massenspektrometer nachgewiesen werden.
25. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikate
oder Fragmente der Amplifikate im Massenspektrometer nachgewiesen werden.
26. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 und/oder 25, dadurch gekennzeichnet, dass zur
besseren Detektierbarkeit im Massenspektrometer die erzeugten Fragmente eine einzelne positive
oder negative Nettoladung aufweisen.
27. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass man die
Detektion mittels Matrix assistierter Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI)
oder mittels Elektrospray Massenspektrometrie (ESI) durchführt und visualisiert.
28. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass die genomische
DNA aus Zellen oder Zellbestandteilen erhalten wurde, welche DNA enthalten, wobei Quellen von
DNA z. B. Zelllinien, Biopsien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit, in
Paraffin eingebettetes Gewebe, beispielsweise Gewebe von Augen, Darm, Niere, Hirn, Herz,
Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologische Objektträger und alle möglichen Kombinationen
hiervon umfassen.
29. Kit, umfassend ein Bisulfit (= Disulfit, Hydrogensulfit) Reagenz sowie Oligonukleotide
und/oder PNA-Oligomere gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4.
30. Verwendung einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 1, eines Oligonukleotids oder PNA-
Oligomers gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, eines Kits gemäß Anspruch 29, eines Arrays gemäß
einem der Ansprüche 11 bis 14, eines Satz von Oligonukleotiden, umfassend mindestens ein
Oligomer zur Detektion des Methylierungszustandes zumindest eines der CpG Dinukleotide aus
einer der Sequenzen der Seq. ID 1 bis Seq. ID 206 und zu deren komplementären Sequenzen
und/oder Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomere aus Anspruch 5 zur Diagnose von
Augenerkrankungen, proliferativer Retinopathie, neovascularem Glaukom, soliden Tumoren,
Gewebsentzündungen, rheumatischer Arthritis, diabetischer Retinopathie, macularer Degeneration
aufgrund von Neovascularisation, Psoriasis, Artheriosklerose, entzündliche Darmerkrankungen,
ulcerativem Darmkatarrh, Morbus Crohn und Krebserkrankungen.
31. Verwendung einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 1, eines Oligonukleotids oder PNA-
Oligomers gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, eines Kits gemäß Anspruch 29, eines Arrays gemäß
einem der Ansprüche 11 bis 14, eines Satz von Oligonukleotiden, umfassend mindestens ein
Oligomer zur Detektion des Methylierungszustandes zumindest eines der CpG Dinukleotide aus
einer der Sequenzen der Seq. ID 1 bis Seq. ID 206 und zu deren komplementären Sequenzen
und/oder Oligonuldeotid- und/oder PNA-Oligomere aus Anspruch 5 zur Therapie von
Augenerkrankungen, proliferativer Retinopathie, neovascularem Glaukom, soliden Tumoren,
Gewebsentzündungen, rheumatischer Arthritis, diabetischer Retinopathie, macularer Degeneration
aufgrund von Neovascularisation, Psoriasis, Artheriosklerose, entzündliche Darmerkrankungen,
ulcerativem Darmkatarrh, Morbus Crohn und Krebserkrankungen.
32. Kit, umfassend ein Bisulfit (= Disulfit, Hydrogensulfit) Reagenz sowie Oligonukleotide
und/oder PNA-Oligomere gemäß Anspruch 31.
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10061338A DE10061338A1 (de) | 2000-12-06 | 2000-12-06 | Diagnose von mit Angiogenese assoziierten Krankheiten |
| US10/433,793 US20040142334A1 (en) | 2000-12-06 | 2001-12-06 | Diagnosis of diseases associated with angiogenesis |
| PCT/EP2001/014320 WO2002046454A2 (de) | 2000-12-06 | 2001-12-06 | Diagnose von mit angiogenese assoziierten krankheiten durch bestimmung der methylierung von mit angiogenese assoziierten genen |
| EP01999661A EP1402059A2 (de) | 2000-12-06 | 2001-12-06 | Diagnose von mit angiogenese assoziierten krankheiten durch bestimmung der methylierung von mit angiogenese assoziierten genen |
| AU2002217091A AU2002217091A1 (en) | 2000-12-06 | 2001-12-06 | Diagnosis of diseases associated with angiogenesis by determining the methylation of genes associated with angiogenesis |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10061338A DE10061338A1 (de) | 2000-12-06 | 2000-12-06 | Diagnose von mit Angiogenese assoziierten Krankheiten |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE10061338A1 true DE10061338A1 (de) | 2002-06-20 |
Family
ID=7666455
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE10061338A Ceased DE10061338A1 (de) | 2000-12-06 | 2000-12-06 | Diagnose von mit Angiogenese assoziierten Krankheiten |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20040142334A1 (de) |
