CN1777687A - 制备流感疫苗组合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于优化流感病毒制备的方法和组合物，该流感病毒适于用作流感疫苗。

Description

制备流感疫苗组合物的方法
相关申请的交叉参照
本申请要求2003年2月25日提交的题为“制备流感疫苗组合物的方法(METHODS OF PRODUCING INFLUENZA VACCINE COMPOSITIONS)”的第60/450,181号美国临时申请的优先权。这个在先申请已被完整纳入本文作为参考。
发明背景
制备抗不同流感病毒及其进化株的疫苗不仅从公众健康的角度来看是十分重要的，而且还具有巨大的商业利益，因为每年有无数人感染不同株和不同型的流感病毒。婴幼儿、老年人、以及那些未得到适当健康护理和免疫缺陷的人死于这种感染的风险很高。由于流感病毒的感染问题是因为新型流感病毒株易于突变引起的，因此迫切需要不断地研发新的疫苗。
在过去的50年中，能产生抗不同流感病毒的保护性免疫反应的多种疫苗被制备出来，其中包括全病毒疫苗、裂解病毒疫苗、表面抗原疫苗和减毒活病毒疫苗。虽然这些疫苗类型的合适制剂都可以激发系统免疫反应，但是减毒活病毒疫苗具有一些独特的优点，因为这种疫苗还可以在呼吸道内刺激局部粘膜免疫。含减毒活病毒的疫苗还具有制备快速而经济、易于储存和运输的优点，因此是十分适宜的疫苗。
到目前为止，所有上市的流感疫苗都是在含胚鸡蛋内繁殖的。由于鸡蛋的供应必须是有组织的，制备疫苗用的病毒株在下一次流感季节到来之前几个月就要筛选出来，因此这种制备方法的灵活性较低，常常导致疫苗制备和分配的延迟和疫苗短缺。因此，急需找到提高用鸡蛋生产疫苗的效率和/或提高疫苗产量的方法。
最近几年有人开发出用细胞培养物制备流感病毒的系统(见Furminger的“疫苗制备”(Vaccine Production)，摘自Nicholson等编的 《流感病毒教材》 (Textbook of Influenza)第324-332页；Merten等(1996)“在细胞培养物中扩增流感病毒用于疫苗制备”(Production of influenza virus in cell culturesfor vaccine preparation)，摘自Cohen & Shafferman编的 《疫苗设计和制备 新策略》(Novel strategies in Desing and Production of Vaccines)第141-151页)。虽然利用这些方法可以解决用鸡蛋制备流感疫苗所面临的许多困难，但是并不是所有的流感病毒致病株都可以在细胞培养物上良好生长，或者可以用已有的组织培养方法制备。另外，许多具有我们所期望的特性如减毒活性、温敏和冷适应能力的病毒株虽然适于制备减毒活疫苗，但是根据已有的方法培养却不能在组织培养物上成功生长。因此，找到提高用细胞培养物生产疫苗的效率和/或提高疫苗产量的方法也是急需的。
本发明的发明者及其同事在扩增用于疫苗制备的流感病毒方面作了大量的工作。见“制备流感病毒的多质粒系统(Multi-Plasmid system for the Productionof Influenza Virus)”，USSN60/375,675，申请日为2002年4月26日；USSN10/423,828，申请日为2003年4月25日，等等。本发明提供了改善/优化这种用于疫苗组合物制备的病毒以及其他流感病毒生产(从量/质和效率两个方面)的方法。本发明的方法适用于传统的用鸡蛋制备疫苗的模式和新型的用细胞培养物制备疫苗的模式(以及混合系统)，本发明的方法还有其他的多种优点，通过阅读下文就会了解这些优点。
发明概述
本发明提供了一种或多种流感病毒组合物制备方法的实施方式，该方法包括用鸡蛋将流感病毒(如A型病毒株、B型病毒株等)传代、加热病毒以及通过滤膜过滤病毒。在某些实施方式中，过滤是指将组合物通过一个孔径约为0.2μm到0.45μm的微孔滤器。另外，在其他的多个实施方式中，加热温度可以选择为约28℃到约40℃或更高，而在另外一些实施方式中，加热温度为31℃或约30℃到32℃。在这些实施方式中，加热可选择在过滤前或过滤过程中进行，也可以在过滤前和过滤过程中都加热，加热时间可选择约50到100分钟、约60到90分钟、或者约60分钟。本发明还提供了根据这种方法制备的流感病毒组合物(其中包括是疫苗组合物的组合物)。
在其他方面，本发明包括制备一种或多种流感病毒组合物的方法，该方法包括用鸡蛋传代流感病毒、加热病毒和纯化病毒。这些实施方式也可以加上用滤膜过滤组合物的步骤，其中的组合物包括通过这种实施方式制备的疫苗组合物和实际应用的疫苗组合物。
在一些相关的方面，本发明包括通过在鸡蛋内传代流感病毒来制备一种或多种流感病毒组合物的方法，该方法在传代过程中需要摇动鸡蛋。摇动过程可以是以每分钟约一圈的速度转动鸡蛋，可以连续转动约12小时。这种实施方式可以使用A流感病毒株和/或B流感病毒株，其中用这种摇动的鸡蛋制备出的病毒的TCID50可以比用未摇动的鸡蛋制备出的同种病毒的TCID50高出0.4log。用这种实施方式制备出的病毒组合物也是本发明的特征，其中的组合物包括疫苗组合物。
本发明还包括制备一种或多种流感病毒组合物的方法(如偏重于将这些病毒重新分类)，该方法包括将一组含流感病毒基因组的载体导入到一群鸡蛋宿主内(这些鸡蛋可支持病毒的复制)，在低于或等于35℃的温度下孵育鸡蛋，以及收获一批流感病毒。这种病毒还可以包括减毒病毒、冷适应病毒、温度敏感病毒或冷适应的温度敏感减毒病毒，还可以包括B型流感病毒。根据这个实施方式制备出的病毒组合物也是本发明的特征(包括疫苗组合物)。本发明的这些方面还可以包括筛选含野生型HA和NA基因的流感病毒的步骤(如通过将一组病毒与一种或多种非野生型HA和NA基因的特异性抗体共孵育(例如在一个或多个鸡蛋内进行))。根据这种方法制备出的组合物也是本发明的特征，其中包括疫苗组合物。
本发明的其他方面包括制备一种或多种流感病毒组合物的方法，该方法包括将一组含流感病毒基因组的载体导入到一群鸡蛋宿主内(这些鸡蛋可支持病毒的复制)，在低于或等于35℃的温度下孵育鸡蛋，收获一批流感病毒，将这批病毒与一种或多种非野生型HA和NA基因的特异性抗体共孵育，用鸡蛋(这些鸡蛋是摇动的)传代病毒，以及加热病毒和通过滤膜过滤病毒。根据这种方法制备出的组合物也是本发明的特征(其中包括疫苗组合物)。
在本文所提供的各种方法中，流感病毒组合物还可以通过荧光聚焦试验进行分析。这种病毒组合物可以包含约10％到60％的未分馏正常尿囊液(还可以包含约1％到5％的精氨酸)。组合物可以用实质不含正常尿囊液的缓冲液稀释。本文的组合物可以是实质不含明胶的。这些组合物在约2℃到8℃的条件下、或者在4℃的条件下是稳定的。在本文的某些组合物和方法中，病毒是流感病毒，而在本文的另外一些组合物和方法中(如那些包括微孔过滤和/或超声过滤和/或加热和/或摇动的方法)，病毒可以是非流感病毒(例如通过在鸡蛋内培养制备出的病毒，如粘液病毒、副粘液病毒、RSV、流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、Sendi病毒、黄热病毒、pIV等)。本发明的方法和组合物也适用于这些病毒和/或非流感病毒。
在其他一些方面，本发明包括流感病毒组合物，其中的组合物是通过如下步骤制备的：在鸡蛋内传代流感病毒、加热病毒以及通过滤膜过滤病毒，这种组合物具有第一TCID50，这个第一TCID50大于第二TCID50，第二TCID50来自于不是通过如下过程制备的流感病毒：在鸡蛋内传代流感病毒、加热病毒以及通过滤膜过滤病毒。
本发明的其他方面包括流感病毒组合物，其中的组合物是通过如下步骤制备的：在鸡蛋内传代流感病毒，其中鸡蛋在所述的传代过程中摇动，这种组合物具有第一TCID50，这个第一TCID50大于第二TCID50，第二TCID50来自于不是通过如下过程制备的流感病毒：在鸡蛋内传代流感病毒，其中鸡蛋在所述的传代过程中摇动。
本文的其他实施方式包括流感病毒组合物，其中的组合物是通过如下步骤制备的：将一组含流感病毒基因组的载体导入到一群鸡蛋宿主内，这些鸡蛋可支持流感病毒的复制，在低于或等于35℃的温度下孵育鸡蛋，以及收获一批流感病毒，这种组合物具有第一TCID50，这个第一TCID50大于第二TCID50，第二TCID50来自于不是通过如下过程制备的流感病毒：将一组含流感病毒基因组的载体导入到一群鸡蛋宿主内，这些鸡蛋可支持流感病毒的复制，在低于或等于35℃的温度下孵育鸡蛋，以及收获一批流感病毒。
通过阅读下面的详细描述并结合附图就可以更全面地理解本发明的这些目的和特征以及其他目的和特征。
附图简述
图1描述的是在33℃和25℃的条件下感染DEK TC-24后的M基因分型。
图2描述的是噬菌斑试验，图中显示的是在33℃的条件下5∶3和6∶2重配株的不同滴度。
图3描述的是6∶2对5∶3重配株的生长曲线。
图4描述的是MDV-B和野生型B病毒的M1序列。
图5描述的是MDV-B和野生型B病毒的M2序列。
图6描述的是MDVB-M1两个保守位点上的突变。
图7描述的是B/HK 6∶2M1突变株的生长曲线。
图8显示的是以不同MOI感染的各种CEK细胞。
图9显示的是在疫苗制备过程中可能出现微生物污染的流程图。
图10说明的是通过红外线成像技术观察到的各个鸡蛋的温度衰减速率。
图11显示的是活鸡蛋、不孕鸡蛋和死鸡蛋的热成像图。
图12显示的是病毒收获浓缩的流程图。
图13描述的是用NAF蛋白进行第5次洗涤后的比较。
图14描述的是浓缩前N/New Caledonia/20/99 1-X-Neat样品的分析。
图15描述的是A/New Caledonia/20/99 10×浓缩样品的分析。
图16：图A-B：显示的是1×和10×A/New Caledonia/20/99的比较；以及经5次洗涤后的1×-W样品。
图17描述的是A/New Caledonia/20/991×和1×-W样品的比较。
图18：图A-C：描述的是10×和10×-W A/New Caledonia/20/99的比较；A/NewCaledonia/20/99的渗透液；以及经5次洗涤后的A/New Caledonia/20/99。
图19显示的是通过SEC分析比较洗涤的时间和去除的杂质。
图20显示的是1×-W和10×-W A/New Caledonia/20/99的比较。
图21显示的是A/New Caledonia/20/99的96孔板分析。
图22显示的是渗余物和渗透液中神经酰胺酶活性/病毒纯化图。
图23显示的是对照、10×、10×-W和1×-W的RHPLC。
图24显示的是对照、10×、1×-W和10×-W样品的图。
图25显示的是渗透液和洗涤1到6次的RHPLC。
图26显示的是去除卵类黏蛋白的RHPLC图(峰面积)。
图27显示的是去除溶菌酶的RHPLC图(峰面积)。
图28显示的是去除伴清蛋白的RHPLC图(峰面积)。
图29显示的是去除卵清蛋白的RHPLC图(峰面积)。
图30显示的是通过Agilent 2100进行卵清蛋白分析的图。
图31显示的是抗A/New Caledonia抗体的Western印迹SDS-PAGE凝胶图。
图32显示的是10×-W样品、经5次洗涤的A/New Caledonia/20/99样品的分析。
图33显示的是通过RT-PCR进行RNA分析的图。
图34描述的是通过SEC监测A/Beijing病毒在细胞培养物中的繁殖情况。
图35显示的是A/Beijing病毒在Vero细胞内繁殖后收获的细胞培养物。
图36显示的是2升A/Panama细胞培养物的浓缩。
图37显示的是2升B/Hong Kong细胞培养物浓缩到10ml的情况。
图38显示的是典型的病毒储藏制剂稳定性的4个图。
图39显示的是不同病毒株的储藏制剂稳定性的图。
图40显示的是不同病毒株的储藏制剂稳定性的图。
图41：图A-C：含不同浓度柠檬酸盐的病毒储藏制剂的稳定性。
图42：图A-C：含不同浓度EDTA的病毒储藏制剂的稳定性。
图43显示的是不同病毒株的未纯化病毒收获制剂在9个月内的稳定性。
图44说明的是磷酸缓冲液制剂的初始毒力损失。
图45描述的是各种制剂在6个月时的稳定性斜率全图。
图46描述的是各种制剂在6个月时的稳定性斜率全图。
图47描述的是含明胶和PVP/EDTA的各种制剂的稳定性。
图48描述的是含组氨酸的各种制剂在不同pH下的稳定性。
图49描述的是含不同量蔗糖的各种制剂的稳定性。
图50：通过各孔的吸光度值对该值出现的频率(具有该吸光度值的孔数)绘图得到的直方图。
图51：通过吸光度值对该值出现的频率绘图得到的直方图。
图52描述的是制备6∶2流感病毒重配株的通用过程。
发明详述
本发明包括提高病毒和病毒组合物制备效率和产量的方法和组合物，这些病毒和病毒组合物适于疫苗的制备/使用。本发明所包括的方法和组合物可用于在病毒制备、温度调节/过滤、摇动、抗体筛选、毒力分析过程中筛选所需要的重配株，本发明的其他特征将在本文中作详细描述。
本领域的技术人员应该了解本文所描述的各个步骤在同一制备系列中并不要求都要执行或存在。因此，在某些实施方式中本文所描述的所有步骤和/或组合物，都要求执行或存在，如表1所列出的那些步骤和组合物，而在另外一些实施方式中，可以选择性地去掉、改变(规模、顺序、位置等)一个或多个步骤。
本文用于病毒制备的方法和组合物简要概述于表1中。正如自始至终都需要强调的一样，需要再次强调的是，本发明的每个步骤，如表1所列出的那些步骤并不一定要求彼此依存。例如，在某些实施方式中，含适当重配病毒溶液的鸡蛋在孵育期间需要摇动(见下)，而在其他的实施方式中则不需要如此；步骤10中的加热和过滤也不依赖于步骤13中的通用试剂的使用；等等。本发明的任何一个步骤/方法/组合物的存在都不依赖于本发明其他任何步骤/方法/组合物的存在。因此，本发明的不同实施方式可能只包含步骤之一、不同步骤的组合或者所有步骤。
本领域的技术人员还应该理解的是典型的实施方式中包含了本领域熟知的一些步骤/方法/组合物，如照光检查含病毒的鸡蛋、用病毒接种鸡蛋等。因此，本领域的技术人员很容易地就可以为这些熟知的步骤确定合适的条件、分步骤、步骤的细节等以制备出合适的病毒、病毒液、组合物等。各个步骤将在下文作进一步的详细描述。见表1所列的典型实施方式中的主要步骤。
为了便于讨论和描述，本发明的各个步骤，如各种方法和组合物，可以被认为包含在4个大组中。第一组包括这些方面，如共转染、重配、重配株的筛选和重配株的克隆(大致相当于表1的步骤1到步骤3)。第二组包括这些方面，如重配株的纯化和扩增，大致相当于表1中的步骤4到步骤6。第三组包括在鸡蛋中进一步扩增重配株，以及收获和纯化收获的病毒液(大致相当于表1中的步骤7到步骤11)。第四组包括所收获病毒液的稳定化和病毒液的毒力/感染性分析(大致相当于表1中的步骤12到步骤15)。但是，应当理解的是将本发明的方面分为上述四大类只是为了解释/组织的目的，并不意味着各步骤之间是相互依存的。
步骤的详细描述
如上所述，为了便于讨论和描述，本发明的各个步骤可以被认为包含在4个大组中。第一组包括这些方面，如共转染、重配、重配株的筛选和重配株的克隆(大致相当于表1的步骤1到步骤3)。第二组包括这些方面，如重配株的纯化和扩增，大致相当于表1中的步骤4到步骤6。第三组包括在鸡蛋中进一步扩增重配株，以及收获和纯化收获的病毒液(大致相当于表1中的步骤7到步骤11)。第四组包括所收获病毒液的稳定化和病毒液的毒力/感染性分析(大致相当于表1中的步骤12到步骤15)。但是，需要强调的是将本发明的方面分为上述四大类只是为了解释/组织的目的，并不意味着各步骤之间是相互依存的。
第一组
在本文中被大致分类为第一组的本发明的方面包括与优化细胞系共转染相关的方法和组合物，如利用主供体病毒和一种或多种野生型病毒优化细胞系的转染以制备出特别适宜的重配病毒；适宜重配病毒的筛选；以及筛选出的重配病毒的克隆。流感病毒株的重配方法是本领域技术人员所熟知的。曾在细胞培养物和鸡蛋中重配A型流感病毒和B型流感病毒以制备重配的病毒株。见Tannock等，“A/Leningrad/134/17/57供体病毒株来源的冷适应性减毒A型流感病毒重配株的制备和特征”(Preparation and characterisation of attenuated cold-adapted influenzaA reassortants derived from the donor strain)， Vaccine(2002)20：2082-2090。流感病毒株的重配过程已经用质粒构建的方法表示出来，见“用于流感病毒制备的多质粒系统”，引用文献同上。
简单地说，重配一般包括不同病毒来源的基因片段的混合(如在鸡蛋内或细胞培养物内)。例如，典型的8片段B型流感病毒就可以通过如含有目的表位的野生型病毒株和“供体”病毒株如冷适应病毒株混合而成。因此两个类型的病毒之间的重配可以产生出含有一个片段编码野生型表位而另一个片段编码冷适应性的病毒。但是不幸的是，制备出预期的重配株有时需要进行大量的重配。重配以后还需要筛选病毒(如，找到需要的重配株)。然后将预期的重配株克隆(如数量上的扩增)。因此，急需找到降低重配株构建的时间和提高制备出预期重配株的效率的方法。
优化、筛选和克隆所需要的B型流感病毒重配株的传统方法一般是通过将病毒株共转染到细胞培养物(如CEK细胞)内，然后用适当的抗体筛选，如抗亲本病毒之一的抗体(通常在鸡蛋内进行)，再进行病毒的克隆或扩增等，病毒的克隆或扩增一般在细胞培养物内进行。但是，这种传统的重配方法存在一些缺点，因为需要进行数千次重配才能使所需要的片段组合在一起。当进行这种重配时，很明显真正的随机重配并不是我们所需要的最终结果。换言之，偏向过程的压力存在于该系统中。但是对于A型流感病毒来说，该过程未显示出这种偏向。对于A型病毒株来说，病毒株共转染(一般转染到细胞培养物内，如CEK细胞)后同时进行筛选和克隆，同样也是在细胞培养物内进行。
因此如本文所详细描述的，本发明的许多实施方式都包括降低重配偏向的步骤。也就是说，重配株的克隆是在鸡蛋内(如在33℃)而不是在细胞系内进行，或者在细胞系内进行，但是温度是25℃。
重配的优化
本发明利用第一组的步骤来优化重配过程以减少所需的重配次数(以及因此可以提高疫苗制备过程的效率)。利用这种优化技术的步骤一般适用于B型流感病毒株的重配，通常是在细胞培养物如CEK细胞内进行。
重配流感病毒的其他方法是将主供体病毒(MDV)和野生型病毒的稀释液混合，如不论每种溶液的浓度是多少都按1∶5进行稀释，然后在25℃和33℃的条件下分别孵育24和48小时。但是，这种方法通常只适用于A型流感病毒株，而对于B型流感病毒株来说利用这种方法常常得不到阳性的结果。例如，为了达到正确的6∶2的分配(即MDV的6个基因和野生型病毒的2个基因NA和HA)，常常需要进行数千次重配。
因此，本发明第一组步骤的典型实施方式包括确定MDV和野生型病毒株的MOI(感染复数)(特别适用于B型流感病毒株)，然后进行表2中所列的那些重配步骤。这种优化的重配混合物在鸡蛋内33℃孵育24小时。在类似于这样的实施方式中，通过筛选数百个重配混合物就可以得到正确的6∶2的重配，而在非优化系统中则需要筛选数千个重配混合物。
重配的筛选和克隆
第一组的步骤还包括重配的流感病毒的筛选。本发明的方法和组合物特别适用于(通常用于)筛选正确的重配的B型流感病毒。重配的A型流感病毒株可在细胞培养物(如CEK细胞)内筛选，也可以在鸡蛋内筛选。但是，当在细胞培养物内重配时(如在CEK细胞内筛选时)，重配的B型流感病毒株就会出现问题。研究认为这是因为CEK细胞会干扰B型流感病毒的M基因，因此会降低病毒的总产量。见下。本发明注意到了这种抑制作用，因此在某些实施方式中筛选B型流感病毒重配株是在33℃的鸡蛋内进行的(鸡蛋可中和抗B型流感病毒株M基因的筛选压力)，或者在CEK细胞内、25℃进行。见图52。
第一组中的本发明实施方式包括在筛选过程中使用抗HA(MDV的)和抗NA(MDV的)抗血清，这样就可以达到较强的筛选效果。
第一组的本发明的其他实施方式还包括所制备的重配株的克隆。正如通过上面的讨论所了解到的，在CEK细胞培养物内克隆B型流感病毒重配株被证明是有问题的，因为存在负筛选压力。因此在本文的某些实施方式中，B型流感病毒株的重配株是用鸡蛋在33℃的条件下进行的。另一方面，A型流感病毒株的重配株可以在CEK细胞培养物内同时克隆和筛选。
虽然本文的某些实施方式利用了鸡蛋对重配没有偏向或没有压力的优点(见上)，但是本文的其他实施方式也利用细胞培养物进行重配株的筛选/克隆，但是是在25℃下进行的。因此，本发明的某些方面包括的实施方式利用了MDVB(B型主供体病毒)M基因和B型野生型病毒M基因的不同特性。例如，可以选择进行6∶2和5∶3共转染来制备目的重配株。因此在B/HongKong/330/01MVS的制备过程中，通过有限稀释从CEK细胞内、33℃克隆混合的野生型和冷适应性M基因的病毒RNA所得到的主要是野生型M基因的病毒RNA。在鸡蛋和CEK细胞内，当6∶2重配株和5∶3重配株(含野生型M基因)在33℃共转染细胞时，野生型M基因vRNA相对于MDV来源的M基因vRNA是占优势的，尽管在鸡蛋内得到野生型M基因的vRNA的几率更高。但是，当6∶2重配株和5∶3重配株在25℃共转染CEK细胞时，MDV来源的M基因的vRNA和野生型M基因的vRNA大致相同。因此，在本文的某些实施方式中，MVS过程中从CEK细胞内克隆6∶2重配株时所用的温度是25℃。见图1到图8。从图中可以看到，噬菌斑试验的结果表明，在33℃时，6∶2重配的B型病毒的滴度至少比5∶3重配株低2个数量级，而在25℃时二者的生长处于同一水平。6∶2重配株在33℃的条件下出现生长缺陷可以解释在MVS CEK克隆过程中6∶2重配株所受到的筛选压力。MDVB和6∶2重配株的不同生长特性说明HA和NA参与形成了M基因的优势地位。MDVB和野生型B病毒之间只有两个保守氨基酸是不同的。6∶2M1基因上的缬氨酸单个突变成野生型保守的蛋氨酸就可以反转6∶2重配株在33℃、CEK细胞内的生长缺陷。
重配株的特征
本发明还有一些实施方式利用高通量的单链构象多态性/毛细管电泳(SSCP/CE)技术来确定本文所用的流感病毒基因的排列方式。应当理解的是这些特征也可以归类到本文的其他“组”，但是在此处讨论只是为了便于组织的目的。流感病毒含有8个基因，如上所述，两种不同的流感病毒株共转染一个细胞可以产生出具有不同于任何一个亲本病毒的新型基因排列的重配株。因此，本文的某些实施方式利用SSCP/CE技术来快速地确定大量流感病毒样本的基因片段的排列方式。还可以利用8个片段特异性的荧光标记引物通过TR-PCR来扩增流感病毒的基因片段。见Arvin等，(2000) J.Clin.Micro.38(2)：839-845，本文已纳入作为参考。
为了减少分型流感病毒所有8个片段所需要的RT-PCR反应的次数，可以选择复合反应从而可以在一次反应中同时扩增出多个片段。每个片段的RT-PCR产物的长度、迁移模式和荧光颜色都是不同的。单链DNA片段在非变性基质上的迁移模式不仅是由其长度决定的，也是由其序列组成决定的。
细胞可以用冷适应性的B/Ann Arbor/1/66(MOV-ES)或相似的病毒共转染，也可以用几种B型野生型流感病毒中的一种转染。共转染后繁殖的病毒通过有限稀释方法克隆出来，核酸通过复合反应来扩增。选择引物并在18℃的条件下通过SSCP/CE分离产物，可以提高MDVB和野生型病毒株8个基因片段的分辨效率。
例如，为了证明SSCP/CE的精确度，从大约50株不同的重配株中挑选400个基因片段来进行SSCP/CE分析，所得到的结果与限制性片段长度多态性(RFLP)的分析结果相比较。结果发现两组数据之间具有高度的一致性(约98％)，从而证明了SSCP/CE技术的可靠性。另外，SSCP/CE技术还能用于检测B型流感病毒M基因上的单个核苷酸替代。
细菌污染的预防
本发明的某些实施方式包含检测和/或预防/检测用于制备流感病毒的鸡蛋发生微生物污染的步骤。这些步骤可用于表1所列的几个领域，第一组、第二组和第三组都包括，但是为了文章组织的目的只把这些步骤列在第一组中。本发明的微生物检测方法可用于微生物的快速/高通量检测，因此和本文的许多其他步骤一样，可以提高病毒/疫苗制备的效率。
本发明的许多流感病毒制备策略，包括本发明的某些实施方式，利用在无特殊病原的含胚鸡蛋内扩增流感病毒的传统方法作为本发明的一部分。用鸡蛋制备流感病毒的过程中有几个点可能会发生微生物污染。见图9，该图列出了一个病毒制备流程图的例子以及可能发生污染的环节。但是不幸的是，在鸡蛋的外壳上就可能有某些微生物存在，这也是其天然菌群的一部分。在鸡胚发育过程中也有可能有微生物被包裹到鸡蛋壳内。为了使鸡蛋发育成胚胎需要将受精鸡蛋置于37℃、高湿度的环境下孵育，但这也为多种微生物的繁殖提供了适宜的条件。微生物污染的另外一种可能发生在穿刺蛋壳进行接种时。虽然在接种前常常在鸡蛋上喷洒酒精，但是微生物依然有机会进入鸡蛋内。
病毒在鸡蛋内扩增2到3天后，通常要去掉蛋壳的顶部以便于收集鸡蛋内含病毒的尿囊液。这是发生微生物污染的另一个点。不幸的是发生这种污染的鸡蛋往往会逃脱过检测，这样就迫使我们在采集尿囊液时需要将液体装到多个容器内以使由于MPA试验失败而造成整批样品被污染的几率降到最低。因为用于疫苗制备的流感病毒株通常有三种，因此需要将三株病毒混合形成最后的接种液。在混合和添加前的病毒收获环节(见图9)需要进行MPA(微生物纯度检测)试验以确保产物无微生物污染。
孵育以后可以用传统的照光法来鉴定不孕的鸡蛋和死鸡蛋，这些死鸡蛋可能是由于自然的原因，也可能是由于微生物污染引起的(如，由于病毒的感染和/或微生物的扩增引起的鸡蛋死亡，这种鸡蛋必须要加以检测并剔除之)。照光检查是指在暗室内将鸡蛋置于光源前观察发育的胚胎。死鸡蛋不能用于病毒接种。
从上面几点可以看出，在制备流感病毒的过程中有多个步骤需要检测微生物的污染。需要去除或减少家禽的微生物和环境微生物，也要去除或减少引入的环境微生物和人的微生物。因此需要找到一种无损伤而且快速的鸡蛋筛选方法以便于鉴别和剔除不孕的、死的或污染微生物的鸡蛋。这种方法最好是非创伤性的，而且是快速的。目前用于检测微生物污染的方法包括简便方法(MPA和Bioburden)。目前所用的方法有接种前/后对鸡蛋进行照光检查(使用这种方法一般每人每小时可检查约500个鸡蛋)；MPA试验和BioBurden试验，MPA试验一般约进行14天，BioBurden试验一般约进行3天(在病毒收获时进行)；支原体检查，一般约进行28天(病毒收获时进行)；分支杆菌检测，一般进行约56天(在收获病毒时进行)。由此看来是有机会显著缩短传统方法的完成时间的。新方法最好能够将获得结果的时间缩短到数天到24小时或更短(工序中的检测时间最后能在4小时或更短的时间内完成)放行检测的时间缩短到数周到数天。其他需要改进的地方包括减少中间环节占用时间/库存时间、加快出货速度以及减少成本/劳动力/管理费用。总之，不论选择何种方法来检测微生物污染都应该考虑如下因素：科学上的要求，如用途、获得结果所需要的时间、样品的类型、设备的容量等；法规要求，如FDA的指导原则(如FDA要求生物负荷量试验必须作为活微生物总量的一个检测指标)、回顾、预期/可接受性；顺应性要求，如售主核查(vendor audits)、售主支持(vendor support)(IOPQ或可通过仪器观察的透视质量)、软件的可靠性和文件；以及商业要求如产业的发展趋势、制造成本、每次试验的成本等。
存在于本发明各实施方式中的检测微生物污染的几种潜在替代方法列于表3中。其中一种替代鸡蛋照光检查的方法和本发明的一个实施方式是病毒接种前/后的热成像技术。在这些实施方式中，用红外摄像机捕获孵育鸡蛋所发出的红外线。利用软件将捕获的图像转换成鸡蛋的温度读数。摄像机能够分辨出小于或等于0.01℃的温度差异。代谢活跃的正在发育的胚胎热量丢失的速度要慢于未受精鸡蛋或死胚胎，因此就会出现较大的温度差异。例如，可以设计一种病毒接种前/后的热成像试验来代替鸡蛋照光检查，捕获一盘鸡蛋的热成像图像(将一红外摄像机置于一盘鸡蛋的下方(如有底孔的托盘))。然后利用软件分析每个鸡蛋的底部温度(或者侧面温度、顶部温度等)。每个鸡蛋的温度衰减速率就可以计算出来，据此就可以显示出问题鸡蛋的最大温度差异。通过这种热成像技术就可以了解活胚胎和未受精鸡蛋及死鸡蛋之间的温度差异。见图10和图11。
在本文的另外一些实施方式中，本发明利用另外一种方法来代替病毒收获时进行的生物负荷量检测，这种方法被称为MPN或最大几率数检测，该方法的根据是 《细 菌学在线分析手册》(Bacteriological Analytical Manual Online)，2001年1月附录2的 “系列稀释的最大几率数”(Most Probable Number from Serial Dilutions)， FDA/CFSA-BAM。例如，一次MPN试验可进行3个重复的96孔板试验，其中在一个96孔板上就可以进行一系列的10倍稀释(如1∶10、1∶100、1∶1K、1∶10K、1∶100K、1∶1000K)，每个稀释度设3个复孔，带阴性对照。TSB作为稀释液和浓缩培养基在开始时就加到每个孔中以支持微生物的生长。肉眼观察培养板或在600nm处检测。对于微生物污染的检测来说，MPN生物负荷量试验与膜过滤试验相比更加实用。膜过滤试验需要15个TSA板(3个样品)，所需要的样品量要大，耗费的时间和精力很多，很难自动化，样品只能进行1∶10和1∶100的稀释，而96孔板MPN试验只需要一个96孔板(3个样品)，所需要的样品量少，只需几个简单的一次性耗材和试剂，稀释范围从1∶10到1∶100,000，结果可用肉眼观察，也可用96孔板记录仪自动读数。利用常规的生物负荷量检测方法和96孔板MPN试验分别进行了70个样品的检测，结果发现两个试验所得到的结果完全一致。值得注意的是，为了其应用目的，96孔板MPN提供了较高通量的可比较结果。
