ES2669439T3 - Métodos y ácidos nucleicos para el análisis del carcinoma de vejiga - Google Patents

Métodos y ácidos nucleicos para el análisis del carcinoma de vejiga Download PDF

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Abstract

Un método de detección del carcinoma de vejiga que comprende determinar el estatus de metilación del ADN genómico de CYP1B1 de acuerdo con la SEQ NO: 12 en una muestra biológica aislada de un sujeto, en donde la hipermetilación es indicativa de la presencia de carcinoma de vejiga.

Description

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DESCRIPCION
Métodos y ácidos nucleicos para el análisis del carcinoma de vejiga Campo de la invención
La presente invención se refiere a secuencias de ADN genómico que presentan en patologías patrones de expresión alterados con respecto a lo normal. Las realizaciones particulares proporcionan métodos, ácidos nucleicos, matrices de ácidos nucleicos y kits útiles para detectar o para diagnosticar el carcinoma de vejiga.
Antecedentes
Metilación de las islas de CpG. Se ha demostrado que la metilación anómala de las islas de CpG conduce al silenciamiento transcripcional de determinados genes que se han relacionado previamente con la patogénesis de diversos trastornos proliferativos celulares, incluido el carcinoma de vejiga. Las islas de CpG son secuencias que son ricas en dinucleótidos CpG y que habitualmente se pueden encontrar en la región 5' de aproximadamente el 50 % de todos los genes humanos. La metilación de las citosinas en estas islas conduce a la pérdida de la expresión génica y se ha informado en la inactivación del cromosoma X y la impronta genómica. Por ejemplo, el documento WO 2009/069984 A1divulga el diagnóstico de cáncer de vejiga detectando la metilación del promotor o de la región del exón del gen CYP1 B1 en una muestra clínica. El documento WO 02/18632 A2 divulga una biblioteca de secuencias genómicas para el análisis de la metilación de dinucleótidos CpG, que incluyen regiones del gen CYP1B1.
Desarrollo de pruebas médicas. Dos medidas evaluativas clave de cualquier cribado médico o prueba de diagnóstico son su sensibilidad y especificidad, que miden qué tan bien se desempeña la prueba para detectar de forma precisa a todos los individuos afectados sin excepción, y sin incluir de forma errónea a individuos que no tienen la enfermedad buscada (valor predictivo). Históricamente, muchas pruebas de diagnóstico han sido cuestionadas debido a la poca sensibilidad y especificidad.
Un resultado positivo verdadero (PV) es cuando la prueba es positiva y la afección está presente. Un resultado positivo falso (PF) es cuando la prueba es positiva pero la afección no está presente. Un resultado negativo verdadero (NV) es cuando la prueba es negativa y la afección no está presente. Un resultado negativo falso (NF) es cuando la prueba es negativa pero la afección no está presente. En este contexto: Sensibilidad = PV/(PV+NF); Especificidad = NV/(PF+NV); y valor predictivo = PV/PV+PF).
La sensibilidad es una medida de la capacidad de una prueba para detectar correctamente la enfermedad buscada en un individuo que se está analizando. Una prueba que tiene poca sensibilidad produce una alta tasa de falsos negativos, es decir, individuos que tienen la enfermedad pero que se identifican falsamente como estando libres de esa enfermedad en particular. El peligro potencial de un falso negativo es que el individuo enfermo permanecerá sin diagnosticar y sin tratar durante un período de tiempo, durante el cual la enfermedad puede progresar a una fase posterior en donde los tratamientos, si los hubiere, pueden ser menos eficaces. Un ejemplo de una prueba que tiene baja sensibilidad es un análisis de sangre basado en proteínas para el VIH. Este tipo de prueba presenta poca sensibilidad porque fracasa en detectar la presencia del virus hasta que la enfermedad está bien establecida y el virus ha invadido el torrente sanguíneo en cantidades sustanciales. Por el contrario, un ejemplo de una prueba que tiene alta sensibilidad es la detección de la carga viral utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se logra una alta sensibilidad porque este tipo de prueba puede detectar cantidades muy pequeñas del virus. La alta sensibilidad es particularmente importante cuando las consecuencias de perder un diagnóstico son altas.
La especificidad, por otro lado, es una medida de la capacidad de una prueba para identificar de forma precisa a los pacientes que están libres de la patología. Una prueba que tiene poca especificidad produce una alta tasa de falsos positivos, es decir, individuos que se identifican falsamente como que tienen la enfermedad. Una desventaja de los falsos positivos es que obligan a los pacientes a someterse a tratamientos con procedimientos médicos innecesarios con los riesgos, el estrés emocional y la carga económica consiguientes, y que podrían tener efectos adversos en la salud del paciente. Una característica de las enfermedades que dificulta el desarrollo de pruebas de diagnóstico con alta especificidad es que los mecanismos de la enfermedad, en particular en los trastornos proliferativos celulares, a menudo implican una pluralidad de genes y proteínas. De forma adicional, determinadas proteínas pueden estar elevadas por razones no relacionadas con una patología. La especificidad es importante cuando el costo o riesgo asociado con procedimientos de diagnóstico adicionales o la intervención médica adicional son muy altos.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona un método de detección del carcinoma de vejiga en un sujeto, que comprende determinar el estatus de metilación del ADN genómico de CYP1B1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 12 en una muestra biológica aislada de dicho sujeto, en donde la hipermetilación es indicativa de la presencia de dicho trastorno. Diversos aspectos de la presente invención proporcionan un marcador genético eficaz y exclusivo,
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mediante el cual el análisis de la mutilación de dicho marcador permite la detección del carcinoma de vejiga con una sensibilidad, especificidad y/o valor predictivo particularmente altos.
Dicho método comprende las siguientes etapas: i) poner en contacto ADN genómico aislado de una muestra biológica (preferentemente seleccionada del grupo que consiste en muestras de tejido vesical, preparaciones histológicas, tejido incluido en parafina, fluidos corporales como plasma o suero sanguíneo, líneas celulares, muestra de ensayo de orina) obtenida del sujeto con al menos un reactivo o serie de reactivos que distingue entre dinucleótidos CpG metilados y no metilados dentro de al menos una región diana del ADN genómico, en donde la secuencia de nucleótidos de dicha región diana comprende al menos una secuencia de dinucleótido de CpG del ADN genómico de CYP1B1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 12 y ii) detectar el carcinoma de vejiga, al menos en parte.
La presente invención proporciona el establecimiento de parámetros epigenéticos del ADN genómico asociados con el desarrollo de carcinoma de vejiga. El método tiene utilidad para la detección y el diagnóstico mejorados de dicha enfermedad.
Preferentemente, la fuente de la muestra de prueba se selecciona del grupo que consiste en muestras de tejido vesical, preparaciones histológicas, tejido incluido en parafina, fluidos corporales como plasma o suero sanguíneo, líneas celulares, muestras de ensayo de orina y combinaciones de los mismos.
Específicamente, la presente invención proporciona un método de detección del carcinoma de vejiga adecuado para su uso en una herramienta de diagnóstico, que comprende: obtener una muestra biológica que comprende ácido nucleico (o ácidos nucleicos) genómico; poner en contacto el ácido nucleico (o ácidos nucleicos), o un fragmento del mismo, con un reactivo o una pluralidad de reactivos suficientes para distinguir entre secuencias de dinucleótidos CpG metiladas y no metiladas dentro de una secuencia diana del ácido nucleico del sujeto, en donde la secuencia diana comprende, o hibrida en condiciones rigurosas con, una secuencia que comprende al menos 16 nucleótidos contiguos de una secuencia genómica de acuerdo con la SEC ID NO: 12, comprendiendo dichos nucleótidos contiguos al menos una secuencia de dinucleótidos CpG; y determinar, basándose al menos en parte en dicha distinción, el estado de metilación de al menos una secuencia de dinucleótidos CpG diana, o un promedio, o un valor que refleja un estado de metilación promedio de una pluralidad de secuencias de dinucleótidos CpG diana.
Preferentemente, la distinción entre secuencias de dinucleótidos CpG metiladas y no metiladas dentro de la secuencia diana comprende la conversión dependiente del estado de metilación o la no conversión de al menos una de tales secuencias de dinucleótidos CpG a la correspondiente secuencia de dinucleótidos convertida o no convertida dentro de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 38, 39, 68, 69 y regiones contiguas de las mismas, que corresponden a la secuencia diana. Las secuencias de nucleótidos que corresponden a los NO de ID de las secuencias individuales se resumen en las tablas 1, 2 y 3.
Se prevé que al menos partes de las secuencias de nucleótidos de acuerdo con la invención se utilicen para al menos uno de: detección de; detección y diferenciación entre subclases de; diagnóstico de; pronóstico de; tratamiento de; control de; tratamiento y control de; control del tratamiento de; predecir el resultado del tratamiento de; y la diferenciación del estadio del carcinoma de vejiga.
Realizaciones adicionales proporcionan un método de detección del carcinoma de vejiga que comprende: obtener una muestra biológica que tenga ADN genómico en cuestión; extraer el ADN genómico; tratar el ADN genómico, o un fragmento del mismo, con uno o más reactivos para convertir las bases de citosina no metiladas en la posición 5 en uracilo o en otra base que sea detectablemente diferente de la citosina en términos de propiedades de hibridación; poner en contacto el ADN genómico tratado, o el fragmento tratado del mismo, con una enzima de amplificación y al menos dos cebadores que comprenden, en cada caso, una secuencia contigua de al menos 9 nucleótidos de longitud que es complementaria a, o hibrida en condiciones moderadamente rigurosas o rigurosas con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 37, 38, 68, 69 y complementos de las mismas, en donde el ADN tratado o el fragmento del mismo se amplifica para producir un amplificado, o no se amplifica; y determinar, basándose en una presencia o ausencia de, o en una propiedad de dicho producto de amplificación, el estado de metilación o un promedio, o un valor que refleja un promedio del nivel de metilación de al menos uno, pero más preferentemente una pluralidad de dinucleótidos CpG de al menos una secuencia genómica de acuerdo con la SEQ ID NO: 12.
Preferentemente, la determinación comprende el uso de al menos un método seleccionado del grupo que consiste en: i) hibridar al menos una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia contigua de al menos 9 nucleótidos de longitud que es complementaria a, o hibrida en condiciones moderadamente rigurosas o rigurosas con, una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 38, 39, 68, 69 y complementos de las mismas; ii) hibridar al menos una molécula de ácido nucleico, unida a una fase sólida, que comprende una secuencia contigua de al menos 9 nucleótidos de longitud que es complementaria a, o hibrida en condiciones moderadamente rigurosas o rigurosas con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 38, 39, 68, 69 y complementos de las mismas; iii) hibridar al menos una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia contigua de al menos 9 nucleótidos de longitud que es complementaria a, o hibrida en condiciones
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moderadamente rigurosas o rigurosas con, una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 38, 39, 68, 69 y complementos de las mismas, y la extensión de al menos una de tales moléculas de ácido nucleico hibridadas en al menos un base nucleotídica; y iv) secuenciar el amplificado.
Realizaciones adicionales proporcionan un método para el análisis (es decir, la detección o el diagnóstico) del carcinoma de vejiga, que comprende: obtener una muestra biológica que tenga ADN genómico en cuestión; extraer el ADN genómico; poner en contacto el ADN genómico, o un fragmento del mismo, que comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 12 o una secuencia que hibrida con él en condiciones rigurosas, con una o más enzimas de restricción sensibles a la metilación, en donde el ADN genómico se digiere de este modo para producir fragmentos de digestión, o no se digiere de ese modo; y determinar, basándose en la presencia o ausencia de, o en la propiedad de al menos uno de tales fragmentos, el estado de metilación de una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 12 o un promedio, o un valor que refleja un estado de metilación promedio de una pluralidad de secuencias de dinucleótidos CpG de la misma. Preferentemente, el ADN genómico digerido o no digerido se amplifica antes de dicha determinación.
Realizaciones adicionales proporcionan nuevas secuencias de ácido nucleico genómicas y químicamente modificadas, así como oligonucleótidos y/u oligómeros de APN para el análisis de patrones de metilación de citosinas dentro de una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 12, para su uso en el método de la invención.
Descripción detallada de la invención
Definiciones:
La expresión "proporción observado/esperado" ("razón O/E") se refiere a la frecuencia de los dinucleótidos CpG dentro de una secuencia de ADN particular y corresponde al [número de sitios CpG / (número de bases C x número de bases G)] / longitud de banda para cada fragmento.
La expresión "isla de CpG" se refiere a una región contigua de ADN genómico que satisface los criterios de (1) tener una frecuencia de dinucleótidos CpG que corresponde a una "proporción observada/esperada" >0,6, y (2) tener un "contenido de GC" > 0,5. Las islas de CpG son normalmente, pero no siempre, de entre aproximadamente 0,2 a aproximadamente 1 KB, o a aproximadamente 2 kb de longitud.
La expresión "estado de metilación" o "estatus de metilación" se refiere a la presencia o ausencia de 5-metilcitosina ("5-mCyt") en uno o una pluralidad de dinucleótidos CpG dentro de una secuencia de ADN. Los estados de metilación en uno o más sitios de metilación de CpG particulares (teniendo cada uno dos secuencias de dinucleótidos CpG) dentro de una secuencia de ADN incluyen "no metilado", "completamente metilado" y "hemi- metilado".
El término "hemi-metilación" o "hemimetilación" se refiere al estado de metilación de un ADN bicatenario en donde solo una cadena del mismo está metilada.
El término 'ABC' como se usa en el presente documento es una abreviatura para el área bajo una curva. En particular, se refiere al área bajo una curva de eficacia diagnóstica (ROC, acrónimo de Receiver Operating Characteristic). La curva ROC es una representación de la tasa de positivos verdaderos frente a la tasa de positivos falsos para los distintos valores de corte posibles de una prueba de diagnóstico. Muestra la compensación entre sensibilidad y especificidad dependiendo del valor de corte seleccionado (cualquier aumento en la sensibilidad irá acompañado de una disminución de la especificidad). El área bajo una curva ROC (ABC) es una medida de la precisión de una prueba de diagnóstico (cuanto más grande sea el área, mejor, óptimo es 1, una prueba aleatoria tendría una curva ROC que se dispone en la diagonal con un área de 0,5; para referencia: J.P. Egan. Signal Detection Theory and ROC Analysis, Academic Press, Nueva York, 1975).
El término "micromatriz" se refiere en sentido amplio a "micromatrices de ADN" y 'chip (o chips) de ADN', como se reconoce en la técnica, abarca todos los soportes sólidos reconocidos en la técnica, y abarca todos los métodos para fijar moléculas de ácido nucleico a los mismos o la síntesis de ácidos nucleicos sobre los mismos.
Los "parámetros genéticos" son mutaciones y polimorfismos de genes y las secuencias requeridas adicionalmente para su regulación. A designar como mutaciones se encuentran, en particular, las inserciones, las deleciones, las mutaciones puntuales, las inversiones y polimorfismos y, particularmente preferente, los SNP (polimorfismos mononucleotídicos).
Los "parámetros epigenéticos" son, en particular, la metilación de citosinas. Otros parámetros epigenéticos incluyen, por ejemplo, la acetilación de histonas que, sin embargo, no puede analizarse directamente utilizando el método descrito pero que, a su vez, se correlaciona con la metilación del ADN.
