CN107488744A

CN107488744A - 用于n9亚型禽流感病毒检测的试剂、检测方法及应用

Info

Publication number: CN107488744A
Application number: CN201710774966.4A
Authority: CN
Inventors: 曹琛福; 秦智锋; 林彦星; 阮周曦; 王潇; 黄超华; 陶虹; 刘建利; 陈兵; 曾少灵; 吕建强; 杨俊兴; 花群义
Original assignee: Shenzhen Graduate School Tsinghua University; Shenzhen Academy of Inspection and Quarantine; Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center of Shenzhen Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Current assignee: Shenzhen Graduate School Tsinghua University; Shenzhen Academy of Inspection and Quarantine; Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center of Shenzhen Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Priority date: 2017-08-31
Filing date: 2017-08-31
Publication date: 2017-12-19

Abstract

本申请公开了一种用于N9亚型禽流感病毒检测的试剂、检测方法及应用。本申请的N9亚型禽流感病毒检测试剂，包括引物对和探针，引物对上下游引物分别为Seq ID No.1和Seq ID No.2所示序列，探针为Seq ID No.3所示序列或者其反向互补序列；SEQ ID No.3所示的探针序列中，第34碱基修饰6‑荧光基团‑dT，第38碱基替换为dSpacer，第39碱基修饰荧光淬灭基团‑dT，3’端修饰C3 Spacer。本申请的试剂，能通过重组酶聚合酶扩增对N9亚型禽流感病毒进行灵敏、特异、高效检测。与现有检测方法相比，本申请的试剂和检测方法，时间短，易操作，可快速得出结论，适于现场检测，对N9亚型禽流感病毒的快速防控具有重大意义。

Description

用于N9亚型禽流感病毒检测的试剂、检测方法及应用

技术领域

本申请涉及N9亚型禽流感病毒检测领域，特别是涉及一种用于N9亚型禽流感病毒检测的试剂、检测方法及应用。

背景技术

禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)属于正黏病毒科、A型流感病毒属，为单股负链RNA，分为8个独立的RNA节段，分别编码HA、NA、NP、NS、MP、PA、PB1和PB2等10个蛋白。AVI显著的生物学特征之一是亚型众多,变异频繁。根据血凝素(Hemagglutinin,HA)与神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)的抗原性不同，可分为16个HA亚型(H1～H16)和9个NA亚型(N1～N9)，不同亚型毒株对宿主的致病力差异很大。2013年3月中国首次出现人感染H7N9亚型流感病例，经过国家禽流感参考实验室证实，此次禽流感疫情由全球首次发现的H7N9新型流感病毒引起，同时证实H7N9亚型禽流感病毒是一种新的重配病毒，能导致人类发生严重或致命的呼吸系统疾病。根据国家卫生计生委疾病预防控制局发布的法定传染病疫情概况，2013年3月至2017年6月，人感染H7N9禽流感发病数累计1445例，死亡数562例，严重威胁人类健康，引起了全世界的关注。其中，仅2017年上半年，人感染H7N9禽流感发病数累计636例，死亡数261例，可见当前H7N9禽流感疫情防控形势严峻。因此，开展N9亚型流感病毒的特异、敏感、快速的检测工作具有重要意义。

发明内容

本申请的目的是提供一种用于N9亚型禽流感病毒检测的试剂、检测方法及应用。

本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了一种用于N9亚型禽流感病毒检测的试剂，该试剂包括引物对和探针，探针在引物对的扩增靶标区域内，引物对的上游引物为Seq ID No.1所示序列，引物对的下游引物为Seq ID No.2所示序列，探针为Seq ID No.3所示序列或者Seq IDNo.3所示序列的反向互补序列；

Seq ID No.1：5’-GCTCTCAGCCAAGGAACAACAATCAGAGGGAAAC-3’

Seq ID No.2：5’-TGCAGATGCATTGTTGTTTGGTCCTGATAT-3’

Seq ID No.3：

5’-CAATACACGATAGGTCCCAGTATCGCGCCCTGATAAGCTGGCCACTA TCATCACC-3’