在本发明的某些实施方式中，利用广泛应用的商业化的标准核酸快速扩增试剂盒(如PCR)来代替用于病毒收获时检测支原体的传统简明方法。目前所用的简明方法(直接的和间接的)可以检测所有可能产生污染的株(包括鸟类的滑液霉形体和败血霉形体，人的肺炎支原体，即鸟类和人的所有分支杆菌株)。可替代简明方法的PCR检测方法包括研究者开发的用于实时PCR的引物/探针对，可特异性地检测一组支原体，根据靶基因如结核杆菌和非结核性分支杆菌(如脓肿分支杆菌和鸟型分支杆菌)的序列同源性(如16s和/或23s rRNA上的属和/或种特异性序列)能够检测的物种可能超过40种。本文的某些实施方式利用了可快速检测结核杆菌和非结核性分支杆菌等的标准核酸扩增试剂盒。
第二组
包含在第二组中的本发明的某些方面包括相当于表1所列的步骤4到步骤6。经过正确的重配过程并且将重配株(如6∶2重配病毒)克隆出来以后，这些重配病毒需要在含胚鸡蛋内进行进一步纯化，正确的克隆需要被扩增(通过在鸡蛋内的生长)以制备主病毒株(MVS)或主病毒种子，这种种子再进一步扩增形成主工作病毒株(MWVS)或生产者的工组病毒种子。从鸡蛋内纯化病毒颗粒和利用这种纯化的病毒接种更多的鸡蛋以扩大病毒颗粒的量的许多方法都是本领域技术人员所熟知的。许多这样的技术在目前病毒颗粒的制备中是很常用的，并且已经应用了至少40年。见Reimer等，“利用带状超离心技术纯化流感病毒” Science1966，152：1379-81。例如，常用的纯化方法包括蔗糖梯度超离心(如10-40％的蔗糖)等。如本文所强调的，列在其他组中的其他方法也可以存在于第二组中，如防止微生物的污染等。
第三组
包含在第三组中的本发明的某些方面包括表1所列的步骤7到步骤11。这些步骤主要用于调整含胚鸡蛋的孵育条件(如，在病毒感染鸡蛋孵育过程中的特殊处理和环境条件)以及从鸡蛋的尿囊液中收集和澄清流感病毒。
例如，本发明包括选择、洗涤、照光和孵育含用于疫苗制备的重配病毒的鸡蛋；这种鸡蛋的接种、加封等；照光检查这种鸡蛋；从鸡蛋内收获病毒液(即尿囊液)；以及病毒液的澄清。还应当强调的是，适用于第二组步骤的几种技术同样也适用于第三组的步骤(如照光检查等)。包含在第三组中的本发明的几个方面是本领域技术人员所熟知的。在病毒制备过程中照光检查鸡蛋以及用病毒接种鸡蛋和洗涤、孵育鸡蛋的各个方面都是用鸡蛋制备病毒/疫苗中熟知的技术。当然，这些熟知的技术与本发明的独特技术和创新技术结合使用将是更好的。
摇动
培养某些类型的流感病毒株(特别是B型流感病毒株如Victoria/504/2000)的一个缺陷是在鸡蛋内培养时无法获得和其他病毒株一样高的病毒滴度。例如，如果第一株病毒(如A型流感病毒株)制备的滴度达到108或109log(即每毫升含108或109病毒颗粒)，而第二株病毒(如B型流感病毒株)制备的滴度只能达到每毫升107病毒颗粒，那么必须用更多的鸡蛋来培养第二株病毒，或者把第一株病毒储存起来等待第二株病毒的制备。
因此，本发明的一个方面是摇动或温和转动孵育病毒的鸡蛋(即鸡蛋接种病毒以后)。应当强调的是用于摇动鸡蛋的装置不受限制。例如，可在晃动平台或摇动平台上摇动鸡蛋(如用于孵育细菌培养瓶的摇床、鸡蛋孵育器等)。在某些实施方式中，摇动鸡蛋的速度约为每分钟1圈或1圈以下到2圈或2圈以上。在这里“圈”应当理解为鸡蛋完成一个全范围活动的过程。在另外的实施方式中，摇动鸡蛋的速度约为每分钟0.5圈或0.5圈以下到5圈或5圈以上。在某些实施方式中，鸡蛋每分钟摇动1圈。当第三组的孵育步骤(即接种后)也加上摇动时，B-Victoria流感病毒株的滴度可以高出未摇动的对照鸡蛋0.4log。
过滤和加温
本发明第三组的另一个方面是测定在无菌过滤(一般通过0.2μm的滤膜)过程中病毒尿囊液(VAF)对病毒毒力丢失的影响。在本发明的不同实施方式中，从尿囊液中收集病毒颗粒以后都要经过加温尿囊液然后过滤尿囊液的过程。见表1的步骤10到11。只所以需要这些步骤有几个理由。例如，如本文所指出的，疫苗制剂中存在尿囊液和碎片可能导致变态反应。另外更重要的是过滤可除去溶液中的生物负荷(细菌)。所有含生物负荷的VH(病毒收获物)液必须丢弃。但是减毒活病毒疫苗用于鼻内时却不需如此。因此，本发明过滤和澄清减毒活病毒以除去和/或减少这种生物负荷的步骤是十分必要的。
本文的一个实施例描述的是以可接受的毒力损失通过无菌梯级滤膜过滤冷适应性(ca)病毒株(如A/Sydney/05/97，H3N2型)所需要的病毒尿囊液(VAF)温度和加热时间的影响。可接受的过滤A/Sydney/05/97的条件以及在相同的条件下过滤其他5株冷适应性流感病毒(即：2×H1N1、1×H3N2、2×B)所得到的结果在此进行了描述。
三个独立的试验(TCID50、神经酰胺酶检测和血凝素试验)用于在过滤全过程中分析病毒尿囊液的特征。所得到的数据表明，对于A/Sydney/05/97来说，过滤过程中加上加温步骤(过滤前31±3℃加温，最长可加温60分钟)与无加温步骤的无菌梯级过滤相比，可使毒力损失降低到可接受的水平(0-0.3log10TCID50)。在另外的实施方式中，加温所用温度可选择28℃以上，或者28到36℃，加温时间至少30分钟，而在其他实施方式中，加温时间可以达到约60到240分钟。应当了解的是，虽然加温步骤确实可以持续相当长的一段时间，但是经过较长时间的加温以后，在此较高温度下因病毒稳定性下降而导致的毒力损失就可能达到可测量的水平，并且是有害的。添加加温步骤对于所检测的其他病毒株来说在试验期间不会导致毒力的额外损失，说明对于冷适应性流感病毒(CAIV)的无菌梯级过滤来说加温步骤是可以接受的处理步骤。
如本文所描述，目前的FluMistTM制备过程利用含胚鸡蛋扩增主病毒种子(MVS)、厂家的工作病毒种子(MWVS)和病毒收获物(VH)。见表1的步骤6。种子和病毒收获物可能含有生物负荷(一般是细菌污染物)，这些生物负荷可能会引起种子或病毒产物无法用于疫苗制备。通过上述试验来评价含病毒尿囊液的过滤效果证明在制备过程中加上过滤步骤可减少生物负荷。但是，根据以前的研究工作我们发现对于特定的病毒株来说(如A/Sydney/05/97)这种过滤方法是有问题的。基于这些研究结果，我们为过滤装置设计了新的操作方法，包括将一个无菌塑料介质袋连接到前滤膜上，将一个0.2毫米的无菌梯级滤膜与各种填充、分配和加样线(见下)相结合。当然，应当理解的是，除非特别说明，对所使用的特定产品的类型、尺寸等的罗列或描述都不能被认为是对本发明的限制。
从这些试验中可以看出，大多数进行检测的冷适应性(ca)病毒株被过滤后的毒力损失都很小，虽然以Sartorius Sartoclean CA前滤膜加上Sartorius Sartopore2作为无菌梯级滤膜。但是，利用A/Sydney/05/97进行过滤试验的结果却是导致毒力损失在0.7到1.4log10TCID50/mL之间。其他的研究表明这种损失发生在透过Sartorius Sartopore 2无菌梯级滤膜时。另外，还应该注意的是其他品牌和/或类型的滤膜也可用于此步骤中，特定的滤膜名称/类型不应看作是对本发明的限制。
下面第一组试验的目的在于测定过滤过程中VAF温度对病毒毒力损失的影响。试验的第二部分用于确定过滤前加温VAF的合适时间。冷适应性的(ca)A/Sydney/05/97病毒(H3N2型)作为模型株来确定加温的条件，因为正如上面所描述的，该株病毒在过滤过程中有较大的毒力损失。
本实施例的第三部分用于评价加温病毒尿囊液(VAF)对其他几株单价病毒的因过滤引起的毒力损失的影响。本试验包括5株CAIV(2×H1N1、1×H3N2和2×B)。所有试验都以CAIV种子规模(MVS和MWVS)进行，使用1.0-3.0L蔗糖磷酸盐谷氨酸盐(SPG)稳定的VAF和相应规模的滤器，即去除检测样品前的推荐最大VH处理规模的1∶30到1∶10。一般的处理规模可以达到每个过滤装置约33L经稳定的VH。这种体积的液体一般用带50L袋的过滤装置就可以完成。用标准的10”过滤囊过滤这个体积的液体具有相当大的安全边缘。但是，对于开发/研究工作来说这个体积太大了，因此所用的是1/10th规模的过滤(即约3L)。
用于此加温/过滤步骤的病毒的繁殖可按照本领域常用的方法和/或本领域的其他方法进行(见上文和下文)，所用的病毒株为表4所列的冷适应性(ca)流感病毒株。
试验各个阶段的样品都要通过操作试验(见下面有关其他TCID50测定方法的描述)测定组织培养感染剂量(TCID50)以分析其毒力。神经酰胺酶活性(NA)和血凝素活性(HA)也要测定。
通过Sartorius Sartoclean CA/Sartorius Sartopore 2复合滤膜进行一系列过滤以评价过滤前的VAF温度对毒力(TCID50/mL)、神经酰胺酶活性(NA)和血凝素活性(HA)丢失的影响。
在收获病毒期间，将VAF置于1L PETG瓶内，收集到所需体积的未稳定化的VAF以后进行过滤。此阶段未稳定化的VAF的温度是15±3℃。总的加温时间定义为VAF处于33±10℃水浴中的时间，包括升温时间(从15±3℃升到28±3℃)和保温时间(温度高于28℃，即设定温度的时间)。
第一部分的VAF温度影响试验(见下)用的是冷适应性(ca)A/Sydney/05/97病毒株(H3N2型)。本实施例的第二部分主要用于确定最佳的保温时间(“在此温度下的持续时间”)。在第三部分中测定了通过上述试验确定的保温时间对5株其他病毒(表5)的影响。在实施例的各个部分中，1.0-3.0L蔗糖磷酸盐谷氨酸盐(SPG)稳定的VAF通过过滤装置进行过滤，该体积是典型的病毒种子规模，约等于推荐mVH处理规模的1∶30到1∶10。
目前常用的制备过程是VH收获以后进行离心、稳定化、冷冻，以便于下一步的运输。在这些实施例中，从未经稳定的样品中取出一部分VAF进行离心，然后用SPG稳定，经目前常用的制备过程处理，作为本实施例所有部分中经过滤的VAF的对照。
第一部分：温度对过滤过程中A/Svdnev/05/97病毒滴度改变的影响
为了确定温度对毒力损失的影响，进行了两组在不同温度下的过滤试验。每组都包括3个平行试验，用同一批鸡蛋收集的VAF在同一天进行。在这些试验中，VAF收集后用SPG稳定，然后分为三份，在过滤前分别于5±3℃(冰箱)、20±3℃(工作台上)和31±3℃(水浴)放置60分钟。在此期间，瓶内的VAF每10分钟颠倒混合一次。保温完成以后用Sartoclean CA和Sartopore 2滤器过滤。在对照试验中，VAF只进行离心稳定化处理。不同条件下所得到的TCID50值互相比较并与对照组比较。
为了确定VAF温度对毒力损失的影响，VAF在过滤前分别于5±3℃、20±3℃和31±3℃放置60分钟。经离心、稳定化处理的样品和经不同温度处理的过滤后样品的毒力变化、神经酰胺酶活性和血凝素活性差异列在表5-10中。从表中可以看出，经冷处理(5±3℃)和室温处理(20±3℃)的VAF经过滤后的毒力损失在0.7到1.0log10TCID50/rnL(见表5和表8)。但是当VAF在31±3℃保温60分钟(升温时间30分钟，在设定温度保温30分钟)后再过滤则其滴度无明显下降(与经离心、稳定化处理的VAF相比)。见表5和表8。另外，当VAF升温到31±3℃后与经冷处理和室温处理的样品相比，经过滤后的神经酰胺酶活性要高。见表6和表9。加上加温步骤也可以减少血凝素活性的损失。见表7和表10。
第二部分：确定A/Svdney/05/97经过滤后毒力损失达到可接受的水平所需要 的加温时间
为了确定所需的加温时间，过滤前在31±3℃水浴中加温VAF，然后进行一系列试验。在对照试验中，VAF用SPG稳定后立即过滤。在所有试验中，加温时间定义为VAF处于水浴(即31±3℃)中的总时间(升温时间加上保温时间)。瓶内的VAF每10分钟颠倒混合一次。保温完成以后用Sartoclean CA和Sartopore 2滤器过滤。在对照试验中，VAF只进行离心稳定化处理，这代表了目前常规的制备过程。不同条件下所得到的TCID50值互相比较并与对照组比较。
为了确定过滤ca A/Sydney/05/97前所需要的加温时间进行了一系列试验，其中VAF在过滤前加温到31±3℃，一组试验分别保持30、90和180分钟，另一组试验分别保持30、60和90分钟。在对照试验中，VAF在用SPG稳定后不经加温直接过滤。经过滤的VAF和对照组的病毒毒力、神经酰胺酶活性和血凝素活性列于表11-16中。
试验结果表明VAF保温于31±3℃可降低过滤后的病毒毒力损失，并且可部分恢复神经酰胺酶和血凝素的活性。见表11-13。在试验开始时(收获后、加温前)未进行稳定化处理的VAF的温度是15±2℃。1-1.5L VAF加温到31±3℃所需要的时间大约为20-30分钟。因此，30分钟的VAF总加温时间中在31±3℃的保温时间为0-10分钟。
使过滤导致的毒力损失降到最低所需要的最短加温时间由第二个系列的试验确定。见表14-16(第一组)和表17-19(重复试验)。测定0和30分钟总加温试验中的过滤后毒力损失、HA和NA下降水平。在60分钟和90分钟总加温时间(31±3℃下的保温时间分别为30-40分钟和60-70分钟)试验中，过滤后病毒的毒力、HA和NA水平与对照样品(只经过离心和稳定化的VAF)相同。见表14-19。
第三部分：加温对其他病毒株的影响
利用A/Sydney/05/97以外的其他5株病毒，即2×H1N1、1×H3N2和2×B进行一系列试验以评价加温步骤对A/Sydney/05/97之外的其他病毒株过滤的影响。VAF在过滤前加温到31±3℃，持续60分钟(升温时间30分钟，保温时间30分钟)。经加温处理以后，用Sartoclean CA和Sartopore 2滤器过滤。在对照试验中，VAF在室温下用SPG稳定后马上过滤。不同条件下所得到的TCID50值互相比较并与对照组比较。
对于所检测的5株其他冷适应性流感病毒来说，与不经加温处理的样品相比，短时间(总加温时间为60分钟)置于31±3℃(在设定的温度下保温30-40分钟)可使A/Sydney/05/97和B/Victoria/504/2000经过滤后的毒力损失减少，但是对于其他病毒株的毒力没有影响。这些试验所测得的毒力(TCID50/mL)、神经酰胺酶活性和血凝素活性总结在下面的表20-25中。
从表中可以看出，在用Sartoclean CA前滤膜和Sartopore 2无菌梯级滤膜过滤前通过本发明的方法将稳定化的病毒收获物加温到31±3℃、甚至到36℃(1-1.5L VAF置于瓶中，保温60-90分钟)所导致的A/Sydney/05/97毒力下降水平(0-0.3log10TCID50/ml)是可以接受的。在对照试验中，稳定化的A/Sydney/05/97病毒收获物不经加温就进行过滤，其毒力损失可达1.0log10TCID50/ml。
从这些表中还可以看出，所检测的所有6株冷适应性流感病毒短时间(升温和保温时间共60分钟)置于31±3℃(在31±3℃保温30-40分钟)或者可以使过滤过程中的毒力损失降低，或者对过滤过程中额外的毒力损失没有影响。在所有的试验中，过滤后的滴度下降都不超过0.3log TCID50/ml。与未加温的样品相比，加温的VAF经过滤后的病毒表面蛋白(神经酰胺酶和血凝素)的活性损失减少，这个结果支持TCID50试验所得到的毒力损失数据。
因此，这些数据表明本发明包含过滤CAIV(MVS、MWVS或VH)所需的加温时间的某些实施方式中，经60分钟加温(将VAF升温到31±3℃的时间和保温时间(处于设定温度的时间)至少30分钟)后再过滤所导致的毒力损失是可以接受的。这种对加温的耐受性是未预料到的新结果，特别是与其他过滤方法相比时。见上。另外，应当强调的是含加温/过滤步骤的本发明的实施方式并不受上述实施例的限制。换言之，只要不偏离本发明的精神，也可以选择其他的过滤装置和过滤方法。
第四组
本发明的第四组包括表1中的步骤12-15。这些步骤主要涉及含病毒液体的稳定化(通过添加组分、改变缓冲液/NAF比例等)和毒力/无菌分析。在某些实施方式中，含活病毒的病毒溶液/疫苗是以液体形式稳定存在的，在4℃条件下保持稳定性的时间足以保证在整个流感病毒免疫季节(在北半球一般是指9月到4月)能以液体的形式储存(如冷藏在4℃的条件下销售和分销等)。因此，病毒/疫苗组合物需要在储存期内保持其毒力，或者毒力即使下降也是以可接受的速率下降。例如，如果可接受的毒力损失是0.3log，储存期是9个月，那么毒力以每月0.05log的速率下降是可以接受的。另外，使用FFA可使可接受的毒力损失幅度更大。例如，如果毒力损失允许到0.75log，那么低于或等于每月0.09log的毒力下降速率就足以保证置于冰箱内(如4℃)的材料的稳定性。在其他实施方式中，这种以液体形式存在的溶液/疫苗在约2℃到8℃的条件下是稳定的。在另外的实施方式中，溶液/疫苗在室温下是稳定的。由于用NAF稀释(见下)，本文的典型实施方式不会出现免疫原性的下降(或者微小幅度的下降)。
病毒收获物的浓缩/渗滤
在本文的某些实施方式中，病毒收获物还可以选择用适当的柱子浓缩。流感病毒溶液被浓缩后可以达到不出现明显的病毒毒力/活性的损失。这种不出现毒力损失的浓缩是很令人惊奇的，因为以前的研究表面浓缩会导致毒力的下降。病毒的浓缩可在纯化/制备过程的很多点上进行，如表1所描述的，其目的在于提高病毒颗粒的浓度并去除其他蛋白、RNA等。例如，浓缩可在毒力分析前、甚至毒力分析后进行，但是在许多实施方式中是在第四组的步骤内/步骤间进行。病毒颗粒浓缩液可用于纯化、疫苗制备和特征分析。见《病毒学方法和技术》(Methods andTechniques in Virology)，Pierre Payment和Michel Trudel，Marcel Dekker，Inc.，(1993)。由于某些VAF样品内的病毒量可能很少，因此某些分析技术如分析超离心(AUC)、圆盘式离心、衬质辅助激光解吸与电离(MALDI)、颗粒计数等就无法用于病毒颗粒的直接分析。
以前从鸡蛋NAF等中浓缩病毒的传统方法是通过梯度纯化离心技术进行的。见“从尿囊液中浓缩和纯化流感病毒”Arora等， 《分析生物化学》(Analytical Biochemistry)，144：189-192(1985)。但是本文的实施方式用的是尺寸排斥色谱柱。不论是通过鸡蛋制备方法、细胞培养物制备方法(如Vero细胞)还是质粒回收制备方法等制备的病毒都可以被浓缩。另外，不同的病毒和/或病毒株(如A型流感病毒和B型流感病毒都适用此处理方法)以及同一病毒株的不同批次都可进行浓缩以确保产物的质量。另外，通过尺寸排斥色谱柱进行的浓缩常常作为检测鸡蛋等的收获物内病毒颗粒量的指标。因此，峰面积(从色谱柱上洗脱下来的病毒的峰面积)可替代这种溶液的TCID50值，或者作为TCID50值之外的一个指标。这种指标特别适用于用鸡蛋制备的病毒。另外，浓缩和纯化的病毒材料还可以作为制备纯的HA、NA和其他病毒成分的起始材料用于进一步的研究。还有就是SEC纯化的病毒使我们可以更好地了解病毒的结构及其与宿主细胞的结合机制。由于在大多数VAF(病毒尿囊液)材料中病毒颗粒的量都低于UV的检测下限，因此病毒的浓缩对进一步了解病毒的特征是很有帮助的。
在病毒收获物的浓缩过程中，尺寸排斥色谱柱如带加压的中空纤维过滤器的MidGee或QuixStand(Amersham)可用于去除杂质和/或不想要的缓冲液/液体。因此浓缩的病毒还可以很容易地被悬浮或储存在特殊的缓冲液/稳定剂中。见下。
为了说明病毒收获物样品的浓缩过程，浓缩和分析通过交叉流动过滤VAF得到的A/New Caledonia流感病毒收获物。当然，需要再次强调的是本部分的技术并不限定只能用于特定的病毒株/特定类型的病毒。这种浓缩方法可浓缩病毒颗粒、去除大部分的杂质，并且能保持病毒的感染性。如本文所描述，病毒的感染性通过CELISA(TCID50)来检测。血凝素活性通过HA试验来测定，神经酰胺酶活性通过SEC试验来测定，NAF通过RHPLC来检测，RNA通过RT-PCR来检测。
下面实施例中病毒的浓缩是利用Amersham的Cross Flow Filtration UnitMidGee来完成的。MidGee在2-3小时内可将100或200ml的溶液浓缩到10ml。同样，利用QuixStand可在4到6小时内将病毒颗粒从2L浓缩到100ml。病毒的浓缩不仅可以提高病毒颗粒计数，而且可以去除大部分杂质如鸡蛋蛋白、RNA和小分子物质如尿酸。
用于下述实施例的病毒是A/New Caledonia/20/99。NAF含有冷适应性的流感病毒。鸡血来自Colorado Serum公司(Denver，CO)。浓缩用的设备来自AmershamBiosciences(A/G Technology Corporation)和一个带蠕动泵的MidJet系统(Watson Marlowe)。浓缩用的色谱柱来自Amersham Biosciences(A/G TechnologyCorporation)，是一个额定截留分子量为750,000的MidGee Hoop Cross FlowFilter。但是，需要再次强调的是使用或引用特定模式、特定厂家等的设备并不意味着对本发明的限制。本实施例所用的洗涤缓冲液是1×-SPG。
SEC所用的设备是Heweltt Packard HP 1100HPLC系统，色谱柱是Waters的Ultrahydrogel 1000，尺寸为7.8×300mm。SEC所用的缓冲液是Hyclone Solvent的Dulbecco磷酸缓冲盐水，方法中包括的等位条件为流速0.5ml/min，在210和280nm处监测。RHPLC所用设备来自Waters，色谱柱是YMC C4(反向)，2.1×250mm，5um，300A。RHPLC的方法是：流动相-A：0.1％TFA水溶液；B：95％CAN 0.09％TFA；洗脱条件-梯度变量，13-100％B；流速：0.2ml/min；柱温，45℃；加样体积-50μl；检测波长-214nm。
如图12所示，步骤1是在室温下用MidJet设备浓缩150ml A/NewCaledonia/20/99。出入口之间的压力维持在5到10PSI之间。通过交叉滤膜循环2小时以后，150ml 1×的样品减少为15ml 10×的浓缩样品(步骤2)。分别收集渗透出的液体储存起来作进一步的分析。进行特征分析时去掉4ml 10×的样品(步骤3)。剩余的11ml 10×的样品用1×的SPG稀释到110ml，然后通过渗透去除1×的SPG使其再浓缩到11ml。渗透出的液体携带了回流液的大部分杂质。如步骤4和步骤5所示，此步骤用1×的SPG重复5次。经洗涤的渗透液储存起来作进一步分析。第一次和第二次的洗涤液呈黄色。这是因为去除鸡蛋蛋白和其他小分子杂质造成的。经第三次和第四次洗涤后渗透液的黄色消失。经第五次洗涤以后，样品用1×-SPG稀释到110ml使其浓度变回1×。在步骤6中，保存10ml1×-W用于分析。剩余的100ml 1×-W进一步浓缩成1×-W(步骤7)。这个浓缩的样品分装成1ml的小管用于进一步的分析。
利用SEC色谱技术分析所有的样品。色谱柱为Ultrphydrogel 100，溶剂为DPBS。即使采集了220、260、280nm处的数据，为了讨论还需要比较220nm处的峰面积。色谱峰主要分为三大类：一种是病毒的(滞留时间约为10.6min)，一种是第一组杂质的(滞留时间为18到21min)，一种是第二组杂质的(滞留时间为21到27min)。三种NAF蛋白-卵清蛋白、伴清蛋白和卵类黏蛋白约在18-21min时被洗脱。见图13。溶菌酶的洗脱时间约为27.0min。我们认为第二组的杂质由小分子如尿酸和其他未知的分子组成。所有洗脱下来的液体都以和病毒分析相同的条件用分析SEC色谱法进行检测。分组进行CELISA、HA试验、NA试验和RT-PCR。
SEC分析和CELISA
1×的样品在11.1分钟时出现病毒峰，峰面积为1221。见图14。而浓缩的10×样品的峰面积为11192，见图15，与1×的样品相比峰面积增加约9.16倍。见表26，11192/1221。这是根据以前的试验证明峰面积与注射的病毒样品量成线性关系而计算出来的。在浓缩过程中，如果不进行洗涤，虽然某些杂质可以被去除，但是并不明显。见表26、图16a-b。从峰面积上看，10×样品内的第一组和第二组的杂质与1×的样品相比是增加的(表26)。相应的，TCID50从log 9.1升高到log10.0(表27)。经过此步骤，95.9％的感染性得以保留。这些结果说明1×的样品浓缩成10×的样品可以完好地保留其感染性。
用1×-SPG进行第五次洗涤以后，样品1×-W的病毒峰面积为1005，而洗涤前的病毒峰面积是1221(表26)。按照峰面积计算，1×和1×-W之间的回收率约为82％(1005/1221)。通过比较1×和1×-W的色谱图(见图17)，可以发现第一组和第二组杂质显著减少(表26)。1×-W的TCID50值有一个小的降低(表27，1×：9.1，1×-W：log 8.9)。1×和1×-W之间的感染性回收率约为98.99％(log8.9/log 9.1)。洗涤步骤通过去除NAF蛋白和其他成分提高了病毒材料的质量。
同样，通过比较10×和10×-W发现第一组和第二组的杂质大部分被去除(表26、图18)。经过5次洗涤以后，10×的病毒峰面积为11,192，而10×-W的峰面积则降低到10,282(表26，按峰面积计回收率为91.86％)。TCID50从log10.0(10×)降低到log 9.9(10×-W)，回收率为99.56％(表27)。
通过比较1×-W和10×-W的色谱图发现峰面积增加了10倍。见表26，1×-W的峰面积为1005，10×-W的峰面积为10,282。TCID50值也增加了1个log(表27，1×-W：log 8.9，10×-W：log 9.9)。通过一个步骤将1×-W浓缩成10×-W，无论从活性来看还是从峰面积来看都没有损失(10×-W的峰面积为10282，1×-W的峰面积为1005)。
渗透液的检测结果表明在10.4min时出现一个病毒峰，峰面积为25。这可能是由于很少量的病毒颗粒丢失造成的，或者是某些其他蛋白与1×样品内的病毒一起被洗脱出来造成的。第一组和第二组的大部分杂质被洗脱出来。见表26。CELISA值表明其感染性低于检测的下限。这说明在浓缩过程中没有多少病毒颗粒能够通过膜被洗脱出来。
经过5次洗涤可去除第一组和第二组的大部分杂质，因而提高了病毒的质量。这一点可从表26和图19中看出来。经过第二次洗涤以后第一组和第二组的大部分杂质显著减少。经过第五次洗涤以后，曲线达到平台期。但是，即使经过第五次洗涤，样品1×-W和10×-W内仍然含有极少量的第一组和第二组杂质。见图20。峰在19.208min时的一致性通过从10×-W样品中分离的卵清蛋白得到确证。SDS-PAGE也证明了这个结果。
HA分析
样品1×和1×-W的HAU为1024。见图21。浓缩的但没有经洗涤的10×的HAU为8192。但是，10×-W在HAU 2和4处出现假阴性结果，这可能是与鸡RBC相比病毒量很大造成的。大量的神经酰胺酶可反转血凝素试验的结果。见《病毒培养、检测和遗传》(Virus cultivation，Detection，and Genetics)，S.J.Flint，L.W.Enquist，R.M.Krug，V.R.Racaniello和A.M.Skalka，“病毒学原理”(Principles of Virology)，ASM Press，Washington，34页，(2000)。渗透液内没有HAU的存在说明在步骤1内洗脱的病毒不多。见图12。
NA分析
神经酰胺酶活性分析结果表明10×稀释回1×后的活性与1×相比下降。见图22。这被认为是由于VAF内游离的NA蛋白丢失引起的。渗透液内含有少量的NA也支持这一解释。样品1×-W和由10×-W稀释成的1×-W的活性处于同一水平。这是因为样品10×-W是由1×-W直接浓缩而成的。所有洗涤液的活性都处于检测下限以下。
RHPLC
通过RHPLC分析鸡蛋蛋白已经找到了最佳的条件，因此，本实施例的所有材料都用相同的条件进行分析，如C4色谱柱、0.1％TFA/乙睛梯度、214nm处监测。卵类黏蛋白、溶菌酶、伴清蛋白和卵清蛋白的洗脱模式见图23所示。在洗涤前10×样品含有所有的鸡蛋蛋白。这与对照样品的滞留时间相匹配。10×还显示出含有未知的病毒蛋白峰，分别标记为U1、U2和U3。完全洗涤的样品10×-W和1×-W依然保留了病毒蛋白U1、U2和U3。由于这些蛋白的比例是相同的，因此这些蛋白可能来自与乙睛接触时的病毒颗粒。但是，用1×-SPG洗涤5次以后10×样品内的卵类黏蛋白、溶菌酶和伴清蛋白被完全去除。与此相对应，大多数可见的蛋白峰都是卵清蛋白，它还能随10×-W和1×-W样品一起被洗脱出来。即使10×-W和1×-W被洗涤6次和5次，还有与病毒结合的卵清蛋白。这可能是由于HA蛋白与卵清蛋白之间有较强的相互作用造成的。这些数据以柱形图的形式显示在图24中。
用RHPLC检测渗透液和所有的洗出液。见图25。渗透液含有所有种类的NAF蛋白和其他未知峰。卵类黏蛋白经两次洗涤后可被除去(见图26)；溶菌酶经两次洗涤后也可被除去(见图27)；伴清蛋白经两次洗涤后也可被除去(见图28)；卵清蛋白逐渐耗竭，但是经6次洗涤后依然有约5％的剩余。见图29。
Agilent Bioanalyzer
同时我们用Agilent Bioanalyzer评估卵清蛋白的量，如图30所示。样品从1×浓缩到10×，只通过浓缩无需洗涤就可以将其中相当数量的卵清蛋白去除。第一渗透液携带大部分的卵清蛋白，RHPLC结果显示所有洗涤液中都含有卵清蛋白，但是用Bioanalyzer分析时其浓度却在检测限以下。10×-W样品和1×-W样品，检测结果表明还是含有少量的卵清蛋白。从这些数据中可以看出通过浓缩和洗涤步骤可以去除95％的鸡蛋蛋白。
SDS-PAGE和蛋白印迹杂交
