CN109402131B - 一种编码kansl1基因突变体的核酸及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种编码KANSL1基因突变体的核酸及其应用，属于基因工程技术领域。该突变体与野生型相比，具有c.3031C>T突变，其编码的多肽的氨基酸序列具有p.Arg1011*突变。通过检测该新突变体是否存在，可有效筛选出易患Koolen‑de Vries综合征的生物样品。本发明的检测方法快速、准确、高效。

Description

一种编码KANSL1基因突变体的核酸及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种KANSL1基因突变体及其应用。具体地，本发明涉及分离的编码KANSL1基因突变体的核酸及其编码的多肽，含KANSL1突变体核酸的重组细胞，以及筛选易患Koolen-de Vries综合征的生物样品的方法。

背景技术

Koolen-de Vries综合征是一种以发育迟缓和轻度至中度智力残疾为特征的疾病。该病患者通常被描述为性格开朗，善于交际和合作。他们通常在幼年时出现肌张力减退。约一半患有复发性癫痫。受累者通常具有独特的面部特征，包括高而宽的额头、眼睑下垂、眼裂狭窄、外眼角上斜、内眦赘皮、蒜头鼻、耳朵突出。Koolen-de Vries综合征的患病男性经常有隐睾。部分受累者可出现室间隔缺损或其他心脏异常、肾脏异常和骨骼异常。Koolen-de Vries综合征患者可能会失去生育能力，因为没有任何已知Koolen-de Vries综合征患者有生育后代。

Koolen-de Vries综合征由KANSL1基因突变或缺失后的单倍剂量不足所导致。大多数受累者有17q21.31的杂合微缺失，极少数有KANSL1基因内的杂合缺失或碱基突变。KANSL1基因的蛋白产物在出生前和整个生命中在身体的大多数器官和组织中表达。该蛋白质通过参与控制其他基因的活性，在身体许多部分的发育和功能中起重要作用。但目前KANSL1基因损失与Koolen-de Vries综合征的特定体征和症状的关系尚不清楚。由于KANSL1基因突变病例罕见，KANSL1基因的哪些位点可以导致Koolen-de Vries综合征的发生还不清楚。

因而，可用于Koolen-de Vries综合征诊断的KANSL1基因致病突变对于建立Koolen-de Vries综合征的基因检测新方法，明确基因突变位点与临床表型的相关性具有重要意义。

发明内容

为此，需要提供一种KANSL1基因突变体，并提出一种能够有效筛选易患Koolen-deVries综合征的生物样品的方法。

为实现上述目的，发明人提供的技术方案如下：

根据国际医学最新研究进展，多种遗传性疾病可导致智力障碍，因此主要表型为智力障碍时，患者的分子诊断要检测众多基因，而Sanger测序等经典分子诊断技术在检测速度、检测费用等方面无法满足临床需求。第二代测序技术可同步对智力障碍相关的众多基因或全基因组的外显子序列进行序列分析，具有快速、准确、经济的特点。第二代测序是利用设计的DNA序列探针将目标基因或全基因组中的外显子区域捕获下来，然后针对每个外显子进行深度测序。利用该技术流程用于患者疾病诊断或者寻找疾病致病基因已成研究热点。苗圃等(苗圃,彭镜,陈晨,等.不明原因智力障碍共患癫痫患者的临床及遗传学分析[J].中华实用儿科临床杂志,2017,32(8):603-606.)利用第二代测序技术对40例不明原因智力障碍伴癫痫患者进行基因检测，其遗传性确诊率为18％。Itsara等(Itsara A,VissersL E,Steinberg K M,et al.Resolving the breakpoints of the17q21.31microdeletion syndrome with next-generation sequencing.[J].AmericanJournal of Human Genetics,2012,90(4):599-613.)利用第二代测序技术发现了Koolen-de Vries综合征基因位点断裂的规律，为阐明Koolen-de Vries综合征的发病机制提供的重要的依据。由此可见，第二代测序技术正在推动Koolen-de Vries综合征等众多智力障碍疾病的诊断及其机制研究的迅速发展。

发明人针对一个智力障碍伴癫痫患者及其双亲，采用福建福君基因生物科技有限公司提供的智力障碍相关的495基因panel，通过目标区域捕获的高通量第二代测序技术，并联合Sanger测序验证的方法进行致病突变挖掘和验证，最终确定了Koolen-de Vries综合征的一个新的杂合致病突变位点——KANSL1基因的c.3031C>T突变。

发明人一方面，提出了一种分离的编码KANSL1基因突变体的核酸。所述核酸的基因序列与SEQ ID NO:1相比，具有c.3031C>T突变。该突变体与Koolen-de Vries综合征的发病密切相关，从而通过检测该突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物体是否易患Koolen-de Vries综合征。

另一方面提出了一种利用所述的编码KANSL1基因突变体的核酸来检测生物样品是否存在KANSL1基因突变体的方法。所述的方法包括适于检测与SEQ ID NO:1相比具有c.3031C>T突变的KANSL1基因突变体的引物及相关试剂。所述的方法可用于筛选易患Koolen-de Vries综合征的生物样品，具体包括以下步骤：

