CN1324660A - 流感病毒静水压灭活与纳米技术处理工艺制备裂解疫苗的方法 - Google Patents

Abstract

采用静水压和纳米技术相结合工艺制备流感病毒裂解疫苗的方法，就是选取流感病毒工作毒种，即由甲1、甲3及乙型流感病毒接种8－110日龄鸡胚，并于34℃孵化，48－72小时后放入4－8℃冷胚过滤,然后收获尿囊液进行病毒试验,后用静水压技术灭活,低速离心提纯及超滤浓缩,过柱层析,采用纳米技术处理,使病毒粒悬液裂解至14nm颗粒,单价病毒悬液检定,半成品配制与检定,成品分装与检定,成品包装即成流感病毒裂解疫苗。本项工艺制备方法采用了当代两次高新技术,取代甲醛灭活病毒和化学试剂裂解病毒,新工艺使疫苗免疫原性好,安全无化学污染,工艺快速、简便,可以满足工业化生产的需要,宜于普及推广。

Description

流感病毒静水压灭活与纳米技术处理工艺制备裂解疫苗的方法

本发明涉及医药生物制品中流感病毒灭活疫苗与流感病毒裂解疫苗，特别是流感病毒静水压灭活与纳米技术处理工艺制备疫苗的方法。

流感是一种甲、乙、丙三型流感病毒引起的急性呼吸道传染病。本病发病急，传播快，发病率高，具有一定的死亡率，在儿童和老弱患者中死亡率较高，给人类造成严重的社会和经济后果。而且流感病毒经常不断发生抗原变异，出现新的亚种，一般10-15年发生一次世界范围内的大流行；区域性流行春秋常在各地发生。至今人类尚无有效的治疗方法，唯一的方法就是接种流感疫苗进行预防，因此流感疫苗的研制具有十分重要的社会和经济效益。制备流感疫苗必须采用WHO推荐毒株结合各国实际情况用甲1、甲3和乙型三价流感病毒来制作灭活疫苗和裂解疫苗。灭活和裂解方法的选择是疫苗制备上的关键技术。化学试剂甲醛(福尔马林)是应用最早最广泛的灭活剂，从1941年美国批准甲醛灭活制备流感病毒灭活疫苗以来一直沿用至今。目前已确认甲醛是一种致癌物质。由于甲醛易使病毒粒子表面蛋白抗原受损，往往影响疫苗的免疫原性。同时甲醛又有一定的刺激性，有一定的副作用。人体接种疫苗局部和全身反应都较强。为了解决甲醛灭活存在的问题，本世纪60年代，超速离心机和层析色谱技术的应用，使流感病毒纯化操作大大提高，制成了流感全病毒灭活疫苗。然而，儿童使用时仍可出现不良反应。为了使不良反应减少，接着又研制出多种裂解剂，如乙醚，3-N-丁基磷酸盐(Tri-N-butylphosphate)，聚山梨酸酯80(Polysorbate80)，脱氧胆酸钠(Sodium deoxy cholate)，三硝基甲苯X100(Triton X100)等，生产出了裂解疫苗。1980年英国首次批准使用，而后扩展到其它到国家。

在实践中发现，流感病毒亚单位和表面抗原疫苗接种后虽然不良反应有减少，但其免疫原性都不如纯正化的全病毒粒疫苗，从而又开展了佐剂研究工作。利用佐剂来提高免疫效果的。用B30-MDP[6-0-(2-14烷基16烷酰“2-tetradcylhexdecanoyl”)-N-乙酰胞壁酰“N-acetylmuramoy”-L-丙氨酰“L-alanyl”-D-异谷氨酰胺“D-isoglutamine”和纯化的流感病毒颗粒HA、NA抗原、胆因醇及去污剂(Octyl glucoside-辛基苷)相混，通过超声波使之充分混合，溶解，然后经过纤维素去除去污剂。这样就能使流感毒粒HA和NA亚单位内部和外表面相互附着成微脂粒的薄片状结构，其直径约为100nm，类似于一个完整的流感病毒颗粒。这种疫苗，日本已开始在志愿者试用，抗体阳转为理想，但仍有副反应，如注射部位有疼痛和红肿等。

