CN109154026B - 用于将dlbcl分类的方法和组合物 - Google Patents
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Abstract
本文提供了使用定量RT‑PCR分类DLBCL亚型的方法和组合物。
Description
发明背景
弥漫性大B细胞性淋巴瘤(DLBCL)占所有非霍奇金淋巴瘤的30-35%。DLBCL是生物学上侵袭性的，但是可以在超过50%的病例中治愈。但是，多达1/3的患者产生抗性并且是治疗难治的。标准疗法是化学疗法CHOP或化学疗法+利妥昔单抗（Rituxamab）(R-CHOP)。DLBCL可以分类成3种不同的分子起源细胞(COO)亚型：生发中心B-细胞(GCB)，活化的B-细胞(ABC)，和原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBCL)。通过淋巴瘤/白血病分子特征概况分析项目进行的回顾分析证实，当用R-CHOP治疗时，具有GCB亚型的DLBCL患者具有比具有ABC亚型的那些患者更好的预后，并且用于改善ABC亚型预后的药物候选物处于开发中。
用于区分GCB和ABC亚型的当前方法包括免疫组织化学(IHC)和基因表达特征概况分析。IHC和基因表达特征概况分析技术是费时的，并且就亚型分类而言具有另外的缺点。例如，基因表达技术使用冷冻的样品，且不使用在临床实验室中通常收集的甲醛固定的石蜡包埋组织(FFPET)样本。Nanostring Technologies (Seattle, WA)已经开发了一种基因表达特征概况分析特征，其使用FFPET样品将DLBCL亚型分类，但是Nanostring平台在市场上没有被广泛采用，并且它是昂贵的。IHC也使用FFPET样品，但是显示出在实验室之间的高测定变异性。
发明概况
本文提供了用于确定弥漫性大B细胞性淋巴瘤(DLBCL)亚型和治疗DLBCL患者的方法和组合物。本文提供了用于确定弥漫性大B细胞性淋巴瘤(DLBCL)亚型和治疗DLBCL患者的方法和组合物。在某些实施方案中，提供了鉴别具有DLBCL的个体的方法，所述方法包括:(a)从个体得到样品(DLBCL样品)；(b)通过qRT-PCR检测所述DLBCL样品中的GCB标志物ZNF318、PDK3、HMGN1、PTK2、SSBP2、BCL6和/或LRMP的表达；(c)通过qRT-PCR检测所述DLBCL样品和对照样品中的ABC标志物ARID3A、CCND2、FOXP1、KIAA0226L、JADE3、PIM2、TCF4和/或FAM46C的表达；和(d)通过qRT-PCR检测所述DLBCL样品中的对照基因(例如，内部对照)的表达；其中在所述个体的样品中GCB标志物表达与ABC标志物表达的比率高于GCB阈值指示所述个体对R-CHOP (利妥昔单抗或依托泊苷；环磷酰胺；多柔比星；长春新碱；和泼尼松龙)的施用的敏感性。一些实施方案，如果ABC标志物表达与GCB标志物表达的比率高于个体的样品中的ABC阈值，指示所述个体对替代施用的敏感性。在某些实施方案中，所述方法还包括，基于在(d)中检测到的对照基因的表达而调节关于步骤(b)和(c)中的基因检测到的表达水平。在某些实施方案中，将所述施用直接提供给患者。
在某些实施方案中，提供了为具有DLBCL的个体提供治疗的方法，所述方法包括：(a)从个体得到样品(DLBCL样品)；(b)通过qRT-PCR检测所述DLBCL样品中的GCB标志物ZNF318、PDK3、HMGN1、PTK2、SSBP2、BCL6和/或LRMP的表达；(c)通过qRT-PCR检测所述DLBCL样品和对照样品中的ABC标志物ARID3A、CCND2、FOXP1、KIAA0226L、JADE3、PIM2、TCF4和/或FAM46C的表达；(d)通过qRT-PCR检测所述DLBCL样品中的对照基因(例如，内部对照)的表达；和(e)为所述个体提供治疗。在某些实施方案中，如果GCB标志物表达与ABC标志物表达的比率高于GCB阈值，所述治疗包含R-CHOP (利妥昔单抗或依托泊苷；环磷酰胺；多柔比星；长春新碱；和泼尼松龙)的施用。在某些实施方案中，如果ABC标志物表达与GCB标志物表达的比率高于ABC阈值，所述治疗包含替代疗法。在某些实施方案中，所述方法还包括基于在(d)中检测到的对照基因的表达而调节关于步骤(b)和(c)中的基因检测到的表达水平。在某些实施方案中，将所述治疗直接提供给所述患者。
在某些实施方案中，以任意组合在步骤(b)中检测1、2、3、4、5或6种GCB标志物。在某些实施方案中，在步骤(b)中检测所有7种GCB标志物。在某些实施方案中，以任意组合在步骤(c)中检测1、2、3、4、5、6或7种ABC标志物。在某些实施方案中，在步骤(c)中检测所有8种ABC标志物。在某些实施方案中，步骤(b)包括检测ZNF318、SSBP2和PTK2的表达。在某些实施方案中，步骤(c)包括检测CCND2、FOXP1和JADE3的表达。
在某些实施方案中，所述方法还包括在GCB阳性对照上进行步骤(b)-(d)，并将结果用于设定GCB阈值。在某些实施方案中，所述GCB阳性对照包含51-100%的已知GCB样品，例如，55-85%、55-65%、60-70%的已知GCB样品。在某些实施方案中，剩余的GCB阳性对照包含已知的ABC样品。在某些实施方案中，所述方法还包括在ABC阳性对照上进行步骤(b)-(d)，并将结果用于设定ABC阈值。在某些实施方案中，所述ABC阳性对照包含51-100%的已知ABC样品，例如，55-85%、55-65%、60-70%的已知ABC样品。在某些实施方案中，剩余的ABC阳性对照包含已知的GCB样品。在某些实施方案中，所述方法还包括在阴性对照样品上进行步骤(b)-(d)，例如，缺乏核酸的样品、非癌样品或基本上缺少列举的ABC和GCB标志物核酸的样品。
在某些实施方案中，所述样品来自肺活组织检查(例如，肿瘤组织)或支气管肺泡灌洗。在某些实施方案中，所述样品是福尔马林固定的石蜡包埋组织(FFPET)，例如，来自在肺中或已经转移的肿瘤样品。在某些实施方案中，所述样品是血液、血浆、血清、尿、粘液、粘膜组织或唾液。