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La expresión "reactivo de bisulfito" se refiere a un reactivo que comprende bisulfito, disulfito, hidrogenosulfito o combinaciones de los mismos, útil como se divulga en el presente documento para distinguir entre secuencias de dinucleótidos CpG metiladas y no metiladas.
La expresión "ensayo de metilación" se refiere a cualquier ensayo para determinar el estado de metilación de una o más secuencias de dinucleótidos CpG dentro de una secuencia de ADN.
El término "MS.AP-PCR" (forma siglada del inglés methylation-sensitive arbitrarily-primed polymerase chain reaction: reacción en cadena de la polimerasa cebada aleatoriamente sensible a la metilación) se refiere a la tecnología reconocida en la técnica que permite un exploración global del genoma utilizando cebadores ricos en CG para centrarse en las regiones con mayor probabilidad de contener dinucleótidos CpG, y descrita por Gonzalgo et al., Cancer Research 57:594-599, 1997.
La expresión "MethyLight™" se refiere a la técnica de PCR en tiempo real basada en fluorescencia reconocida en la técnica, descrita por Eads et al., Cancer Res. 59:2302-2306, 1999.
La expresión ensayo "HeavyMethyl™", en la realización del mismo implementada en el presente documento, se refiere a un ensayo en donde las sondas de bloqueo específicas de metilación (también denominadas en el presente documento bloqueantes) que incluyen posiciones de CpG entre, o incluidas en, los cebadores de amplificación, permiten la amplificación selectiva específica de metilación de una muestra de ácido nucleico.
La expresión ensayo "HeavyMethyl™ MethyLight™", en la realización del mismo implementada en el presente documento, se refiere a un ensayo HeavyMethyl™ MethyLight™, que es una variación del ensayo MethyLight™, en donde el ensayo MethyLight ™ se combina con sondas de bloqueo específicas de metilación que incluyen posiciones de CpG entre los cebadores de amplificación.
El término "Ms-SNuPE" (forma siglada del inglés methylation-sensitive single nucleotide primer extension, extensión de cebador de nucleótido único sensible a la metilación) se refiere al ensayo reconocido en la técnica descrito por Gonzalgo y Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997.
El término "MSP" (forma siglada del inglés methylation-specific PCR, PCR específica de metilación) se refiere al ensayo de metilación reconocido en la técnica descrito por Herman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996, y por la Patente de Estados Unidos N.° 5.786.146.
El término "COBRA" (forma siglada del inglés combined bisulfite restriction analysis, análisis de restricción combinado con bisulfito) se refiere al ensayo de metilación reconocido en la técnica descrito por Xiong y Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534, 1997.
El término "MCA" (forma siglada del inglés methylated CpG island amplification, amplificación de isla de CpG metilada) se refiere al ensayo de metilación descrito por Toyota et al., Cancer Res. 59:2307-12, 1999 y en el documento WO 00/26401A1.
El término "hibridación" debe entenderse como un enlace de un oligonucleótido con una secuencia complementaria a lo largo de las líneas de los emparejamientos de bases de Watson-Crick en el ADN de muestra, formando una estructura bicatenaria.
"Condiciones de hibridación rigurosas", como se define en el presente documento, implican la hibridación a 68 °C en SSC 5x/solución de Denhardt 5x/SDS al 1,0 %, y lavado en SSC 0,2x/SDS al 0,1 % a temperatura ambiente, o implica el equivalente reconocido en la técnica de la mismo (por ejemplo, condiciones en que se lleva a cabo una hibridación a 60 °C en tampón SSC 2,5 x, seguido de varias etapas de lavado a 37 °C en una concentración de tampón baja y permanece estable). Las condiciones moderadamente rigurosas, como se define en el presente documento, implican incluir el lavado en SSC 3x a 42 °C, o el equivalente reconocido en la técnica del mismo. Los parámetros de concentración de sales y temperatura pueden variarse para conseguir el nivel óptimo de identidad entre la sonda y el ácido nucleico diana. La orientación con respecto a tales condiciones está disponible en la técnica, por ejemplo, en Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; y Ausubel et al. (eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N.Y.) en la Unidad 2.10.
Las expresiones "enzimas de restricción específicas de metilación" o "enzimas de restricción sensibles a la metilación" deben entenderse como una enzima que digiere selectivamente un ácido nucleico dependiente del estado de metilación de su sitio de reconocimiento. En el caso de tales enzimas de restricción que cortan específicamente si el sitio de reconocimiento no está metilado o está hemimetilado, el corte no tendrá lugar, o lo hará con una eficacia significativamente reducida, si el sitio de reconocimiento está metilado. En el caso de tales enzimas de restricción que cortan específicamente si el sitio de reconocimiento está metilado, el corte no tendrá lugar, o lo hará con una eficacia significativamente reducida, si el sitio de reconocimiento no está metilado. Son preferentes las enzimas de restricción específicas de metilación, cuya secuencia de reconocimiento contiene un dinucleótido CG
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(por ejemplo, cgcg o cccggg). Para algunas realizaciones son preferente además enzimas de restricción que no se cortan si la citosina en este dinucleótido está metilada en el átomo de carbono C5.
Las "enzimas de restricción no específicas de metilación" o "enzimas de restricción no sensibles a la metilación" son enzimas de restricción que cortan una secuencia de ácido nucleico independientemente del estado de metilación con una eficacia casi idéntica. También se les llama "enzimas de restricción no específicas de metilación".
En referencia a las secuencias de matriz combinadas, la frase "nucleótidos contiguos" se refiere a una región de secuencia contigua de cualquier secuencia contigua individual de la matriz combinada, pero no incluye una región de la secuencia de matriz combinada que incluye un "nodo", como se define anteriormente en el presente documento.
Adicionalmente, como se conoce una pluralidad de SNP dentro de CYPB1, se entenderá que el término incluye todas las variantes de secuencia de los mismos.
Descripción general:
La presente invención proporciona un método de detección del carcinoma de vejiga en un sujeto, que comprende determinar el estatus de metilación del ADN genómico de CYP1B1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 12 en una muestra biológica aislada de dicho sujeto, en donde la hipermetilación es indicativa de la presencia de dicho trastorno. Dicho marcador puede utilizarse para el diagnóstico del carcinoma de vejiga.
El producto génico de CYP1 B1 pertenece a la superfamilia de monooxigenasas del citocromo p450 y sirve como fuente de ácido retinoico durante el desarrollo embrionario y posnatal temprano.
Además de las realizaciones anteriores en donde se analiza el análisis de la metilación del ADN genómico de acuerdo con CYP1B1 de la SEQ ID NO: 12, la invención presenta paneles de genes que comprenden adicionalmente al menos un gen o secuencia genómica seleccionada del grupo que consiste en AC051635.7, PRDM14, DMRT2 y SOX1, y secuencias reguladoras de los mismos, con nueva utilidad para la detección del carcinoma de vejiga.
La modificación del ADN con bisulfito es una herramienta reconocida en la técnica utilizada para evaluar el estatus de metilación de CpG. El método más frecuentemente utilizado para analizar el ADN en cuanto a la presencia de 5- metilcitosina está basado en la reacción de bisulfito con citosina, con lo que, tras la hidrólisis alcalina posterior, la citosina se convierte en uracilo, que corresponde a timina en su comportamiento de emparejamiento de bases. De manera significativa, sin embargo, la 5-metilcitosina permanece sin modificar en estas condiciones. En consecuencia, el ADN original se convierte de manera tal que la metilcitosina, que originalmente no podía distinguirse de la citosina por su comportamiento de hibridación, ahora puede detectarse como la única citosina restante, utilizando técnicas de biología molecular convencionales reconocidas en la técnica, por ejemplo, mediante amplificación e hibridación, o mediante secuenciación. Todas estas técnicas están basadas en propiedades de emparejamiento de bases diferenciales, que ahora se pueden aprovechar completamente.
Se proporciona una descripción de los métodos reconocidos en la técnica para la detección de 5-metilcitosina en Rein, T., et al., Nucleic Acids Res., 26:2255, 1998.
La técnica del bisulfito, salvo algunas excepciones (por ejemplo, Zeschnigk M, et al., Eur J Hum Genet. 5:94-98, 1997), actualmente solo se utilizan en investigación. En general, se amplifican fragmentos específicos cortos de un gen conocido después de un tratamiento con bisulfito, y se secuencian completamente (Olek y Walter, Nat Genet. 1997 17:275-6, 1997), se someten a una o más reacciones de extensión de cebador (Gonzalgo y Jones, Nucleic Acids Res., 25:2529-31, 1997; el documento WO 95/00669; Patente de Estado Unidos N.° 6.251.594) para analizar posiciones de citosina individuales, o se tratan por digestión enzimática (Xiong y Laird, Nucleic Acids Res., 25:2532- 4, 1997). La detección por hibridación también se ha descrito en la técnica (Olek et al., documento WO 99/28498). De forma adicional, se ha descrito el uso de la técnica de bisulfito para la detección de la metilación con respecto a genes individuales (Grigg y Clark, Bio-essays, 16:431-6, 1994; Zeschnigk M, et al., Hum Mol Genet., 6:387-95, 1997; Feil R, et al., Nucleic Acids Res., 22:695-, 1994; Martin V, et al., Gene, 157:261-4, 1995; los documentos WO 9746705 y WO 9515373).
Se divulga el uso de la técnica de bisulfito, en combinación con uno o más ensayos de metilación, para la determinación del estatus de metilación de secuencias de dinucleótidos CpG dentro de al menos una secuencia genómica, seleccionada de un grupo que comprende la SEQ ID NO: 7, 1, 4, 10 y 13; preferentemente de la SEQ ID NO: 8, 2, 5, 11, 14 y muy preferentemente de la SEQ ID NO: 9, 3, 6, 12, 15. Los dinucleótidos CpG genómicos pueden estar metilados o no metilados (alternativamente conocidos como metilado al alza y a la baja, respectivamente). Sin embargo, los métodos de la presente invención son adecuados para el análisis de muestras biológicas de naturaleza heterogénea, por ejemplo, una baja concentración de células tumorales dentro de un fondo de sangre o semen. Por consiguiente, cuando se analiza el estatus de metilación de una posición de CpG dentro de tal muestra, el experto en la materia puede utilizar un ensayo cuantitativo para determinar el nivel (por ejemplo, porcentaje, fracción, proporción, proporción o grado) de metilación en una posición de CpG particular, al contrario de un estado de metilación. Por consiguiente, el término situación de metilación o estado de metilación también debe
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entenderse como un valor que refleja el grado de mutilación en una posición de CpG. A menos que se indique específicamente, los términos "hipermetilado" o "metilado al alza" deben entenderse como un nivel de metilación por encima del de un valor de corte especificado, en donde dicho valor de corte puede ser un valor que representa el promedio o la mediana del nivel de metilación para una población dada, o es preferentemente un nivel de valor de corte optimizado. El "valor de corte" también se denomina en el presente documento "umbral". En el contexto de la presente divulgación, los términos "metilado", "hipermetilado" o "metilado al alza" debe entenderse que incluyen un nivel de metilación por encima del valor de corte cero (0) % (o equivalentes del mismo) de metilación para todas las posiciones de CpG dentro, y asociadas con (por ejemplo, en regiones promotoras o reguladoras) al menos un gen o secuencia genómica seleccionada del grupo que consiste en AC051635.7, PRDM14, DMRT2, CYP1 B1 y SOX1, y secuencias reguladoras de los mismos.
De acuerdo con la presente divulgación, la determinación del estatus de metilación de secuencias de dinucleótidos CpG dentro de al menos una secuencia genómica, seleccionada de un grupo que comprende la SEQ ID NO: 7, 1, 4, 10 y 13; preferentemente de la SEQ ID NO: 8, 2, 5, 11, 14 y muy preferentemente de la SEQ ID NO: 9, 3, 6, 12, 15, tiene utilidad en el diagnóstico y detección del carcinoma de vejiga.
Procedimientos de ensayos de metilación. Se conocen en la técnica diversos procedimientos de ensayo de metilación, y se pueden utilizar junto con la presente invención. Estos ensayos permiten la determinación del estado de metilación de uno o una pluralidad de dinucleótidos CpG (por ejemplo, islas de CpG) dentro de una secuencia de ADN. Dicho ensayo implica, entre otras técnicas, secuenciación de aDn del ADN tratado con bisulfito, PCR (para la amplificación específica de secuencia), análisis por transferencia de Southern y el uso de enzimas de restricción sensibles a la metilación.
Por ejemplo, mediante el uso del tratamiento con bisulfito la secuenciación genómica se ha simplificado para el análisis de patrones de metilación del ADN y la distribución de 5-metilcitosina (Frommer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1827-1831, 1992). De forma adicional, se utiliza digestión con enzimas de restricción de productos de PCR amplificados a partir de ADN convertido con bisulfito, por ejemplo, el método descrito por Sadri y Hornsby (Nucl. Acids Res. 24:5058-5059, 1996) o COBRA (análisis de restricción combinado con bisulfito) (Xiong y Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534, 1997).
COBRA. El análisis COBRA™ es un ensayo de metilación cuantitativo útil para determinar los niveles de metilación del ADN en locus génicos específicos en pequeñas cantidades de ADN genómico (Xiong y Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534, 1997). En resumen, la digestión con enzimas de restricción se utiliza para revelar diferencias de secuencias dependientes de metilación en productos de PCR de ADN tratado con bisulfito de sodio. Las diferencias de secuencias dependientes de metilación se introducen en primer lugar en el ADN genómico mediante tratamiento con bisulfito convencional de acuerdo con el procedimiento descrito por Frommer et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1827-1831, 1992). La amplificación por PCR del ADN convertido con bisulfito se realiza después utilizando cebadores específicos para las islas de CpG de interés, seguido de digestión con endonucleasa de restricción, electroforesis en gel y detección utilizando sondas de hibridación marcadas específicas. Los niveles de metilación en la muestra de ADN original están representados por las cantidades relativas de producto de PCR digerido y no digerido, de forma linealmente cuantitativa en un amplio espectro de niveles de metilación de ADN. Además, esta técnica se puede aplicar de forma fiable al ADN obtenido de muestras de tejido incluidas en parafina microdiseccionadas.
Los reactivos típicos (por ejemplo, como podría encontrarse en un kit basado en COBRA™ típico) para el análisis por COBRA™ pueden incluir, pero sin limitación: cebadores de PCR para un gen específico (o secuencia de ADN o isla de CpG tratada con bisulfito); una enzima de restricción y una tampón apropiado; un oligonucleótido de hibridación génica; un oligonucleótido de hibridación de control; un kit de marcaje de quinasa para una sonda de oligonucleótidos y nucleótidos marcados. De forma adicional, los reactivos de conversión con bisulfito pueden incluir: tampón de desnaturalización de ADN; tampón de sulfonación; reactivos o kits para la recuperación de ADN (por ejemplo, precipitación, ultrafiltración, columna de afinidad); tampón de desulfonación; y componentes para la recuperación de ADN.
Preferentemente, los ensayos tales como "MethyLight™" (una técnica de PCR en tiempo real basada en fluorescencia) (Eads et al., Cancer Res. 59:2302-2306, 1999), las reacciones de Ms-SNuPE™ (extensión de cebador de nucleótido único sensible a metilación) (Gonzalgo y Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997), PCR específica de metilación ("MSP"; Herman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996; Patente de Estados Unidos N.° 5.786.146 ) y la amplificación de islas de CpG metiladas ("MCA"; Toyota et al., Cancer Res. 59:2307-12, 1999) se utilizan solos o en combinación con otros de estos métodos.
