KR20120087892A - 인플루엔자 백신 조성물의 제조 방법 - Google Patents

인플루엔자 백신 조성물의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

인플루엔자 백신으로서 적합한 인플루엔자 바이러스의 제조를 최적화하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.

Description

인플루엔자 백신 조성물의 제조 방법 {METHODS OF PRODUCING INFLENZA VACCINE COMPOSITIONS}
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2003년 2월 25일 출원된 미국 가출원 제60/450,181호 "인플루엔자 백신 조성물의 제조 방법 {METHODS OF PRODUCING INFLUENZA VACCINE COMPOSITIONS}" 발명을 우선권으로 주장한다. 본원에서는 모든 목적으로 본 우선 출원의 전문을 참고문헌으로 인용하였다.
다양하면서도 진화된 인플루엔자 스트레인에 대한 백신은, 매년 수많은 개체가 인플루엔자 바이러스의 상이한 스트레인 및 유형으로 감염되기 때문에 공중 건강의 대표 지점이라는 점에서 뿐 아니라, 상업상으로도 중요하다. 신생아, 태아, 적절한 건강 주의를 하지 않는 사람들 및 면역이 손상된 사람들은 그런 감염으로부터 특별히 위험하다. 인플루엔자 감염의 문제를 해결하는 것은 신규 인플루엔자 스트레인을 용이하게 진화시키고, 그럼으로써 신규 백신의 연속 제조를 허용하게 되는 것이다.
그런 상이한 인플루엔자 바이러스에 특이적인 보호성 면역 반응을 생성하는 것이 가능한 다수의 백신이 50여년에 절쳐 제조되어 왔으며 예컨대, 전체 바이러스 백신, 분리 바이러스 백신, 표면 항원 백신 및 생 약독화 바이러스 백신을 포함한다. 그렇지만, 임의의 이들 백신 유형의 적절한 조성이 전신 면역 반응을 생성하는 것이 가능하게 되는 동안, 생 약독화 바이러스 백신은 호흡 기관에서 국소 점막 면역성을 자극할 수 있다는 장점을 가진다. 생 약독화 바이러스 함유 백신은 신속하고 경제적으로 제조할 수 있으며 그리고 보관/운반이 용이할 수 있어서 바람직하다.
현재까지, 모든 상업상 구입할 수 있는 인플루엔자 백신은 수정시킨 닭의 에그에서 증식되었다. 비록 인플루엔자 바이러스가 닭 에그에서 잘 성장하지만, 백신의 제조는 그런 에그의 유용성에 좌우된다. 에그의 공급이 조직화되어 있고, 그리고 백신 제조용 스트레인을 다음 플루 시즌에 몇달 앞서 선택하기 때문에, 이러한 접근의 가용성은 제한적일 수 있으며, 그리고 종종 지연되고 제조 및 분배에 있어서 단점을 가진다. 따라서, 닭의 에그에서 백신의 처리량을 증가시키고 그리고/또는 백신의 생산량을 증가시키는 임의의 방법이 상당히 요구된다.
세포 배양시 인플루엔자 바이러스를 제조하기 위한 시스템이 또한 최근 수년간 개발되어 왔다 (예컨대, Furminger. Vaccine Production, in Nicholson et al. (eds.) Textbook of Influenza pp. 324-332; Merten et al. (1996) Production of Influenza virus in cell cultures for Vaccine preparatiorz, in Cohen & Shafferman (eds.) Novel Strategies in Design and Production of Vaccines pp. 141-151 참조). 닭의 에그에서 백신 제조에 관련하여 많은 문제점들이 있어 왔으며, 인플루엔자의 변원성 스트레인 모두가 세포 배양시 잘 성장하거나, 또는 확립된 조직 배양 방법에 따라 제조될 수 있는 것은 아니다. 게다가, 바람직한 특성, 예컨대, 약독화, 온도 민감성 및 추위 적응, 생 약독화 백신의 제조에 대한 적합성을 가지는 많은 스트레인이 조직 배양시 확립된 방법을 사용하여 성공적으로 성장해온 것은 아니다. 따라서, 세포 배양시 백신 제조시 처리량을 증가시키거나 및/또는 생산량을 증가시키는 임의의 방법이 또한 상당히 요구된다.
백신을 제조하기 위한 인플루엔자 바이러스의 제조시 고려할 만한 작업은 본 발명자들 및 공동-작업자들에 의해 수행되었다; 예컨대, 인플루엔자 바이러스 제조용 멀티-플라스미드 시스템, 2002년 4월 26일 출원 USSN 60/375,675, 2003년 4월 25일 출원 PCT/US03/12728 및 2003년 4월 25일 출원 USSN 10/423,828 등 참조. 본 발명은, 백신 조성물 제조용 그런 바이러스, 뿐 아니라 다른 인플루엔자 바이러스의 제조를 (정량/정성 및 속도 모두) 증가시키고/최적화시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 태양은 종래의 닭 에그 및 신규 세포 배양 백신 제조 스타일 (및 또한 조합 시스템)에 적용할 수 있으며 이하의 연구로부터 명백한 수많은 다른 장점을 포함한다.
본 발명은, 인플루엔자 바이러스 (예컨대, A 바이러스 스트레인 또는 B 바이러스 스트레인 등)를 에그를 통해 통과시키고, 바이러스를 가열하고 그리고 멤브레인을 통해 바이러스를 여과시킴으로써, 하나 또는 그 이상의 인플루엔자 바이러스 조성물을 제조하는 방법의 구체예를 제공한다.
몇가지 그런 구체예에서, 여과시키는 것은 소공의 크기 0.2 마이크로미터 내지 약 0.45 마이크로미터의 마이크로필터를 통해 그 조성물을 통과시키는 것을 포함한다. 게다가, 다양한 구체예에서, 그런 구체예에서 가열 온도는 선택적으로 약 28℃ 내지 약 40℃ 또는 그 이상을 포함하며, 일부 구체예에서, 그 온도는 31℃ 또는 약 30℃ 내지 약 32℃를 포함한다. 그런 구체예에서 가열은 선택적으로 여과 이전 또는 여과 동안 또는 여과 이전 및 여과 동안 발생하며 그리고 선택적으로 약 50분 내지 약 100분, 약 60분 내지 약 90분, 또는 약 60 분을 포함한다. 본 발명은 또한 그런 방법으로 제조된 인플루엔자 바이러스 조성물을 제공한다 (그 조성물이 백신 조성물인 경우 포함).
다른 태양으로서, 본 발명은, 에그를 통해 인플루엔자 바이러스를 통과시키고, 바이러스를 가열하고 그리고 바이러스를 정제시킴으로써, 하나 또는 그 이상의 인플루엔자 바이러스 조성물을 제조하는 방법을 포함한다. 그런 구체예는 또한 선택적으로 멤브레인을 통해 조성물을 여과시키는 것을 포함하며 그리고 여기서 그 조성물은 백신 조성물 뿐 아니라 그런 구체예에 의해 제조된 실질적인 백신 조성물을 포함한다.
관련 태양으로서, 본 발명은, 에그를 통해 인플루엔자 바이러스를 통과시킴으로써 통과 동안 로킹(rocking)시켜 하나 또는 그 이상의 인플루엔자 바이러스 조성물을 제조하는 방법을 포함한다. 로킹은 선택적으로 분당 약 1 사이클의 속도로 선택적으로 약 12시간 동안 에그를 틸팅(tilting)시키는 것을 포함한다. 그런 구체예는 선택적으로 인플루엔자 A 바이러스 스트레인 및/또는 인플루엔자 B 바이러스 스트레인을 사용하며 그리고 또한 선택적으로 그런 로킹시킨 에그의 TCID50이 로킹시키지 않은 에그를 통해 통과시킨 동일한 바이러스의 TCID50에 비해 0.4 로그 더 큰 경우를 포함한다. 그런 구체예에 의해 제조된 바이러스 조성물이 또한 본 발명의 특징이며, 그 조성물이 백신 조성물인 경우를 포함한다.
본 발명은 또한 인플루엔자 바이러스 게놈을 포함하는 복수의 벡터를 (바이러스의 복제를 지지할 수 있는) 숙주 에그의 집단 내로 도입시키고, 35℃ 또는 그 이하의 온도에서 에그의 집단을 배양시키고, 그리고 복수의 인플루엔자 바이러스를 회수함으로써 하나 또는 그 이상의 인플루엔자 바이러스 조성물을 제조하는 (예컨대, 그런 재배열을 편주시키는) 방법을 포함한다. 그런 바이러스는 선택적으로, 예컨대, 약독화 바이러스, 추위 적응 바이러스, 온도 민감성 바이러스 또는 약독화 추위 적응 온도 민감성 바이러스를 포함하며, 또한, 예컨대, 인플루엔자 B 바이러스를 포함할 수 있다. 그런 구체예에 의해 제조된 바이러스 조성물(백신 조성물 포함)이 또한 본 발명의 특징이다. 그런 태양은 또한 선택적으로 예컨대, 복수의 바이러스를 (예컨대, 하나 또는 그 이상의 에그 내에서 수행된) 비-야생형 HA 및 NA 유전자에 특이적인 하나 또는 그 이상의 항체와 배양시킴으로써, 야생형 HA 및 NA 유전자를 포함하는 인플루엔자 바이러스를 선택하는 것을 더 포함한다. 그렇게 제조된 바이러스 조성물이 또한 백신 조성물을 포함하여 본 발명의 특징이다.
본 발명의 다른 태양은, 인플루엔자 바이러스 게놈을 포함하는 복수의 벡터를 (인플루엔자 바이러스의 복제를 지지할 수 있는) 숙주 에그의 집단 내에 도입시키고, 35℃ 또는 그 이하의 온도에서 에그의 집단을 배양시키고, 그리고 복수의 바이러스를 회수하고, 복수의 바이러스를 비-야생형 HA 및 NA 유전자에 특이적인 하나 또는 그 이상의 항체와 배양시키고, 그 바이러스를 (로킹시킨) 에그를 통해 통과시키고 그리고 그 바이러스를 가열하고 그리고 멤브레인을 통해 그 바이러스를 여과시킴으로써, 하나 또는 그 이상의 인플루엔자 바이러스 조성물을 제조하는 것을 포함한다. 그런 방법으로 제조된 바이러스가 또한 본 발명의 특징이다 (백신 조성물 포함).
본원에 구체화된 다양한 방법에서, 인플루엔자 바이러스 조성물은 선택적으로 형광 포커스 분석을 사용함으로써 분석하였다. 그런 바이러스 조성물은 선택적으로 약 10% 내지 약 60% 분획화시키지 않은 정상 요낭 유체 (그리고 선택적으로 약 1% 내지 약 5% 아르기닌)를 포함한다. 그 조성물은 선택적으로 실질적으로 정상 요낭 유체가 없는 버퍼로 선택적으로 희석한다. 본원에서 그 조성물은 선택적으로 실질적으로 젤라틴이 없다. 이들 조성물은 약 2℃ 내지 약 8℃에서 안정하거나, 또는 4℃에서 안정하다. 본원의 일부 조성물 및 방법에서, 본원의 다른 조성물 및 방법 (예컨대, 마이크로여과 및/또는 초여과 및/또는 가열 및/또는 로킹 포함)에서도 바이러스는 인플루엔자 바이러스이며, 바이러스는 선택적으로, 예컨대, 비-인플루엔자 바이러스 (예컨대, 에그에서 배양을 통해 제조되는 바이러스, 예컨대, 믹소바이러스, 파라믹소바이러스, RSV, 아하선염 바이러스, 홍역 바이러스, 센디 바이러스, 황열 바이러스, pIV, 등)를 포함한다. 따라서, 본 발명의 방법 및 조성물은 또한 그런 다른 바이러스 및/또는 비-인플루엔자 바이러스에도 적용할 수 있다.
또다른 태양에서, 본 발명은 인플루엔자 바이러스 조성물을 포함하며, 여기서 그 조성물은, 에그를 통해 인플루엔자 바이러스를 통과시키고, 바이러스를 가열하고, 그리고 멤브레인을 통해 바이러스를 여과시킴으로써 제조되며, 그 조성물은 2차 TCID50보다 더 큰 1차 TCID50를 가지며, 2차 TCID50은 에그를 통해 인플루엔자 바이러스를 통과시키고, 바이러스를 가열하고, 그리고 멤브레인을 통해 바이러스를 여과시킴으로써 제조되는 것이 아닌 인플루엔자 바이러스로부터 유래하는 것이다.
