CN1147316C - 流感病毒静水压技术灭活工艺制备疫苗的方法 - Google Patents

Abstract

流感病毒静水压技术灭活工艺制备疫苗的方法，选取工作毒种，接种8-11日龄鸡胚并于34℃孵化，48-72小时后收获尿囊液，超滤浓缩、超速离心纯化，过柱层析，半成品检定，单价病毒悬液合并，静水压灭活，成品检定，终产品分装及包装，是利用当代高压物理学与生物学技术结合的一种偿试，它不仅保留流感全病毒完整结构不被破坏，而且病毒又完全灭活，同时抗原的免疫原性又不受影响而且还有有所提高，对流感病毒变异快，变种多非常适宜，而且工艺简便，生产周期短，总成本低，能满足现代工业化规模生产。

Description

流感病毒静水压技术灭活工艺制备疫苗的方法

本发明涉及医药生物制品中流感病毒灭活疫苗，特别是流感病毒静水压技术灭活工艺制备疫苗的方法。

流感是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病。流感病毒分为甲、乙、丙三型，其中甲型病毒传染性最强且容易发生变异，传播速度最快。流感病毒经常不断发生抗原变异，出现新的亚种，一般10-15年发生一次世界范围内的大流行；区域性流行春秋常在各地发生。注射流感灭活疫苗是一种有效的预防流感的方法。制备流感疫苗必须采用WHO推荐毒株结合各国实际情况用甲1、甲3和乙型三价流感病毒来制作灭活疫苗。灭活剂的选择及应用方法，是灭活疫苗制备上的关键技术。化学试剂甲醛(福尔马林)是应用最早最广泛的灭活剂，从1941年美国批准用甲醛灭活制备流感病毒灭活疫苗以来一直沿用至今。

由于甲醛易使病毒粒子表面蛋白抗原受损，往往影响疫苗的免疫原性。同时甲醛又有一定的刺激性，有一定的副作用。人体接种这种疫苗局部和全身反应都较强。为了解决甲醛灭活存在的问题，本世纪60年代，超速离心机和层析色谱技术的应用，使流感病毒纯化操作大大提高，制成了流感全病毒灭活疫苗。然而，儿童使用时仍可出现不良反应。为了使不良反应减少，接着又研制出多种裂解剂，如乙醚，3-N-丁基磷酸盐(Tri-N-butylphosphate)，聚山梨酸酯80(Polysorbate80)，脱氧胆酸钠(Sodium deoxy cholate)，三硝基甲苯X100(Triton X100)等，生产出了裂解疫苗，此种疫苗1986年在美国首次被批准使用。

本世纪70和80年代，在裂解疫苗的基础上，又研制出了流感病毒亚单位和表面抗原(HA和NA)疫苗。英国在临床试用中，证实了免疫效果与裂解疫苗相同，并可用于儿童。1980年英国首次批准使用，而后扩展到其它国家。

在实践中发现，流感病毒亚单位和表面抗原疫苗接种后虽然不良反应有所减少，但其免疫原性都不如纯化的全病毒粒疫苗，从而又开展了佐剂研究工作。利用佐剂来提高免疫效果的。用B30-MDP[6-0-(2-14烷基16烷酰“2-tetradcylhexdecanoyl”)-N-乙酰胞壁酰“N-acetylmuramoyl”-L-丙氨酰“L-alanyl”-D-异谷氨酰胺“D-isoglutamine”和纯化的流感病毒颗粒HA、NA抗原、胆固醇及去污剂(Octyl glucoside-辛基苷)相混，通过超声波使之充分混合，溶解，然后经过纤维素去除去污剂。这样就能使流感毒粒HA和NA亚单位内部和外表面相互附着成微脂粒的薄片状结构，其直径约为100nm，类似于一个完整的流感病毒颗粒。这种疫苗，日本己开始在志愿者试用，抗体阳转为理想，但仍有副反应，如注射部位有疼痛和红肿等。

本发明的目的是针对现有技术的不足，应用现代高压物理学与生物学互相交叉渗透建立起来的一种理想方法，既流感病毒静水压灭活疫苗方法。它不仅保留流感全病毒完整结构不被破坏，而且病毒又能完全灭活，同时抗原的免疫原性又不受影响而且还有明星提高，对流感病毒变异快，变种多非常适宜，而且工艺简便，生产周期短，总成本低，能满足现代工业化规模生产。

流感病毒静水压技术灭活工艺制备疫苗的操作方法，取工作毒种，接种8-11日龄鸡胚并于34℃孵化，48-72小时后收获尿囊液，超滤浓缩、超速离心纯化，过柱层析，半成品检定，单价病毒悬液合并，静水压灭活，成品检定，终产品分装及包装。

