CN103952481B - 用于检测等位基因cyp2c19*3的引物组合及检测试剂盒 - Google Patents

用于检测等位基因cyp2c19*3的引物组合及检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于检测等位基因CYP2C19*3的引物组合，所述引物组合包括上游引物p1、下游引物p2、基因延伸引物p3和p4，序列分别如Seq ID No.1‑4所示。本发明还提供含有所述引物组合的检测等位基因CYP2C19*3的试剂盒。本发明基于特异引物延伸和高分辨率熔解曲线的设计思路，可以在不进行特殊扩增后处理的前提下直接进行基因分型。本方法利用荧光染料识别延伸产物进行基因分型，无需使用特殊标记的探针，方法简单，成本低廉，易于在临床中推广。

Description

用于检测等位基因CYP2C19*3的引物组合及检测试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种用于检测等位基因CYP2C19*3的引物组合及检测试剂盒。
背景技术
CYP2C19基因存在多种等位基因，包括*1、*2、*3……*17等。其中，具有正常酶活性的等位基因是CYP2C19*1，而CYP2C19*2和CYP2C19*3等位基因编码的酶无活性。由CYP2C19*2和CYP2C19*3导致的药物慢代谢占东方人慢代谢的99%，因此CYP2C19*2和CYP2C19*3的检测技术日益受到重视。患者如果为*1/*1则属于快代谢型；如果为*1/*2或*1/*3则属于中代谢型；如果为*2*2或*2/*3或*3/*3则属于慢代谢型。通过检测CYP2C19的G681A变异可以鉴定CYP2C19*2等位基因，通过检测CYP2C19的G636A变异可以鉴定CYP2C19*3等位基因。
CYP2C19基因型与个体化用药：
1）CYP2CI9基因型与氯吡格雷抵抗：氯吡格雷（波立维）是目前世界范围内使用最广泛的噻吩吡啶类抗血小板药，用于急性冠脉综合征、冠脉支架术和冠心病的一级、二级预防，可以减少心血管疾病患者心脏病发作、卒中以及死亡的风险。氯吡格雷是一种前体药物，在体外无活性，口服后必须在体内经肝脏细胞色素P450代谢为有效活性产物才能发挥其抗血小板聚集的作用。美国FDA发布警告称，药师可以通过检测CYP2C19的基因型来了解患者波立维的代谢能力，对于波立维慢代谢者可以增加药量或者选用其它抗凝血药物。
2）CYP2C19基因型与苯妥英血药浓度关系：苯妥英(phenytoin，PHT)是临床上常用的抗癫痫药物，具有亲脂性，进入人体后经I相反应进行生物转化后，由肾脏和肝脏排出体外。苯妥英代谢受CYP2C9和CYP2C19基因调控。研究结果显示，CYP2C19*2和CYP2C19*3与苯妥英的代谢缺陷关系密切，是苯妥英的关键代谢酶。检测CYP2C19基因型能够指导苯妥英服用剂量。
3）CYP2C19基因型与奥美拉唑临床疗效相关性：质子泵抑制药(PPIs)体内主要经CYP2C19代谢，其次是CYP3A4代谢。通过对CYP2C19基因型与奥美拉唑临床疗效的研究发现，奥美拉唑合用阿莫西林等抗生素治疗幽门螺旋杆菌感染性消化道溃疡患者，慢代谢和中间代谢患者愈合率明显高于快代谢患者。
4）CYP2C19基因型与伏立康唑：伏立康唑是一种广谱的三唑类抗真菌药，与目前国内市场上的抗真菌药相比，具有高效低毒的特点。伏立康唑通过细胞色素P450同工酶代谢，包括CYP2C19、CYP2C9和CYP3A4。这些酶的抑制剂或诱导剂可以分别增高或降低伏立康唑的血液浓度。伏立康唑进入人体后，快代谢患者与慢代谢患者血液浓度差异显著，慢代谢患者使用常规剂量可能出现毒副反应，此时应考虑减小剂量；快代谢和中间代谢患者应考虑给予常规剂量，根据疗效小幅增、减剂量；给予常规剂量，若快代谢患者出现毒副反应或慢代谢患者疗效不佳时，均应考虑换药。
目前已建立了多种G636A基因分型的方法，分述如下：
1、直接测序法：该方法是基因分型的金标准。但是该方法涉及基因特异扩增和测序反应两个步骤。不但成本高，耗时长，而且由于需要进行扩增后的处理，容易造成样本的污染。不适合在临床开展。