在某些实施方案中，在多个容器中以多路进行(b)和(c)的检测。例如，可以在1-6个容器中进行(b)的检测，其中使用每种GCB标志物探针的不同标记或使用在两种或更多种GCB标志物探针上的相同标记检测每种GCB标志物。类似地，可以在1-7个容器中进行(c)的检测，其中使用每种ABC标志物探针的不同标记或使用在两种或更多种ABC标志物探针上的相同标记检测每种ABC标志物。在某些实施方案中，单独地检测每种GCB和ABC标志物。在某些实施方案中，为每个样品在单个容器中进行(b)的检测。在某些实施方案中，为每个样品在单个容器中进行(c)的检测。在某些实施方案中，在与(b)和(c)的检测相同的容器中进行(d)的检测。
在某些实施方案中，所述替代施用或疗法包括BTK抑制剂、SYK抑制剂、NFkB抑制剂或免疫调节剂。在某些实施方案中，所述替代施用或疗法包含单独的或与BTK抑制剂、SYK抑制剂、NFkB抑制剂或免疫调节剂组合的R-CHOP。
进一步提供了用于确定具有DLBCL的个体的起源细胞(COO)亚型的方法，所述方法包括：(a)从个体得到样品(DLBCL样品)；(b)通过qRT-PCR检测所述DLBCL样品中的GCB标志物ZNF318、PDK3、HMGN1、PTK2、SSBP2、BCL6和/或LRMP的表达；(c)通过qRT-PCR检测所述DLBCL样品中的ABC标志物ARID3A、CCND2、FOXP1、KIAA0226L、JADE3、PIM2、TCF4和/或FAM46C的表达；(d)通过qRT-PCR检测所述DLBCL样品中的对照基因的表达；和(e) (i)如果GCB标志物表达与ABC标志物表达的比率高于GCB阈值，确定所述个体的COO亚型是生发中心B细胞(GCB)，或(ii)如果ABC标志物表达与GCB标志物表达的比率高于ABC阈值，确定所述个体的COO亚型是活化的B细胞(ABC)。在某些实施方案中，所述方法还包括基于在(d)中检测到的对照基因的表达而调节关于步骤(b)和(c)中的基因检测到的表达水平。
在某些实施方案中，以任意组合在步骤(b)中检测1、2、3、4、5或6种GCB标志物。在某些实施方案中，在步骤(b)中检测所有7种GCB标志物。在某些实施方案中，以任意组合在步骤(c)中检测1、2、3、4、5、6或7种ABC标志物。在某些实施方案中，在步骤(c)中检测所有8种ABC标志物。在某些实施方案中，步骤(b)包括检测ZNF318、SSBP2和PTK2的表达。在某些实施方案中，步骤(c)包括检测CCND2、FOXP1和JADE3的表达。
在某些实施方案中，所述方法还包括在GCB阳性对照上进行步骤(b)-(d)，并将结果用于设定GCB阈值。在某些实施方案中，所述GCB阳性对照包含51-100%的已知GCB样品，例如，55-85%、55-65%、60-70%的已知GCB样品。在某些实施方案中，剩余的GCB阳性对照包含已知的ABC样品。在某些实施方案中，所述方法还包括在ABC阳性对照上进行步骤(b)-(d)，并将结果用于设定ABC阈值。在某些实施方案中，所述ABC阳性对照包含51-100%的已知ABC样品，例如，55-85%、55-65%、60-70%的已知ABC样品。在某些实施方案中，剩余的ABC阳性对照包含已知的GCB样品。在某些实施方案中，所述方法还包括在阴性对照样品上进行步骤(b)-(d)。
在某些实施方案中，所述样品来自肺活组织检查(例如，肿瘤组织)或支气管肺泡灌洗。在某些实施方案中，所述样品是福尔马林固定的石蜡包埋组织(FFPET)，例如，来自在肺中或已经转移的肿瘤样品。在某些实施方案中，所述样品是血液、血浆、血清、尿、粘液、粘膜组织或唾液。
在某些实施方案中，在多个容器中以多路进行(b)和(c)的检测。例如，可以在1-6个容器中进行(b)的检测，其中使用每种GCB标志物探针的不同标记或使用在两种或更多种GCB标志物探针上的相同标记检测每种GCB标志物。类似地，可以在1-7个容器中进行(c)的检测，其中使用每种ABC标志物探针的不同标记或使用在两种或更多种ABC标志物探针上的相同标记检测每种ABC标志物。在某些实施方案中，单独地检测每种GCB和ABC标志物。在某些实施方案中，为每个样品在单个容器中进行(b)的检测。在某些实施方案中，为每个样品在单个容器中进行(c)的检测。在某些实施方案中，在与(b)和(c)的检测相同的容器中进行(d)的检测。
在某些实施方案中，所述方法还包括根据COO亚型为所述个体提供治疗。
进一步提供了用于确定具有DLBCL的个体的COO亚型的试剂盒。在某些实施方案中，所述试剂盒包含(a)包含引物集合和荧光地标记的探针的混合物，其特异性地扩增和检测GCB标志物ZNF318、PDK3、HMGN1、PTK2、SSBP2、BCL6和LRMP基因产物中的至少一种(例如，2、3、4、5、6或所有7种)；和(b)包含引物集合和荧光地标记的探针的混合物，其特异性地扩增和检测ABC标志物ARID3A、CCND2、FOXP1、KIAA0226L、JADE3、PIM2、TCF4和FAM46C基因产物中的至少一种(例如，2、3、4、5、6、7或所有8种)。在某些实施方案中，所述试剂盒包括引物集合和探针以特异性地扩增和检测所有7种GCB标志物和所有8种ABC标志物。在某些实施方案中，混合物(a)包含引物集合和荧光地标记的探针，其特异性地扩增和检测ZNF318、SSBP2和PTK2。在某些实施方案中，混合物(b)包含引物集合和荧光地标记的探针，其特异性地扩增和检测CCND2、FOXP1和JADE3。在某些实施方案中，(a)和(b)的混合物各自进一步包含引物集合和荧光地标记的探针，其特异性地扩增和检测对照基因产物，其中所述特异性地检测对照基因产物的荧光地标记的探针与混合物(a)和混合物(b)中的荧光地标记的探针不同地标记。在某些实施方案中，混合物(a)中荧光地标记的探针都用相同荧光标记进行标记。在某些实施方案中，混合物(b)中的荧光地标记的探针都用相同荧光标记进行标记。
在某些实施方案中，所述试剂盒包含多种混合物，所述混合物包含引物集合和荧光地标记的探针，其特异性地扩增且单独地检测(i) GCB标志物ZNF318、PDK3、HMGN1、PTK2、SSBP2、BCL6和LRMP基因产物中的每一种；(ii) ABC标志物ARID3A、CCND2、FOXP1、KIAA0226L、JADE3、PIM2、TCF4和FAM46C基因产物中的每一种；和(iii)对照基因产物，其中特异性地扩增和单独地检测对照基因产物的所述引物集合和荧光地标记的探针存在于所述多种混合物中的每一种中。在某些实施方案中，所述试剂盒包含3-15种混合物，例如，5种混合物。在某些实施方案中，所述试剂盒包含多种混合物，所述混合物包含引物集合和荧光地标记的探针，其特异性地扩增且单独地检测(i) ZNF318、PDK2和SSBP2中的每一种；(ii)CCND2、FOXP1和JADE3中的每一种；和(iii)对照基因产物，其中特异性地扩增和单独地检测对照基因产物的所述引物集合和荧光地标记的探针存在于所述多种混合物中的每一种中。