(1)从生物样品中提取核酸样本，所述的生物样品是指来源于人体的各类样品，包括但不限于血液、唾液、组织、毛发或口腔黏膜。所述生物样品可用于分离获得编码KANSL1基因突变体的核酸，或者是通过反转录反应获得的cDNA样本以构成所述核酸样本；

(2)利用KANSL1基因的第14号外显子特异性的引物或探针，对核酸样本进行PCR扩增，针对所得的扩增产物构建核酸测序文库并进行测序；其中，所述的特异性的引物或探针，具有如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；

(3)将测序核苷酸图谱与人参考基因组序列比对，发现KANSL1基因编码区的第3031位碱基C突变为T，该变异导致编码蛋白在第1011位氨基酸位置变为终止密码子，翻译提前终止，蛋白截短，功能丧失，即发生p.Arg1011*突变。基于此即可筛选出易患Koolen-deVries综合征的生物样品。

第三方面，提出了一种分离的KANSL1基因突变体多肽，所述多肽是由所述的编码KANSL1基因突变体的核酸编码的，与SEQ ID NO:2相比，其氨基酸序列具有p.Arg1011*突变。

进一步的，提出了一种利用分离的KANSL1基因突变体多肽筛选患Koolen-deVries综合征的生物样品的方法。通过检测生物样品中是否表达上述多肽，或者野生型KANSL1基因编码的多肽(氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)的表达量是否低于正常水平，可以作为生物体是否患Koolen-de Vries综合征的辅助判断方法。

第四方面，提出了一种重组细胞，所述的重组细胞是由编码KANSL1基因突变体的核酸构建的遗传载体转化受体细胞获得的。

进一步的，所述的重组细胞在筛选治疗Koolen-de Vries综合征的药物中的应用。利用所述的重组细胞能够有效筛选治疗Koolen-de Vries综合征的药物。

区别于现有技术，上述技术方案的有益效果如下：

(1)本发明快速、准确、高效、简便，能有效筛选出易患Koolen-de Vries综合征的生物样本；

(2)本发明可用于Koolen-de Vries综合征患者的分子诊断及其相关疾病的鉴别诊断，检测结果可以为Koolen-de Vries综合征的早期诊断、鉴别诊断、治疗方案的制定提供科学依据。

附图说明

图1为具体实施方式所述的Koolen-de Vries综合征患者的家系图谱，图中箭头指向的是先证者，实心图标表示为患者，空心图标表示为健康个体；

图2为具体实施方式所述的含突变位点的患者的正向引物测序图，图中中间长方形框出的为c.3031C>T突变碱基；

图3为具体实施方式所述的不含突变位点的正常家系成员的正向引物测序，图中中间长方形框出的为可能发生c.3031C>T突变的碱基所在位置，图中所示碱基未发生突变。

具体实施方式

KANSL1基因突变体

第一方面，本发明提出了一种分离的编码KANSL1基因突变体的核酸。与SEQ IDNO:1相比，所述的核酸具有c.3031C>T突变。本发明中所使用的表达方式“编码KANSL1基因突变体的核酸”，是指与编码KANSL1突变体的基因相对应的核酸物质，即核酸的类型不受特别限制，可以是任何包含与KANSL1突变体的编码基因相对应的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。根据实施例，所述的编码KANSL1基因突变体的核酸为DNA。

根据实施例，发明人确定了KANSL1基因的新突变体，该突变体与Koolen-de Vries综合征的发病密切相关，从而通过检测上述突变体在生物样品中是否存在，可以达到有效地预测生物体是否易患Koolen-de Vries综合征的目的。

对于本发明提及的核酸，包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本发明中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。本领域技术人员可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。

该编码KANSL1基因突变体的核酸，是发明人通过外显子组测序分析联合Sanger测序验证的方法确定的Koolen-de Vries综合征致病基因上的新致病突变。该致病突变位点为新的，在现有技术中并未被提到。