El técnica del ensayo "HeavyMethyl™" es un método cuantitativo para evaluar las diferencias de metilación basado en la amplificación específica de metilación del ADN tratado con bisulfito. Las sondas de bloqueo específicas de metilación (también denominadas en el presente documento bloqueantes) que incluyen posiciones de CpG entre, o incluidas en, los cebadores de amplificación, permiten la amplificación selectiva específica de metilación de una muestra de ácido nucleico.
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La expresión ensayo "HeavyMethyl™ MethyLight™", en la realización del mismo implementada en el presente documento, se refiere a un ensayo HeavyMethyl™ MethyLight™, que es una variación del ensayo MethyLight™, en donde el ensayo MethyLight ™ se combina con sondas de bloqueo específicas de metilación que incluyen posiciones de CpG entre los cebadores de amplificación. El ensayo HeavyMethyl™ también puede utilizarse en combinación con cebadores de amplificación específicos de metilación.
Los reactivos típicos (por ejemplo, como podría encontrarse en un kit basado en MethyLight™ típico) para el análisis por HeavyMethyl™ pueden incluir, pero sin limitación: cebadores de PCR para genes específicos (o una secuencia de ADN o isla de CpG tratada con bisulfito); oligonucleótidos de bloqueo; tampones para PCR optimizados y desoxinucleótidos; y Taq polimerasa.
MSP. La MSP (PCR específica de metilación) permite evaluar el estatus de metilación de prácticamente cualquier grupo de sitios CpG dentro de una isla de CpG, independientemente del uso de enzimas de restricción sensibles a la metilación (Herman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996; patente de Estados Unidos N.° 5.786.146). En resumen, el ADN se modifica mediante bisulfito de sodio convirtiendo todas las citosinas no metiladas, pero no las metiladas, en uracilo, y se amplifica posteriormente con cebadores específicos para ADN metilado frente a ADN no metilado. La MSP necesita solo pequeñas cantidades de ADN, es sensible al 0,1 % de alelos metilados de un locus de isla de CpG dado y puede realizarse sobre ADN extraído de muestras incluidas en parafina. Los reactivos típicos (por ejemplo, como podría encontrarse en un kit basado en MSP típico) para el análisis por MSP pueden incluir, pero sin limitación: cebadores de PCR metilados o no metilados para un gen específico (o secuencia de ADN o isla de CpG tratada con bisulfito), tampones de PCR optimizados y desoxinucleótidos, y sondas específicas.
MethyLight™. El ensayo MethyLight™ es un ensayo de metilación cuantitativo de alto rendimiento que utiliza tecnología de PCR en tiempo real basada en fluorescencia (TaqMan®) que no requiere manipulaciones adicionales después de la etapa de PCR (Eads et al., Cancer Res. 59:2302-2306, 1999). En resumen, el proceso de MethyLight™ comienza con una muestra mixta de ADN genómico que se convierte, en una reacción con bisulfito de sodio, en un conjunto mixto de diferencias de secuencias dependientes de metilación de acuerdo con procedimientos convencionales (el proceso con bisulfito convierte restos de citosina no metilados en uracilo). Después, la PCR basada en fluorescencia se realiza en una reacción "sesgada" (con cebadores de PCR que solapan con dinucleótidos CpG conocidos). La discriminación de secuencia puede producirse a nivel del procedimiento de amplificación y a nivel del procedimiento de detección de fluorescencia.
El ensayo MethyLight™ se puede utilizar como una prueba cuantitativa para los patrones de metilación en la muestra de ADN genómico, en donde la discriminación de la secuencia se produce a nivel de la hibridación de la sonda. En esta versión cuantitativa, la reacción de PCR proporciona una amplificación específica de metilación en presencia de una sonda fluorescente que solapa con un supuesto sitio de metilación particular. Se proporciona un control no sesgado para la cantidad de ADN de entrada mediante una reacción en que ni los cebadores ni la sonda se superponen con ninguno de los dinucleótidos CpG. Como alternativa, una prueba cualitativa para la metilación genómica se logra sondando el conjunto de PCR sesgada con oligonucleótidos de control que no "incluyen" sitios de metilación conocidos (una versión basada en fluorescencia de las técnicas HeavyMethyl™ y MSP), o con oligonucleótidos que incluyen sitios de metilación potenciales.
El procedimiento MethyLight™ se puede utilizar con cualquiera de las sondas adecuadas, por ejemplo, "TaqMan®", Lightcycler® etc.... Por ejemplo, el ADN genómico bicatenario se trata con bisulfito de sodio y se somete a uno de dos conjuntos de reacciones PCR utilizando sondas TaqMan®; por ejemplo, con cebadores de MSP y/o oligonucleótidos bloqueantes HeavyMethyl y una sonda TaqMan®. La sonda TaqMan® esta doblemente marcada con moléculas "indicadoras" fluorescentes "informadoras" y "extintoras", y está diseñada para ser específica para una región de contenido relativamente alto de GC, de modo que en el ciclo de PCR se desaparea a una temperatura 10 °C mayor que los cebadores directos o inversos. Esto permite que la sonda TaqMan® permanezca completamente hibridada durante la etapa de apareamiento/extensión de la PCR. Dado que la Taq polimerasa sintetiza enzimáticamente una nueva cadena durante la PCR, finalmente alcanzará la sonda TaqMan® apareada. La actividad endonucleasa 5' a 3' de la Taq polimerasa desplazará después la sonda TaqMan® mediante su digestión, para liberar la molécula indicadora fluorescente para la detección cuantitativa de su señal ahora no extinguida, utilizando un sistema de detección fluorescente en tiempo real.
Los reactivos típicos (por ejemplo, como podría encontrarse en un kit basado en MethyLight™ típico) para el análisis por MethyLight™ pueden incluir, pero sin limitación: cebadores de PCR para un gen específico (o secuencia de ADN o isla de CpG tratada con bisulfito); sondas TaqMan® o Lightcycler®; tampones para PCR optimizados y desoxinucleótidos; y Taq polimerasa.
El ensayo QM™ (metilación cuantitativa) es una prueba cuantitativa alternativa para los patrones de metilación en la muestra de ADN genómico, en donde la discriminación de la secuencia se produce a nivel de la hibridación de la sonda. En esta versión cuantitativa, la reacción de PCR proporciona una amplificación no sesgada en presencia de una sonda fluorescente que solapa con un supuesto sitio de metilación particular. Se proporciona un control no sesgado para la cantidad de ADN de entrada mediante una reacción en que ni los cebadores ni la sonda se
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superponen con ninguno de los dinucleótidos CpG. Como alternativa, una prueba cualitativa para la mutilación genómica se logra sondando el conjunto de PCR sesgada con oligonucleótidos de control que no "incluyen" sitios de metilación conocidos (una versión basada en fluorescencia de las técnicas HeavyMethyl™ y MSP), o con oligonucleótidos que incluyen sitios de metilación potenciales.
El procedimiento QM™ se puede utilizar con cualquiera de las sondas adecuadas, por ejemplo, "TaqMan®", Lightcycler® etc... en el procedimiento de amplificación. Por ejemplo, el ADN genómico bicatenario se trata con bisulfito de sodio y se somete a cebadores no sesgado y a la sonda TaqMan®. La sonda TaqMan® esta doblemente marcada con moléculas "indicadoras" fluorescentes "informadoras" y "extintoras", y está diseñada para ser específica para una región de contenido relativamente alto de GC, de modo que en el ciclo de PCR se desaparea a una temperatura 10 °C mayor que los cebadores directos o inversos. Esto permite que la sonda TaqMan® permanezca completamente hibridada durante la etapa de apareamiento/extensión de la PCR. Dado que la Taq polimerasa sintetiza enzimáticamente una nueva cadena durante la PCR, finalmente alcanzará la sonda TaqMan® apareada. La actividad endonucleasa 5' a 3' de la Taq polimerasa desplazará después la sonda TaqMan® mediante su digestión, para liberar la molécula indicadora fluorescente para la detección cuantitativa de su señal ahora no extinguida, utilizando un sistema de detección fluorescente en tiempo real.
Los reactivos típicos (por ejemplo, como podría encontrarse en un kit basado en QM™ típico) para el análisis por QM™ pueden incluir, pero sin limitación: cebadores de PCR para un gen específico (o secuencia de ADN o isla de CpG tratada con bisulfito); sondas TaqMan® o Lightcycler®; tampones para PCR optimizados y desoxinucleótidos; y Taq polimerasa.
Ms-SNuPE. La técnica Ms-SNuPE™ es un método cuantitativo para evaluar las diferencias de metilación en sitios CpG específicos basada en el tratamiento de ADN con bisulfito, seguido de la extensión de cebador de único nucleótido (Gonzalgo y Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997). En resumen, el ADN genómico se hace reaccionar con bisulfito de sodio para convertir la citosina no metilada en uracilo, mientras se deja sin cambios la 5- metilcitosina. La amplificación de la secuencia diana deseada se realiza después utilizando cebadores de PCR específicos para ADN convertido con bisulfito, y el producto resultante se aísla y se utiliza como molde para el análisis de metilación en el sitio (o sitios) CpG de interés. Se pueden analizar pequeñas cantidades de ADN (por ejemplo, cortes de anatomía patológica microdiseccionados), y esto evita la utilización de enzimas de restricción para determinar el estatus de metilación en los sitios CpG.
Los reactivos típicos (por ejemplo, como podría encontrarse en un kit basado en Ms-SNuPE™ típico) para el análisis por Ms-SNuPE™ pueden incluir, pero sin limitación: cebadores de PCR para un gen específico (o secuencia de ADN o isla de CpG tratada con bisulfito); tampones para PCR optimizados y desoxinucleótidos; un kit de extracción por gel; cebadores de control positivo; cebadores de Ms-SNuPE™ para un gen específico; tampón de reacción (para la reacción de Ms-SNuPE); y nucleótidos marcados. De forma adicional, los reactivos de conversión con bisulfito pueden incluir: tampón de desnaturalización de ADN; tampón de sulfonación; reactivos o un kit para la recuperación de ADN (por ejemplo, precipitación, ultrafiltración, columna de afinidad); tampón de desulfonación; y componentes para la recuperación de ADN.
La secuencia genómica (o secuencias genómicas) de acuerdo con al menos una secuencia genómica, seleccionada de un grupo que comprende la SEQ ID NO: 7, 1, 4, 10 y 13; preferentemente de la SEQ ID NO: 8, 2, 5, 11, 14 y muy preferentemente de la SEQ ID NO: 9, 3, 6, 12, 15, y variantes tratadas que no son de origen natural de acuerdo con las SEQ ID NO: 28, 29, 30, 31, 32, 33, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, se determinó que tienen utilidad nueva para la detección del carcinoma de vejiga.
La expresión anómala de ARNm transcrito a partir de al menos un gen o secuencia genómica seleccionada del grupo que consiste en AC051635.7, PRDM14, DMRT2, CYP1B1 y SOX1, y secuencias reguladoras de los mismos, está asociada con la presencia de carcinoma de vejiga en un sujeto. De acuerdo con la presente divulgación, la hipermetilación y/o la expresión a la baja se asocian con la presencia de carcinoma de vejiga.
Los niveles anómalos de expresión de polipéptidos de los polipéptidos codificados en al menos un gen o secuencia genómica seleccionada del grupo que consiste en AC051635.7, PRDM14, DMRT2, CYP1 B1 y SOX1, y secuencias reguladoras de los mismos, están asociados con la presencia de carcinoma de vejiga.
De acuerdo con la presente divulgación, la expresión a la baja de dichos polipéptidos está asociada con la presencia de carcinoma de vejiga.
Las realizaciones particulares de la presente invención proporcionan una aplicación nueva del análisis de los niveles y/o patrones de metilación dentro del ADN genómico de CYP1B1, de acuerdo con la SEQ ID NO: 12, que permite una detección precisa, caracterización y/o tratamiento del carcinoma de vejiga. La detección temprana del carcinoma de vejiga está directamente relacionada con el pronóstico de la enfermedad, y el método divulgado permite de este modo al médico y al paciente tomar decisiones de tratamiento mejores y más informadas.
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En la realización más preferente del método, la presencia o ausencia de carcinoma de vejiga se determina mediante el análisis del estatus de metilación de uno o más dinucleótidos CpG del ADN genómico de CYP1B1, de acuerdo con la SEQ ID NO: 12.
En una realización, la invención de dicho método comprende las siguientes etapas: i) poner en contacto ADN genómico (preferentemente, aislado de una muestra de ensayo de orina) obtenido del sujeto con al menos un reactivo o serie de reactivos que distingue entre dinucleótidos CpG metilados y no metilados dentro de ADN genómico de CYP1B1, de acuerdo con la SEQ ID NO: 12 y ii) detectar el carcinoma de vejiga.
La presente invención proporciona adicionalmente un método para establecer parámetros genéticos y/o epigenéticos del ADN genómico de CYP1B1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 12 dentro de un sujeto, mediante el análisis de la metilación de citosina. Dicho método comprende poner en contacto un ácido nucleico que comprende al menos una secuencia genómica de acuerdo con la SEQ ID NO: 12 en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto, con al menos un reactivo o una serie de reactivos, en donde dicho reactivo o serie de reactivos, distingue entre dinucleótidos CpG metilados y no metilados dentro del ácido nucleico diana.
En una realización preferente, dicho método comprende las siguientes etapas: En la primera etapa, se obtiene una muestra del tejido a analizar. La fuente puede ser cualquier fuente adecuada, tal como muestras de tejido vesical, preparaciones histológicas, tejido incluido en parafina, fluidos corporales como plasma o suero sanguíneo, líneas celulares y todas las combinaciones posibles de los mismos. Es preferente que dichas fuentes de ADN sean una muestra de ensayo de orina.
Después se aísla el ADN genómico de la muestra. El ADN genómico se puede aislar mediante cualquiera de los medios convencionales en la técnica, que incluyen el uso de kits disponibles en el mercado. En resumen, en donde el ADN de interés está encapsulado en una membrana celular, la muestra biológica debe romperse y lisarse por medios enzimáticos, químicos o mecánicos. Después, la solución de ADN puede clarificarse de proteínas y otros contaminantes, por ejemplo, por digestión con proteinasa K. Después se recupera el ADN genómico de la solución. Esto se puede llevar a cabo mediante una diversidad de métodos que incluyen saturación de sal, la extracción orgánica o la unión del ADN a un soporte en fase sólida. La elección del método se verá afectada por varios factores, incluidos el tiempo, el coste y la cantidad necesaria de ADN.
En donde el ADN de muestra no está contenido en una membrana (por ejemplo, ADN en circulación procedente de una muestra de sangre), se pueden emplear métodos convencionales en la técnica para el aislamiento y/o la purificación de ADN. Dichos métodos incluyen el uso de un reactivo degenerativo de proteínas, por ejemplo, sal caotrópica, por ejemplo clorhidrato de guanidina o urea; o un detergente, por ejemplo, dodecilsulfato de sodio (SDS), bromuro de cianógeno. Los métodos alternativos incluyen, pero sin limitación, precipitación con etanol o precipitación con propanol, concentración al vacío, por medio de una centrífuga, entre otros. El experto en la materia también puede hacer uso de dispositivos tales como dispositivos de filtración, por ejemplo, ultrafiltración, superficies o membranas de sílice, partículas magnéticas, partículas de poliestirol, superficies de poliestirol, superficies cargadas positivamente y membranas cargadas positivamente, membranas cargadas, superficies cargadas, membranas de cambio cargadas, superficies de cambio cargadas.