在某些实施方案中，所述试剂盒进一步包含逆转录酶和/或热稳定的DNA聚合酶。在某些实施方案中，所述试剂盒进一步包含具有逆转录酶和DNA聚合酶活性的酶。在某些实施方案中，所述试剂盒进一步包含至少一个对照样品，例如，如本文中所述的ABC阳性对照和/或GCB阳性对照。在某些实施方案中，所述试剂盒还包括阴性对照(例如，非癌样品)。
在某些实施方案中，特异性地扩增ZNF318的引物集合是具有选自SEQ ID NO:193-208的序列的正向和反向引物，且单独地检测ZNF318的探针的序列选自SEQ ID NO:302-304。在某些实施方案中，单独地检测ZNF318的探针的序列是SEQ ID NO:304。在某些实施方案中，特异性地扩增PDK3的引物集合是具有选自SEQ ID NO:177-192的序列的正向和反向引物，且单独地检测PDK3的探针的序列选自SEQ ID NO:299-301。在某些实施方案中，单独地检测PDK3的探针的序列是SEQ ID NO:300。在某些实施方案中，特异性地扩增HMGN1的引物集合是具有选自SEQ ID NO:209-220的序列的正向和反向引物，且单独地检测HMGN1的探针的序列选自SEQ ID NO:305-307。在某些实施方案中，单独地检测HMGN1的探针的序列是SEQ ID NO:305。在某些实施方案中，特异性地扩增PTK2的引物集合是具有选自SEQ ID NO:1-24的序列的正向和反向引物，且单独地检测PTK2的探针的序列选自SEQ ID NO:253-258。在某些实施方案中，单独地检测PTK2的探针的序列是SEQ ID NO:253。在某些实施方案中，特异性地扩增SSBP2的引物集合是具有选自SEQ ID NO:161-176的序列的正向和反向引物，且单独地检测SSBP2的探针的序列选自SEQ ID NO:297和298。在某些实施方案中，特异性地检测SSBP2的探针的序列是SEQ ID NO:297。在某些实施方案中，特异性地扩增BCL6的引物集合是具有选自SEQ ID NO:49-64的序列的正向和反向引物，且单独地检测BCL6的探针的序列选自SEQ ID NO:266-268。在某些实施方案中，单独地检测BCL6的探针是SEQ ID NO:266。在某些实施方案中，特异性地扩增LRMP的引物集合是具有选自SEQ ID NO:25-48的序列的正向和反向引物，且单独地检测LRMP的探针的序列选自SEQ ID NO:259-265。在某些实施方案中，单独地检测LRMP的探针的序列是SEQ ID NO:262。在某些实施方案中，特异性地扩增ARIDA3A的引物集合是具有选自SEQ ID NO:81-96的序列的正向和反向引物，且单独地检测ARIDA3A的探针的序列选自SEQ ID NO:276-280。在某些实施方案中，单独地检测ARIDA3A的探针的序列是SEQ ID NO:279。在某些实施方案中，特异性地扩增CCND2的引物集合是具有选自SEQ ID NO:97-112的序列的正向和反向引物，且单独地检测CCND2的探针的序列选自SEQ ID NO:281-283。在某些实施方案中，单独地检测CCND2的探针的序列是SEQID NO:281。在某些实施方案中，特异性地扩增FOXP1的引物集合是具有选自SEQ ID NO:221-236的序列的正向和反向引物，且单独地检测FOXP1的探针的序列选自SEQ ID NO:308和309。在某些实施方案中，单独地检测FOXP1的探针的序列是SEQ ID NO:309。在某些实施方案中，特异性地扩增KIAA0226L的引物集合是具有选自SEQ ID NO:237-252的序列的正向和反向引物，且单独地检测KIAA0226L的探针的序列选自SEQ ID NO:310-314。在某些实施方案中，单独地检测KIAA0226L的探针的序列是SEQ ID NO:313。在某些实施方案中，特异性地扩增JADE3的引物集合是具有选自SEQ ID NO:145-160的序列的正向和反向引物，且单独地检测JADE3的探针的序列选自SEQ ID NO:290-296。在某些实施方案中，单独地检测JADE3的探针的序列是SEQ ID NO:292。在某些实施方案中，特异性地扩增PIM2的引物集合是具有选自SEQ ID NO:65-80的序列的正向和反向引物，且单独地检测PIM2的探针的序列选自SEQID NO:269-275。在某些实施方案中，单独地检测PIM2的探针的序列是SEQ ID NO:275。在某些实施方案中，特异性地扩增TCF4的引物集合是具有选自SEQ ID NO:129-144的序列的正向和反向引物，且单独地检测TCF4的探针的序列选自SEQ ID NO:287-289。在某些实施方案中，单独地检测TCF4的探针的序列是SEQ ID NO:287。在某些实施方案中，特异性地扩增FAM46C的引物集合是具有选自SEQ ID NO:113-128的序列的正向和反向引物，且单独地检测FAM46C的探针的序列选自SEQ ID NO:284-286。在某些实施方案中，单独地检测FAM46C的探针的序列是SEQ ID NO:284。
发明详述
I. 引言
本文提供了新颖的多路实时定量反转录(qRT)-PCR分类器以确定弥漫性大B细胞性淋巴瘤(DLBCL)的起源细胞(COO)亚型。所述分类器使用qRT-PCR多路反应来定量16种基因靶标(15种可确定的和1种对照)和分配DLBCL的COO亚型。在某些实施方案中，所述测定是五试管qRT-PCR。在本文中显示了qRT-PCR分类器在来自DLBCL的福尔马林固定的石蜡包埋组织(FFPET)中的可行性和准确度。
本文描述的测定依赖于经证实的广泛采用的技术，并提供准确的、可再现的和快速的结果。
II. 定义
术语“多路”表示在其中检测超过一种靶标的测定。
术语“贮器”、“容器”、“试管”、“孔”、“室”、“微室”等表示可以容纳试剂或测定的容器。如果贮器是在试剂盒中且容纳试剂或被用于扩增反应，可以将它封闭或密封以避免污染或蒸发。如果贮器被用于测定，它可以是开放的或可接近的，至少在所述测定的装配中。
关于标记基因或标记基因产物的术语“单独地检测”或“单独检测”指示，检测多路反应中的每种标志物。也就是说，每种标志物与不同标记(用不同地标记的探针检测)结合。