目前，国际上流感病毒疫苗主要包括流感病毒灭活疫苗(纯化的，三价的全属毒粒灭活疫苗)；裂解疫苗；亚单位疫苗三种(见图1)，三种流感病毒疫苗的结构所示。它们各有利弊，前者制备简单，但有时会引起不良反应；裂解的，可降低不良反应，但制备过程中需加和去除裂解剂；而后者安全性好，可对儿童进行免疫接种，但抗体应答效果差，同时造价高。

流感全病毒灭活疫苗于1941年在美国首次被批准使用。这种疫苗接种后，局部和全身反应都很强。本世纪60年代，超速离心机和层析色谱技术的应用，使毒粒纯化操作大大提高，制成了全毒粒疫苗。然而，儿童使用时仍可出现不良反应。以后又研制出裂解的纯化疫苗，不良反应大为减少，接着研制出多种化学裂解剂，如乙醚，3-M-丁基酸盐(Tri-N-butylphosphate)，聚山梨酸酯80(Polysorbate80)，脱氧胆酸钠(Sodium deoxy cholate)，三硝基甲苯X100(TritonX100)等，生产出了裂解疫苗，此种疫苗1986年在美国首次被批准使用。

在实践中发现，毒粒亚单位和表面抗原疫苗接种后虽然不良反应有所减少，但其免疫原性都不如纯化的全毒粒疫苗，从而就开始了佐剂研究工作。从根本上讲裂解疫苗，亚单位疫苗的免疫原性目前还尚未完全解决。

本发明的目的是针对现有技术的不足，应用现代高压物理学与生物学互相交叉渗透建立起来的一种理想方法，既流感病毒静水压灭活结合纳米技术裂解病毒的方法制备流感病毒裂解疫苗，取代化学试剂和去污剂。它不仅使病毒能完全灭活，同时抗原的免疫原性又不受影响，而且还有明显提高免疫活性，对流感病毒变异快，变种多非常适宜，工艺简便，生产周期显著缩短，总成本低，能满足现代工业化规模生产。

流感病毒静水压灭活与纳米技术处理工艺制备裂解疫苗的方法，选取流感病毒毒种，即由甲1、甲3及乙型流感病毒接种8-110日龄鸡胚，并于34℃孵化，48-72小时后放入4-8℃冷胚过滤，然后收获尿囊液进行无菌试验后用静水压技术灭活，低速离心提纯及超滤浓缩，过柱层析，采用纳米技术处理，使病毒粒悬液裂解至14nm颗粒，单价病毒悬液检定，半成品配制与检定，成品分装与检定，成品包装即成流感病毒裂解疫苗。其工艺路线为：种子液制备→接种鸡胚→34-55℃温箱培育48-72小时→4-8℃冷胚过夜→收获尿囊液→无菌试验→静水压技术灭活→低速离心提纯及超滤浓缩→过柱层析→纳米技术裂解→单价病毒悬液检定→半成品配制与检定→成品分装与检定→成品包装。

静水压技术是近年来发展起来的一项高新物理技术，将该技术应用于生物学领域，主要用于研究生物大分子在高压下所发生的结构与功能的变化，亦有用于灭活生物大分子病毒。我们将该技术首次应用于流感病毒灭活疫苗目的在于彻底省去福尔马林灭活剂，提高疫苗的安全性。而且极大在地简化了生产工艺，缩短了生产周期。实验证实，经静水压技术灭活的流感病毒，在免疫原性方面亦有所提高。

常规的流感病毒裂解疫苗制备过程中，是用化学裂解剂将病毒蛋白裂解成亚单位，再经纯化制成亚单位疫苗的。这样在制成的流感病毒裂解疫苗中或多或少地存在化学裂解剂，从而使疫苗的不安全性增加。而用纳米技术处理流感病毒，不仅彻底消除了化学裂解剂的存在，而且还可以保证使裂解后的病毒亚单位大小均一，使疫苗的安全性增加，质量全面提高，达到WHO的有关规定要求。

静水压是流体静压力的简称。将固体、液体和气体均视为连续介质。在外力作用下，各部分介质通过它们之间的分界面互施大小相等、方向相反的作用力，称作用在单位界面上的力为应力。可以把应分解成两个分量：一个垂直于作用面，称为正应力；常用σ表示：另一个在作用面内，称切应力，常用T表示。可以证明，介质内任一点的应力状态可以用对称的应力张量来表示，应力张量共有9个分量，表示为： $\left[\begin{array}{ccc}\mathrm{\σx}& \mathrm{Txy}& \mathrm{Txz}\\ \mathrm{Txy}& \mathrm{\σy}& \mathrm{Tyz}\\ \mathrm{Tzx}& \mathrm{Tzy}& \mathrm{\σz}\end{array}\right]$