2、焦磷酸测序法：该方法同样是基因分型的金标准，与直接测序法具有相同的缺点。
3、高分辨率熔解曲线法：该方法涉及基因特异扩增和高分辨率熔解曲线分析两个步骤。其中高分辨率熔解曲线分析可以在不进行任何扩增后处理的前提下直接进行，因此方法简单，便宜，易于在临床推广。但由于普通的高分辨率熔解曲线方法不含有特异针对G636A位点的延伸引物或探针，其检测出的突变可能是针对扩增区段中任意位点。因此，特异性远逊于测序方法。
4、PCR-LDR法：该方法涉及基因特异扩增和连接酶检测反应两个步骤，成本高，耗时长，而且由于需要扩增后的特殊处理，容易造成样本的污染。
5、固相芯片法：该方法涉及基因特异扩增、杂交、检测等多个步骤，成本高，耗时长，而且扩增后的处理比较复杂，容易造成样本的污染。
6、等位基因特异扩增法：该方法使用3’端终止于G636A位点的基因特异引物进行扩增，检测扩增产物的荧光信号，判定SNP位点的基因型。该方法操作简单，无需扩增后处理，适合在临床推广。该方法的缺点是由于基因特异引物必须终止于G636A位点，从而造成引物设计无法最优化，导致扩增效率受到影响。因此，在样本DNA量较少或质量不高的情况下，很可能会导致扩增和分型的失败。该方法的另一个缺点是需要使用特殊标记的探针，从而提高了成本。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测等位基因CYP2C19*3的引物组合及检测试剂盒。
为了实现本发明目的，本发明的一种用于检测等位基因CYP2C19*3的引物组合，所述引物组合包括：
上游引物p1：5’-AATTGAATGAAAACATCAGGATTGTAAGCACCC-3’，也可依照CYP2C19基因的碱基序列，在上述碱基序列的基础上增加或减少若干碱基；也可依照CYP2C19基因的碱基序列，在上述碱基序列的上游或下游重新设计其他序列；
下游引物p2：5’-GGTTTCTCAGGAAGCAAAAAACTTG-3’，也可依照CYP2C19基因的碱基序列，在上述碱基序列的基础上增加或减少若干碱基；也可依照CYP2C19基因的碱基序列，在上述碱基序列的上游或下游重新设计其他序列；
基因延伸引物p3：5’-TGGCCTTACCTGGATC-3’，也可依照CYP2C19基因的碱基序列，在上述碱基序列的基础上增加或减少若干碱基；
基因延伸引物p4：5’-TGGCCTTACCTGGATT-3’，也可依照CYP2C19基因的碱基序列，在上述碱基序列的基础上增加或减少若干碱基。
所述基因延伸引物p3和p4的3’端带有修饰，所述修饰包括但不限于硫代修饰、C3封闭、磷酸修饰等。
本发明还提供含有所述引物组合的检测等位基因CYP2C19*3的试剂盒。所述试剂盒还包括dNTPs、高保真DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液、荧光染料等中的至少一种。优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
前述的试剂盒，所述高保真DNA聚合酶包括但不限于DNA聚合酶pfu、phusion、phanta、Kod、Vent等。
前述的试剂盒，所述荧光染料包括但不限于染料LC green、Eva green、Sybrgreen I等。
G636A位点存在三种可能的基因型：GG、AG、AA。本发明通过2个不同的反应对其进行检测。G反应检测是否存在G等位基因，A反应检测是否存在A等位基因。如果单独G反应阳性则证明G636A位点为GG基因型。如果单独A反应阳性则证明G636A位点为AA基因型。如果G和A反应同时阳性则证明G636A位点为AG基因型。
通过明确G636A和G681A位点基因型即可明确受试者的药物代谢类型。基因型与药物代谢类型间的对应关系如表1所示。
表1基因型与药物代谢类型间的对应关系
本发明中针对G636A位点基因分型的设计思路如下：