본 발명의 다른 태양은 인플루엔자 바이러스 조성물을 포함하며, 여기서 그 조성물은, 에그를 통해 인플루엔자 바이러스를 통과시킴으로써 제조되며, 여기서 에그를 상기 통과 동안 로킹시키며, 그 조성물은 2차 TCID50보다 더 큰 1차 TCID50를 가지며, 2차 TCID50은 에그를 통해 인플루엔자 바이러스를 통과시킴으로써 제조되는 것이 아닌 인플루엔자 바이러스로부터 유래하는 것이며, 여기서 에그를 상기 통과 동안 로킹시킨다.
본원에서 더 다른 구체예는 인플루엔자 바이러스 조성물을 포함하며, 여기서 그 조성물은 인플루엔자 바이러스 게놈을 포함하는 복수의 벡터를 숙주 에그의 집단 내로 도입시키고, 그 숙주 에그의 집단은 인플루엔자 바이러스의 복제를 지지할 수 있으며, 35℃ 또는 그 이하의 온도에서 숙주 에그의 집단을 배양시키고, 그리고 복수의 인플루엔자 바이러스를 회수함으로써 제조되며, 그 조성물은 2차 TCID50보다 더 큰 1차 TCID50를 가지며, 2차 TCID50은 숙주 에그의 집단 내로 인플루엔자 바이러스 게놈을 포함하는 복수의 벡터를 도입시키고, 35℃ 또는 그 이하의 온도에서 숙주 에그의 집단을 배양시키고, 그리고 복수의 인플루엔자 바이러스를 회수함으로써 제조되는 것이 아닌 인플루엔자 바이러스로부터 유래하는 것이며, 여기서 숙주 에그의 집단은 인플루엔자 바이러스의 복제를 지지할 수 있다.
본 발명의 이들 및 다른 목적 및 특징은 이하의 상세한 설명을 첨부된 도면과 조합하여 읽음으로써 완전히 명백해진다.
본 발명은 백신 제조/사용에 적합한 바이러스 및 바이러스 조성물 제조의 처리량 및 생산량을 증가시키는 방법 및 조성물을 포함한다. 그 방법 및 조성물에는, 예컨대, 바이러스 제조시 목적하는 재배열을 선택하는 것, 온도 콘디쇼닝/여과, 로킹, 항체 선택, 포텐시 분석, 및 본원에 더 상세히 기재된 많은 특징들이 포함된다.
본원의 다양한 단계들을 모두 수행하거나 또는 동일한 제조 시리즈로 존재할 필요는 없다는 것이 본 기술 분야에서 당업자에게 이해되어야 한다. 따라서, 몇가지 바람직한 구체예에서, 본원의 모든 단계들 및/또는 조성물이, 예컨대, 표 1에 요약한 바와 같이 수행하거나 또는 존재하며, 다른 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 단계를 선택적으로, 예컨대, 생략하고, 변경한다 (범위, 순서, 장소, 등).
본원의 바이러스 제조를 위한 방법 및 조성물의 기본 개요를 표 1에 요약하였다. 다시 말하면, 그것을 통해 강조하는 바와 같이, 본 발명의 개별 단계들, 예컨대 표 1에 나열된 단계들은 반드시 상호 의존적이지는 않다. 예컨대, 몇가지 구체예에서, 적절한 재배열 바이러스 용액을 함유하는 에그를 배양 동안 로킹시키고 (이하 참조), 다른 구체예에서는 그렇지 않으며; 단계 10에서의 가열 및 여과는 단계 13에서의 범용 시약의 사용과는 별개이다. 본 발명에서 임의의 하나의 단계/방법/조성물이 존재하는 것은 본 발명에서 임의의 다른 단계/방법/조성물이 존재하는 것에 반드시 좌우되는 것은 아니다. 따라서, 본 발명의 다양한 구체예는 단지 하나의 단계, 모든 단계, 또는 단계들의 임의의 조합 및 모든 다양한 조합을 포함할 수 있다.
종래의 구체예는 본 기술 분야에서 공지된 단계/방법/조성물, 예컨대, 바이러스 함유 에그의 캔들링, 에그에 바이러스를 접종시키는 것 등을 포함한다는 것을 본 기술 분야의 당업자가 이해하여야 한다. 따라서, 본 기술 분야에서 당업자는, 적절한 바이러스, 바이러스 용액, 조성물 등을 제조하기 위한 그런 공지의 단계에 대해, 적절한 조건, 서브-단계, 단계 상세사항, 등을 용이하게 결정할 수 있다. 개별 단계는 이하에 더 상세히 설명하였다. 실시예에 포함되는 주된 단계에 대해서는 표 1에 나열된 사항을 참조한다.
기재 및 설명의 편의상, 본 발명의 다양한 단계들, 예컨대, 다양한 방법 및 조성물을 크게 4개의 그룹을 포함하거나 또는 4개의 그룹으로 구분되는 것으로 고려할 수 있다. 제1그룹은 공-감염, 재배열, 재배열의 선택, 및 재배열의 클로닝과 같은 태양을 포함한다 (예컨대, 그럼으로써 대략적으로 표 1 중 단계 1 내지 3에 해당). 제2그룹은 재배열의 정제 및 팽창과 같은 태양을 포함하며 대략적으로 표 1 중 단계 4 내지 6에 해당하는 것으로 고려할 수 있다. 제3그룹은 추가로 에그의 재배열의 팽창 및 그렇게 수확한 바이러스 용액의 정제를 포함한다 (예컨대, 대략적으로 표 1 중 단계 7 내지 11에 해당). 제4그룹은 수확한 바이러스 용액의 안정화 및 바이러스 용액의 포텐시/멸균 분석을 포함한다 (예컨대, 대략적으로 표 1 중 단계 12 내지 15에 해당). 그렇지만, 상기 4개의 일반 카네고리 내에서 본 발명의 태양을 분리하는 것은 단지 설명을 위해/분류적인 목적이며 각 단계들의 상호의존성을 간섭하고자 하는 것이 아님을 반드시 이해하여야 한다.
인플루엔자 백신으로서 적합한 인플루엔자 바이러스의 제조를 최적화하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
도 1 : DEK TC-24에서 33℃ 및 25℃에서의 감염 이후 M 유전자형을 도시한다.
도 2: 33℃에서 5:3 및 6:2의 상이한 타이터를 보여주는 플라그 분석 및 데이타를 도시한다.
도 3: 6:2 vs. 5:3 재배열의 성장 곡선을 도시한다.
도 4: MDV-B 및 야생형 B 바이러스의 M1 서열을 도시한다.
도 5: MDV-B 및 야생형 B 바이러스의 M2 서열을 도시한다.
도 6: MDVB-M1에서 두 상보적 영역에서의 돌연변이를 도시한다.
도 7: B/HK 6:2 M1 돌연변이의 성장 곡선을 도시한다.
도 8: 상이한 MOI에서 다양한 CEK 세포 감염을 보여준다.
도 9: 백신 제조 프로세스 동안 잠재적인 미생물 오염의 플로우 차트를 보여준다.
도 10: 적외선 이미지화를 통한 개별 에그의 온도 디케이 속도를 도시하였다.
도 11: 생, 사, 및 생식력 없는 에그의 열에 의한 이미지화를 도시하였다.
도 12: 바이러스 수확 농축의 개략적인 플로우 차트를 도시하였다.
도 13: 5회 세척과 NAF 단백질의 비교를 도시한다.
도 14: 농축 이전 N/뉴 칼레도니아/20/99 1-X-비농축 시료의 어세이를 도시한다.
도 15: A/뉴 칼레도니아/20/99 10X 농축 시료의 어세이를 도시한다.
도 16, 판넬 A-B: 1X 및 10X의 A/뉴 칼레도니아/20/99; 및 5회 세척 이후 1X-W 시료의 비교를 도시한다.
도 17: A/뉴 칼레도니아/20/99 1X 및 1X-W 시료의 비교를 도시한다.
도 18, 판넬 A-C: 10X 및 10X-W의 A/뉴 칼레도니아/20/99; A/뉴 칼레도니아/20/99의 투과물; 및 5회 세척 A/뉴 칼레도니아/20/99의 비교를 도시한다.
도 19: 세척 회수 및 제거된 불순물을 비교하는 SEC에 의한 분석을 보여준다.
도 20: A/뉴 칼레도니아/20/99의 1XW 및 10X-W 비교를 도시한다.
도 21: A/뉴 칼레도니아/20/99의 96-웰 플레이트 분석을 보여준다.
도 22: 보류물 및 투과물에서 뉴라미니다제 활성/바이러스 정제 그래프를 보여준다.
도 23: 대조군, 10X, 10X-W, 및 1X-W의 RHPLC를 도시한다.
도 24: 대조군, 10X, 1X-W 및 10X-w 시료의 그래프를 보여준다.
도 25: 투과물 및 1 내지 6회 세척의 RHPLC를 도시한다.
도 26: 오보뮤코이드 제거 RHPLC 그래프를 보여준다 (피크 면적).
도 27: 리소짐 제거의 RHPLC 그래프를 보여준다 (피크 면적).
도 28: 콘알부민 제거의 RHPLC 그래프를 보여준다 (피크 면적).
도 29: 오브알부민 제거의 RHPLC 그래프를 보여준다 (피크 면적).
도 30: Agilent 2100에 의한 오브알부민 분석의 그래프를 보여준다.
도 31: 항-A/뉴 칼레도니아의 웨스턴 블롯 SDS-PAGE 젤이다.
도 32: 10X-W, A/뉴 칼레도니아/20/99의 5회 세척 이후 시료의 분석을 도시한다.
도 33: RTPCR에 의한 RNA 분석의 그래프를 보여준다.
도 34: SEC에 의한 A/베이징-세포 배양물 증식의 모니터링을 보여준다.
도 35: 베로 세포에서 A/베이징의 세포 배양물 수확을 보여준다.
도 36: 2 리터의 A/파나마 세포 배양물의 농축을 보여준다.
도 37: 2 리터의 B/홍콩 세포 배양물을 10 ml로의 농축을 보여준다.
도 38: 예시 바이러스 저장 조성의 안정도의 4 그래프를 보여준다.
도 39: 다양한 바이러스 스트레인에 의한 예시 바이러스 저장 조성의 안정도 그래프를 보여준다.
도 40: 다양한 바이러스 스트레인에 의한 예시 바이러스 저장 조성의 안정도 그래프를 보여준다.
도 41, 판넬 A-C: 상이한 시트레이트 농도에 의한 예시 바이러스 저장 조성의 안정도를 보여준다.
도 42, 판넬 A-C: 상이한 EDTA 농도에 의한 예시 바이러스 저장 조성의 안정도를 보여준다.
도 43: 9개월에 걸쳐 상이한 바이러스 스트레인에 의한 미정제 바이러스 수확 조성물의 안정도를 보여준다.
도 44: 인산 버퍼와 관련된 조성의 초기 포텐시 손실을 도시하였다.
도 45: 6개월에서 다양한 조성의 안정도 기울기의 글로벌 도면을 제공한다.
도 46: 6개월에서 다양한 조성의 안정도 기울기의 글로벌 도면을 제공한다.
도 47: 젤라틴 및 PVP/EDTA에 의한 다양한 조성의 안정도를 보여준다.
도 48: 상이한 pH에서 히스티딘에 의한 다양한 조성의 안정도를 보여준다.
도 49: 상이한 양의 수크로즈에 의한 다양한 조성의 안정도를 보여준다.
도 50: 웰로부터 판독한 흡광도, vs 수치의 빈도수 (그 흡광도 수치에서 판독 웰의 번호)의 플로팅으로부터 유도된 히스토그램.
도 51: 판독 흡광도 vs 수치의 빈도수의 플로팅으로부터 유도된 히스토그램.
도 52: 6:2 인플루엔자 재배열을 발생시키기 위한 일반 프로세스를 보여준다.
전술한 바와 같이, 논의 및 설명을 용이하게 하기 위해서, 본 발명의 각종 단계는 광범위하게 4개의 그룹을 포함하는 것으로 생각할 수 있다. 제1 그룹은 동시감염, 재배열, 재배열체 선별 및 재배열체의 클로닝(예컨대, 대체로 표 1의 단계 1 내지 3에 상응함) 측면을 포함한다. 제2 그룹은 재배열체의 정제 및 증식 측면을 포함하며, 대체로 표 1의 단계 4 내지 6에 상응하는 것으로 생각할 수 있다. 제3 그룹은 수거와 함께 알 내의 재배열체의 추가의 증식과 그렇게 수거된 바이러스 용액의 정제(예, 대체로 표 1의 단계 7 내지 11에 상응함)를 포함한다. 제4 그룹은 수거된 바이러스 용액의 안정화 및 바이러스 용액의 효능/무효성 분석을 포함한다(예컨대, 대체로 표 1의 단계 12 내지 15에 상응함). 그러나, 본 발명의 측면들을 상기 4개의 일반 카테고리로 분류하는 것은 설명/구성을 위한 것이고, 단계들의 상호의존성을 내포하는 것은 아님을 강조하는 바이다.