除非另外标记，否则术语“COO分类器”、“亚型分类器”、“COO亚型特征”、“亚型确定特征”等术语用于表示可以用于分类DLBCL患者的起源细胞亚型的15-基因特征。术语“6-基因COO分类器”、“6-基因亚型分类器”、“6-基因COO亚型特征”、“6-基因亚型确定特征”等术语表示包括CCND2、FOXP1、JADE3、ZNF318、SSBP2和PTK2的分类器。
术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”表示核苷酸(例如，核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合物，且包括天然存在的(腺苷、胍、胞嘧啶、尿嘧啶和胸苷)、非天然存在的和经修饰的核酸。该术语不受聚合物的长度(例如，单体的数目)限制。核酸可以是单链的或双链的，且通常含有5’-3’磷酸二酯键，尽管在某些情况下，核苷酸类似物可能具有其它键。单体通常被称作核苷酸。术语“非天然的核苷酸”或“修饰的核苷酸”表示这样的核苷酸：其含有修饰的含氮碱基、糖或磷酸酯基团，或其在它的结构中掺入非天然的部分。非天然的核苷酸的例子包括二脱氧核苷酸、生物素化的、胺化的、脱氨的、烷基化的、苄基化的和荧光体-标记的核苷酸。
术语“引物”表示在合适的条件下充当通过核酸聚合酶实现的多核苷酸链合成起始点的短核酸（寡核苷酸）。多核苷酸合成和扩增反应通常包括适当的缓冲液、dNTP和/或rNTP和一种或多种任选的辅因子，并且在合适的温度进行。引物通常包括至少一个靶标杂交的区域，其与靶序列至少基本上互补(例如，具有0、1、2或3个错配)。该区域通常具有约8至约40个核苷酸的长度，例如，12-25个核苷酸。“引物集合”表示这样的正向和反向引物：其相对于靶序列以相反方向朝向，且其在扩增条件下产生扩增产物。引物集合还可以包括另外的正向或反向引物，例如，以实现等位基因特异性的扩增。
本文中使用的“探针”是指能够选择性地结合特别预期的靶生物分子（例如，与探针杂交的目标核酸序列）的任何分子。所述探针用至少一个非核苷酸部分可检测地标记。在某些实施方案中，所述探针用荧光团和猝灭剂标记。
词语“互补的”或“互补性”表示多核苷酸中的核酸与第二种多核苷酸中的另一个核酸形成碱基对的能力。例如，序列A-G-T（对于RNA，A-G-U）与序列T-C-A（对于RNA，U-C-A）互补。互补性可以是部分的，其中仅一些核酸根据碱基配对匹配，或可以是完全的，其中所有核酸都根据碱基配对匹配。如果探针或引物与靶序列至少部分地互补，那么所述探针或引物被视为对靶序列“特异性的”。取决于条件，与靶序列的互补性程度通常对于较短核酸如引物而言高于（例如，大于80%、90%、95%或更高）较长序列。
术语“特异性地扩增”指示，引物集合以统计上显著的水平扩增除了非靶序列以外的靶序列。术语“特异性地检测”指示，探针将以统计上显著的水平检测除了非靶序列以外的靶序列。如本领域中将理解的，使用阴性对照（例如，这样的样品，其包括与测试样品相同的核酸，但是不包括靶序列或缺乏核酸的样品），可以确定特异性扩增和检测。例如，特异性地扩增和检测靶序列的引物和探针产生可容易地与背景(非靶序列)辨别的Ct，例如，比背景小至少2、3、4、5、5-10、10-20或10-30个循环的Ct。
在两种或更多种核酸、或两种或更多种多肽的背景下，术语“等同的”或“同一性百分比”表示两个或更多个序列或子序列是相同的，或具有指定百分比的相同的核苷酸或氨基酸（例如，当在对比窗或指定区域上关于最大对应性进行对比和比对时，在指定区域上的约60%同一性，例如，至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性中的任一种），如使用BLAST或BLAST 2.0序列对比算法（用默认参数）测量的，或通过手工比对和目检测量的。参见例如，在ncbi.nlm.nih.gov/BLAST处的NCBI网站。这样的序列然后被说成是“基本上等同的”。通常在最佳比对的序列上确定同一性百分比，使得所述定义适用于具有缺失和/或添加的序列以及具有置换的序列。在本领域中通常使用的算法会处理缺口等。通常，同一性存在于包含至少约8-25个氨基酸或核苷酸长度的序列的区域上，或者50-100个氨基酸或核苷酸长度的区域上，或者参照序列的整个长度上。
术语“试剂盒”表示包括至少一种试剂（诸如核酸探针或探针库等）的任何制造品（例如，包装或容器），所述试剂如本文中所述用于特异性地扩增、捕获、标记/转换或检测RNA或DNA。
术语“扩增条件”表示核酸扩增反应(例如，PCR扩增)中的条件，其允许引物的杂交和模板依赖性延伸。术语“扩增子”或“扩增产物”表示这样的核酸分子：其含有靶核酸序列的全部或片段，并且其通过任意合适的扩增方法形成为体外扩增产物。技术人员会理解，正向和反向引物(引物对)限定扩增产物的边界。当应用于引物时，术语“产生扩增产物”指示，所述引物在适当的条件下(例如，在有核苷酸聚合酶和NTP存在下)将产生限定的扩增产物。各种PCR条件描述在PCR Strategies (Innis等人, 1995, Academic Press, San Diego,CA)第14章; PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications (Innis等人,Academic Press, NY, 1990)中。
术语“扩增产物”表示扩增反应的产物。所述扩增产物包括用于开始每轮多核苷酸合成的引物。“扩增子”是为扩增靶向的序列，且该术语也可以用于表示扩增产物。扩增子的5’和3’边界由正向引物和反向引物限定。
术语“样品”或“生物样品”表示含有或假定含有核酸的任何组合物。该术语包括纯化的或分离的细胞、组织或血液的组分，例如，DNA、RNA、蛋白、无细胞部分或细胞裂解物。在本文公开的测定的背景下，所述样品通常是FFPET，例如，来自肿瘤或转移性病灶。所述样品还可以来自冷冻的或新鲜的组织，或来自液体样品，例如，血液或血液组分(血浆或血清)、尿、精液、唾液、痰、粘液、精液、泪液、淋巴液、脑脊液、口腔/喉冲洗液、支气管肺泡灌洗液、从拭子洗下的物质等。样品也可以包括从个体得到的细胞的体外培养物（包括细胞系）的成分和组分。还可以从直接得自个体的样品（例如，细胞裂解物或除去了红血细胞的血液）部分地处理样品。
术语“从个体得到样品”是指，将来自个体的生物样品提供用于测试。得到可以直接来自个体，或来自从个体直接得到样品的第三方。