一、静水压、高压设备及其工作原理

1、静水压

静水压是流体静压力的简称。将固体、液体和气体均视为连续介质。在外力作用下，各部分介质通过它们之间的分界面互施大小相等、方向相反的作用力，称作用在单位界面上的力为应力。可以把应力分解成两个分量：一个垂直于作用面，称为正应力，常用σ表示；另一个在作用面内，称切应力，常用т表示。可以证明，介质内任一点的应力状态可以用对称的应力张量来表示，应力张量共有9个分量，表示为： $\left[\begin{array}{ccc}\mathrm{\σx}& \mathrm{\&Tgr;xy}& \mathrm{\&Tgr;xz}\\ \mathrm{\&Tgr;yx}& \mathrm{\σy}& \mathrm{\&Tgr;yz}\\ \mathrm{\&Tgr;zx}& \mathrm{\&Tgr;zy}& \mathrm{\σz}\end{array}\right]$

其中，σx、σy、σz分别是介质的其余部分对介质内的体积元在x、y、z方向的正应力；тij(I，j＝x、y、z)是6个切应力，前一个足标代一切应力的方向，后一个足标代表切应力作用面的外法线方向。

定义压力为            p＝-(σx+σy+σz)/3，即压力的大小等于所考察点上的3个正应力的平均值，负号表示压力的作用方向与过该点的作用面的外法线方向相反。特殊地，如果流体处于静止状态，或者虽然处于运动状态，但是流体是无粘性的，其6个切应力分量都等于零，只有3个正应力不为零。可以证明

                      σx＝σx＝σz＝-P，

即静止流体或无粘流体的压力等于任一方向正应务的负值，称这样的压力为流体静压力。概括的说，静水压状态的特点是切应力为零，正应力各向同性。在高压科学技术研究中，一般称接近静水压的状态为准静水压，称远离静水压力的状态为非静水压。在压强的实验测量中，实际测量的是某一有限面积上的正应力。当该面积处于流体当中时，由于平衡态下满足静水压条件，压力分布是均匀的，于是用单位面积上的力可以把压强确定到相当高的精度。高精度静水压的获得，与所选用的传压介质的剪切强度有关。

所谓的传压介质是指：传递压力的媒介物质。流体传压介质的基本功能是把施于其上的轴向压力转变成作用到试样上的均匀压力，即转变成静水压力。此外考虑到使用时的可靠、方便与安全，还要求传压介质具有下列物性：化学惰性，渗透率及压缩率低，容易操作，容易密封，价格低廉。根据不同的使用要求和压力范围，可选用不同的气体、液体或固体作为传压介质。一般地说，转变成静水压的能力方面，气体最佳，液体次之，固体最差，即使选用剪切强度很低的软固体也只能获得准静水压。常用的液体介质有甘油、变压器油、煤油、汽油、石油醚、戊浣与异戊烷的混合液以及水等。

二、静水压机设备简介及其工作原理

常温常压静水压机由超高压容器、超高压力源及配套的管路附件系统组成。它使受压制品得到各向均匀的超高压力作用。

超高压腔体积一定，通过不断增加腔体内油密度来改变腔体内压力，达到升压的目的。加压在常温下进行。升、降压过程在几秒或几十秒内完成，因此在操作过程中，可将整个系统视为绝热状态，与外界无热交换，即Dq＝Tds≈0。由于在升、降压过程中系统对外分别做负功和正功，因而系统内部有微小的温度起伏，但并不影响病毒的存活。所以，病毒的灭活完全是由压力所致，而不是温度造成的。

三、流感三价全病毒混合悬液静水压灭活操作方法

1、根据流感病毒疫苗生产规模大小，引进或加工制造适于生产规模产量的静水压机，进口自动化程度高，自己加工制作的一般手工操作，中、小型静水压机日本有定型产品出售；大规模生产的静水压机瑞典生产；我国上海大龙机械厂能加工制造；

2、选定好静水压机，安放于符合药品GMP生产流程要求的4-8℃无菌室内，按通电源，调节电压、检测、调试至符合生产要求的各项参数指标。

3、流感三价全病毒浓缩悬液，经检定合格后，装于500ml软塑料采血袋或软塑料输液袋内密封好，置于4-8℃冰箱保存备用，防止冻融，也可以加工制式的软塑料袋专供装流感病毒悬流，根据规模而定250ml-5000不等规格。

4、将静水压机密封高压腔打开，置放好装有流感三价全病毒悬液采血袋或塑料袋，选用好传压介质、密闭高压腔，接通电源，调节电压，选定200-300Mpa、静水压20-40分钟；

5、流感三价全病毒悬液经静水压处理后及时存放于4-8℃冰箱。

本发明创造是利用当代高压物理学与生物学技术结合的一种偿试，替代了传统的化学灭活方法。静水压技术是近几年发展起来的一种全新的方法和手段。用以灭活流感病毒同时保苗甚至提高免疫原性。因物理方法灭活技术，不残留化学物质成分，使适用安全。无疑使流感病毒疫苗的生产，具有了极大的应用价值和巨大的经济效益。