其中，σx、σy、σz分别是介质的其余部分对介质内的体积元在x、y、z方向的正应力；Tij(I、j=x、y、z)是6个切应力，前一个足标代一切应力的方向，后一个足标代表切应力作用面的外法线方向。

定义压力为    P=-(σx+σy+σz)/3，即压力的大小等于所考察点上的3个正应力的平均值，负号表示压力的作用方向与过该点的作用面的外法线方向相反。特殊地，如果流体处于静止状态，或者虽然处于运动状态，但是流体是无粘性的，其6个切应力分量都等于零，只有3个正应力不为零。可以证明

σx=σy=σz=-P，即静止流体或无粘流体的压力等于任一方向正应力的负值，称这样的压力为流体静压力。概括的说，静水压状态的特点是切应力为零，正应力各向同性。在高压科学技术研究中，一般称接近静水压的状态为准静水压，称远离静水压力的状态为非静水压。在压强的实验测量中，实际测量的是某一有限面积上的正压力。当该面积处于流体当中时，由于平衡态下满足静水压条件，压力分布是均匀的，于是用单位面积上的力可以把压强确定到相当高的精度。高精度静水压的获得，与所选用的传压介质的剪切强度有关。

所谓的传压介质是指：传递压力的媒介物质。流体传压介质的基本功能是把施于其上的轴向压力转变成作用到试样上的均匀压力，即转变成静水压力。此外考虑到使用时的可靠、方便与安全，还要求传压介质具有下列物性；化学惰性，渗透率及压缩率低，容易操作，容易密封，价格低廉。根据不同的使用要求和压力范围，可选用不同的气体、液体或固体作为传压介质。一般地说，转变成静水压的能力方面，气体最佳，液体次之，固体最差，即使选用剪切强度很低的软固体也只能获得准静水压。常用的液体介质有甘油、变压器油、煤油、汽油、石油醚、戊浣与异戊烷的混合液以及水等。

常温常压静水压机由超高压容器、超高压力源及配套的管路附件系统组成。它使受压制品得到各向均匀的起高压力作用(见图2)。

超高压腔体积一定，通过不断增加腔体内油密度来改变腔体内压力，达到升压的目的。加压在常温下进行。升、降压过程在几秒或几十秒内完成，因此在操作过程中，可将整个系统视为绝热状态，与外界无热交换，即Dq=Tds≈0。由于在升、降压过程中系统对外分别做负功和正功，因而系统内部有微小的温度起伏，但并不影响病毒的存活。所以病毒的灭活完全是由压力所致，而不是温度造成的。

流感三价全病毒混合悬液静水压灭活操作方法

1)根据流感病毒疫苗生产规模大小，引进或加工制造适于生产规模产量的静水压机，进口自动化程度高，自己加工制作的一般手工操作，中、小型静水压机日本有定型产品出售；大规模生产的静水压机瑞典生产；我国上海大龙机械厂能加工制造；

2)选定好静水压机，安放于符合药品GMP生产流程要求的4-8℃无菌室内，按通电源，调节电压、检测、调试至符合生产要求的各项参数指标；

3)流感三价全病毒浓缩悬液，经检定合格后，装于500ml软塑料采血袋或软塑料输液袋内密封好，置于4-8℃冰箱保存备用，防止冻融，也可以加工制式的软塑料袋专供装流感病毒悬液，根据规模而定250-5000ml不等规格；

4)将静水压机密封高压腔打开，置放好装有流感三价全病毒悬液采血袋或塑料袋，选用好传压介质、密闭高压腔，接通电源，调节电压，选定200-300Mpa，静水压20-40分钟；

5)流感三价全病毒悬液经静水压处理后及时存放于4-8℃冰箱。

流感病毒静水压灭活，系由甲1(H1N1)型：Al/Beijing/262/295、甲3(H3N2)型：A3/SYSNWY/5/97和乙型：B/HARBIN/7/94三株流感病毒分别接种鸡胚，培养48-72小时后收获尿囊液，分别对流感病毒静水压灭活进行固定受压时间、改变压力及固定压力、改变受压时间的实验。将经静水压力处理后的样品分别进行TCID50测定，结果表明：经250Mpa压力处理的病毒其毒力也明显下降。