Una vez que se han extraído los ácidos nucleicos, se usa el ADN bicatenario genómico en el análisis.
En la segunda etapa del método, la muestra de ADN genómico se trata de tal manera que las bases de citosina que no están metiladas en la posición 5' se convierten en uracilo, timina u otra base que es diferente a la citosina en términos de comportamiento de hibridación. Esto se entenderá en el presente documento como 'pretratamiento' o 'tratamiento'.
Esto se logra preferentemente mediante un tratamiento con un reactivo de bisulfito. La expresión "reactivo de bisulfito" se refiere a un reactivo que comprende bisulfito, disulfito, hidrogenosulfito o combinaciones de los mismos, útil como se divulga en el presente documento para distinguir entre secuencias de dinucleótidos CpG metiladas y no metiladas. Los métodos de dicho tratamiento son conocidos en la técnica (por ejemplo, documento PCT/EP2004/011715). Es preferente que el tratamiento con bisulfito se realice en presencia de disolventes desnaturalizantes tales como, pero sin limitación, n-alquilénglicol, en particular dietilenglicol dimetiléter (DME), o en presencia de derivados de dioxano o dioxano. En una realización preferente, los disolventes desnaturalizantes se utilizan en concentraciones de entre el 1 % y el 35 % (v/v). También es preferente que la reacción con bisulfito se lleve a cabo en presencia de eliminadores tales como, pero sin limitación, derivados de cromano, por ejemplo, ácido 6-hidroxi-2,5,7,8, -tetrametilcromano 2-carboxílico o ácido trihidroxibenzoico y derivados de los mismos, por ejemplo, ácido gálico (véase: documento PCT/EP2004/011715). La conversión con bisulfito se lleva a cabo preferentemente a una temperatura de reacción de entre 30 °C y 70 °C, por lo que la temperatura aumenta hasta por encima de 85 °C durante periodos de tiempo cortos durante la reacción (véase: documento PCT/EP2004/011715). El ADN tratado con bisulfito se purifica preferentemente antes de la cuantificación. Esto puede realizarse por cualquier medio conocido en la técnica, tal como, pero sin limitación, ultrafiltración, preferentemente se lleva a cabo mediante columnas MicroconA(TM) (fabricadas por MicroconA(TM). La purificación se lleva a cabo de acuerdo con un protocolo modificado del fabricante (véase: documento pCt/EP2004/011715).
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En la tercera etapa del método, se amplifican fragmentos del ADN tratado, utilizando conjuntos de oligonucleótidos cebadores de acuerdo con la presente invención, y una enzima de amplificación. La amplificación de varios segmentos de ADN se puede llevar a cabo de forma simultánea en uno y en el mismo recipiente de reacción. Normalmente, la amplificación se lleva a cabo utilizando una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Preferentemente, dichos productos de amplificación son de 100 a 2.000 pares de bases de longitud. El conjunto de oligonucleótidos cebadores incluye al menos dos oligonucleótidos cuyas secuencias son cada una complementaria inversa, idéntica o hibrida en condiciones rigurosas o altamente rigurosas, con un segmento de al menos 16 pares de bases de longitud de las secuencias de bases de una de las SEQ ID NO: 38, 39, 68, 69 y secuencias complementarias de las mismas.
En una realización alternativa del método, el estatus de metilación de las posiciones de CpG preseleccionadas dentro del ADN genómico de CYP1B1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 12 se puede detectar mediante el uso de oligonucleótidos cebadores específicos de metilación. Esta técnica (MSP) se ha descrito en la patente de los Estados Unidos N.° 6.265.171 para Herman. El uso de cebadores específicos de situación de metilación para la amplificación de ADN tratado con bisulfito permite la diferenciación entre ácidos nucleicos metilados y no metilados. Las parejas de cebadores de MSP contienen al menos un cebador que hibrida con un dinucleótido CpG tratado con bisulfito. Por lo tanto, la secuencia de dichos cebadores comprende al menos un dinucleótido CpG. Los cebadores de MSP específicos para ADN no metilado contienen una "T" en la posición de la posición de la C en CpG. Preferentemente, por lo tanto, se requiere que la secuencia de bases de dichos cebadores comprenda una secuencia que tenga una longitud de al menos 9 nucleótidos que hibrida con una secuencia de ácido nucleico tratada de acuerdo con una de las SEQ ID NOS: 38, 39, 68, 69 y secuencias complementarias de la misma, en donde la secuencia de bases de dichos oligómeros comprende al menos un dinucleótido CpG. Una realización preferente adicional del método comprende el uso de oligonucleótidos bloqueantes (el ensayo HeavyMethyl™). El uso de tales oligonucleótidos bloqueantes se ha descrito en Yu et al., BioTechniques 23:714-720, 1997. Los oligonucleótidos de sonda de bloqueo se hibridan con el ácido nucleico tratado con bisulfito de forma simultánea con los cebadores de PCR. La amplificación por PCR del ácido nucleico se interrumpe en la posición 5' de la sonda de bloqueo, de forma que la amplificación de un ácido nucleico se suprime cuando está presente la secuencia complementaria a la sonda de bloqueo. Las sondas pueden diseñarse para que hibriden con el ácido nucleico tratado con bisulfito de una manera específica del estatus de metilación. Por ejemplo, para la detección de ácidos nucleicos metilados dentro de una población de ácidos nucleicos no metilados, la supresión de la amplificación de ácidos nucleicos que no están metilados en la posición en cuestión se llevaría a cabo mediante el uso de sondas de bloqueo que comprenden un 'CpA' o un 'TpA' en la posición en cuestión, a diferencia de un 'CpG' si se desea la supresión de la amplificación de ácidos nucleicos metilados.
Para los métodos de PCR que utilizan oligonucleótidos bloqueantes, la alteración eficaz de la amplificación mediada por polimerasa requiere que los oligonucleótidos bloqueantes no se elonguen mediante la polimerasa. Preferentemente, esto se logra a través del uso de bloqueantes que son 3'-desoxioligonucleótidos u oligonucleótidos derivatizados en la posición 3' con un grupo que no sea un hidroxilo "libre". Por ejemplo, los oligonucleótidos de 3'-O- acetilo son representativos de una clase preferente de molécula bloqueante.
De forma adicional, debería impedirse la descomposición de los oligonucleótidos bloqueantes mediada por la polimerasa. Preferentemente, dicho impedimento comprende el uso de una polimerasa que carece de actividad exonucleasa 5'-3', o el uso de oligonucleótidos bloqueantes modificados que tienen, por ejemplo, puentes de tioato en los extremos 5' de los mismos, que hacen que la molécula bloqueante resistente a nucleasas. Las aplicaciones particulares pueden no requerir tales modificaciones 5' del bloqueante. Por ejemplo, si los sitios de unión del bloqueante y del cebador solapan, impidiendo de este modo la unión del cebador (por ejemplo, con un exceso de bloqueante), la degradación del oligonucleótido bloqueante se impedirá sustancialmente. Esto es debido a que la polimerasa no extenderá el cebador hacía, y a través de (en la dirección 5'-3'), el bloqueante, un proceso que normalmente da como resultado la degradación del oligonucleótido bloqueante hibridado.
Una realización de bloqueante/PCR particularmente preferente, para los fines de la presente invención y como se implementa en el presente documento, comprende el uso de oligómeros de ácido peptidonucleico (PNA) como oligonucleótidos de bloqueo. Dichos oligómeros bloqueantes de PNA son idealmente adecuados, dado que la polimerasa no los descompone ni los extiende.
Preferentemente, por lo tanto, se requiere que la secuencia de bases de dichos oligonucleotidos de bloqueo comprenda una secuencia que tenga una longitud de al menos 9 nucleótidos que hibride con una secuencia de ácido nucleico tratada, de acuerdo con una de las SEQ ID NO: 38, 39, 68, 69 y secuencias complementarias de la misma, en donde la secuencia de bases de dichos oligonucleótidos comprende al menos un dinucleótido CpG, TpG o CpA.
Los fragmentos obtenidos mediante la amplificación pueden portar un marcador detectable de forma directa o indirecta. Son preferentes los marcadores en forma de marcadores fluorescentes, radionúclidos o fragmentos de moléculas separables que tienen una masa típica que puede detectarse en un espectrómetro de masas. Cuando dichos marcadores son marcadores de masa, es preferente que los productos de amplificación marcados tengan una única carga neta positiva o negativa, permitiendo una mejor detección en el espectrómetro de masas. La detección se puede llevar a cabo y visualizar mediante, por ejemplo, espectrometría de masas de
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desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI) o utilizando espectrometría de masas por electronebulización (ESI).
La espectrometría de masas de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF) es un desarrollo muy eficaz para el análisis de biomoléculas (Karas y Hillenkamp, Anal Chem., 60:2299-301, 1988). Un analito está incluido en una matriz que absorbe la luz. La matriz se evapora mediante un pulso de láser corto transportando así la molécula de analito a la fase de vapor de una forma no fragmentada. El analito se ioniza por colisiones con las moléculas de la matriz. Una fuerza eléctrica aplicada acelera los iones en un tubo de vuelo libre de campo. Debido a sus masas distintas, los iones se aceleran a velocidades distintas. Los iones más pequeños alcanzan el detector antes que los más grandes. La espectrometría MALDI-TOF es muy adecuada para el análisis de péptidos y proteínas. El análisis de ácidos nucleicos es un tanto más difícil (Gut y Beck, Current Innovations and Future Trends, 1:147-57, 1995). La sensibilidad con respecto al análisis de ácidos nucleicos es aproximadamente 100 veces menor que para los péptidos y disminuye de forma desproporcionada con un tamaño de fragmento creciente. Además, para ácidos nucleicos que tienen una estructura cargada negativamente de forma múltiple, el procedimiento de ionización a través de la matriz es considerablemente menos eficaz. En la espectrometría mAlDI-TOf, la selección de la matriz desempeña un papel eminentemente importante. Para la desorción de péptidos, se han encontrado varias matrices muy eficaces que producen una cristalización muy fina. Ahora existen varias matrices reactivas para ADN, sin embargo, la diferencia en sensibilidad entre péptidos y ácidos nucleicos no se ha reducido. Esta diferencia en la sensibilidad se puede reducir, sin embargo, modificando químicamente el ADN de manera tal que se vuelva más similar a un péptido. Por ejemplo, los ácidos nucleicos fosforotioato, en los que los fosfatos habituales de la estructura están sustituidos con tiofosfatos, se puede convertir en un ADN de carga neutra utilizando química de alquilación simple (Gut y Beck, Nucleic Acids Res. 23: 1367-73, 1995). El acoplamiento de una etiqueta de carga a este ADN modificado da como resultado un aumento en la sensibilidad de la MALDI-TOF al mismo nivel que el encontrado para péptidos. Una ventaja adicional del etiquetado de carga es la estabilidad aumentada del análisis frente a las impurezas, lo que hace que la detección de sustratos no modificados sea considerablemente más difícil.
En la cuarta etapa del método, los productos de amplificación obtenidos durante la tercera etapa del método se analizan para establecer el estatus de metilación de los dinucleótidos CpG antes del tratamiento.
En realizaciones donde los productos de amplificación se obtuvieron mediante la amplificación por MSP, la presencia o ausencia de un producto de amplificación es en sí misma indicativa del estado de metilación de las posiciones CpG incluidas en el cebador, de acuerdo con las secuencias de bases de dicho cebador.
Los productos de amplificación obtenidos mediante PCR convencional y específica de metilación pueden analizarse adicionalmente mediante métodos basados en bases tales como, pero sin limitación, la tecnología de matrices y las tecnologías basadas en sondas, así como mediante técnicas tales como secuenciación y extensión dirigida por molde.
En una realización del método, los productos de amplificación sintetizados en la etapa tres se hibridan posteriormente con una matriz o un conjunto de oligonucleótidos y/o sondas de PNA. En este contexto, la hibridación tiene lugar de la siguiente manera: el conjunto de sondas utilizado durante la hibridación está compuesto preferentemente de al menos 2 oligonucleótidos u oligómeros de PNA; en el procedimiento, los productos de amplificación sirven como sondas que se hibridan con oligonucleótidos unidos previamente a una fase sólida; los fragmentos no hibridados se eliminan posteriormente; dichos oligonucleótidos contienen al menos una secuencia de bases que tiene una longitud de al menos 9 nucleótidos que es complementaria inversa o idéntica a un segmento de las secuencias de bases especificadas en el Listado de Secuencias del presente documento; y el segmento comprende al menos un dinucleótido CpG, TpG o CpA. La porción de hibridación de los ácidos nucleicos que hibridan es normalmente al menos de 9, 15, 20, 25, 30 o 35 nucleótidos de longitud. Sin embargo, las moléculas más largas tienen utilidad inventiva y, así, están dentro del alcance de la presente invención.
En una realización preferente, dicho dinucleótido está presente en el tercio central del oligómero. Por ejemplo, en donde el oligómero comprende un dinucleótido CpG, dicho dinucleótido es preferentemente el quinto al noveno nucleótido desde el extremo 5' de un 13-mero. Existe un oligonucleótido para el análisis de cada dinucleótido CpG dentro de una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 12, y las posiciones equivalentes dentro de las SEQ ID NO: 38, 39, 68, 69. Dichos oligonucleótidos también pueden estar presentes en forma de ácidos peptidonucleicos. Después se eliminan los productos de amplificación no hibridados. Después se detectan los productos de amplificación hibridados. En este contexto, es preferente que los marcadores unidos a los productos de amplificación sean identificables en cada posición de la fase sólida en la que se emplaza una secuencia de oligonucleótido.
En aún una realización adicional del método, el estatus de metilación genómica de las posiciones de CpG puede establecerse mediante sondas de oligonucleótidos (como se detalla anteriormente) que se hibridan con el ADN tratado con bisulfito, de manera simultánea con los cebadores de amplificación de PCR (en donde dichos cebadores pueden ser específicos de metilación o convencionales).
Una realización particularmente preferente de este método es el uso de PCR cuantitativa en tiempo real basada en fluorescencia (Heid, et al., Genome Res. 6:986-994, 1996; véase también la patente de estados unidos N.°
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6.331.393, que emplea una sonda fluorescente doblemente marcada (PCR TaqMan™, utilizando un sistema de detección de secuencia ABI Prism 7700, Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, California). La reacción de PCR TaqMan™ emplea el uso de un oligonucleótido de análisis no extensible, denominado una sonda TaqMan™, que, en realizaciones preferentes, está diseñado para hibridar con una secuencia rica en CpG emplazada entre los cebadores de amplificación directo e inverso. La sonda TaqMan™ comprende adicionalmente una "fracción indicadora" fluorescente y una "fracción extintora" unidas covalentemente a fracciones enlazadoras (por ejemplo, fosforamiditas) unidas a los nucleótidos del oligonucleótido TaqMan™. Para el análisis de la metilación dentro de los ácidos nucleicos después del tratamiento con bisulfito, se requiere que la sonda sea específica para metilación, como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 6.331.393, también conocido como el ensayo MethyLightTM™. Las variaciones en la metodología de detección TaqMan™ que también son adecuadas para su uso con la invención descrita, incluyen el uso de tecnología de doble sonda (Lightcycler™) o cebadores de amplificación fluorescentes (tecnología Sunrise™). Ambas técnicas pueden adaptarse de una manera adecuada para su uso con ADN tratado con bisulfito y además para el análisis de metilación dentro de dinucleótidos CpG.