其中，野生型KANSL1基因的cDNA具有如下所示的核苷酸序列：

ATGGCTGCGATGGCGCCCGCTCTCACTGACGCAGCAGCTGAAGCACACCATATCCGGTTCAAACTGGCTCCCCCATCCTCTACCTTGTCCCCTGGCAGTGCCGAAAATAACGGCAACGCCAACATCCTTATTGCTGCCAACGGAACCAAAAGAAAAGCCATTGCTGCAGAGGATCCCAGCCTAGATTTCCGAAATAATCCTACCAAGGAAGACTTGGGAAAGCTGCAACCACTGGTGGCATCTTATCTCTGCTCTGATGTAACATCTGTTCCCTCAAAGGAGTCTTTGAAGTTGCAAGGGGTCTTCAGCAAGCAGACAGTCCTTAAATCTCATCCTCTCTTATCTCAGTCCTATGAACTCCGAGCTGAGCTGTTGGGGAGACAGCCAGTTTTGGAGTTTTCCTTAGAAAATCTTAGAACCATGAATACGAGTGGTCAGACAGCTCTGCCACAAGCACCTGTAAATGGGTTGGCTAAGAAATTGACTAAAAGTTCAACACATTCTGATCATGACAATTCCACTTCCCTCAATGGGGGAAAACGGGCTCTCACTTCATCTGCTCTTCATGGGGGTGAAATGGGAGGATCTGAATCTGGGGACTTGAAGGGGGGTATGACCAATTGCACTCTTCCACATAGAAGCCTTGATGTAGAACACACAACTTTGTATAGCAATAATAGCACTGCAAACAAATCCTCTGTCAATTCCATGGAACAGCCGGCACTTCAAGGAAGCAGTAGATTATCACCTGGTACAGACTCCAGCTCTAACTTGGGGGGTGTCAAATTGGAGGGTAAAAAGTCTCCCCTGTCTTCCATTCTTTTCAGTGCTTTAGATTCTGACACAAGGATAACAGCTTTACTGCGGCGACAGGCTGACATTGAGAGCCGTGCCCGCAGATTACAAAAGCGCTTACAGGTTGTGCAAGCCAAGCAGGTTGAGAGGCATATACAACATCAGCTGGGTGGATTTTTGGAGAAGACTTTGAGCAAACTGCCAAACTTGGAATCCTTGAGACCACGGAGCCAGTTGATGCTGACTCGAAAGGCTGAAGCTGCCTTGAGAAAAGCTGCCAGTGAGACCACCACTTCAGAGGGACTTAGCAACTTTCTGAAAAGCAATTCAATTTCAGAAGAATTGGAGAGATTTACAGCTAGTGGCATAGCCAACTTGAGGTGCAGTGAACAGGCATTTGATTCAGATGTCACTGACAGTAGTTCAGGAGGGGAGTCTGATATTGAAGAGGAAGAACTGACCAGAGCTGATCCCGAGCAGCGTCATGTACCCCTGAGACGCAGGTCAGAATGGAAATGGGCTGCAGACCGGGCAGCTATTGTCAGCCGCTGGAACTGGCTTCAGGCTCATGTTTCTGACTTGGAATATCGAATTCGTCAGCAAACAGACATTTACAAACAGATACGTGCTAATAAGGGGTTGATAGTTCTTGGGGAGGTACCTCCCCCAGAGCATACAACAGACTTATTTCTTCCACTTAGTTCTGAGGTGAAGACAGATCATGGGACTGATAAATTGATTGAGTCTGTTTCTCAGCCATTGGAAAACCATGGTGCCCCTATTATTGGTCATATTTCAGAGTCACTGTCTACCAAATCATGTGGAGCACTCAGACCTGTCAATGGAGTTATTAACACTCTTCAGCCTGTCTTGGCAGACCACATTCCAGGTGACAGCTCTGATGCTGAGGAACAATTACATAAGAAGCAACGACTGAATCTCGTCTCTTCATCATCTGATGGCACCTGTGTGGCAGCCCGGACACGTCCTGTACTGAGCTGTAAGAAGCGGAGGCTTGTTCGACCCAACAGCATCGTTCCTCTTTCCAAGAAGGTTCACCGGAACAGCACAATCCGCCCTGGCTGTGATGTGAATCCCTCCTGCGCACTGTGTGGTTCAGGCAGCATCAACACCATGCCTCCCGAAATTCACTATGAAGCCCCTCTGTTGGAACGTCTTTCCCAGTTGGACTCTTGTGTTCATCCTGTTCTAGCATTTCCAGATGATGTTCCCACAAGCCTGCATTTCCAGAGCATGCTGAAATCTCAGTGGCAGAACAAGCCTTTTGACAAAATCAAACCTCCCAAAAAGTTATCGCTTAAGCACAGAGCACCCATGCCGGGCAGTCTGCCAGATTCAGCTCGTAAGGACAGGCACAAATTGGTCAGCTCCTTCCTAACAACAGCCAAGCTGTCCCATCACCAAACCCGGCCTGACAGGACCCACAGGCAGCACTTAGACGATGTGGGGGCCGTGCCCATGGTGGAGCGAGTGACAGCGCCAAAAGCAGAGCGCTTGCTCAACCCACCACCACCCGTGCATGACCCAAACCACAGCAAAATGAGATTGCGAGACCATTCATCTGAGAGAAGTGAAGTGTTGAAGCATCACACAGACATGAGCAGTTCGAGCTACTTGGCAGCCACCCACCATCCTCCACACAGTCCCTTGGTGCGACAGCTCTCCACCTCCTCAGATTCCCCTGCACCCGCCAGCTCTAGCTCACAGGTTACAGCCAGCACATCGCAGCAGCCAGTAAGGAGGAGAAGGGGAGAGAGCTCATTTGATATTAACAACATTGTCATCCCAATGTCTGTTGCTGCAACAACTCGCGTAGAGAAACTGCAATACAAGGAAATCCTTACGCCCAGCTGGCGGGAGGTTGATCTTCAGTCTCTGAAGGGGAGTCCTGATGAGGAGAATGAAGAGATTGAGGACCTATCCGACGCAGCCTTCGCCGCCCTGCATGCCAAATGTGAGGAGATGGAGAGGGCACGGTGGCTGTGGACCACGAGTGTGCCACCCCAGCGGCGGGGCAGCAGGTCCTACAGGTCATCAGACGGCCGGACAACCCCCCAGCTGGGCAGTGCCAACCCCTCCACCCCCCAGCCTGCCTCCCCTGATGTCAGCAGTAGCCACTCTTTGTCAGAATACTCCCATGGTCAGTCCCCTAGGAGCCCCATTAGCCCGGAACTGCACTCAGCACCCCTCACCCCTGTGGCTCGGGACACTCCGCGACACTTAGCCAGTGAGGATACCCGTTGTTCCACACCAGAGCTGGGGCTGGATGAACAGTCTGTCCAGCCCTGGGAGCGGCGGACCTTCCCCCTGGCGCACAGTCCCCAGGCGGAGTGTGAGGACCAGCTGGATGCACAGGAGCGAGCAGCCCGCTGCACTCGACGCACCTCAGGCAGCAAGACTGGCCGGGAGACAGAGGCAGCGCCCACCTCGCCTCCCATTGTCCCCCTCAAGAGTCGGCATCTGGTGGCAGCAGCCACAGCTCAGCGCCCGACTCACAGATGA(SEQ ID NO:1)；