取被250Mpa灭活的病毒样品，电镜观察显示在形态上与正常病毒粒子相比有明显变化，病毒粒子有凸起形成。取同样的两份病毒样品分别提取其总RNA，进行反转录后，对CHBA进行琼脂糖凝胶电泳，分析其带谱的变化，再结合HA基因的特片段扩增，结果二者无明显差异，HA基因的特异扩增呈阳性。这说明一定的静水压力虽然可使流感病毒灭活，但并没有使HA基因片段断裂。这是因压力对病毒表面结构蛋白产生影响，从而使其灭活。取流感静水压灭活疫苗注射家兔，经基础免疫、二次免疫及三次免疫之后采血，离心取上清，获得实验用待检血清，进行血清中和试验。同时用相同处理的病毒用甲醛灭活作为对照。结果表明，经静水压力灭活的病毒所引起的中和抗体效价远远高于用甲醛灭活的病毒所引起的中和抗体效价5-10％。

纳米技术裂解流感病毒理论依据设置选型、工作原理、操作方法及效果检定

1、纳米科学概念

纳米科学，是人们研究纳米尺度——即100纳米至0.1范围之内的物质所具有的特异现象和特异功能的科学，而纳米技术则是指此基础之上制造新材料、研究新工艺的方法和手段。纳米科学技术不是某一学科的延伸，也不是某一工艺产物，而是基础理论学科与当代高新技术的结晶。它以物理、化学的微观研究理论为基础，以当代精密仪器和先进的分析技术为手段，是一个内容广阔的多学科群。

纳米技术不仅是指它能制造超细粉末或纳米液体技术，它还泛指在扫描隧道显微镜下，直接观察和操纵单个原子和分子，按人们意愿组成需要的超微型器件。

纳米又称毫微米，符号为nm或mu，是1微米的千分之一。如果以我们日常生活中常用的单位“米”(m)(1m=3市尺)作为主单位的话，纳米在长度单位中换算所处的位置如表1所示。

可见，1纳米等于10^-9米(十亿分之一米)，是人类肉眼不能分辨出来的很小的长度单位。一般人类头发丝的直径在70微米左右，即为70000纳米。

组成自然界的最基本的单位是原子，它们的大小必须用埃这个单位来量度。而由原子构成的分子，则大小不等。一般有机小分子在几个纳米至几十纳米之间，与生命有关的生物分子则大得多。

2、纳米技术裂解流感病毒的理论依据

1)流感病毒的形态结构

众所周知，甲、乙型流感病毒是有囊膜病毒，呈现多型性，常为球型，直径为80-120nm。主要包括HA和NA以及M2三种蛋白。核衣壳呈现螺旋对称，直径9-15nm。RNA为单股负链。甲、乙型流感病毒的结构示意图(见图3)。

2)流感病毒主要多肽成分及其抗原性质：(见表2)

根据流感病毒各抗原成分的性质及分子量大小可以看出，其主要保护性抗原可分为HA和NA，裂解的大小分别为70kDa，其病毒颗粒裂解直径在14nm以下。所以，我们选用14nm级对撞机对流感病毒进行技术处理，既保持其病毒的免疫原性，又能充分裂解病毒颗粒。用这种方法裂解的流感亚单位疫苗只含有浓缩和纯化的流感病毒外壳抗原即血凝毒和种经氨酸酶；而不含有病毒核酸及其他外来蛋白质。这就是我们用纳米技术处理流感病毒，制作亚单位疫苗的理论论据。

3、纳米对撞机的选型及工作原理

目前尚无国产纳米对撞机问世，从日本进口的纳米对撞机主要有两个型号：LEH-2和PEH-1，(见表3)。我们选用LEH-2型纳米对撞机进行了中等规模的流感病毒亚单位疫苗生产，基本可以满足实际需要。如果进行较大规模的生产，可采用PEH-1型机。

纳米对撞机的基本工作原理是对撞机中的单晶金刚石开了两个“X”通道，反应物和介质在2000个大气压驱动通过这两个“X”通道，在通道的交叉处瞬间被粉碎、分散和乳化。粉碎的粒度只有几个纳米，粒度小，粒度分布窄，而且粒度大小是可调控的。这与一般情况和一般能量下的反应显然不同，肯定会发生质的变化。