将待测样本分成两个反应管进行检测。G反应管中包含：待测样本基因组DNA、基因扩增上游引物p1、基因扩增下游引物p2、基因延伸引物p3（该延伸引物的3’端与G636A位点重叠，与G基因型匹配，进行硫代修饰）、荧光染料、高保真DNA合成酶pfu、dNTP、PCR反应缓冲体系。A反应管中包含：待测样本基因组DNA、基因扩增上游引物p1、基因扩增下游引物p2、基因延伸引物p4（该延伸引物的3’端与G636A位点重叠，与A基因型匹配，进行硫代修饰）、荧光染料、高保真DNA合成酶pfu、dNTP、PCR反应缓冲体系。在每个反应管中首先进行聚合酶链反应：利用p1和p2，在高保真酶pfu的催化下，对G636A位点目的区段进行扩增。反应中使用的p1和p2浓度不同，其中p1过量（0.1-1μM），而p2限量（0.01-0.1μM）。因此，通过扩增可以同时产生大量的目的区段双链DNA和目的区段正向单链DNA。由于p3和p4长度远远短于p1和p2，且退火延伸温度较高。扩增过程中p3和p4无法结合于其配对的DNA模板，因此不参与，也不影响扩增反应。扩增反应结束后，G反应管和A反应管无需任何处理，直接在PCR仪上进行引物延伸反应。延伸反应的模板是扩增反应产生的正向单链DNA，延伸反应的催化酶是扩增反应后仍存在活性pfu，延伸反应使用的dNTP和缓冲体系也与扩增体系相同。在G反应管中，延伸引物仅能识别636位为G的正向单链DNA，并生成延伸产物。在A反应管中，延伸引物仅能识别636位为A的正向单链DNA，并生成延伸产物。由于反应体系中存在荧光染料，通过高分辨率熔解曲线方法分析G反应管和A反应管中是否存在延伸峰即可确定G636A位点基因型。
PCR反应体系：
PCR反应程序：采用罗氏480实时定量PCR仪。
94℃3min；94℃30s，57℃30s，72℃30s，共50个循环；72℃3min，37℃3min，60℃1min，95℃30s，40℃1min，63℃1s，84℃持续，其中63℃-84℃为荧光采集区间。
本发明涉及4种基因特异性引物。扩增引物p1和p2均为普通引物。延伸引物p3和p4的3’端带有修饰。修饰可以为硫代修饰、C3封闭、磷酸修饰，也可以是其他保证引物惰性的修饰方式。这种修饰对于引物延伸的特异性极为重要。使用无修饰的延伸引物常常会导致不匹配情况下的非特异延伸，从而出现错误结果。
本发明中使用高保真DNA聚合酶。高保真DNA聚合酶具有3'到5'核酸外切酶的活性，PCR扩增途中如果产生了错配的碱基，它可以将其切掉，从而保证了扩增的准确性。目前市售高保真DNA聚合酶包括pfu、phusion、phanta、Kod、Vent等。高保真酶和修饰引物的配合使用是保证延伸引物严格特异延伸的基础。
本发明采用非对称PCR的方式进行基因扩增，从而同时得到双链基因扩增产物和单链基因扩增产物。其中过量的p1和限量的p2用于特异扩增G636A区段DNA。
本发明中使用荧光染料，目前常用荧光染料包括LC green、Eva green、Sybrgreen I等。
本发明基于高分辨率熔解曲线的设计思路，可以在不进行特殊扩增后处理的前提下直接进行基因分型。本方法利用荧光染料识别延伸产物进行基因分型，无需使用特殊标记的探针，方法简单，成本低，易于在临床中推广。与以往的高分辨率熔解曲线法不同，本发明通过在反应体系中引入基因延伸引物，进行G636A位点的特异延伸，完全避免了误诊情况的出现。
本发明的优点在于：
（一）使用引物延伸技术保证检测精度等同于测序。
（二）引物延伸与基因扩增在同一反应管中进行，降低成本，简化操作，避免污染，适合临床需要。
（三）使用荧光染料检测延伸产物无需复杂仪器，可以通过实时定量PCR仪实现，利于推广。
附图说明
图1为本发明鉴定的CYP2C19*3GG基因型峰图；
图2为本发明鉴定的CYP2C19*3AG基因型峰图；
图3为本发明鉴定的CYP2C19*3AA基因型峰图；
图中：每个图包括上、下两个部分。上部分显示1号反应管，即A反应管，下部分显示2号反应管，即G反应管。其中，左侧箭头指示延伸峰，右侧箭头指示扩增峰。对于样本基因型的判断主要依赖延伸峰的存在与否。同时扩增峰的形状也能够对于延伸峰结果做进一步确证。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例基于高分辨率熔解曲线的等位基因CYP2C19*3的检测方法
1、材料：
上游引物p1：
5’-AATTGAATGAAAACATCAGGATTGTAAGCACCC-3’；