En una realización más preferente del método, la cuarta etapa del método comprende el uso de extensión de oligonucleótido dirigida por molde, tal como MS-SNuPE, como describen Gonzalgo y Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997.
En aún una realización adicional del método, la cuarta etapa del método comprende la secuenciación y el posterior análisis de secuencia del producto de amplificación generado en la tercera etapa del método (Sanger F., et al., Proc Natl Acad Sci USA 74:5463-5467, 1977).
MEJOR MODO
En la realización más preferente del método, los ácidos nucleicos genómicos se aíslan y se tratan de acuerdo con las primeras tres etapas del método descrito anteriormente, en concreto:
a) obtener de un sujeto una muestra biológica que tenga ADN genómico en cuestión;
b) extraer o aislar de otra forma el ADN genómico;
c) tratar el ADN genómico de b), o un fragmento del mismo, con uno o más reactivos para convertir bases citosina que no están metiladas en la posición 5 de las mismas en uracilo o en otra base que sea detectablemente diferente de la citosina en términos de propiedades de hibridación; y en donde
d) la amplificación posterior al tratamiento en c) se lleva a cabo de una manera específica de metilación, en concreto mediante el uso de cebadores específicos de metilación u oligonucleótidos bloqueantes, y adicionalmente en donde
e) la detección de los productos de amplificación se lleva a cabo mediante una sonda de detección en tiempo real, como se describe anteriormente.
Preferentemente, cuando la amplificación posterior de d) se lleva a cabo mediante cebadores específicos de metilación, como se describe anteriormente, dichos cebadores específicos de metilación comprenden una secuencia que tiene una longitud de al menos 9 nucleótidos que hibrida con una secuencia de ácido nucleico tratada de acuerdo con una de las SEQ ID NO: 38, 39, 68, 69 y secuencias complementarias de la misma, en donde la secuencia de bases de dichos oligómeros comprende al menos un dinucleótido CpG.
La etapa e) del método, en concreto la detección de los productos de amplificación específicos indicativos del estatus de metilación de una o más posiciones de CpG de acuerdo con al menos una secuencia genómica de acuerdo con la SEQ ID NO: 12 se lleva a cabo mediante métodos de detección en tiempo real como se describe anteriormente.
Las realizaciones adicionales de la invención proporcionan un método para el análisis del estatus de metilación del ADN genómico de CYP1B1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 12 sin la necesidad de conversión con bisulfito. Se conocen en la técnica métodos en donde se utiliza en la determinación de la metilación un reactivo de enzima de restricción sensible a la metilación o una serie de reactivos de enzimas de restricción que comprenden reactivos de enzimas de restricción sensibles a la metilación que distinguen entre dinucleótidos CpG metilados y no metilados dentro de una región diana, por ejemplo, pero sin limitación, la hibridación de metilación diferencial (DMH, forma siglada de differential methylation hybridization).
En la primera etapa de tales realizaciones adicionales, la muestra de ADN genómico se aísla de fuentes tisulares o celulares. El ADN genómico se puede aislar mediante cualquiera de los medios convencionales en la técnica, que incluyen el uso de kits disponibles en el mercado. En resumen, en donde el ADN de interés está encapsulado en una membrana celular, la muestra biológica debe romperse y lisarse por medios enzimáticos, químicos o mecánicos. Después, la solución de ADN puede clarificarse de proteínas y otros contaminantes, por ejemplo, por digestión con proteinasa K. Después se recupera el ADN genómico de la solución. Esto se puede llevar a cabo mediante una diversidad de métodos que incluyen saturación de sal, la extracción orgánica o la unión del ADN a un soporte en fase sólida. La elección del método se verá afectada por varios factores, incluidos el tiempo, el coste y la cantidad necesaria de ADN. Para los inventores son adecuados todos los tipos de muestras clínicas que comprenden materia
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neoplásica o potencialmente neoplásica, preferentemente son muestras de tejido vesical, preparaciones histológicas, tejido incluido en parafina, fluidos corporales como plasma o suero sanguíneo, líneas celulares y combinaciones de los mismos. Los fluidos corporales son la fuente preferente de ADN; particularmente preferente es la muestra de ensayo de orina.
Una vez que se han extraído los ácidos nucleicos, se utiliza el ADN bicatenario genómico en el análisis.
En una realización preferente, el ADN puede escindirse antes del tratamiento con enzimas de restricción sensibles a la metilación. Tales métodos son conocidos en la técnica y pueden incluir tanto medios físicos como enzimáticos. Particularmente preferente es el uso de una o una pluralidad de enzimas de restricción que no son sensibles a la metilación, y cuyos sitios de reconocimiento son ricos en AT y no comprenden dinucleótidos CG. El uso de tales enzimas permite la conservación de las islas de CpG y las regiones ricas en CpG en el ADN fragmentado. Las enzimas de restricción no específicas de metilación se seleccionan preferentemente del grupo que consiste en MseI, BfaI, Csp6I, Tru1I, Tvu1I, Tru9I, Tvu9I, MaeI y XspI. Particularmente preferente es el uso de dos o tres de tales enzimas. Particularmente preferente es el uso de una combinación de MseI, BfaI y Csp6I.
El ADN fragmentado se puede ligar después a oligonucleótidos adaptadores para facilitar la amplificación enzimática posterior. El ligamiento de oligonucleótidos a fragmentos de ADN terminados en romo y extremos cohesivos es conocida en la técnica y se lleva a cabo mediante desfosforilación de los extremos (por ejemplo, utilizando fosfatasa alcalina de ternera o de camarón), y el ligamiento posterior utilizando enzimas ligasa (por ejemplo, ADN ligasa T4) en presencia de los dATP. Los oligonucleótidos adaptadores son normalmente de al menos 18 pares de bases de longitud.
En la tercera etapa, el ADN (o fragmentos del mismo) se digiere después con una o más enzimas de restricción sensibles a metilación. La digestión se lleva a cabo de forma que la hidrólisis del ADN en el sitio de restricción es informativa del estatus de metilación de un dinucleótido CpG específico de al menos un gen o secuencia genómica seleccionada del grupo que consiste en AC051635.7, PRDM14, DMRT2, CYP1 B1 y SOX1, y secuencias reguladoras de los mismos.
Preferentemente, la enzima de restricción específica de metilación se selecciona del grupo que consiste en Bsi E1, Hga I HinPI, Hpy99I, Ava I, Bce AI, Bsa HI, BisI, BstUI, BshI236I, Accll, BstFNI, McrBC, Glal, MvnI, HpalI (HapII), Hhal, AciI, SmaI, HinP1I, HpyCH4IV, EagI y mezclas de dos o más de las enzimas anteriores. Es preferente una mezcla que contiene las enzimas de restricción, HpaII, HpyCH4IV yHinP1I.
En la cuarta etapa, que es opcional pero es una realización preferente, se amplifican los fragmentos de restricción. Esto se lleva a cabo preferentemente utilizando una reacción en cadena de la polimerasa, y dichos productos de amplificación pueden portar marcadores detectables adecuados, como se discutió anteriormente, en concreto, marcadores fluoróforos, radionúclidos y marcadores de masa. Particularmente preferente es la amplificación mediante una enzima de amplificación y al menos dos cebadores que comprenden, en cada caso, una secuencia contigua de al menos 16 nucleótidos de longitud que es complementaria a, o hibrida en condiciones moderadamente rigurosas o rigurosas con una secuencia seleccionada de un grupo que comprende la SEQ ID NO: 12, y complementarias de la misma. Preferentemente, dicha secuencia contigua es al menos de 16, 20 o 25 nucleótidos de longitud. En una realización alternativa, dichos cebadores pueden ser complementarios a cualquiera de los adaptadores ligados a los fragmentos.
En la quinta etapa se detectan los productos de amplificación. La detección puede ser mediante cualquier medio convencional en la técnica, por ejemplo, pero sin limitación, análisis por electroforesis en gel, análisis de hibridación, incorporación de etiquetas detectables dentro de los productos de pCr, análisis de matriz de ADN, análisis MALDI o ESI. Preferentemente, dicha detección se lleva a cabo por hibridación con al menos un ácido nucleico o ácido peptidonucleico que comprende en cada caso una secuencia contigua de al menos 16 nucleótidos de longitud que es complementaria a, o hibrida en condiciones moderadamente rigurosas o rigurosas con, una secuencia seleccionada del grupo que comprende la SEQ ID NO: 12, y complementarias de la misma. Preferentemente, dicha secuencia contigua es al menos de 16, 20 o 25 nucleótidos de longitud.
Después de la determinación del estado o nivel de metilación de los ácidos nucleicos genómicos, la presencia, ausencia de carcinoma de vejiga, se deduce basándose en el estado o nivel de metilación de al menos una secuencia de dinucleótido CpG de una secuencia genómica de acuerdo con la SEQ ID NO: 12, o un promedio, o un valor que refleja un estado de metilación promedio de una pluralidad de secuencias de dinucleótido CpG de una secuencia genómica de acuerdo con la SEQ ID NO: 12, en donde la metilación está asociada con la presencia de carcinoma de vejiga. En donde dicha metilación se determina por medios cuantitativos, el valor de corte para determinar dicha presencia de metilación es preferentemente cero (es decir, en donde una muestra presenta cualquier grado de metilación se determina que tiene una situación metilada en la posición CpG analizada). No obstante, está previsto que el experto en la materia pueda desear ajustar dicho valor de corte para proporcionar un ensayo de una sensibilidad o especificidad particularmente preferente. Por consiguiente, dicho valor de corte puede aumentarse (aumentando así la especificidad), dicho valor de corte puede estar dentro de un intervalo seleccionado
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del grupo que consiste en el 0 %-5 %, 5 %-10 %, 10 %-15 %, 15 %-20 %, 20 %-30 % y 30 %-50 %. Particularmente preferentes son los valores de corte del 10 %, 15 %, 25 % y 30 %.
Tras la determinación de la metilación del ADN genómico de CYP1B1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 12, se determina la presencia o ausencia de carcinoma de vejiga, en donde la hipermetilación indica la presencia de carcinoma de vejiga y la hipometilación indica la ausencia de carcinoma de vejiga en el sujeto.
MEJORAS ADICIONALES
La invención divulgada proporciona ácidos nucleicos tratados, obtenidos de al menos una secuencia genómica de acuerdo con la SEQ ID NO: 12, en donde el tratamiento es adecuado para convertir al menos una base de citosina no metilada de la secuencia de ADN genómico en uracilo u otra base que es detectablemente diferente a citosina en términos de hibridación. Las secuencias genómicas en cuestión pueden comprender una o más posiciones de CpG metiladas consecutivas. Dicho tratamiento comprende preferentemente el uso de un reactivo seleccionado del grupo que consiste en bisulfito, hidrogenosulfito, disulfito y combinaciones de los mismos. En una realización preferente de la invención, la invención proporciona un ácido nucleico modificado que no es de origen natural que comprende una secuencia de al menos 16 bases de nucleótidos contiguas de longitud, de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 38, 39, 68, 69. En realizaciones preferentes adicionales de la invención, dicho ácido nucleico es al menos de 50, 100, 150, 200, 250 o 500 pares de bases de longitud, de un segmento de la secuencia de ácido nucleico divulgada en las SEQ ID NO: 38, 39, 68, 69. Particularmente preferente es una molécula de ácido nucleico que no es idéntica o complementaria a toda o a una porción de las secuencias SEQ ID NO: 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 64 65. 66, 67, 68, 69, pero no una secuencia genómica de acuerdo con la SEQ ID NO: 12 u otro ADN de origen natural.
Es preferente que dicha secuencia comprenda al menos un dinucleótido CpG, TpA o CpA, y secuencias complementarias a la misma. Las secuencias de las SEQ ID NO: 38, 39, 68, 69, proporcionan versiones modificadas que no son de origen natural del ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 12, en donde la modificación de cada secuencia genómica da como resultado la síntesis de un ácido nucleico que tiene una secuencia que es exclusiva y distinta de dicha secuencia genómica como sigue. Para cada ADN genómico de cadena de sentido, por ejemplo, obtenido de la secuencia genómica de acuerdo con la SEQ ID NO: 12, se divulgan cuatro versiones convertidas. Una primera versión en donde la "C" se convierte en "T", pero "CpG" permanece "CpG" ( es decir, corresponde al caso donde, para la secuencia genómica, todos los restos "C" de secuencias de dinucleótidos CpG están metilados y, por lo tanto, no se convierten); una segunda versión divulga la complementaria de la secuencia de ADN genómico divulgada (es decir, cadena antisentido), en donde "C" se convierte en "T", pero "CpG" permanece "CpG" ( es decir, corresponde al caso donde, todos los restos "C " de las secuencias de dinucleótidos CpG están metilados y, por lo tanto, no se convierten). Las secuencias convertidas 'metiladas al alza' de la secuencia genómica de acuerdo con la SEQ ID NO: 12, corresponden a las SEQ ID NO: 38, 39. Se proporciona una tercera versión convertida químicamente de cada una de las secuencias genómicas, en donde "C" se convierte en "T" para todos los restos, incluidos los de secuencias de dinucleótidos "CpG" (es decir, corresponde al caso donde, para las secuencias genómicas, todos los restos "C" de secuencias de dinucleótidos CpG no están metilados); una versión convertida químicamente final de cada secuencia, divulga la complementaria de la secuencia de ADN genómico divulgada (es decir, cadena antisentido), en donde "C" se convierte en "T" para todos los restos, incluidos los de secuencias de dinucleótidos "CpG" (es decir, corresponde al caso donde, para la complementaria (cadena antisentido) de cada secuencia genómica, todos los restos "C" de secuencias de dinucleótido CpG no están metilados). Las secuencias convertidas 'metiladas a la baja' de la secuencia genómica de acuerdo con la SEQ ID NO: 12, corresponden a las SEQ ID NO: 68, 69.
De manera significativa, hasta el momento, las secuencias y moléculas de ácido nucleico de acuerdo con las SEQ ID NO: 38, 39, 68, 69 no estaban implicadas o relacionadas con la detección o el diagnóstico del carcinoma de vejiga.
En una realización preferente alternativa, la invención proporciona adicionalmente oligonucleótidos u oligómeros adecuados para uso en los métodos de la invención para detectar el estado de metilación de las citosinas dentro de ADN genómico o tratado (químicamente modificado), de acuerdo con las SEQ ID NO: 12, 38, 39, 68, 69 o las complementarias de las mismas. Dichos ácidos nucleicos de oligonucleótidos o de oligómeros proporcionan nuevos medios de diagnóstico. Dicho oligonucleótido u oligómero que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene una longitud de al menos nueve (9) nucleótidos que es idéntica a, hibrida con, en condiciones moderadamente rigurosas o rigurosas (como se define anteriormente en el presente documento), una secuencia de ácido nucleico tratado de acuerdo con las SEQ ID NO: 38, 39, 68, 69 y/o las secuencias complementarias a las mismas, o a una secuencia genómica de acuerdo con la secuencia genómica de acuerdo con la SEQ ID NO: 12 y/o una secuencia complementaria de la misma.