本发明创造是利用高新物理技术和生物技术处理流感病毒的方法。取代化学试剂和去污剂制成亚单位疫苗的一次革命。

三十年前，生物学遇到了可见光仪器的局限问题。一般的光学显微镜由分辨率不够不能对病毒进行观测。电子显微镜虽然有很高的放大倍数，但是不能用于对活细胞的研究。而许多基本的生物学问题，必须在活的机体中去研究。

纳米技术的发展使上述问题有了解决的办法。在这个用埃或纳米作单位的范围中，病毒就好比是大象了。而原子就象是棋盘上的棋子，可以一个一个搬动。

纳米技术在生物学中的应用既可能在扫描隧道显微镜下，直接观察和操纵单个原子或分子，又可以粉碎生物材料，制造纳米粉末或液体。我们应用纳米技术处理流感全病毒(80-120nm)，裂解为14nm左右大小的颗粒，取代化学试剂和去污剂制成亚单位疫苗。实践证明是完全可以的。它不仅手段先进科学，方法简便快速，而且非常安全。表面抗原生物活性指标好。流感全病毒经纳米级裂解超微化后，颗粒小，表面积大。产物易纯化，收产率高，一般可使抗原的免疫原性提高15-20％，影响安全的因素少，不残留任何化学物质，具有物殊的生物物理性能。

4、纳米技术裂解流感病毒操作方法

纳米技术裂解流感病毒的方法：单价全病毒悬液经检定合格后，置4-8℃冰箱中保存备用，防止冻融；将选定好的纳米对撞机放置于4-8℃无菌室中，接通电源，调节电压，选定14nm极超微粒子通道，用无菌超纯水冲洗容器和管道，对裂解后的流感毒超微粒子再层进行检定，最后合格成品包装为流感裂解疫苗。

5、纳米技术裂解流感疫苗效果检定

1)纳米技术裂解流感端正毒的电镜结果。(见图4)

2)纳米技术裂解(物理方法)裂解流感病毒疫苗各项质控指标检测的结果。(见表4)

由表2可看出化学方法裂解需要清除化学裂解剂，工艺复杂，影响安全因素多、疫苗免疫原性低；而纳米技术处理表面抗原活性指标高，而且技术先进，方法简便快捷，适于工业化生产，宜于普有推广。

下面结合实施例进一步描述本发明创造。

实施例1：

1)按国家规定的质量标准和工艺生产出的合格流感三价全病毒悬液250ml；

2)将流感三价病毒粒悬液装入采血袋密封，用微型静水压机处理，压力250MPa，时间30分钟，经静水压机处理后，再放入4-8℃冰箱内；

3)将用静水压灭的流感三价病毒粒悬液，放入调试好的纳米对撞机，对流感病毒进行纳米技术处理，调节电压、压力、流量，使病毒悬液裂解至14nm大小颗粒，以15分钟处理30ml，经纳米机处理后，再放入4-8℃冰箱内。

实施例2：

1)按国家规定流感病毒疫苗生产方法进行，三价病毒粒悬液约1000毫升；

2)选定中小型静水压机，超高压腔体积一次能处理1000ml，放入静水压机进行技术处理，加压力均选定为250MPa，时间30分钟，经静水压机处理后，再放入4-8℃冰箱内；

3)选下中小型纳米对撞机，30分钟能处理1000毫升产样品，裂解病毒悬液颗粒均为14nm。

实施例3：

1)流感病毒裂解疫苗规模化生产，生产环境条件必须符合GMP要求，疫苗全程工艺及质量指标必须按流感疫苗WHO规定要求进行，人员技术，设备、工艺环境必须配套；

2)静水压机需中型一流设备，每次能技术处理流感三价病毒粒悬液5000ml，安置于生产流感病毒疫苗最佳工艺环节；

3)纳米对撞机也需用中型一流设备，每小时能处理流感三价病毒草粒悬液15000ml以上，安置于生产流感病毒疫苗最佳工艺环节，一般固定不动，纳米对撞机每次处理流感三价病毒粒悬液技术参数不宜有变动，以确保量的稳定性。

