CN108424961A

CN108424961A - 一种用于检测上火的血清特异性miRNA的试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN108424961A
Application number: CN201810490199.9A
Authority: CN
Inventors: 包洁; 范永升; 窦晓兵; 张喜召
Original assignee: Zhejiang Chinese Medicine University ZCMU
Current assignee: Zhejiang Chinese Medicine University ZCMU
Priority date: 2018-05-21
Filing date: 2018-05-21
Publication date: 2018-08-21
Anticipated expiration: 2038-05-21
Also published as: CN108424961B

Abstract

本发明涉及miR‑122‑5p、miR‑483‑5p和miR‑3197联合使用作为中医上火分子标记物的应用；涉及miR‑122‑5p、miR‑483‑5p、miR‑3197和U6联合使用在制备中医上火miRNA检测试剂盒中的应用；本发明采用血清hsa‑miR‑122‑5p、hsa‑miR‑483‑5p和hsa‑miR‑3197作为诊断标志物，经大样本验证，在实热上火人群中，单个血清hsa‑miR‑122‑5p、hsa‑miR‑483‑5p或hsa‑miR‑3197均显著性低表达，本发明提供的用于检测实热上火体质的试剂盒，通过对血清hsa‑miR‑122‑5p、hsa‑miR‑483‑5p和hsa‑miR‑3197的同时相对定量，鉴别实热上火体质，诊断的敏感度为90.9％，特异度为72.7％，具有较高的准确性，并且高于单个miRNA的诊断特性。可以代替传统望、闻、问、切的中医诊断方法，将中医证候的诊断与现代分子生物学相结合，达到诊断的标准化。

Description

一种用于检测上火的血清特异性miRNA的试剂盒及其应用

技术领域

本发明设计一种miRNA的检测产品以及miR-122-5p、miR-483-5p和 miR-3197作为上火的分子标志物的应用，属于生物技术领域。

背景技术

根据《中华中医药学会团体标准》-上火的诊断和治疗指南的记载，中医上火是指因精神紧张、过度劳累、辛热药食、气候变化等因素，引起的人体以头面部口、舌、牙龈、咽喉、眼、鼻等部位皮肤黏膜出现红肿热痛、溃疡为主，并可伴有全身症状的一种轻微且易反复的疾病。通常表现为口腔溃疡、牙龈肿痛、口舌生疮、目赤、咽痛、口干、牙衄、鼻衄等头面部粘膜症状，同时伴有舌红、脉数等表现的病症。随着饮食结构的变化和工作压力的增强，上火现象在现代生活中的发生率不断上升。但其诊断缺少明确的理化手段和依据。

研究发现微小RNA(microRNA，miRNA)与上火的发生密切相关。miRNA 是一类高度保守，长度约在19-24个核苷酸的内源性非编码小分子单链RNA，能通过与靶基因mRNA特异性的碱基互补配对，引起靶基因mRNA的降解或者抑制其翻译，从而参与调控细胞增殖、分化及凋亡过程。血清中的miRNA可稳定存在并可作为血清标志物。

血清miRNA的检测可作为中医上火有前景的诊断和预测指标，但上火相关的特异性miRNA表达谱的筛选、检测方法及检测程序的标准化、稳定内参基因的选择都是迫切需要解决的问题。血清中的miRNA含量远低于组织，需要一种非常灵敏且特异的检测方法；又由于miRNA引物序列短，引物设计比较困难，没有针对性的软件可以直接利用，故引物及体系均需筛选及优化过程。目前对 miRNA的高通量筛查一般采用芯片技术，成本高、特异性和灵敏度有限，且不能满足零散标本实时检测需求；对少数miRNA的实时检测多采用Taqman探针法，部分已形成商业化试剂盒产品，但成本和售价高昂。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测快速方便、准确率高，可以实现中医上火早期的辅助诊断的miRNA检测试剂盒，以及提供miR-122-5p、miR-483-5p和 miR-3197联合使用作为中医上火分子标记物的应用。

本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：miR-122-5p、miR-483-5p、miR-3197和U6联合使用在制备中医上火miRNA检测试剂盒中的应用，其中U6作为内参。

基于上述应用本发明提出的具体技术方案是：一种中医上火miRNA检测试剂盒，其检测体系包括反转录反应体系和qRCR反应体系，所述反转录反应体系中包括分别针对miR-122-5p、miR-483-5p、miR-3197和U6的反转录引物序列；所述qRCR反应体系中包括针对miR-122-5p、miR-483-5p、miR-3197和U6 的扩增引物序列。针对所述miR-122-5p的反转录引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；针对所述miR-483-5p的反转录引物的核苷酸序列如SEQID No.2所示；针对所述miR-3197的反转录引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；针对所述U6的反转录引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；针对所述miR-122-5p 的扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.9所示；针对所述 miR-483-5p的扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6和SEQ ID No.10所示；针对所述miR-3197的扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.11所示；针对所述U6的扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8和SEQ ID No.12所示。