其编码的蛋白质具有如下所示的氨基酸序列：

MAAMAPALTDAAAEAHHIRFKLAPPSSTLSPGSAENNGNANILIAANGTKRKAIAAEDPSLDFRNNPTKEDLGKLQPLVASYLCSDVTSVPSKESLKLQGVFSKQTVLKSHPLLSQSYELRAELLGRQPVLEFSLENLRTMNTSGQTALPQAPVNGLAKKLTKSSTHSDHDNSTSLNGGKRALTSSALHGGEMGGSESGDLKGGMTNCTLPHRSLDVEHTTLYSNNSTANKSSVNSMEQPALQGSSRLSPGTDSSSNLGGVKLEGKKSPLSSILFSALDSDTRITALLRRQADIESRARRLQKRLQVVQAKQVERHIQHQLGGFLEKTLSKLPNLESLRPRSQLMLTRKAEAALRKAASETTTSEGLSNFLKSNSISEELERFTASGIANLRCSEQAFDSDVTDSSSGGESDIEEEELTRADPEQRHVPLRRRSEWKWAADRAAIVSRWNWLQAHVSDLEYRIRQQTDIYKQIRANKGLIVLGEVPPPEHTTDLFLPLSSEVKTDHGTDKLIESVSQPLENHGAPIIGHISESLSTKSCGALRPVNGVINTLQPVLADHIPGDSSDAEEQLHKKQRLNLVSSSSDGTCVAARTRPVLSCKKRRLVRPNSIVPLSKKVHRNSTIRPGCDVNPSCALCGSGSINTMPPEIHYEAPLLERLSQLDSCVHPVLAFPDDVPTSLHFQSMLKSQWQNKPFDKIKPPKKLSLKHRAPMPGSLPDSARKDRHKLVSSFLTTAKLSHHQTRPDRTHRQHLDDVGAVPMVERVTAPKAERLLNPPPPVHDPNHSKMRLRDHSSERSEVLKHHTDMSSSSYLAATHHPPHSPLVRQLSTSSDSPAPASSSSQVTASTSQQPVRRRRGESSFDINNIVIPMSVAATTRVEKLQYKEILTPSWREVDLQSLKGSPDEENEEIEDLSDAAFAALHAKCEEMERARWLWTTSVPPQRRGSRSYRSSDGRTTPQLGSANPSTPQPASPDVSSSHSLSEYSHGQSPRSPISPELHSAPLTPVARDTPRHLASEDTRCSTPELGLDEQSVQPWERRTFPLAHSPQAECEDQLDAQERAARCTRRTSGSKTGRETEAAPTSPPIVPLKSRHLVAAATAQRPTHR(SEQ ID NO:2)。

与野生型KANSL1基因的SEQ ID NO:1所示序列相比，发明人发现的KANSL1基因新突变体具有c.3031C>T突变，该KANSL1基因突变体的cDNA中第3031位碱基由C突变为T，由此，其所编码的产物与野生型KANSL1(SEQ ID NO:2)相比，具有p.Arg1011*突变，即该突变是由c.3031C>T突变引起编码氨基酸变为终止密码子，导致蛋白翻译提前终止。

发明人首次提出KANSL1基因的c.3031C>T杂合突变导致患者出现Koolen-deVries综合征的症状，从而通过检测该新突变体在生物样品中是否存在，可达到有效地预测生物体是否易感Koolen-de Vries综合征的目的。

第二方面，根据获得的突变基因提出了一种分离的多肽。根据实施例，与野生型KANSL1相比，所述分离的多肽具有p.Arg1011*突变。该多肽是由前述分离的编码KANSL1基因突变体的核酸编码的。通过检测生物样品中是否表达上述多肽，或者野生型KANSL1基因编码的多肽(氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)的表达量是否低于正常水平，可以作为生物体是否患Koolen-de Vries综合征的辅助判断方法。

筛选易患Koolen-de Vries综合征的生物样品的方法

第三方面，提供了筛选易患Koolen-de Vries综合征的生物样品的方法。根据实施例，该筛选易患Koolen-de Vries综合征的生物样品的方法包括以下实施步骤：