“对照”样品或值表示这样的值：其充当参照，通常是已知的参照，用于与测试样品或测试条件对比。例如，测试样品可以取自测试条件，例如，疑似具有癌症的个体，并且与来自已知条件（例如，来自无癌个体（阴性对照）或来自已知具有癌症的个体（阳性对照））的样品进行对比。在本公开内容的上下文中，测试样品通常来自DLBCL患者。对照还可以代表从许多测试或结果收集的平均值或范围。还可以为反应条件制备对照。例如，关于核酸的存在、特性和/或量的对照（例如，内部对照）可以包括将检测已知存在于样品中的序列(例如，持家基因诸如β肌动蛋白、β珠蛋白、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、核糖体蛋白L37和L38、PPIase、EIF3、真核翻译延伸因子2 (eEF2)、DHFR或琥珀酸脱氢酶)的引物或探针。还可以加入一种已知的添加的多核苷酸，例如，具有指定的长度。阴性对照的一个例子是不含核酸的对照，或包括对不存在于样品中的序列（例如，来自不同物种）特异性的引物或探针的对照。技术人员会理解，对照的选择将取决于特定测定，例如，使得所述对照是细胞类型和生物适当的。本领域技术人员会认识到，可以设计对照用于评估任意数目的参数。例如，可以设计对照以基于药理学数据（例如，半衰期）或治疗性措施（例如，益处和/或副作用的对比）来对比治疗益处。可以设计对照用于体外应用。本领域技术人员会理解哪些对照在给定的情形下是有价值的，且能够基于与对照值的对比来分析数据。对照对于确定数据的显著性也是有价值的。例如，如果给定参数的值在对照中宽泛地变化，测试样品中的变化不会被视作显著的。
术语“标记”、“标签”、“可检测的部分”等术语表示通过光谱、光化学、生化、免疫化学、化学或其它物理方式可检测的组合物。例如，有用的标记包括荧光染料(荧光团)、发光试剂、放射性同位素(例如，32P、3H)、电子致密试剂或基于亲和力的部分，例如，聚腺苷酸(与聚胸苷酸相互作用)或聚胸苷酸标签(与聚腺苷酸相互作用)，His标签(与Ni相互作用)，或抗生蛋白链菌素标签(可用生物素分离)。
术语“鉴别个体”是指，基于从个体(例如，患者)衍生出的样品，确定各个个体是否实际上对施用或治疗敏感。
术语“为个体提供治疗”是指，将所述治疗实际上施用给个体(例如，住院患者注射)，或使它可被个体得到，使得所述个体或第三方实际上施用所述治疗。
除非另外定义，否则在本文中使用的技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解相同的含义。参见，例如，Lackie, DICTIONARY OF CELL AND MOLECULARBIOLOGY, Elsevier (第4版2007); Sambrook等人, MOLECULAR CLONING, A LABORATORYMANUAL, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, N.Y. 1989)。术语“一个”或“一种”意图指“一个/种或多个/种”。当在步骤或要素的列举前面时，术语“包含”、“包括”和“含有”意图指其它步骤或要素的添加是任选的且不被排除。
III.核酸样品
用于核酸扩增的样品可以得自疑似含有核酸的任何来源。样品可以取自福尔马林固定的石蜡包埋组织(FFPET)、组织活组织检查、支气管肺泡灌洗或培养的细胞(例如，得自患者，或代表对照)。在本公开内容的上下文中，所述样品通常取自肺组织或包括肺细胞（例如，肺癌细胞）的细胞群体。在某些实施方案中，所述样品以非侵袭性方式得到，例如，来自尿、皮肤、拭子、唾液、血液或血液级分。
在包括细胞的样品中，可以将细胞分离出(例如，使用基于大小的过滤或离心)，由此剩下无细胞的核酸(cfNA)，包括在外核体、微囊泡、病毒颗粒中的核酸，或自由循环的那些核酸。可替换地，在有磁性玻璃颗粒(MGP)存在下或在将细胞裂解物加给MGP之前，可以裂解细胞以得到细胞核酸。
用于从生物样品分离核酸的方法是已知的，例如，如在Sambrook中所述，且几种试剂盒是商购可得的(例如，高纯RNA分离试剂盒、高纯病毒核酸试剂盒和MagNA纯LC总核酸分离试剂盒、用于细胞和组织的DNA分离试剂盒、用于哺乳动物血液的DNA分离试剂盒、高纯FFPET DNA分离试剂盒，可得自Roche)。在本文公开的方法的上下文中，收集RNA，尽管在某些实施方案中，可以将所述分类器用在以前制备的cDNA上。
IV. 弥漫性大B细胞性淋巴瘤(DLBCL)和疗法
弥漫性大B细胞性淋巴瘤(DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤的最常见亚型。大约40%的患者具有难治的疾病或在最初应答以后将复发的疾病，并且大多数具有复发性DLBCL的患者将死于所述疾病。DLBCL存在两种主要的生物学上不同的分子亚型: 生发中心B-细胞(GCB)和活化的B-细胞(ABC)。ABC DLBCL与当用标准化学疗法治疗时实质上恶化的结果有关。
GCB患者通常受益于标准化学疗法。这可以包括CHOP (环磷酰胺；多柔比星；长春新碱；和泼尼松龙)或R-CHOP，后者还包括利妥昔单抗和/或依托泊苷。可以定期施用混合液设定的时间段，或直到检测到肿瘤大小和/或征状的减小。例如，可以每2或3周施用CHOP或R-CHOP。治疗或施用通常开始于低剂量，使得可以确定副作用，且增加剂量直到副作用出现或在患者的耐受性内。
用于ABC患者的许多另外试剂(替代疗法)处于开发中。这些可以与CHOP或R-CHOP组合地同时或以单独剂量施用。这些替代疗法可以包括BTK抑制剂(例如，依鲁替尼)、SYK抑制剂(例如，福他替尼)、NFkB抑制剂(例如，硼替佐米)或免疫调节剂(例如，沙利度胺的结构和功能类似物，例如，来那度胺)。
用于DLBCL GCB和ABC亚型的另外适当疗法描述在Dunleavy等人(2014年4月15日)Oncology and Nowakowki & Czuczman (2015) Am. Soc. Clin. Oncol. Educ. Book e449。
V. 扩增和检测
