CN106906284A - 一种检测CYP2C19基因SNP位点rs4244285基因型的试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种检测CYP2C19基因SNP位点rs4244285基因型的试剂盒及其制备方法，所述试剂盒包括：标准品、引物、含有荧光染料的qPCR扩增试剂；所述标准品为包含CYP2C19 rs4244285(c.681G>A)位点的野生型DNA序列和包含CYP2C19 rs4244285(c.681G>A)位点的纯合突变型DNA序列；所述引物用于扩增标准品和待检测样品。本发明所提供的试剂盒具有灵敏度高，检测速度快，操作简单，耗费低等优点。

Description

一种检测CYP2C19基因SNP位点rs4244285基因型的试剂盒及 其制备方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及CYP2C19基因SNP位点rs4244285基因型的检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
目前已证实CYP2C19不但参与抗癫痫药物的代谢，而且很多的临床重要药物都是它的底物。人类对药物的氧化代谢能力可分为2种表型，一种为强代谢型，另一种为弱代谢型，后者主要是由于CYP2C19*2和CYP2C19*3这两个缺陷型等位基因引起的。由于不同个体存在药物代谢方面的差异，因而给药后可能会出现严重的不良反应或药物剂量不足，从而导致治疗的失败。CYP2C19在体内可催化一系列药物，如S-美芬妥英(S-mephenytoin，S-MP)、奥美拉唑(omeprazole，OPZ)、地西汁(diazepam，DZ)、去甲地西汁(demethyldiazepam)、丙米嗪(imipramine，IMI)、甲苯磺丁脲(tolbutamide，D860)、苯巴比妥(phenobarbital，PB),氯胍(proguanil)和二氯胍(chlorproguanil)等。
CYP2C19*2(rs4244285)是第五外显子第681位的碱基发生变异(G-A)，形成了一个异常的位点，使得转录时在第五外显子的初始段丢失了一个包含SmaI限制性内切酶位点的40碱基对(634-682bp)的片段，从而改变了mRNA的阅读框架，在215位氨基酸下游第20个氨基酸处提前产生一个终止密码，结果使这一截短的含234个氨基酸的蛋白质缺失血红素结合区，从而丧失了催化活性。
高分辨率熔解曲线(high resolution melting,HRM)的分析原理是在常规聚合酶链式反应(PCR)过程中饱和荧光染枓与双链DNA结合，当通过加热升温使DNA双链解离时，荧光染料从局部解链的DNA分子上释放，由于突变、SNP位点双链碱基间不匹配会使双链DNA在此位点首先解开，通过实时监测升温过程中的荧光强度，从荧光强度与时间轴曲线上便可判断是否存在突变或SNP，而且不同位点、杂合子与否、GC含量、扩增子长度等都会影响熔解曲线的峰形。所以，HRM分析能够有效区分不同突变位点、SNP位点和拥有不同GC含量的扩增片段。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种检测CYP2C19基因SNP位点rs4244285基因型的试剂盒。
本发明的第二个目的是为了提供一种上述试剂盒的制备方法。
实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：
一种检测CYP2C19基因SNP位点rs4244285基因型的试剂盒，包括：标准品、引物、含有荧光染料的qPCR扩增试剂；所述标准品为包含CYP2C19rs4244285(c.681G>A)位点的野生型DNA序列和包含CYP2C19rs4244285(c.681G>A)位点的纯合突变型DNA序列；所述引物用于扩增标准品和待检测样品。
优选地，所述野生型DNA序列为序列W；所述纯合突变型DNA序列为序列M。
优选地，所述标准品为连接有序列W的质粒和连接有序列M的质粒。
优选地，所述引物为CYP2C19-F和CYP2C19-R。
优选地，所述含有荧光染料的qPCR扩增试剂为生工生物工程(上海)股份有限公司所产的含EvaGreen的Green-2-Go qPCR Mastermix试剂盒。
本发明还提供所述的检测CYP2C19基因SNP位点rs4244285基因型的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
1)引物设计与合成
根据CYP2C19rs4244285基因序列，应用Primer express 3软件、Primer Premier5软件以及Oligo 7软件，设计一组引物；
2)制备标准品
A、合成含有CYP2C19rs4244285(c.681G>A)位点的野生型DNA序列和纯合突变型DNA序列；
B、将野生型DNA序列和纯合突变型DNA序列分别与质粒连接；将连接后的质粒导入细菌中；培养细菌并且获得阳性克隆；