그룹 1
본 명세서에서 그룹 1에 속하는 것으로서 광범위하게 분류되는 본 발명의 측면은, 예컨대 특별히 목적하는 재배열 바이러스를 생성하기 위해서 하나 이상의 야생형 바이러스와 마스터 도너 바이러스를 사용하는 세포 배양주의 동시 감염의 최적화; 적절한 재배열 바이러스의 선별; 및 선별된 재배열 바이러스의 클로닝과 관련된 방법 및 조성물을 포함한다. 인플루엔자 바이러스 균주의 재배열은 당업자에게 공지되어 있다. 인플루엔자 A 바이러스 및 인플루엔자 B 바이러스 모두의 재배열을 세포 배양물 및 알에서 이용하여 재배열 바이러스 균주를 생성하였다. 예컨대 Tannock et al., Preparation and characterisation of attenuated cold-adapted influenza A reassortants derived from the A/Leningrad/134/17/57 donor strain, Vaccine (2002) 20:2082-2090 참조. 플라스미드 구성체를 이용한 인플루엔자 균주의 재배열이 확인된 바 있다. 상기 인용된 "Multi-Plasmid System for the Production of Influenza Virus" 참조.
간단히 요약하면, 재배열은 일반적으로 상이한 바이러스로부터의 유전자 세그먼트의 (예, 알 또는 세포 배양물에서의) 혼합을 포함한다. 예를 들면, 인플루엔자 B 바이러스 균주의 전형적인 8 세그먼트를, 예컨대 관심 에피토프를 갖는 야생형 균주와 예컨대 저온 적응 균주를 포함하는 "도너" 균주 간에 혼합할 수 있다. 2종 바이러스 간의 재배열은, 특히 한 세그먼트에 대해서는 야생형 에피토프 균주를 포함하고 다른 세그먼트에 대해서는 저온 적응 균주를 포함하는 바이러스를 생성할 수 있다. 유감스럽게도, 목적하는 재배열체를 얻기 위해서, 다수회의 재배열을 실시해야 하는 경우가 흔히 있다. 재배열 후에, (예컨대, 목적하는 재배열체를 찾기 위해서) 바이러스를 선별할 수 있다. 목적하는 재배열체를 클로닝할 수 있다(예컨대 수 증가). 따라서, 재배열체의 구성을 위해 필요한 시간을 감소시키고 목적하는 재배열체 형성을 향상시키기 위한 단계가 극히 요망되는 실정이다.
인플루엔자 B 바이러스에 대한 목적하는 재배열체의 전형적인 최적화, 선별 및 클로닝 통상적으로, 바이러스 균주를 세포 배양물(예, CEK 세포)에 동시감염시킨 후에, 예컨대 모 바이러스 중 하나로부터 얻은 물질에 대한 적절한 항체로 선별하고(이것은 일반적으로는 알에서 행해짐), 보통 세포 배양물에서 행해지는 바이러스의 클로닝 또는 증식 등에 의해 실시된다. 그러나, 그러한 전형적인 재배열은 목적하는 세그먼트 혼합물을 형성하는 데 필요한 재배열 회수가 수천번에 이른다는 단점이 있다. 그러한 재배열이 행해지는 경우에는, 무작위 재배열이 최종 결과가 아니라는 점은 분명하다. 즉, 상기 과정을 편중시키는 압력이 계내에 존재한다. 그러나, 인플루엔자 A 균주의 경우 그러한 과정은 편중되지 않는 것으로 보인다. A 균주의 경우, 균주의 (통상적으로는 CEK 세포와 같은 세포 배양물로의) 동시 감염 후에, 통상적으로 세포 배양물 내에서 동시에 선별 및 클로닝을 다시 실시한다.
따라서, 본 명세서에 상세히 설명된 바와 같이, 본 발명의 각종 구체예들은 재배열 편중을 감소시키는 단계를 포함한다. 즉, 재배열체 클로닝은 세포주에서보다는 알(예, 33℃)에서 실시하거나, 또는 세포주에서, 예컨대 25℃에서 실시한다.
재배열 최적화
본 발명은 필요한 재배열의 횟수를 줄이(고, 이에 따라 백신 제조 공정의 처리량을 증가시키)기 위해서 그룹 1의 단계를 이용하여 재배열 과정을 최적화한다. 이 단계들을 이용하는 최적화 방법은 통상적으로 인플루엔자 B 균주의 재배열에 대해 구현되어 있고, 보통 세포 배양물(예, CEK 세포)에서 실시한다.
인플루엔자 바이러스의 다른 재배열 방법은 마스터 도너 바이러스(MDV)와 야생형 바이러스의 희석물, 예컨대 1:5 희석물(각 용액의 농도는 별로 중요하지 않음)을 혼합한 다음, 25℃ 및 33℃에서 24 시간 및 48 시간 동안 항온처리한다. 그러나, 그러한 방법이 인플루엔자 A 균주에 대해서는 흔히 허용가능하지만, 인플루엔자 B 균주는 일반적으로 그러한 프로토콜에 대한 양성의 결과를 산출하지 않는다. 예를 들어, 적당한 6:2 재배열(즉, MDV로부터의 6 유전자 및 야생형 바이러스로부터의 2 유전자인 NA 및 HA)를 실현하기 위해서, 종종 수천회의 재배열을 실시해야 한다.
따라서, 본 발명의 그룹 1의 단계의 전형적인 구체예는 MDV 균주 및 야생형 균주(특히 사용된 인플루엔자 B 균주)의 MOI(다중감염도)를 측정한 후, 표 2에 예시된 것들을 포함하는 재배열을 실시하는 것을 포함한다. 상기 최적화된 재배열 혼합물의 항온처리는 알에서 24 시간 동안 33℃에서 실시한다. 이와 유사한 구체예에서, 최적화되지 않은 시스템에서 수천개의 재배열 혼합물이 필요한 것과 대조적으로 수백개의 재배열 혼합물을 스크리닝함으로써 통상적으로 적당한 6:2 재배열을 실현할 수 있다.
재배열체의 선별 및 클로닝
그룹 1의 단계는 또한 재배열 인플루엔자 바이러스의 선별을 포함한다. 본 발명의 방법 및 조성물은 적당하게 재배열된 인플루엔자 B 바이러스의 선별에 특히 유용하다(그리고, 이에 대해 통상적으로 구현되어 있다). 재배열된 인플루엔자 A 균주를 세포 배양물(예, CEK 세포) 또는 알에서 선별할 수 있다. 그러나, 세포 배양물에서 재배열되는 경우(예컨대, CEK에서 선별되는 경우) 재배열 인플루엔자 B 균주는 문제를 야기한다. CEK 세포는 인플루엔자 B 균주 내의 M 유전자를 방해하여, 전체 생성을 감소시키는 것으로 생각된다. 하기 참조. 본 발명은, 일부 구체예에서 33℃의 알(인플루엔자 B 균주 내의 M 유전자에 대한 선별압 측면에서 중성임), 또는 대안적으로 25℃의 CEK 세포에서 실시되는 인플루엔자 B 재배열체를 선별하여 그러한 억제를 확인하였다. 도 52 참조.
그룹 1에 속하는 본 발명의 다른 구체예는 선별 과정에서 (MDV의) 항-HA 및 (MDV의) 항-NA 항혈청의 사용을 포함함으로써, 더욱 강력한 선별을 실현한다.
그룹 1에 속하는 본 발명의 또 다른 구체예는 생성된 재배열체의 클로닝을 포함한다. 상기 논의로부터 명백해지는 바와 같이, CEK 세포 배양물 내의 인플루엔자 B 재배열체의 클로닝은 음의 선별압으로 인하여 문제가 있는 것을 판명되었다. 따라서, 본 명세서의 일부 구체예에서, B 균주 재배열체를 33℃의 알에서 클로닝한다. 한편, 균주 재배열체를 경우에 따라서 CEK 세포 배양물 중에서 클로닝하고 동시에 선별한다.
본 명세서의 일부 구체예가 재배열체에 대한 알의 비편중 또는 비억제를 이용하긴 하지만(상기 참조), 본 명세서 중의 다른 구체예는 세포 배양물 내에서, 그러나 25℃에서의 재배열체의 선별/클로닝을 포함한다. 따라서, 본 발명의 일부 측면은 MDVB(마스터 도너 바이러스 B) M 유전자 및 야생형 B 바이러스 M 유전자의 상이한 성질을 이용하는 구체예를 포함한다. 예를 들어, 6:2 및 5:3 동시감염을 선택적으로 실시하여 목적하는 재배열체를 생성한다. 따라서, 예를 들어, B/HongKong/330/01 MVS 제조 과정에서, 33℃에서 CEK 세포 중의 희석율을 제한하여 혼합된 야생형 및 저온 적응 M 바이러스 RNA로부터 클로닝하면, 야생형 M 바이러스 RNA의 성장이 우세하게 된다. 알 및 CEK 세포에서, 33℃에서 6:2가 5:2(야생형 M 유전자 포함)와 함께 동시감염시키면 야생형 M vRNA는 MDV-유도된 M vRNA보다 우세하지만, 알에서 야생형 M vRNA를 얻을 기회가 더 높다. 대조적으로, 6:2 및 5:3으로 25℃에서 CEK 세포를 동시감염시킬 때 MDV-유도 M vRNA 및 야생형 M vRNA 모두는 유사한 양으로 존재한다. 따라서, 본 명세서의 일부 구체예에서, MVS 과정에서는 CEK 세포에서의 6:2 클로닝의 경우 25℃를 이용한다. 도 1 내지 도 8 참조. 도면으로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 플라크 분석 결과 33℃에서의 B 바이러스 6:2 역가는 낮은 MOI에서 각각의 5:3 역가보다 2 log10 이상 낮지만, 6:2는 25℃에서 5:3과 동일한 수준으로 성장한다. 33℃에서의 6:2의 성장 결함으로 MVS CEK 클로닝에서 6:2를 선별할 수 있다. MDVB 및 6:2의 성장 성질차는 M 유전자 우성에 있어서의 HA, NA의 연관성을 시사한다. MDVB와 야생형 B 바이러스 간에 보존성 아미노산차는 2개뿐이다. 6:2 M1 유전자에서 발린의 야생형 보존성 메티오닌으로의 단일 돌연변이는 33℃의 CEK 세포에서의 6:2 성장 결함을 복구할 수 있다.
재배열체의 특성규명
본 발명의 또 다른 구체예는 본 명세서에서 사용된 인플루엔자 바이러스의 유전자 배치를 결정하기 위해서 고 처리량 단일 가닥 형태 다형성/모세관 전기영동(SSCP/CE) 응용을 이용한다. 이러한 특성규명 측면을 다른 "그룹"으로 분류할 수 있지만, 구성적 목적을 위해서 이 부분에서 논의한다는 점에 유의해야 한다. 인플루엔자 바이러스는 8 유전자 세그먼트를 포함하며, 전술한 바와 같이 2종의 상이한 인플루엔자 균주로 단세포를 동시감염시키면 모 바이러스와 구별되는 신규한 유전자 배치를 갖는 재배열 바이러스를 생성할 수 있다. 따라서, 본 명세서의 일부 구체예는 다수의 인플루엔자 바이러스 샘플의 유전자 세그먼트 배치를 신속하게 결정하기 위해서 SSCP/CE 분석을 이용한다. 인플루엔자 바이러스 세그먼트는, 경우에 따라 8 세그먼트 각각에 대해 특이적인 형광 표지된 프라이머를 사용한 RT-PCR로 증폭시킨다. 또한, 참고 인용한 Arvin et al., (2000) J. Clin. Micro. 38 (2): 839-845 참조.
인플루엔자 게놈의 모든 8 세그먼트의 유전자형을 밝히는 데 필요한 RT-PCR 반응의 횟수를 줄이기 위해서, 복수의 세그먼트가 동일 반응에서 동시에 증폭되는 복합 반응을 경우에 따라 형성한다. 각 세그먼트에 상응하는 RT-PCR 생성물을 크기, 이동 패턴 및 형광 색상에 따라 분류한다. 비변성 매트릭스 내의 단일 가닥 DNA 단편의 이동은 크기뿐 아니라 그 서열 함량으로 측정한다.