用于配制所述反转录反应体系的试剂包括脱氧核糖核苷三磷酸、反转录缓冲液、RNA酶抑制剂、反转录酶和反转录引物液；用于配制所述qRCR反应体系的试剂包括SYBRGreen混合液、扩增引物液和纯水。

上述反转录反应体系的总体积为10μl；其中，所述脱氧核糖核苷三磷酸的体积是0.5μl，所述反转录缓冲液的体积是2.0μl，所述RNA酶抑制剂的体积是 0.5μl，所述反转录酶的体积是1.0μl，所述变性后的总RNA和反转录引物的体积是6μl；所述RNA酶抑制剂的使用浓度为40U/μl，所述反转录酶的使用浓度为200U/μl；所述miRNA样品中含有内参U6。

上述qRCR反应体系的总体积为20μl；其中，所述SYBR Green混合液的体积是10μl，所述扩增引物液的体积是0.8μl，所述DNA模板1μl，其余是纯水；所述扩增引物液的使用浓度为10μM；所述DNA模板是所述反转录反应体系反应后的产物稀释五倍获得的。

本发明具有积极的效果：

(1)miR-122-5p、miR-483-5p和miR-3197作为组合分子标记物，经过临床实验验证，在中医上火的辅助诊断指标方面具有突出优势。这三个分子标记物首次应用于中医上火miRNA检测试剂盒的开发，该中医上火miRNA检测试剂盒运用qPCR方法，可以实现早期上火的辅助诊断，提高患者的生活质量。

(2)本发明的中医上火miRNA检测试剂盒选择了miR-122-5p、miR-483-5p 和miR-3197这三个miRNA标记物进行组合，开发成检测试剂盒，检测快速方便、检测灵敏度、特异度高、成本低，可以满足绝大多数上火患者的检测需求，应用范围极广，经临床验证预测准确率高。

(3)本发明的中医上火miRNA检测试剂盒针对血清中作为定量反应的内参，不同样本中差异很大的因素，特别引入稳定的snRNA序列U6(RNA聚合酶Ⅲ转录)作为内参对照RNA，并优化设计了针对U6的内参引物，极大提高了进行miRNA检测时相对定量的准确度。

附图说明

图1是采用本发明的试剂盒检测样本的miR-122-5p的熔解曲线图；

图2是采用本发明的试剂盒检测样本的miR-483-5p的熔解曲线图；

图3是采用本发明的试剂盒检测样本的miR-3197的熔解曲线图；

图4是采用本发明的试剂盒检测样本的U6的熔解曲线图；

图5是miR-122-5p、miR-483-5p和miR-3197各单个检测指标预测结果及 miR-122-5p、miR-483-5p和miR-3197的联合预测结果。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。

实施例1

一、试剂盒的组成。

本实施例的中医上火miRNA检测试剂盒，包括用于配制反转录反应体系的试剂和用于配制qPCR体系的试剂。

1、反转录反应体系：

用于配制反转录反应体系的试剂包括脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP，供应商：Takara，商品号：4019)、反转录缓冲液(5×RT buffer，供应商：Takara，商品号： 9158A)、RNA酶抑制剂(RNase inhibitor，供应商：Takara，商品号：2313A)和反转录酶(M-MLV，供应商：Takara，商品号：2641A)。用于配制反转录反应体系的试剂逐瓶封装，使用时按一定的比例配制成反转录反应体系，反转录反应体系为10μl/次，封装的体积是100次的用量。如表1所示。

表1反转录反应体系组分表

用于反转录反应体系的扩增引物分别为针对miR-122-5p、miR-483-5p、 miR-3197和U6。用于配制反转录反应体系的四种引物分开逐瓶封装。配制反转录反应体系的扩增引物的核苷酸序列，如表2所示，由上海生工生物工程有限公司合成。

表2反转录引物特征表

2、qPCR反应体系：

用于配制qPCR反应体系的试剂包括SYBR Green混合液(2×SYBR Green Mix WithROX，供应商：美国Thermo Fisher Scientific公司，商品号：11733-038)、纯水(ddH2O)和扩增引物液(Primer mix)。用于配制PCR反应体系的试剂逐瓶封装，使用时按一定的比例配制成PCR反应体系，PCR反应体系为100μl/次，封装的体积是100次的用量，如表3所示。

