CN112695080A - 一种基于数字PCR平台的miRNA-106b检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生物技术领，尤指一种基于数字PCR平台的miRNA‑106b检测试剂盒，所述的试剂盒主要包括PCR反应液、检测引物、反转录缓冲液、反转录引物和阳性对照品；所述的反转录引物为：以SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为反转录引物Pri‑RT；所述的检测引物为：以SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为上游引物Pri‑F1；以SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列为下游引物Pri‑R1；本发明的试剂盒中应用的反转录缓冲液和PCR缓冲液提高反转录体系RNA的上样量及PCR反应体系的上样量，有利于提高试剂盒检测的稳定性，减少加样时出现的误差；采用数字PCR技术进行检测具有更高的灵敏度和特异性、准确性，本发明配制的反应液或试剂盒可提高了检测灵敏度、准确率，对于临床上预后观察及微量病变样本的检测提供有效方法。

Description

一种基于数字PCR平台的miRNA-106b检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种生物技术领，尤指一种基于数字PCR平台的miRNA-106b检测试剂盒。
背景技术
阿尔兹海默病(AD)是一种有认知、行为功能失常的中枢神经系统的退行型疾病，约占老年人痴呆病例中50-60％。其中老年痴呆是AD的一种最常见形式，具有隐匿起病、进行性加重的特点，会逐渐出现认知和社交功能障碍。为了早期识别并干预AD，许多学者在此基础上提出了轻度认知功能障碍(MCI)的概念，是用来定义那些有轻度记忆力或认知能力损害但未达到AD诊断标准的老年人。MCI患者是AD的高危人群，有研究发现，社区环境中的年转换率3-10％，专科诊所为10-15％。2011年美国老化研究所-阿尔茨海默氏症协会的修订指南指出MCI事实上是在早期阶段的广告MCI(称为AD源性的MCI),因此对MCI的早期诊断以及确定何种类型的MCI更有可能发展为AD是非常重要的。
目前，AD诊断唯一的金标准是脑组织中淀粉样蛋白Aβ的沉积，但MIC并未达到AD的诊断标准，而研究认为MIC是最终发展为AD的危险因素之一，所以对MIC的诊断尤为重要。
MicroRNA(miRNA)是由21-25个核苷酸构成的分子，MicroRNA通过抑制其靶分子mRNA的翻译或者促进其降解而起到负性基因表达调控作用。与传统的活检相比，微创(抽血)或无创(使用尿液或唾液)诊断方法减少了患者的痛苦和不便，也降低了分析成本。
阿尔兹海默氏症的越来越多研究中对MicroRNA进行分析，但目前尚无有报道研究利用血浆miRNA中的一组miRNAs(miRNA-106b)对MCI进行定量检测，从而实现对阿尔兹海默氏症的预防和早期诊断。
数字PCR与荧光定量PCR的区别及其优势在于，数字PCR能将传统的荧光定量PCR单个样本的特异扩增反应体系分割成10万个小微滴体系，依据泊松分布的原理，通过检测小微滴反应体系有无带检靶分子的荧光值，计算出靶分子的具体拷贝数，而不需要荧光定量PCR所依赖的标准曲线和参照样本，而且分割的体系能大大减少干扰物质对扩增的抑制，这种检测方式比荧光定量PCR更具有更高的灵敏度和特异性、准确性。
发明内容
为解决上述问题，本发明旨在公开一种生物技术领，尤指一种基于数字PCR平台的miRNA-106b检测试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种基于数字PCR平台的miRNA-106b检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒主要包括PCR反应液、检测引物、反转录缓冲液、反转录引物和阳性对照品；还包括miRNA提取试剂，所述miRNA提取试剂为QIAGEN的miRNeasySerum/Plasma Kit。
优选地，所述的反转录引物为：以SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为反转录引物Pri-RT。
优选地，所述的检测引物为：以SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为上游引物Pri-F1；以SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列为下游引物Pri-R1。