其中，SEQ ID No.3所示的探针序列中，第34个碱基修饰6-荧光基团-dT，第38个碱基替换为碱基类似物，第39个碱基修饰荧光淬灭基团-dT，3’端修饰C3Spacer。

需要说明的是，本申请的试剂中，引物对和探针是针对N9亚型禽流感病毒设计的，特别用于重组酶聚合酶扩增的引物和探针。重组酶聚合酶扩增，缩写RPA，是英国TwistDx公司开发的一种新型的核酸等温扩增技术；该技术的关键之一是设计合适的扩增引物对和探针。但是，常用的PCR引物对和探针并不适合RPA；常规PCR的引物相对太短、重组效率低；常规的探针系统，与RPA也不兼容。因此，无法通过常规的引物或探针设计软件直接输出适用于RPA的引物对和探针。目前设计RPA引物对和探针，主要根据TwistDx公司网站上提供的筛选指南，例如引物长度一般为30～35bp，引物设计应尽量避免易形成二级结构、引物-引物相互作用、发夹结构，扩增产物不超过500bp，探针长度一般为46-52bp，且在碱基类似物5’端至少有30个碱基等原则，人工设计多条特异性引物和探针进行试验筛选，以获得扩增效率高、灵敏度高、特异性强的引物和探针。本申请的一种实现方式中，针对不同的靶标设计了2条上游引物、2条下游引物和2条探针进行试验筛选，最终筛选出Seq ID No.1所示序列和Seq ID No.2所示序列的引物对和SEQ ID No.3所示序列的探针，作为本申请的N9亚型禽流感病毒检测试剂。

还需要说明的是，RPA的原理是采用三个酶，在恒温下使一对引物对靶标进行指数扩增；本申请的试剂中，考虑到通过荧光检测的方式对RPA扩增产物进行检测，因此，在一对特异性引物的基础上提供了相应的特异性探针。可以理解，RPA扩增产物也可以采用其它方式，例如侧流层析试纸条、生物芯片、凝胶电泳等进行检测；因此，如果不采用荧光检测，则可以不使用SEQ ID No.3所示序列的探针。也就是说，本申请的试剂中，可以单独使用SeqID No.1和Seq ID No.2所示序列的引物，也可以与探针一起使用，具体使用方式可以根据检测条件和环境选择。本申请的一种实现方式中，由于采用便携式的常温等温扩增荧光检测仪，优选的将引物和探针一起使用，通过荧光法对RPA扩增产物进行检测。

优选的，6-荧光基团-dT为6-FAM-dT。

优选的，碱基类似物为dSpacer。

优选的，荧光淬灭基团-dT为BHQ1-dT。

需要说明的是，根据探针的设计原则，只需要在碱基类似物的两端分别修饰荧光基团和荧光淬灭基团即可，本申请的优选方案中，优选的使用FAM荧光基团和BHQ1荧光淬灭基团。可以理解，荧光基团的选择是根据所使用的荧光检测仪的荧光通道进行的，不同的荧光检测仪具有检测一种或多种荧光基团的通道，例如FAM、TET、JOE、HEX、CY3、CY5等；而荧光淬灭基团则是根据荧光基团进行选择的，荧光淬灭基团的吸收光谱只要能够覆盖荧光基团的发射光谱即可，不只限于BHQ1。

优选的，本申请用于N9亚型禽流感病毒检测的试剂中，还包括用于重组酶聚合酶扩增的反应液、酶和反应添加剂。

需要说明的是，本申请的试剂，是特别针对N9亚型禽流感病毒的重组酶聚合酶扩增检测设计的，因此，为了使用方便，试剂中完全可以进一步的包括用于重组酶聚合酶扩增的反应液、酶和反应添加剂。其中，反应液在本申请的一种实现方式中为RehydrationBuffer，酶可以是混合有多种酶的RPA冻干酶粉，反应添加剂在本申请的一种实现方式中采用的是MgAc。