表3PCR反应体系组分表

组分	体积	使用浓度
			2×SYBR Green Mix With ROX	10μl	原商品浓度
ddH2O	8.2μl	—
			Primer mix	0.8μl	10uM
RT product	1μl	—

用于配制qPCR反应体系的扩增引物分别为针对miR-122-5p、miR-483-5p、 miR-3197和U6。用于配制PCR反应体系的四种引物分开逐瓶封装。配制qPCR 反应体系的扩增引物的核苷酸序列，如表4所示，由上海生工生物工程有限公司合成。

表4扩增引物特征表

二、试剂盒的使用方法。

本实施例的中医上火miRNA检测试剂盒的具体检测步骤如下：

1、总RNA的提取

采用Norgen公司的Plasma/Serum Exosome Kit试剂盒对待测样品进行总 RNA提取，具体步骤如下：(1)在50mL离心管(自备)中，对应于每1mL血浆样品加入0.2mL的PSSolution A和1.8mL的PS Solution B(在加入β-巯基乙醇后使用)。涡旋15s混合均匀。(注意：PS Solution A中含有树脂，因此在吸取之前要混合均匀)；(2)将第1步中的混合液放入60℃温育箱内，孵育10min； (3)在管中加入3mL的无水乙醇(自备)，涡旋15s，混合均匀；(4)1000rpm， 4℃，离心30s，小心倒掉上清液，防止沉淀丢失；(5)加入0.3mL PS Solution C，涡旋15s混合均匀；(6)将步骤5中的混合液继续放入60℃温育箱内，孵育10min； (7)在管中加入0.3mL的无水乙醇(自备)，涡旋15s，混合均匀；(8)将步骤 7中650μL的混合液加到柱上，14000rpm，离心1min，小心倒掉管中的液体，将柱子重新装回到收集管中；(9)重复步骤8，直到步骤7中的混合液全部转移到柱子上；(10)加400μL的Wash Solution到柱子中，14000rpm，离心1min，小心倒掉管中的液体，将柱子重新装回到收集管中；(11)步骤10重复两次，总共清洗三次；(12)14000rpm，4℃，空离3min，弃去收集管；(13)将柱子转移到一个新的1.7mL的洗脱管中，加100μL的Elution solution到柱中，2000rpm 离心2min，然后14000rpm离心3min。放置在4℃中，通过测定浓度和 OD260/OD280的比值控制样本质量，最终加入反转录反应体系中的样本 OD260/OD280的比值在1.8～2.0之间的可获得最优反应结果。

2、反转录反应

(1)反转录反应体系：取0.5μl的dNTP、0.5μl的RNase inhibitor、2μl的5×RTbuffer和1μl的RT primer进行混合；再加入抽提的总RNA样本，使得反转录的反应总体积为10μl。如表5表示。

表5反转录反应体系表

组分	体积	使用浓度
			总RNA	5μl	—
RT primer	1μl	2μM
			dNTP	0.5μl	10mM
5×RT buffer	2μl	原商品浓度
			RNase inhibitor	0.5μl	40U/ul
M-MLV	1μl	200U/ul

(2)反转录程序：42℃，孵育60min，70℃孵育15min。所得cDNA4℃冷藏待用，作为下一步反应的模板。

3、qPCR反应

(1)qPCR反应体系：取10μl的2×SYBR Green Mix With ROX、0.8μl的其中一种Primer mix和1μl的模板cDNA进行混合，最后加入适量的H2O使得PCR 反应总体积为20μl。如表6所示。

表6荧光定量PCR反应体系表

(2)qPCR反应及溶解曲线分析程序：

1)50℃，2min；

2)95℃，2min；

3)95℃，15s；

4)60℃，30s；

5)重复第3)步到第5步40个循环；

6)溶解曲线分析60℃-95℃；

(3)反应结果

采用本实施例的中医上火miRNA检测试剂盒进行miR-122-5p、miR-483-5p 和miR-3197的检测，对应引物扩增特异性较好，均为单峰。图1为检测样本的 miR-122-5p的熔解曲线图；图2为检测样本的miR-483-5p的熔解曲线图；图3 为检测样本的miR-3197的熔解曲线图；图4为检测样本的U6的熔解曲线图。