优选地，所述PCR反应液包括PCR反应预混液、上游引物Pri-F1、下游引物Pri-R1、无核酸酶水。
优选地，所述反转录缓冲液包括dNTPs、5X Buffer、反转录引物、无核酸酶水。
优选地，所述阳性对照品为合成的miRNA-106b双链mimics。
优选地，所述反转录引物Pri-RT的浓度为1ug/μl。
优选地，所述上游引物Pri-F1、下游引物Pri-R1的浓度为200nM。
一种基于数字PCR平台的miRNA-106b检测试剂盒的应用方法，其特征在于，所述的应用方法包括以下步骤：
1)提取miRNA模板：从待测血浆样品中提取总RNA模板，以总RNA模板，配制一种基于数字PCR平台miRNA-106b的反转录反应体系；
2)配制一种基于数字PCR平台miRNA-106b的反转录缓冲液：10mM dNTPs、5XBuffer、反转录引物、反转录酶、无核酸酶水；
3)进行反转录，得到cDNA模板：反转录的反应程序为：70℃，5min；冰上孵育5min；加入反转录缓冲液后，37℃，60min；
4)配制一种基于数字PCR平台miRNA-106b的PCR反应液：PCR反应预混液、10μM上游引物、10μM下游引物、无核酸酶水；
5)配制PCR特异扩增反应体系：以步骤3)的cDNA模板，配制一种基于数字PCR平台miRNA-106b的PCR特异扩增反应体系；
6)将PCR特异扩增反应体系生成微滴：通过MicroDrop-100A样本制备仪将PCR特异扩增反应体系生成微滴；
7)进行数字PCR扩增，并通过软件得到拷贝数：进行数字PCR扩增，扩增的反应程序为：95℃，10min，1个循环，升降温速率1℃/秒；95℃30s，60℃60s，45个循环，升降温速率1℃/秒；72℃，2min，1个循环，升降温速率1℃/秒；16℃保持。
本发明使用MicroDrop-100B生物芯片分析仪检测荧光信号，采用MicroDropTM数字PCR仪配套数据分析软件QuantDrop计算给出待检靶分子的拷贝数。
优选地，所述步骤2)中配制反转录缓冲液的具体质量组分包括：：10mM dNTPs0.65μl、5X Buffer 2.5μl、1ug/μl反转录引物0.5μl、反转录酶0.5μl、无核酸酶水6.35μl，总RNA模板2μl。
优选地，步骤4)中配制PCR反应液的具体质量组分包括：PCR反应预混液10μl、10μM上游引物0.4μl、10μM下游引物0.4μl、核酸酶水5.4μl、cDNA模板4μl。
本发明的有益效果体现在：本发明的试剂盒中应用的反转录缓冲液和PCR缓冲液不仅在检测miRNA-106b上进行了成分及PCR反应程序的优化，而且优化了PCR反应体系的体积，提高反转录体系RNA的上样量及PCR反应体系的上样量，有利于提高试剂盒检测的稳定性，减少加样时可能出现的误差；本发明采用数字PCR技术进行检测，具有更高的灵敏度和特异性、准确性，通过本发明配制的反应液或试剂盒，可提高了检测灵敏度、提高检测的准确率，对于临床上预后观察及微量病变样本的检测提供更加有利的手段。
具体地，本发明采用的反转录引物SEQIDNO.1，其终浓度及特异性都更适用于反转录miRNA-106b，能够发挥优良显著的特异性，提高反转录效率；而本发明采用的引物SEQIDNO.2和SEQIDNO.3，其终浓度及特异性都更适用于数字PCR检测，可发挥优良显著的特异性。
本发明采用的数字PCR技术进行检测，该技术能将单个样本的20μl检测miRNA-106b的特异扩增反应体系分割成10万个小微滴反应体系，通过检测小微滴反应体系有无带检靶分子的荧光值，计算出靶分子的具体拷贝数，不依赖于标准曲线和参照样本，这种检测方式具有更高的灵敏度和特异性、准确性，为阿尔兹海默氏症早期预防、药效评估以及疗效检测提供了重要的参考依据；本发明适用于对血浆中miRNA的miRNA-106b进行检测。本发明提高了检测灵敏度，为临床样本提供快速、准确的辅助用药指导；尤其对于临床上预后观察及微量病变样本的检测提供更加有利的手段。
附图说明
图1为本发明采用MicroDropTM微滴式数字PCR系统检测miRNA-106b的临床样本微滴荧光分布一维图。
图2为本发明采用MicroDropTM微滴式数字PCR系统检测miRNA-106b梯度稀释标准品微滴荧光分布一维图。
图3为本发明检测miRNA-106b梯度稀释标准品的线性拟合图。
图4为本发明检测60例临床样本的miRNA-106b表达量分布图。