1×(2道)，10×(9道)样品含有多个颜色较深的银染条带。见图31。与10×样品相比，10×-W(10道)的条带数较少。这是因为去除了NAF蛋白和其他杂质。同样，1×-W(8道)比1×干净。样品1×、10×稀释成的1×(3道)和10×W稀释成的1×-W(4道)含有相同数量的病毒，只是杂质去除程度有不同程度的提高。显然10×-W稀释成的1×-W含有更清楚的病毒蛋白条带。但是这个样品依然含有卵清蛋白条带，与6道的NAF相似。10×-W样品通过分析SEC色谱柱进一步纯化，收集组分。见图32。19.1min时收集的组分通过SDS-PAGE分析，结果发现这个组分含有大部分的卵清蛋白(5道)。这一点通过抗NAF的蛋白印迹杂交试验得到进一步证实。这些结果表明即使经过6次洗涤，卵清蛋白依然能够与病毒紧密结合。切下抗NAF凝胶，与鸡抗A/New Caledonia抗体杂交，可以观察到代表病毒蛋白HA0和HA1或M蛋白的不同条带。见图31。
RTPCR
RTPCR结果表明10×样品扩增出的RNA比1×样品高一个数量级。见图33。同样，10×-W样品扩增出的RNA也比1×-W高10倍。这说明浓缩步骤可以保留大部分病毒。渗透液内未检测到病毒RNA，但是1×-SPG洗出液含有极少量的RNA，这可能是由于循环过程中少量病毒被剪切造成的，或者是在洗涤循环中某些病毒RNA与滤膜结合释放较晚造成的。
总之，利用交叉流动过滤装置可以达到浓缩A/New Caledonia/20/99的目的。在此过程中病毒颗粒的感染性得以保持，这点可被CELISA试验证实。用1×-SPG洗涤浓缩的材料可去除其他杂质，改善样品的质量。即使经过第五次洗涤依然有少量的卵清蛋白与病毒紧密结合，这可能是由于卵清蛋白与HA或NA蛋白之间的强相互作用造成的。RHPLC、SDS-PAGE和蛋白印迹杂交结果支持这一蛋白-蛋白相互作用的观点。原始和浓缩样品之间RNA量的提高说明通过此过程可回收大部分病毒。
其他相似的技术也可用于分析细胞培养物制备的病毒样品，例如在细胞如Vero细胞内生长的流感病毒样品。为了说明这一点，用Vero细胞培养3株病毒，分别是A/Beijing(A/H1N1)；A/Panama(A/H3N2)从2L浓缩成100ml或20×；以及B/Hong Kong从2L浓缩成10ml或200×。应当了解的是，由于Vero细胞产生的病毒量一般很低，因此本部分实施方式还适用于浓缩病毒样品。与上面所描述的一样，Amersham MidGee和QuixStand Instrument可用于病毒浓缩。
图34-35显示了A/Beijing细胞培养物病毒扩增情况(图34)和A/BeijingVero细胞收获物(图35)的SEC监测结果。从中可以看出SEC是短期监测病毒扩增情况的有效技术。这种监测所需要的样品量一般很少(如100μl)。图36显示的是2L A/Panama细胞培养物样品的浓缩情况。用QuixStand将2L病毒收获物浓缩成100ml。见上。1×混合物的TCID50检测不到，但是20×混合物的TCID50为4.4。这是20×对1×的峰面积比。Panama细胞培养物样品的浓缩结果说明了交叉流动过滤方法的优点，如病毒颗粒浓度可有效提高，低分子量的杂质可被从溶液中去除以及可进行渗滤以进一步“清洁”溶液。图37显示的是2LB/Hong Kong Vero细胞培养物浓缩成10ml的情况。1×的log10TCID50/ml是4.7，而18.8×的log10TCID50/ml是5.8(理论值是5.95)，200×的log10TCID50/ml是6.95(理论值是7.00)。
从上面的图中可以看出，SEC是一种有用的监测细胞培养物中病毒生长的技术；可用于分析经浓缩后的极低滴度的病毒；也可用于分析经浓缩后的低滴度病毒。
稳定剂/缓冲液
本发明包括病毒溶液组合物和制备该组合物的方法。这种组合物还可以包含各种稀释液用于稀释含目的病毒的NAF(一般是指未分离的NAF)以及蔗糖、精氨酸、明胶、EDTA等的混合物，如本文所详细描述的。如本文所指出的，各种组合物含有10％到60％的NAF。NAF可能含有各种酶如核酸酶、溶菌酶等，这些酶可破坏病毒组合物的稳定性。这些方法和组合物在特定的温度(如一般为4℃、5℃、8℃，约2℃到8℃或高于2℃等)下在所选定的时间段(一般至少6个月、至少9个月、至少12个月、至少15个月、至少18个月、至少24个月等)内最好是稳定的(即，不会出现不可接受的毒力损失)。优选的实施方式显示在预定储存期内毒力是没有损失的。其他的实施方式显示毒力的损失低于10％、5％、4％、3％、2％或1％。本文的病毒组合物的毒力可用FFU或荧光聚焦单位(见下文关于FFA分析的描述)表示。靶FFU一般根据0时间点时的病毒浓度来设定(如，由于NAF的稀释等)。因此，优选的实施方式应该是起始值降低很少或没有降低。在本文的许多组合物中，病毒溶液含有约5％到10％的蔗糖、约1％到4％的精氨酸和约1％到4％的明胶。某些优选的实施方式含有约7％-10％的蔗糖、约2％的精氨酸和约2％的明胶。在某些实施方式中，在预定温度下将病毒制剂储存以后需要用FluMist_的涂布/喷洒(applicator/accuspray)装置或其他类似装置测定组合物的稳定性。
在某些实施方式中，本发明包括含稳定剂如精氨酸(pH约为7.0-7.2)的组合物，其中的稳定剂与明胶一起使用，或者替代明胶或者明胶相关的和/或来源的产物(如明胶水解物)。见表1的步骤12和15。但是，目前的法规考虑到动物和动物来源的产品如明胶、胶原等可能造成非故意的污染(如引入朊病毒、支原体或宿主病毒的问题)，以及考虑到动物来源的产物可能会产生变态反应，因此需要使用非动物性稳定剂。精氨酸单独使用或者和其他赋形剂如金属离子螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA)和/或其盐)或其他氨基酸(如组氨酸和/或其盐)一起使用能够稳定含非动物性赋形剂的冷适应性流感病毒制剂。
在许多实施方式中，精氨酸还可以包含无机酸盐或有机酸盐。当然，盐一般是指药用盐，因为药用盐可用作疫苗的组分。通常优选的盐包括盐酸盐、柠檬酸盐和硫酸盐。这类稳定剂的使用量并无特殊限制，但是一般的用量范围为1ml病毒溶液约含5mg到60mg。优选用量约为1ml病毒溶液含10mg到50mg，更优选的用量约为1ml病毒溶液含10mg到25mg。在其他实施方式中，精氨酸用量约为病毒溶液的1％；1.5％；2％；3％；4％到5％。本发明的不同实施方式稳定剂的用量是不同的。在本发明的另外一些实施方式中，病毒溶液/疫苗溶液还可以包含磷酸钾。在某些实施方式中，溶液含有约11mM的磷酸钾。在另外一些实施方式中，溶液含有约10mM到12mM的磷酸钾。组合物制剂还可以含有实质量的鸡蛋尿囊液成分(如蛋白质和代谢物)和/或缓冲稀释剂。另外，药用疫苗组合物可以含有缓冲盐，如5到200mM的一价的或二价磷酸钠或磷酸钾，或者含有25到100mM的组氨酸和/或其盐。在优选实施方式中，蔗糖含量约为100mM到350mM。
许多病毒溶液/疫苗溶液还可以使用SPG碱溶液(蔗糖、磷酸钾和一价谷氨酸钠)。但是，在本发明的某些实施方式中，病毒/疫苗溶液不含MSG。在另外一些实施方式中，MSG的含量是减少的。可用于本文实施方式中的蔗糖含量范围很宽。一般的实施方式所含的蔗糖为0.2M(7％W/V)，但是，组合物中的蔗糖含量即使高达20％也不会对病毒活性/毒力造成损害。组合物的各种实施方式所含有的表面活性剂包括Poloxamer 188(聚氧乙烯-聚氧丙稀嵌段共聚物，如Pluronic F68)和Tween 20(聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯)，浓度范围为0.01％到0.1％(W/V％)。在某些实施方式中，含Poloxamer、明胶水解物和精氨酸的溶液优于只含一种组分的溶液，含稳定剂的溶液都要比不添加任何额外成分的溶液更稳定。
在另外的实施方式中，第四组的步骤(如表1的步骤15)包括更换全部或部分正常尿囊液(NAF)，其中病毒用蔗糖、磷酸钾和一价谷氨酸钠缓冲液(SPG)或其他简单溶液，如含减量MSG的溶液等悬浮。利用SPG更换部分或全部NAF稀释液可使病毒在溶液中更稳定。这种稳定性也是本发明实施方式的一个未预料到的新优点。我们制备了可体现制剂的上述部分或全部特性的典型制剂，并且评价了其组分冷适应性病毒的稳定性。典型制剂组合物列在表28中。制剂在5℃下的稳定性见表29。
我们测定了本发明的各种制剂在不同月内和不同温度下的稳定性。例如，表30阐述了12种不同的制剂。制剂10和11是利用干病毒制备物制备的制剂。该表中的制剂涵盖了各种组分，如蔗糖和明胶。表31-34描述的是含4种不同病毒株的制剂在6个月内的稳定性(每种制剂取两个样品点)。图38用图表描述了含B/HongKong病毒株的4种典型制剂。表35描述的是其他制剂的组合物。表15中的组合物检测了在基础组合物(即，一般为10/2/2，是指约含10％的蔗糖、2％的精氨酸和2％的明胶)添加各种化合物对抑制NAF内有害成分如溶菌酶等的作用。表35中制剂的稳定性结果列于表36到表39和图39到40中。表40和41及图41a-c描述的是改变制剂(这里是指约含10％蔗糖、1％明胶和2％精氨酸的基础制剂)内柠檬酸盐的浓度所产生的影响。含柠檬酸盐的制剂在储存约7-8个月时会出现沉淀。表42和43及图42a-c描述的是一个类似的试验结果，但是其中EDTA的浓度是不同的。上述实施例中典型制剂的进一步检测结果见表44和图45a-d。含不同浓度蔗糖、明胶、精氨酸和EDTA的其他制剂见表46到48的描述。
为了进一步说明本发明的几种单价制剂的稳定性，我们检测了含60％尿囊液的组合物的稳定性。样品储存于5℃，通过FFA试验进行分析。头两个月内每两周取一次样，然后每月取一次样，共做9个月。利用含60％AF的组合物制备出具有所需毒力的VH的可能性很高，即使是低滴度的病毒株在几年内依然能保持所需的毒力。某些使用未纯化VH的制剂也具有足够的稳定性，对于所有检测的病毒株来说，几乎都符合在5℃的条件下7个月内毒力下降0.5log的标准。流感病毒株B/HongKong/330/01可能是进行稳定性检测的所有病毒株中最容易出问题的。见表30，该表给出了13种不同制剂内蔗糖、精氨酸、明胶和其他组分的百分含量。图43描述的是4种病毒株在这种制剂中9个月后的稳定性。未纯化病毒组合物的典型制剂含有VH、10％蔗糖、2％精氨酸、2％明胶；VH、10％蔗糖、2％精氨酸；VH、10％蔗糖、2％精氨酸、1％右旋糖酐；VH、10％蔗糖、2％精氨酸、0.5％PVP；VH、10％蔗糖、2％精氨酸、2％明胶、2.5mM EDTA；VH、10％蔗糖、2％精氨酸、2％明胶、柠檬酸盐缓冲液；以及VH、10％蔗糖、2％精氨酸、2％明胶、组氨酸缓冲液。
病毒/疫苗溶液纯化(如为了稳定化等)的其他方法包括这类技术如通过分馏去除所有的NAF(一道添加稳定剂)以提高溶液的稳定性。但是本发明的许多实施方式包括将含病毒/疫苗的NAF稀释出来。例如，在本文的许多实施方式中，NAF的浓度一般约占溶液的10％到60％。在另外一些实施方式中，NAF约占溶液的20％到50％、或30％到40％。对NAF的这种稀释可提高病毒/疫苗溶液的稳定性，尤其是以液体形式保存在需要的温度下(如4℃、约2℃到8℃等)。另外，本发明的某些实施方式包括降低NAF的浓度并且使用精氨酸(见上)。比较本发明的不同制剂和病毒组合物的无NAF纯化制剂或低NAF(但还是NAF纯化的)制剂的稳定性。表49描述的是本发明组合物的各种制剂以及含有以各种方式从NAF中纯化出的VH的制剂。应当理解的是表49中所描述的基础制剂一般含有约2％的精氨酸、约2％的明胶、约1％的PVP、约1％的优选糖酐、约2.7mM EDTA和约100mM的组氨酸。表49中的数字与图44-46所示的制剂相对应。
本发明经稀释的NAF实施方式与其他的稳定化方法相比较，即其最终制剂中含有10-25％的分馏NAF、甚至5％或更少的分馏NAF。但是，本领域的技术人员认为某些实施方式中存在的NAF不含这类分馏NAF而是用未分馏的NAF代替是最好的。本发明的制剂在稳定性方面与目前所用的纯化NAF(如分馏的NAF等)制备的其他病毒溶液是不同的。比较的目的在于在2℃到8℃、如4℃的条件下储存时病毒在12个月内的毒力损失低于或等于1.0log，或者低于或等于每月0.080log。目前所用的其他用作本发明制剂对照品的病毒制剂是通过分馏、渗滤等方法纯化的。3株不同的流感病毒用来测试不同的制剂形式：H1N1株(A/New Caledonia/20/99或A/NC)、H3N2株(A/Panama/2007/99或A/Pan或A/PA)和B株(B/HongKong/330/01或B/HK)。制剂加入到Accusprayers(即FluMist_的转移装置)内。为了模拟可能的制备过程，样品于-25℃冷冻6天作为试验的第一步。
在第一组比较试验中，比较NAF纯化的冷适应性三价制剂和本发明的未纯化NAF制剂的稳定性。本发明的制剂含有7％的蔗糖、1％的明胶、1％的精氨酸(这是作为对照的三价制剂的标准)和60％的AF(尿囊液)。本发明的制剂经过6个月后，其含有的A/NC的毒力损失速度为-0.035±0.016，A/Pan的毒力损失速度为-0.079±0.035，B/HK的毒力损失速度为-0.151±0.018。而纯化组合物的测定值分别为：A/NC的毒力损失速度为-0.020±0.027，A/Pan的毒力损失速度为-0.011±0.020，B/HK的毒力损失速度为-0.138±0.022。上述数值的单位是logFFU/月。见表50。表51描述的是纯化的制剂和本发明的制剂之间的比较，本发明的制剂用的是上述的10/2/2组合物。所观察到的较高初始毒力损失被认为是由于冻融和/或混合造成的。表52描述的是相似的比较，只是FluMist_制剂包含的是组氨酸，组氨酸可以提供更好的稳定性，并且不会造成初始的毒力损失。
图44说明了上面所观察到的初始毒力损失(冷冻和/或混合损失)只存在于磷酸盐缓冲制剂。组氨酸缓冲制剂无初始毒力损失，组氨酸对稳定性有促进作用。图44所显示的制剂是表49所列的那些制剂。图45描述的是经过6个月后表49所示制剂的稳定性斜率的“球形”图。如图所示，组氨酸缓冲的10/2/2制剂展示了稳定性和符合靶目标的最佳组合。见上。图46从不同角度展示了同一数据(即以每周的变化代替每月的变化)。图47描述的是第二组试验，其结果说明了含明胶(L106)或PVP/EDTA(L104)的10/2/2+组氨酸制剂的稳定性。从图中可以看出用PVP/EDTA代替明胶所产生的稳定性几乎与明胶相同。图48描述的是本发明的含组氨酸的10/2/2制剂的最佳pH。如图所示，pH7.0是优选的实施方式。本发明的实施方式还包括pH约为6.8到7.2的含100mM组氨酸的10/2/2制剂。图49描述的是本发明的实施方式中优选的蔗糖浓度。某些优选的实施方式约含10％的蔗糖，而另一些实施方式含有的蔗糖约为7％。图49中的基础制剂是上述的10/2/2加上蔗糖和组氨酸。在本文描述的各种实施方式中，某些实施方式包含作为缓冲添加剂的组氨酸和/或作为稳定剂的精氨酸和/或右旋糖酐和/或替代明胶的PVP。
本发明的其他实施方式还可以通过超滤/浓缩病毒/疫苗溶液进行稳定。这种超滤一般作为达到溶液稳定性的减少/稀释NAF的替代方法。例如，如果在某些情况下特定病毒株/溶液的滴度或毒力较低，那么可用超滤方法来代替NAF稀释(NAF稀释会进一步降低溶液的病毒滴度/毒力)。第四组步骤中的超滤与上述的微孔过滤稍微有些不同。上一组中的过滤步骤是用于除菌，而本组中的过滤步骤涉及稳定性等，过滤过程中的病毒得以保留。见上。
毒力分析
在本文的某些实施方式中，病毒/疫苗的毒力是通过细胞ELISA(即以细胞为基础的ELISA或CELISA，用于FluMist(一种减毒活流感疫苗)或此类的其他疫苗的毒力测定)测定的。这种方法简单而快速，可替代更传统的半数组织培养感染剂量(TCID50)分析用于测定活病毒的毒力。简言之，在96孔微滴定板上生长的汇合单层Madin-Darby犬肾细胞(MDCK)用含活病毒的样品感染，感染后16-18小时用甲醛固定，与流感病毒特异性的单克隆抗体(Mab)反应，然后利用抗鼠IgG-过氧化物酶和过氧化物酶底物检测结合Mab的病毒抗原，形成可溶性的有色产物，通过分光光度计测定产物的光密度(OD)。本领域的技术人员了解各种亚型的流感病毒株所共有的表位/抗原(如各种HA等)。用经验证有效的TCID50毒力分析法测定活流感病毒标准品的log10TCID50值，制作标准曲线，根据此标准曲线可计算出样品中活病毒的毒力。已知在4.9-6.7log10TCID50的范围内CELISA的测定值是线性的(r2大于或等于9.95)。天与天之间、不同批次的试验之间、不同板之间以及板内(残留的)的变异性(以log10TCID50表示的标准差)分别是0.06、0.02、0.05和0.03。利用CELISA测定的几种疫苗和野生型流感病毒株A/H1N1、A/H3N2和B的毒力与平行进行的通过确认有效的TCID50毒力分析法测定的毒力是一致的(±0.3log10TCID50)。CELISA能够在2天内测定高达10个样品/培养板，而确认有效的TCID50毒力分析法在6天内只能测定2个样品/培养板。CELISA可以替代其他毒力分析法或与其他毒力分析法联合使用(如FFA和TCID50，见下)。
半数组织培养感染剂量(TCID50)分析(见下文的详细描述)是被广泛应用的活病毒和活病毒疫苗的毒力测定方法。但是，在某些实施方式中，以细胞为基础的ELISA(CELISA)作为一种简单快速的方法可替代传统的费时费力的TCID分析法来测定FluMist(一种减毒活疫苗)或其他类似疫苗内流感病毒的毒力。
在其他典型的实施方式中，病毒溶液的毒力分析法还包括荧光聚焦分析(FFA)，这种分析法与本领域常用的TCID50分析法是不同。这种FFA有一些特殊的优点，如更适于自动化，因此可使疫苗制备的效率更高。TCID50分析法通常测定可感染50％特定细胞培养物所需要的病毒悬液或溶液的量。测定结果是很精确的，但是其速度比FFA慢，因此在制备疫苗过程中会浪费宝贵的时间。FFA分析一般用型和/或亚型(甚至通用抗原)特异性的抗流感病毒抗体(一般是看HA抗体)来检测感染细胞内的病毒抗原。在使用过程中抗体不会与其他型/亚型的流感病毒发生交叉反应，因此可用于定量分析多病毒制剂(如三价疫苗制剂)中不同型的病毒。FFA试验还可用于分析特定病毒株的一致性。本领域的技术人员很熟悉FFA及其在病毒/疫苗检测中的应用。
另一方面，荧光聚焦分析不依赖于细胞死亡的诱导(或者是被感染的细胞，或者是指示细胞)，而是利用抗体染色方法来检测细胞单层中被感染细胞内的病毒抗原。然后利用病毒抗体上的荧光标记物来检测和定量这些被感染的细胞。本发明的典型FFA利用型和亚型特异性的抗流感病毒HA抗体来检测被感染细胞内的病毒抗原。
在其他的实施方式中，FFA(以及本文描述的其他方法)还可以使用流感病毒共有抗原特异性的通用抗体而不是特定型/亚型流感病毒抗原的特异性抗体。这样，FFA使用这种通用抗体就可以筛选多种不同类型的病毒，也不用每次在分析不同的病毒时都要开发和生产型/亚型的特异性抗体。
本文的其他实施方式包括通过以细胞为基础的荧光测定方法(CFA)来确定病毒毒力。虽然FFA可用于许多实施方式中，但是CFA却适用于其他实施方式。FFA分析的图像处理和数据读取速度约为20板/人/天(或图像处理速度约为5板/小时)，而CFA的图像处理和数据读取速度可高达FFA的4倍。另外，通过FFA测定的B型流感病毒株的滴度可能与TCID50滴度不同；而通过CFA测定的滴度与TCID50(或FFA)滴度没有显著差异，这是因为该分析使用了标准或校正。总之，CFA可用于测定96孔板内生长的MDCK细胞内的感染性流感病毒。与FFA一样，CFA检测的也是在第一轮感染期间感染病毒的MDCK细胞表达的病毒蛋白。CFA利用校正或分析标准来进行病毒滴度的计算。CFA常用的抗体包括：HA或A型病毒株和B型病毒株(流感病毒)特异性的一抗和二抗，如连接有Alexa 488的羊抗鼠IgG。CFA所用的分析标准包括与已知FFA或TCID滴度的样品相同的病毒株的病毒收获物。CFA所用的分析参照包括已知FFA或TCID滴度和已知线性斜率的病毒收获物(不一定是与已检测样品相同的病毒株)。样品一抗包括A/H1N1或A/H2N2病毒株的特异性抗体(如Takara的抗体)，工作稀释度为1∶2000；A/H3N2病毒株的特异性抗体(如Takara的抗体)，工作稀释度为1∶1000；以及B型病毒株的特异性抗体(如Chemicon的抗体)，工作稀释度为1∶1000。典型的CFA分析过程包括病毒接种，33℃孵育18小时，然后固定，在室温下孵育15分钟，加入一抗后在37℃孵育60分钟，然后加入二抗在37℃孵育60分钟。用荧光计数仪测定培养板，分析得到的数据。在CFA的某些实施方式中，一个孔的感染水平是通过测定其蛋白表达来确定的(而典型的FFA分析测定的是被感染的细胞数)。本领域的技术人员应该了解典型的FFA和荧光计数分析，这些试验应注意的问题同样也适用于CFA分析。
半自动TCID 50 分析
如上所述，本发明的某些实施方式包括TCID50分析以及由其改进的分析法。例如，某些实施方式包括如下文所描述的该分析法的半自动化版本。
这一部分比较了手工操作的半数组织培养感染剂量(TCID50)分析法和半自动的半数组织培养感染剂量(TCID50)分析法，所用的样品为减毒活流感疫苗，如FluMist_或其他类似的疫苗。TCID50毒力分析法还可用于测定FluMist或其他类似疫苗的毒力。本文描述了半自动的TCID50毒力分析法，其中改进了确认有效的手工毒力分析法中的两个费力步骤，它们是(i)利用自动加样仪进行样品稀释和MDCK细胞单层的感染，代替多次的手工重复稀释步骤，(ii)在感染后6天，用96孔板读数仪测定MTT产物的吸光度来代替在光镜下人工观察所有96孔分析板的每一个孔以评价MDCK细胞是否存在流感病毒诱导的细胞病变效应(CPE)，MTT(3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑)是一种广泛应用的活细胞染料，可作为细胞健康/死亡的指示剂。
我们设计并验证了可用于本文实施方式中的半自动TCID50毒力分析法以确定其精密度(可重复性：＜0.25log10TCID50；中间精密度：SD(天)＜0.3log10TCID50；SD(分析员)和SD(设备)＜0.4log10TCID50；90％置信区间时的重现性为±0.3log10TCID50)、线性、准确度和线性范围(斜率1±0.1)。利用自动加样仪和MTT染料进行的半自动TCID50毒力分析结果与确认有效的手工TCID50毒力分析结果是等效的(90％置信区间时重现性为1±0.3log10TCID50)。总之，本文的结果为使用自动加样仪和MTT测定FluMist_制剂内流感病毒的毒力提供了支持。这些改进的方面也可以提高检测的效率。
感染性/毒力(单价)分析法验证
目前常用的单价流感病毒毒力检测手工操作方法的半自动版本还可用于FluMistTM和其他类似疫苗的制备。半自动毒力分析法采用了自动洗板和自动进行系列稀释的技术，以及自动检测病毒诱导的细胞病变效应(CPE)的技术，代替了人工镜检。洗板和系列稀释步骤的自动化可以提高分析的效率，降低由于重复操作造成的质量下降。该方法采用对照分析。自动检测病毒诱导的CPE因省略了镜检使本方法的一致性和效率得到提高。
半自动分析法的某些步骤/方面与较传统的TCID50分析法一样，而其他步骤/方面是完全不一样的。试验步骤包括含Madm-Darby犬肾细胞(MDCK)单层的制备、孵育和洗涤、分析板的感染和感染后孵育、以及根据两个试验中的CPE阳性细胞数和样品检测情况计算毒力。发明者及其同事已验证了半自动毒力分析法，结果发现其表现与目前常用的手工分析法一样。这种半自动分析法还可作为测定扩增的野生型流感病毒(eWT)主病毒种子(MVS)、厂家的工作病毒种子(MWVS)和病毒收获物(VH)样品感染性/毒力的主要方法。手工操作方法可作为备份在半自动分析法无法使用的情况下，如设备长时间处于停工期的情况下使用。
传统的半数组织培养感染剂量(TCID50)分析法是以细胞为基础的测定感染性细胞自杀病毒颗粒的方法。在96孔板内培养MDCK细胞，其汇合单层用系列稀释的病毒样品感染。病毒在MDCK细胞内复制可导致细胞的死亡。子代病毒又会感染其他细胞，最终导致细胞单层的毁坏。感染所导致的CPE在6天的孵育期内不断发展。在显微镜下观察每一个孔以确定各孔内是否存在CPE。通过这种方法在3天内每天进行一次试验，重复检测4次得到4个数值，所得到的12个数值平均得到一个检测值。除了样品以外，每个分析员还要检测一个单价对照品，也是在3天内每天检测一次，重复测定4次。
手工操作法费时费力，检测样品的效率不高。每次测定都需要多次细胞洗涤和系列稀释步骤，因为是用手动加样器操作的。96孔分析板上的每一个孔都需要在显微镜下观察以确定CPE是否存在。培养板进行多次洗涤和稀释会对分析结果造成重复操作损害。另外，在显微镜下观察96孔板的每一个孔容易使人疲劳，因此限制了每个分析员分析的数量，一个分析员一天只能分析20个板左右。在3天的检测期内检测到的12个数值的平均值作为一个检测结果，除了样品以外每个分析员还要进行一次单价对照品分析。这就使每个分析员在一个为期3天的检测期内只能分析9个样品(每个分析员平均每天分析3个样品)。因为单价疫苗收获物的每个亚批(一批疫苗约有40-50亚批)都要用这种方法检测，因此有限的检测效率导致了对疫苗(如FluMistTM等)全规模商业化能力的限制。
传统分析法，尤其是洗板和加样步骤以及CPE的MTT(3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑)染料检测步骤的自动化产生出了单价流感病毒的半自动TCID50毒力分析技术。半自动分析技术利用SkatronTM Cell Washer进行洗涤步骤，其中碎片和废液从细胞培养板中去掉，换成新鲜的培养基。Matrix SerialMate_多道加样仪用于病毒的连续10倍稀释以及稀释样品向96孔分析板内细胞单层上的转移。当然，具有相似功能的其他装置也可以使用，除非特别说明，提及特定品牌或型号的装置并不构成对本发明的限制。经过6天的孵育以后，96孔培养板与MTT染料孵育6小时，MTT是一种应用广泛的细胞代谢和存活能力指示剂。在孵育过程中，完整而健康的细胞单层可处理染料形成不溶于水的蓝紫色甲_产物，这种产物可在细胞内积聚。在细胞单层被破坏的孔内，无蓝紫色甲产物形成。然后加入含20％表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)的0.01N盐酸溶解液，培养板孵育过夜可将不溶性的染料产物溶解掉。测定570nm处的吸光度值就可以测得不溶性染料产物的量。利用Microsoft ExcelTM Macro程序(或其他类似的程序)处理测得的吸光度值以鉴定和计数CPE阳性或CPE阴性孔，计算出TCID50滴度。与预设的截留值相比，含完整细胞单层的孔具有更高的吸光度值，被认为是CPE阴性的，而CPE阳性孔的吸光度值在截留值以下(见图50)。根据经Karber修饰的Reed-Muench方法利用每个稀释度下的CPE阳性孔数计算滴度(log10TCID50/mL)。细胞洗涤、系列稀释和病毒接种步骤以及MTT染料法检测CPE的自动化在下文有详细描述。
利用Skatron TM  Cell Washer进行自动化的细胞洗涤
在手工分析法中，含MDCK细胞单层的96孔板在接种稀释的病毒样品前需洗涤两次。经过4天的孵育以后含废物和胎牛血清(FBS)的废液需要被去掉换成不含FBS的新鲜病毒生长培养基(VGM)。细胞在33±1℃和5±1％CO2中至少孵育10分钟，然后去掉VGM，再次更换新鲜的VGM。在进行每一个洗涤步骤时，需要将每块板反转置于卫生纸上，温和洗干以去掉孔内的培养基，然后用手动多道加样器在每个孔内加入200μl新鲜VGM。如果很多板需要处理，那么这一过程是相当费时费力的。
SkatronTM Skanwasher(Series 300，Model 12010)是微处理器控制的96道细胞洗涤仪，可自动完成这些洗涤步骤。Skanwasher体积较小，一个6英尺大小的层流生物安全通风厨就足以放下。利用SkatronTM Skanwasher进行的细胞培养板洗涤步骤的自动化包括一个洗涤程序，其中废液被从板上吸去，然后新鲜VGM被分散加入到空孔内。将培养板放到Skanwasher上，完成一轮洗涤后取下移到33±1℃、5±1％CO2孵育箱内，在孵育箱内孵育至少10分钟后再放到Skanwasher上进行第二次洗涤，洗涤完以后移回孵育箱内。SkatronTM Skanwasher在这些洗涤步骤中的表现证明其可用于细胞洗涤步骤。200μl液体的加样精密度相当于CV＜10％，加样准确度在10％以内。吸除液体步骤中残留的液体体积＜1％。因此，SkatronTMSkanwasher的表现是可以接受的，并且提高了其使用的简便性和细胞洗涤步骤的效率。另外，应该了解的是能在同一标准内完成洗涤步骤的其他类似装置也可用于本发明。
利用Matrix SerialMate _ Multichannel Pipetting Station进行自动系列稀 释和病毒接种
手工操作的传统TCID50分析法的系列稀释和病毒接种步骤是用手动的多道加样器完成的。系列稀释分两步完成。第一组的5个系列稀释是在0.5mL稀释管内进行的，然后从第一管中取适量稀释液加入到2mL稀释管内，然后进行最后5个稀释系列的稀释。系列稀释过程的关键在于仔细操作，因为任何一个稀释度的加样误差都通过随后的稀释被传递和放大。随后的病毒接种步骤包括将稀释的病毒重复加样到含汇合细胞单层的培养板的不同行或不同列中。为了保持加样的准确度需要长时间使用手动加样器，这样可能会导致严重的肌肉疲劳和肌腱炎，限制了每个分析员每天操作的板数，因此会影响整个过程的效率。