C、扩大培养步骤B所获得的阳性克隆，提取质粒得到标准品；
3)选购或配制含有荧光染料的qPCR扩增试剂。
优选地，步骤B中所述的质粒为pMD18-T质粒。
优选地，所述野生型DNA序列为序列W；所述纯合突变型DNA序列为序列M。
优选地，步骤B中将序列W或序列M分别与pMD18-T质粒连接，所采用的连接体系为：
SolutionI为来自TaKaRa公司，编号D6020A的产品。
连接的反应时间为10-16小时，反应温度为16℃。
优选地，步骤C的具体操作为将阳性克隆接种于含有氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃220rpm培养14-16h；再从菌体中提取质粒获得标准品。
本发明所述序列W为：
TTAATTTAATAAATTATTGTTTTCTCTTAGATATGCAATAATTTTCCCACTATCATTGATTATTTCCCGGGAACCCATAACAAATTACTTAAAAACCTTGCTTTTATGGAAAGTGATATTTTGGAGAAAGTAAAAGAACACCAAGAATCGATGGACATCAACAACCCTCGGGACTTTATTGATTGCTTCCTGATCAAAAT；其中标有下划线的碱基为基因突变位点；
本发明所述序列M为：
TTAATTTAATAAATTATTGTTTTCTCTTAGATATGCAATAATTTTCCCACTATCATTGATTATTTCCCAGGAACCCATAACAAATTACTTAAAAACCTTGCTTTTATGGAAAGTGATATTTTGGAGAAAGTAAAAGAACACCAAGAATCGATGGACATCAACAACCCTCGGGACTTTATTGATTGCTTCCTGATCAAAAT；其中标有下划线的碱基为基因突变位点。
本发明所述的CYP2C19-F和CYP2C19-R的序列具体为：
CYP2C19-F：5'-TGCAATAATTTTCCCACTATCATT-3'
CYP2C19-R：5'-TGGTGTTCTTTTACTTTCTCCA-3'
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明制备了一种试剂盒，使HRM方法用于鉴定CYP2C19基因SNP位点rs4244285基因型，该试剂盒具有灵敏度高、成本低、操作简单、鉴定速度快的优点。本发明还提供该试剂盒的制备方法，通过控制制备过程的参数使本发明的试剂盒灵敏度更高。
附图说明
图1、本发明试剂盒的灵敏度测试结果图
图2、本发明对基因型的检测结果图
图3、Sanger测序结果图
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：
实施例1：
一种检测CYP2C19基因SNP位点rs4244285基因型的试剂盒，包括：标准品、引物、含有荧光染料的qPCR扩增试剂；
所述标准品为连接有序列W的pMD18-T质粒和连接有序列M的pMD18-T质粒。
所述引物为CYP2C19-F和CYP2C19-R。
所述含有荧光染料的qPCR扩增试剂为生工生物工程(上海)股份有限公司所产的含EvaGreen的Green-2-Go qPCR Mastermix试剂盒。
实施例2
重组野生型和纯合突变型质粒pMD18-T-rs4244285的构建和转化
1、合成序列W和序列M。
2、连接反应：将上述合成的序列W和序列M分别与pMD18-T进行连接，采用如下连接体系进行配制：
SolutionI为来自TaKaRa公司，编号D6020A的产品。
配制完成后置于16℃进行过夜连接反应，获的连接有序列W的质粒和连接有序列M的质粒。
3、pMD18-T-rs4244285质粒的转化以及PCR鉴定
(1)从-80℃的超低温冰箱中取出冻存的DH5α感受态细胞，置于冰盒上使其解冻。
(2)取连接产物(连接有序列W的质粒和连接有序列M的质粒)10μL加入50μL的DH5α感受态细胞中，轻轻摇匀后置冰浴30分钟。
(3)42℃水浴热激90秒，热激后立即置冰上冷却2min。
(4)于1.5ml EP管中加入预冷的1ml的不含抗性的LB液体培养基吹打混匀后，37℃120转轻摇培养90min。
(5)将上述培养液短暂离心吸去900ul后取剩余的100ul涂布于含Amp抗生素的LB平板上，正面向上放置30min，待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿37℃恒温箱培养过夜。
(6)从平板上挑取单克隆菌落于500μL Amp抗性LB液体培养基的1.5ml EP管中，37℃220rpm振荡培养5-6小时。
(7)取1μL作为模板进行菌液PCR鉴定。将鉴定为阳性的菌液加入到20ml的LB液体培养基中进行扩摇获的阳性克隆。
(8)用引物CYP2C19-F和CYP2C19-R扩增上述稀释菌液，PCR产物采用2％琼脂糖凝胶电泳，通过检测PCR产物鉴定阳性转化子。引物序列为HRM分析所用引物，序列如下：