| EP (1) | EP1402059A2 (de) |
| AU (1) | AU2002217091A1 (de) |
| DE (1) | DE10061338A1 (de) |
| WO (1) | WO2002046454A2 (de) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1693468A1 (de) | 2005-02-16 | 2006-08-23 | Epigenomics AG | Verfahren zur Bestimmung des Methylierungsmusters einer Polynukleinsäure |
| US7932027B2 (en) | 2005-02-16 | 2011-04-26 | Epigenomics Ag | Method for determining the methylation pattern of a polynucleic acid |
| EP2481810A1 (de) | 2005-04-15 | 2012-08-01 | Epigenomics AG | Verfahren zur Bereitstellung von DNA-Fragmenten, die von einer dezentralen Probe abgeleitet sind |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7617163B2 (en) * | 1998-05-01 | 2009-11-10 | Health Discovery Corporation | Kernels and kernel methods for spectral data |
| DE10245779A1 (de) * | 2002-10-01 | 2004-04-29 | Epigenomics Ag | Verfahren und Nukleinsäuren für die verbesserte Behandlung von proliferativen Erkrankungen von Brustzellen |
| WO2006111586A2 (es) * | 2005-04-20 | 2006-10-26 | Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. | Procedimiento para la determinación in vitro del grado de metilación del promotor de line-1 |
| US8084734B2 (en) * | 2006-05-26 | 2011-12-27 | The George Washington University | Laser desorption ionization and peptide sequencing on laser induced silicon microcolumn arrays |
| US20100234381A1 (en) * | 2007-04-13 | 2010-09-16 | Bristol-Myers Squibb Company | Biomarkers and methods for determining sensitivity to vascular endothelial growth factor receptor-2 modulators |
| US8110796B2 (en) | 2009-01-17 | 2012-02-07 | The George Washington University | Nanophotonic production, modulation and switching of ions by silicon microcolumn arrays |
| US9490113B2 (en) * | 2009-04-07 | 2016-11-08 | The George Washington University | Tailored nanopost arrays (NAPA) for laser desorption ionization in mass spectrometry |
| AU2012209185B2 (en) * | 2011-01-25 | 2016-06-30 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Methods of diagnosing and treating age-related macular degeneration |
| WO2013033627A2 (en) * | 2011-09-01 | 2013-03-07 | The Regents Of The University Of California | Diagnosis and treatment of arthritis using epigenetics |
| WO2016123163A2 (en) | 2015-01-27 | 2016-08-04 | Kardiatonos, Inc. | Biomarkers of vascular disease |
| CN109906275B (zh) | 2016-06-08 | 2023-05-12 | 爱荷华大学研究基金会 | 检测心血管疾病易感性的组合物和方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998056952A1 (en) * | 1997-06-09 | 1998-12-17 | University Of Southern California | A cancer diagnostic method based upon dna methylation differences |
| WO1999064626A2 (en) * | 1998-06-06 | 1999-12-16 | Genostic Pharma Limited | Probes used for genetic profiling |
| WO1999064627A2 (en) * | 1998-06-06 | 1999-12-16 | Genostic Pharma Limited | Probes used for genetic profiling |
| WO2000044934A2 (de) * | 1999-01-29 | 2000-08-03 | Epigenomics Ag | Verfahren zur identifikation von cytosin-methylierungsmustern in genomischen dna-proben |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5744101A (en) * | 1989-06-07 | 1998-04-28 | Affymax Technologies N.V. | Photolabile nucleoside protecting groups |
| DE19754482A1 (de) * | 1997-11-27 | 1999-07-01 | Epigenomics Gmbh | Verfahren zur Herstellung komplexer DNA-Methylierungs-Fingerabdrücke |
| DK1036202T3 (da) * | 1997-12-05 | 2002-08-12 | Max Planck Gesellschaft | Fremgangsmåde til identifikation af nucleinsyrer ved matriksassisteret laserdesorptions/ionisationsmassespektrometri |
| WO2002002807A2 (en) * | 2000-06-30 | 2002-01-10 | Epigenomics Ag | Diagnosis of diseases associated with cell signalling |
| IL154663A0 (en) * | 2000-09-01 | 2003-09-17 | Epigenomics Ag | Method for determining the degree of methylation of defined cytosines in genomic dna in the sequence context 5'-cpg-3' |
-
2000
- 2000-12-06 DE DE10061338A patent/DE10061338A1/de not_active Ceased
-
2001
- 2001-12-06 AU AU2002217091A patent/AU2002217091A1/en not_active Abandoned
- 2001-12-06 WO PCT/EP2001/014320 patent/WO2002046454A2/de not_active Ceased
- 2001-12-06 EP EP01999661A patent/EP1402059A2/de not_active Withdrawn
- 2001-12-06 US US10/433,793 patent/US20040142334A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998056952A1 (en) * | 1997-06-09 | 1998-12-17 | University Of Southern California | A cancer diagnostic method based upon dna methylation differences |
| WO1999064626A2 (en) * | 1998-06-06 | 1999-12-16 | Genostic Pharma Limited | Probes used for genetic profiling |