具体实施方式
下面结合附图详细说明本发明的具体实施方式：
微滴式数字PCR(ddPCR)是一种核酸分子绝对定量技术，其原理为：标准PCR反应体系经过微滴发生后，每个微滴包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板)，实现“单分子模板PCR扩增”，经过PCR循环后之后，含有核酸分子模板的微滴会给出荧光信号，没有模板的微滴就没有荧光信号产生；最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，采用MicroDropTM数字PCR仪配套数据分析软件QuantDrop可计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数；数字PCR可以直接计算目标序列的拷贝数，因此无需依赖于对照样品和标准曲线就可以进行精确的绝对定量检测；此外，由于数字PCR在进行结果判读时仅判断有/无两种扩增状态，因此也不需要检测荧光信号与设定阈值线的交点，完全不依赖于Ct值的鉴定，因此数字PCR的反应受扩增效率的影响大大降低，对PCR反应抑制物的耐受能力大大提高；数字PCR实验中标准反应体系分配的过程可以极大程度上降低与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度，计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数。
下述实施例中，MicroDropTM微滴式数字PCR系统来自广东永诺医疗科技有限公司，由MicroDrop-100A样本制备仪和MicroDrop-100B生物芯片分析仪组成。
实施例一：一种基于数字PCR平台检测miRNA-106b的反转录缓冲液的配制方法
(1)样本总RNA的反转录前的预变性，配制反应液：无核酸酶水3μl、总RNA模板2μl、1ug/μl反转录引物0.5μl，如表1所示：
表1
总RNA 2μl
反转录引物 0.5μl
无核酸酶水 3μl
总体积 5.5μl
(2)将步骤(1)的反应液充分混合均匀，瞬时离心，进行70℃，5分钟；冰上孵育5分钟；
(3)配制反转录缓冲液：10mM dNTPs 0.65μl、5X Buffer 2.5μl、反转录酶0.5μl、无核酸酶水3.35μl，如表2所示：
表2
5X Buffer 2.5μl
dNTPs 0.65μl
反转录酶 0.5μl
无核酸酶水 3.35μl
总体积 7μl
(4)将步骤(3)配制的反转录缓冲液与步骤(2)配制的反应液混合，充分混合均匀，瞬时离心，进行37℃，1小时。
实施例二：一种基于数字PCR平台检测miRNA-106b的PCR反应液的配制方法
(1)PCR反应预混液：为广东永诺医疗科技有限公司的MicroDropTM数字PCR仪配套的数字PCR用反应预混液(含dUTP/UDG)；
(2)引物：上游引物和下游引物如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示，其中每条引物的浓度配制为10μM，终浓度均为200nM；
(3)PCR反应液如表1所示：PCR反应预混液10μl、10μM上游引物0.4μl、10μM下游引物0.4μl、无核酸酶水5.2μl，一个反应的总体积为16μl，如表3；
表3
Figure BDA0002862830610000071
Figure BDA0002862830610000081
(4)总RNA的提取：使用QIAGEN的miRNeasy Serum/Plasma Kit，按照试剂盒说明书抽提样本总RNA；
(5)PCR特异扩增反应体系：在表1的PCR反应液加入4μl待测样本cDNA，充分混合均匀，瞬时离心，得到20μlPCR特异扩增反应体系。
实施例三：检测方法
本实施例采用的PCR反应液按照实施例一中PCR反应液进行配制，具体的检测方法为：
(1)单个PCR反应体系的配制：取16μlPCR反应液加入4μl cDNA模板，充分混合均匀，瞬时离心；
(2)微滴生成：完成配制的20μl数字PCR扩增体系加入到8个通道的微滴生成芯片的水相孔中，并加入5μl密封剂；然后加入50μl微滴生成油到8个通道的微滴生成芯片的油相孔中，将芯片置于MicroDrop-100A样本制备仪(广东永诺医疗科技有限公司)中制备PCR微反应液滴；
(5)将微滴生成孔中的PCR微反应液滴小心转移至PCR板上，用封膜仪进行热封；