저온 적응된 B/Ann Arbor/1/66(MDVB) 또는 그 유사물과, 몇몇 야생형 인플루엔자 B 균주 중 하나로 세포를 임의로 동시감염시킨다. 희석율과 복합 반응에서 증폭된 핵산을 제한함으로써 동시감염 자손을 클로닝한다. 프라이머를 선택하고, SSCP/CE에 의해 18℃에서 생성물을 분리하여, MDV B와 야생형 균주의 8 유전자 세그먼트 간의 분리능을 향상시킨다.
예를 들어, SSCP/CE 분석의 정확도를 입증하기 위해서, 약 50개의 상이한 재배열 바이러스로부터 얻은 400 유전자 세그먼트를 분석하고, SSCP/CE 결과를 제한 단편 길이 다형성(RFLP)으로 얻은 결과와 비교하였다. 2세트의 데이타 간의 일치도는 높았으며(~98%), 따라서 SSCP/CE 분석이 유효하다는 것을 확인하였다. 또한, SSCP/CE 분석은 인플루엔자 B 바이러스의 M 유전자 세그먼트 내의 단일 뉴클레오티드 치환을 검출할 수 있는 것으로 확인되었다.
박테리아 오염 예방
본 발명의 일부 구체예는 인플루엔자 바이러스가 생성되는 알의 미생물 오염을 검출 및/또는 예방/검출하는 단계를 포함한다. 그러한 단계는 표 1에 요약된 바와 같이 일부 영역에서 유용하며, 그룹 1, 그룹 2 및 그룹 3에 포함시킬 수 있지만, 구성상 그룹 1의 단계에 제공한다. 본 발명의 미생물 검출법은 신속/높은 처리량 미생물 검출에 유용하며, 따라서 본 명세서의 다른 여러 단계들과 마찬가지로 바이러스/백신 생성시 처리량을 증가시키는 데 유용하다.
본 발명의 일부 구체예를 포함하는 본 발명의 다수의 인플루엔자 백신 제조 방법은, 그 구성 성분으로서 특이적 병원체 무함유 수정 달걀에서의 인플루엔자 바이러스 증식을 위한 전형적인 방법을 이용한다. 달걀 내의 바이러스 생성시 몇몇 지점에서 가능한 미생물 오염이 일어날 수 있다. 예컨대, 바이러스 생성 흐름도 및 오염 가능 영역의 가능한 예를 나타내는 도 9 참조. 유감스럽게도, 달걀은 천연 플로라(flora)의 일부로서 그 껍질 밖에 일부 미생물을 가질 수 있다. 배아 발생을 위해 다습한 37℃에서 닭의 수정란을 항온처리하는데, 이는 여러 종류의 미생물 오염물에 대한 중요한 배양 조건을 구성한다. 또 다른 가능한 미생물 오염 시점은, 껍질에 천공을 내어 달걀에 접종할 때 일어난다. 바이러스 접종 전에 달걀에 알콜을 자주 스프레이한다고 해도, 미생물의 달걀로의 진입 기회는 여전히 있다.
달걀 내에 2~3일 동안 바이러스를 증식시킨 후에, 달걀 내에 바이러스를 함유하는 요막액을 수동으로 수거하기 위해 보통 달걀 껍질의 상부를 제거한다. 이 수거 시점이 미생물 오염이 일어날 수 있는 또 다른 시점이다. 유감스럽게도, 그러한 오염성 유해생물을 포함하는 달걀은 검출되지 않을 수 있으므로, MPA 테스트 불합격으로 인해 그 전체가 거부되는 것을 최소화하기 위해 여러 개의 병에 모아야 한다. 통상적으로 3종의 인플루엔자 균주를 백신 제조시 사용하기 때문에, 최종 부피에서 3종의 균주를 혼합해야 한다. 제조 과정의 MPA(미생물 순도 분석) 테스트를, 예컨대 미생물 무함유 생성물을 보장하기 위해서 블렌딩 및 충전에 사용하기 전에 바이러스 수거시(도 9 참조)에 실시한다.
항온처리 후에, "전형적인" 투시검란법을 사용하여, 자연적인 원인 또는 미생물 오염에 의해 죽은 것 같은 사란 및 무정란을 확인한다(즉, 사란은 바이러스 감염 및/또는 미생물 증식으로 인해 일어날 수 있으며, 양 경우에 사란의 검출 및 제거가 필요하다). 투시검란이란, 예컨대 발생 중인 배아를 육안으로 관찰할 수 있도록 암실에서 광원 앞에 달걀을 두는 과정을 포함한다. 사란에는 바이러스를 접종하지 않는다.
상기로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 인플루엔자 백신의 제조 도중 복수의 단계에서 미생물 오염 검출이 필요할 수 있다. 조류 및 환경 미생물을 제거하거나 감소시킬 필요성과, 환경 및 인간 미생물의 도입을 제거하거나 감소시킬 필요성이 존재한다. 따라서, 무정란, 사란 또는 미생물 오염란을 확인하기 위한 비침입성의 신속한 알 스크리닝 방법이 필요하다. 그러한 방법은 비침입성으로서 신속한 것이 바람직하다. 현행 미생물 오염 검출법은, 예컨대 간결한(compendial) 방법(MPA 및 유해생물 테스트)을 포함한다. 현행 방법은, 예컨대 달걀 사전/사후 접종 과정에서의 투시검란(candling)(통상적으로 약 500/시간/1인의 속도로 수동으로 실시됨); MAP 및 유해생물 테스트(통상적으로 수동으로 실시되고, MPA의 경우 약 14일, 유해생물 테스트의 경우 약 3일 소요되고, 바이러스 수거시 실시됨); 마이코플라즈마 테스트(통상적으로 수동으로 실시되고 약 28일이 소요되며, 바이러스 수거시 실시함); 및 마이코박테리아 테스트(통상적으로 수동으로 실시되고 약 56일이 소요되며, 바이러스 수거시 실시됨)를 포함한다. 이로부터, 전형적인 방법의 경우 소요되는 시간을 단축할 기회가 있음을 알 것이다. 신규한 방법은, 예컨대 수일에서 24시간 이하(바람직하게는 처리 과정 테스트의 경우 4시간 이하)로, 방출(Release) 테스트의 경우 수 주에서 수일로 소요 시간을 상당히 단축할 수 있어 바람직하다. 또 다른 장점은 중간/개입 대기 시간을 단축하여 생성물 방출/승인을 잠재적으로 촉진하고, 비용/노동력/간접비를 줄이는 것을 포함한다. 일반적으로, 미생물 오염을 검출하기 위해 선택되는 임의의 방법은, 에컨대 목적하는 용도, 결과를 얻는 데 소요되는 시간, 샘플 종류, 기기능 등과 같은 과학적 요건; FAD 지침(예, 유해생물은 FDA에 의해 요구되는 대로 전체 생유기체로 측정해야 함), 재검토, 기대/허용성과 같은 규제성 요건; 판매자 감사, 판매자 지원(기기 IOPQ, 즉 기기적으로 관찰되는 측면에서의 품질), 소프트웨어 인증 및 증거 조사와 같은 컴플라이언스 요건; 및 산업 경향, 실시 비용, 테스트당 단가 등과 같은 사업상의 요건을 고려해야 한다.
본 발명의 각종 구체예에서 제시되는 미생물 오염을 검출하기 위한 몇몇 유효한 대체법은 표 3에 제시되어 있다. 따라서, 예를 들어 투시검란법 대신에, 본 발명의 구체예는 사전/사후 바이러스 접종 열 이미징을 포함한다. 그러한 구체예는 항온처리된 알에서 방출되는 적외선을 적외선 카메라로 포착한다. 소프트웨어를 사용하여, 포착된 이미지를 알에 대한 온도 판독으로 전환한다. 카메라는 0.01℃ 이하의 온도 변화도 포착할 수 있다. 대사적으로 활성인 발생 중의 배아는 무정란 또는 죽은 배아보다 느린 속도로 열을 상실하므로, 온도차가 크다. 예를 들어, 투시검란법 대신에 사전/사후 바이러스 접종의 열 이미징을 설정하기 위해서, 에그 트레이를 열 이미지화할 수 있다(예컨대, 적외선 카메라를 에그 트레이(예, 하부가 개방된 셀로 된 트레이) 아래에 둘 수 있다). 그 다음 소프트웨어를 설정하여 각 알의 하부 온도(또는 측면, 상부 온도 등)를 측정할 수 있다. 각각의 개별 알의 온도 붕괴 속도를 평가하여, 그 시간을 확인하면 문제 알에서 최대 온도차가 나타난다. 그러한 열 이미징을 통해, 생 배아와 무정란 및 사란의 온도차를 확인할 수 있다. 도 10 및 도 11 참조.
본 명세서의 다른 구체예에서, 본 발명은 바이러스 수거시 유해생물 테스트에 대한 별법, 즉 MPN(최적확수; Most Probable Number)를 이용하는 데, 이 방법은 Bacteriological Analytical Manual Online , January 2001. Appendix 2 Most Probable Number from Serial Dilutions . FDA / CFSA - BAM에 기초한다. 예를 들어, MPN 테스트는 3 복제 96-웰 테스트를 포함할 수 있으며, 여기서 1:10 일련의 희석물(예, 1:10, 1:100, 1:1K, 1:10K, 1:100K, 및 1:1000K 희석물)을, 음성 대조군을 포함하는 96웰 미량역가 플레이트에서 3개의 다른 샘플에 대해 3중으로 실시할 수 있다. 초기에 모든 웰에 TBS를 희석제로서 그리고 농축 매체로서 첨가하여 미생물 배양을 지원한다. 육안으로 또는 600 nm에서 플레이트를 판독할 수 있다. MPN 유해생물 테스트는 오염 검출을 위한 막 여과 테스트와 비교하여 대단히 유용하다. 막 여과 테스트가 (3개 샘플에 대해) 15 TSA 플레이트, 다량의 샘플, 집중적인 시간 및 노동력을 필요로 하고, 자동화하기 곤란하며, 1:10 및 1:100 희석물의 샘플만 가능한 반면에, 96웰 MPN 테스트는 (3개 샘플에 대해) 1개의 96 웰 미량역가 플레이트(대조군 포함), 소량의 샘플, 몇몇 간단한 1회용 물품 및 시약을 필요로 하며, 1:10 내지 1:100,000의 희석 범위를 제공하며, 육안 판독하거나 또는 96웰 플레이트 판독기로 자동 판독할 수 있다. 통상적인 유해생물 테스트와 96웰 플레이트 MPN 테스트를 이용하여 70개의 샘플을 테스트한 결과, 서로 완전히 일치하는 것을 확인하였다. 목적하는 용도에 대해서, 96웰 플레이트 MPN은 유사한 결과를 제공하며, 처리량은 더 높다.
바이러스 수거를 위한 전형적인 간결한 마이코플라즈마 테스트에 대한 별법으로서, 본 발명은 일부 구체예에서 범용되는 상업적 표준의 신속한 핵산 증폭계 키트(예, PCR)의 사용을 포함한다. 본 발명의 간결한 방법은 모든 오염 균주(조류 M. 시노비아(M. synoviae) 및 M. 갈리셉티컴(M. gallisepticum)과, 인간 M. 뉴모니아(M. pneurnoniae), 즉 모든 조류 및 인간 마이코박테리아 균주 포함)를 (직간접적으로) 검출한다. 대안적인 PCR 검출법은, 마이코플라즈마 패널과, 가능하게는 결핵성 박테리아 및 비결핵성 마이크박테리아(예, 엠. 아브세서스(M. abscessus) 및 엠. 아비움(M. avium))와 같은 표적 유전자(예, 16s 및/또는 23s rRNA 상의 속 및/또는 종 특이적 서열)의 서열 상동성에 기초한 40종 이상을 특이적으로 검출하기 위한 조사자가 개발한 실시간 PCR용 프라이머/프로브 세트를 포함한다. 본 명세서의 일부 구체예는 결핵 박테리아 및 비결핵 마이코박테리아 등을 신속하게 검출하는 표준 핵산 증폭계 키트를 이용한다.