Por lo tanto, la presente invención incluye moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, oligonucleótidos y moléculas de ácido peptidonucleico (PNA) (oligómeros de PNA)) que hibridan en condiciones de hibridación moderadamente rigurosas y/o rigurosas con toda o una porción de las secuencias SEQ ID NO: 12, 38, 68, 69, o a las complementarias de las mismas. Particularmente preferente es una molécula de ácido nucleico que hibrida en condiciones de hibridación moderadamente rigurosas y/o rigurosas con toda o una porción de las secuencias SEQ
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ID NO: 38, 68, 69, pero no con la secuencia genómica de acuerdo con la SEQ ID NO: 12 u otro ADN genómico humano.
La porción idéntica o que híbrida de los ácidos nucleicos que hibridan es normalmente al menos de 9, 16, 20, 25, 30 o 35 nucleótidos de longitud. Sin embargo, las moléculas más largas tienen utilidad inventiva y, así, están dentro del alcance de la presente invención.
Preferentemente, la porción de hibridación de los ácidos nucleicos que hibridan de la invención es al menos el 95 %, o al menos el 98 %, o el 100 % idéntica a la secuencia, o a una porción de la misma, de las SEQ ID NOS: 12, 38, 39, 68, 69, o las complementarias de las mismas.
Se pueden utilizar ácidos nucleicos que hibridan del tipo descrito en el presente documento, por ejemplo, como un cebador (por ejemplo, un cebador de PCR), o una sonda o cebador de diagnóstico. Preferentemente, la hibridación de la sonda de oligonucleótido a una muestra de ácido nucleico se realiza en condiciones rigurosas, y la sonda es el 100 % idéntica a la secuencia diana. La estabilidad de la doble cadena o híbrido de ácido nucleico se expresa como la temperatura de fusión o Tm, que es la temperatura a la cual una sonda se disocia de un ADN diana. Esta temperatura de fusión se utiliza para definir las condiciones de rigurosidad necesarias.
Para las secuencias diana que están relacionadas y son sustancialmente idénticas a la secuencia genómica de acuerdo con la SEQ ID NO: 12 (tal como variantes alélicas y los SNP), en lugar de idénticas, es útil establecer en primer lugar la temperatura más baja a la que solo se produce hibridación homóloga con una concentración de sales particular (por ejemplo, SSC o SSPE). Después, suponiendo que una falta de coincidencia del 1 % da como resultado una disminución de la Tm de 1 °C, la temperatura del lavado final en la reacción de hibridación se reduce en de acuerdo con esto (por ejemplo, si se buscan secuencias que tengan > 95 % de identidad con la sonda, la temperatura del lavado final disminuye en 5 °C). En la práctica, el cambio en la Tm puede estar entre 0,5 °C y 1,5 °C por 1 % de falta de coincidencia.
Los ejemplos de oligonucleótidos de longitud X (en nucleótidos), según se indica por las posiciones de polinucleótido con referencia a, por ejemplo, la SEQ ID NO: 1, incluyen los correspondientes a conjuntos (conjuntos sentido y antisentido) de oligonucleótidos solapantes de forma consecutiva de longitud X, donde los oligonucleótidos dentro de cada conjunto solapante de forma consecutiva (que corresponde a un valor X dado) se definen como el conjunto finito de oligonucleótidos Z de las posiciones de nucleótido: n a (n + (X-1)); donde n = 1, 2, 3,...(Y-(X-1)); donde Y es igual a la longitud (nucleótidos o pares de bases) de SEQ ID NO: 1 (3300); donde X es igual a la longitud común (en nucleótidos) de cada oligonucleótido del conjunto (por ejemplo, X = 20 para un conjunto de 20-meros solapantes de forma consecutiva); y donde el número (Z) de oligómeros solapantes de forma consecutiva de longitud X para una dada SEQ ID NO: 1 de longitud Y es igual a Y - (X-1). Por ejemplo, Z = 3300 - 19 = 3281 para conjuntos sentido o antisentido de la SEQ ID NO: 1, donde X = 20.
Los ejemplos de oligonucleótidos de 20-meros incluyen el siguiente conjunto de 3281 oligómeros (y el conjunto antisentido complementario al mismo), indicado por las posiciones de polinucleótido con referencia a la SEQ ID NO 1: 1 - 20, 2 - 21, 3 - 22, 4 - 23, 5 - 24,...............y 3281 - 3300.
Asimismo, los ejemplos de oligonucleótidos de 25-meros incluyen el siguiente conjunto de 3276 oligómeros (y el conjunto antisentido complementario al mismo), indicado por las posiciones de polinucleótido con referencia a la SEQ ID NO 1: 1-25, 2-26, 3-27, 4-28, 5-29,........y 3276-3300.
Preferentemente, el conjunto está limitado a los oligómeros que comprenden al menos un dinucleótido CpG, TpG o CpA.
La presente invención abarca, para cada una de las SEQ ID NO: 12, 38, 39 (sentido y antisentido), múltiples conjuntos de oligonucleótidos solapantes de forma consecutiva u oligonucleótidos modificados de longitud X, donde, por ejemplo, X = 9, 10, 17, 20, 22, 23, 25, 27, 30 o 35 nucleótidos.
Los oligonucleótidos u oligómeros de acuerdo con la presente invención constituyen herramientas eficaces, útiles para establecer parámetros genéticos y epigenéticos de la secuencia genómica correspondiente a la secuencia genómica de acuerdo con la SEQ ID NO: 12. Los conjuntos preferentes de tales oligonucleótidos u oligonucleótidos modificados de longitud X son los conjuntos de oligómeros solapantes de forma consecutiva que corresponden a las SEQ ID NO: 12, 38, 39, (y a las complementarias de las mismas). Preferentemente, dichos oligómeros comprenden al menos un dinucleótido CpG, TpG o CpA.
Los oligonucleótidos u oligómeros de acuerdo con la presente invención particularmente preferentes son aquellos en que la citosina de las secuencias de dinucleótido CpG (o del correspondiente dinucleótido TpG o CpA convertido) está dentro del tercio medio del oligonucleótido; es decir, donde el oligonucleótido es, por ejemplo, de 13 bases de longitud, el dinucleótido CpG, TpG o CpA está situado dentro del quinto al noveno nucleótido desde el extremo 5'.
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Los oligonucleótidos de la invención también se pueden modificar uniendo químicamente el oligonucleótido a una o más fracciones o conjugados, para potenciar la actividad, estabilidad o detección del oligonucleótido. Dichas fracciones o conjugados incluyen cromóforos, fluoróforos, lípidos tales como colesterol, ácido cólico, tioéter, cadenas alifáticas, fosfolípidos, poliaminas, polietilenglicol (PEG), fracciones palmitoílo, y otras divulgadas en, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos números 5.514.758; 5.565.552; 5.567.810; 5.574.142; 5.585.481; 5.587.371; 5.597.696 y 5.958.773. Las sondas también pueden existir en forma de un PNA (ácido peptidonucleico) que tiene propiedades de emparejamiento particularmente preferentes. Por lo tanto, el oligonucleótido puede incluir otros grupos añadidos tales como péptidos, y puede incluir agentes de escisión activados por hibridación (Krol et al., BioTechniques 6:958- 976, 1988) o agentes intercalantes (Zon, Pharm. Res. 5:539-549, 1988). Para este fin, el oligonucleótido puede conjugarse a otra molécula, por ejemplo, un cromóforo, fluoróforo, péptido, agente de reticulación activado por hibridación, agente de transporte, agente de escisión activado por hibridación, etc.
El oligonucleótido también puede comprender al menos una fracción de azúcar y/o base modificada reconocida en la técnica, o puede comprender una estructura modificada o un enlace internucleosídico no natural.
Los oligonucleótidos u oligómeros de acuerdo con realizaciones particulares de la presente invención se usan normalmente en 'conjuntos', que contienen al menos un oligómero para el análisis de cada uno de los dinucleótidos CpG de la secuencia genómica de acuerdo con la SEQ ID NO: 12 y secuencias complementarias a la misma, o al correspondiente dinucleótido CpG, TpG o CpA, dentro de una secuencia de los ácidos nucleicos tratados de acuerdo con las SEQ ID NO: 38, 39, 68, 69 y secuencias complementarias de las mismas. Sin embargo, se anticipa que, por factores económicos u otros, puede ser preferible analizar una selección limitada de los dinucleótidos CpG dentro de dichas secuencias, y el contenido del conjunto de oligonucleótidos se altera de forma consecuente.
En realizaciones particulares, el conjunto comprende adicionalmente al menos uno (oligonucleótidos y/u oligómeros de PNA) útil para detectar el estado de metilación de citosinas en ADN genómico tratado (las SEQ ID NO: 28, 29, 30, 31, 32, 33, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 34, 35, 36, 37, 40, 41, 42, 43, 44, 45,
46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 64, 65, 66, 67, 70, 71, 72, 73, 74, 75), o en ADN genómico (al menos
una secuencia genómica, seleccionada de un grupo que comprende la SEQ ID NO: 7, 1,4, 10 y 13; preferentemente de la SEQ ID NO: 8, 2, 5, 11, 14 y muy preferentemente de la SEQ ID NO: 9, 3, 6, 15 y secuencias complementarias de las mismas). Estas sondas permiten el diagnóstico y la detección del carcinoma de vejiga. El conjunto de oligómeros también puede utilizarse para detectar polimorfismos mononucleotídicos (los SNP) en ADN genómico tratado (las SEQ ID NO: 28, 29, 30, 31, 32, 33, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75), o en ADN genómico (al menos una secuencia genómica, seleccionada de un grupo que
comprende la SEQ ID NO: 7, 1, 4, 10 y 13; preferentemente de la SEQ ID NO: 8, 2, 5, 11, 14 y muy preferentemente de la SEQ ID NO: 9, 3, 6, 12, 15 y secuencias complementarias de las mismas).
En realizaciones preferentes, al menos uno y más preferentemente todos los miembros de un conjunto de oligonucleótidos están unido a una fase sólida.
En realizaciones adicionales, la presente invención proporciona un conjunto de al menos dos (2) oligonucleótidos que se utilizan como oligonucleótidos 'cebadores' para amplificar secuencias de ADN de una de las SEQ ID NO: 12 38, 39, y secuencias complementarias de las mismas o segmentos de las mismas.
Se anticipa que los oligonucleótidos pueden constituir toda o parte de una "matriz" o "chip de ADN" (es decir, una disposición de distintos oligonucleótidos y/u oligómeros de PNA unidos a una fase sólida). Dicha matriz de distintas secuencias de oligómeros de oligonucleótidos y/o de PNA se puede caracterizar, por ejemplo, por estar dispuesta en la fase sólida en forma de una estructura reticular rectangular o hexagonal. La superficie de la fase sólida puede estar compuesta de silicio, vidrio, poliestireno, aluminio, acero, hierro, cobre, níquel, plata u oro. También pueden utilizarse nitrocelulosa y plásticos tales como nailon, que pueden existir en forma de gránulos o también como matrices de resina. Puede obtenerse una visión de conjunto de la técnica anterior en la fabricación de matrices de oligómeros de una edición especial de Nature Genetics (Nature Genetics Supplement, volumen 21, enero de 1999, y de la bibliografía citada en el presente documento). Las sondas marcadas de forma fluorescente se utilizan a menudo para la exploración de matrices de ADN inmovilizadas. La simple unión de los colorantes Cy3 y Cy5 al 5'- OH de la sonda específica es particularmente adecuada para los marcadores de fluorescencia. La detección de la fluorescencia de las sondas hibridadas puede llevarse a cabo, por ejemplo, a través de un microscopio confocal. Los colorantes Cy3 y Cy5, además de muchos otros, están disponibles en el mercado.
Además se anticipa que los oligonucleótidos, o secuencias particulares de los mismos, pueden constituir todo o parte de una "matriz virtual" en donde los oligonucleótidos, o secuencias particulares de los mismos, se utilizan, por ejemplo, como 'especificadores' como parte de, o en combinación con, una población diversa de sondas marcadas exclusivas, para analizar una mezcla compleja de analitos. Dicho método, por ejemplo, se describe en el documento US 2003/0013091 (Número de serie de los Estados Unidos 09/898.743, publicado el 16 de enero de 2003). En tales métodos, se generan suficientes marcadores como para que cada ácido nucleico en la mezcla compleja (es decir, cada analito) pueda unirse de forma exclusiva a un marcador único y, así, detectarse (cada marcador se cuenta directamente, lo que da como resultado una lectura digital de cada especie molecular en la mezcla). Es
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particularmente preferente que los oligómeros de acuerdo con la invención se utilicen para detectar o para diagnosticar carcinoma de vejiga.
Kits
Se divulga un kit que comprende: un medio para determinar la metilación de al menos un gen o secuencia genómica seleccionada del grupo que consiste en AC051635.7, PRDM14, DMRT2, CYP1 B1 y SOX1, y secuencias reguladoras de los mismos. El medio para determinar la metilación de al menos un gen o secuencia genómica seleccionada del grupo que consiste en AC051635.7, PRDM14, DMRT2, CYP1B1 y SOX1, y secuencias reguladoras de los mismos, comprende preferentemente un reactivo que contiene bisulfito; uno o una pluralidad de oligonucleótidos que consisten en secuencias que en cada caso son idénticas, son complementarias o hibridan en condiciones rigurosas o altamente rigurosas con un segmento de 9, o más preferentemente 18 bases, de longitud, de una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 28, 29, 30, 31, 32, 33, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75; y opcionalmente instrucciones para llevar a cabo y evaluar el método descrito de análisis de metilación. En una realización, la secuencia de bases de dichos oligonucleótidos comprende al menos un dinucleótido CpG, CpA o TpG.
Dicho kit puede comprender adicionalmente reactivos convencionales para realizar un análisis de metilación específico de la posición CpG, en donde dicho análisis comprende una o más de las siguientes técnicas: MS- SNuPE, MSP, MethyLight™, HeavyMethyl, COBRA y secuenciación de ácidos nucleicos. Sin embargo, un kit también puede contener solo parte de los componentes mencionados anteriormente.
El kit puede comprender reactivos de conversión por bisulfito adicionales seleccionados del grupo que consiste en: tampón de desnaturalización de ADN; tampón de sulfonación; reactivos o kits para la recuperación de ADN (por ejemplo, precipitación, ultrafiltración, columna de afinidad); tampón de desulfonación; y componentes para la recuperación de ADN.