第一，从生物样品提取核酸样本。所述的生物样品的类型并不受特别限制，只要从该生物样品中能够提取到反映生物样品KANSL1基因是否存在突变的核酸样本即可。生物样品包括但不限于血液、唾液、组织、毛发或口腔黏膜。这里所使用的术语“核酸样本”应做广义理解，其可以是任何能够反映生物样品中KANSL1基因是否存在突变的样本，包括但不限于从生物样品中提取的基因组DNA、总RNA和mRNA。根据本发明的一个实施例，所述核酸样本为全基因组DNA。由此，可以扩大生物样品的来源范围，并且可以同时对生物样品的多种信息进行确定，从而能够提高筛选易患Koolen-de Vries综合征的生物样品的效率。

第二，确定所述核酸样本的核酸序列。根据实施例，确定所述核酸样本的核酸序列的方法和设备并不受特别限制，可采用但不限于核酸测序的方法确定核酸样本的核酸序列。核酸测序的方法和设备并不受特别限制，可采用第二代测序技术，也可以采用第一代、第三代等各种性能的测序技术。根据具体实施例，采用第二代测序技术确定核酸样本的核酸序列的步骤还包括：针对核酸样本，构建测序文库，利用测序设备对测序文库进行测序，达到获得包含KANSL1基因信息的测序结果。所述测序设备包括但不限于Novaseq系列、Hiseq系列、Nexeseq系列、BGIseq系列第二代核酸测序仪。构建测序文库的试剂和方法包括但不限于Nextera、TruSeq、Yeasen，具体流程可参见Illumina等厂家的说明书，本领域技术人员可以根据不同的测序平台进行适当选择。根据实施例，可以对核酸样本进行筛选，富集KANSL1外显子，该筛选富集可以在构建测序文库之前，构建测序文库过程中，或者构建测序文库之后进行。根据实施例，设计并合成特异性扩增KANSL1基因外显子区域的引物，利用所述引物扩增基因组DNA样本，利用扩增产物构建核酸测序文库。所述利用KANSL1基因外显子特异性引物进行PCR扩增的方法，可有效提高筛选易患Koolen-de Vries综合征的生物样品的效率。

根据实施例，KANSL1基因外显子特异性引物不受特别限制，针对c.3031C>T突变，发明人进行了优选设计，所述KANSL1基因外显子特异性引物具有如SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4所示的核苷酸序列：

上游引物F：TGTTGGTGTTTGTTTGCCTC(SEQ ID NO:3)

下游引物R：CAACTGTATTGATCATTTAG(SEQ ID NO:4)

需要说明的是，这里所使用的术语“核酸序列”泛指所有包含KANSL1基因编码信息的核酸序列和信息数据，包括但不限于测序直接获得的核酸序列信息、测序数据进行组装后得到的完整的核酸序列信息、测序设备产生的原始测序数据(reads)、测序数据经计算机处理后的数据信息(Bam文件等)。

第三，所述核酸序列与基因组参考序列的比对。具体地，基于核酸样本的核酸序列或其互补序列与SEQ ID NO:1相比，如具有c.3031C>T突变，则提示生物体易患Koolen-deVries综合征。核酸序列与SEQ ID NO:1进行比对的方法并不受特别限制，可以采用人工比对，也可以基于任意计算机软件。根据具体实施例，可以采用Novocraft公司的NovoAlign软件比对。

作为对本发明的衍生应用，可制备筛选易患Koolen-de Vries综合征的生物样品的试剂。包括适用于检测KANSL1基因突变体的试剂，所述KANSL1基因突变体为与SEQ IDNO:1所示序列相比，具有c.3031C>T突变。

用于筛选易患Koolen-de Vries综合征的生物样品的方法，包括：用适于检测与SEQ ID NO:1相比具有c.3031C>T突变的KANSL1基因突变体的试剂，检测KANSL1基因是否存在c.3031C>T突变，确定生物体是否易患Koolen-de Vries综合征。

需要说明的是，采用第二代测序技术，针对一个Koolen-de Vries综合征患者进行495个与智力障碍相关基因的外显子测序分析，并联合Sanger测序对患者本人及其父母进行验证，最终发现了Koolen-de Vries综合征的一个新突变位点——KANSL1基因的c.3031C>T突变。与第一代测序技术、经典的连锁分析策略相比，高通量的第二代测序技术具有通量高、速度快、检测成本低等优点，可以快速、准确的定位Koolen-de Vries综合征的致病突变位点，进而为阐明Koolen-de Vries综合征的分子发病机制，为疾病筛查、早期诊断、治疗、预后判断提供科学的依据。

作为对本发明的衍生应用，提出了一种重组细胞，所述的重组细胞是由编码KANSL1基因突变体的核酸构建的遗传载体转化受体细胞获得的。其中，所述的受体细胞的种类不受特别的限制，例如可以为大肠杆菌细胞、哺乳动物细胞，优选该受体细胞来源于哺乳动物。所述的遗传载体，其包含特定核酸序列，并且能够将目的核酸序列转入宿主细胞中，以获得重组细胞。所述的遗传载体可以为质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒、病毒的至少一种，优选质粒。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。所述的重组细胞能够表达遗传载体所携带的KANSL1基因突变体。

进一步的，利用所述的重组细胞能够有效筛选治疗Koolen-de Vries综合征的药物。

下面结合具体实施例，对本发明的技术方案进行详细说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。

若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第四版或者相关资料进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