本申请的另一面公开了本申请的用于N9亚型禽流感病毒检测的试剂在N9亚型禽流感病毒检测中的应用。

本申请的另一面公开了本申请的用于N9亚型禽流感病毒检测的试剂在制备N9亚型禽流感病毒检测试剂盒或设备中的应用。

本申请的再一面公开了一种用于N9亚型禽流感病毒检测的试剂盒，该试剂盒中含有本申请的用于N9亚型禽流感病毒检测的试剂。

本申请的再一面公开了一种N9亚型禽流感病毒的检测方法，包括采用本申请的用于N9亚型禽流感病毒检测的试剂，对待测样品的核酸进行重组酶聚合酶扩增检测，并采用荧光检测仪收集荧光。

需要说明的是，本申请的检测方法，通过重组酶聚合酶扩增对N9亚型禽流感病毒进行快速检测，一方面，重组酶聚合酶扩增检测速度快，只需要十几二十分钟就可以完成检测；另一方面，整个检测只需要在相对较低的恒温下就可以完成，例如采用便携式的常温等温扩增荧光检测仪即可。因此，本申请检测方法特别适合于N9亚型禽流感病毒的现场快速检测，为疫病的快速检测和防控提供有力的科学依据。

优选的，重组酶聚合酶扩增的反应条件为，40℃恒温反应20分钟。

需要说明的是，RPA所采用的酶的活性在37℃左右，RPA通常十几分钟或者在十分钟内就可以完成检测；但是，本申请优选的方案中，为了保障检测结果的准确性，优选在40℃恒温反应20分钟。

本申请的有益效果在于：

本申请用于N9亚型禽流感病毒检测的试剂，能够通过重组酶聚合酶扩增，对N9亚型禽流感病毒进行敏感、特异、高效的检测。采用本申请的试剂进行N9亚型禽流感病毒检测，与现有的常规PCR或实时荧光PCR方法相比，本申请的试剂和检测方法，检测时间短，且操作简单方便，可很快做出结果判定，特别适用于现场检测，这对于N9亚型禽流感病毒的快速防控，减少经济损失，最大限度的保障生产安全具有重大意义。

附图说明

图1是本申请实施例中N9亚型禽流感病毒特异性检测结果；

图2是本申请实施例中N9亚型禽流感病毒灵敏度检测结果。

具体实施方式

重组酶聚合酶扩增，缩写RPA，是一种新型的等温核酸扩增技术，该技术主要依赖三种酶：单链DNA结合蛋白(缩写SSB)、重组酶、链置换DNA聚合酶。反应体系中增加反转录酶则可以对RNA模板进行一步法快速扩增。RPA最佳反应温度范围是37℃左右，反应时间少于二十分钟，甚至可以在十分钟内完成反应。引物和探针的设计对于RPA来说至关重要。引物一般为30～35bp，引物设计应尽量避免易形成二级结构、引物-引物相互作用、发夹结构；探针中含有一个碱基类似物，通常是dSpacer或THF，并且在其两侧连接dT-荧光基团和对应的dT-淬灭基团。另外，在3’端连接一个基团，如C3-spacer或磷酸盐，以阻止任何可能的聚合酶延伸探针。RPA中探针的作用原理是，探针与靶标序列退火杂交结合之后，在双链情况下探针的碱基类似物可使DNA修复酶III与之结合，并在该位置处切断探针，使得荧光基团和淬灭基团分离，产生荧光；产生荧光的总量与靶标序列的数量呈正比，从而达到实时监测的效果。并且，实时荧光RPA可在一个便携式的常温等温扩增荧光检测仪上进行，在十几分钟内就可以获得检测结果，极大简化了反应程序，缩短了检测时间。

下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例

一、材料与方法

1.供试核酸

本例实验用模板具体包括H7N9亚型AIV核酸、高致病性H7N9亚型AIV核酸、H1N1亚型AIV核酸、H3N2亚型AIV核酸、H5N1亚型AIV核酸、H6N2亚型AIV核酸、H11N9亚型AIV核酸。本例所用的病毒核酸均由深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心提供和保藏。

2.主要的试剂和仪器

病毒RNA抽提试剂盒MagMAXTM-96Viral RNA Isolation Kit(AM1836)及全自动磁珠提取纯化系统，美国Thermo公司产品。超微量核酸蛋白浓度分析仪，英国BioDrop公司产品。TwistAmp exo RT kit，英国TwistDx公司产品。等温扩增仪T16-ISO，澳大利亚Axxin公司产品。