核酸样品可以用于检测和定量，例如，使用核酸扩增，例如，使用任何引物依赖性的方法。在某些实施方案中，进行初步的反转录步骤(也被称作RT-PCR，不与实时PCR混淆)。参见，例如，Hierro等人(2006) 72:7148。本文中使用的术语“qRT-PCR”表示反转录和随后的定量PCR。可以在单个试管中没有间断（例如，以加入试剂）地进行两个反应。例如，可以使用聚胸苷酸引物逆转录样品中所有具有聚腺苷酸尾巴的mRNA，可以使用随机寡核苷酸，或可以设计对将逆转录成cDNA的特定靶转录物特异性的引物。所述cDNA可以形成要用于定量扩增(实时或定量PCR，即，RTPCR或qPCR)的最初模板链。qPCR允许可靠地检测和测量在PCR过程的每个循环中产生的产物。这样的技术是本领域众所周知的，且试剂盒和试剂是商购可得的，例如，来自Roche Molecular Systems, Life Technologies, Bio-Rad, 等。参见，例如，Pfaffl (2010) Methods: The ongoing evolution of qPCR第50卷。
可以使用单独的逆转录酶和热稳定的DNA聚合酶，例如，在两步(反转录，随后加入DNA聚合酶和扩增)或组合反应(一次性加入两种酶)中。在某些实施方案中，用具有逆转录酶活性和DNA模板依赖性活性的热稳定聚合酶扩增所述靶核酸。示例性的酶包括Tth DNA聚合酶、C. therm聚合酶系统和在US20140170730和US20140051126中公开的那些。
用于如本文中所述的用途的探针可以用荧光团和猝灭剂(例如，TaqMan、LightCycler、Molecular Beacon、Scorpion或双标记的探针)标记。适当的荧光团包括FAM、JOE、TET、Cal Fluor Gold 540、HEX、VIC、Cal Fluor Orang 560、TAMRA、Cyanine 3、Quasar570、Cal Fluor Red 590、Rox、德克萨斯红、Cyanine 5、Quasar 670和Cyanine 5.5。适当的猝灭剂包括TAMRA (用于FAM、JOE和TET)、DABCYL和BHQ1-3。
检测装置是本领域已知的，且可以选择为对于选定的标记适当的。适合于定量PCR的检测装置包括cobas®和Light Cycler®系统(Roche)、PRISM 7000和7300实时PCR系统(Applied Biosystems)等。可在CFX96实时PCR检测系统(Bio-Rad)和Rotorgene Q(Qiagen)上得到6-通道检测，从而允许更高程度的多路化。
可以以阈值循环(缩写为Ct，且在某些情况下Cq或Cp)的方式表达结果。较低的Ct值反映了预定的阈值水平的快速达到，例如，因为更高的靶核酸浓度或更有效的扩增。较高的Ct值可能反映较低的靶核酸浓度，或无效的或受抑制的扩增。通常将阈值循环选择成在给定靶标的扩增的线性范围内。在某些实施方案中，将Ct设定为生长信号超过预定义的阈值线（例如，与基线有关）时的循环，或通过确定生长曲线的二阶导数的最大值。Ct的确定是本领域已知的，且描述在例如美国专利号7363168中。
VI. 试剂盒
本文提供了用于多路qRT-PCR测定以分类DLBCL患者的COO亚型的试剂盒。在某些实施方案中，所述试剂盒包括引物和探针的混合物用于扩增、检测和定量GCB和ABC标记基因产物(RNA)。GCB标志物包括ZNF318、PDK3、HMGN1、PTK2、SSBP2、BCL6和LRMP，且这些基因的转录物在来自GCB患者的样品中的存在水平高于在来自非癌或ABC患者的样品中。ABC标志物包括ARID3A、CCND2、FOXP1、KIAA0226L、JADE3、PIM2、TCF4和FAM46C，且这些基因的转录物在来自ABC患者的样品中的存在水平高于在来自非癌或GCB患者的样品中。
在本文中也包括用于多路qRT-PCR测定以分类DLBCL患者的6-基因COO亚型的试剂盒。在某些实施方案中，所述试剂盒包括引物和探针的混合物用于扩增、检测和定量GCB和ABC标记基因产物(RNA)。GCB标志物包括ZNF318、PTK2和SSBP2，且这些基因的转录物在来自GCB患者的样品中的存在水平高于在来自非癌或ABC患者的样品中。ABC标志物包括CCND2、FOXP1和JADE3，且这些基因的转录物在来自ABC患者的样品中的存在水平高于在来自非癌或GCB患者的样品中。
可以以任意组合混合和匹配标志物特异性的引物集合和探针。例如，可以单独地检测每种标志物。在具有6个通道的检测系统中，与内部对照一起，可以在单个容器中检测多达5种标志物。在该情况下，仅需要3种引物集合和探针混合物即可包括所有15种标志物。在具有4个通道的检测系统中，与内部对照一起，可以在单个容器中检测多达3种标志物。在该情况下，仅需要5种引物集合和探针混合物。可替换地，可以以更低的多路化程度或以非多路方式进行测定，使得需要更多的引物集合和探针混合物来测试样品中的所有15种标志物的表达。5-试管多路测定的一个例子显示在实施例中。因而，在某些实施方案中，所述试剂盒包括5种混合物(例如，主混合物)，每种包含对多达三种GCB和ABC探针标志物特异性的引物集合和探针以及对内部对照基因特异性的引物集合和探针。
对于6-基因COO特征，所述试剂盒可以包括2种混合物，例如，(i)包含引物和探针的混合物，所述引物和探针特异性地扩增和检测GCB标志物，包括ZNF318、PTK2和SSBP2 (和内部对照)，和(ii)包含引物和探针的混合物，所述引物和探针特异性地扩增和检测ABC标志物，包括CCND2、FOXP1和JADE3 (和内部对照)。在某些实施方案中，混合物(i)和(ii)中的每种基因的探针具有不同的标记，使得可以单独地检测每种基因的表达。在某些实施方案中，在混合物(i)和(ii)中的每种决定基因(不是内部对照)的探针具有相同的标记。在某些实施方案中，所述试剂盒包括6种不同的混合物，每种针对6-基因COO特征中的每个基因。
在某些实施方案中，没有单独地检测标志物。例如，所有对GCB标志物特异性的探针可以用相同标记进行标记，且所有对ABC标志物特异性的探针可以用相同标记(不同于在GCB探针上的标记)进行标记。在该情况下，所有15种标志物可以在仅具有3个通道(一个针对GCB标志物探针，一个针对ABC标志物探针，和一个针对对照探针)的用于检测的单个容器中大规模多路化。
在某些实施方案中，所述混合物进一步包含缓冲液、dNTP以及适合用于反转录和扩增的其它要素(例如，辅因子或适体)。通常，将所述混合物浓缩，使得与样品(例如，RNA)、酶和/或水一起，将等分试样加入最终的反应体积中。在某些实施方案中，所述试剂盒进一步包含逆转录酶(或具有逆转录酶活性的酶)和/或DNA聚合酶(例如，热稳定的DNA聚合酶诸如Taq、ZO5、及其衍生物)。