그룹 2
그룹 2에 속하는 본 발명의 측면은 표 1의 단계 4 내지 단계 6에 해당하는 것을 포함한다. 재배열체(즉 6:2 바이러스)의 정확한 재배열 및 클로닝 과정 후에, 재배열된 바이러스 입자를 배아 형성된 달걀에서 추가 정제하고 적당한 클론을 일정량 증식시켜(다시 달걀에서 증식시켜) 마스터 바이러스 균주(MVS) 또는 마스터 바이러스 시드를 형성하며, 이를 추가로 증식시켜 마스트 작용성 바이러스 균주(MWVS) 또는 제조자가 실시가능한 바이러스 시드를 형성한다. 달걀로부터 바이러스 입자의 정제 및 바이러스 입자의 양을 증가시키기 위해 더 많은 달걀에 접종하기 위한 정제된 바이러스의 사용에 관한 여러 측면이 당업자에게 알려져 있다. 그러한 다수의 기법은 현행 바이러스 입자 제조 방법에서는 통용되는 것이며, 40년 이상 동안 이용되어 왔다. 예컨대 Reimer, et al. Influenza virus purification with the zonal ultracentrifuge, Science 1966, 152:1379-81 참조. 예를 들어, 범용의 정제 프로토콜은, 예컨대 수크로즈 구배(예, 10~40% 수크로즈)에서의 초원심분리 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에 개시된 바와 같이, 다른 그룹에서 언급된 다른 절차, 예컨대 미생물 오염 예방 등은 임의로 그룹 2에서 제시한다.
그룹 3
그룹 3의 헤드부에 대응하는 본 발명의 측면은 표 1의 단계 7부터 단계 11을 포함한다. 이러한 단계는 주로 자충포장란(embryonated egg)을 컨디셔닝(즉, 바이러스 감염란의 부화와 관련된 특수한 처리 및 환경 조건)하는 것 및 난(egg)의 요수(allantoic fluid)로부터 인플루엔자 바이러스를 수확하고 청정화(clarification)하는 것을 다룬다.
예컨대, 본 발명은 백신에 사용되는 리어쏘티드(reassorted) 바이러스를 포함하는 난(egg)을 컨디셔닝, 세정(washing), 투시 검란(candling) 및 항온 처리(incubating)하는 단계; 이런 난을 접종(inoculation)하고 실링하는 단계; 이런 난을 투시 검란하는 단계; 난으로부터 바이러스 용액(즉, 요수)을 수확하는 단계; 및 이러한 바이러스 용액을 청정화하는 단계를 포함한다. 또한, 그룹 2에서의 단계들에서 적용되는 몇몇 기술들은 그룹 3의 단계들(예컨대, 투시 검란 등)에도 동일하게 적용됨을 유의하여야 한다. 그룹 3을 구성하는 발명의 몇 가지 측면은 본 발명의 기술 분야의 당업자에게 잘 알려진 것이다. 바이러스 제조에서 투시 검란하는 측면은, 난을 바이러스로 접종하는 것 및 이러한 난을 세정 및 항온 처리하는 것과 마찬가지로 난의 바이러스/백신 제조에서 잘 알려진 기술이다. 물론, 이러한 잘 알려진 기술들은 본 발명의 독특하고 혁신적인 측면과 함께 이용된다는 점을 이해하여야 할 것이다.
로킹( Rocking )
몇몇 형태의 인플루엔자 균주(예컨대, 특히 Victoria/504/2000과 같은 인플루엔자 B 균주)를 배양하는 데 있어서의 하나의 단점은 그 균주들이 난으로 될 때 다른 균주만큼 높은 역가(titer)를 생산하지 못한다는 점이다. 예를 들어, 제1 균주(예컨대, 인플루엔자 A 균주)는 108 또는 109 log의 역가(즉, 밀리역가 당 108 또는 109 바이러스 입자)를 생산하고, 제2 균주(예컨대, 인플루엔자 B 균주)는 107 log의 역가만을 생산한다면, 제2 균주는 즉, 더 많은 양의 난으로 성장함이 분명하고, 또는 제1 균주는 제2 균주가 제2 생산으로 성장할 때까지 유지되고 있음이 분명하다.
따라서, 본 발명의 일 측면은 안에서 바이러스 균주가 항온 처리(즉, 난들이 바이러스로 접종된 후)되는 난들을 록킹(rocking)하거나 교반하는 것이다. 이러한 로킹을 달성하기 위한 정확한 메카니즘에는 제한이 없다는 점을 유의하여야 한다. 예컨대, 난들은 선택적으로 쉐이킹 플랫폼이나 로킹 플랫폼(즉, 박테리아 배양 플라스크 또는 난 부화기(egg incubator)에서 이용되는 것과 같은) 상에서 로킹될 수 있다. 어떤 실시예에서는 난들은 분당 약 1 사이클 이하로부터 분당 약 2 사이클 이상까지 로킹될 수 있다. 이러한 맥락에서, "사이클"은 난이 전체의 이동 범위를 움직이는 것을 의미하도록 채택되어야 할 것이다. 또 다른 실시예에서 난들은 분당 약 0.5 사이클 이하로부터 분당 약 5 사이클 이상까지 로킹될 수 있다. 어떤 실시예에서는 분당 약 1 사이클로 로킹된다. 로킹 단계가 그룹 3의 항온 처리 단계(즉, 접종 후)에 추가된 경우, B-박테리아 인플루엔자 균주는 로킹되지 않은 대조군보다 0.4 log 만큼 증가하였다.
필터링 및 워밍( Filtering and Warming )
그룹 3에 해당되는 본 발명의 또 다른 측면은 바이러스 요수(vral allantoic fluid; VAF) 온도가 멸균 필터링(sterile filtration; 흔히, 0.2 ㎛ 필터) 동안의 바이러스 포텐시 손실(potency loss)에 미치는 효과에 관련된다. 본 발명의 다양한 실시예에서 바이러스 입자는 요수로부터 수확되고, 액을 워밍(warming)하는 단계와 그에 후속하는 액의 여과 단계를 포함하는 과정을 거치게 된다(표 1의 단계 10 및 단계 11 참조). 이러한 단계들은 몇 가지 이유로 바람직하다. 예컨대, 본 명세서에서 지적한 바와 같이, 백신 제조에서 요수 및 찌꺼기(debris)가 존재하게 되면, 알러지 반응(allergic reaction)을 유발할 수 있다. 또한, 더 중요하게는, 여과로 인해 용액으로부터 바이오버든(bioburden)이 제거된다. 바이오버든을 포함하는 모든 바이러스 수확 용액(virus harvest solution; VH 용액)은 제거되어야 한다. 따라서, 이러한 바이오버든 등의 존재를 제거 및/또는 감소시키기 위하여 생 약독화 바이러스(live-attenuated virus)를 여과 및 청정화하는 본 발명의 측면은 매우 바람직하다.
허용가능한 포텐시 손실을 얻기 위해 멸균-등급 필터(sterilizing-grade filter)를 통해 콜드-어댑티드(cold-adapted;vca) 바이러스 균주(즉, A/Aydney 05/97, H3N2 type)를 여과하는 데 필요한 바이러스 요수(VAF) 온도 및 워밍 시간의 효과가 본 명세서에 예시로서 사용된다. A/Sydneyl05/97을 허용 수준으로 여과하기 위한 조건이, 유사한 조건으로 여과되는 5개의 추가적인 콜드-어댑티드 인플루엔자 균주(즉, 2 xH1N1,1 x H3N2, 2 x B)의 결과와 함께 논의된다.
3개의 독립적인 어레이(TCIDO, neuraminidase, and hemagglutinin)가 여과 과정을 통해 바이러스 요수를 특성화하기 위해 사용된다. 데이터는 워밍 단계(예컨대, 여과 전 31±3℃의 온도에서 60분간 노출)를 여과 단계에 추가함으로써, A/Sydney/05/97을 위한 워밍 단계 없이 수행된 멸균-등급 여과(sterilizing-grade filtration)에 비하여 포텐시 손실을 허용 수준(0-0.3 log10 TCIso)으로 감소시킨다는 것을 보여준다. 다른 실시예에서, 워밍 온도는 적어도 30분의 시간 동안 선택적으로 28℃ 또는 28 내지 36℃이며, 또 다른 실시예에서는 워밍 시간이 60 내지 240분이다. 워밍 단계는 정말 긴 기간의 시간 동안 계속되지만, 더 긴 길이의 시간이 지나면, 높은 온도에서의 바이러스 안정도의 감소에 의한 포텐시 손실이 상당한 수준이 되며, 유해해진다. 테스트된 시간에서의 다른 테스트 균주에 대해서는 추가된 워밍 단계가 추가적인 포텐시 손실에 기여하지 못했는데, 이는 워밍 단계는 콜드-어댑티드 인플루엔자 바이러스(CAIV)에 대해서 선택가능한 단계라는 것을 나타낸다.
본 명세서에 기술된 바와 같이, 본 플루미스트(FluMistTM) 제조 과정은 마스터 바이러스 종자(master virus seed; MVS), 제조자의 워킹 바이러스 종자(manufacturer's working virus seeds; MWVS) 및 바이러스 수확물(virus harvests; VH)을 발생시키기 위해 자충포장 계란(embryonated chicken eggs)을 사용한다(표 1의 단계 6 참조). 그 종자 및 바이러스 수확물은 바이오버든(통상 세균 오염(bacterial contamination))을 포함하는데, 이로 인해 백신 제조 과정에서 종자나 벌크 바이러스 제품 다수가 제거되게 된다. 요수 함유 바이러스용 여과를 평가하기 위한 기존의 연구를 통해, 바이오버든은 과정 중 여과 단계를 도입함으로써 감소될 수 있다는 지적이 있었다. 그러나, 기존의 연구를 기초로 한 이러한 여과는 특정 바이러스 균주(예컨대, A/Sydney/05/97)에 대해서는 문제가 있다. 이러한 연구를 토대로, 관련된 다양한 충전, 분재 및 샘플링 라인과 함께 예비 필터 및 0.2 밀리미터 멸균 등급 필터에 연결된 멸균 플라스틱 미디어 백을 구비하는 여과 장비를 위한 구성상 제안이 있다(하기 참조). 물론, 사용된 제품 형태 및 크기 등에 대한 특정의 목록 또는 설명은 특별히 언급하지 않는 한 본 발명을 한정하는 것으로 간주되지 않을 것이라는 것을 이해할 것이다.
이러한 연구에서 보인 바와 같이, 대다수의 테스트된 콜드-어댑티드(ca) 바이러스 균주는 Sartorius Sartoclean CA 예비 필터와 그에 후속하는 멸균 등급 필터인 Sartorius Sartopore 2를 통과함으로써 포텐시 손실을 최소화한 채 여과될 수 있다. 그러나, A/Sydney/05/97에 대한 다른 연구 결과는 포텐시 손실이 0.7 내지 1.4 log10TCID50/mL이다. 추가적인 연구를 통해 이러한 포텐시 손실은 Sartorius Sartopore 2 멸균 등급 필터 사이에서 발생한 것임이 나타났다. 다른 브랜드 및/또는 형태의 필터가 이러한 단계에 선택적으로 사용될 수 있고, 특정의 필터 명칭/형태이 언급이 제한적으로 해석되어서는 안될 것이라는 것을 유의하여야 한다.
이하에 보여지는 제1 실험 세트의 목적은 VAF 온도가 여과 동안의 바이러스 포텐시 손실에 미치는 영향을 테스트하기 위한 것이었다. 연구의 제2 부분은 여과 이전에 VAF의 적절한 워밍 시간을 규정하기 위해 설계된 것이었다. 콜드-어댑티드(ca) A/Sydney/05/97 바이러스 균주(H3N2 type)는 웜-업 조건을 결정하기 위해서 사용되는데, 그 이유는 전술한 바와 같이, 이 균주의 여과 도중에 큰 포텐시 손실이 관찰되기 때문이다.
본 실험의 제3 부분은 바이러스 요수(VAF)의 워밍이 몇몇 다른 단가(monovalent) 바이러스 균주의 여과에 의해 야기된 포텐시 손실에 미치는 영향을 평가하였다. 5개의 CAIV 균주들(2 x H1N1, 1 x H3N2 및 2 x B)이 본 실험에 사용되었다. 모든 실험들은 테스트 샘플을 제거하기 전에, 1.0 내지 3.0L의 수크로스 포스페이트 글루타메이트(sucrose phosphate glutamate; SPG)로 안정화된 VAF 및 대략적으로 스케일된 즉, 약 1:30 내지 1:10의 제안된 VH 프로세스 비율의 필터를 사용하여 CAIV 종자-비율(MVS and MWVS)로 수행된다. 전형적인 프로세스 비율은 여과 장치당 약 33L의 안정화된 VH 까지이다. 이러한 용량은 전형적으로 여과 장치를 위해 선택된 50L 백과 함께 잘 수행되고, 스탠다드 10 필터 캡슐을 사용하여 여과될 수 있는 적당한 안전 마진(safety margin)을 가진다. 그러나, 이러한 용량은 보통 너무 커서, 발생/예시 작업(evelopment/exemplary work)으로는 너무 크다. 따라서 1/10 수준의 여과가 수행된다(즉, 약 3L).