El kit puede contener, empaquetados en recipientes distintos, una polimerasa y un tampón de reacción optimizado para la extensión de cebadores mediada por la polimerasa, tal como PCR. El kit puede comprender adicionalmente medios para obtener una muestra biológica del paciente. Es preferente un kit que comprenda adicionalmente un recipiente adecuado para contener el medio para determinar la metilación de al menos un gen o secuencia genómica seleccionada del grupo que consiste en AC051635.7, PRDM14, DMRT2, CYP1 B1 y SOX1, y secuencias reguladoras de los mismos, en la muestra biológica del paciente, y más preferentemente que comprenda adicionalmente instrucciones para el uso e interpretación de los resultados del kit. Preferentemente el kit comprende: (a) un reactivo de bisulfito; (b) un recipiente adecuado para contener dicho reactivo de bisulfito y la muestra biológica del paciente; (c) al menos un conjunto de oligonucleótidos cebadores que contiene dos oligonucleótidos cuyas secuencias son en cada caso idénticas, son complementarias o hibridan en condiciones rigurosas o altamente rigurosas con un segmento de 9, o más preferentemente 18 bases, de longitud, de una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 28, 29, 30, 31, 32, 33, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75; y opcionalmente (d) instrucciones para el uso e interpretación de los resultados del kit. Como alternativa, el kit comprende: (a) un reactivo de bisulfito; (b) un recipiente adecuado para contener dicho reactivo de bisulfito y la muestra biológica del paciente; (c) al menos uno de los oligonucleótidos y/u oligómero de PNA que tiene una longitud de al menos 9 o 16 nucleótidos, que es idéntico a o hibrida con una secuencia de ácido nucleico pretratada de acuerdo con una de las SEQ ID NO: 28, 29, 30, 31, 32, 33, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23,
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67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75 y secuencias complementarias de las mismas; y opcionalmente (d) instrucciones para el uso e interpretación de los resultados del kit.
Como alternativa, el kit comprende: (a) un reactivo de bisulfito; (b) un recipiente adecuado para contener dicho reactivo de bisulfito y la muestra biológica del paciente; (c) al menos un conjunto de oligonucleótidos cebadores que contiene dos oligonucleótidos cuyas secuencias son en cada caso idénticas, son complementarias o hibridan en condiciones rigurosas o altamente rigurosas con un segmento de 9, o más preferentemente 18 bases, de longitud, de una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 28, 29, 30, 31, 32, 33, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 16, 17, 18, 19, 20,
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64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75; (d) al menos uno de los oligonucleótidos y/u oligómero de PNA que tiene una longitud de al menos 9 o 16 nucleótidos, que es idéntico a o hibrida con una secuencia de ácido nucleico pretratada de acuerdo con una de las SEQ ID NO: 28, 29, 30, 31, 32, 33, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75 y secuencias complementarias de las mismas; y opcionalmente (e) instrucciones para el uso e interpretación de los resultados del kit.
El kit también puede contener otros componentes tales como tampones o soluciones adecuadas para el bloqueo, lavado o recubrimiento, empaquetados en un recipiente distinto.
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Los reactivos típicos (por ejemplo, como podría encontrarse en un kit basado en COBRA™ típico) para el análisis por COBRA™ pueden incluir, pero sin limitación: Cebadores de PCR para al menos un gen o secuencia genómica seleccionada del grupo que consiste en AC051635.7, PRDM14, DMRT2, CYP1 B1 y SOX1, y secuencias reguladoras de los mismos, una enzima de restricción y un tampón apropiado; un oligonucleótido de hibridación génica; un oligonucleótido de hibridación de control; un kit de marcaje de quinasa para una sonda de oligonucleótidos; y nucleótidos marcados. Los reactivos típicos (por ejemplo, como podría encontrarse en un kit basado en MethyLight™ típico) para el análisis por MethyLight™ pueden incluir, pero sin limitación: cebadores de PCR para la secuencia convertida con bisulfito de al menos un gen o secuencia genómica seleccionada del grupo que consiste en AC051635.7, PRDM14, DMRT2, CYP1 B1 y SOX1, y secuencias reguladoras de los mismos, sondas específicas de bisulfito (por ejemplo, TaqMan™ o Lightcycler™); tampones para PCR optimizados y desoxinucleótidos; y Taq polimerasa.
Los reactivos típicos (por ejemplo, como podría encontrarse en un kit basado en Ms-SNuPE™ típico) para el análisis por Ms-SNuPE™ pueden incluir, pero sin limitación: cebadores de PCR para un gen específico (o secuencia de ADN o isla de CpG tratada con bisulfito); tampones para PCR optimizados y desoxinucleótidos; un kit de extracción por gel; cebadores de control positivo; cebadores de Ms-SNuPE™ para la secuencia convertida con bisulfito de al menos un gen o secuencia genómica seleccionada del grupo que consiste en AC051635.7, PRDM14, DMRT2, CYP1 B1 y SOX1, y secuencias reguladoras de los mismos, tampón de reacción (para la reacción de Ms-SNuPE); y nucleótidos marcados.
Los reactivos típicos (por ejemplo, como podría encontrarse en un kit basado en MSP típico) para el análisis por MSP pueden incluir, pero sin limitación: cebadores de PCR metilados y no metilados para la secuencia convertida con bisulfito de al menos un gen o secuencia genómica seleccionada del grupo que consiste en AC051635.7, PRDM14, DMRT2, CYP1 B1 y SOX1, y secuencias reguladoras de los mismos, tampones de PCR optimizados y desoxinucleótidos, y sondas específicas.
Además, un aspecto adicional de la divulgación es un kit alternativo que comprende un medio para determinar la metilación de al menos un gen o secuencia genómica seleccionada del grupo que consiste en AC051635.7, PRDM14, DMRT2, CYP1 B1 y SOX1, y secuencias reguladoras de los mismos, en donde dicho medio comprende preferentemente al menos una enzima de restricción específica de metilación; uno o una pluralidad de oligonucleótidos cebadores (preferentemente uno o una pluralidad de parejas de cebadores) adecuados para la amplificación de una secuencia que comprende al menos un dinucleótido CpG de al menos una secuencia genómica, seleccionada de un grupo que comprende la SEQ ID NO: 7, 1, 4, 10 y 13; preferentemente de la SEQ ID NO: 8, 2, 5, 11, 14 y muy preferentemente de la SEQ ID NO: 9, 3, 6, 12, 15; y opcionalmente instrucciones para llevar a cabo y evaluar el método descrito de análisis de metilación. La secuencia de bases de dichos oligonucleótidos puede ser idéntica, complementaria o hibridar en condiciones rigurosas o altamente rigurosas, con un segmento de al menos 18 bases de longitud de al menos una secuencia seleccionada de un grupo que comprende la SEQ ID NO: 7, 1, 4, 10 y 13; preferentemente de la SEQ ID NO: 8, 2, 5, 11, 14 y muy preferentemente de la SEQ ID NO: 9, 3, 6, 12, 15.
Dicho kit puede comprender una o una pluralidad de sondas de oligonucleótido para el análisis de los fragmentos de digestión, preferentemente dichos oligonucleótidos son idénticos, son complementarios o hibridan en condiciones rigurosas o altamente rigurosas, con un segmento de al menos 16 bases de longitud de al menos una secuencia seleccionada de un grupo que comprende la SEQ ID NO: 7, 1,4, 10 y 13; preferentemente de la SEQ ID NO: 8, 2, 5, 11, 14 y muy preferentemente de la SEQ ID NO: 9, 3, 6, 12, 15.
El kit puede comprender reactivos adicionales seleccionados del grupo que consiste en: un tampón (por ejemplo, tampones de enzimas de restricción, de PCR, de almacenamiento o de lavado); reactivos o kits para la recuperación de ADN (por ejemplo, precipitación, ultrafiltración, columna de afinidad) y componentes para la recuperación de ADN.
Como alternativa, el kit puede contener, empaquetados en recipientes distintos, una polimerasa y un tampón de reacción optimizado para la extensión de cebadores mediada por la polimerasa, tal como PCR. El kit puede comprender adicionalmente medios para obtener una muestra biológica del paciente. El kit comprende preferentemente: (a) un reactivo de enzima de restricción sensible a metilación; (b) un recipiente adecuado para contener dicho reactivo y la muestra biológica del paciente; (c) al menos un conjunto de oligonucleótidos, uno o una pluralidad de ácidos nucleicos o ácidos peptidonucleicos que son idénticos, son complementarios o hibridan en condiciones rigurosas o altamente rigurosas, con un segmento de al menos 9 bases de longitud de al menos una secuencia seleccionada de un grupo que comprende la SEQ ID NO: 7, 1, 4, 10 y 13; preferentemente de la SEQ ID NO: 8, 2, 5, 11, 14 y muy preferentemente de la SEQ ID NO: 9, 3, 6, 12, 15; y opcionalmente (d) instrucciones para el uso e interpretación de los resultados del kit.
Como alternativa, el kit comprende: (a) un reactivo de enzima de restricción sensible a metilación; (b) un recipiente adecuado para contener dicho reactivo y la muestra biológica del paciente; (c) al menos un conjunto de oligonucleótidos cebadores adecuados para la amplificación de una secuencia que comprende al menos un dinucleótido CpG de una secuencia seleccionada de al menos una secuencia genómica, seleccionada de un grupo que comprende la SEQ ID NO: 7, 1, 4, 10 y 13; preferentemente de la SEQ ID NO: 8, 2, 5, 11, 14 y muy
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preferentemente de la SEQ ID NO: 9, 3, 6, 12, 15; y opcionalmente (d) instrucciones para el uso e interpretación de los resultados del kit.
Como alternativa, el kit comprende: (a) un reactivo de enzima de restricción sensible a metilación; (b) un recipiente adecuado para contener dicho reactivo y la muestra biológica del paciente; (c) al menos un conjunto de oligonucleótidos cebadores adecuados para la amplificación de una secuencia que comprende al menos un dinucleótido CpG de una secuencia seleccionada de al menos una secuencia genómica, seleccionada de un grupo que comprende la SEQ ID NO: 7, 1, 4, 10 y 13; preferentemente de la SEQ ID NO: 8, 2, 5, 11, 14 y muy
preferentemente de la SEQ ID NO: 9, 3, 6, 12, 15; (d) al menos un conjunto de oligonucleótidos, uno o una pluralidad
de ácidos nucleicos o ácidos peptidonucleicos que son idénticos, son complementarios o hibridan en condiciones rigurosas o altamente rigurosas, con un segmento de al menos 9 bases de longitud de una secuencia seleccionada de al menos una secuencia genómica, seleccionada de un grupo que comprende la SEQ ID NO: 7, 1,4, 10 y 13;
preferentemente de la SEQ ID NO: 8, 2, 5, 11, 14 y muy preferentemente de la SEQ ID NO: 9, 3, 6, 12, 15, y
opcionalmente (e) instrucciones para el uso e interpretación de los resultados del kit.
El kit también puede contener otros componentes tales como tampones o soluciones adecuadas para el bloqueo, lavado o recubrimiento, empaquetados en un recipiente distinto.
Se divulga adicionalmente un kit para su uso en la proporción de un diagnóstico de la presencia o ausencia del carcinoma de vejiga, en un sujeto, mediante análisis de enzimas de restricción sensibles a metilación. Dicho kit comprende un recipiente y un componente de micromatriz de ADN. Siendo dicho componente de micromatriz de ADN una superficie sobre la cual se inmovilizan una pluralidad de oligonucleótidos en posiciones designadas y en donde el oligonucleótido comprende al menos un sitio de metilación de CpG. Al menos uno de dichos oligonucleótidos es específico para al menos un gen o secuencia genómica seleccionada del grupo que consiste en AC051635.7, PRDM14, DMRT2, CYP1 B1 y SOX1, y secuencias reguladoras de los mismos, y comprende una secuencia de al menos 15 pares de bases de longitud pero no más de 200 pb de una secuencia de acuerdo con al menos una secuencia genómica, seleccionada de un grupo que comprende la SEQ ID NO: 7, 1, 4, 10 y 13; preferentemente de la SEQ ID NO: 8, 2, 5, 11, 14 y muy preferentemente de la SEQ ID NO: 9, 3, 6, 12, 15. Preferentemente, dicha secuencia es al menos de 15 pares de bases de longitud pero no más de 80 pb de al menos una secuencia de acuerdo con una de la SEQ ID NO: 7, 1, 4, 10 y 13; preferentemente de la SEQ ID NO: 8, 2, 5, 11, 14 y muy preferentemente de la SEQ ID NO: 9, 3, 6, 12, 15. Es preferente adicionalmente que dicha secuencia sea al menos de 20 pares de bases de longitud pero no más de 30 pb de una secuencia de acuerdo con al menos una secuencia de acuerdo con una de la SEQ ID NO: 7, 1,4, 10 y 13; preferentemente de la SEQ ID NO: 8, 2, 5, 11, 14 y muy preferentemente de la SEQ ID NO: 9, 3, 6, 12, 15.
Preferentemente, dicho kit de prueba comprende adicionalmente un componente de enzima de restricción que comprende una o una pluralidad de enzimas de restricción sensibles a metilación.
De forma opcional dicho kit de prueba se caracteriza adicionalmente porque comprende al menos una enzima de restricción específica de metilación, y en donde los oligonucleótidos comprenden un sitio de restricción de dicha al menos una enzima de restricción específica de metilación.
El kit puede comprender adicionalmente uno o varios de los siguientes componentes, que son conocidos en la técnica para el enriquecimiento de ADN: un componente de proteína, uniéndose dicha proteína de forma selectiva a ADN metilado; un componente de ácido nucleico que forma un tríplex, uno o una pluralidad de enlazadores, opcionalmente en una solución adecuada; sustancias o soluciones para realizar un ligamiento, por ejemplo, ligasas, tampones; sustancias o soluciones para realizar una cromatografía en columna; sustancias o soluciones para realizar un enriquecimiento basado en inmunología (por ejemplo, inmunoprecipitación); sustancias o soluciones para realizar una amplificación de ácidos nucleicos, por ejemplo, PCR; un colorante o varios colorantes, en su caso con un reactivo de acoplamiento, en su caso en una solución; sustancias o soluciones para realizar una hibridación; y/o sustancias o soluciones para realizar una etapa de lavado.
La divulgación proporciona adicionalmente una composición de materia útil para detectar o para diagnosticar el carcinoma de vejiga.
Dicha composición comprende al menos un ácido nucleico de 18 pares de bases de longitud de un segmento de la secuencia de ácido nucleico divulgada en las SEQ ID NO: 28, 29, 30, 31, 32, 33, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 16, 17, 18,
19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55,
56, 57, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, y una o más sustancias tomadas del grupo que comprende: cloruro de magnesio 1-5 mM, dNTP 100-500 pM, 0,5-5 unidades de taq polimerasa, seroalbúmina bovina, un oligómero, en particular un oligonucleótido u oligómero de ácido peptidonucleico (PNA), comprendiendo dicho oligómero en cada caso al menos una secuencia de bases que tiene una longitud de al menos 9 nucleótidos que es complementaria a, o hibrida en condiciones moderadamente rigurosas o rigurosas con un ADN genómico pretratado de acuerdo con una de las SEQ ID NO: 28, 29, 30, 31, 32, 33, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23,
24, 25, 26, 27, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 64, 65, 66,
67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75 y secuencias complementarias de las mismas. Es preferente que dicha
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composición de materia comprenda una solución de tampón apropiada para la estabilización de dicho ácido nucleico en una solución acuosa y que permita reacciones basadas en polimerasa en dicha solución. Los tampones adecuados son conocidos en la técnica y están disponibles en el mercado.
Dicho al menos un ácido nucleico es preferentemente al menos de 50, 100, 150, 200, 250 o 500 pares de bases de longitud, de un segmento de la secuencia de ácido nucleico divulgada en las SEQ ID NO: 28, 29, 30, 31, 32, 33, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75.