在某些实施方案中，所述试剂盒还包括从样品（例如，FFPET样品）纯化RNA的组分。例如，所述试剂盒可以包括来自高纯或MagNA纯FFPE RNA分离试剂盒(Roche)、RNeasy FFPE试剂盒(Qiagen)、PureLink FFPE RNA分离试剂盒(Thermo Fisher)等的组分。
在某些实施方案中，所述试剂盒还包括至少一个对照样品，例如，来自非癌样品(或合并的样品)或来自已知ABC或GCB样品(或合并的样品)的核酸。在某些实施方案中，所述试剂盒包括ABC阳性对照和/或GCB阳性对照。在某些实施方案中，所述试剂盒包括阴性对照，例如，缺乏核酸，或缺乏ABC和/或GCB标志物核酸。在某些实施方案中，所述试剂盒还包括消耗品，例如，用于核酸制备的平板或试管、用于样品收集的试管等。在某些实施方案中，所述试剂盒还包括使用说明书、对网站的提及或软件。
VII. 实施例
COO亚型确定特征的设计
使用一组商业上获得的DLBCL FFPET样本(训练组群1; n=32)来选择分类器基因(表1)。使用来自Roche的FFPET RNA试剂盒制备所述样品。
在qRT-PCR分类器中的基因靶标源自在DLBCL样本组群(n=32；训练组群)中筛选的基因集合(n=76)。我们使用Affymetrix微阵列平台作为用于确认的“黄金标准”。
表1. 用于具有GenBank登录号的DLBCL的qRT-PCR COO分类器
一旦选择基因，将qRT-PCR测定设计成在5个单独孔中执行。使用200ng RNA测试和对照样品(40 ng/孔)。
每个反应的反应条件如下：
25 ul RNA + 25 ul反应混合物
反应混合物: 5ul醋酸锰+ 10 ul RNA主混合物储备液+ 10 ul引物/探针混合物(终浓度100-300 nM)
在具有4个过滤器的cobas®LC480中运行反应以检测在表2中指出的探针。
表2. 示例性的测定设计
| 标记 | 孔1 | 孔2 | 孔3 | 孔4 | 孔5 |
| FAM | ARID3A | TCF4 | PDK3 | SSBP2 | JADE3 |
| HEX | CCND2 | ZNF318 | HMGN1 | BCL6 | PIM2 |
| JA270 | FOXP1 | KIAA0226L | PTK2 | LRMP | FAM46C |
| CY5.5 | IC | IC | IC | IC | IC |
表2显示了一种示例性测定设计，并允许在最小数目的孔中对每个标记基因的单独检测和定量。
可以使用更多或更少的反应容器。例如，可以使用单试管测定，其中所有的GCB标志物用相同标记(荧光团1)进行标记，所有的ABC标志物用相同标记(荧光团2)进行标记，且内部对照(IC)用不同标记(荧光团3)进行标记。在波谱的另一端，可以在单独孔中检测每个分类器基因以确定测试样品的COO亚型。通过将样品内的GCB标志物的表达水平与ABC标志物的表达水平对比来进行测试。如果GCB标志物表达与ABC标志物表达的比率高于阈值(例如，GCB阈值)，结果指示，所述样品来自具有GCB DLBCL的个体。如果ABC标志物表达与GCB标志物表达的比率高于阈值(例如，ABC阈值)，结果指示，所述样品来自具有ABC DLBCL的个体。基于样品中的核酸的量或特性，使用内部对照来标准化表达水平。
所述阈值水平是基于以下可能性：来自个体的样品中的GCB和ABC表达水平准确地分类个体的DLBCL COO亚型。例如，使用来自已知具有GCB亚型的个体(或个体集合)的样品，可以设定GCB阈值水平。然后可以用已知的GCB样品制备GCB阳性对照。在某些实施方案中，从已知GCB样品制备GCB阳性对照，所述已知GCB样品与已知来自具有ABC的个体的样品混合，使得GCB阳性对照中的超过50%的核酸来自已知的GCB样品以提供最小的GCB:ABC表达水平比率。如果样品具有高于该比率(GCB阈值)的GCB:ABC表达比率，认为结果是GCB COO亚型的准确确定。可以用51-100%的已知GCB样品（例如，约55%、58%、60%、62%、65%、68%、70%、75%或更高）制备GCB阳性对照，其中较高的百分比产生GCB阈值的更严谨置信水平。如果样品具有低于GCB阈值的GCB:ABC表达比率，结果未确定或是ABC COO亚型。类似地设定ABC阈值。例如，可以用51-100%的已知ABC样品（例如，约55%、58%、60%、62%、65%、68%、70%、75%或更高）制备ABC阳性对照，其中较高的百分比产生ABC阈值的更严谨置信水平。如果样品具有高于ABC阈值的ABC:GCB表达比率，认为结果是ABC COO亚型的准确确定，当比率低于ABC阈值时，结果未确定或是GCB COO亚型。在某些实施方案中，通过混合已知量的GCB标志物核酸和ABC标志物核酸，制备GCB和ABC阳性对照。GCB和ABC阳性对照也充当测定性能的对照，例如，以确保加入试剂和适当地执行仪器。
表3和4分别显示了可以用于本发明的分类器的引物和探针的序列。
表3: 引物序列
表4: 探针序列
15-基因特征的验证
在商业上获得的DLBCL FFPET样本(验证组群2；n=29，和验证组群3；n=46)中验证qRT-PCR分类器。在qRT-PCR和基于Affymetrix微阵列的分类器之间的一致率是97.1%(表5和6)。
表5: qRT-PCR COO亚型分类器的验证(组群2, n=29)
表6: qRT-PCR COO亚型分类器的验证(组群3, n=46)
两个独立DLBCL组群中的DLBCL亚型分类特征的高一致性是惊人的，特别是在给定所述特征中的相对小数目的基因的情况下。这些结果表明，DLBCL分类器可以用于快速更新的（quick-turn around）、简单的、廉价的和准确的COO亚型确定。
6-基因特征的验证
在商业上获得的DLBCL FFPET样本(验证组群n=50)中验证了具有6个基因的qRT-PCR分类器。在6-基因特征中包含的基因包括ABC基因CCND2、FOXP1和JADE3以及GCB基因ZNF318、SSBP2和PTK2。在qRT-PCR和基于Affymetrix微阵列的分类器之间的一致率是95%(表7)。
表7：qRT-PCR COO亚型分类器(6-基因分类器)的验证
小的6-基因DLBCL亚型分类特征的高一致性是惊人的。这些结果表明，6-基因DLBCL分类器可以用于快速更新的（quick-turn around）、简单的、廉价的和准确的COO亚型确定。
Claims (23)
1.检测生发中心B细胞标志物和活化的B细胞标志物的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于鉴别具有弥漫性大B细胞性淋巴瘤的个体，其包括：