CYP2C19-F：5'-TGCAATAATTTTCCCACTATCATT-3'
CYP2C19-R：5'-TGGTGTTCTTTTACTTTCTCCA-3'
PCR体系如下：
PCR buffer为来自北京百泰克生物技术有限公司的Power Taq DNA聚合酶，货号PR1001。
扩增程序/反应条件：94℃预变性5min；94℃30s、60℃30s、72℃30sec，35个循环；72℃10min。
4、重组阴性和阳性质粒提取：采用北京百泰克公司生产的质粒制备试剂盒提取重组质粒，测定浓度和纯度，同时吸取一部分纯化质粒送至上海生物工程有限公司进行测序，确定插入片段的基因序列与目的序列一致。
实施例3
标准品的获取和定量
(1)将实施例2得到的冻存的含有重组质粒的阳性克隆100ul接种于15ml氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃220rpm培养14-16h；
(2)获的菌体，采用北京百泰克生物科技有限公司生产的质粒制备试剂盒提取重组质粒；
(3)利用北京百泰克生物科技有限公司的超微量紫外可见分光光度计(ND5000)对提取的质粒测定浓度，根据A260/A280判断质粒的纯度。
实施例4
HRM-PCR检测CYP2C19rs4244285方法的建立和灵敏度检测
一、待测样本的制备
提取30例样本的血液基因组DNA，用作CYP2C19基因PCR扩增的模板。血液基因组DNA的提取步骤如下：
(1)取1ml全血，加入3ml TE，颠倒混匀后静置10min，8000rpm离心5分钟，弃上清液；
(2)重复上述步骤2-3次至沉淀为白色；
(3)加入900ul 10％SDS和10ul 10mg/ml蛋白酶K，55℃水浴1h；
(4)将离心管冷却至室温，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混匀，12000rpm离心10min；
(5)小心吸取上清后再加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混匀，12000rpm离心10min；
(6)取上清，加入两倍体积的无水乙醇，上下颠倒混匀，12000rpm离心10min，弃上清；
(7)加500ul 70％的乙醇洗涤沉淀，短暂离心后弃上清，开盖干燥至乙醇完全挥发；
(8)加50ul双蒸水或TE溶解DNA，-20℃保存。
二、特异性引物的设计与合成
本发明通过对NCBI数据库中CYP2C19rs4244285基因序列进行检索，选取适合设计引物的片段序列为靶目标，应用Primer express 3软件、Primer Premier 5软件以及Oligo7软件，设计了一组HRM-PCR引物。
该引物序列如下：
CYP2C19-F：5'-TGCAATAATTTTCCCACTATCATT-3'
CYP2C19-R：5'-TGGTGTTCTTTTACTTTCTCCA-3'
三、HRM-PCR反应体系和反应条件
以DNA为模板，以上述引物CYP2C19-F和CYP2C19-R为扩增引物，采用如下述体系和反应条件进行PCR扩增。
PCR体系：
其中引物采用CYP2C19-F和CYP2C19-R，HRM-PCR采用生工生物(上海)Green-2-GoqPCR Mastermix试剂盒。HRM分析仪为百源基因ASA-9600实时荧光定量PCR仪。
PCR扩增程序：
94℃预变性3min；94℃变性10s；60℃退火/延伸20s。
HRM分析：
94℃ 90s
60℃ 30sec
83-94℃收集数据，温度上升速率为0.06℃/s。
四、HRM灵敏度实验
将重组阳性质粒和重组阴性质粒均稀释至50ng/μl，然后二者混合以重组阳性质粒占比例依次为50％、25％、12.5％、5％、2％和1％进行梯度稀释，按照上述HRM-PCR反应体系和程序进行扩增，分析突变检出范围，即灵敏度。
反应体系如下：
PCR扩增程序：
94℃预变性3min；94℃变性10s；60℃退火/延伸20s
HRM分析：
94℃ 90s
60℃ 30sec
83-94℃收集数据，温度上升速率为0.06℃/s。
结果参照图1，实验数据显示，当阳性质粒与阴性质粒体积比分别为1:1、1:3、1:7、1:19、1:49和1:99时，能检测出阳性质粒，所以本专利所用HRM检测方法的灵敏度为1％。
实施例5
应用本发明的检测方法检测样本CYP2C19rs4244285基因型
以步骤2中的检测条件，对30例样本进行HRM分析，与阳性质粒和阴性质粒熔解曲线对照比较，依此确定样本中的突变类型，并根据HRM分析结果针对每种基因型随机挑选1个样本在生工生物(上海)进行Sanger测序验证。
HRM分析结果参见表1和图2，数据显示30例样本中CYP2C19基因rs4244285为G>A杂合突变型有9例，G>A纯合突变型4例，其余17例为野生型。
Sanger测序结果参见图3：其中a为样本编号8的测序结果，b为样本编号19的测序结果，c为样本编号24的测序结果；Sanger测序结果与本发明方法检测的结果完全一致。