实施例1确定Koolen-de Vries综合征致病突变

1、样本来源

来自中国福建省的一个名15岁轻度智力障碍伴有癫痫的女患者(先证者)，其父母智力正常，无癫痫病史，发明人挑选患者及其父母进行癫痫的分子诊断。先证者具有轻度智力障碍，具有特俗面容(高而宽的额头、眼睑下垂、眼裂狭窄、外眼角上斜、内眦赘皮、蒜头鼻、耳朵突出)，性格友善、善于交流，但情绪不稳定，易激惹，有发呆等注意缺陷障碍表现；有多年癫痫病史，EEG癫痫样改变。身体发育正常，心脏、肾脏、骨骼无明显异常。该患者的家系谱如图1所示，箭头指向的是先证者，实心图标表示为患者，空心图标表示为健康个体。获得所有参与者的知情同意书，并进行静脉血采集。

2、基因组DNA提取

取上述家系所有成员的外周血，分别采用HiPure Blood&Tissue DNA Kit(Magen)从外周血样品中提取基因组DNA，用Nanodrop one测量DNA的纯度，所得各基因组DNA的OD_260nm/OD_280nm均位于1.7-2.0之间，用Nanodrop one测量DNA的浓度，所得各基因组DNA的浓度为50-100ng/μL，总量为5-10μg。

3、目标外显子捕获测序

发明人利用Illumina公司的Nextera DNA Exome试剂盒结合illumina第二代测序技术，对上述Koolen-de Vries综合征患者的临床外显子组序列进行了测序。

具体如下：

1)利用Illumina公司的Nextera DNA Exome试剂盒将各基因组DNA样本随机打断成200-1000bp左右的片段，随后按照制造商提供的操作说明书，在片段两端分别连接上接头制备文库。

2)文库经纯化后,用Nanodrop检测文库，并等量混合，混合后浓度>100ng/μL，用Nextera Rapid Capture Enrichment捕获试剂，结合Illumina公司的Nextera DNA Exome试剂盒进行杂交富集，再经过扩增，文库检测合格后即可上机测序，获得原始测序数据。其中，测序平台为Illumina Hiseq X Ten，PE150，各样本的20X平均测序覆盖度≥96％。

3)变异检测、注释及数据库比较

使用Novocraft NovoAlign将NGS测序结果和人类参考基因组UCSC NCBI37/hg19进行比对，获得比对到基因组上的唯一比对序列。利用VarScan mpileup2snp和VarScanmpileup2indel检测确定靶区域的变异。利用Remove Run Common Variants和RemoveGlobal Common Variants软件去除dbSNP和ExAC数据库中的常见变异。然后利用Interactive Biosoftware Alamut Batch对变异进行注释。注释用到的数据库包括：dbSNP、ExAC、1000g、ClinVar、OMIM等。利用filterAlamut.py将注释后的变异按照High，Medium，Low排序。在High和Medium分组中，给予变异一个优先级值和分级理由。所有的变异最初都在Low组别中，当一个变异符合某些标准时，则可以被划分为更高级别的变异。并利用FATHMM、FATHMMMKL、METALR、METASVM、MUTATIONASSESSOR、MUTATIONTASTERAGVGD、AGVGD、LRT,PROVEAN、SIFT软件进行变异功能预测。