下游引物p2：5’-GGTTTCTCAGGAAGCAAAAAACTTG-3’；
基因延伸引物p3：5’-TGGCCTTACCTGGATC-3’（3’端硫代修饰）
基因延伸引物p4：5’-TGGCCTTACCTGGATT-3’（3’端硫代修饰）
Pfu高保真DNA聚合酶购自天根生化科技有限公司，Sybr green I荧光染料购自Invitrogen公司，采用罗氏480实时定量PCR仪，扩增管：罗氏480实时定量PCR仪配套光敏管。
2、基因组DNA的提取：在进行基因组DNA提取时，比较常规的样本来源包括血液和唾液。常规的提取方法包括盐析法、离心柱法、磁珠法等。本实施例中采用天根生化科技有限公司产品：Tianamp血液基因组DNA提取试剂盒（DP318），按照说明书操作。
3、扩增体系：
4、扩增程序和熔解曲线分析：
如图1所示，G反应管中左侧箭头出现延伸峰，A反应管中左侧箭头未出现延伸峰为直线。说明该样本基因型为GG。右侧箭头所指的扩增峰为细瘦型。
如图2所示，G反应管中左侧箭头出现延伸峰，A反应管中左侧箭头也出现延伸峰。说明该样本基因型为AG。右侧箭头所指的扩增峰为胖型，出现了“大肚子”。
如图3所示，A反应管中左侧箭头出现延伸峰，G反应管中左侧箭头未出现延伸峰为直线。说明该样本基因型为AA。右侧箭头所指的扩增峰为细瘦型。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (1)

1.一种用于非诊断目的检测等位基因CYP2C19*3的方法，其特征在于，将待测样本分成G、A两个反应管进行检测；
G反应管中包含：待测样本基因组DNA、基因扩增上游引物p1、基因扩增下游引物p2、基因延伸引物p3、荧光染料、高保真DNA合成酶pfu、dNTP、PCR反应缓冲体系；
上游引物p1：5’-AATTGAATGAAAACATCAGGATTGTAAGCACCC-3；’
下游引物p2：5’-GGTTTCTCAGGAAGCAAAAAACTTG-3’；
基因延伸引物p3：5’-TGGCCTTACCTGGATC-3’；
基因延伸引物p4：5’-TGGCCTTACCTGGATT-3’；
其中基因延伸引物p3和p4的3’端带有修饰，所述修饰包括硫代修饰、C3封闭、磷酸修饰；
A反应管中包含：待测样本基因组DNA、基因扩增上游引物p1、基因扩增下游引物p2、基因延伸引物p4、荧光染料、高保真DNA合成酶pfu、dNTP、PCR反应缓冲体系；
在每个反应管中首先进行聚合酶链反应：利用引物p1和p2，在高保真酶pfu的催化下，对G636A位点目的区段进行扩增；反应中使用的p1和p2浓度不同，其中p1 0.1-1μM，而p20.01-0.1μM；通过扩增同时产生大量的目的区段双链DNA和目的区段正向单链DNA；由于p3和p4长度远短于p1和p2，且退火延伸温度较高；扩增过程中p3和p4无法结合于其配对的DNA模板，因此不参与，也不影响扩增反应；
扩增反应结束后，G反应管和A反应管无需任何处理，直接在PCR仪上进行引物延伸反应；延伸反应的模板是扩增反应产生到正向单链DNA，延伸反应的催化酶是扩增反应后仍保持活性高保真pfu酶，延伸反应使用的dNTP和缓冲体系也与扩增体系相同；
在G反应管中，延伸引物仅能识别636位为G的正向单链DNA，并生成延伸产物；在A反应管中，延伸引物仅能识别636位为A的正向单链DNA，并生成延伸产物；
由于反应体系中存在荧光染料，通过高分辨率熔解曲线方法分析G反应管和A反应管中是否存在延伸峰即可确定G636A位点基因型；
其中，所述方法中，使用具有3'到5'核酸外切酶的活性的高保真DNA聚合酶，以保证扩增的准确性；
其中，所述方法中使用荧光染料识别延伸产物进行基因分型，从而无需使用特殊标记的探针；
其中，所述方法中，通过在反应体系中引入基因延伸引物，进行G636A位点的特异延伸；
其中，所述方法中，采用非对称PCR的方式进行基因扩增，从而同时得到双链基因扩增产物和单链基因扩增产物；其中过量的p1和限量的p2用于特异扩增G636A区段DNA。
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