이러한 온도/여과 단계를 위한 바이러스 증식은, 기술 분야에서 일반적으로 알려진 방법 및/또는 표 4에 요약된 콜드-어댑티드(ca) 인플루엔자 균주를 사용하는 본 발명의 다른 측면들(상기 및 하기 참조)에 따라 수행될 수 있다.
실험의 모든 단계로부터 얻어진 샘플들은 포텐시 메뉴얼 분석(TCIDso 측정의 다른 측면을 위해서는 하기 참조) 상의 조직 배양 감염량(Tissue Culture Infectious Dose; TCIDso)을 측정함으로써 분석되었다. 해리능(Neuraminidase activity; NA) 및 혈구 응집 활성(Hemagglutinin activity; HA)도 또한 측정되었다.
여과 전 VAF 온도가, 포텐시(TCIDsImL), 해리능(NA) 및 혈구 응집 활성도(HA)의 감소에 미치는 영향을 평가하기 위해, Sartorius Sartoclean CA/Sartorius Sartopore 2 필터 조합을 통한 일련의 여과가 수행되었다.
바이러스 수확 중, VAF는 1L의 PETG 병에 모여졌다. 일단 비안정화 VAF의 요구량이 수집되고 모여지면, 여과가 수행되었다. 이 단계에서의 비안정화 VAF의 온도(시작 온도)는 15±3℃였다. 총 워밍 시간은 VAF가 33±1℃의 수조 안에 있었던 시간으로 정의되었는데, 이 총 워밍 시간은 웜-업 시간(15±3℃ 에서 28±3℃까지) 및 웜-홀드 시간(설정 점, 예컨대 28℃ 이상으로 있는 시간)으로 구성된다.
파트 1 VAF 온도 효과 연구(하기 참조)가 콜드-어댑티드(ca) A/Sydney/05/97 바이러스 균주(H3N2 type)애 대해 수행되었다. 본 예시의 파트 2는 선택적인 웜-홀드 시간("설정 온도에 있는 시간")의 결정에 촛점이 맞추어졌다. 파트 3에서는 이전에 결정된 웜-홀드 시간이 5개의 균주(표 5)에 대해 미치는 영향이 테스트되었다. 모든 파트의 예에 있어서, 1.0 내지 3.0 L의 수크로스 포스페이트 글루타메이트(SPG) 안정화 VAF가, 전형적인 바이러스 종자 비율 및 약 1:30 내지 1:10의 제안된 mVH 프로세스 비율로 장치를 통해 여과되었다.
전형적인 본 제조 과정에서, 수확 후에, VH는 추가적인 운반을 위해 원심분리되고, 안정화되며, 냉동된다. 본 예시에서, 비안정화 풀(pool)로 부터 수집된 VAF 샘플은 본 제조 과정과 유사하게 원심분리되고 SPG로 안정화되는데, 이는 본 예시의 모든 부분에서 여과된 VAF를 위한 대조의 기능을 수행한다.
파트 1: 여과도중 A/ Svdney /05/97 바이러스의 역가 변화에 미치는 온도의 효과
포텐시 손실에 미치는 온도의 효과를 결정하기 위해, 다양한 온도에서의 2개 세트의 여과 실험들이 수행되었다. 각 세트는 동일한 배치의 난으로부터 수집된 VAF로 동일한 날에 수행된 3개의 대응 실험들로 구성된다. 이 실험에서, 수확 후에, VAF는 SPG로 안정화되었고, 3개의 풀로 나뉘었으며, 여과 전에 5±3℃(냉장고), 20±3℃(벤치 탑) 및 31±3℃(수조)에서 60분간 노출되었다. 이 시간 동안, 병 내부의 VAF는 10분마다 뒤집음으로써 혼합되었다. 온도 처리 후, Sartoclean CA 및 Sartopore 2 필터를 통해 여과되었다. 제어 실험에서, VAF는 원심 분리되고, 안정화되었다. 다른 조건하에서의 TCID50 여과 결과는 각각 다른 결과 및 대조군과 비교되었다.
VAF 온도가 포텐시 손실에 미치는 영향을 결정하기 위해서, VAF는 여과 전 각각 5±3℃, 20±3℃,및 31±3℃에서 60분간 노출되었다. 각기 다른 온도에서 원심 분리, 안정화된 여과 후 물질들 간의 포텐시 변화 및 해리능과 혈구 응집 활성도의 차가 표 5-10에 요약되어 있다. 보여지는 바와 같이, 저온(5±3℃) 및 상온(20±3℃)에서의 VAF 여과 결과, 0.7 내지 1.0 log10TCID50mL(도 5 및 도 8 참조)의 포텐시 손실이 나타났다. 그러나, VAF가 60분간(30분의 웜-업 시간 + 설정점 온도에서의 30분의 웜-홀드 시간) 31±3℃로 웜업되었을 때, 여과 후의 역가 감소(원심분리 안정화 VAF와 비교하여)없었다(표 5 및 표 8 참조). 또한, 여과 후의 해리능 및 혈구 응집 활성도 수준은 VAF가 31±3℃로 웜업된 후 수행된 여과에서 저온 및 상온 여광서 관찰된 수준에 비교할 때 더 높았다(표 6 및 표 9 참조). 또한 웜업 단계의 추가는 혈구 응집 활성도 감소치를 줄어들게 하였다.
파트 2: A/ Sydney /05/97의 적합한 포텐시 손실을 위해 요구되는 워밍 시간의 결정
필요한 워밍 시간을 결정하기 위하여, 수조에서 여과하기 전 31±3℃에서 워밍된 VAF에 대해 일련의 실험들이 수행되었다. 각 세트는 동일한 배치의 난(egg)으로부터 수집된 VAF로 동일한 날에 수행된 3개의 대응 실험들로 구성된다. 제어 실험에서, VAF는 SPG로 안정화된 후 즉시 여과되었다. 모든 실험에서, 워밍 시간은 VAF가 수조 내(즉, 31±3℃)에 있는 총 시간(웜-업 시간 + 웜-홀드 시간)으로 정의되었다. 병 내부의 VAF는 10분마다 뒤집음으로써 혼합되었다. 온도 처리 후, Sartoclean CA 및 Sartopore 2 필터를 통해 여과되었다. 본 제조 과정을 나타내는 제어 실험에서, VAF는 원심 분리되고, 안정화되었다. 다른 조건하에서의 TCID50 여과 결과는 각각 다른 결과 및 대조군과 비교되었다.
여과 전 ca A/Sydney/05/97를 여과하기 위해, 일련의 실험들이 수행되는데, 여기서 VAF는, 하나의 실험 세트에서는 여과 전 31±3℃로 30, 90, 180분간워밍되였고, 다른 한 세트의 실험에서는 여과 전 31±3℃로 30, 60, 90분간 워밍되었다. 대조 실험에서는, VAF는 SPG로 안정화된 후 즉시 워밍 없이 여과되었다. 여과된 VAF 와 대조군 사이의 바이러스 포텐시, 해리능 및 혈장 응고치는 표 11 내지 표 16에 요약되어 있다
데이터는 VAF를 31±3℃에 노출하면, 여과 후 바이러스 포텐시 손실이 줄어들고, 해리능 및 혈장 응고 활성도가 부분적으로 회복됨을 나타낸다(표 11 내지 표13 참조). 실험 시작시(수확 후, 워밍 전)의 비안정화 VAF 온도는 15±2℃였다. 1 내지 1.5L의 VAF가 31±3℃로 되는데 필요한 웜-업 시간은 약 20 내지 30분이다. 따라서 30분의 VAF 웜-업 시간은 31±3℃에서의 VAF 웜-홀드 시간을 0 내지 10분으로 되도록 한다.
여과 포텐시 손실을 최소화하기 위해 요구되는 최소 워밍 시간은 제2 실험 시리즈에서 결정되었다(표 14 내지 표 16의 제1 세트 및 표 17 내지 표 19의 제2 세트 참조). 여과 후의 포텐시, HA 및 NA 감소치는 0분과 30분의 워밍 시간 실험에서 관찰되었다. 60분 및 90분의 총 워밍 시간(31±3℃에서 30-40분 및 60-70분의 웜-홀드 시간) 실험에서, 여과 후 바이러스 포텐시, HA 및 NA 수준은 대조군(원심분리 및 안정화된 VAF)과 유사하다(표 14 내지 표 19 참조).
파트 3: 기타 균주에 대한 워밍 효과
웜업 단계가 A/Sydney/05/97 이외의 인플루엔자 바이러스 균주들에 미치는 영향을 평가하기 위해, A/Sydney/05/97 이외의 5개의 균주, 즉 2 x H1N1,1 x H3N2, and 2 x B에 대해서 일련의 실험들이 수행되었다. 각 균주는 2회씩 테스트되었다. VAF는 여과 전 60분간(30분의 웜-업 시간 + 설정점 온도에서의 30분의 웜-홀드 시간) 31±3℃에서 워밍되었다. 온도 처리 후, 그것은 Sartoclean CA 및 Sartopore 2 필터를 통해 여과되었다. 대조 실험에서, VAF는 SPG로 상온에서 안정화된 후 즉시 여과되었다. 다른 조건하에서의 TCID50 여과 결과는 각각 다른 결과 및 대조군과 비교되었다.
테스트된 추가적인 5개의 콜드-어댑티드 인플루엔자 바이러스 균주들에 대하여, 31±3℃(설정 온도에서 30-40분의 웜-홀드 시간)에서의 짧은 노출(60분의 총 워밍 시간)은 A/Sydney/05/97 및 B/Victoria/504/2000에 대해서는 온도 처리를 하지 않은 실험과 비교하여 여과 후 포텐시 손실이 줄어드는 데에 기여했고, 다른 균주들에 대해서는 포텐시에 영향을 주지 않았다. 이러한 실험에서의 포센시(TCmso/mL), 해리능 및 혈장 응고 수준은 표 20 내지 표 25에 요약되어 있다.
표에서 볼 수 있는 바와 같이, Sartoclean CA 예비 필터 및 Sartopore 2 멸균 수준 필터로 여과하기 전에 안정화된 바이러스 수확물을 31±3℃ 또는 36℃로 워밍(병 내부에서 1 - 1.5L의 VAF에 대한 60 - 90분의 웜-홀드 시간)하는 것을 포함하는 본 발명의 측면은 A/Sydney/05/97에 대해 바이러스 포텐시의 적합한 감소(0-0.3 log10 TCID50/ml)를 가져다준다.
이러한 테이블에서 보여지는 바와 같이, 테스트된 6개의 모든 콜드-어댑티드 인플루엔자 바이러스 균주들에 대해, 31±3℃(설정 온도에서 30-40분의 웜-홀드 시간)에서의 짧은 노출(60분의 총 워밍 시간)은 여과 동안, 포텐시 손실치가 줄어들게 하거나, 또는 추가적인 포텐시 손실에 기여하지 않았다. 모든 실험에서, 여과 후 역가의 감소는 0.3 log10 TCID50/ml보다 크지 않았다. 워밍 및 여과된 VAF의 바이러스 표면 단백질(뉴라미니다제; neuraminidase 및 헤마글루티닌;hemagglutintin)의 활성도 감소치가 줄어든 것은 TCID50 분석에 의해 보여지는 줄어든 포텐시 손실 데이털를 지지한다.
따라서 상기 데이터는 본 발명의 CAIV (MVS, MWVS 또는 VH)를 여과하기 위해 요구되는 워밍 시간을 포함하는 본 발명의 몇 실시예들은 60분의 워밍 시간에 대해(VAF를 31±3℃로 웜업하고 적어도 30분간 웜-홀드(설정점 온도에서)함)의 적합한 포텐시 손실을 가져온다는 것을 증명한다. 이렇게 워밍이 허용되는 것은, 특히 다른 여과 시도에 비추어 볼 때, 신규하고 기대하지 않은 결과이다(상기 참조). 다시 말하지만, 이해하는 바와 같이, 가열/여과 단계들을 포함하는 본 발명의 실시예들은 상기의 예시에 한정되지 않는다. 다시 말하여, 예컨대, 본 발명에서 벗어나지 않은 채, 여타의 필터 및 필터 유형 등이 사용될 수 있다.