(6)将完成热封的PCR板放入PCR仪中，设置反应程序进行PCR扩增，PCR扩增反应程序为：95℃，10min，1个循环，升降温速率1℃/s；95℃30s，60℃60s，40个循环，升降温速率1℃/s；72℃，2min，1个循环，升降温速率1℃/s；16℃保持；
(7)PCR扩增反应后将PCR板置于MicroDrop-100B生物芯片分析仪(广东永诺医疗科技有限公司)中进行检测荧光信号，有核酸分子模板的微滴信号检测仪就会给出荧光信号，没有模板的微滴信号检测仪就没有荧光信号，最后根据泊松分布原理及阳性微滴的比例，采用MicroDropTM数字PCR仪配套数据分析软件QuantDrop可计算给出带检靶分子的拷贝数。
实施例四：检测miRNA-106b标准品的线性
本实施例采用实施例1的反转录方法和实施例2的检测方法对miRNA进行定量检测，具体的检测方法为：
(1)样本制备：使用人工合成的miRNA-106b双链mimics，反转录后，进行梯度稀释为10-5、10-6、10-7、10-8和10-9，其浓度分别为9.632*105、9.632*104、9.632*103、9.632*102、9.632*101拷贝/μl；
(2)单个PCR反应体系的配制：取16μlPCR反应液加入4μl标准品cDNA，充分混合均匀，瞬时离心；
(4)微滴生成：完成配制的20μl数字PCR扩增体系加入到8个通道的微滴生成芯片的水相孔中，并加入5μl密封剂；然后加入50μl微滴生成油到8个通道的微滴生成芯片的油相孔中，将芯片置于MicroDrop-100A样本制备仪(广东永诺医疗科技有限公司)中制备PCR微反应液滴；
(5)将微滴生成孔中的PCR微反应液滴小心转移至PCR板上，用封板膜进行热封；
(6)将完成热封的PCR板放入PCR仪中，设置反应程序进行PCR扩增，PCR扩增反应程序为：95℃，10min，1个循环，升降温速率1℃/秒；95℃30s，60℃60s，40个循环，升降温速率1℃/秒；72℃，2min，1个循环，升降温速率1℃/秒；16℃保持；
(7)PCR扩增反应后将PCR板置于MicroDrop-100B生物芯片分析仪(广东永诺医疗科技有限公司)中进行检测荧光信号，有核酸分子模板的微滴信号检测仪就会给出荧光信号，没有模板的微滴信号检测仪就没有荧光信号。最后根据泊松分布原理及阳性微滴的比例，采用MicroDropTM数字PCR仪配套数据分析软件QuantDrop可计算给出待检靶分子的拷贝数；
(8)根据从QuantDrop数据分析软件得到的数据，计算出样本实际拷贝数(以log10进行转化)，同时比较样本理论拷贝数(以log10进行转化)，计算出miRNA-106b标准品线性关系R2值。
实施例五：部分临床样本检测
本实施例采用实施例2所述PCR反应液和参照实施例3检测方法，对部分临床患者样本进行miRNA-106b的表达量检测，对20例经AD的金标准确认为AD患者样本、20例经临床观察确认为MCI患者样本以及20例正常人样本进行检测：
(1)样本制备：20例正常人样本、20例临床AD患者样本、20例MCI患者样本；
(2)单个PCR反应体系的配制：取16μl PCR反应液加入4μl cDNA样本或对照品，充分混合均匀，瞬时离心；
(3)微滴生成：完成配制的20μl数字PCR扩增体系加入到8个通道的微滴生成芯片的水相孔中，并加入5μl密封剂；然后加入50μl微滴生成油到8个通道的微滴生成芯片的油相孔中，将芯片置于MicroDrop-100样本制备仪(广东永诺医疗科技有限公司)中制备PCR微反应液滴；
(4)将微滴生成孔中的PCR微反应液滴小心转移至PCR板上，用封板膜进行热封；
(5)将完成热封的PCR板放入PCR仪中，设置反应程序进行PCR扩增，PCR扩增反应程序为：95℃，10min，1个循环，升降温速率1℃/秒；95℃30s，60℃60s，40个循环，升降温速率1℃/秒；72℃，2min，1个循环，升降温速率1℃/秒；16℃保持；
(6)PCR扩增反应后将PCR板置于MicroDrop-100B生物芯片分析仪(广东永诺医疗科技有限公司)中进行检测荧光信号，有核酸分子模板的微滴信号检测仪就会给出荧光信号，没有模板的微滴信号检测仪就没有荧光信号。最后根据泊松分布原理及阳性微滴的比例，采用MicroDropTM数字PCR仪配套数据分析软件QuantDrop可计算给出带检靶分子的拷贝数；
(7)实验检测结果分析：
(7-1)对照品1有效性判断：检测结果应总拷贝数在2000-3000copies/20μl；
(7-2)对照品2有效性判断：检测结果应总拷贝数在10000-11000copies/20μl；