使用Matrix SerialMate_加样仪进行系列稀释和病毒接种可提高使用的简便性和分析的效率，减少操作员损伤的发生，同时还能提供必须的精密度和准确度。Matrix SerialMate_加样仪是一种台式液体处理工作站，配备一个12道的喷头，能吸取和分配5-225μL体积的样品。该仪器体积小，一个标准的4英尺或6英尺生物安全橱柜就可以放下，并且便于使用。转移5-225μL体积的液体时MatrixSerialMate_的精密度超过0.5μL，准确度超过1.0μL。在系列稀释步骤转移30μL体积的液体时这相当于精密度超过±1.7％，准确度超过±3.3％。自动分析法和目前常用的手工操作方法所得结果的可比性将在下文进行确证。另外，应当理解的是能在同一标准内完成同样操作的其他类似装置也可用于本发明。
MTT检测法描述
TCID50分析法的最后一步是检测CPE和定量病毒。利用目前所用的(手工操作的)TCID50分析法，需要在显微镜下观察每一个孔以确定每个孔内是否有CPE信号。这些信号包括细胞单层的局灶、部分或全部塌陷的面积以及被破坏的细胞单层上部是否有圆形的和发暗的细胞。已经发现当分析员数的培养板过多时会发生眼疲劳，因此每个分析员分析的培养板数应限定在20个左右。这一步是手工操作方法的限速步骤。
四唑染料是一种广泛应用的细胞存活能力指示剂。最常用的染料是黄色MTT染料。具有活线粒体的活细胞可将MTT降解成不溶于水的蓝紫色甲产物，经溶解步骤以后可在570nm处检测到。在CPE阳性孔内大量的细胞被破坏，形成的染料产物很少或没有，所检测到的吸光度值就会很低。
在半自动TCID50分析中，培养板感染并孵育6天后，去掉废液，在每一孔中加入100μL含0.5mg/mL MTT染料的新鲜病毒生长培养基，置于37±1℃、5±1％CO2孵育6小时。通过在37±1℃过夜孵育使染料产物溶解，然后加入100μL溶解试剂(含20％SDS的0.01N盐酸)，在培养板计数仪上测定蓝紫色甲产物在570nm处的吸光度值。吸光度数据输入经确认有效的Microsoft ExcelTM Macro程序(或其他类似程序)中，根据预设的截留值将吸光度值转化成CPE计数。根据经Karber修饰的Reed-Muench方法用每个稀释度下的CPE阳性孔数计算滴度(log10TCID50/mL)。
以染料为基础的自动化检测方法可提高CPE读数的一致性和分析的效率。通过大量的试验来验证以染料为基础的检测方法和人工显微镜CPE检测方法的可比性，其中分析所用的样品是不同的疫苗和野生型病毒株，以及用不同代数的细胞和不同的接种密度制备的培养板。在这些试验中，首先在显微镜下人工观察培养板，然后再用以染料为基础的检测方法测定吸光度。分析这些试验的结果以确定通用吸光度截留值，该值可为两种检测方法提供可比较的CPE计数。根据更详细的研究结果(见下)确定这个通用截留值等于0.5254，是指在570nm处的吸光度值，其中9个不同的分析员在3台不同的仪器上进行了6天的试验，共使用了573块分析板。首先在显微镜下人工观察培养板上的每一孔(每个培养板有80个病毒接种孔，总共45840孔)是否存在CPE，然后再用以染料为基础的检测方法测定吸光度。
图50显示的是不同孔的吸光度值对该值出现的频率(读出该吸光度值的孔数)所做的直方图。频率测定结果表明A570＝0.5254的吸光度截留值位于CPE阴性孔分布区的最左侧尾部(概率＝0.007％)和CPE阳性孔分布区的最右侧尾部(概率＝0.02％)。利用这个截留值比较两种方法所检测到的每孔的CPE数值，结果表明无论是CPE阳性孔还是CPE阴性孔，用以染料为基础的检测方法和显微镜检查方法所得到的结果在大多数孔(45840孔中的45279孔，98.78％)上都是一一对应的。
半自动毒力分析法的验证
用于分析单价流感疫苗病毒的半自动半数组织培养感染剂量(TCID50)毒力分析法适用于测定扩增的野生型病毒(eWT)、主病毒种子(WVS)、厂家的工作病毒种子(MWVS)和病毒收获物(VH)样品的感染性/毒力。对半自动TCID50分析法进行验证以确定其精密度(可重复性、中间精密度和重现性)、线性、准确度和适用范围，结果表明该方法所得到的结果与手工操作的TCID50分析法一致。验证试验用三株不同单价疫苗进行，分别是一株A/H1N1型病毒、一株A/H3N2型病毒和一种B型病毒。验证试验在两个不同的实验室分两组进行以检验实验室与实验室之间的重现性。半自动分析法和手工操作分析法之间的精密度(试验之间的变异性)、线性、准确度和适用范围的比较结果列于表53中。
半自动分析法进行的试验之间的标准差(SD)通过6次试验进行评价，这6次试验在三株疫苗上分别进行，由同一组人员操作，在同一台加样仪上进行(每个试验结果都是通过平均3天内得到的12个数据获得的)。半自动分析法试验之间变异性的接受标准为0.25log10TCID50/ml，这一数值是基于手工分析法的最大变异性(0.11log10TCID50单位)所得到的单次检测结果95％置信区间的一半。利用半自动分析法得到的三株病毒的实际SD值在0.06-0.09log10TCID50mL的范围内。这些数值在接受标准SD＜0.25log10TCID50/ml之内，与手工操作TCID50分析法所得到的试验之间的变异性(0.07-0.11 log10TCID50单位)一致，后者是用三个独立批次的三株病毒进行了9次试验而得到的。
试验证明该分析法在105倍的稀释范围内(滴度范围为4.2-9.3log10TCID50/mL)是成线性的，这一点可通过一个试验来检验计算出的TCID50滴度与测得的TCID50滴度之间的关系是否符合1％显著水平下的线性模型来确定。该分析法是准确的，三株病毒的斜率在1.00-1.02之间，完全符合1±0.1的接受标准。半自动分析法的线性、准确度和适用范围与手工分析法一样。见表53。
两组分析员在9天内用一株A型疫苗病毒和一株B型疫苗病毒进行了18次试验，检验这18次试验的结果是否与随机效应模型相符合，依次来确定半自动分析法的中间精密度。所测得的天与天之间的变异性(SD(天)、不同分析员组之间的变异性(SD(分析员))以及设备之间的变异性(SD(设备))的标准差范围分别是0.04-0.08、0.14-0.16和0.000-0.03，这一范围符合SD(天)＜0.3、SD(分析员)＜0.4和SD(设备)＜0.4的接受标准。
在两个不同的实验室用一株A/H1N1型病毒、一株A/H3N2病毒和一株B型病毒进行试验以证明该分析法在实验室之间的重现性。实验室与实验室之间重现性的接受标准要求两个实验室所得结果的差异的双侧90％置信区间应该在±0.3log10TCID50/mL之内。所有3株病毒的90％置信区间的上限和下限分别为大于-0.05和小于+0.15，符合接受标准。
为了证明手工操作分析法和半自动分析法的可比性，我们进行了详细的统计学比较。通过手工操作分析法检测两株疫苗，一株为A/H1N1型(A/NewCaledonia/20/99)，一株为B型(B/Yamanashi/166/98)，每株病毒得到18个检测结果。所有这些结果汇总起来与通过半自动分析法测定的汇总结果(每株18个检测结果)进行精密度和中间精密度的比较。SAS内的Proc Mixed方法用于测算分析法之间的平均差异及其90％置信区间(CI)。接受标准为90％CI必须在±0.3log10TCID50/mL，即90％CI的下限(LB)大于-0.3，上限(UB)小于0.3。结果在分析法验证报告里，下面的表54中也有总结。从结果中可以看出，两株病毒的双侧90％置信区间都在接受标准±0.3log10TCID50/mL之内，下限和上限的实际计算值都在-0.05到0.10log10TCID50/mL之间。
总之，用于分析单价流感病毒的手工TCID50毒力分析法是一种经验证有效的传统方法，可用于分析扩增的野生型流感病毒(eWT)、主病毒种子(MVS)、厂家的工作病毒种子(MWVS)和病毒收获物(VH)样品中单价流感疫苗病毒株的感染性/毒力，这是一种很费力的方法，包括许多手工操作的加样步骤，会因重复操作而对分析员造成损害。另外，由于该方法通过人工在显微镜下读取CPE数据，因此将分析效率限制在每人每天进行3个试验的水平上。洗板和手工加样步骤的自动化以及用CPE的MTT染料检测法代替人工镜检读取数据导致了单价流感病毒的半自动TCID50毒力分析法的诞生。利用半自动分析法检测单价材料可将分析的效率提高2-3倍，因而可使疫苗如FluMistTM疫苗实现真正商业化的目的，以预期的剂量水平为市场提供疫苗。另外一个优点就是能够降低质控分析员因重复操作而导致的损伤风险。
半自动分析法用于在一个组内分析滴度范围为4.2-9.3log10TCID50/mL的病毒材料时其可重复性、中间精密度、线性和准确度都已得到确认。该方法在实验室之间的重现性也得到确认。
利用半自动分析法和手工操作方法重复测定一株A型病毒和一株B型病毒的毒力，所得到的结果进行详细的统计学比较，结果表明两种方法得到了一致的结果。因此，半自动分析法在用于测定扩增的野生型病毒(eWT)、FluMistTM主病毒种子(WVS)、厂家的工作病毒种子(MWVS)和病毒收获物(VH)样品的毒力时比得上手工操作方法。
半自动TCID 50 分析法中的CPE通用截留值
在本文的另外一些实施方式中，经修改或调整的TCID50分析法用于测定疫苗/病毒的毒力。一种调整是为了确定利用TCID50半自动毒力分析法分析单价流感病毒时测定CPE所用的通用截留值。“单价流感病毒的半自动TCID50毒力分析法”(见上)利用活细胞染料MTT(3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑)来评价MDCK感染细胞单层的CPE分数。为了便于利用MTT比色终点来检测CPE阳性孔数从而很容易地确定病毒的毒力数值，需要确定一个可重复区分CPE阳性孔和CPE阴性孔的吸光度截留值。如发明者在其他文献中所描述的，确定的“通用截留吸光度(A570)值为0.5254。在“单价流感病毒的半自动TCID50毒力分析法”中，当一个孔的A570吸光度值＜0.5254时被认为是CPE阳性的；当一个孔的A570吸光度值＞0.5254时被认为是CPE阴性的。
本部分所总结的数据确证了以前所确定的通用截留值的有效性。利用冷适应性流感病毒株A/New Caledonia/20/99(A/H1N1型)、A/Sydney/05/97(A/H3N2型)和B/Yamanashi/166/98(B型)进行的大量试验不仅可以为通用截留值的验证提供更多的支持数据，而且还可用于分析员之间的和设备之间的比较。本文所提供的数据证实了半自动TCID50分析法的稳定性、重现性和可靠性，证明该方法与经确认有效的手工毒力分析法是一样准确的。因而说明了包含这些测量方法的实施方式的证明力。
正如上面所解释的，半数组织培养感染剂量(TCID50)分析法是一种以细胞为基础的分析法，用于测定感染性细胞自杀病毒颗粒的毒力。将系列稀释的病毒加入到生长在96孔板上的Madin-Darby犬肾细胞MDCK)汇合单层上。病毒在MDCK细胞内的复制可影响细胞的代谢，最终导致子代病毒释放进入培养上清液，细胞死亡。子代病毒又会感染其他细胞，最终导致细胞单层的破坏。在6天的孵育期内因感染造成的细胞病变效应(CPE)得以显现。经过这一段时间之后，利用MTT检测细胞单层上是否存在CPE。活体染料如MTT已被大量用在以细胞为基础的生物分析试验中作为细胞健康和死亡的指示剂。(见Denizotet等， J.Immun.Methods(1986)89：271-277；Gerlier等，(1986) J.Immuno.Methods94：57-63；Heeg等， J.Immuno Methods(1985)77：237：246；Mooseman， J.Immuno.Methods(1983)65：55-63；Tada等，J.Immuno.Methods(1986)93：147-165以及Vistica， Cancer Research(1991)51：2515-2520)。含完整活细胞单层的孔(CPE阴性的)可将染料转化成蓝紫色甲染料产物，在570nm处产生高吸光度值，而CPE阳性孔因部分或整个细胞单层被病毒破坏所产生的吸光度值较低。为了便于利用比色终点来检测CPE阳性细胞孔数从而很容易地确定病毒的毒力数值，需要确定一个可重复区分CPE阳性孔和CPE阴性孔的吸光度截留值。结合通用吸光度值，根据病毒检测样品的吸光度值就可以判断是CPE阳性还是CPE阴性的。CPE阳性孔数用于计算病毒滴度(log10TCID50/mL)。
本发明的发明者及其同事根据多个分析员用三株流感病毒在几天内所做的两个研究结果确定了通用截留值的起始推荐值。如本文所描述，被认为是CPE阳性的孔的A570吸光度值＜0.5254；被认为是CPE阴性的孔的A570吸光度值＞0.5254。本部分描述了另外一些试验用于验证以前所确定的吸光度截留值。两个不同研究组的多位分析员利用半自动TCID50分析法测定三株参照病毒的毒力。如本文所描述，利用已验证有效的人工镜检方法确定的CPE被认为是“金标准”，与MTT法确定的CPE一致。利用病毒株A/New Caledonia/20/99(A/H1N1型)、A/Sydney/05/97(A/H3N2型)和B/Yamanashi/166/98(B型)进行的大量试验不仅可以为通用截留值的验证提供更多的支持数据，而且还可用于分析员之间的和设备之间的比较。本文所提供的数据证实了半自动TCID50分析法的稳定性、重现性和可靠性，证明该方法与已验证有效的手工毒力分析法是一样准确的。
设计半自动毒力分析法需要使用已知毒力值的参照病毒株，其毒力值是以前用已验证有效的手工毒力分析法确定的。作为参照病毒的冷适应性病毒株如下：A/NewCaledonia/20/99，一种A/H1N1型病毒；A/Sydney/05/97，一种A/H3N2型病毒和B/Yamanashi/166/98，一种B型病毒。冷适应性对照病毒株A/Sydney/05/97用于确定系统适应性。
本发明的发明者及其同事已设计出了半自动TCID50毒力分析单价流感病毒的方法以及半板重复的整体分析格局和病毒CPE计分方法。见上。简言之，利用SkatronTMCell Washer用病毒生长培养基(VGM)洗涤96孔板上的MDCK汇合细胞单层两次。利用MatrixTM SerialMate Pipetting Station和96孔稀释管用含TPCK-胰蛋白酶的VGM制备10倍系列稀释的病毒样品。将最后5个稀释度(10-5到10-9)的稀释液转移到含MDCK细胞的培养板上，病毒终浓度为10-6到10-10，这是病毒的起始滴度。从每个培养板上采集两个毒力数据点。由于每个样品都在两个培养板上进行分析，因此可得到4个重复的毒力数值。16个对照孔(培养板上的第6列和第7列)内加入无病毒的VGM作为细胞对照。经过6天孵育(33±1℃、5±1％CO2)以后，用显微镜检查所有孔，观察是否存在CPE。因此，如果一个孔内的细胞单层出现病毒破坏的迹象则记录为CPE阳性。相反，CPE阴性孔内的细胞单层是完整的。
在显微镜下观察培养板上的细胞单层并记录每个孔是否是CPE阳性孔以后，去掉培养基，将磷酸盐缓冲液制备的MTT(0.5mg/mL)(US Biochemical Corporation，Cleveland，OH)加入到每一孔内(每孔100μl)。细胞单层与MTT在37±1℃、5±1％CO2中孵育6±0.5小时。将溶解缓冲液(100μl含20％SDS的0.01N HCl)加入到每一孔中，37±1℃、5±1％CO2中孵育16到20小时。用PerkinElmer-Wallac 1420Multilabel Counter Spectrophotometer测定570nm处的吸光度值，数值输入到MicrosoftTM Excel macro内，这是一个根据CPE阳性孔数计算病毒滴度(log10TCID50/mL)的程序。
接受标准适用于本部分的实施方式。相应的，如果每个板上的16个细胞对照孔中出现CPE、细胞毒效应或微生物污染迹象的孔数不超过1个，则认为这个培养板是有效的。另外，得自单价病毒对照样品(A/Sydney/05/97)的4个重复TCID50滴度值的平均值和标准差(SD)都必须位于质控证明所报告的质量范围之内。
下文所描述的是根据“金标准”CPE和MTT法测定的CPE之间的关系计算出的敏感性和特异性数据。TP表示“真阳性”，FP表示“假阳性”，FN表示“假阴性”，TN表示“真阴性”。因此，“全部阳性”是指TP+FN的和，“全部阴性”是指FP+TN的和。见表55。计算公式为：每个复值的敏感性＝(TP)/(全部的CPE阳性数)，每个复值的敏感性＝(TN)/(全部的CPE阴性数)。
为了确定设备与设备之间的可比性，第一组的6位分析员利用半自动TCID50分析法测定了三株参照病毒样品的毒力。在3天的试验期内用了两套试验设备AZ-039和AZ-040。第二组的分析员用另一套设备AZ-036。这一组的3位分析员利用半自动TCID50分析法在3天内检测了三株参照病毒样品。
为了确定分析员与分析员之间的可比性，第一组的每位分析员(分析员#1-6)根据半自动TCID50分析法用AZ-039在3天内检测了三株参照病毒。在第二组中，3位分析员(分析员#7-9)分别根据半自动TCID50分析法用AZ-036在3天内检测了相同的三株参照病毒。
为了可靠地分辨利用MTT的半自动TCID50分析法所检测的CPE阳性和CPE阴性孔，通过统计学处理确定一个通用截留值。在验证这个截留值有效性的试验中，两个研究组还进行了另外的一些试验，又得到了45840个吸光度值。结果在下文描述。
利用人工镜检方法计算出的敏感性和特异性数据作为参考标准。两组的总数据(n＝45840)列于表56中。利用推荐的截留值0.5254计算出的敏感性为98.45％，特异性为99.12％。另外，根据第二组数据计算出的敏感性和特异性分别为99.15％和99.99％。同样，根据第一组数据计算出的敏感性和特异性分别为98.13％和98.71％。上面的所有数据(敏感性＞95％，特异性＞95％)都与计算出的数据有关，其中所计算出的敏感性为99.05％，特异性为99.99％。
图51显示的是吸光度值对该值出现的频率(N＝45,840)作图所得到直方图，两组数据结合以后显示通用截留值0.5254位于CPE阳性孔和CPE阴性孔分布区之间的中点附近。频率分布图显示推荐的截留值位于对照孔分布区的最左侧尾部，相当于位于延伸向左侧的尾部内的可能性为0.007％。在利用所有CPE阳性孔的吸光度值估计截留值时，0.5254的截留值相当于位于尾部的可能性为0.02％。另外，图51所示的分布形态表明CPE阳性孔的吸光度值分布区域与CPE阴性孔的吸光度值分布区域分离的是相当开的。
CPE阴性对照孔的平均吸光度值比较。以前根据6720个对照孔的吸光度值计算出了一个0.5254的截留值。对照孔的平均吸光度值为1.261，标准差为0.15。如表57所示，本试验又做了9168个对照孔；其中2880个对照孔来自第二组，6288个对照孔来自第一组。第二组和第一组的平均吸光度值分别为1.226和1.235，总的平均吸光度值为1.231。总的平均吸光度值和以前报道的平均吸光度值的差只有0.03(见表57)。虽然这两组数据是在6个月内获得的，但是它们之间的差异还是很小的。以前的试验连续进行了2个月，而本文描述的第二组试验是在进行第一组试验前4个月进行的。
表58总结了利用两组的不同设备检测三株参照病毒所获得的毒力数据，用于确定设备与设备之间的可比性。第一组的6位分析员利用两套设备(命名位AZ-039和AZ-040)进行了半自动TCID50分析试验。A/New Caledonia/20/99的总平均毒力在9.2-9.3log10TCID50/mL之间，AZ039和AZ-040所测定滴度值差异不超过0.09log10TCID50/mL(见表58)。A/Sydney/05/97的总平均毒力在8.5-8.6log10TCID50/mL之间，AZ039和AZ-040所测定滴度值差异不超过0.02log10TCID50/mL。B/Yamanashi/166/98的总平均毒力在8.3-8.4log10TCID50/mL之间，AZ039和AZ-040所测定滴度值差异不超过0.14log10TCID50/mL。第二组试验使用一套设备(AZ-036)。3位分析员在三天内利用半自动TCID50分析法检测了三株参照病毒样品。对于A/NewCaledonia/20/99来说，第二组的设备所测定的数据与质控实验室的设备所测定的数据之间的平均差值不超过0.09log10TCID50/mL，对于A/Sydney/05/97来说平均差值不超过0.08log10TCID50/mL，对于B/Yamanashi/166/98来说平均差值不超过0.12log10TCID50/mL。第一组两套设备(AZ-039和AZ-040)之间以及第一组和第二组(AZ-036)之间的平均差值也被计算出来。
为了确定分析员与分析员之间的可比性，第一组的每位分析员(1号到6号分析员)于3天内在设备AZ-039上利用半自动TCID50毒力分析法检测了A/NewCaledonia/20/99、A/New Sydney/05/97和B/Yamanashi/166/98。第二组的3位分析员(7到9号分析员)分别于3天内在设备AZ-036上利用半自动TCID50毒力分析法检测了相同的病毒株。计算每株病毒的毒力值，结果列在表59中。对于所检测的三株病毒来说，第一组结果之间的变异性都小于或等于0.3log10TCID50/mL。与此相类似的是，第二组的毒力值之间的变异性小于或等于0.2log10TCID50/mL。对于三株参照病毒样品来说，两组分析员之间的总变异性小于±0.3log10TCID50/mL。检测结果(三天内得到4个重复数值)的标准差(SD)在0.11到0.27之间。由于标准差低于0.50的接受标准，因此所有的数据都是有效的。
本部分所提供的结果验证了“通用吸光度截留值(0.5254)。这个通用截留值的可信度很高，因为这些试验得到了高度一致的数据，尽管这些试验是由不同研究组的多位分析员在一个相当长的时期内完成的。总之，两组试验所得到的对照(CPE阴性)吸光度值不仅彼此一致，而且与以前所报道的平均值几乎相同(见表57)。两组试验的敏感性和特异性数值非常接近，并且与以前的研究结果一致(见图51和表57)。在两组试验中，利用MTT评价CPE的半自动TCID50毒力分析法所产生的结果彼此一致，并且与确认有效的手工TCID50毒力分析法所得到的结果也一致。最后，半自动系统相比手工操作方法有几个优点。利用设备来代替手工加样和显微镜检查培养板这样的费力步骤可提高分析能力，因此检测效率较高。另外，分光光度计检测CPE以及随后进行的自动毒力计算可使结果被打印出来，和/或进行电子记录。
定义
除非另外定义，否则所有的科技术语都被认为与其所述领域的意义相同。为了本发明的目的特将下列术语定于如下。
术语“核酸”、“多核苷酸”、“多核苷酸序列”和“核酸序列”是指单链的或双链的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物、及其嵌合体或类似物。这个术语用于本文中时还包括具有天然核苷酸性质的天然核苷酸类似物的聚合物，这种类似物可以天然核苷酸相同的方法与单链核酸杂交(如肽核酸)。除非另外说明，一个特定核酸序列除了清楚说明的序列以外还包括其互补序列。
术语“基因”是一个被广泛应用的术语，是指任何具有生物功能的核酸。因此，基因包括编码序列和/或其表达所需的调节序列。术语“基因”适用于描述特定的基因组序列以及该基因组序列所编码的cDNA或mRNA。
基因还包括非表达的核酸片段，如其他蛋白质的识别序列。非表达的调节序列包括“启动子”和“增强子”，调节蛋白如转录因子可结合到这些调节序列上导致其相邻或附近序列的转录。“组织特异性的”启动子或增强子是指可在特定类型的组织或细胞内调节转录的启动子或增强子。
术语“载体”是指能扩增核酸和/或可使核酸在有机体、细胞或细胞组分之间转移的方式。载体包括质粒、病毒、噬菌体、原病毒、噬菌粒、转座子和人工染色体等，载体可自主复制或者可以整合到宿主细胞染色体上。载体还可以是不能自助复制的裸RNA、裸DNA、在同一条链上即有DNA又有RNA的多核苷酸、多聚赖氨酸连接的DNA或RNA、肽连接的DNA或RNA、脂质体连接的DNA等。本文所述的载体最常见的是指质粒。
“表达载体”是指能够启动其所含核酸的表达以及复制的载体，如质粒。一般来说，被表达的核酸以“可调控的方式连接”启动子和/或增强子，其转录受启动子和/或增强子的调控。
“双向表达载体”的特征是含有两个启动子，其方向相对于两个启动子之间的核酸来说是相对的，这样表达可在两个方向上起始，即可以转录出正(+)链或正义链RNA，也可以转录出负(-)链或反义链RNA。
本发明所用的术语“游离的”是指生物材料如核酸或蛋白质实质上不含其在天然环境下与其正常伴随或相互作用的成分。游离的材料还包括在其所处的天然环境如细胞内不存在的材料。例如，如果材料处于其天然环境如细胞中，那么游离的材料就是指该材料在细胞内所处的位置(如基因组或遗传元件)对于该细胞来说是非天然的。例如，天然核酸(如编码序列、启动子、增强子等)如果以非自然的方式被插入到对该核酸来说是非天然的基因组(例如载体，如扩增子的质粒或病毒载体)内，则该核酸就成为游离的了。这种核酸也被称为“异源”核酸。
术语“重组子”是指通过人工方法或合成方法(非天然的)进行改变的生物材料(如核酸或蛋白质)。对生物材料的改变可在其天然环境中或在其天然状态下进行，或者从其天然环境中去除。当指病毒如流感病毒时，如果该病毒是通过重组核酸的表达制备的，那么该病毒就是重组病毒。
术语“重配株”用于指病毒时表示该病毒包含来源于一个以上亲本病毒株或资源的遗传和/或多肽组分。例如，7∶1重配株包含第一亲本病毒来源的7个基因组片段(或基因片段)和第二亲本病毒来源的一个补充病毒基因组片段，如编码血凝素或神经酰胺酶的片段。6∶2重配株包含第一亲本病毒来源的6个基因组片段(最常见的6个内部基因)和其他亲本病毒来源的2个补充片段，如编码血凝素和神经酰胺酶的片段。
术语“导入的”用于指异源核酸或游离核酸时表示核酸被引入到真核或原核细胞内，其中核酸被插入到细胞的基因组内(如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)，转变成自主复制子或被瞬时表达(如转染的mRNA)。该术语包括这些方法如“感染”、“转染”、“转化”和“转导”。在本发明中，许多方法都可用于将核酸导入到原核细胞内，其中包括电穿孔、钙磷酸盐沉淀、脂质介导的转染(脂质转染)等。
术语“宿主细胞”是指含有外源核酸如载体，并且能支持核酸的复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌，也可以是真核细胞如酵母、昆虫细胞、两栖类动物细胞、鸟类动物细胞或哺乳动物细胞。本发明中典型的宿主细胞包括Vero(非洲绿猴肾)细胞、BHK(幼仓鼠肾)细胞、原代鸡肾(PCK)细胞、Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞、Madin-Darby牛肾(MDBK)细胞、293细胞(如293T细胞)和COS细胞(如COS 1、COS7细胞)。
流感病毒
本文的组合物和方法主要用于制备生产疫苗的流感病毒。流感病毒包含一个含片段状单链RNA基因组的内部核糖核蛋白核心和一个由基质蛋白组成的外层脂蛋白包膜。A型和B型流感病毒都含有8个单链反义RNA片段。A型流感病毒的基因组编码11个多肽。片段1-3编码3个多肽，组成RNA依赖的RNA聚合酶。片段1编码聚合酶复合物蛋白PB2。剩余的聚合酶蛋白PB1和PA分别是由片段2和片段3编码的。另外，某些流感病毒株的片段1还编码一个小蛋白PB1-F2，这是由PB1编码区内的另外一个阅读框架编码的。片段4编码血凝素(HA)表面糖蛋白，参与感染期间病毒与细胞的粘附和病毒向细胞内的进入。片段5编码核外壳核蛋白(NP)多肽，这是与病毒RNA相连的主要结构成分。片段6编码神经酰胺酶(NA)包膜糖蛋白。片段7编码两个基质蛋白，被称为M1和M2，这两个蛋白翻译自经过不同剪接的mRNA。片段8编码NS1和NS2，这是两个非结构蛋白，也是翻译自经过不同剪接的mRNA。
B型流感病毒的8个基因组片段编码11个蛋白质。三个最大的基因编码RNA聚合酶的组分PB1、PB2和PA。片段4编码HA蛋白。片段5编码NP。片段6编码NA蛋白和NB蛋白。NA蛋白和NB蛋白翻译自mRNA顺反子的重叠阅读框架。B型流感病毒的片段7也编码两个产物：M1和BM2。最小的片段编码两个产物，其中NS1翻译自全长RNA，NS2翻译自经间接的mRNA。
流感病毒疫苗
从历史上看，流感病毒疫苗主要是根据经验预测即将流行的病毒株来选择何种类型的病毒株在含胚鸡蛋内制备的。最近已经制备出了重配病毒，该病毒含有已获批准的温敏减毒主病毒株的血凝素抗原和神经酰胺酶抗原。在鸡蛋内经过多次传代培养以后收获病毒，另外还可以选择将病毒灭活，如使用甲醛和/或P丙内酯灭活(或者用作减毒活疫苗)。
但是，以这种方式制备的流感疫苗在几个方面引起了广泛的关切。例如，来源于鸡蛋的污染残留物可能是高抗原性的和/或易引起高热的，在注射时常常会导致明显的副作用。因此，如本文所描述，本发明的一个方面包括用无动物源性物质的介质来替换一定比例的鸡蛋组分。更重要的是，必须在下一个流感病毒季节到来之前几个月开始筛选和分布用于制备疫苗的病毒株以便于有足够的时间制备和灭活流感疫苗。因此，能缩短制备时间的任何改进，如通过使用本发明的方法和组合物，都是很受欢迎的。