(a) 从个体得到弥漫性大B细胞性淋巴瘤样品；
(b) 通过qRT-PCR检测所述弥漫性大B细胞性淋巴瘤样品中生发中心B细胞标志物ZNF318、PTK2和SSBP2的表达；
(c) 通过qRT-PCR检测所述弥漫性大B细胞性淋巴瘤样品中活化的B细胞标志物CCND2、FOXP1和JADE3的表达；和
(d) 通过qRT-PCR检测所述弥漫性大B细胞性淋巴瘤样品中对照基因的表达；
(i) 其中在所述个体的样品中生发中心B细胞标志物表达与活化的B细胞标志物表达的比率高于生发中心B细胞阈值指示所述个体对R-CHOP的施用的敏感性；或者
(ii) 其中在所述个体的样品中活化的B细胞标志物表达与生发中心B细胞标志物表达的比率高于活化的B细胞阈值指示所述个体对替代施用的敏感性，其中所述替代施用包括BTK抑制剂、SYK抑制剂、NFkB抑制剂或免疫调节剂。
2.根据权利要求1所述的用途，其包括步骤(a)至(d)，其中(b)和/或(c)如下进行：
(b) 通过qRT-PCR检测所述弥漫性大B细胞性淋巴瘤样品中生发中心B细胞标志物ZNF318、PDK3、HMGN1、PTK2、SSBP2、BCL6和LRMP的表达；
(c) 通过qRT-PCR检测所述弥漫性大B细胞性淋巴瘤样品中活化的B细胞标志物ARID3A、CCND2、FOXP1、KIAA0226L、JADE3、PIM2、TCF4和FAM46C的表达。
3.根据权利要求1至2中的任一项所述的用途，其中所述替代施用还包括R-CHOP。
4.根据权利要求1至2中的任一项所述的用途，其包括基于在(d)中检测到的对照基因的表达而调节关于步骤(b)和(c)中的基因检测到的表达水平。
5.检测生发中心B细胞标志物和活化的B细胞标志物的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于确定具有弥漫性大B细胞性淋巴瘤的个体的起源细胞亚型，其包括：
(a) 从个体得到弥漫性大B细胞性淋巴瘤样品；
(b) 通过qRT-PCR检测所述弥漫性大B细胞性淋巴瘤样品中生发中心B细胞标志物ZNF318、PTK2和SSBP2的表达；
(c) 通过qRT-PCR检测所述弥漫性大B细胞性淋巴瘤样品中活化的B细胞标志物CCND2、FOXP1和JADE3的表达；
(d) 通过qRT-PCR检测所述弥漫性大B细胞性淋巴瘤样品中对照基因的表达；和
(e) 确定所述个体的起源细胞亚型是
(i) 生发中心B细胞，如果生发中心B细胞标志物表达与活化的B细胞标志物表达的比率高于生发中心B细胞阈值；或者
(ii) 活化的B细胞，如果活化的B细胞标志物表达与生发中心B细胞标志物表达的比率高于活化的B细胞阈值。
6.根据权利要求5所述的用途，其包括步骤(a)至(d)，其中(b)和/或(c)如下进行：
(b) 通过qRT-PCR检测所述弥漫性大B细胞性淋巴瘤样品中生发中心B细胞标志物ZNF318、PDK3、HMGN1、PTK2、SSBP2、BCL6和LRMP的表达；
(c) 通过qRT-PCR检测所述弥漫性大B细胞性淋巴瘤样品中活化的B细胞标志物ARID3A、CCND2、FOXP1、KIAA0226L、JADE3、PIM2、TCF4和FAM46C的表达。
7.根据权利要求1至2和5至6中的任一项所述的用途，其中基于生发中心B细胞阳性对照中的生发中心B细胞标志物表达与活化的B细胞标志物表达的比率而设定所述生发中心B细胞阈值。
8.根据权利要求1至2和5至6中的任一项所述的用途，其中基于活化的B细胞阳性对照中的活化的B细胞标志物表达与生发中心B细胞标志物表达的比率而设定所述活化的B细胞阈值。
9.根据权利要求1至2和5至6中的任一项所述的用途，其中所述样品来自肺活组织检查或支气管肺泡灌洗。
10.根据权利要求1至2和5至6中的任一项所述的用途，其中所述样品是福尔马林固定的石蜡包埋组织。
11.根据权利要求1至2和5至6中的任一项所述的用途，其中所述样品是血液、血浆或血清。
12.根据权利要求1至2和5至6中的任一项所述的用途，其中在多个容器中以多路进行(b)和(c)的检测。
13.根据权利要求1至2和5至6中的任一项所述的用途，其中单独地检测每种生发中心B细胞和活化的B细胞标志物。
14.根据权利要求1至2和5至6中的任一项所述的用途，其中为每个样品在单个容器中进行(b)的检测。
15.根据权利要求1至2和5至6中的任一项所述的用途，其中为每个样品在单个容器中进行(c)的检测。
16.根据权利要求1至2和5至6中的任一项所述的用途，其中在与(b)和(c)的检测相同的容器中进行(d)的检测。
17.根据权利要求5-6中的任一项所述的用途，其包括基于在(d)中检测到的对照基因的表达而调节关于步骤(b)和(c)中的基因检测到的表达水平。
18.一种试剂盒，其包含：
(a) 包含引物集合和荧光地标记的探针的混合物，其特异性地扩增和检测生发中心B细胞标志物ZNF318、PTK2和SSBP2基因产物中的每一种；和
(b) 包含引物集合和荧光地标记的探针的混合物，其特异性地扩增和检测活化的B细胞标志物CCND2、FOXP1和JADE3基因产物中的每一种。
19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中(a)和(b)的混合物各自进一步包含引物集合和荧光地标记的探针，其特异性地扩增和检测对照基因产物，其中所述特异性地检测对照基因产物的荧光地标记的探针与混合物(a)和混合物(b)中的荧光地标记的探针不同地标记。
20.根据权利要求18至19中任一项所述的试剂盒，其中在混合物(a)中的荧光地标记的探针都用相同荧光标记进行标记，或其中混合物(b)中的荧光地标记的探针都用相同荧光标记进行标记。
21.根据权利要求18至19中的任一项所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含逆转录酶和/或热稳定的DNA聚合酶。
22.根据权利要求18至19中的任一项所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含具有逆转录酶和DNA聚合酶活性的酶。
23.根据权利要求18至19中的任一项所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含至少一个对照样品。
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