上述流程中分析的目标基因共495个，主要为智力障碍相关的基因，包括：

ABCC6,ABCD1,ABCG5,ACAT1,ACOX1,ACSL4,ACY1,ADAR,ADSL,AFF2,AGL,AGT,AGTR2,AHI1,AIFM1,ALDH18A1,ALDH4A1,ALDH5A1,ALG11,ALG12,ALG6,ALX4,AMER1,ANK3,ANKRD11,AP1S1,AP1S2,AP3B1,AP4B1,AP4E1,AP4M1,AP4S1,APOB,AR,ARG1,ARHGEF6,ARHGEF9,ARID1A,ARID1B,ARX,ASPM,ASS1,ATL1,ATM,ATP10A,ATP13A2,ATP1A2,ATP6AP2,ATP7A,ATRX,AUH,AUTS2,AVP,AVPR1A,AVPR2,BBS9,BCOR,BCS1L,BDNF,BIN1,BRAF,BRIP1,BRWD3,BUB1B,CACNA1C,CACNG2,CAMTA1,CANT1,CASK,CBS,CC2D1A,CC2D2A CCDC22,CCDC88C,CDH15,CDK16,CDKL5,CDKN1C,CEP290,CEP41,CEP57,CHD7,CHD8,CHRNA4,CLCN4,CLIC2,CLN3,CNKSR2,CNTNAP2,CNTNAP5,COG5,COG7,COL1A2,CP,CPA6,CPS1,CRADD,CRBN,CREBBP,CTC1,CTNNB1,CTSA,CUL4B,CYB5R3,CYP27A1,D2HGDH,DARS2,DBT,DCX,DHCR24,DHCR7,DKC1,DLG3,DLGAP2,DMD,DOCK4,DPP10,DPP6,DPYD,DYNC1H1,DYRK1A,EBP,EFNB1,EHMT1,EIF2S3,ELOVL4,ERCC2,ERCC3,ERCC5,ERCC6,ERCC8,F5,FAAH2,FAM126A,FANCB,FANCG,FBLN5,FBN1,FBN2,FGD1,FGF14,FGFR1,FGFR2,FGFR3,FKRP,FKTN,FLNA,FMR1,FOLR1,FOXG1,FOXP1,FOXP2,FRMPD4,FTO,FTSJ1,G6PC3,GABRB3,GABRG1,GABRG2,GALE,GAMT,GAN,GBA,GBE1,GCK,GDI 1,GFAP,GFM1,GHR,GK,GLI3,GLRA1,GLUL,GLYCTK,GM2A,GNA14,GNAS,GNPAT,GNPTAB,GNPTG,GPC3,GRIA3,GRIK2,GRIN1,GRIN2A,GRIN2B,GRM1,GRPR,GSPT2,GSS,GUSB,GYS2,HAX1,HCCS,HCFC1,HDAC4,HDAC8,HECW2,HEPACAM,HEXB,HOXA1,HOXD10,HPD,HPRT1,HSD17B10,HSPD1,HUWE1,IDS,IGBP1,IGF1,IGF1R,IL1RAPL1,IMMP2L,INSR,IQSEC2,IRX5,ITGA7,KATNAL2,KCNJ10,KCNJ11,KCNK9,KCNQ2,KCTD13,KCTD7,KDM5C,KDM6A,KIAA2022,KIF11,KIF1A,KIF21A,KIF5A,KIF7,KIRREL3,KLF8,KLHL3,KMT2D,KRAS,L1CAM,LAMA2,LAMC3,LAMP2,LARGE1,LAS1L,LBR,LHX3,LIG4,LMBRD1,LRP5,LYST,MAGT1,MAN1B1,MAN2B1,MANBA,MAOA,MAT1A,MBD5,MBTPS2,MCCC1,MCCC2,MCOLN1,MCPH1,MECP2,MED12,MED17,MED23,MEF2C,MET,MFSD8,MGAT2,MID1,MKKS,MMADHC,MOCS2,MPI,MPZ,MRAP,MTFMT,MTHFR,MTM1,MTR,MYCN,MYO5A,MYO7A,NAA10,NAGA,NBN,NDP,NDUFA1,NDUFAF5,NDUFS1,NEGR1,NF1,NGF,NGLY1,NHEJ1,NHP2,NHS,NIPBL,NLGN3,NLGN4X,NPC1,NPC2,NPHP3,NRXN1,NSD1,NSDHL,NSUN2,NTNG1,OCRL,OFD1,OGT,OPHN1,ORC1,OTC,PAFAH1B1,PAH,PAK3,PAX6,PCDH19,PCDH9,PCNT,PDE10A,PDE4D,PDHA1,PDHX,PDSS1,PEX7,PGK1,PHF6,PHF8,PHKA2,PHKG2,PIGL,PIGO,PIGV,PIP5K1B,PLA2G6,PLP1,PNKP,POMGNT1,POMT1,POMT2,PON3,PORCN,POU1F1,PPOX,PQBP1,PRICKLE1,PRKAR1A,PRPS1,PRSS12,PTCHD1,PTEN,PTPN11,PYCR1,PYGL,RAB39B,RAB40AL,RAI1,RAPSN,RBBP8,RBFOX1,RBM10,RELN,RFX6,RPGRIP1L,RPL10,RPS6KA3,SACS,SAMHD1,SATB2,SCN1A,SCN2A,SCN8A,SDCCAG8,SGCA,SGSH,SHANK2,SHANK3,SHROOM4,SIL1,SLC16A2,SLC20A2,SLC25A12,SLC25A13,SLC25A15,SLC2A1,SLC2A2,SLC35C1,SLC46A1,SLC4A4,SLC5A2,SLC5A5,SLC6A4,SLC6A8,SLC7A7,SLC9A6,SLC9A9,SLX4,SMARCA2,SMARCA4,SMARCB1,SMC1A,SMG6,SMS,SNIP1,SNRPN,SOBP,SOX10,SOX2,SOX3,SOX5,SPAST,SPATA5,SPR,SPTAN1,SPTLC1,SRD5A3,SRPX2,ST3GAL3,ST7,STAT5B,STK3,STRA6,STX11,STXBP1,SUCLG1,SYN1,SYNGAP1,SYP,SYT14,TAF1,TBC1D24,TBCE,TBX1,TCF4,TECR,TGIF1,TH,THOC2,THRB,TIMM8A,TINF2,TMCO1,TMEM165,TMEM216,TMEM67,TMEM70,TPH2,TPK1,TRAPPC9,TRHR,TSC1,TSC2,TSHR,TSPAN7,TTC37,TTR,TUBA1A,TUBA8,TUBB2B,TUBB3,TUSC3,TWIST1,UBE2A,UBE3A,UPB1,UPF3B,UROC1,USP9X,VLDLR,VPS13B,WDR13,WDR62,WDR81,WRN,XPNPEP3,ZBTB16,ZBTB24,ZC4H2,ZCCHC12,ZDHHC15,ZDHHC9,ZEB2,ZFP57,ZFYVE26,ZIC2,ZMYM3,ZNF41,ZNF507,ZNF674,ZNF711,ZNF804A,ZNF81,ZNHIT6