| WO1999064627A2 (en) * | 1998-06-06 | 1999-12-16 | Genostic Pharma Limited | Probes used for genetic profiling |
| WO2000044934A2 (de) * | 1999-01-29 | 2000-08-03 | Epigenomics Ag | Verfahren zur identifikation von cytosin-methylierungsmustern in genomischen dna-proben |
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| Chem.Abstr.127:246319(Cancer Res. 57(1997) 3370- 3374 * |
| Chem.Abstr.130:151759(Int.J.Cancer 78(1998) 561- 567) * |
| Chem.Abstr.130:277551((J.Biol.Chem. 274(1999) 2483-2491) * |
| Chem.Abstr.131:168514(Oncogene18(1999)3284-3289) * |
| Chem.Abstr.131:270195(DNA Cell Biol. 18(1999) 643-652) * |
| Chem.Abstr.133:250442(DNA Alteration Cancer (2000)311-322) * |
| Chem.Abstr.133:3035(J.Cell Physiol. 183(2000) 145-154) * |
| Chem.Abstr.134(2001)96164(J.Biol.Chem. 275(37) 28539-28548) * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1693468A1 (de) | 2005-02-16 | 2006-08-23 | Epigenomics AG | Verfahren zur Bestimmung des Methylierungsmusters einer Polynukleinsäure |
| US7932027B2 (en) | 2005-02-16 | 2011-04-26 | Epigenomics Ag | Method for determining the methylation pattern of a polynucleic acid |
| EP2481810A1 (de) | 2005-04-15 | 2012-08-01 | Epigenomics AG | Verfahren zur Bereitstellung von DNA-Fragmenten, die von einer dezentralen Probe abgeleitet sind |
| US10731215B2 (en) | 2005-04-15 | 2020-08-04 | Epigenomics Ag | Method for determining the presence or absence of methylation in a sample |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1402059A2 (de) | 2004-03-31 |
| WO2002046454A3 (de) | 2003-12-24 |
| WO2002046454A2 (de) | 2002-06-13 |
| AU2002217091A1 (en) | 2002-06-18 |
| US20040142334A1 (en) | 2004-07-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE60126593T2 (de) | Diagnose von mit apoptose assoziierten erkrankungen mittels ermittlung des methylierungszustandes von apoptose-assozierten genen | |
| EP1432828B1 (de) | Verfahren zum nachweis von cytosin-methylierung in cpg-inseln | |
| EP1294951A2 (de) | Diagnose von mit dem immunsystem assoziierten krankheiten | |
| WO2002018631A2 (de) | Diagnose von bestehenden erkrankungen oder der prädisposition für bestimmte erkrankungen | |
| DE10132212B4 (de) | Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierung durch vergleichende Analyse der Einzelstränge von Amplifikaten | |
| DE10154317B4 (de) | Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierungen in immobilisierten DNA Proben | |
| DE10061338A1 (de) | Diagnose von mit Angiogenese assoziierten Krankheiten | |
| DE20121960U1 (de) | Nukleinsäuren für die Diagnose von mit Metastase assoziierten Krankheiten | |
| DE10128508A1 (de) | Verfahren und Nukleinsäuren für die Differenzierung von Prostata-Tumoren | |
| DE10037769A1 (de) | Diagnose von mit CD24 assoziierten Krankheiten | |
| EP1332228A2 (de) | Diagnose von mit cdk4 assoziierten krankheiten durch bestimmung des methylierungszustandes des cdk4 gens | |
| EP1339873B1 (de) | Diagnose von mit humos assoziierten krankheiten | |
| DE10128509A1 (de) | Verfahren und Nukleinsäuren für die Differenzierung von Prostata- und Nierenkarzinomen | |
| DE20121967U1 (de) | Nukleinsäuren für die Diagnose von Verhaltensstörungen, neurologischen Erkrankungen und Krebs | |
| DE20121968U1 (de) | Nukleinsäuren für die Diagnose von mit Apoptose assoziierten Krankheiten | |
| DE20121969U1 (de) | Nukleinsäuren für die Diagnose von mit DNA Reparatur assoziierten Krankheiten | |
| DE10230692A1 (de) | Verfahren und Nukleinsäuren für die Analyse von Methylierungsmustern innerhalb des DD3-Gens | |
| DE20121979U1 (de) | Nukleinsäuren für die Diagnose von mit der Zellsignalisierung assoziierten Krankheiten | |
| DE20121964U1 (de) | Nukleinsäuren für die Diagnose von mit dem Metabolismus assoziierten Krankheiten | |
| DE20121961U1 (de) | Nukleinsäuren für die Diagnose von mit der Signaltransduktion assoziierten Krankheiten | |
| DE10245779A1 (de) | Verfahren und Nukleinsäuren für die verbesserte Behandlung von proliferativen Erkrankungen von Brustzellen | |
| DE20121977U1 (de) | Nukleinsäuren für die Diagnose von mit Tumor-Suppressorgenen und Onkogenen assoziierten Krankheiten | |
| WO2003031648A2 (de) | Verfahren zum nachweis von dna-methylierung mittels markierten s-adenosylmethioninanaloga | |
| DE20121966U1 (de) | Nukleinsäuren für die Diagnose von mit dem Immunsystem assoziierten Krankheiten | |
| DE10255104A1 (de) | Verfahren und Nukleinsäuren für die Analyse von proliferativen Erkrankungen von Brustzellen |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| OP8 | Request for examination as to paragraph 44 patent law | ||
| 8131 | Rejection |