4、试剂盒的判断标准。

通过Logistic回归方程拟合四个指标发现，拟合后的灵敏度和特异性均高于单独指标。通过数据分析，得到判断公式(回归方程)为：

Y＝-14.277*AmiR-122-5p-4.46*BmiR-483-5p+11.945*CmiR-3197+2.259。

其中AmiR-122-5p的是miR-122-5p的表达量(2-△△CT值)，BmiR-483-5p 是miR-483-5p的表达量(2-△△CT值)，CmiR-3197是miR-3197的表达量 (2-△△CT值)。

当Y值≥0.636时，即预测概率值大于或等于0.636时判为阳性(即预测为中医上火患者)；反之为阴性。

应用例1

采用实施例1的中医上火miRNA检测试剂盒，对30例上火患者及30例健康人(对照)的血清中的miRNA进行检测，检测miR-122-5p、miR-483-5p和 miR-3197的表达量(2^-△△CT值)。对检测结果采用SPSS19.0进行回归分析， miR-122-5p、miR-483-5p和miR-3197各单个检测指标预测结果及miR-122-5p、 miR-483-5p和miR-3197的联合预测结果参见图5。

各指标及联合指标P值均<0.05，说明各检测指标均与中医上火预测显著相关。miR-122-5p、miR-483-5p和miR-3197的联合预测准确率达到90.9％，高于各单个检测指标的预测率。由回归分析还得到采用本试剂盒进行三指标联合检测验证，其敏感度为90.9％，特异度为72.7％，具有明显的优势。

序列表

<110> 浙江中医药大学

<120> 一种用于检测上火的血清特异性miRNA的试剂盒及其应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 59

<212> DNA/RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

gtctgtatgg ttgttctcgt ctccttctca tccctatcta caaccataca gaccaaaca 59

<210> 2

<211> 54

<212> DNA/RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

gtctgtatgc ttgttctcgt ctctgtgtca tccctcaagc atacagactg ccag 54

<210> 3

<211> 54

<212> DNA/RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

gtctgtatgc ttgttctcgt ctctgtgtca tccctcaagc atacagaccg cctt 54

<210> 4

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

aacgcttcac gaatttgcgt 20

<210> 5

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 5

cgtaaagtgg agtgtgacaa tgg 23

<210> 6

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 6

taacatcagc tgggcgagg 19

<210> 7

<211> 17

<212> DNA/RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 7

ggaggcgcag gctcgga 17

<210> 8

<211> 17

<212> DNA/RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 8

ctcgcttcgg cagcaca 17

<210> 9

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 9

tatggttgtt ctcgtctcct tctc 24

<210> 10

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 10

tatgcttgtt ctcgtctctg tgtc 24

<210> 11

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 11

tatgcttgtt ctcgtctctg tgtc 24

<210> 12

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 12

aacgcttcac gaatttgcgt 20

Claims

1.miR-122-5p、miR-483-5p和miR-3197联合使用作为中医上火分子标记物的应用。

2.miR-122-5p、miR-483-5p、miR-3197和U6联合使用在制备中医上火miRNA检测试剂盒中的应用，其中U6作为内参。

3.如权利要求2所述的应用，其检测体系包括反转录反应体系和qPCR反应体系，其特征在于：所述反转录反应体系中包括miR-122-5p、miR-483-5p、miR-3197和U6的反转录引物；所述qRCR反应体系中包括针对miR-122-5p、miR-483-5p、miR-3197和U6的扩增引物序列。针对所述miR-122-5p的反转录引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；针对所述miR-483-5p的反转录引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；针对所述miR-3197的反转录引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；针对所述U6的反转录引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；针对所述miR-122-5p的扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ IDNo.9所示；针对所述miR-483-5p的扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6和SEQID No.10所示；针对所述miR-3197的扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.11所示；针对所述U6的扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8和SEQ ID No.12所示。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：用于配制所述反转录反应体系的试剂包括脱氧核糖核苷三磷酸、反转录缓冲液、RNA酶抑制剂、反转录酶和反转录引物液；用于配制所述qRCR反应体系的试剂包括SYBR Green混合液、扩增引物液和纯水。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述反转录反应体系的总体积为10μl；其中，所述脱氧核糖核苷三磷酸的体积是0.5μl，所述反转录缓冲液的体积是2.0μl，所述RNA酶抑制剂的体积是0.5μl，所述反转录酶的体积是1.0μl，所述变性后的总RNA和反转录引物的体积是6μl；所述RNA酶抑制剂的使用浓度为40U/μl，所述反转录酶的使用浓度为200U/μl；所述miRNA样品中含有内参U6。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述qRCR反应体系的总体积为20μl；其中，所述SYBR Green混合液的体积是10μl，所述扩增引物液的体积是0.8μl，所述DNA模板1μl，其余是纯水；所述扩增引物液的使用浓度为10μM。