(7-3)满足上述1、2点，若检测结果总拷贝数在3000-10000copies/20μl，则判定该样本为MCI阳性；若检测结果总拷贝数大于10000copies/20μl，则判定该样本为MCI-AD阳性；若检测结果总拷贝数小于3000copies/20μl，则判定该样本为MCI阴性。
(8)检测结果如表4临床样本检测结果分析表所示：
表4临床样本检测结果分析表
Figure BDA0002862830610000121
表5临床样本检测结果分析表
Figure BDA0002862830610000122
(9)在60例临床样本对比实验中显示，数字PCR与AD金标准和临床观察的结果一致性达96％；结果中不相符的临床样本是临床观察确认为MCI阳性，而数字PCR检测为阴性的样本为1例；发现1例经AD金标准确认的AD患者样本呈现MIC阳性。表明数字PCR灵敏度与AD金标准和临床观察有较高的检测符合率，有助于提高临床的检测效率。本发明是结合数字PCR对引物有较高的要求，对引物进行优选，提高对目标基因特异性扩增，提高了在数字PCR上的检测灵敏度，为临床样本提供快速、准确的辅助用药指导；尤其对于临床上预后观察及微量病变样本的检测提供更加有利的手段。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明的技术范围作任何限制，本行业的技术人员，在本技术方案的启迪下，可以做出一些变形与修改，凡是依据本发明的技术实质对以上的实施例所作的任何修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种基于数字PCR平台的miRNA-106b检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒主要包括PCR反应液、检测引物、反转录缓冲液、反转录引物和阳性对照品。
2.根据权利要求1所述的一种基于数字PCR平台的miRNA-106b检测试剂盒，其特征在于，所述的反转录引物为：以SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为反转录引物Pri-RT。
3.根据权利要求1所述的一种基于数字PCR平台的miRNA-106b检测试剂盒，其特征在于，所述的检测引物为：以SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为上游引物Pri-F1；以SEQ IDNO.3所示的核苷酸序列为下游引物Pri-R1。
4.根据权利要求1所述的一种基于数字PCR平台的miRNA-106b检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括PCR反应预混液、上游引物Pri-F1、下游引物Pri-R1、无核酸酶水。
5.根据权利要求1所述的一种基于数字PCR平台的miRNA-106b检测试剂盒，其特征在于，所述反转录缓冲液包括dNTPs、5X Buffer、反转录引物、无核酸酶水。
6.根据权利要求1所述的一种基于数字PCR平台的miRNA-106b检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为合成的miRNA-106b双链mimics。
7.根据权利要求2所述的一种基于数字PCR平台的miRNA-106b检测试剂盒，其特征在于，所述反转录引物Pri-RT的浓度为1ug/μl。
8.根据权利要求3所述的一种基于数字PCR平台的miRNA-106b检测试剂盒，其特征在于，所述上游引物Pri-F1、下游引物Pri-R1的浓度为200nM。
9.根据权利要求1～8任一项所述的一种基于数字PCR平台的miRNA-106b检测试剂盒的应用方法，其特征在于，所述的应用方法包括以下步骤：
1)提取miRNA模板；
2)配制反转录缓冲液；
3)进行反转录，得到cDNA模板；
4)配制PCR反应液；
5)配制PCR特异扩增反应体系；
6)将PCR特异扩增反应体系生成微滴；
7)进行数字PCR扩增，并通过软件得到拷贝数。
10.根据权利要求9所述的种基于数字PCR平台的miRNA-106b检测试剂盒的应用方法，其特征在于，所述步骤2)中配制反转录缓冲液的组分为：10mM dNTPs、5X Buffer、1ug/μl反转录引物、反转录酶、无核酸酶水；步骤4)中配制PCR反应液的组分为：PCR反应预混液、10μM上游引物、10μM下游引物、核酸酶水、cDNA模板。
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