Descripción de las figuras
La Figura 1 muestra los resultados de la evaluación técnica de los ensayos de MSP. ADNm = ADN completamente metilado, ADM = Amplificación de desplazamiento múltiple; esto da como resultado un ADN completamente no metilado; se utiliza una mezcla 1:1000 de ADN metilado en no metilado para evaluar la sensibilidad relativa. ASU = agrupamiento de sedimentos urinarios. Se analizaron 3 agrupamientos con ADN de 3 a 5 personas sanas distintas, por lo tanto, cada agrupamiento representa una muestra exclusiva; CSM = Controles sin molde, muestras que deben ser negativas; Pac. 1-5: muestras de tejido tumoral vesical que se utilizaron en la DMH, por lo tanto, un desempeño positivo del ensayo en estas muestras proporciona la confirmación de los resultados de la DMH. Los valores son datos de qPCR (PCR cuantitativa) que se muestran como puntos de cruce (los PC). Un PC de 50 significa que no se detectó ADN metilado; más pequeño corresponde a cantidades crecientes de ADN metilado detectadas por el ensayo respectivo.
La Figura 2 muestra las proporciones de ADN metilado frente al total en la muestra de ensayo de orina completa obtenida de individuos sanos (contr.) y de pacientes diagnosticados con carcinoma de vejiga (cáncer). Se detectó la metilación en productos de PCR (las SEQ ID NO: 84, 76, 80, 88, 92), cada uno de los cuales representa un fragmento de secuencia de los genes indicados.
Ejemplos
1. Introducción
Un diagnóstico fiable y no invasivo de carcinoma de vejiga recurrente sigue siendo un desafío para la práctica clínica. Los autores emplearon la hibridación de metilación diferencial (DMH) como metodología para descubrir biomarcadores basados en la metilación del ADN que sean adecuados para el diagnóstico temprano del carcinoma de vejiga no invasivo del músculo. Se eligió como material de muestra para el descubrimiento tejido tumoral y ADN procedentes de sedimentos urinarios de personas sanas. Los locus genómicos identificados como diferencialmente metilados se filtraron para seleccionar los candidatos que están hipermetilados en el tumor y predominantemente no metilados en el ADN obtenido del sedimento urinario de personas sanas, así como en linfocitos de sangre periférica normales.
Para un subgrupo de estos marcadores candidatos, los autores desarrollaron ensayos de PCR específicos de metilación (MSP) para validar los hallazgos de este estudio del descubrimiento. Los ensayos de mejor desempeño finalmente se probaron en una colección de muestras de orina de pacientes con carcinoma de vejiga no invasivo de músculo y pacientes sin carcinoma de vejiga.
Los resultados detallados se muestran para cinco marcadores candidatos que son adecuados para el desarrollo adicional del ensayo, para obtener herramientas útiles desde el punto de vista clínico para el diagnóstico no invasivo y temprano del carcinoma de vejiga.
2. Métodos
2,1. Hibridación de metilación diferencial
Muestras: Se eligió como un grupo de prueba el tejido tumoral de carcinoma de vejiga de seis pacientes con un contenido de células tumorales del 70 por ciento o más; como grupo de control, ADN extraído de muestras de sedimento urinario de siete personas sanas.
DMH: Se preparó una biblioteca de genoma completo utilizando digestión no específica de metilación, seguida del ligamiento del adaptador y de una digestión de restricción sensible a metilación. La amplificación con cebadores que coinciden con los adaptadores genéricos produjo un producto de amplificación que posteriormente se hibridó a una micromatriz que incluía más de 50.000 locus genómicos. Cada muestra se procesó dos veces de forma independiente y se hibridó con dos matrices.
Análisis: Los datos se controlaron en cuanto a la calidad utilizando oligonucleótidos de control en el chip y criterios de calidad adicionales; los chips de cada muestra que pasaron los controles de calidad se promediaron y normalizaron a base de las muestras técnicas con situación de metilación conocida. Los posibles biomarcadores candidatos se seleccionaron basándose en el tamaño del efecto y la variación intragrupo entre los locus individuales
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de los dos grupos. Se proporciona una descripción detallada de la tecnología DMH en FassbenderA et al., Humana Press. Methods in Molecular Medicine. 2009, Christian Pilarsky and Robert Grützmann (Editor) ISBN: 978-1-93411576-3 y por Lewin J. et al., Int J Biochem Cell Biol. 2007;39(7-8):1539-50. Los marcadores candidatos hipermetilados en tumor y predominantemente no metilados en sedimentos urinarios sanos, así como en linfocitos de sangre periférica normales, se marcaron con puntuaciones más altas frente a locus que presentaban otros patrones de metilación diferencial.
2,2. Ensayos de PCR específicos de metilación
Evaluación técnica: Se desarrollaron 62 ensayos de MSP en tiempo real para los locus de DMH de mayor puntuación. La mayoría de los ensayos se diseñaron con dos parejas de cebadores, que permitieron seleccionar las parejas de cebadores con el mejor desempeño.
Todos los ensayos se sometieron después a un esquema de análisis que se diseñó para permitir:
- Evaluación del desempeño del ensayo utilizando muestras técnicas
Requisito mínimo: Detección de al menos 50 pg de ADN metilado absoluto y de sensibilidades relativas, es decir, 50 pg de ADN metilado en un fondo de 50 ng de ADN no metilado.
- Estimación de la metilación de fondo en controles biológicos
Requisito mínimo: Se esperaba que los niveles de metilación en muestras agrupadas de sedimento urinario sano y el ADN de linfocitos de sangre periférica difirieran en 2 puntos de cruce en comparación con muestras técnicas con ADN metilado
- Verificación de los resultados de la DMH para el locus respectivo
Requisito mínimo: Respuesta del ensayo positiva en al menos el 70 % de las muestras de tejido tumoral.
Evaluación en muestras clínicas: Para el análisis en muestras de orina clínicas, solamente se seleccionaron ensayos con suficiente desempeño técnico y niveles aceptables de metilación de fondo en los controles biológicos. De los 62 ensayos, se seleccionaron 8 ensayos para su análisis posterior. Estos ensayos se utilizaron para analizar muestras de orina completa procedentes de 20 pacientes con carcinoma de vejiga, recién diagnosticados o en recaída, y 22 muestras de control, incluidos los casos con antecedentes de carcinoma de vejiga.
Todo el ADN extraído se sometió a tratamiento con bisulfito, utilizando protocolos desarrollados en Epigenomics. Las PCR en tiempo real se analizaron en la plataforma ABI 7300 TaqMan. Se cuantificaron las cantidades totales de ADN amplificable utilizando un ensayo no específico de metilación.
3. Resultados
En la Figura 1 se muestra una visión de conjunto de la evaluación técnica de los ensayos MSP y los resultados de cinco ensayos.
Con los ensayos que pudieron verificar la diferencia de metilación encontrada inicialmente mediante DMH en el tejido tumoral, también se encontraron niveles elevados de metilación del ADN en la muestra de ensayo de orina. Las sensibilidades logradas con estos ensayos de investigación variaron del 40 % al 65 %. Sin embargo, todos los locus establecidos como objetivo permitirían diseños de ensayos perfeccionados que pueden permitir mejorar significativamente las sensibilidades y especificidades del ensayo. Además, la combinación de ensayos en paneles parece ser prometedora con respecto a los resultados obtenidos hasta el momento.
4. Conclusiones
• Se descubrieron nuevos biomarcadores con el potencial de aplicabilidad clínica en el diagnóstico de carcinoma de vejiga utilizando la tecnología DMH.
• Se encontró que los niveles de metilación del ADN fueron significativamente mayores en la mayoría de las muestras de orina de pacientes con cáncer en comparación con las muestras de individuos sin cáncer.
Tabla 1: Secuencias genómicas (las SEQ ID NO)
Secuencia génica o genómica
Secuencia genómica Región genómica preferente (RDI ± 300 pb) Región genómica más preferente (RDI) Región genómica muy preferente (Fragmento de DMH)
AC051635.7
96 7 8 9
PRDM14
97 1 2 3
DMRT2
98 4 5 6
CYP1B1
99 10 11 12
SOX1
100 13 14 15

Claims (10)

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    1. Un método de detección del carcinoma de vejiga que comprende determinar el estatus de metilación del ADN genómico de CYP1B1 de acuerdo con la SEQ NO: 12 en una muestra biológica aislada de un sujeto, en donde la hipermetilación es indicativa de la presencia de carcinoma de vejiga.
  2. 2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende poner en contacto ADN genómico aislado de una muestra biológica obtenida de dicho sujeto con al menos un reactivo, o serie de reactivos, que distingue entre dinucleótidos CpG metilados y no metilados dentro de al menos una región diana del ADN genómico, en donde la región diana comprende, o hibrida en condiciones rigurosas con una secuencia de al menos 16 nucleótidos contiguos de la sEq NO: 12 respectivamente, en donde dichos nucleótidos contiguos comprenden al menos una secuencia de dinucleótido CpG, y mediante lo cual se proporciona, al menos en parte, la detección del carcinoma de vejiga.
  3. 3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende:
    a. extraer o aislar de otra forma ADN genómico de una muestra biológica obtenida del sujeto;
    b. tratar el ADN genómico de a), o un fragmento del mismo, con uno o más reactivos para convertir bases
    citosina que no están metiladas en la posición 5 de las mismas en uracilo o en otra base que sea
    detectablemente diferente de la citosina en términos de propiedades de hibridación;
    c. poner en contacto el ADN genómico tratado, o el fragmento tratado del mismo, con una enzima de
    amplificación y al menos un cebador que comprende una secuencia contigua de al menos 9 nucleótidos que es complementaria a, o hibrida en condiciones moderadamente rigurosas o rigurosas con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ NO: 38, 39, 68 y 69, y complementarias de las mismas, en
    donde el ADN genómico tratado o el fragmento del mismo se amplifica para producir al menos un producto de
    amplificación, o no se amplifica; y
    d. determinar, basándose en una presencia o ausencia de, o en una propiedad de dicho producto de amplificación, el estado o nivel de metilación de al menos un dinucleótido CpG de una secuencia genómica de la SEQ NO: 12 o un promedio, o un valor que refleja un estado o nivel de metilación promedio de una pluralidad de dinucleótidos CpG de al menos una de dichas secuencias genómicas, mediante lo cual se proporciona, al menos en parte, al menos uno de la detección y el diagnóstico del carcinoma de vejiga.
  4. 4. El método de la reivindicación 3, en donde el tratamiento del ADN genómico o el fragmento del mismo en b) comprende el uso de un reactivo seleccionado del grupo que comprende bisulfito, hidrogenosulfito, disulfito y combinaciones de los mismos.
  5. 5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la muestra biológica obtenida del sujeto se selecciona del grupo que comprende muestras de tejido vesical, preparaciones histológicas, tejido incluido en parafina, fluidos corporales como plasma o suero sanguíneo, líneas celulares, muestras de ensayo de orina y combinaciones de los mismos.
  6. 6. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende:
    a. extraer o aislar de otra forma ADN genómico de una muestra biológica obtenida del sujeto;
    b. digerir el ADN genómico de a), o un fragmento del mismo, con una o más enzimas de restricción sensibles a metilación; poner en contacto el producto de digestión de las enzimas de restricción de ADN de b) con una enzima de amplificación y al menos dos cebadores adecuados para la amplificación de una secuencia genómica que comprende al menos un dinucleótido CpG de una secuencia genómica de la SEQ NO: 12; y
    c. determinar, basándose en una presencia o ausencia de un producto de amplificación, el estado o nivel de metilación de al menos un dinucleótido CpG de una secuencia genómica de la SEQ NO: 12, mediante lo cual se proporciona, al menos en parte, la detección de dicho trastorno.
  7. 7. Uso de un ácido nucleico para realizar el método de las reivindicaciones 1 a 6 en la detección del carcinoma de vejiga, en donde el ácido nucleico comprende al menos 16 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ NO: 38, 39, 68 y 69, y secuencias complementarias de las mismas.
  8. 8. El uso de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el ácido nucleico comprende al menos 50 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ NO: 38, 39, 68 y 69, y secuencias complementarias de las mismas.
  9. 9. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 8, en donde la secuencia de bases contiguas comprende al menos una secuencia de dinucleótido CpG, TpG o CpA.
  10. 10. Uso de un kit para realizar el método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 6, en donde el kit comprende (a) un reactivo de bisulfito; (b) un recipiente adecuado para contener dicho reactivo de bisulfito y la muestra biológica del paciente; (c) al menos un conjunto de oligonucleótidos que contiene dos oligonucleótidos cuyas secuencias son en
    cada caso idénticas, son complementarias o hibridan en condiciones rigurosas o altamente rigurosas con un segmento de 9 o más, preferentemente 18, bases de longitud, de una secuencia seleccionada de las SEQ NO: 38, 39, 68 y 69.
    5 11. Uso de un kit para realizar el método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 6, en donde el kit comprende (a) un
    reactivo de enzima de restricción sensible a metilación; (b) un recipiente adecuado para contener dicho reactivo y la muestra biológica del paciente; (c) al menos un conjunto de oligonucleótidos, uno o una pluralidad de ácidos nucleicos o ácidos peptidonucleicos que son idénticos, son complementarias o hibridan en condiciones rigurosas o altamente rigurosas con un segmento de al menos 9 bases de longitud de una secuencia genómica de la SEQ NO: 10 12; y opcionalmente (d) instrucciones para el uso e interpretación de los resultados del kit.
    Figura 1
    Sensibilidad en muestras técnicas
    Ensayo/locus
    500 pg ADNm 100 pg ADNm 50 pg ADNm 20 ng adn de ADM 1:1000 ADN-ADM
    PRDM14
    31,5 34,3 34,9 50,0 37,2
    DMRT2
    34,5 37,3 38,6 50,0 40,3
    AC051635.7
    29,4 31,9 37,7 50,0 32,5
    CYP1B1
    32,9 35,0 35,7 48,0 42,5
    SOX1
    31,1 34,1 35,2 48,7 40,7
    Metilación de fondo en muestras biológicas
    Ensayo/locus
    20 ng bis ADN de LSP 10 ng bis ASU Agrupamiento 1 10 ng bis ASU Agrupamiento 2 10 ng bis ASU Agrupamiento 3 CSM (dH20)
    PRDM14
    50,0 41,4 50,0 41,6 50,0
    DMRT2
    41,5 44,9 50,0 38,1 50,0
    AC051635.7
    42,9 50,0 50,0 50,0 50,0
    CYP1B1
    38,2 35,0 35,3 34,2 50,0
    SOX1
    45,5 43,9 50,0 35,0 50,0
    Confirmación por DMH en muestras de tejido
    Ensayo/locus
    Pac. 1 Pac. 2 Pac. 3 Pac. 4 Pac. 5
    PRDM14
    35,3 33,1 33,0 50,0 41,9
    DMRT2
    33,3 36,8 31,7 33,0 36,0
    AC051635.7
    29,0 27,6 26,4 31,4 31,7
    CYP1B1
    30,5 29,9 30,1 30,7 31,6
    SOX1
    31,2 26,4 28,7 38,1 32,9
    imagen1
    Figura 2
    PRDM14
    AC051635.7 i
    SÜX1
    DMRT2
    CYP1B1
    SEQID
    SEQ ID
    SEQID
    SEQ ID
    SEQID
    NO: 76
    NO: 84
    NO: 92
    NO: 80
    NO: 88
    cáncer = Ctrl cáncer Ctrl
    ctr cáncer
    cáncer
    cáncer
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