表1、应用本发明对样本CYP2C19基因rs4244285的分析结果
样本编号 基因型 样本编号 基因型
1 野生型 16 野生型
2 野生型 17 野生型
3 野生型 18 杂合突变型
4 纯合突变型 19 杂合突变型
5 杂合突变型 20 纯合突变型
6 杂合突变型 21 野生型
7 野生型 22 野生型
8 野生型 23 杂合突变型
9 纯合突变型 24 纯合突变型
10 野生型 25 野生型
11 杂合突变型 26 杂合突变型
12 野生型 27 野生型
13 杂合突变型 28 野生型
14 杂合突变型 29 野生型
15 野生型 30 野生型
对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测CYP2C19基因SNP位点rs4244285基因型的试剂盒：其特征在于包括：标准品、引物、含有荧光染料的qPCR扩增试剂；所述标准品为包含CYP2C19 rs4244285(c.681G>A)位点的野生型DNA序列和包含CYP2C19 rs4244285(c.681G>A)位点的纯合突变型DNA序列；所述引物用于扩增标准品和待检测样品。
2.根据权利要求1所述的检测CYP2C19基因SNP位点rs4244285基因型的试剂盒，其特征在于：所述野生型DNA序列为序列W；所述纯合突变型DNA序列为序列M。
3.根据权利要求2所述的检测CYP2C19基因SNP位点rs4244285基因型的试剂盒，其特征在于：所述标准品为连接有序列W的质粒和连接有序列M的质粒。
4.根据权利要求2所述的检测CYP2C19基因SNP位点rs4244285基因型的试剂盒，其特征在于：所述引物为CYP2C19-F和CYP2C19-R。
5.根据权利要求1所述的检测CYP2C19基因SNP位点rs4244285基因型的试剂盒，其特征在于：所述含有荧光染料的qPCR扩增试剂为生工生物工程(上海)股份有限公司所产的含EvaGreen的Green-2-Go qPCR Mastermix试剂盒。
6.一种如权利要求1所述的检测CYP2C19基因SNP位点rs4244285基因型的试剂盒的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
1)引物设计与合成
根据CYP2C19 rs4244285基因序列，应用Primer express 3软件、Primer Premier 5软件以及Oligo 7软件，设计一组引物；
2)制备标准品
A、合成含有CYP2C19rs4244285(c.681G>A)位点的野生型DNA序列和纯合突变型DNA序列；
B、将野生型DNA序列和纯合突变型DNA序列分别与质粒连接；将连接后的质粒导入细菌中；培养细菌并且获得阳性克隆；
C、扩大培养步骤B所获得的阳性克隆，提取质粒得到标准品；
3)选购或配制含有荧光染料的qPCR扩增试剂。
7.根据权利要求6所述的检测CYP2C19基因SNP位点rs4244285基因型的试剂盒的制备方法，其特征在于步骤B中所述的质粒为pMD18-T质粒。
8.根据权利要求7所述的检测CYP2C19基因SNP位点rs4244285基因型的试剂盒的制备方法，其特征在于：所述野生型DNA序列为序列W；所述纯合突变型DNA序列为序列M。
9.根据权利要求8所述的检测CYP2C19基因SNP位点rs4244285基因型的试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤B中将序列W或序列M分别与pMD18-T质粒连接，所采用的连接体系为：
连接的反应时间为10-16h，反应温度为16℃。
10.根据权利要求6所述的检测CYP2C19基因SNP位点rs4244285基因型的试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤C的具体操作为将阳性克隆接种于含有氨苄抗性的LB液体培养基中，温度为37℃搅拌速度为220rpm培养14-16h；再从菌体中提取质粒获得标准品。
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LINA ZHANG等: "Comparison of High-Resolution Melting Analysis,TaqMan Allelic Discrimination Assay, and Sanger Sequencing for Clopidogrel Efficacy Genotyping in Routine Molecular Diagnostics", 《THE JOURNAL OF MOLECULAR DIAGNOSTICS》 *
张裕: "氯吡格雷个体化用药相关基因CYP2C19*2质粒标准品的构建", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *
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