3.核酸的提取

使用Thermo病毒RNA抽提试剂盒MagMAXTM-96Viral RNA Isolation Kit(AM1836)及磁珠纯化系统提取病毒核酸，BioDrop超微量核酸蛋白浓度分析仪测定核酸浓度。

4.RPA引物和探针的设计与筛选

根据NCBI GenBank中已发表的N9亚型禽流感病毒基因序列，设计了多条特异性的引物探针，通过BLAST比对确定其特异性，然后再用于后续试验筛选，引物和探针具体序列如表1所示。所有的引物和探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 供试引物和探针

表1中，SEQ ID No.3所示序列的N9-450-P1探针中，第34个碱基修饰6-荧光基团-dT，第38个碱基替换为碱基类似物，第39个碱基修饰荧光淬灭基团-dT，3’端修饰C3Spacer。SEQ ID No.5所示序列的N9-450-P2探针中，第38个碱基修饰6-荧光基团-dT，第42个碱基替换为碱基类似物，第43个碱基修饰荧光淬灭基团-dT，3’端修饰C3Spacer。

5.反应体系和反应条件

本例采用TwistAmp exoRT Kit试剂盒进行RPA扩增。

反应体系为50μL。将Rehydration Buffer 29.5μL，两条浓度为10μM的引物各2.1μL，浓度为10μM的探针0.6μL，DEPC水11.2μL，核酸模板2μL混合均匀后加入到RPA冻干酶粉的反应管中，混匀，最后加入浓度为280mM的MgAc溶液2.5μL，混匀。将上述反应管置于等温扩增仪中，40℃反应5分钟，取出混合，再继续反应15分钟，反应过程中实时读取荧光信号。

其中，两条浓度为10μM的引物是指上游引物和下游引物。

6.引物和探针筛选

在筛选的过程中，由于引物的数量比较多，相应RPA探针固定不变，先采用其中一条正向引物，对反向引物进行筛选，然后再根据筛选出来的反向引物，再去筛选正向引物。引物和探针筛选采用“5.反应体系和反应条件”。每条探针筛选出最佳的上下游引物组合后，再采用相同的判断方法，比较不同探针的扩增效果，以获得最佳的N9亚型禽流感病毒检测用引物探针组合。

7.特异性试验

采用筛选的引物和探针组合，按“5.反应体系和反应条件”，对H7N9亚型AIV核酸、高致病性H7N9亚型AIV核酸、H1N1亚型AIV核酸、H3N2亚型AIV核酸、H5N1亚型AIV核酸、H6N2亚型AIV核酸、H11N9亚型AIV核酸模板进行检测。并设置一个空白水对照。

8.敏感性试验

本例将N9亚型AIV核酸按10倍梯度稀释至10^-5，采用各梯度浓度的稀释核酸模板，按“5.反应体系和反应条件”进行RPA试验，试验中设置新城疫病毒(NDV)核酸作为阴性对照，以测试引物探针的敏感性。

9.样品检测

采用本例筛选出的引物和探针，对34份N9亚型流感病毒核酸标准阳性样品，以及113份经测试验证过的阴性样品，按照“5.反应体系和反应条件”进行检测。并设置一个水空白对照。34份阳性样品和113份阴性样品均由深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心提供和保藏。

二、结果和分析

1.引物和探针筛选

经过筛选，本例最终从表1的引物探针中，筛选出Seq ID No.1所示序列的正向引物N9-404-F1、Seq ID No.2所示序列的反向引物N9-620-R1和Seq ID No.3所示序列的探针N9-450-P1，该引物探针组合可用于对N9亚型AIV核酸进行特异性检测。

2.特异性试验结果

特异性检测结果如图1所示，图中，曲线1为H11N9亚型AIV核酸的检测结果、曲线2为高致病性H7N9亚型AIV核酸的检测结果、曲线3为H7N9亚型AIV核酸的检测结果、曲线4-8分别为H1N1亚型AIV核酸、H3N2亚型AIV核酸、H5N1亚型AIV核酸、H6N2亚型AIV核酸和水空白对照的检测结果。可见，N9亚型AIV核酸均出现典型的荧光扩增曲线，呈阳性；而其它病原核酸和水空白对照都没有荧光曲线，呈阴性。因此，本例的引物和探针能对N9亚型AIV核酸进行特异性检测，与H1N1亚型AIV核酸、H3N2亚型AIV核酸、H5N1亚型AIV核酸、H6N2亚型AIV核酸无交叉反应，具有良好的特异性。