但是，由于被批准用于疫苗制备的某些病毒株不能在标准的细胞培养条件下生长，因此阻碍了用细胞培养物制备重组疫苗和重配疫苗的企图。本发明的发明者及其同事在以前的研究工作中设计出了一个载体系统和在细胞培养物中制备重组和重配病毒的方法，因此有可能通过这个载体系统和这些方法快速制备出一种或多种所选抗原性病毒株相应的疫苗。见，“用于流感疫苗制备的多质粒系统”，引用文献如上。当然，这种重组病毒还可以在鸡蛋内进一步扩增。一般来说，细胞培养是在一个系统如细胞培养孵育器内进行，控制湿度和CO2，利用温度调节器如恒温器使温度恒定，不要超过35℃。这种前沿的研究工作以及其他疫苗制备方法也可以通过部分或全部使用本发明的方法来加以优化和改进。
通过将一个亚组的编码主流感病毒基因组片段和目的病毒株(如抗原性目的突变株)来源的补充基因组片段的载体导入到细胞培养物中就可以很容易地获得重组流感病毒。一般而言，主病毒株要根据所制备疫苗所要求的特性来选择。例如，要制备减毒活疫苗，主病毒株要选择具有减毒活性、冷适应性和/或温敏表型的病毒株。
FluMist TM
如上所述，现有的流感疫苗有多种类型。其中一种典型的流感疫苗是FluMistTM，这是一种减毒活疫苗，可预防儿童和成年人发生流感(Belshe等，(1998)，“冷适应性的三价减毒活流感疫苗鼻内制剂用于儿童的效果”(The efficacy of liveattenuated，cold-adapted，trivalent，intranasal influenza virus vaccine inchildren)， N.Engl.J.Med.338：1405-12；Nichol等，(1999)，“减毒活流感疫苗鼻内制剂在健康工作人群中的效果：随机对照试验”(Effectiveness of live，attenuated intranasal influenza virus vaccinein healthy，working adults：a randomized controlled trial)， JAMA282：137-44)。在典型的实施方式中，本发明的方法和组合物优选用于FluMistTM的制备。但是，本领域的技术人员应该理解的是本文的步骤/组合物也适用于类似的、甚至是不同类型的病毒疫苗的制备。
FluMistTM疫苗病毒株含有野生型病毒株来源的HA和NA基因片段，这两个片段与常用主供体病毒(MDV)来源的6个基因片段，PB1、PB2、PA、NP、M和NS一起组成疫苗。用于制备FluMist A型流感病毒株的MDV(MDV-A)是通过野生型A/AnnArbor/6/60(A/AA/6/60)病毒株在原代鸡肾组织培养物中在较低温度下系列传代得到的(Maassab，(1967)，“流感病毒在25℃条件下的适应性和生长特性”(Adaptation and growth characteristics of influenza virus at 25degrees C)，Nature 213：612-4)。MDV-A在25℃可有效复制(ca，冷适应性)，但是在38℃和39℃的条件下生长受到限制(ts，温敏)。另外，这个病毒在被感染的雪貂的肺内不复制(att，减毒的)。这种ts表型被认为促成了疫苗在人体内的减毒活性，这种疫苗的复制并不是在整个呼吸道内，而是在最冷的区域都受到限制。这种特性的稳定性已在动物模型和临床试验中得到证明。与通过化学突变方法得到流感病毒株的ts表型不同，MDV-A的ts特性经过在感染仓鼠体内传代以后不会还原，从儿童体内分离出的病毒株其ts特性也不会减弱(最近的有关综述见Murphy & Coelingh，(2002)，“开发和使用冷适应性减毒活流感病毒A型和B型疫苗的原理”(Principlesunderlying the development and use of attenuated cold-adapted influenza Aand B virus vaccines)， Viral Immunol.15：295-323)。
使用12株不同的6∶2重组病毒进行了超过20000个成人和儿童的临床试验，结果表明这些疫苗是减毒的、安全的和有效的(Belshe等，(1998)，“冷适应性的三价减毒活流感疫苗鼻内制剂用于儿童的效果” N.Engl.J.Med.338：1405-12；Boyce等，(2000)，“含佐剂的和不含佐剂的亚单位流感疫苗健康成人鼻内给药的安全性和免疫原性”(Safety and immunogenicity of adjuvanted and unadjuvantedsubunit influenza vaccines administered in tranasally to healthy adults)，Vaccine 19：217-26；Edwards等，(1994)，“用于预防A型流感疾病的冷适应性和灭活疫苗的随机对照临床试验”(A randomized controlled trial of cold adaptedand inactivated vaccines for the prevention of influenza A disease)，J.Infect.Dis.169：68-76；Nichol等，(1999)，“减毒活流感疫苗鼻内制剂在健康工作人群中的效果：随机对照试验”， JAMA 282：137-44)。含MDV-A的6个内部基因和野生型病毒的HA和NA基因的重配株(即6∶2重配株)可始终如一地保持其ca、ts和att表型(Maassab等，(1982)，“在雪貂体内评价冷重组流感疫苗”(Evaluation of a cold-recombinant influenza virus vaccine in ferrets)，J.Infect.Dis.146：780-900)。但是，利用流感病毒B株制备这种重组病毒更困难一些。
最近的文献描述了一种用于制备B型流感病毒的完全来自于克隆cDNA的8质粒系统和适用于疫苗制剂，如用于鼻内给药的活病毒疫苗制剂的减毒A型和B型活流感病毒的制备方法。见“用于制备流感病毒的多质粒系统”，引用文献如上。
以前描述的系统和方法可用于在细胞培养物中快速制备重组和重配的A型和B型流感病毒，其中包括适宜作为疫苗、包括减毒活疫苗的病毒，例如适于鼻内给药的疫苗如FluMist_。本文所描述的本发明的方法还可与以前的此类研究结果如重组流感病毒结合应用以制备疫苗，以更稳定、更均匀和效率更高的方式生产出可用作疫苗的病毒。
细胞培养物
如前所述，流感病毒还可以在细胞培养物上生长。一般来说，病毒的扩增是在培养宿主细胞的培养基组合物内进行的。适于流感病毒复制的宿主细胞包括Vero细胞、BHK细胞、MDCK细胞、293细胞和COS细胞，如293T、COS7细胞。通常情况下，用包含上述两种细胞系如MDCK细胞和293T或COS细胞的共培养物以1∶1的比例来提高病毒的复制效率。一般来说，细胞用标准的商用培养基如添加血清(如10％胎牛血清)或无血清的DMEM、在适于维持中性缓冲pH(如pH在7.0到7.2之间)的可控湿度和CO2浓度下培养。培养基中还可以添加抗生素以阻止细菌的生长，如青霉素、链霉素等，和/或其他营养物质，如L谷氨酰胺、丙酮酸钠、非必须氨基酸、添加剂如胰蛋白酶、β巯基乙醇等以改善细胞的生长状态。
在培养基中培养哺乳动物细胞的方法已多有报道，是本领域技术人员所熟知的。通用培养技术见Freshney，(1983)，《动物细胞的培养：基本技术操作方法》(Culture of Animal Cells：Manual of Basic Technique)，Alan R.Liss，New York；Paul，(1975)，《细胞和组织培养》(Cell and Tissue Culture)，第5版，Livingston，Edinburgh；Adams，(1980)，《生物化学和分子生物学实验室技术-细胞培养》(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Cell Culturefor Biochemists)，Work和Burdon(编)，Elsevier，Amsterdam。有关于为了流感病毒体外制备过程中的特定目的而进行的组织培养过程的其他详细描述参见Merten等，(1996)，“在细胞培养物中制备流感病毒用于疫苗的制备”(Productionof influenza virus in cell cultures for vaccine preparation)，Cohen和Shafferman(编辑)，《疫苗设计和制备的新策略》(Novel Strageties in Design andProduction of Vaccines)，本文都已完整纳入作为参考。另外，本领域的技术人员了解如何通过常规的试验确定对这些方法的改动以适应本发明。
制备流感病毒用的细胞可在含血清或无血清的培养基内培养。在某些情况下，如用于制备纯化病毒时，一般希望宿主细胞能在无血清条件下生长。细胞可在小规模培养管或培养瓶，如含25ml以下培养基的培养管或培养瓶内培养，也可在振摇瓶、旋转瓶或微载体珠(例如DEAE-右旋糖酐微载体珠，如Dormacell，Pfeifer &Langen；Superbead，Flow Laboratories；苯乙烯共聚物三甲胺微载体珠，如Hillex，SoloHill，Ann Arbor)反应器内大规模培养。微载体珠是小球(直径在100-200微米之间)，可为单位体积的细胞培养物粘附生长提供很大的表面积。例如，1升培养基包含的微载体珠数量超过2千万个，提供的生长表面面积超过8000cm2。在制备商业病毒，如疫苗时，通常希望在生物反应器或发酵罐内培养细胞。目前可用的生物反应器1升以下到100升以上的都有，如Cyto3 Bioreactor(Osmonics，Minnetonka，MN；NBS bioreactors(New Brunswick Scientific，Edison，N.J.)；B.Braun Biotech International的实验室规模和商用规模的生物反应器(B.Braun Biotech，Melsungen，德国)。
在本发明的许多优选方面，无论培养体积大小，在适当的温度下培养都是十分重要的，这样才能确保利用温度依赖性的多质粒系统(见“用于流感病毒制备的多质粒系统”，引用文献如上)有效地回收重组和/或重配的流感病毒、加热病毒溶液便于过滤等。一般来说，需要有探测和维持细胞培养系统和/或其他溶液温度的调节器如恒温器或其他装置在适当时期内(如病毒复制期间等)将温度校正在正确的水平上。
在本文的某些实施方式(例如，其中的重配的病毒是由载体上的片段制备的)中，按照本领域熟知的方法将含有流感病毒基因组片段的载体导入(或转染)到宿主细胞内以使外源核酸进入到真核细胞内，如钙磷酸盐共沉淀技术、电穿孔技术、微注射技术、脂质体转染技术以及利用多胺转染试剂进行转染的技术。例如，根据厂家提供的说明书利用多胺转染试剂TransFT-LTl(Minis)可将载体如质粒转染到宿主细胞如COS细胞、293T细胞或COS细胞与293T或MDCK细胞的混合培养物内，制备出重配的病毒等。将约1μg载体导入到宿主细胞群内需要约2μlTransIT-LTl，稀释到160μl培养基内，优选无血清培养基，总体积为200μl。DNA：转染试剂混合物在室温下孵育45分钟，然后加入800μl培养基。转染混合物加到宿主细胞上，细胞按照上述条件或者本领域技术人员熟知的其他方法培养。相应的，在用细胞培养物制备重组病毒或重配病毒时，将带有8个基因组片段(PB2、PB1、PA、NP、M、NS、HA和NA)中不同片段的载体分别与约2μl TransIT-LTl混合物，转染到宿主细胞内。另外，在转染前还可以用无血清培养基如Opti-MEM I替换含血清的培养基，然后孵育4-6小时。
另外，也可以利用电穿孔技术将含有流感病毒基因组片段的这种载体导入到宿主细胞内。例如，含A型或B型流感病毒基因组片段的质粒载体适于通过如下过程利用电穿孔技术导入到Vero细胞内。简言之，收获约5×106在添加10％胎牛血清(FBS)的MEM培养基中生长的Vero细胞，悬浮于0.4ml OptiMEM中，然后加入到电穿孔槽内，通过轻叩温和混匀。按照厂家的说明书进行电穿孔操作，300伏、950微法、持续时间28-30微秒。通过轻叩再次温和混匀细胞，电穿孔后约1-2分钟将0.7ml含10％FBS的MEM直接加入到电穿孔槽内。然后将细胞转移到含2ml MEM、10％FBS的标准6孔组织培养板的2个孔内。洗涤电穿孔槽回收槽内剩余的细胞，洗涤的悬液再分成两份加到上述2个孔内，终体积约为3.5mL。然后在适于病毒生长的条件下孵育细胞，例如，对于冷适应性病毒株来说孵育温度约为33℃。
试剂盒
为了便于使用本发明的方法和组合物，疫苗和/或组合物的任何组分，如尿囊液和各种制剂中的重配病毒等，以及用于实验性或治疗性疫苗所用的流感病毒的包装和感染的其他组分，如缓冲液、细胞、培养基都可以包装成试剂盒的形式。一般来说，试剂盒除了包含上述组分以外，还包含其他材料，如操作本发明方法的说明书、包装材料和容器。
虽然为了清楚理解的目的，在上文已对本发明作了详细描述，但是，本领域的技术人员应当清楚的是，只要不偏离本发明的真实范围，通过阅读本说明书可以对本发明的形式和细节做出某些修改。例如，上面所描述的所有技术和设备都可以以各种组合方式使用。出于所有目的，本申请所引用的所有文献、专利、专利申请或其他资料都已完整纳入作为参考，其程度如果已将各个出版物、专利、专利申请或其它文献单独纳入本文作为参考。
                                    表
表1
  步骤的描述   步骤的细节
  步骤1.   主供体病毒(MDV)和WT病毒共转染CEK细胞
  步骤2.   筛选重配病毒   根据病毒株的不同可在鸡蛋或CEK细胞内进行。筛选MDV NA和/或HA。
  步骤3.   克隆重配病毒
  步骤4.   鸡蛋内重配病毒的纯化
  步骤5.   扩增鸡蛋内的重配病毒以制备主病毒株(MVS)
  步骤6.   扩增MVS以制备主工作病毒株(MWVS).
  步骤7.   鸡蛋的挑选、洗涤和初次孵育以及接种   含重配病毒的鸡蛋在孵育期间可以摇动
  步骤8.   鸡蛋的照光检查、接种、封闭、二次孵育等
  步骤9.   鸡蛋的照光检查和降温
  步骤10.   从鸡蛋内收获病毒液   含病毒的溶液还可以加温和无菌过滤以去除杂质/污染物(生物负荷)
  步骤11.   病毒溶液的澄清   溶液还可以选择超滤以去除尿酸和其他动物源杂质以及稳定溶液
  步骤12.   病毒溶液的稳定化   除了pH为6.6到6.8的明胶或明胶水解物以外，还可以选择加入精氨酸，或者用精氨酸代替明胶或明胶水解物以稳定溶液。只使用精氨酸可避免引入其他动物性产物
  步骤13.   病毒溶液的毒力分析   可选择使用“通用试剂”和视野聚焦分析代替TCID50来确定毒力
  步骤14.   病毒溶液的无菌分析
  步骤15.   病毒溶液的NAF调整   可选择减少NAF的含量或用缓冲液代替以提高病毒的稳定性
表2
  细胞培养物的管/孔   MDV的MOI  野生型病毒的MOI   靶孵育时间(小时)
  1   5.0  1.0   24
  2   5.0  0.2   24
  3   1.0  1.0   24
4 1.0 0.2 24
  5   1.0  0.04   24
  6   n/a  n/a   24
表3.
  制造过程   检测项目   检测类型/检测时间   其他替代方法
  接种前/后的鸡蛋   鸡蛋照光检查   手工/数小时   鸡蛋的自动照光检查或热成像检查
  病毒收获物   MPA生物负荷   手工/14天手工/3天   生物量度检测或MPN
  病毒收获物   支原体生长   手工/28天   PCR
  病毒收获物   分支杆菌生长   手工/56天   PCR或临床诊断系统
表4.
  病毒类型   株和分离编号
  AH1N1   caA/Beijing/262/95
  AH1N1   caA/New Caledonia/20/99
  AH3N2   caA/Sydney/05/97
  AH3N2   caA/Panama/2007/99
  B   caB/Victoria/504/2000
  B   caB/Yamanashi/166/98
表5.A/Sydney/05/97病毒毒力[log10TCID50/mL].
  处理步骤                     温度
  5±3℃   20±3℃   31±3℃
  经稳定化处理的VAF(处理前)   8.7±0.3   8.6±0.2   8.8±0.2
  经稳定化处理的VAF(处理后)   9.0±0.2   8.8±0.2   8.8±0.2
  经过滤的VAF(收集物)   7.6±0.2   7.7±0.1   8.7±0.1
  经离心稳定化处理的VAF(对照)   8.4±0.3   8.6±0.2   8.7±0.2
  过滤样品与对照相比毒力升高/下降的幅度   -0.8   -0.7   0.0
NA＝未进行分析
表5中的所有过滤用的都是同一天的收获物。在用Sartoclean CA和Sartopore2滤器过滤前VAF分别置于5±3℃、20±3℃和31±3℃保持60分钟。
表6.A/Sydney/05/97的神经酰胺酶活性[μU/ml]
  处理步骤                  温度
  5±3℃   20±3℃   31±3℃
  经稳定化处理的VAF(处理前)   34.4   36.4   38.4
  经稳定化处理的VAF(处理后)   43.7   38.7   39.1
  经过滤的VAF(收集物)   BD   BD   22.1
  经离心稳定化处理的VAF(对照)   28.2   27.5   27.0
  过滤样品与对照相比活性升高/下降的幅度   -28.2   -27.5   -4.9
BD＝检测限以下(低于5μU/ml)
表6中的所有过滤用的都是同一天的收获物。在用Sartoclean CA和Sartopore2滤器过滤前VAF分别置于5±3℃、20±3℃和31±3℃保持60分钟。
表7.A/Sydney/05/97的血凝素活性[HA滴度].
 处理步骤                  温度
  5±3℃   20±3℃   31±3℃
 经稳定化处理的VAF(处理前)   128   128   256
 经稳定化处理的VAF(处理后)   128   256   128
 经过滤的VAF(收集物)   4   16   64
 经离心稳定化处理的VAF(对照)   128   64   256
表7中的所有过滤用的都是同一天的收获物。在用Sartoclean CA和Sartopore2滤器过滤前VAF分别置于5±3℃、20±3℃和31±3℃保持60分钟。
表8.A/Sydney/05/97病毒的毒力[log10TCID50/mL].
  处理步骤                     温度
  5±3℃   20±3℃   31±3℃
  经稳定化处理的VAF(处理前)   8.7±0.1   8.5±0.2   8.8±0.1
  经稳定化处理的VAF(处理后)   8.9±0.2   8.9±0.2   8.7±0.2
  经过滤的VAF(收集物)   7.6±0.2   7.5±0.2   8.7±0.2
  经离心稳定化处理的VAF(对照)   8.5±0.2   8.5±0.1   8.7±0.1
  过滤样品与对照相比毒力升高/下降的幅度   -0.9   -1.0   0.0
表8中的所有过滤用的都是同一天的收获物。在用Sartoclean CA和Sartopore2滤器过滤前VAF分别置于5±3℃、20±3℃和31±3℃保持60分钟*。
表9.A7Sydney/05/97的神经酰胺酶活性[μU/ml].
  处理步骤                  温度
  5±3℃   20±3℃   31±3℃
  经稳定化处理的VAF(处理前)   29.8   26.1   27.0
  经稳定化处理的VAF(处理后)   29.3   26.1   27.3
  经过滤的VAF(收集物)   BD   BD   15.4
  经离心稳定化处理的VAF(对照)   21.3   16.1   20.3
  过滤样品与对照相比活性升高/下降的幅度   -21.3   -16.1   -4.9
BD＝检测限以下(低于5μU/ml)
表9中的所有过滤用的都是同一天的收获物。在用Sartoclean CA和Sartopore2滤器过滤前VAF分别置于5±3℃、20±3℃和31±3℃保持60分钟*。
表10.A/Sydney/05/97的血凝素活性[HA滴度]
 处理步骤                温度
  5±3℃   20±3℃   31±3℃
 经稳定化处理的VAF(处理前)   256   128   256
 经稳定化处理的VAF(处理后)   256   256   128
 经过滤的VAF(收集物)   16   32   128
 经离心稳定化处理的VAF(对照)   128   128   128
*所有试验都用10％的PBS调整体积
表10中的所有过滤用的都是同一天的收获物。在用Sartoclean CA和Sartopore2滤器过滤前VAF分别置于5±3℃、20±3℃和31±3℃保持60分钟*。
表11.A/Sydney/Q5/97病毒的毒力[log10TCID50/mL].
  处理步骤                   加温时间
  30min   90min   180min
  经稳定化处理的VAF(加温前)*   8.7±0.2   8.7±0.2   8.7±0.2
  经稳定化处理的VAF(升温后)   8.9±0.2   8.9±0.2   8.7±0.2
  经过滤的VAF(收集物)   8.5±0.2   8.5±0.2   8.9±0.3
  经离心稳定化处理的VAF(对照)*   8.9±0.3   8.9±0.3   8.9±0.3
  过滤样品与对照相比毒力升高/下降的幅度   -0.4   -0.4   0.0
所有过滤用的都是同一天的收获物。在用Sartoclean CA和Sartopore2滤器过滤前VAF置于31±3℃分别保持30、90、180分钟。
表12.A/Sydney/05/97的神经酰胺酶活性[μU/ml].
  处理步骤                 加温时间
  30min   90min   180min
  经稳定化处理的VAF(加温前)*   35.0   35.0   35.0
  经稳定化处理的VAF(升温后)   38.0   35.2   36.0
  经过滤的VAF(收集物)   17.8   22.9   23.1
  经离心稳定化处理的VAF(对照)*   27.9   27.9   27.9
  过滤样品与对照相比活性升高/下降的幅度   -10.1   -5.0   -4.8
所有过滤用的都是同一天的收获物。在用Sartoclean CA和Sartopore2滤器过滤前VAF置于31±3℃分别保持30、90、180分钟。
表13.A/Sydney/05/97的血凝素活性[HA滴度].
  处理步骤                加温时间
  30min   90min   180min
  经稳定化处理的VAF(加温前)*   256   256   256
  经稳定化处理的VAF(升温后)   128   256   256
  经过滤的VAF(收集物)   128   128   128
  经离心稳定化处理的VAF(对照)*   NA   NA   NA
*在将VAF分成4个试验(0、30、60、90分钟加温处理)前经稳定化处理的VAF和经离心稳定化处理的VAF(对照)取自样品池。
NA＝未做
所有过滤用的都是同一天的收获物。在用Sartoclean CA和Sartopore2滤器过滤前VAF置于31±3℃分别保持30、90、180分钟。
表14.A/Sydney/05/97病毒的毒力[log10TCID50/mL].
  处理步骤                        加温时间
  0min   30min   60min   90min
  经稳定化处理的VAF(加温前)*   8.8±0.3   8.8±0.3   8.8±0.3   8.8±0.3
  经稳定化处理的VAF(升温后)   -   8.7±0.2   8.6±0.1   8.6±0.1
  经过滤的VAF(收集物)   7.7±0.1   8.3±0.2   8.4±0.2   8.6±0.1
  经离心稳定化处理的VAF(对照)*   8.6±0.1   8.6±0.1   8.6±0.1   8.6±0.1
  过滤样品与对照相比毒力升高/下降的幅度   -0.9   -0.3   -0.2   0.0
所有过滤用的都是同一天的收获物。在用Sartoclean CA和Sartopore2滤器过滤前VAF置于31±3℃分别保持0、30、60、90分钟。
表15.A/Sydney/05/97的神经酰胺酶活性[μU/ml].
  处理步骤                       加温时间
  0min   30min   60min   90min
  经稳定化处理的VAF(加温前)*   44.5   44.5   44.5   44.5
  经稳定化处理的VAF(升温后)   -   44.5   41.0   47.5
  经过滤的VAF(收集物)   6.0   17.5   26.0-   30.0
  经离心稳定化处理的VAF(对照)*   33.0   33.0   33.0   33.0
  过滤样品与对照相比活性升高/下降的幅度   27.0   -15.5   -7.0   -3.0
所有过滤用的都是同一天的收获物。在用Sartoclean CA和Sartopore2滤器过滤前VAF置于31±3℃分别保持0、30、60、90分钟。
表16.A/Sydney/05/97的血凝素活性[HA滴度]
  处理步骤              加温时间
  0min   30min   60min   90min
  经稳定化处理的VAF(加温前)*   64   64   64   64
  经稳定化处理的VAF(升温后)   -   128   128   128
  经过滤的VAF(收集物)   16   64   128   128
  经离心稳定化处理的VAF(对照)*   64   64   64   64
*在将VAF分成4个试验(0、30、60、90分钟加温处理)前经稳定化处理的VAF和经离心稳定化处理的VAF(对照)取自样品池。
所有过滤用的都是同一天的收获物。在用Sartoclean CA和Sartopore2滤器过滤前VAF置于31±3℃分别保持0、30、60、90分钟。
表17.病毒毒力[log10TCID50/mL].
  处理步骤                            加温时间
  0min   30min   60min   90min
  经稳定化处理的VAF(加温前)*   8.6±0.2   8.6±0.2   8.6±0.2   8.6±0.2
  经稳定化处理的VAF(升温后)   -   8.6±0.2   8.6±0.2   8.5±0.3
  经过滤的VAF(收集物)   8.1±0.2   8.1±0.2   8.5±0.2   8.5±0.3
  经离心稳定化处理的VAF(对照)*   8.6±0.2   8.6±0.2   8.6±0.2   8.6±0.2
  过滤样品与对照相比毒力升高/下降的幅度   -0.5   -0.5   -0.1   -0.1
所有过滤用的都是同一天的收获物。在用Sartoclean CA和Sartopore2滤器过滤前VAF置于31±3℃分别保持0、30、60、90分钟。
表18.神经酰胺酶活性[μU/ml].
  处理步骤                     加温时间
  0min   30min   60min   90min
  经稳定化处理的VAF(加温前)*   35.5   35.5   35.5   35.5
  经稳定化处理的VAF(升温后)   -   36.5   36.0   34.5
  经过滤的VAF(收集物)   7.0   9.0   14.5   19.5
  经离心稳定化处理的VAF(对照)*   23.0   23.0   23.0   23.0
  过滤样品与对照相比活性升高/下降的幅度   -16   -14   -8.5   -3.5
所有过滤用的都是同一天的收获物。在用Sartoclean CA和Sartopore2滤器过滤前VAF置于31±3℃分别保持0、30、60、90分钟。
表19.血凝素活性
  处理步骤                     加温时间
  0min   30min   60min   90min
  经稳定化处理的VAF(加温前)*   64   64   64   64
  经稳定化处理的VAF(升温后)   -   64   64   128
  经过滤的VAF(收集物)   16   32   64   64
  经离心稳定化处理的VAF(对照)*   64   64   64   64
*在将VAF分成4个试验(0、30、60、90分钟加温处理)前经稳定化处理的VAF和经离心稳定化处理的VAF(对照)取自样品池。
所有过滤用的都是同一天的收获物。在用Sartoclean CA和Sartopore2滤器过滤前VAF置于31±3℃分别保持0、30、60、90分钟。
表20.6株流感病毒的毒力[log10TCID50/mL].