流感病毒裂解疫苗系由甲1、甲3及乙型流感病毒接种鸡胚，收获尿囊液，静水压灭活获得的病毒悬液，经离心浓缩层析纯化，用纳米技术处理，经磷酸盐缓冲液稀释而成。确保0.5ml(每人分一支)含有血凝素甲1、甲3及乙型都在15μg以上。经三价流感病毒裂解疫苗免疫小白鼠后，血清中和试验证明疫苗免疫后血清对甲1、甲3及乙型流感病毒的中和指数分别达到1.6×10⁵，2.5×10⁵,1.6×10⁵以上，以确保疫苗免疫效果。

流感病毒裂解疫苗再经皮下接种小白鼠，腹腔接种豚鼠，观察7天。全部小白鼠及豚鼠体重增加，健康存活，无任何异常表现。证明疫苗安全性及毒性试验合格。并经过敏原性检定证明不存在有过敏原。

通过静水压结合纳米技术处理流感病毒粒悬液，经实验室、中试，产业化等不同规模生产，证实既能有效灭活裂解流感病毒，又能提高免疫原性，还能缩短工艺时间，又简便价廉，符合现代产业化生产。

单位	缩写或符号	对主单位的比
			米	M	主单位
分米	Dm	1/10
			厘米	Cm	1/100
毫米	Mm	1/1000
			丝米	Dmm	1/10000
忽米	Cmm	1/100000
			微米	U	1/1000000
纳米	Nm或mu	1/10000000
			埃	A	1/100000000

                                表1

多肽链名称	MW	亚单位个数	蛋白分子量	病毒颗中的分子数	分布及抗原性质
						神经氨酸酶(NA)	60,000	4	240,000	100-200(25-50个突起)	表面糖蛋白，神经氨酸酶抗原，抗原性变异株的特征
核蛋白(NP)	53,000			1,000	内部蛋白，联系RNA，核工业蛋白抗原，抗原性稳定，型的特征
						血凝素	重链58,000轻链28,000	3		1,00021,000(少于500个突起)1,000	表面糖蛋白，血凝素抗原，抗原性易变，株特征
内膜蛋白	25,000			3,000	主要内部蛋白，内膜蛋白抗原，抗原性稳定型特征

                                表2

型号	类型	电压	产量
				LEH-2	小型机	220V	60L/h 10kgF/cm
PEH-1	生产机	220或380V	300L/h 10kgF/cm

                                表3

                                表4

Claims (5)

1、流感病毒静水压灭活与纳米技术处理工艺制备裂解疫苗的方法，选取流感病毒毒种，即由甲1、甲3及乙型流感病毒接种8-110日龄鸡胚，并于34℃孵化，48-72小时后放入4-8℃冷胚过滤，然后收获尿囊液进行无菌试验后用静水压技术灭活，低速离心提纯及超滤浓缩，过柱层析，采用纳米技术处理，使病毒粒悬液裂解至14nm颗粒，单价病毒悬液检定，半成品配制与检定，成品分装与检定，成品包装即成流感病毒裂解疫苗。

2、根据权利要求1所述的流感病毒静水压灭活与纳米技术处理工艺制备裂解疫苗的方法，选用规定的质量标准和工艺生产的合格流感三价全病毒悬液250ml；将流感三价病毒粒悬液装入采血袋密封，微型静水压机处理，压力250MPa，时间30分钟，再放入4-8℃冰箱内。

3、根据权利要求1所述的流感病毒静水压灭活与纳米技术处理工艺制备裂解疫苗的方法，按规定流感病毒灭活疫苗生产方法进行，三价病毒粒悬液约1000ml；选定中小型静水压机，超高压腔体积一次能处理1000ml，放入静水压机进行技术处理，压力均选定为250MPa，时间30分钟；其他方法同上。

4、根据权利要求1所述的流感病毒静水压灭活与纳米技术处理工艺制备裂解疫苗的方法，按规定的质量标准和工艺生产出的合格流感三价静水压灭活全病毒粒悬液取30ml，放入微型纳米对撞机内，进行纳米技术处理，使流感悬液裂解到14nm大小颗粒，以15分钟处理30ml，放入4-8℃冰箱内。

5、根据权利要求1所述的流感病毒静水压灭活与纳米技术处理工艺制备裂解疫苗的方法，按规定的流感病毒灭活疫苗生产方法进行收集单价病毒粒悬液约1000ml，选定小型纳米对撞机，30分钟能处理1000ml裂解病毒悬液颗粒均为14nm。

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