그룹 4
본 발명의 측면의 그룹 4는, 예컨대 표 1의 단계 12 내지 단계 15를 포함한다. 이러한 단계들은 주로 안정화(예컨대, 구성 요소의 추가, 버퍼/NAF 비율 등)및 용액을 함유하는 바이러스의 포텐시/멸균도 분석에 관한 것이다. 몇몇 실시예에서, 생 바이러스를 함유하는 최종 바이러스 용액/백신은, 인플루엔자 접종 기간(예컨대, 북반구에서 전형적으로 9월부터 3월까지)에, "시중에서(예컨대, 4℃ 에서 냉장되어 판매 및 상용화되는 등)", 보관하기에 충분한 시간 동안 4℃에서 액체 상태로 안정상태에 있다. 따라서 이러한 바이러스/백신 조성물은 보관 기간 동안 포텐시를 유지하거나, 적당한 비율로 감소하게 된다. 예컨대, 만약 0.3 log 포텐시 손실이 수용될 수 있고 보관 기간이 9개월이면, 0.05 log/월의 포텐시 손실율이 받아들여질 수 있을 것이다. 또한, FFA를 사용하면 가능한 감소치의 측면에서 더 큰 여지가 생긴다. 예컨대, 0.75 log 포텐시 손실까지가 수용된다면, 냉장 온도(예컨대 4℃)에서 연속적으로 보관된 재료의 안정성을 보장하기 위해서는 0.09 log/월 이하의 포텐시 손실율이면 충분할 것이다. 다른 실시예에서, 이러한 용액/백신은 약 2℃ 내지 약 8℃에서 액체 상태로 안정상태에 있다. 또 다른 실시예에서, 이러한 용액/백신은 상온에서 액체 상태로 안정상태에 있다.
본 명세서에서의 특정의 구체예는 NAF 희석으로 인한 면역원성의 감소를 나타내지 않는다 (또는 약간의 감소를 나타낸다). (이하 참조).
바이러스 수거물의 농축/ 투석여과
특정의 구체예에서, 바이러스 수거물은 적절한 컬럼을 사용하여 임의로 농축시킨다. 인플루엔자 바이러스 용액은 상당한 바이러스 역가/활성을 상실하지 않으면서 농축될 수 있다. 이러한 역가 손실이 없는 농축은 상당히 놀라운 결과를 산출하는데, 이는 종래의 문헌등에서는 농축이 바이러스 활성의 손실을 나타내기 때문이다. 바이러스 농축은 바이러스 입자를 개선시키고 기타의 단백질 RNA, 등을 제거하기 위하여 표 1에 예시된 바와 같이 정제/생성 과정에서 다수의 지점에서 수행될 수 있다. 예를 들면, 농축은 역가 분석 이전에, 또는 역가 분석 이후조차 수행할 수 있으나, 다수의 구체예에서는 그룹 4에서 분류된 단계내에서 또는 단계중에서 수행된다. 바이러스 입자의 농축은 정제, 백신 생성에 대하여 그리고, 분석 특성화에 대하여 유용할 수 있다. 문헌 [Methods and Techniques in Virology, Pierre Payment and Michel Trudel, Marcel Dekker, Inc., (1993)]. 특정의 VAF 샘플중의 소량의 바이러스로 인하여, 바이러스 입자의 직접 분석은 분석 초원심분리 (AUC), 디스크 원심분리, 매트릭스 보조 레이저 이탈 이온화 (MALDI) 및 입자 계수와 같은 특정의 분석 기법은 제외하였다.
난 (egg) NAF 등으로부터의 종래의 통상의 바이러스 농축은 구배 정제 원심분리에 의하여 수행되었다. 문헌 [Concentration and Purification of Influenza Virus from Allantoic Fluid, Arora et al., Analytical Biochemistry, 144 : 189-192 (1985)]. 그러나, 본 명세서에서 구체예는 크기 배제 컬럼을 사용한다. 농축은 바이러스가 산란 능력, 세포 배양 생성 (예, Vero 세포), 플라스미드 구조 생성 등에 의하여 생성되느냐에 사용할 수 있다. 또한, 농축 단계는 다수의 상이한 바이러스 및/또는 바이러스 균주 (예, 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B 균주 모두는 이러한 작용을 수행할 수 있음) 뿐 아니라, 하나의 균주의 상이한 로트 사이에서 생성물의 성질을 확인하기 위하여 수행될 수 있다. 또한, 크기 배제 컬럼 농축은 수거물중에서, 예를 들면 난 중에서 바이러스 입자의 함량에 대한 추적으로서 사용할 수 있다. 그리하여, 예를 들면 피이크 면적 (즉, 컬럼으로부터 용출된 바이러스의)은 이러한 용액의 TCID50 측정 대신에 또는 측정 이외에 사용할 수 있다. 이러한 추적이 난에서 생성된 바이러스에 대하여 특히 유용하다. 또한, 농축 및 정제된 바이러스 물질은 임의로 추가의 연구를 위한 순수한 HA, NA 및 기타의 바이러스 성분을 생성하기 위한 출발 물질이 될 수 있다. 또한, SEC 정제된 바이러스는 바이러스 구조 및 숙주 세포와의 결합 메카니즘에 대한 우수한 고찰을 제공할 수 있다. VAF (바이러스/바이러스 요막액) 물질의 대부분에서 바이러스 입자가 UV의 검출 한계치 이하이기 때문에, 바이러스 입자의 농축은 추가의 특성화를 위하여서는 상당히 도움이 된다.
바이러스 수거물의 농축에서, 크기 배제 컬럼, 예를 들면 가압하의 중공 섬유 필터를 갖는 MidGee 또는 QuixStand (애머샴)는 불순물 및/또는 원치 않는 완충액/유체를 제거하는데 사용할 수 있다. 그리하여 농축된 바이러스는 특정의 완충액/안정화제중에 더욱 용이하게 현탁 또는 저장된다. 이하 참조.
바이러스 수거물 샘플의 농축을 예시하기 위하여, A/New Caledonia의 인플루엔자 수거물을 농축시키고, 이를 교차 흐름 여과로부터 분석한다. 물론, 이러한 분야의 기법은 바이러스의 특정의 균주/유형에 한정되는 것은 아니다. 이러한 농축은 바이러스 입자를 농축시키고, 대부분의 불순물을 제거하고, 바이러스 감염력을 보유한다. 예시한 바와 같이 바이러스 감염력은 CELISA (TCID50)에 의하여 체크한다. HA 분석에 의한 적혈구응집, 뉴라미니다제 활성, SEC 분석, RHPLC에 의한 NAF 및 RTPCR에 의한 RNA를 수행하였다.
하기의 실시예에서의 바이러스 농축은 애머샴의 Cross Flow Filtration Unit MidGee을 사용하여 달성하였다. MidGee는 2~4 시간 동안 100 또는 200 ㎖를 10 ㎖로 농축시킬 수 있다. 유사하게, QuixStand는 4~6 시간 동안 바이러스 입자를 2 ℓ에서 100 ㎖로 농축시키는데 사용할 수 있다. 바이러스의 농축은 바이러스 입자 계수를 향상시킬 뿐 아니라, 대부분의 난단백질, RNA 등의 기타의 불순물 및, 요산과 같은 소분자를 제거한다.
하기의 실시예에서 사용한 바이러스는 A/New Caledonia/20/99이다. NAF는 저온 적응된 인플루엔자 바이러스를 포함한다. 닭 혈액은 미국 콜로라도주 덴버에 소재하는 콜로라도 세럼 컴파니로부터 입수하였다. 농축에 사용되는 장치는 Amersham Biosciences (A/G 테크놀로지 코포레이션)로서, Peristaltic Pump (Watson Marlowe)를 구비한 MidJet 시스템이다. 농축에 사용된 컬럼은 Amersham Biosciences (A/G 테크놀로지 코포레이션)로서, 공칭 분획 분자량이 750,000인 MidGee Hoop Cross Flow Filter이다. 그러나, 장치의 특정 모델, 제조업자 등의 사용 또는 인용은 본 발명을 제한하는 것으로 간주하여서는 아니된다. 본 실시예에서 세정에 사용한 완충액은 1X-SPG이다.
SEC의 경우, 사용한 장치는 휴렛 팩커드 HP 1100 HPLC 시스템이며, 컬럼은 크기가 7.8×300 ㎜인 워터스에서 입수한 Ultrahydrogel 1000이다. SEC를 구비한 완충액은 하이클론 솔벤트에서 입수한 둘베코 인산염 완충 염수이다. SEC의 경우, 이러한 방법은 210 및 280 ㎚에서 모니터한 0.5 ㎖/분의 유속에서의 등용매 조건을 포함한다. RHPLC의 경우, 장치는 워터스에서 입수하였으며, 컬럼은 YMC C4 (역상), 2.1×250 ㎜, 5 ㎛, 300 A이다. RHPLC를 위한 방법은 이동상 - A: 물중의 0.1% TFA, B: 95% CAN 0.09% TFA; 용출 조건 - 가변 구배, 13~100% B; 유속: 0.2 ㎖/분; 컬럼 온도 -45℃; 주입 용적 - 50 ㎕; 및 검출 - 214 ㎚이다.
도 12, 단계 1에서 도시한 바와 같이, 150 ㎖의 A/New Caledonia/20/99는 저온실에서 MidJet 장치에 의하여 농축시켰다. 주입과 배출간의 압력은 5~10 psi를 유지하였다. 교차 필터에 2 시간 동안 순환시킨 후, 150 ㎖의 1X 샘플을 15 ㎖의 10X 농축된 샘플 (단계 2)로 농축시켰다. 투과물을 별도로 수집하고, 이를 분석을 위하여 보관하였다. 분석 특성화를 위하여, 4 ㎖의 10X 샘플을 제거하였다 (단계 3). 10X 샘플의 나머지 11 ㎖를 1X-SPG로 110 ㎖로 희석하고, 투과물로서 1X-SPG를 제거하여 11 ㎖로 더 농축시켰다. 투과물은 보유물(retentat)로부터의 대부분의 불순물을 지닌다. 이 단계를 단계 4 및 단계 5에서 나타낸 바와 같이 1X-SPG를 사용하여 5회 반복하였다. 세정한 투과물을 추가의 분석을 위하여 저장하였다. 1차 및 2차 세정물은 황색으로 변색되었다. 이는 난단백질 및 기타의 소분자 불순물의 제거로 인한 것으로 판단된다. 투과물중의 황색은 3차 및 4차 세정후에는 소실된다. 5차 세정후, 샘플을 1X-SPG를 사용하여 110 ㎖로 희석하여 농축물을 다시 1X로 만들었다. 단계 6에서, 10 ㎖의 1X-W를 분석을 위하여 두었다. 1X-W의 나머지 100 ㎖를 10X-W로 더 농축시켰다 (단계 7). 이와 같이 농축된 샘플을 추가의 분석을 위하여 1 ㎖ 분량으로 분액화하였다.
모든 샘플을 SEC 크로마토그래피로 분석하였다. Ultrahydrogel 100 컬럼을 용매로서 DPBS를 사용한 분석에 사용하였다. 데이타를 220, 260 및 280 ㎚에서 수집하기는 하였으나, 논의를 위하여, 22 ㎚ 피이크 부위를 사용하여 비교를 수행하였다. 크로마토그래피의 피이크를 3 가지의 군으로 분류하였으며, 바이러스군 (약 10.6 분의 보유 시간), 불순물군-1 (18~21 분의 보유 시간) 및 불순물군-2 (21~27 분의 보유 시간)이다. 3 종의 NAF 단백질, 난알부민, 콘알부민 및 난점질은 18~21 분의 보유 시간에서 용출시켰다. 도 13 참조. 리소자임은 약 27.0 분에서 용출하였다. 불순물군-2는 소분자, 예컨대 요산 및 기타의 불특정 물질로 이루어진 것으로 판단된다. 모든 세정물은 바이러스 분석과 동일한 조건하에서 분석 SEC 크로마토그래피로 체크하였다. CELISA, HA 분석, NA 분석 및 RTPCR은 상이한 군으로 수행하였다.