  流感病毒株                        处理步骤
  稳定化的VAF*   过滤的VAF   离心稳定化的VAF*   毒力升高/降低幅度
  A/Beijing/262/95RT**   9.7+0.1   9.6±0.2   9.6±0.3   0.0
  A/Beijing/262/9531±3℃   9.7+0.1   9.4±0.3   9.6±0.3   -0.2
  A/New Caledonia/20/99RT**   9.6+0.2   9.3±0.2   9.5±0.2   -0.2
  A/New Caledonia/20/9931±3℃   9.6±0.2   9.3±0.2   9.5±0.2   -0.2
  A/Sydney/05/97RT   8.8±0.3   7.7±0.1   8.6±0.1   -0.9
  A/Sydney/05/9731±3℃   8.8±0.3   8.4±0.2   8.6±0.1   -0.2
  A/Panama/2007/99R**   8.5±0.2   8.2±0.1   8.5±.3   -0.3
  A/Panama/2007/9931±3℃   8.5±0.2   8.6±0.2   8.5±0.3   0.1
  B/Victoria/504/2000RT**   8.3±0.2   7.8±0.2   8.4±0.2   -0.6
  B/Victoria/504/200031±3℃   8.3±0.2   8.4±0.2   8.4±0.2   0.0
  B/Yamanashi/166/98RT**   8.4±0.2   8.3±0.2   8.6±0.2   -0.3
  B/Yamanashi/166/98 31±3℃   8.4±0.2   8.4±0.2   8.6±0.2   -0.2
*在将VAF分成2个试验(RT和31±3℃)前经稳定化处理的VAF和经离心稳定化处理的VAF(对照)取自样品池。
**RT：室温
同一病毒株的两种过滤用的都是同一天的收获物。在用Sartoclean CA和Sartopore2滤器过滤前VAF置于31±3℃分别保持0(RT)或60分钟。
表21.6株流感病毒的神经酰胺酶活性[μU/ml]
  流感病毒株                    处理步骤
  稳定化的VAF*  过滤的VAF   离心稳定化的VAF*   活性升高/降低幅度
  A/Beijing/262/95RT**   55.5   47.5   52.0   -4.5
  A/Beiiing/262/95 31±3℃   55.5   51.5   52.0   -0.5
  A/New Caledonia/20/99RT**   49.5   47.5   48.5   -1.0
  A/New Caledonia/20/99 31±3℃   49.5   48.5   48.5   0.0
  A/Sydney/05/97RT**   44.5   6.0   33.0   -27.0
  A/Svdnev/05/97 31±3℃   44.5   26.0   33.0   -7.0
  A/Panama/2007/99RT**   61.0   16.5   48.0   -31.5
  A/Panama/2007/99 31±3℃   61.0   40.0   48.0   -8.0
  B/Victoria/504/2000RT**   58.5   20.5   44.0   -23.5
  B/Victoria/504/200031±3℃   58.5   37.0   44.0   -7.0
  B/Yamanashi/166/98RT**   66.5   51.0   55.5   -4.5
  B/Yamanashi/166/9831±3℃   66.5   53.0   55.5   -2.5
*在将VAF分成2个试验(RT和31±3℃)前经稳定化处理的VAF和经离心稳定化处理的VAF(对照)取自样品池。
**RT：室温
同一病毒株的两种过滤用的都是同一天的收获物。在用Sartoclean CA和Sartopore2滤器过滤前VAF置于31±3℃分别保持0(RT)或60分钟。
表22.6株流感病毒的血凝素活性[HA滴度]
  流感病毒株                        处理步骤
  稳定化的VAF*   升温过程中稳定化的VAF*   过滤的VAF   离心稳定化的VAF*
  A/Beiiing/262/95RT**   1024   -   128   1024
  A/Beijing/262/95 31±33℃   1024   512   512   1024
  A/New Caledonia/20/99RT**   32   -   32   64
  A/New Caledonia/20/99 31±33℃   32   32   32   64
  A/Sydney/05/97RT**   64   -   16   64
  A/Sydney/05/97 31±33℃   64   128   128   64
  A/Panama/2007/99RT**   128   -   32   128
  A/Panama/2007/9931±33℃   128   128   64   128
  B/Victoria/504/2000RT**   128   -   32   128
  B/Victoria/504/2000 31±33℃   128   64   64   128
  B/Yamanashi/166/98RT**   512   -   16   32
  B/Yamanashi/166/9831±33℃   512   32   32   32
*在将VAF分成2个试验(RT和31±3℃)前经稳定化处理的VAF和经离心稳定化处理的VAF(对照)取自样品池。
**RT：室温
同一病毒株的两种过滤用的都是同一天的收获物。在用Sartoclean CA和Sartopore2滤器过滤前VAF置于31±3℃分别保持0(RT)或60分钟。
表23.6株流感病毒的毒力[log10TCID50/mL]
  流感病毒株                         处理步骤
  稳定化的VAF*   过滤的VAF   离心稳定化的VAF*   毒力升高/降低幅度
  A/Beijing/262/95RT**   9.6±0.1   9.4±0.2   9.6±0.1   -0.2
  A/Beijing/262/95 31±3℃   9.6±0.1   9.5±0.2   9.6±0.1   -0.1
  A/New Caledonia/20/99RT**   9.1±0.2   9.5±0.2   9.2±0.2   0.3
  A/New Caledonia/20/9931±3℃   9.1±0.2   9.2±0.3   9.2±0.2   0.0
  A/Sydney/05/97RT**   8.6±0.2   8.1±0.2   8.6±0.2   -0.5
  A/Sydney/05/97 31±3℃   8.6±0.2   8.5±0.2   8.6±0.2   -0.1
  A/Panama/2007/99RT**   8.9±0.2   8.3±0.2   8.5±0.2   -0.2
  A/Panama/2007/99 31±3℃   8.9±0.2   8.6±0.1   8.5±0.2   0.1
  B/Victoria/504/2000RT**   7.6±0.2   7.7±0.2   7.9±0.2   -0.2
  B/Victoria/504/2000 31±3℃   7.6±0.2   7.7±0.1   7.9±0.2   -0.2
  B/Yamanashi/166/98RT**   8.4±0.1   8.2±0.2   8.3±0.3   -0.1
  B/Yamanashi/166/98 31±3℃   8.4±0.1   8.3±0.2   8.3±0.3   0.0
*在将VAF分成不同的稳定化收集物(RT和31±3℃)前经稳定化处理的VAF和经离心稳定化处理的VAF(对照)取自样品池。
**RT：室温
同一病毒株的两种过滤用的都是同一天的收获物。在用Sartoclean CA和Sartopore2滤器过滤前VAF置于31±3℃分别保持0(RT)或60分钟。
表24.6株流感病毒的神经酰胺酶活性[μU/ml]
  流感病毒株                      处理步骤
  稳定化的VAF*  过滤的VAF   离心稳定化的VAF*   活性升高/降低幅度
  A/Beijing/262/95RT**   56.5   47.5   54.5   -7.0
  A/Beijing/262/9531±3℃   64.5   56.0   58.5   -1.5
  A/New Caledonia/20/99RT**   46.0   38.5   40.0   -1.5
  A/New Caledonia/20/99 31±3℃   46.0   43.0   40.0   3.0
  A/Sydney/05/97RT**   35.5   7.0   23.0   -16.0
  A/Sydney/05/9731±3℃   35.5   14.5   23.0   -8.5
  A/Panama/2007/99RT**   55.5   15.0   34.5   -19.5
  A/Panama/2007/9931±3℃   60.5   42.5   39.0   3.5
  B/Victoria/504/2000RT**   35.0   21.0   28.5   -7.5
  B/Victoria/504/200031±3℃   39.0   25.5   31.5   -6.0
  B/Yamanashi/166/98RT**   29.0   26.0   28.5   -2.5
  B/Yamanashi/166/98 31±3℃   33.5   27.5   29.5   -2.0
*在将VAF分成不同收集物(RT和31±3℃)前经稳定化处理的VAF和经离心稳定化处理的VAF(对照)取自样品池。
**RT：室温
同一病毒株的两种过滤用的都是同一天的收获物。在用Sartoclean CA和Sartopore2滤器过滤前VAF置于31±3℃分别保持0(RT)或60分钟。
表25.6株流感病毒的血凝素活性[HA滴度]
  流感病毒株                       处理步骤
  稳定化的VAF*   升温过程中稳定化的VAF*  过滤的VAF   离心稳定化的VAF*
  A/Beijing/262/95RT**   256   -   1024   512
  A/Beijing/262/9531±3℃   256   1024   2048   512
  A/New Caledonia/20/99RT**   512   -   512   512
  A/New Caledonia/20/99 31±3℃   512   512   512   512
  A/Sydney/05/97RT**   64   -   16   64
  A/Sydney/05/97 31±3℃   64   64   64   64
  A/Panama/2007/99RT**   256   -   64   256
  A/Panama/2007/99 31±3℃   256   512   512   256
  B/Victoria/504/2000RT**   64   -   128   128
  B/Victoria/504/200031±3℃   64   64   64   128
  B/Yamanashi/166/98RT**   128   -   32   128
  B/Yamanashi/166/98 31±3℃   128   64   64   128
*在将VAF分成不同收集物(RT和31±3℃)前经稳定化处理的VAF和经离心稳定化处理的VAF(对照)取自样品池。
**RT：室温
同一病毒株的两种过滤用的都是同一天的收获物。在用Sartoclean CA和Sartopore2滤器过滤前VAF置于31±3℃分别保持0(RT)或60分钟。
表26.SEC分析-峰面积比较
  样品细节   样品ID                     220处峰面积
  病毒峰-(10.5min)   第1组杂质(18到21min)   第2组杂质(21到27min)
  净样品(VH)10倍浓缩样品用1×-SPG洗涤1×5次用1×-SPG洗涤10×5次渗透液或过滤液洗涤-1洗涤-2洗涤-3洗涤-4洗涤-5   1×10×1×-W10×-W渗透液W-1W-2W-3W-4W-5   12211119210051028225   31785126849213115858338376626229618791046876   339528435652251021943608127126015773576531102769
表27.A/New Caledonia-CELISA值
  样品细节   样品ID  复孔(N)   平均值+/-SD(CELISA)
  净样品(VH)10倍浓缩样品用1×-SPG洗涤5次的1×用1×-SPG洗涤5次的10×渗透液或过滤液用1×-SPG将10×稀释回1×用1×-SPG将10×-W稀释回1×-W   1×10×1×-W10×-W渗透液10×到1×10×-W到1×-W   4444444   9.1+/-0.0210.0+/-0.058.9+/-0.039.9+/-0.04＜LOQ9.0+/-0.088.9+/-0.02
表28.典型制剂的组成
  制剂号   组成
  1   100ml磷酸盐缓冲液，含10％尿囊液、7％蔗糖，不加赋形剂
  2   100ml磷酸盐缓冲液，含60％尿囊液、7％蔗糖，不加赋形剂
  3   100ml磷酸盐缓冲液，含10％尿囊液、7％蔗糖[2]、1％明胶水解物和1％精氨酸
  4   100ml磷酸盐缓冲液，含60％尿囊液、7％蔗糖[3]、1％明胶水解物和1％精氨酸
  5   100ml磷酸盐缓冲液，含60％尿囊液、10％蔗糖、2％明胶水解物和2％精氨酸
  6   100ml磷酸盐缓冲液，含60％尿囊液、10％蔗糖和2％精氨酸
  8   100ml磷酸盐缓冲液，含60％尿囊液、10％蔗糖、2％精氨酸、2％明胶水解物和2.5mMEDTA
  9   50ml组氨酸缓冲液，含60％尿囊液、10％蔗糖、2％精氨酸和2％明胶水解物
  50ml组氨酸缓冲液，含60％尿囊液、10％蔗糖、2％精氨酸、2％明胶水解物和2.5mMEDTA
表29.病毒在典型制剂中的稳定性(滴度下降log10/mL/月)
  制剂号   A/New Caledonia20/99   A/Panama/2007/99   B/Hong Kong/330/01
  1   0.030   0.133   0,156
  2   0.040   0.098   0.166
  3   0.042   0.080   0.151
  4   0.087   0.073   0.181
  5   0.021   0.093   0.107
  6   未观察到滴度下降   0.090   0.097
  7   0.046   0.037   0.113
  8   0.068   0.072   0.061
  9   0.034   0.073   0.121
表30.
  成分   Liq01   Liq02   Liq03   Liq04   Liq05   Liq06   Liq07   Liq08   Liq09   ars43Liq10   avs53Liq11   Liq12
  KP04PH 7.2   100mM   100mM   100mM   100mM   100mM   100mM   100mM   100mM   100mM   100mM
  HBPES   100mM
  蔗糖   15％   15％   15％   15％   10％   15％   15％   15％   20％   20％   20％
  明胶   1％   1％   1％   2％   2％   1％   2％   2％   2％
  精氨酸   2％   2％   2％   2％   2％   1％   2％
  甘氨酸   1％
  蛋氨酸   0.15％
  PVP   1％
  右旋糖酐   1％
  Pluronic   0.02％   0.02％
  单价CAIV(添加)   10％   10％   10％   10％   10％   10％   10％   10％   10％   10％   10％   10％
  NAF(添加)   50％.   50％   50％   50％   50％   50％   50％   50％   50％   50％   50％   50％
  纯水   q.s.   q.s.   q.s.   q.s.   q.s.   q.s.   q.s.   q.s.   q.s.   q.s.   q.s.   q.s.
                                                第一滴度：FFA方法分析的毒力
  B/Hongkong(SPG内)       靶：6.9                                                         4℃(月数)
  制剂   0   0   1   1   2   2   3   3   4   4   5   5   6   6   制剂组成
  Liq01   7.3   7.3   6.6   6.6   6.1   6.2   6.5   6.5   6.5   6.6   6.7   6.7   6.5   6.4   15蔗糖/1明胶/2精氨酸
  Liq01(重复)   6.9   6.8   6.7   6.6   6.6   6.5   6.6   6.5   6.4   6.4   6.4   15蔗糖/1明胶/2精氨酸
  Liq02   7.3   7.3   6.6   6.4   6.3   6.4   6.3   6.3   6.4   6.4   6.6   6.7   6.1   6.3   15蔗糖/1明胶/1甘氨酸
  Liq02(重复)   6.7   6.6   6.3   6.6   6.5   6.6   6.4   6.3   6.4   6.3   6.2   6.2   15蔗糖/1明胶/1甘氨酸
  Liq03   7.3   7.1   6.5   6.5   6.2   6.1   6.4   6.3   6.4   6.2   6.7   6.8   6.3   15蔗糖/1明胶
  Liq03(重复)   6.8   6.9   6.7   6.7   6.5   6.6   6.4   6.4   6.3   6.2   6.3   6.2   15蔗糖/1明胶
  Liq04   7.2   7.2   6.3   6.5   6.1   6.1   6.2   6.4   6.4   6.4   6.7   6.8   6.5   6.3   15蔗糖/2明胶/2精氨酸
  Liq04(重复)   6.8   6.8   6.7   6.7   6.5   6.5   6.4   6.4   6.4   6.4   6.3   6.2   15蔗糖/2明胶/2精氨酸
  Liq05   7.1   7.1   6.5   6.5   6.1   6.1   6.4   6.2   6.4   6.5   6.7   6.7   6.4   6.2   10蔗糖/2明胶/2精氨酸
  Liq05(重复)   7.0   7.1   6.8   6.6   6.6   6.6   6.7   6.9   6.7   6.8   6.9   6.9   10蔗糖/2明胶/2精氨酸
  Liq06   7.1   7.0   5.8   5.7   5.4   5.3   5.1   5.3   4.6   4.1   4.4   3.6   3.7   5.0   15蔗糖/1明胶/2精氨酸，HEPES
  Liq07   7.0   7.1   6.3   6.3   5.9   5.9   6.3   6.3   6.2   6.2   6.5   6.6   6.4   6.4   15蔗糖/1PVP/2精氨酸
  Liq07(重复)   6.7   6.6   6.4   6.5   6.3   6.4   6.4   6.3   6.3   6.2   6.1   6.2   15蔗糖/1PVP/2精氨酸
  Liq08   7.0   6.9   6.4   6.4   6.0   6.0   6.3   6.4   6.4   6.1   7.1   6.7   6.4   6.3   15蔗糖/1右旋糖酐/2精氨酸
  Liq08(重复)   6.7   6.8   6.6   6.7   5.8   6.7   6.4   6.6   6.4   6.4   6.2   6.2   15蔗糖/1右旋糖酐/2精氨酸
  Liq09   6.9   7.0   6.5   6.4   6.0   6.0   6.3   6.3   6.0   6.2   6.7   6.6   6.3   6.4   20蔗糖/2明胶/2精氨酸
  Liq09(重复)   6.9   6.9   6.7   6.8   6.6   6.6   6.6   6.6   6.3   6.4   6.4   6.3   20蔗糖/2GeV2精氨酸
  Liq10   6.9   7.0   6   6.3   5.7   6.0   6.2   6.3   5.9   6.2   6.7   6.5   6.2   6.3   20蔗糖/2明胶/0.15蛋氨酸/0.02Plur
  Liq10(重复)   6.9   6.9   6.5   6.5   6.5   6.3   6.3   6   6.2   6.2   6.2   6   20蔗糖/2明胶/0.15蛋氨酸/0.02Plur
  Liq11   7.0   7.0   6.3   6.3   6.0   5.9   6.2   6.4   6.0   6.0   6.4   6.6   6.1   6.1   20蔗糖/2明胶/0.02Plur
  Liq12   6.9   7.0   6.3   6.5   6.4   6.4   6.1   6.1   5.8   5.3   5.1   5.3   5.6   5.3   只有NAF(60％)
                                                                  表31
  B/Harbin(SPG内)             靶：7.0                                                                                   4℃(月数)
  制剂   0   0   1   1   2   2   3   3   4   4   5   5   5   6   制剂组成
  Liq01   7.1   7.2   6.6   6.7   6.2   6.4   6.6   6.6   6.8   6.8   6.7   6.8   6.2   6.1   15蔗糖/1明胶/2精氨酸
  Liq01(重复)   6.9   6.9   6.7   6.8   6.7   6.6   6.6   6.6   6.6   6.4   6.4   6.5   15蔗糖/1明胶/2精氨酸
  Liq02   7.1   7.1   6.7   6.6   6.2   6.0   6.5   6.5   6.5   6.7   6.7   6.7   6.0   6.0   15蔗糖/1明胶/1甘氨酸
  Liq02(重复)   6.9   7   6.8   6.7   6.5   6.6   6.5   6.5   6.3   6.4   6.3   6.2   15蔗糖/1明胶/1甘氨酸
  Liq03   7.1   7.0   6.5   6.7   6.1   6.0   6.5   6.5   6.7   6.5   6.7   7.1   6.2   6.3   15蔗糖/1明胶
  Liq03(重复)   6.9   6.9   6.7   6.7   6.5   6.5   6.6   6.5   6.5   6.4   6.4   6.4   15蔗糖/1明胶
  Liq04   7.0   7.0   6.5   6.8   6.1   6.2   6.5   6.6   7.0   6.9   7.3   7.1   6.4   6.5   15蔗糖/2明胶/2精氨酸
  Liq04(重复)   6.8   6.8   6.7   6.7   6.7   6.6   6.5   6.5   6.4   6.5   6.4   6.5   15蔗糖/2明胶/2精氨酸
  Liq05   7.1   7.2   6.8   6.7   6.2   6.1   6.6   6.7   6.9   6.7   6.9   6.9   6.4   6.3   10蔗糖/2明胶/2精氨酸
  Liq05(重复)   7.0   7.0   6.6   6.5   6.7   6.8   6.8   6.8   6.7   6.8   6.7   6.6   10蔗糖/2明胶/2精氨酸
  Liq06   7.1   7.1   6.4   6.3   5.4   5.4   5.4   5.3   5.4   5.2   4.3   4.3   3.8   ud   15蔗糖/1明胶/2精氨酸，HEPES
  Liq07   7.0   7.1   6.7   6.8   6   6.2   6.4   6-4   6.5   6.6   6.4   6.7   6.4   6.5   15蔗糖/1PVP/2精氨酸
  Liq07(重复)   6.9   6.8   d.d   6.5   6.5   6.6   6.4   6.4   6.3   6.2   6.4   6.4   15蔗糖/1PVP/2精氨酸
  Liq08   7.1   6.9   6.6   6.9   5.9   6.1   6.4   6.4   6.6   6.9   6.7   6.7   6.2   6.4   15蔗糖/1右旋糖酐/2精氨酸
  Liq08(重复)   6.8   6.9   6.7   6.6   6.6   6.6   6.4   6.4   6.2   6.4   6.4   6.3   15蔗糖/1右旋糖酐/2精氨酸
  Liq09   6.9   7.0   6.8   6.9   6.1   6.2   6.5   6.5   6.8   6.8   6.6   6.9   6.4   6.4   20蔗糖/2明胶/2精氨酸
  Liq09(重复)   6.7   6.7   6.6   6.5   6.4   6.4   6.3   6.2   6.4   6.2   6.5   6.6   20蔗糖/2GeV2精氨酸
  Liq10   7.0   7.0   ud   ud   6.1   6.2   6.4   6.4   6.7   6.8   6.5   6.6   6.6   6.4   20蔗糖/2明胶/0.15蛋氨酸/0.02Plur
  Liq10(重复)   6.8   7.0   6.7   6.7   6.6   6.5   6.5   6.3   6.4   6.4   6.3   6.3   20蔗糖/2明胶/0.15蛋氨酸/0.02Plur
  Liq11   6.9   6.9   ud   ud   6   6.1   6.4   6.5   6.6   6.7   6.6   6.3   6.5   6.4   20蔗糖/2明胶/0.02Plur
  Liq12   6.9   6.9   6.5   6.5   6.3   6.1   6.0   6.1   6.1   6.1   5.8   5.7   5.9   5.9   只有NAF(60％)
                                                                                             表32
                                                            第一滴度：FFA方法分析的毒力
  A/New Caledonia(SPG内)          靶：6.8                                                         4℃(月数)
  制剂   0   0   1   1   2   2   3   3   4   4   5   5   6   6   制剂组成
  Liq01   7.1   7.0   7.0   7.0   6.6   6.8   6.5   6.6   6.7   6.8   6.9   6.8   6.5   6.6   15蔗糖/1明胶/2精氨酸
  Liq01(重复)   7.0   7.0   6.9   6.7   6.7   6.6   6.5   6.5   6.6   6.7   6.6   6.6   15蔗糖/1明胶/2精氨酸
  Liq02   7.0   7.0   6.9   7.0   6.7   6.6   6.6   6.4   6.5   6.6   6.9   6.8   6.3   6.4   15蔗糖/1明胶/1甘氨酸
  Liq02(重复)   7.1   7.1   6.9   6.9   6.9   6.7   6.8   6.7   6.7   6.8   6.7   6.4   15蔗糖/1明胶/1甘氨酸
  Liq03   7.0   7.2   6.8   6.9   6.6   6.4   6.5   6.5   6.5   6.5   6.9   6.9   6.4   6.4   15蔗糖/1明胶
  Liq03(重复)   6.8   6.9   6.7   6.7   6.6   6.6   6.5   6.6   6.6   6.6   6.6   6.5   15蔗糖/1明胶
  Liq04   7.2   7.2   6.8   7.0   6.7   6.4   6.5   65   6.5   6.7   7.0   7.1   6.5   6.5   15蔗糖/2明胶/2精氨酸
  Liq04(重复)   6.9   7.0   6.8   6.9   6.8   6.9   6.8   6.8   6.7   6.6   6.5   6.4   15蔗糖/2明胶/2精氨酸
  Liq05   7.2   7.1   7.0   7.0   6.7   6.6   6.5   6.6   6.6   6.7   7.0   7.1   6.7   6.6   10蔗糖/2明胶/2精氨酸
  Liq05(重复)   6.9   6.9   6.9   6.8   6.8   6.8   5.8   6.6   6.7   6.6   6.6   10蔗糖/2明胶/2精氨酸
  Liq06   6.9   6.9   6.4   6.3   5.5   5.5   5.4   5.0   UD   UD   4.7   4.7   3.S   4.1   15蔗糖/1明胶/2精氨酸，HEPES
  Liq07   7.1   7.1   6.5   6.6   6   6.1   6.3   6.3   6.3   6.3   6.8   6.6   6.4   6.2   15蔗糖/1PVP/2精氨酸
  Liq07(重复)   6.9   7.0   6.4   6.5   6.3   6.4   6.6   6.5   6.4   6.3   6.5   6.2   15蔗糖/1PVP/2精氨酸
  Liq08   7.1   6.9   6.8   6.9   6.3   6.4   6.4   6.4   6.5   6.5   6.8   7.3   6.4   6.4   15蔗糖/1右旋糖酐/2精氨酸
  Liq08(重复)   6.7   6.7   6.6   6.5   6.5   6.5   6.5   6.6   6.3   6.5   6.5   6.3   15蔗糖/1右旋糖酐/2精氨酸
  Liq09   6.8   6.9   7.0   6.8   6.5   5.7   6.5   6.5   6.4   6.5   7.1   7.2   6.4   6.3   20蔗糖/2明胶/2精氨酸
  Liq09(重复)   6.8   6.9   6.8   6.7   6.6   6.6   6.7   6.6   6.5   6.6   6.6   6.3   20蔗糖/2GeV2精氨酸
  Liq10   6.7   6.9   6.8   6.8   6.6   6.5   6.4   6.3   6.2   6.2   6.9   7.0   6.3   6.3   20蔗糖/2明胶/0.15蛋氨酸/0.02Plur
  Liq10(重复)   6.6   6.6   6.5   6.5   6.4   6.4   6.3   6.3   6.5   6.3   6.2   6.2   20蔗糖/2明胶/0.15蛋氨酸/0.02Plur
  Liq11   6.8   6.7   6.8   6.7   6.7   6.6   6.3   6.4   6.3   6.2   6.7   6.8   6.4   6.3   20蔗糖/2明胶/0.02Plur
  Liq12   6.9   7.0   5.7   5.6   5.5   5.3   5.1   5.3   4.7   4.6   4.5   4.5   4.4   4.5   只有NAF(60％)
                                                                                         表33
  A/Panama(SPG内)   靶7.4                                                         4℃(月数)
  制剂   0   0   1   1   2   2   3   3   4   4   5   5   6   6   制剂组成
  Liq01   7.6   7.6   7.4   7.3   6.9   7.1   6.6   6.6   6.8   7.1   7.4   7.4   6.6   6.7   15蔗糖/1明胶/2精氨酸
  Liq01(重复)   6.8   6.8   6.8   6.6   6.6   6.7   6.7   6.B   6.6   6.6   6.7   6.7   15蔗糖/1明胶/2精氨酸
  Liq02   7.6   7.6   7.3   7.3   6.9   6.4   6.6   6.6   6.9   6.8   7.3   7.4   6.6   6.6   15蔗糖/1明胶/1甘氨酸
  Liq02(重复)   7.3   7.0   7.3   7.1   7.1   7.4   7.3   7.2   7.2   6.7   6.7   15蔗糖/1明胶/1甘氨酸
  Liq03   7.2   7.8   7.2   7.3   6.8   6.7   6.6   6.7   6.6   7.1   7.3   7.4   6.6   6.8   15蔗糖/1明胶
  Liq03(重复)   6.8   6.8   6.9   6.8   6.7   6.8   6.8   6.8   6.7   6.8   6.8   6.6   15蔗糖/1明胶
  Liq04   7.8   7.8   7.4   7.4   7.1   7.1   6.5   6.5   6.9   6.9   7.5   7.4   6.6   6.7   15蔗糖/2明胶/2精氨酸
  Liq04(重复)   7.0   7.1   6.9   6.9   6.8   6.9   6.6   6.8   6.7   6.6   6.7   6.8   15蔗糖/2明胶/2精氨酸
  Liq05   7.8   7.8   7.5   7.4   6.8   6.8   6.7   6.7   7.0   7.0   7.4   7.3   6.7   6.7   10蔗糖/2明胶/2精氨酸
  Liq05(重复)   7.0   7.0   6.6   6.5   6.7   6.8   6.8   6.8   6.7   6.8   6.7   6.6   10蔗糖/2明胶/2精氨酸
  Liq06   7.7   7.6   6.9   7.0   6.3   6.4   6.2   5.9   5.8   5.8   6.0   6.0   5.0   4.8   15蔗糖/1明胶/2精氨酸，HEPES
  Liq07   7.2   7.1   7.4   7.0   7.0   6.6   6.7   6.5   7.0   7.1   7.2   7.3   6.6   6.3   15蔗糖/1PVP/2精氨酸
  Liq07(重复)   7.2   7.2   7.2   6.9   7.2   6.9   6.8   6.6   6.6   6.7   6.8   6.9   15蔗糖/1PVP/2精氨酸
  Liq08   7.1   7.2   7.1   7.2   6.6   6.8   6.7   6.S   6.9   6.9   7.2   7.2   6.5   6.6   15蔗糖/1右旋糖酐/2精氨酸
  Liq08(重复)   7.2   6.8   7.0   6.8   6.9   6.9   6.9   6.5   6.8   6.9   6.9   6.7   15蔗糖/1右旋糖酐/2精氨酸
  Liq09   7.4   7.3   6.9   6.9   6.7   7.0   6.3   6.8   6.7   7.0   7.3   7.3   6.5   6.5   20蔗糖/2明胶/2精氨酸
  Liq09(重复)   7.2   7.2   7.0   6.7   6.8   7.0   6.9   6.9   6.7   7.0   6.8   6.7   20蔗糖/2GeV2精氨酸
  Liq10   7.2   7.1   7.1   7.1   6.8   6.6   6.6   6.4   6.7   6.7   7.3   7.2   6.5   6.6   20蔗糖/2明胶/0.15蛋氨酸/0.02Plur
  Liq10(重复)   7.0   6.7   6.7   6.7   6.7   6.7   6.6   6.6   6.6   6.6   6.6   6.5   20蔗糖/2明胶/0.15蛋氨酸/0.02Plur
  Liq11   7.1   6.9   7.1   7.2   6.5   6.6   6.7   6.5   6.6   6.9   7.2   7.3   6.6   6.4   20蔗糖/2明胶/0.02Plur
  Liq12   7.2   7.3   6   6.4   6.3   5.9   4.9   5.0   5.1   4.5   4.6   4.6   3.3   4.1   只有NAF(60％)
                                                                                表34：
制剂：第二滴度
  成分   对照Liq13a   Liq14   Liq15   Liq15(脱气)   Liq16   Liq17   Liq18   Liq19   Liq20
  KPO4缓冲盐，pH7.2(1.1mM来自于所包含的病毒)   1.1mM   100mM   100mM   100mM   100mM   100mM   100mM   100mM
  柠檬酸缓冲盐，pH7.2   100mM
  蔗糖(0.7％来自所包含的病毒)   1％   10％   10％   10％   10％   10％   10％   10％   10％
  明胶   2％   2％   2％   2％   2％   2％   2％   2％
  精氨酸   2％   2％   2％   2％   2％   2％   2％   2％
  抑肽酶(PI)   0.02％
  亮抑蛋白酶半硫酸盐(PI)   0.02％
  溶菌酶抑制剂   0.1％
  蛋白酶抑制剂混合物   (0.6％DMSO)0.5％*
  PMSF   1mM
  胞甘2’一磷酸
  NAF(来自病毒)   10％   10％   10％   10％   10％   10％   10％   10％   10％
  NAF(添加)   50％   50％   50％   50％   50％   50％   50％   50％   50％
  IN KOH或1N HCl到pH7.2   pH7.2   到pH 7.0   到pH7.2   到pH7.2   到pH7.2   到pH 7.2   到pH7.2   到pH7.2   到pH
  纯水   未加   q.s.   q.s.   q.s.   q.s.   q.s.   q.s.   q.s.   q.s
  成分   Liq21   Liq22   Liq23   Liq31   Liq24   Liq25   Liq26   Liq27
  KPO4缓冲盐，pH7.2(1.1mM来自于所包含的病毒) 100mM 100mM 100mM 100mM 100mM 100mM 100mM 100mM
  蔗糖(0.7％来自于所包含的病毒)   10％   10％   10％   10％   10％   10％   9.3％
  明胶   10％   2％   2％   2％   2％   2％   2％   2％
  精氨酸   2％   2％   2％   2％   2％   2％   2％   2％
  L-抗坏血酸   2％   0.05％
  抗坏血酸6棕榈酸酯   0.005％   0.001％
  熊果甙   0.05％
  没食子酸丙酯(Propyll Gallate)   0.05％
  EDTA   10mM
  RNA酶抑制剂，SuperAse In   (0.05％丙氨酸)2.0U/μL
  NAF(来自病毒)   5mM   10％   10％   10％   10％   10％   10％   10％
  NAF(添加)   10％   50％   50％   50％   50％   50％   50％   50％
  1N KOH或IN HClto pH7.2   50％   滴定到H7.2   滴定到H7.2   滴定到H7.2   滴定到H7.2   滴定到H7.2   滴定到H7.2 滴定到H7.2
纯水   到pH 7.2 q.s. q.s. q.s. q.s. q.s. q.s. q.s.
  q.s.