3.敏感性试验结果

敏感性检测结果如图2所示，图2中，曲线1、曲线2依序为N9亚型AIV10倍梯度稀释核酸，稀释度分别为10⁰和10^-1，曲线3-6分别为N9亚型AIV稀释度分别为10^-2、10^-3、10^-4和10^-5的10倍梯度稀释核酸。测得所提取N9亚型AIV核酸浓度为0.25μg/mL。可见，本例中RPA最低可以检测到所提取N9亚型AIV核酸10^-1稀释度，对应的核酸浓度为25pg/μL。综上可知，本例的N9亚型AIV检测方法，检测时间短，反应条件简单且无需大型仪器设备，大大提升了检测效率。

4.样品检测结果

样品检测结果显示，采用本例的引物和探针，能够检出34份N9亚型流感病毒核酸阳性样品，113份阴性样品均无扩增曲线出现，检测准确性达100％。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心

深圳市检验检疫科学研究院

清华大学深圳研究生院

<120> 用于N9亚型禽流感病毒检测的试剂、检测方法及应用

<130> 17I24847

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gctctcagcc aaggaacaac aatcagaggg aaac 34

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgcagatgca ttgttgtttg gtcctgatat 30

<210> 3

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

caatacacga taggtcccag tatcgcgccc tgataagctg gccactatca tcacc 55

<210> 4

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gaatgcaggt tctatgctct cagccaagga acaacaatca gagggaaac 49

<210> 5

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggaacaatac acgataggtc ccagtatcgc gccctgataa gctggccact atcatcaccg 60

cccacag 67

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atatcaggac caaacaacaa tgcatctgca 30

Claims

1.一种用于N9亚型禽流感病毒检测的试剂，其特征在于：所述试剂包括引物对和探针，所述探针在引物对的扩增靶标区域内，所述引物对的上游引物为Seq ID No.1所示序列，所述引物对的下游引物为Seq ID No.2所示序列，所述探针为Seq ID No.3所示序列或者SeqID No.3所示序列的反向互补序列；

Seq ID No.1：5’-GCTCTCAGCCAAGGAACAACAATCAGAGGGAAAC-3’Seq ID No.2：5’-TGCAGATGCATTGTTGTTTGGTCCTGATAT-3’

Seq ID No.3：

5’-CAATACACGATAGGTCCCAGTATCGCGCCCTGATAAGCTGGCCACTATCATCACC-3’

2.根据权利要求1所述的用于N9亚型禽流感病毒检测的试剂，其特征在于：所述6-荧光基团-dT为6-FAM-dT。

3.根据权利要求1所述的用于N9亚型禽流感病毒检测的试剂，其特征在于：所述碱基类似物为dSpacer。

4.根据权利要求1所述的用于N9亚型禽流感病毒检测的试剂，其特征在于：所述荧光淬灭基团-dT为BHQ1-dT。

5.根据权利要求1-4任一项所述的用于N9亚型禽流感病毒检测的试剂，其特征在于：还包括用于重组酶聚合酶扩增的反应液、酶和反应添加剂。

6.根据权利要求1-5任一项所述的用于N9亚型禽流感病毒检测的试剂在N9亚型禽流感病毒检测中的应用。

7.根据权利要求1-5任一项所述的用于N9亚型禽流感病毒检测的试剂在制备N9亚型禽流感病毒检测试剂盒或设备中的应用。

8.一种用于N9亚型禽流感病毒检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求1-5任一项所述的用于N9亚型禽流感病毒检测的试剂。

9.一种N9亚型禽流感病毒的检测方法，其特征在于：包括采用权利要求1-5任一项所述的用于N9亚型禽流感病毒检测的试剂，对待测样品的核酸进行重组酶聚合酶扩增检测，并采用荧光检测仪收集荧光。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于：所述重组酶聚合酶扩增的反应条件为，40℃恒温反应20分钟。