流感病毒静水压灭活疫苗，系由甲1(H₁N₁)型：A1/Beijing/262/95、甲3(H₃N₂)型：A3/SYSNWY/5/97和乙型：B/HARBIN/7/94三株流感病毒分别接种鸡胚，培养48-72小时后收获尿囊液，经一系列浓缩、柱层析纯化、及静水压技术处理工艺后制成的多价灭活疫苗。

分别对流感静水压灭活疫苗进行固定受压时间、改变压力及固定压力、改变受压时间的实验。将经静水压力处理后的样品分别进行TCID50测定，结果表明：经250MPa及其以上高压力处理的病毒完全丧失感染能力，而低于250MPa压力处理的病毒其毒力也明显下降。

取被灭活(250MPa)的病毒样品，电镜观察显示在形态上与正常病毒粒子相比有明显变化，病毒粒子有凸起形成。取同样的两份病毒样品分别提取其总RNA，进行反转录后，对CHBA进行琼脂糖凝胶电泳，分析其带谱的变化，再结合HA基因的特片段扩增，结果二者无明显差异，HA基因的特异扩增呈阳性。这说明一定的静水压力虽然可使流感病毒灭活，但并没有使HA基因片段断裂。这是因压力对病毒表面结构蛋白产生影响，从而使其灭活。

取流感静水压灭活疫苗注射家兔，经基础免疫、二次免疫及三次免疫之后采血，离心取上清，获得实验用待检血清，进行血清中和试验。同时用相同处理的病毒用甲醛灭活作为对照。结果表明，经静水压力灭活的病毒所引起的中和抗体效价远远高于用甲醛灭活的病毒所引起的中和抗体效价5-10％。

六、下面结合实施例进一步描述本发明创造。

实施例1：

1)、按国家规定的质量标准和工艺生产出的合格流感三价全病毒悬液250ml；

2)将流感三价病毒粒悬液装入采血袋密封，用微型静水压机处理，压力250MPa，时间30分钟，经静水压机处理后，再放入4-8℃冰箱内。

实施例2：

1)按国家规定流感病毒灭活疫苗生产方法进行，三价病毒粒悬液约1000毫升；

2)选定中小型静水压机，超高压腔体积一次能处理1000毫升，放入静水压机进行技术处理，加压力均选定为250MPa，时间30分钟，其他方法同上。

实施例3：

1)流感病毒静水压灭活疫苗规模化生产，生产环境条件必须符合GMP要求，疫苗全程工艺及质量指标必须按流感疫苗WHO规定要求进行，人员技术，设备、工艺环境必须配套；

2)静水压机需大中型一流设备，每次能技术处流感三价病毒粒悬液5000毫升，安置于生产流感病毒疫苗最佳工艺环节，其他方法同上。

流感病毒静水压灭活疫苗系由甲1、甲3及乙型流感病毒接种鸡胚，收获尿囊液，浓缩纯化后静水压灭活获得的病毒悬液，经磷酸盐缓冲液稀释而成。确保0.5ml(每人分一支)含有血凝素甲1、甲3及乙型都在15μg以上。经三价流感病毒灭活疫苗免疫小白鼠后，血清中和试验证明疫苗免疫后血清对甲1、甲3及乙型流感病毒的中和指数分别达到1.6×10⁵，2.5×10⁵，1.6×10⁵以上，以确保疫苗免疫效果。

流感病毒静水压灭活疫苗再经皮下接种小白鼠，腹腔接种豚鼠，观察7天。全部小白鼠及豚鼠体重增加，健康存活，无任何异常表现。证明疫苗安全性及毒性试验合格。并经过敏原性检定证明不存在有过敏原。

通过静水压技术处理流感病毒粒悬液，经实验室、中试，产业化等不同规模生产，证实既能有效灭活流感病毒，又能提高免疫原性，还能缩短工艺时间，又简便价廉，符合现代产业化生产。

Claims (3)

1、一种流感病毒静水压技术灭活工艺制备疫苗的方法，取工作毒种，接种8-11日龄鸡胚并于34℃孵化，48-72小时后收获尿囊液，超滤浓缩、超速离心纯化，过柱层析，半成品检定，单价病毒悬液合并，静水压灭活，成品检定，终产品分装及包装。

2、根据权利要求1所述的流感病毒静水压技术灭活工艺制备疫苗的方法，实验样品选用国家批准的生物制品制药单位，现生产符合国家规定的质量标准和工艺生的合格流感三价全病毒悬液250ml；将的流感三价病毒粒悬液装入采血袋密封，微型静水压机处理，压力250MPa，时间30分钟，经静水压机处理后，再放入4-8℃冰箱内。

3、根据权利要求1所述的流感病毒静水压技术灭活工艺制备疫苗的方法，按国家规定流感病毒灭活疫苗生产方法进行，三价病毒粒悬液约1000毫升；选定中小型静水压机，超高压腔体积一次能处理1000毫升，放入静水压机进行技术处理，加压力均选定为250MPa，时间30分钟；其他方法同上。