                                                                 表35：
第二滴度：FFA方法分析毒力
  SP稳定的B/Hongkong          靶：6.9                                                               15℃(每周)
  0   0   2   2   4   4   6   6   8   8  10   10  12   12   14  14
  Liq13a   6.6   6.7   6.3   6.3   5.8   5.8   5.7   5.6   5.5   5.0  5.1   5.2  5.5   5.1   4.4  4.7   无赋形剂(60％NAF)，在15℃平衡
  Liq13b   6.6   6.6   6.4   6.4   6.0   5.8   5.6   5.5   5.0   5.3  4.8   4.9  ud   4.6   ud  5.2   无赋形剂(60％NAF)，在33℃平衡
  Liq13c   6.5   6.7   6.1   6.3   5.7   5.8   5.5   5.6   5.3   5.2  5.1   4.7  4.7   4.5   4.7  4.5   无赋形剂(60％NAF)，在45℃平衡
  Liq14   6.7   6.8   6.4   6.7   6.0   6.0   5.7   5.5   5.3   5.3  5.3   5.3  5.0   4.9   4.8  4.8   柠檬酸缓冲盐，10蔗糖/2明胶/2精氨酸，在15℃平衡
  Liq15a   6.9   6.7   6.6   6.5   6.2   6.2   6.0   5.9   5.6   5.8  5.5   5.5  5.4   5.1   5.0  5.4   10蔗糖/2明胶/2精氨酸，在15℃平衡
  Liq15b   6.7   6.9   6.6   6.5   6.1   6.1   6.0   6.0   5.4   5.3  4.8   5.7  5.1   5.2   5.0  4.7   10蔗糖/2明胶/2精氨酸，在33℃平衡
  Liq15c   6.7   6.8   6.4   6.4   5.9   6.0   5.7   5.S   4.8   5.3  5.2   5.2  ud   5.0   4.5  4.7   10蔗糖/2明胶/2精氨酸，在45℃平衡
  Liq15d   7.0   7.0   6.2   6.3   5.7   5.9   5.8   5.8   disc.   10蔗糖/2明胶/2精氨酸(脱气)
  Iiq16   6.8   6.9   6.2   6.2   5.8   5.8   5.8   5.5   5.6   5.6  5.6   5.2  disc.   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/0.02抑肽酶(PI)
  Liq17   6.8   6.9   6.1   6.1   5.8   5.8   5.6   5.9   5.6   5.7  5.6   5.5  disc.   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/0.02抑蛋白酶半硫酸盐(PI)
  Liq18   7.0   7.1   6.3   6.3   6.2   6.0   5.9   5.9   disc．   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/0.1溶菌酶抑制剂
  Iiq19   6.6   6.6   6.2   6.2   5.9   5.6   5.7   5.6   5.7   5.5  5.3   5.2  disc.   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/0.5蛋白酶抑制剂混合物
  Liq20   ud   4.8   ud   ud   ud   ud   dsic.   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/1mM PMSF
  Liq21   6.7   6.5   6.3   6.3   5.9   5.9   5.9   5.8   6.3   6.3  5.8   5.4  disc.   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/1mM胞苷2’一磷酸
  Liq22   6.8   6.7   5.8   5.6   5.6   5.7   ud   ud   ud   ud  disc.   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/’0.05L抗坏血酸
  Liq22a(deg)   6.5   6.5   5.2   5.9   disc．   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/0.05L抗坏血酸
  Liq23   4.5   4.9   ud   ud   ud   ud   disc   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/0.005抗坏血酸6软脂酸盐
  Liq24   6.8   6.7   6.4   6.5   6.3   5.9   5.8   5.7   5.3   5.5  5.8   5.3  5.1   5.1   4.8  4.8   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/0.05熊果甙
  Liq24(deg)   6.7   6.6   6.2   6.3   6.0   5.0   disc.   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/0.05熊果甙
  Liq25   6.6   6.7   5.1   6.2   5.1   ud   ud   ud   ud   ud  disc.   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/0.05没食子酸丙酯
  Liq25(deg)   6.4   6.4   4.8   4.7   disc.   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/0.05没食子酸丙酯
  Liq26   6.8   6.8   6.6   6.4   6.3   6.3   5.8   6.0   5.4   5.5  5.4   5.6  5.3   5.4   5.3  5.3   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/10mM EDTA
  Liq26a(deg)   6.8   6.7   6.5   6.5   6.5   6.3   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/10mM EDTA
  Liq27   6.6   6.7   ud   ud   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/RNA酶抑制剂2U/μL
  Liq31   ud   5.9   ud   ud   nd   ud   disc   10蔗糖/2明胶V2精氨酸/0.001抗坏血酸6软脂酸盐
                                                                                表36
第二滴度：FFA方法分析毒力
  SP稳定的A/Panama    靶：7.5                                                        15℃(每周
  0   0   2   2   4 4   6   6   8   8   10   10   12   12   14   14   16   16
  Liq13a   7.0   6.9   6.4   6.4   5.3 5.5   5.4   5.3   5.3   4.7   5.1   4.8   4.5   4.6   4.2   3.8   无赋形剂(60％NAF)，在15℃平衡
  Liq13b   6.9   6.9   6.4   6.3   5.4 5.6   5.4   5.6   5.2   4.8   4.9   5.0   4.8   4.6   4.3   4.6   无赋形剂(60％NAF)，在33℃平衡
  Liq13c   6.8   6.7   6.3   6.3   5.4 5.6   5.3   5.0   5.1   4.7   4.5   4.7   4.7   4.9   4.5   4.2   无赋形剂(60％NAF)，在45℃平衡
  Liq14   7.3   7.3   7.2   7.2   6.8 6.8   6.7   5.8   6.5   6.5   6.7   6.6   6.4   6.5   6.1   6.2   6.5   6.5   柠檬酸缓冲盐，10蔗糖/2明胶/2精氨酸，在15℃平衡
  Liq15a   7.2   7.2   6.9   7   6.6 6.7   6.6   6.4   6.2   6.0   6.0   6.0   5.7   6.1   5.7   5.7   6.1   5.8   10蔗糖/2明胶/2精氨酸，在15℃平衡
  Liq15b   7.3   7.1   7.0   6.9   6.3 6.5   6.7   6.6   6.0   5.8   6.1   6.0   6.1   5.8   5.9   5.8   6.0   6.0   10蔗糖/2明胶/2精氨酸，在33℃平衡
  Liq15c   7.1   6.9   6.8   6.8   6.3 6.0   6.3   65   5.8   5.8   6.1   6.1   5.8   5.8   5.8   5.8   5.9   5.9   10蔗糖/2明胶/2精氨酸，在45℃平衡
  Liq15d   6.8   6.7   6.7   6.5   6.5 6.4   6.4   6.4   6.4   6.4   10蔗糖/2明胶/2精氨酸(脱气)
  Iiq16   只用于B/Hongkong   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/0.02抑肽酶(PI)
  Liq17   只用于B/Hongkong   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/0.02抑蛋白酶半硫酸盐(PI)
  Liq18   6.9   6.9   6.7   6.5   6.2 6.5   6.2   6.4   6.5   6.4   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/0.1溶菌酶抑制剂
  Iiq19   6.5   6.6   6.6   6.5   5.7 6.0   5.9   ud   5.4   5.4   5.5   5.8   5.8   5.8   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/0.5蛋白酶抑制剂混合物
  Liq20   6.8   6.9   6.0   5.7   ud ud   ud   ud   disc.   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/1mM PMSF
  Liq21   6.9   6.7   6.2   6.3   6.5 6.6   6.9   7.1   5.8   5.9   6.1   6.0   5.9   5.7   6   6.1   5.8   5.6   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/1mM胞苷2’一磷酸
  Liq22   7.1   7.2   6.0   6.0   5.9 5.8   5.1   ud   5.7   ud   ud   5.4   ud   ud   disc.   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/’0.05L抗坏血酸
  Liq22a(deg)   6.7   6.7   6.2   5.9   6.0 5.9   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/0.05L抗坏血酸
  Liq23   5.6   5.5   ud   ud   ud   disc.   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/0.005抗坏血酸6软脂酸盐
  Liq24   7.0   6.9   6.7   6.8   6.6 6.6   6.4   6.5   6.2   6.2   6   6.3   6.1   5.9   5.7   5.9   5.9   6.1   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/0.05熊果甙
  Liq24(deg)   6.6   6.6   6.5   6.6   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/0.05熊果甙
  Liq25   6.9   6.5   5.1   5.5   ud ud   ud   ud   ud   ud   disc   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/0.05Piopyll GalIate
  Liq25(deg)   ud   ud   ud   ud   disc   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/0.05没食子酸丙酯
  Liq26   7.4   7.3   7.2   7.1   ud(repd) ud(repd)   6.9   6.9   6.7   6.7   6.7   6.9   6.5   6.4   6.4   6.4   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/10mM EDTA
  Liq26a(deg)   7.1   7.2   7   7.1   7.1 6.9   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/10mM EDTA
  Liq27   只用于B/Hongkong   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/RNA酶抑制剂2U/μ L
  Liq31   ud   ud   ud   ud   3.5 3.8   disc.   10蔗糖/2明胶V2精氨酸/0.001抗坏血酸6软脂酸盐
                                                                                                                                     表37：
                                                              第二滴度：FFA方法分析毒力
  SP稳定的B/Hongkong                      靶：6.9                                   4℃(月数)
  0   0   1   1   2  2   3   3   4   4
  Liq13a   6.6   6.7   6.4   6.5   6.2  6.2   64   6.3   6.1   6.2   无赋形剂(60％NAF)，在15℃平衡
  Liq13b   6.6   6.6   6.5   6.4   6.3  6.2   6.3   6.4   6.1   6.2   无赋形剂(60％NAF)，在33℃平衡
  Liq13c   6.5   6.7   6.4   6.4   6.1  6.1   6.3   6.4   6   5.9   无赋形剂(60％NAF)，在45℃平衡
Liq14 6.0 6.8 6.4 6.5 6.0 6.4 6.3 6.4 6.1 6.1   柠檬酸缓冲盐，10蔗糖/2明胶/2精氨酸，在15℃平衡
  Liq15a   6.9   6.7   6.7   6.8   6.4  6.3   5.7   6.7   6.5   6.5   10蔗糖/2明胶/2精氨酸，在15℃平衡
  Liq15b   6.7   6.9   6.7   6.6   6.0  6.2   6.5   6.5   6.4   6.4   10蔗糖/2明胶/2精氨酸，在33℃平衡
  Liq15c   6.7   6.8   6.6   6.6   6.1  6.2   6.5   6.4   6.4   6.4   10蔗糖/2明胶/2精氨酸，在45℃平衡
  Liq15d   7.0   7.0   6.8   6.8   6.5  6.3   10蔗糖/2明胶/2精氨酸(脱气)
  Liq16   6.8   6.9   6.4   6.7   6.6  6.5   6.1   6.3   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/0.02抑肽酶(PI)
Liq17 6.8 6.9 6.7 6.6 6.5 6.5 6.1 6.3   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/0.02抑蛋白酶半硫酸盐(PI)
  Liq18   7.0   7.1   6.9   6.8   6.5  6.5   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/0.1溶菌酶抑制剂
  Liq19   6.6   6.6   6.5   6.4   6.5  6.5   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/0.5蛋白酶抑制剂混合物
  Liq20   ud   4.8   ud   ud   disc.   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/1mM PMSF
  Liq21   6.7   6.5   6.6   6.6   7.0  7.0   6.6   6.6   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/1mM胞苷2’一磷酸
  Liq22   6.8   6.7   5.9   UD   UD  UD   5.2   5.5   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/’0.05L抗坏血酸
  Liq22a(deg)   6.5   6.5   6   6.2   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/0.05L抗坏血酸
  Liq23   4.5   4.9   ud   ud   disc.   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/0.005抗坏血酸6软脂酸盐
Liq24 6.8 6.7 6.7 6.6   ud(rep)  ud(rep) 6.4 6.3 6.3 6.2   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/0.05熊果甙
  Liq24(deg)   6.7   6.6   7.0   7.0   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/0.05熊果甙
  Liq25   6.6   6.7   6.2   6.3   5.2  5.2   5.4   5.3   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/0.05Piopyll GalIate
  Liq25(deg)   6.4   6.4   5.8   5.9   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/0.05没食子酸丙酯
  Liq26   6.8   6.8   6.6   6.7   6.6  6.5   6.6   6.6   6.3   6.3   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/10mM EDTA
  Liq26a(deg)   6.8   6.7   6.9   6.9   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/10mM EDTA
  Liq27   6.6   6.7   6.6   6.4   6.6  6.5   6.3   6.3   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/RNA酶抑制剂2U/μL
  Liq31   ud   5.9   5.1   4.9   disc.   10蔗糖/2明胶V2精氨酸/0.001抗坏血酸6软脂酸盐
                                                                                       表38：
第二滴度：FFA方法分析毒力
  SP稳定的A/Panama                  靶：7.5                                       4℃(月数)
  0   0   1   1   2   2   3   3   4   4
  Liq13a   7.0   6.9   6.2   6.2   6.0   6.1   5.8   5.9   5.8   5.6   无赋形剂(60％NAF)，在15℃平衡
  Liq13b   6.9   6.9   5.9   6.0   6.0   6.0   5.9   5.7   5.9   6.0   无赋形剂(60％NAF)，在33℃平衡
  Liq13c   6.8   6.7   6   6.1   5.8   6.1   5.9   5.7   5.8   5.6   无赋形剂(60％NAF)，在45℃平衡
  Liq14   7.3   7.3   7.2   7.2   7.3   7.2   7.1   7.1   6.8   7   柠檬酸缓冲盐，10蔗糖/2明胶/2精氨酸，在15℃平衡
  Liq15a   7.2   7.2   6.7   6.6   6.6   6.6   65   7.0   6.4   6.6   10蔗糖/2明胶/2精氨酸，在15℃平衡
  Liq15b   7.3   7.1   6.7   6.7   6.7   6.6   6.9   6.8   6.4   6.6   10蔗糖/2明胶/2精氨酸，在33℃平衡
  Liq15c   7.1   6.9   6.5   6.4   6.7   6.6   6.6   6.6   6.4   6.4   10蔗糖/2明胶/2精氨酸，在45℃平衡
  Liq15d   6.8   6.7   6.9   6.8   6.4   6.4   10蔗糖/2明胶/2精氨酸(脱气)
  Liq16   只用于B/Hongkong   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/0.02抑肽酶(PI)
  Liq17   只用于B/Hongkong   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/0.02抑蛋白酶半硫酸盐(PI)
  Liq18   6.9   6.9   6.9   6.8   6.4   6.3   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/0.1溶菌酶抑制剂
  Liq19   6.5   6.6   6.2   6.4   6.3   6.6   6.3   63   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/0.5蛋白酶抑制剂混合物
  Liq20   6.8   6.9   6.9   7.0   7.1   7.2   6.9   6.7   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/1mM PMSF
  Liq21   6.9   6.7   6.7   6.8   6.7   6.8   7.0   7.1   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/1mM胡胞苷2’一磷酸
  Liq22   7.1   7.2   6.2   6.0   6.3   5.8   6.0   5.9   6.1   6.1   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/’0.05L抗坏血酸
  Liq22a(deg)   6.7   6.7   6.7   6.6   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/0.05L抗坏血酸
  Liq23   5.6   5.5   ud   ud   disc.   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/0.005抗坏血酸6软脂酸盐
  Liq24   7.0   6.9   6.5   6.7   6.4   6.3   6.8   6.7   6.4   6.5   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/0.05熊果甙
  Liq24a(deg)   6.7   6.6   6.2   6.2   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/0.05熊果甙
  Liq25   6.9   6.5   5.1   7.2   5.1   ud   disc.   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/0.05Piopyll Gallate
  Liq25a(deg)   6   6.3   rep   6.4   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/0.05没食子酸丙酯
  Lig26   7.4   7.3   7.3   7.3   7.3   7.3   7.4   7.3   7.0   7.1   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/10mM EDTA
  Liq26a(deg)   7.1   7.2   7.4   7.5   7.1   7.0   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/10m MEDTA
  Liq27   只用于B/Hongkong   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/RNA酶抑制剂2U/μL
  Liq31   ud   ud   ud   disc.   10蔗糖/2明胶V2精氨酸/0.001抗坏血酸6软脂酸盐
                                                                                            表39：
  制剂
成分 无柠檬酸盐   20mM柠檬酸盐   50mM柠檬酸盐   100mM柠檬酸盐   200mM柠檬酸盐
  柠檬酸缓冲盐pH7.2 0 20mM 50mM 100mM 200mM
  KPO4缓冲盐(来自病毒材料) 1.1mM 1.1mM 1.1mM 1.1mM 1.1mM
  蔗糖(0.7％来自所包含的病毒) 10％ 10％ 10％ 10％ 10％
  明胶   1％   1％   1％   1％   1％
  精氨酸   2％   2％   2％   2％   2％
  NAF(来自病毒：B/Hongkong；A/Panama) 10％ 10％ 10％ 10％ 10％
  NAF(添加)   50％   50％   50％   50％   50％
  KOH或HCl调节pH到7.2 滴定pH到7.2 滴定pH到7.2 滴定pH到7.2 滴定pH到7.2 滴定pH到7.2
  纯水   q.s.   q.s.   q.s.   q.s.   q.s.
                                                       表40：
FFA分析得到的毒力结果
  A/Panama第1管   A/Panama第2管   B/Hongkong第1管   B/Hongkong第2管
  A/Panama，起始材料   9个板的平均值8.1±0.2(8.5)   9个板的平均值7.0±0.1(7.9)
  稀释前起始材料(1∶10)   8.0±0.1(8.0) 无 n/a n/a
  0％柠檬酸盐   6.7±0.1(7.0)   6.9±0.0(7.0)   6.7±0.0(6.9)   6.8±0.1(6.9)
  20mM柠檬酸盐   6.7±0.1(7.0)   6.7±0.2(7.0)   6.9±0.0(6.9)   6.8±0.1(6.9)
  50mM柠檬酸盐   6.7±0.1(7.0)   6.7±0.1(7.0)   6.9±0.0(6.9)   6.8±0.1(6.9)
  100mM柠檬酸盐   6.8±0.0(7.0)   6.8±0.0(7.0)   6.8±0.1(6.9)   6.9±0.1(6.9)
  200mM柠檬酸盐   6.8±0.1(7.0)   6.8±0.0(7.0)   6.7±0.1(6.9)   6.6±0.2(6.9)
基础制剂：60％NAF、10％蔗糖、1％明胶、2％精氨酸
                                                                  表41：
  制剂
  成分   无EDTA   0.5mM EDTA   1.0mM EDTA   2.0mM EDTA   5.0mM EDTA   10mM EDTA
  KPO4缓冲盐，pH7.2(1.1mM来自所包含的病毒) 100mM 100mM 100mM 100mM 100mM 100mM
  蔗糖(0.7％来自所包含的病毒) 10％ 10％ 10％ 10％ 10％ 10％
  明胶   1％   1％   1％   1％   1％   1％
  精氨酸   2％   2％   2％   2％   2％   2％
  EDTA 0％   0.0186％(0.5mmM)   0.037％(1.0mM)   0.0744％(2.0mM)   0.186％(5.0mM)   0.372％(10mM)
  NAF(来自病毒：B/Hongkong，A/Panama) 10％ 10％ 10％ 10％ 10％ 10％
  NAF添加)   50％   50％   50％   50％   ·50％   50％
  1N KOH或1N HCl调节pH到7.2 滴定到pH7.2 滴定到pH7.2 滴定到pH7.2 滴定到pH7.2 滴定到pH7.2 滴定到pH7.2
  纯水   q.s.   q.s.   q.s.   q.s.   q.s.   q.s.
                                                         表42：
FFA分析得到的毒力结果
  A/Panama第1管   A/Panama第2管   B/Hongkong第1管   B/Hongkong第2管
  A/Panama，起始材料   9个板的平均值8.1+0.2(8.5)   6个板的平均值7.9+0.1(7.9)
  稀释前起始材料(1∶10)   8.0±0.1(8.0)   无   n/a   n/a
  0％EDTA   6.1±0.2(7.0)   6.1±0.2(7.0)   6.7±0.1(6-9)   6.7±0.1(6.9)
  0.5mM EDTA   6.3±0.2(7.0)   6.3±0.1(7.0)   6.7±0.1(6.9)   6.6±0.1(6.9)
  1.0mM EDTA   6.5±0.1(7.0)   6.5±0.1(7.0)   6.8±0.1(6.9)   6.6±0.1(6.9)
  2.0mM EDTA   6.6±0.0(7.0)   6.8±0.1(7.0)   6.6±(6.9)   6.6±0.1(6.9)
  5.0mMEDTA   6.7±0.0(7.0)   6.8±0.1(7.0)   6.6±0.1(6.9)   6.7±0.2(6.9)
  10mMEDTA   6.8±0.1(7.0)   6.7±0.1(7.0)   6.7±0.1(6;9)   6.6±0.2(6.9)
基础制剂：100mM KPO4、60％NAF、10％蔗糖、1％明胶、2％精氨酸
                                      表43：
制剂：第三滴度
  成分   Liq28   Liq29   Liq30
  KPO4缓冲盐，pH7.2(1.1mM来自于所包含的病毒) 100mM 100mM
  柠檬酸缓冲盐，pH7.2 n/a n/a 100mM
  蔗糖(0.7％来自于所包含的病毒) 10％ 10％ 10％
  明胶   2％   n/a   2％
  精氨酸   2％   2％   2％
  EDTA   (5mM)0.186％   (10mM)0.372％   (10mM)0.372％
  NAF(来自病毒) 10％ 10％ 10％
  NAF(添加)   50％   50％   50％
  1N HCl或1N KOH调节pH到7.2   滴定到pH7.2   滴定到pH7.2   滴定到pH7.2
  纯水   q.s.   q.s.   q.s.