对测序结果分析后，发现了KANSL1基因突变体c.3031C>T(p.Arg1011*)。该变异在总人口中的等位基因频率尚未在gonmAD数据库中报道。该变异(p.Arg1011*)发生在15个外显子转录本的第14号外显子上，该变异可能导致截短的蛋白产物或激活无义介导的mRNA降解，从而丢失其生物功能。依据ACMG指南，发明人认为该变异是致病变异。由于KANSL1基因是Koolen-de Vries综合征的致病基因，因此发明人判断患者易患Koolen-de Vries综合征，且患者临床表现与Koolen-de Vries综合征相符。

实施例2Sanger法测序验证

分别对实施例1中所述的Koolen-de Vries综合征患者家系中的家系成员(包括1个患者和2个正常家系成员)的KANSL1基因进行检测：针对KANSL1基因的c.3031C>T突变设计引物，然后通过PCR扩增、产物纯化和测序的方法获得突变位点有关序列，根据确定序列测定结果属于突变型还是野生型，验证KANSL1基因的c.3031C>T突变与Koolen-de Vries综合征之间的相关性。

具体方法步骤如下：

1、DNA提取

参照实施例1中所述的提取DNA的方法。

2、引物设计及PCR反应

首先，参考人类基因组序列数据库hg19/build36.3，设计得到针对KANSL1基因的c.3031C>T突变的外显子特异性引物，具体序列如下：

上游引物F：TGTTGGTGTTTGTTTGCCTC(SEQ ID NO:3)

下游引物R：CAACTGTATTGATCATTTAG(SEQ ID NO:4)

接着，分别按照以下配比配制各基因组DNA样本的PCR反应体系以及进行PCR反应，50μL反应体系包括：10×buffer 5μL、基因组DNA 1μL、上游引物F(SEQ ID NO:3)2μL、下游引物R(SEQ ID NO:4)2μL、10mM dNTP 5μL、Taq酶1μl、ddH₂O 34μL。PCR反应条件：95℃5min，30个循环(95℃15s，53℃30s，72℃45s)，72℃5min，4℃保温。最终获得各受试者基因组DNA样本的PCR扩增产物。

3、测序

将步骤2中获得的各受试者基因组DNA样本的PCR扩增产物直接进行DNA测序。测序采用ABI3730型测序仪进行正反向测序。将测序结果与KANSL1基因序列(SEQ ID NO:1)进行比对。基于比对结果，可以排查Koolen-de Vries综合征家系成员中是否存在KANSL1基因的c.3031C>T突变位点。

比对发现，该家系中患者(先证者)携带了c.3031C>T杂合突变，见图2。该突变体编码的多肽与KANSL1基因编码的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)比较，具有p.Arg1011*变异。而表型正常的父母均未携带该突变,结果见图3。上述结果提示，KANSL1基因的c.3031C>T变异为新发变异，符合Koolen-de Vries综合征常染色体显性遗传的特点，进一步证明KANSL1基因的c.3031C>T是Koolen-de Vries综合征的新的致病位点，KANSL1基因的c.3031C>T的杂合突变能够导致该病。

实施例3KANSL1基因突变体检测试剂盒

KANSL1基因突变体的检测试剂盒，包含能够检测KANSL1基因的c.3031C>T突变的引物。这些引物为KANSL1基因的特异性引物，其序列如实施例2中SEQ ID NO：3-4所示。该试剂盒可用于筛选易患Koolen-de Vries综合征的生物样品。

利用上述试剂盒筛选易患Koolen-de Vries综合征的生物样品的具体步骤包括：提取待测者DNA，可按照实施例1的步骤2所述的方法；以所提取的DNA为模板与上述KANSL1基因的特异性引物进行PCR反应，并按照本领域常规方法对PCR产物纯化；将纯化的产物进行测序；测序所得到的序列与SEQ ID NO：1序列进行比对，判断是否具有c.3031C>T突变，即可检测出待测者DNA中是否存在KANSL1基因突变体，从而能够有效地检测待测者是否易患Koolen-de Vries综合征，进一步，能够从待测者中筛选出易患Koolen-de Vries综合征的生物样品。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“实施例”、“具体实施例”等的描述意指结合该实施例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例中，且不做特定指代。

需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。

Claims (6)

1.一种编码KANSL1基因突变体的核酸，其特征在于，与SEQ ID NO:1相比，所述核酸的基因序列具有c.3031C>T突变。

2.一种如权利要求1所述的编码KANSL1基因突变体的核酸在制备检测易患Koolen-deVries综合征的生物样品的试剂中的应用。

3.一种分离的多肽，其特征在于，所述的多肽由权利要求1所述的编码KANSL1基因突变体的核酸编码，与SEQ ID NO:2相比，所述的多肽的氨基酸序列具有p.Arg1011*突变。

4.一种如权利要求3所述的分离的多肽在制备筛选患Koolen-de Vries综合征的生物样品的检测试剂中应用。

5.一种重组细胞，其特征在于，所述的重组细胞是由权利要求1所述的编码KANSL1基因突变体的核酸构建的遗传载体转化受体细胞获得的。

6.一种如权利要求5所述的重组细胞在筛选治疗Koolen-de Vries综合征的药物中的应用。

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