                                           表44：
  SP稳定的B/Hongkong      靶：6.9                                                           15℃(周数)
  0   0   2   2   4   4   6   6   8   8   10   10   12   12   14   14   制剂
  Liq26   6.8   6.8   6.6   6.4   6.3   6.3   5.8   6.0   5.4   5.5   5.4   5.6   5.3   5.4   5.3   5.3   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/10mM EDTA
  Liq26a(deg)   6.8   6.7   6.5   6.5   6.5   6.3   10蔗糖/2GeJ/2Ars/10mM EDTA
  Liq28   6.2   5.9   5.8   5.9   6.2   6.0   5.4   5.3   5.1   5.1   disc.   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/5mM EDTA
  Liq28a   6.5   6.5   6.2   6.0   6.0   5.9   5.8   5.6   disc.   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/5mM EDTA
  Liq29   4.9   4.9   4.8   4.7   5.0   4.8   4.2   4.0   ud   3.6   disc.   10蔗糖/2精氨酸/10mM EDTA
  Liq29a   6.3   6.4   6.0   6.3   6.1   5.9   5.8   5.7   disc.   10蔗糖/2精氨酸/10mM EDTA
  Liq30   6.6   6.6   6.3   6.4   6.7   6.5   5.9   5.9   5.4   5.4   disc.   柠檬酸盐/10蔗糖/2明胶/2精氨酸/10mM EDTA
  Liq30a   6.6   6.6   6.1   6.2   6.1   5.9   5.8   5.8   disc.   柠檬酸盐/10蔗糖/2明胶/2精氨酸/10mM EDTA
                                                                                                   A
  SP稳定的B/Hongkong      靶：6.9                         4℃(月数)
  0   0   1   1   2   2   3   3   4  4   制剂
  iq26   6.8   6.8   6.6   6.7   6.6   6.5   6.6   6.6   6.3   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/10mM EDTA
  Liq26a(deg)   6.8   6.7   6.9   6.9   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/10mM EDTA
  Liq28   5.2   5.9   6.6   6.4   6.6   6.5   5.8   5.8   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/5mM EDTA
  Liq28a   6.5   6.5   6.7   6.S   6.5   6.6   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/5mM EDTA
  Liq29   4.9   4.9   5.1   5.1   4.9   4.9   disc.   10蔗糖/2精氨酸/10mM EDTA
  Liq29a   6.3   6.4   6.4   6.5   6.3   6.4   10蔗糖/2精氨酸/10mM EDTA
  Liq30   6.6   6.6   6.8   7.1   6.6   6.5   6.2   6.0   柠檬酸盐/10蔗糖/2明胶/2精氨酸/10mM EDTA
  Liq30a   6.6   6.6   6.9   6.7   6.4   6.0   柠檬酸盐/10蔗糖/2明胶/2精氨酸/10mM EDTA
B
  SP稳定的B/Panama            靶：7.5                                                                       15℃(周数)
  0   0   2   2   4   4   6   6   8   8   10   10   12   12   14   14   制剂
  Liq26   7.4   7.3   7.2   7.1   ud(repd)   ud(repd)   6.9   6.9   6.7   6.7   6.7   6.9   6.5   6.4   6.4   6.4   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/10mM EDTA
  Liq26a(deg)   7.1   7.2   7   7.1   7.1   6.9   6.4   6.8   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/10mM EDTA
  Liq28   7.5   7.4   7.1   7.1   6.9   7.0   6.7   6.7   6.5   6.5   6.6   6.6   6.1   6.1   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/10mM EDTA
  Liq29   7.3   7.3   6.9   6.9   7.0   7.0   6.7   6.8   6.6   6.7   6.5   6.7   6.0   6.0   10蔗糖/2精氨酸/10mM EDTA
  Liq30   7.4   7.3   7.0   7.0   6.8   6.9   6.3   6.3   6.1   6.3   6.2   6.1   5.8   5.6   柠檬酸盐/10蔗糖/2明胶/2精氨酸/10mM EDTA
                                                                                                                       C
  SP稳定的A/Panama        靶：7.5                         4℃(月数)
  0   0   1   1   2   2   3   3   4   4   制剂
  Liq26   7.4   7.3   7.3   7.3   7.3   7.3   7.4   7.3   7.0   7.1   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/10mM EDTA
  Liq26a(deg)   7.1   7.2   7.4   7.5   7.1   7.0   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/10mM EDTA
  Liq28   7.5   7.4   7.3   7.3   7.1   7.2   10蔗糖/2明胶/2精氨酸/5mM EDTA
  Liq29   7.3   7.3   7.2   7.5   7.1   7.1   10蔗糖/2精氨酸/10mM EDTA
  Liq30   7.4   7.3   7.3   7.4   7.0   7.2   柠檬酸盐/10蔗糖/2明胶/2精氨酸/10mM EDTA
                                                                                        D
                                                                                                                                               表45：
         制剂：P-B 4-级定制筛选(P-B 4-level Custom Screen)
  成分   Liq36   Liq37   Liq38   Liq39   Liq40   Liq41   Liq42   Liq43   Liq44   Llq45   Liq46   Liq47
  KPO4缓冲盐，pH7.2(1.1mM来自于所包含的病毒) 50mM 50mM 50mM 50mM 50mM 50mM 50mM 50mM 50mM 50mM 50mM 50mM
  蔗糖(0.7％来自于所包含的病毒) 0.0％ 7.5％ 7.5％ 7.5％ 7.5％ 7.5％ 7.5％ 10％ 10％ 10％ 10％ 10％
  明胶   0％   0％   0％   1％   1％   2％   2％   0％   0％   0％   1％   1％
  精氨酸   2％   2％   4％   0％   4％   0％   2％   4％   2％   4％   2％   2％
EDTA 1mM 2.7mM 5mM 1mM   2.7mM 5mM 1mM 5mM 5mM 1mM 1mM   2.7mM
  NAF(来自病毒：B/Hongkcng；A/Panama) 10％ 10％ 10％ 10％ 10％ 10％ 10％ 10％ 10％ 10％ 10％ 10％
  NAF(添加)   50％   50％   50％   50％   50％   50％   50％   50％   50％   50％   50％   50％
  1N HCl或1N KOH调节pH到7.2   滴定到pH7.2   滴定到pH7.2   滴定到pH7.2   滴定到pH7.2   滴定到pH7.2   滴定到pH7.2   滴定到pH7.2   滴定到pH7.2   滴定到pH7.2   滴定到pH7.2   滴定到pH7.2   滴定到pH7.2
  纯水   q.s.   q.s   q.s   q.s   q.s   q.s   q.s   q.s   q.s   q.s   q.s   q.s
成分   Liq48   Liq49   Liq50   Liq51   Liq52   Liq53   Liq54   Liq55   Liq56   Liq57   Liq58   Liq59
KPO4缓冲盐，pH7.2(1.1mM来自于所包含的病毒) 50mM 50mM 50mM 50mM 50mM 50mM 50mM 50mM 50mM 50mM 50mM 50mM
蔗糖(0.7％来自于所包含的病毒)   10％   10％   10％   10％   15％   15％   15％   15％   15％   15％   15％   15％
明胶   1％   2％   2％   2％   0％   0％   0％   1％   1％   1％   2％   2％
精氨酸   4％   0％   0％   4％   2％   2％   4％   0％   0％   4％   2％   4％
EDTA   5mM   1mM   2.7mM   2.7mM   2.7mM   1mM   2.7mM   2.7mM   5mM   1mM   5mM   1mM
NAF(来自病毒：B/Hongkcng；A/Panama) 10％ 10％ 10％ 10％ 10％ 10％ 10％ 10％ 10％ 10％ 10％ 10％
NAF(添加)   50％   50％   50％   50％   50％   50％   50％   50％   50％   50％   50％   50％
1N HCl或1N KOH调节pH到7.2   滴定到pH7.2   滴定到pH7.2   滴定到pH7.2   滴定到pH7.2   滴定到pH7.2   滴定到pH7.2   滴定到pH7.2   滴定到pH7.2   滴定到pH7.2   滴定到pH7.2   滴定到pH7.2   滴定到pH7.2
纯水   q.s.   q.s   q.s   q.s   q.s   q.s   q.s   q.s   q.s   q.s   q.s   q.s
                                                    表46：
                                                 P-B 4-级定制筛选：FFA方法分析的毒力
  SP稳定的B/Hongkong               靶：6.9                   4℃(月数)
  0   0   0  1  1  1  2  2  2  3  3  3  4  4  4  5  5  5   ％
  Liq36   6.8   6.8   6.7   50mMKPO4/0蔗糖/0凝胶/2精氨酸/1mmEDTA
  Liq37   6.6   6.6   6.7   50mMKPO4/7.5蔗糖/0明胶/2精氨酸/2.7mmEDTA
  Liq38   6.6   6.5   6.6   50mMKPO4/7.5蔗糖/0明胶/4精氨酸/5mmEDTA
  Liq39   6.9   6.8   6.7   50mMKPO4/7.5蔗糖/1明胶/0精氨酸/1mmEDTA
  Liq40   6.7   6.7   6.7   50mMKPO4/7.5蔗糖/1明胶/4精氨酸/2.7mmEDTA
  Liq41   7.0   7.0   7.0   50mMKPO4/7.5蔗糖/2明胶/0精氨酸/5mmEDTA
  Liq42   6.9   6.9   7.0   50mMKPO4/7.5蔗糖/2明胶/2精氨酸/1mmEDTA
  Llq43   6.8   6.8   6.7   50mMKPO4/10蔗糖/0明胶/4精氨酸/5mmEDTA
  Liq44   6.8   6.9   6.9   50mMKPO4/10蔗糖/0明胶/2精氨酸/5mmEDTA
  Liq45   6.7   6.8   6.8   50mMKPO4/10蔗糖/0明胶/4精氨酸/1mmEDTA
  Liq46   7.0   7.0   6.8   50mMKPO4/10蔗糖/1明胶/2精氨酸/1mmEDTA
  Liq47   7.1   7.0   7.0   50mMKPO4/10蔗糖/1明胶/2精氨酸/2.7mmEDTA
  Liq48   7.0   6.9   6.9   50mMKPO4/10蔗糖/1明胶/4精氨酸/5mmEDTA
  Liq49   7.0   7.0   7.0   50mMKPO4/10蔗糖/2明胶/0精氨酸/1mmEDTA
  Liq50   7.0   6.8   7.0   50mMKPO4/10蔗糖/2明胶/0精氨酸/2.7mmEDTA
  Liq51   6.9   6.8   6.9   50mMKPO4/10蔗糖/2明胶/4精氨酸/2.7mmEDTA
  Liq52   6.6   6.7   6.7   50mMKPO4/15蔗糖/0明胶/2精氨酸/2.7mmEDTA
  Liq53   6.7   6.8   6.7   50mMKPO4/15蔗糖/0明胶/2精氨酸/1mmEDTA
  Liq54   6.7   6.8   6.7   50mMKPO4/15蔗糖/0明胶/4精氨酸/2.7mmEDTA
  Liq55   6.9   6.8   6.9   50mMKPO4/15蔗糖/1明胶/0精氨酸/2.7mmEDTA
  Liq56   6.8   6.8   6.8   50mMKPO4/15蔗糖/1明胶/0精氨酸/5mmEDTA
  Liq57   6.9   68   6.8   50mMKPO4/15蔗糖/1明胶4精氨酸/1mmEDTA
  Liq58   6.9   6.8   6.9   50mMKPO4/15蔗糖/2明胶/2精氨酸/5mmEDTA
  Liq59   50mMKPO4/15蔗糖/2明胶/4精氨酸/1mmEDTA
                                                           表47：
                                    P-B 4-级定制筛选
  SP稳定的A/Panama                 靶：7.0                         4℃(月数)
  0   0   0  1  1  1  2  2  2  3  3  3  4  4  4  5  5  5   ％
  Liq36   6.4   6.2   6.1   50mMKPO4/0蔗糖/0凝胶/2精氨酸/1mmEDTA
  Liq37   6.6   6.7   6.6   50mMKPO4/7.5蔗糖/0明胶/2精氨酸/2.7mmEDTA
  Liq38   6.7   6.7   6.6   50mMKPO4/7.5蔗糖/0明胶/4精氨酸/5mmEDTA
  Liq39   6.4   6.4   6.4   50mMKPO4/7.5蔗糖/1明胶/0精氨酸/1mmEDTA
  Liq40   6.7   6.7   6.6   50mMKPO4/7.5蔗糖/1明胶/4精氨酸/2.7mmEDTA
  Liq41   6.0   6.0   6.0   50mMKPO4/7.5蔗糖/2明胶/0精氨酸/5mmEDTA
  Liq42   5.9   5.9   6.0   50mMKPO4/7.5蔗糖/2明胶/2精氨酸/1mmEDTA
  Llq43   6.5   6.6   6.5   50mMKPO4/10蔗糖/0明胶/4精氨酸/5mmEDTA
  Liq44   6.5   6.4   6.4   50mMKPO4/10蔗糖/0明胶/2精氨酸/5mmEDTA
  Liq45   6.3   6.3   6.4   50mMKPO4/10蔗糖/0明胶/4精氨酸/1mmEDTA
  Liq46   6.3   6.3   6.3   50mMKPO4/10蔗糖/1明胶/2精氨酸/1mmEDTA
  Liq47   6.7   6.7   6.6   50mMKPO4/10蔗糖/1明胶/2精氨酸/2.7mmEDTA
  Liq48   6.6   6.6   6.7   50mMKPO4/10蔗糖/1明胶/4精氨酸/5mmEDTA
  Liq49   6.1   6.1   6.1   50mMKPO4/10蔗糖/2明胶/0精氨酸/1mmEDTA
  Liq50   6.6   6.6   6.5   50mMKPO4/10蔗糖/2明胶/0精氨酸/2.7mmEDTA
  Liq51   6.9   7.0   6.9   50mMKPO4/10蔗糖/2明胶/4精氨酸/2.7mmEDTA
  Liq52   6.8   6.7   6.8   50mMKPO4/15蔗糖/0明胶/2精氨酸/2.7mmEDTA
  Liq53   6.7   6.7   6.7   50mMKPO4/15蔗糖/0明胶/2精氨酸/1mmEDTA
  Liq54   6.9   6.9   6.8   50mMKPO4/15蔗糖/0明胶/4精氨酸/2.7mmEDTA
  Liq55   6.7   6.9   6.7   50mMKPO4/15蔗糖/1明胶/0精氨酸/2.7mmEDTA
  Liq56   6.8   6.6   6.8   50mMKPO4/15蔗糖/1明胶/0精氨酸/5mmEDTA
  Liq57   6.9   6.8   6.9   50mMKPO4/15蔗糖/1明胶4精氨酸/1mmEDTA
  Liq58   6.8   6.8   7.0   50mMKPO4/15蔗糖/2明胶/2精氨酸/5mmEDTA
  Liq59   6.9   6.8   6.6   50mMKPO4/15蔗糖/2明胶/4精氨酸/1mmEDTA
                                                             表48：
                                     表49：比较研究中的制剂
  未纯化的VH              纯化的VH1   渗滤的VH2
  10％AF   60％AF   ＜1％AF   10％AF   60％AF   ＜1％AF
  7％磷酸蔗糖(基础稳定剂)   2   3   1   16
  Wyeth临床制剂   7   8   4   5   6
  7％磷酸蔗糖，精氨酸   17
  7％磷酸蔗糖，精氨酸，明胶   18
  10％磷酸蔗糖，精氨酸，明胶   9
  10％磷酸蔗糖，精氨酸   10
  10％磷酸蔗糖，精氨酸，PVP   12
  10％磷酸蔗糖，精氨酸，右旋糖酐   11
  10％磷酸蔗糖，精氨酸，明胶，EDTA   13
  10％蔗糖，精氨酸，明胶，组氨酸   14
  10％蔗糖，精氨酸，明胶，组氨酸，EDTA   15
   表50：纯化的VH与未纯化的VH(FluMist)稳定性比较：
       二者都通过纯化制剂进行稳定时
       4℃的稳定性斜率(±SE)，在6个月时
  纯化的制剂(Log FFU/月)   FluMist*(Log FFU/月)
  A/NC   -0.020±0.027   -0.035±0.016
  A/Pan   -0.011±0.020   -0.079±0.035
  B/HK   -0.138±0.022   -0.151±0.018
制剂：7％蔗糖、1％明胶、1％精氨酸[7/1/1制剂]
*60％AF水平
表51：纯化的VH与FluMist稳定性比较：FluMist通过10/2/2制剂进行稳定时
  稳定性斜率@4℃(±SE)，在6个月时[logFFU/月]         初始毒力损失(LogFFU)**
  纯化的VH   FluMist*   纯化的VH   FluMist*
  A/NC   -0.020±0.027   -0.011±0.019   0.4   0.5
  A/Pan   -0.011±0.020   -0.093±0.032   0.9   0.9
  B/HK   -0.138±0.022   -0.107±0.025   0   0.3
纯化的VH制剂：7％蔗糖、1％明胶、1％精氨酸[7/1/1制剂]，不另外添加AF
*FluMist制剂：10％蔗糖、2％明胶、2％精氨酸[10/2/2制剂]，60％AF水平
**根据线性回归
              表52：纯化的VH与FluMist稳定性比较：
            FluMist通过10/2/2组氨酸制剂进行稳定时
  稳定性斜率@4℃(±SE)，在6个月时[logFFU/月]         初始毒力损失(LogFFU)**
  纯化的VH   FluMist*   纯化的VH   FluMist*
  A/NC   -0.020±0.027   -0.068±0.014   0.4   0
  A/Pan   -0.011±0.020   -0.072±0.012   0.9   0
  B/HK   -0.138±0.022   -0.061±0.020   0   0
纯化的VH制剂：7％蔗糖、1％明胶、1％精氨酸[7/1/1制剂]，不另外添加AF
*FluMist制剂：组氨酸、10％蔗糖、2％明胶、2％精氨酸[10/2/2组氨酸制剂]，60％AF水平
**根据线性回归
表53：比较方法的表现
  检测参数                               方法的表现
  手工操作方法   半自动方法
  精密度/试验之间的变异性(SD)   SD范围为0.07到0.11logTCID50单位1   SD范围为0.06到0.09log10TClD50/mL2，3
线性   在1％显著水平上不匹配线性模型则通过试验   在1％显著水平上不匹配线性模型则通过试验3
  准确度   斜率范围0.986-1.007   斜率范围1.00-1.023
  范围   4.7-9.5log10TCID50/mL   4.2-9.3log10TCID50/mL3
1用同一种材料进行9次试验得到的试验之间的SD(每个试验结果是在3天内测定的12个测定值的平均值)，由同一组分析员操作，用同一套加样仪。所试验的材料包括每株病毒的3个不同制造批次，共3株病毒(H1N1、H3N2和B)。
2用同一种材料进行6次试验得到的试验之间的SD(每个试验结果是在3天内测定的12个测定值的平均值)，由同一组分析员操作，用同一套加样仪。所试验的材料包括每株病毒的3个不同制造批次，共3株病毒(H1N1、H3N2和B)。
3来自用单价流感病毒验证半自动TCID50毒力分析法的报告。
表54：分析法之间的比较
  病毒株                      平均滴度(log10TCID50/mL)
  手工操作方法   半自动分析法   差值   90％CI(LB，UB)
  A/NewCaledonia/20/99   9.40   9.42   -0.02   (-0.05，0.01)
  B/Yamanashi/166/98   8.47   8.40   0.07   (0.03，0.10)
表55.
  手工操作“金标准”读数
  半自动MTT读数   CPE阳性   CPE阴性
  CPE阳性(A570＜截留值)   TP   EP
  CPE阴性(A570＞截留值)   FN   TN
  所有阳性   所有阴性
表56.半自动TCID50毒力分析法分析单价流感病毒：根据“金标准”验证的手工操作CPE读数和A570截留值为0.5254的MTT分析结果的敏感性和特异性
  真阳性   假阴性   敏感性a   真阴性   假阳性   特异性b
 AB(N＝14,400)   7091   61   99.15％   7247   1   99.99％
 QC(N＝31,440)   15835   301   98.13％   15106   198   98.71％
 AB和QC(N＝45,840)   22926   362   98.45％   22353   199   99.12％
 对照ATR.0126   17248   167   99.05％   15882   3   99.99％
a敏感性＝(真阳性)/所有阳性
b特异性＝(真阴性)/所有阴性
表57.两组试验所得到的对照孔(CPE阴性)吸光度值和以前所报道的吸光度值比较
 第2组   第1组   总结果(两组)   (以前的数值)对照
孔数  2880   6288   9168   6720
A570平均值 1.226  1.235   1.231   1.261
SD  0.17   0.20   0.19   0.15
                               表58.设备与设备之间的比较：
                  半自动TCID50毒力分析法测定的参照病毒株的毒力值
               参照病毒株(平均log10TCID50/mL±SD)
  设备(组)   A/New Caledonia/20/99   A/Sydney/05/97   B/Yamanashi/166/98
  AZ-039(第1组)1，2   9.2±0.15   8.6±0.09   8.4±0.10
  AZ-040(第1组)1，3   9.3±0.08   8.6±0.01   8.4±0.10
  AZ-036(第2组)1   9.2±0.08   8.5±0.05   8.3±0.06
1试验次数(AZ-036，N＝9；AZ-039，N＝5；AZ-040，N＝2)；
2AZ-039组有1个试验结果因不符合天与天之间的SD接受标准而被排除
3AZ-040组有4个试验结果因不符合天与天之间的SD接受标准或培养板的错误处理而被排除
                    表59.分析员与分析员之间的比较：
利用设备AZ-039或AZ-036测定参照病毒株的半自动TCID50毒力值
                    参照病毒(平均log10TCID50/mL±SD)a
 第1组   A/New Caledonia/20/99   A/Sydney/05/97   B/Yamanashi/166/98
  AZ-039   AZ-039   AZ-039
 1号分析员   9.3±0.19   8.5±0.25   8.4±0.26
 2号分析员   9.1±0.17   8.5±0.27   8.4±0.16
 3号分析员   9.1±0.16   8.5±0.15   8.4±0.19
 4号分析员   9.2±0.24   8.6±0.21   8.6±0.24
 5号分析员   9.1±0.21   8.6±0.19   8.3±0.23
 6号分析员   9.4±0.21   8.7±0.20   8.6±0.21
 第2组   AZ-036   AZ-036   AZ-036
 7号分析员   9.4±0.16   8.5±0.21   8.3±0.18
 8号分析员   9.2±0.21   8.5±0.18   8.2±0.15
 9号分析员   9.3±0.16   8.5±0.20   8.3±0.16
a平均毒力值得自3天试验期间的4次重复测定(n＝12)
权利要求书
(按照条约第19条的修改)
1.一种制备一种或多种流感病毒组合物的方法，该方法包括：
a.通过鸡蛋传代流感病毒；
b.加温流感病毒；以及
c.通过滤膜过滤流感病毒。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流感病毒包含一种或多种A型流感病毒株和/或一种或多种B型流感病毒株。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，过滤包括使流感病毒组合物通过微孔滤膜，其中所述微孔滤膜的孔径约为0.2到0.45微米。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，加温包括在约31℃的条件下孵育病毒。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，加温包括在28℃或更高的温度下孵育病毒。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，加温包括在28℃到约40℃的温度下孵育病毒。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，加温包括在约28℃到约36℃的温度下孵育病毒。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，加温包括在约28℃到约34℃的温度下孵育病毒。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，加温包括在约30℃到约32℃的温度下孵育病毒。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，加温在过滤病毒前进行。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，加温在过滤病毒过程中进行。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，加温是在过滤病毒前和过滤病毒过程中进行。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，加温过程持续约1小时。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，加温过程持续约30到240分钟。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，加温过程持续约45到200分钟。
16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，加温过程持续约60到90分钟。
17.一种用权利要求1所述方法制备的流感病毒组合物。
18.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病毒组合物包含流感疫苗组合物。
19.一种用权利要求18所述方法制备的流感疫苗组合物。
20.一种制备一种或多种流感病毒组合物的方法，该方法包括：通过鸡蛋传代流感病毒，其中，接种后在所述传代期间摇动鸡蛋。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，摇动包括以每分钟约1圈或更低的速度、每分钟约5圈或更低的速度、每分钟约10圈或更低的速度倾斜鸡蛋。
22.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述鸡蛋被摇动约12小时。
23.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述鸡蛋被摇动约24-48小时。
24.如权利要求20所述的方法，该方法还包括第二次孵育。
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，在第二次孵育期间摇动所述鸡蛋。
26.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述流感病毒包括A型流感病毒和/或B型流感病毒。
27.如权利要求20所述的方法，其特征在于，用摇动的鸡蛋传代的病毒的TCID50比未摇动的鸡蛋生产出来的同一流感病毒的TCID50高至少0.4log。
28.一种用权利要求20所述方法制备的流感病毒组合物。
29.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述病毒组合物包括流感疫苗组合物。
30.一种用权利要求29所述方法制备的流感疫苗组合物。
31.一种制备一种或多种流感病毒组合物的方法，该方法包括：
a.将含流感病毒基因组的多个载体导入一群鸡蛋宿主内，该群鸡蛋宿主能够支持流感病毒的复制；
b.在低于或等于35℃的温度下孵育这群鸡蛋宿主；以及
c.回收多个流感病毒。
32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述流感病毒包含一种或多种：减毒流感病毒、冷适应性流感病毒、温敏流感病毒或冷适应性温敏减毒流感病毒。
33.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述多个载体包含一种或多种B型流感病毒。
34.一种用权利要求31所述方法制备的流感病毒组合物。
35.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述病毒组合物包括流感疫苗组合物。
36.一种用权利要求35所述方法制备的流感疫苗组合物。
37.如权利要求31所述的方法，该方法还包括筛选含野生型HA和NA基因的流感病毒。
38.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述筛选包括将一群流感病毒与一种或多种非野生型HA和NA基因的特异性抗体共孵育。
39.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述孵育在一个或多个鸡蛋内进行。
40.一种用权利要求38所述的方法制备的流感病毒组合物。
41.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述病毒组合物包括流感疫苗组合物。
42.一种用权利要求41所述方法制备的流感疫苗组合物。
43.一种制备一种或多种流感病毒组合物的方法，该方法包括：
a.i.将含流感病毒基因组的多个载体导入到一群鸡蛋宿主内，该群鸡蛋宿主能够支持流感病毒的复制；
ii.在低于或等于35℃的温度下孵育这群鸡蛋宿主；
iii.回收多个流感病毒；
b.将该群流感病毒与一种或多种非野生型HA和NA基因的特异性抗体共孵育；
c.通过鸡蛋传代流感病毒，该鸡蛋被摇动；以及
d.加热流感病毒并通过滤膜过滤流感病毒。
44.一种用权利要求43所述方法制备的流感病毒组合物。
45.如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述病毒组合物包括流感疫苗组合物。
46.一种用权利要求45所述的方法制备的流感疫苗组合物。
47.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流感病毒通过荧光聚焦分析法进行检测。
48.一种制备一种或多种流感病毒组合物的方法，其特征在于，所述组合物含有约10-60％的未分馏的正常尿囊液。
49.如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述组合物含有约1-5％的精氨酸。
50.如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述流感病毒组合物用缓冲液稀释，该缓冲液基本上不含正常尿囊液。
51.如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述流感病毒组合物含有约1-4％的明胶。
52.如权利要求51所述的方法，其特征在于，所述流感病毒组合物含有约2％的明胶。
53.如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述流感病毒组合物含有约5-10％的蔗糖。
54.如权利要求53所述的方法，其特征在于，所述组合物含有约7-10％的蔗糖。
55.如权利要求49所述的方法，其特征在于，所述组合物含有约2％的精氨酸。
56.如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述组合物含有约80-150mM的组氨酸。
57.如权利要求56所述的方法，其特征在于，所述组合物含有约100mM的组氨酸。
58.如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述流感病毒组合物在约2-8℃的条件下能够基本稳定至少6个月、至少9个月、至少18个月或至少24个月。
59.如权利要求58所述的方法，其特征在于，所述组合物在约4℃的条件下是基本稳定的。
60.一种流感病毒组合物，其中，该组合物是通过如下过程制备的：通过鸡蛋传代流感病毒，加热病毒，以及通过滤膜过滤病毒，该组合物具有第一TCID50，所述第一TCID50大于第二TCID50，第二TCID50来自于不是通过下述过程制备的流感病毒：通过鸡蛋传代流感病毒，加热病毒，以及通过滤膜过滤病毒。
61.一种流感病毒组合物，其特征在于，所述组合物是通过如下步骤制备的：通过鸡蛋传代流感病毒，其中，在所述传代过程中摇动鸡蛋，这种组合物具有第一TCID50，所述第一TCID50大于第二TCID50，第二TCID50来自于不是通过如下过程制备的流感病毒：通过鸡蛋传代流感病毒，其中，在所述的传代过程中摇动鸡蛋。
62.一种流感病毒组合物，其特征在于，所述组合物是通过如下步骤制备的：将含流感病毒基因组的多个载体导入一群鸡蛋宿主内，这群鸡蛋宿主能够支持流感病毒的复制，在低于或等于35℃的温度下孵育鸡蛋，以及回收多个流感病毒，这种组合物具有第一TCID50，所述第一TCID50大于第二TCID50，第二TCID50来自于不是通过如下过程制备的流感病毒：将含流感病毒基因组的多个载体导入到一群鸡蛋宿主内，这群鸡蛋宿主可支持流感病毒的复制，在低于或等于35℃的温度下孵育鸡蛋，以及回收多个流感病毒。
63.一种稳定的流感病毒疫苗组合物，该组合物包含流感病毒、精氨酸、蔗糖、NAF和明胶。
64.权利要求63所述的组合物，其特征在于，所述组合物所含的精氨酸的浓度约为1-4％。
65.权利要求63所述的组合物，其特征在于，所述组合物所含的蔗糖的浓度约为5-10％。
66.权利要求63所述的组合物，其特征在于，所述组合物所含的NAF的浓度约为10-60％。
67.权利要求63所述的组合物，其特征在于，所述组合物所含的明胶的浓度约为1-4％。
68.权利要求63所述的组合物，其特征在于，所述组合物在约2-8℃下是稳定的。
69.一种流感病毒疫苗组合物，该组合物含有流感病毒、约1-4％的精氨酸、约5-10％的蔗糖、约10-60％的NAF和约1-4％的明胶，其中所述组合物在约2-8℃下是稳定的。

Claims (62)

1.一种制备一种或多种流感病毒组合物的方法，该方法包括：
a.通过鸡蛋传代流感病毒；
b.加温流感病毒；以及
c.通过滤膜过滤流感病毒。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流感病毒包含一种或多种A型流感病毒株和/或一种或多种B型流感病毒株。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，过滤包括使流感病毒组合物通过微孔滤膜，其中所述微孔滤膜的孔径约为0.2到0.45微米。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，加温包括在约31℃的条件下孵育病毒。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，加温包括在28℃或更高的温度下孵育病毒。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，加温包括在28℃到约40℃的温度下孵育病毒。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，加温包括在约28℃到约36℃的温度下孵育病毒。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，加温包括在约28℃到约34℃的温度下孵育病毒。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，加温包括在约30℃到约32℃的温度下孵育病毒。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，加温在过滤病毒前进行。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，加温在过滤病毒过程中进行。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，加温是在过滤病毒前和过滤病毒过程中进行。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，加温过程持续约1小时。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，加温过程持续约30到240分钟。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，加温过程持续约45到200分钟。
16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，加温过程持续约60到90分钟。
17.一种用权利要求1所述方法制备的流感病毒组合物。
18.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病毒组合物包含流感疫苗组合物。
19.一种用权利要求18所述方法制备的流感疫苗组合物。
24.一种制备一种或多种流感病毒组合物的方法，该方法包括：通过鸡蛋传代流感病毒，其中，接种后在所述传代期间摇动鸡蛋。
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，摇动包括以每分钟约1圈或更低的速度、每分钟约5圈或更低的速度、每分钟约10圈或更低的速度倾斜鸡蛋。
26.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述鸡蛋被摇动约12小时。
27.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述鸡蛋被摇动约24-48小时。
28.如权利要求24所述的方法，该方法还包括第二次孵育。
29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，在第二次孵育期间摇动所述鸡蛋。
30.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述流感病毒包括A型流感病毒和/或B型流感病毒。
31.如权利要求24所述的方法，其特征在于，用摇动的鸡蛋传代的病毒的TCID50比未摇动的鸡蛋生产出来的同一流感病毒的TCID50高至少0.4log。
32.一种用权利要求24所述方法制备的流感病毒组合物。
33.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述病毒组合物包括流感疫苗组合物。
34.一种用权利要求33所述方法制备的流感疫苗组合物。
35.一种制备一种或多种流感病毒组合物的方法，该方法包括：
a.将含流感病毒基因组的多个载体导入一群鸡蛋宿主内，该群鸡蛋宿主能够支持流感病毒的复制；
b.在低于或等于35℃的温度下孵育这群鸡蛋宿主；以及
c.回收多个流感病毒。
36.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述流感病毒包含一种或多种：减毒流感病毒、冷适应性流感病毒、温敏流感病毒或冷适应性温敏减毒流感病毒。
37.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述多个载体包含一种或多种B型流感病毒。
38.一种用权利要求35所述方法制备的流感病毒组合物。
39.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述病毒组合物包括流感疫苗组合物。
40.一种用权利要求39所述方法制备的流感疫苗组合物。
41.如权利要求35所述的方法，该方法还包括筛选含野生型HA和NA基因的流感病毒。
42.如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述筛选包括将一群流感病毒与一种或多种非野生型HA和NA基因的特异性抗体共孵育。
43.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述孵育在一个或多个鸡蛋内进行。
44.一种用权利要求42所述的方法制备的流感病毒组合物。
45.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述病毒组合物包括流感疫苗组合物。
46.一种用权利要求45所述方法制备的流感疫苗组合物。
47.一种制备一种或多种流感病毒组合物的方法，该方法包括：
a.i.将多个含流感病毒基因组的载体导入到一群鸡蛋宿主内，该群鸡蛋宿主能够支持流感病毒的复制；
ii.在低于或等于35℃的温度下孵育这群鸡蛋宿主；
iii.回收多个流感病毒；
b.将该群流感病毒与一种或多种非野生型HA和NA基因的特异性抗体共孵育；
c.通过鸡蛋传代流感病毒，该鸡蛋被摇动；以及
d.加热流感病毒并通过滤膜过滤流感病毒。
48.一种用权利要求47所述方法制备的流感病毒组合物。
49.如权利要求47所述的方法，其特征在于，所述病毒组合物包括流感疫苗组合物。
50.一种用权利要求49所述的方法制备的流感疫苗组合物。
51.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流感病毒通过荧光聚焦分析法进行检测。
52.一种制备一种或多种流感病毒组合物的方法，其特征在于，所述组合物含有约10-60％的未分馏的正常尿囊液。
53.如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述组合物含有约1-5％的精氨酸。
54.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流感病毒组合物用缓冲液稀释，该缓冲液基本上不含正常尿囊液。
55.如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述流感病毒组合物含有约1-4％的明胶。
56.如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述流感病毒组合物含有约2％的明胶。
57.如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述流感病毒组合物含有约5-10％的蔗糖。
58.如权利要求57所述的方法，其特征在于，所述组合物含有约7-10％的蔗糖。
59.如权利要求53所述的方法，其特征在于，所述组合物含有约2％的精氨酸。
60.如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述组合物含有约80-150mM的组氨酸。
61.如权利要求60所述的方法，其特征在于，所述组合物含有约100mM的组氨酸。
62.如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述流感病毒组合物在约2-8℃的条件下能够基本稳定至少6个月、至少9个月、至少18个月或至少24个月。
63.如权利要求62所述的方法，其特征在于，所述组合物在约4℃的条件下是基本稳定的。
65.一种流感病毒组合物，其中，该组合物是通过如下过程制备的：通过鸡蛋传代流感病毒，加热病毒，以及通过滤膜过滤病毒，该组合物具有第一TCID50，所述第一TCID50大于第二TCID50，第二TCID50来自于不是通过下述过程制备的流感病毒：通过鸡蛋传代流感病毒，加热病毒，以及通过滤膜过滤病毒。
66.一种流感病毒组合物，其特征在于，所述组合物是通过如下步骤制备的：通过鸡蛋传代流感病毒，其中，在所述传代过程中摇动鸡蛋，这种组合物具有第一TCID50，所述第一TCID50大于第二TCID50，第二TCID50来自于不是通过如下过程制备的流感病毒：通过鸡蛋传代流感病毒，其中，在所述的传代过程中摇动鸡蛋。
67.一种流感病毒组合物，其特征在于，所述组合物是通过如下步骤制备的：将含流感病毒基因组的多个载体导入一群鸡蛋宿主内，这群鸡蛋宿主能够支持流感病毒的复制，在低于或等于35℃的温度下孵育鸡蛋，以及回收多个流感病毒，这种组合物具有第一TCID50，所述第一TCID50大于第二TCID50，第二TCID50来自于不是通过如下过程制备的流感病毒：将含流感病毒基因组的多个载体导入到一群鸡蛋宿主内，这群鸡蛋宿主可支持流感病毒的复制，在低于或等于35℃的温度下孵育鸡蛋，以及回收多个流感病毒。
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