SEC 분석 및 CELISA
니트 샘플, 1X는 피이크 부위 1,221로 11.1 분에서 바이러스 피이크를 나타낸다. 도 14 참조. 그러나, 농축된 10X 샘플은 피이크 부위 11,192를 나타낸다. 도 15 참조, 피이크에서의 증분은 1X에 비하여 약 9.16 배이었다. 표 26, 11,192/1221 참조. 이는 피이크 부위와 투입한 바이러스 샘플의 함량간의 선형 관계를 예시하는 상기의 실험에 기초한 것이다. 농축시, 임의의 세척물을 사용하지 않고, 특정의 불순물을 제거하였으나, 그리 중요하지는 않다. 표 26, 도 16a-b 참조. 불순물군-1 및 불순물군-2는 1X~10X의 피이크 크기에서 증분을 나타낸다 (표 26). 따라서, TCID50은 log 9.1에서 log 10.0으로 증가하였다. (표 27). 이러한 단계중에, 95.9%의 감염성이 보유되었다. 이러한 데이타는 1X 샘플을 10X 샘플로의 농축이 감염성을 상당히 보유시킨다는 것을 나타낸다.
1X-SPG를 사용하여 5차 세척후, 샘플 1X-W의 바이러스 피이크 부위는 세척전에 1221에 비하여 1005로 보유되었다. (표 26). 1X 및 1X-W 사이의 피이크 부위에 의한 회수율은 약 82% (1005/1221)이었다. 1X 및 1X-W 크로마토그래피를 비교하면 (도 17 참조), 불순물군-1 및 불순물군-2이 크게 감소하였다는 것을 알 수 있다. (표 26). 1X-W는 TCID50이 약간 감소하였다. (표 27, 1X : 9.1, 1X-W: log 8.9). 감염성의 회복은 1X 및 1X-W의 사이에서 약 98.99 %이었다. (log 8.9/log 9.1). 세정 단계는 NAF 단백질 및 기타의 성분의 제거에 의하여 바이러스 물질의 성질을 개선시킨다.
유사하게, 10X 및 10X-W를 비교함으로써, 불순물군-1 및 불순물군-2이 상당한 정도로 제거되었다. (표 26, 도 18). 5회의 세정에 의하여, 10X: 11,192의 바이러스 피이크 부위는 10X-W: 10,282로 감소하였다 (표 26, 91.86%의 피이크 부위). TCID50은 log 10.0 (10X)에서 log 9.9 (10X-W)로 변화되어 회수율은 99.56%이었다. (표 27).
1X-W 및 10X-W 크로마토그래피를 비교함으로써 피이크 부위는 10X 증가하였다. 표 26 참조. 1X-W: 피이크 부위: 1005 및 10X-W: 10,282. TCID50값은 또한 1 log 증가하였다 (표 27, 1X-W: log 8.9 및 10X-W: log 9.9). 10X-W가 1 단계에서 1X-W로 농축되었기 때문에, 활성 또는 피이크 부위에서의 손실은 관찰되지 않다. (1OX-W: 피이크 부위 10282 및 1X-W 피이크 부위 1005).
투과물은 피이크 부위 25를 갖는 10.4 분에서의 바이러스 피이크를 나타낸다. 이는 1X 샘플에서의 바이러스와 함께 용출되는 소량의 바이러스 입자 또는 특정의 기타의 단백질의 손실로 인한 것일 수 있다. 대부분의 불순물은 불순물군-1 및 불순물군-2에서 용출되었다. 표 26 참조. CELISA 값은 검출 한계치 이하인 것으로 나타났다. 이는 농축 과정중에 막을 통하여 용출되는 바이러스 입자가 그리 많지 않다는 것을 나타낸다.
5종의 세정물은 대부분의 불순물군-1 및 불순물군-2을 제거하여 바이러스의 성질을 개선시킨다. 이는 표 26 및 도 19에서 예시한다. 불순물군-1 및 불순물군-2은 2차 세정후 대부분 제거되었다. 5차 세정후 곡선은 평탄부에 도달하였다. 5차 세정후조차도 샘플 1X-W 및 10X-W는 아주 소량의 불순물군-1 및 불순물군-2를 나타낸다. 도 20 참조. 19.208 분에서의 피이크의 실체는 10X-W 샘플로부터 분리된 난알부민인 것으로 확인되었다. 또한, 이러한 결과를 SDS-PAGE로 확인하였다.
HA 분석
샘플 1X 및 1X-W은 HAU 1024를 나타낸다. 도 21 참조. 농축되었으나, 세정하지는 않은 10X는 HAU 8192에서 나타났다. 그러나, 10X-W는 HAU 2 및 4에서 가짜 음성을 나타내었다. 이는 닭 RBC에 비하여 다량의 바이러스로 인할 수 있다. 다량의 뉴라미니다아제는 적혈구응집 과정을 역전시킨다. 문헌 [Virus cultivation, Detection, and Genetics, S. J. Flint, L. W. Enquist, R. M. Krug, V. R. Racaniello 및 A. M. Skalka, "Principles of Virology, "ASM Press, Washington, p 34, (2000)]. 투과물에서의 HAU의 부재는 단계 1에서 용출되는 바이러스가 그리 많지 않다는 것을 나타낸다. 도 12 참조.
NA 분석
뉴라미니다아제 분석은 10X를 1X로 희석하는 것이 1X에 비하여 활성이 다소 감소하였다는 것을 예시한다. 도 22 참조. 이는 VAF 물질로부터의 유리 NA 단백질의 손실로 인한 것으로 생각된다. 이는 투과물중의 소량의 NA에 의하여 뒷받침된다. 샘플 1X-W 및 10X-W를 다시 1X-W로 희석하는 것은 동일한 수준에서의 활성을 보유한다. 이는 샘플 10X-W를 1X-W로부터 직접 농축시켰기 때문이다. 모든 세정물은 검출 레벨 이하의 활성을 갖는다.
RHPLC
난단백질 분석은 RHPLC에 의하여 상기에서 최적화되었으며, 그리하여 실시예중의 모든 물질은 동일한 조건, 즉 0.1% TFA/아세토니트릴 구배를 갖는 C4 컬럼에서 분석하고, 214 ㎚에서 모니터하였다. 난점질, 리소자임, 콘알부민 및 난알부민의 용출 패턴은 도 23에 도시하였다. 임의의 세정전에 10-X 샘플은 모든 난단백질을 나타낸다. 이는 대조용 샘플의 보유 시간과도 부합된다. 또한, 10X는 U1, U2 및 U3으로 표지된 미확인 바이러스 단백질 피이크를 나타낸다. 완전 세정한 샘플 10X-W 및 1X-W은 바이러스 단백질 U1, U2 및 U3을 보유한다. 10X 및 10X-W 샘플은 동량의 U1, U2 및 U3 단백질을 보유한다. 이러한 단백질의 비율이 동일하기 때문에, 단백질은 아세토니트릴에 노출중에 바이러스 입자로부터 생성될 수 있다. 그러나, 난점질 리소자임 및 콘알부민은 1X-SPG를 사용한 5회 세정에 의하여 10X로부터 완전 제거되었다. 특히, 대부분의 뚜렷한 단백질 피이크는 난알부민이며, 이는 10X-W 및 1X-W 샘플을 사용하여 용출된다. 10X-W 및 1X-W가 6 및 5회의 세정을 하기는 하였으나, 난알부민은 여전히 바이러스에 결합되어 있다. 이는 HA 단백질과 난알부민 사이의 강한 상호작용으로 인한 것일 수 있다. 또한, 이러한 데이타는 도 24에서와 같은 막대형 그래프 형태로 나타난다.
투과물 및 모든 세정물은 RHPLC에 의하여 체크하였다. 도 25 참조. 투과물은 모든 NAF 단백질 및 기타의 미확인 피이크를 포함한다. 난점질은 2 회의 세정에 의하여 (도 26 참조), 리소자임은 2회의 세정에 의하여 (도 27 참조); 콘알부민은 2회의 세정에 의하여 (도 28 참조) 제거하였으며; 그리고 난알부민은 점진적으로 결여되었으나, 세정 횟수 6회 이후조차도 약 5%로 남았다. 도 29 참조.
Agilent 바이오분석기
동시에, 난알부민은 도 30에 도시한 바와 같이 Agilent 바이오분석기에 의하여 평가하였다. 임의의 세정 단계 없이 농축에 의하여서는, 난알부민은 1X에서 10X로 대부분 제거되었다. 1차 투과는 대부분의 난알부민 RHPLC를 수행하였는데, 이는 모든 세정물중의 난알부민을 나타내나, 바이오분석기의 분석은 검출 한계치 이하에 도달하였다. 10X-W 샘플을 10X 희석하여 1X-W 샘플에 근접한 농도에 도달하였으며, 이는 소량의 난알부민을 나타낸다. 이러한 데이타에 기초하여 95%의 난단백질은 농축 및 세정 단계에 의하여 제거되었다.
SDS - PAGE 및 웨스턴 블롯
1X (레인 2)에 비하여, 10X (레인 9)은 보다 강한 다수의 실버 균주 밴드를 포함한다. 도 31 참조. 10X-W (레인 10)는 10X에 비하여 더 적은 수의 밴드가 나타났다. 이는 NAF 단백질 및 기타의 불순물의 제거로 인한 것이다. 유사하게, 1X-W (레인 8)은 1X보다 선명하였다. 샘플 1X, 1X로 희석된 10X (세번째 레인) 및 1X-W로 희석된 10XW (네번째 레인)은 불순물의 제거에서 상이한 정도의 개선을 제외하고는 동량의 바이러스를 포함한다. 명백하게, 1X-W로 희석된 10X-W는 더 뚜렷한 바이러스 단백질 밴드를 나타낸다. 그러나, 이러한 샘플은 난알부민 밴드를 포함한다. 이를 레인 6의 NAF 단백질과 비교하였다. 10X-W 샘플은 분석용 SEC 컬럼에 의하여 추가로 정제하고, 분획을 수집하였다. 도 32 참조. 19.1 분에서 수집한 분획을 SDS-PAGE로 체크하고, 이러한 분획은 대부분의 난알부민 단백질을 포함한다. (레인 5). 이는 항-NAF에 대한 웨스턴 블롯에서 나타났다. 이는 6회의 세정후에도 난알부민이 바이러스에 강하게 결합된다는 것을 추가로 입증하는 것이다. 항-NAP 겔을 스트리핑 처리하고, 닭 항-A/New Caledonia를 사용하여 프로브 처리하였다. 바이러스 단백질, HA0 및 HA2 또는 M 단백질을 나타내는 뚜렷한 밴드가 관찰되었다. 도 31 참조.
RTPCR
RTPCR은 RNA가 1X와 10X의 사이에서 1 log 더 높다는 것을 나타낸다. 도 33 참조. 유사하게, 1X-W 및 10X-W의 사이에서 바이러스 RNA에서의 약 10X 증가가 나타났다. 이는 대부분의 바이러스가 농축 단계중에 보유되었다는 것을 나타낸다. 투과물은 임의의 검출 가능한 바이러스 RNA를 포함하지 않으나, 1X-SPG 세정물은 아주 소량의 RNA를 나타냈다. 이는 순환중에 전단 처리되는 소량의 바이러스 또는, 세정 사이클중에서 여과물에 결합되고 이를 서서히 방출하는 특정의 바이러스 RNA로 인한 것일 수 있다.
요컨대, A/New Caledonia/20/99의 농축은 교차 흐름 여과 장치를 사용하여 달성하였다. 이러한 바이러스 입자의 감염성은 이 과정중에는 보유되었으며, 이를 CELISA 분석으로 확인하였다. 1X-SPG에 의한 농축 물질의 세정은 기타의 불순물을 제거하여 바이러스의 성질을 개선시켰다. 5차 세정 이후조차도, 소량의 난알부민은 바이러스에 강하게 결합되었다. 이는 난알부민 및 HA 또는 NA 단백질 사이의 강한 상호작용에 기인한 것이다. RHPLC 및 SDS-PAGE 및 웨스턴 블록은 이러한 단백질-단백질 고찰을 뒷받침한다. 니트 샘플 및 농축 샘플간의 RNA 함량의 증가는 대다수의 바이러스가 이러한 과정에 의하여 회수된다는 것을 나타낸다.
또한, 유사한 절차를 세포 배양액, 예를 들면 Vero 세포 등과 같은 세포중에서 증식된 인플루엔자 샘플로부터의 바이러스 샘플과 함께 사용하는데 적용할 수 있다. 이를 예시하기 위하여, 3 종의 바이러스를 Vero 세포 배양액, 즉 그 자체로서 사용한 A/Beijing (A/H1N1); 2 ℓ로부터 100 ㎖로 또는 20X 농축시킨 A/Panama (A/H3N2); 및 2 ℓ로부터 10 ㎖ 또는 200X로 농축시킨 B/Hong Kong 중에서 증식시켰다. Vero 세포로부터의 바이러스의 수율은 통상적으로 낮기 때문에, 통상의 구체예를 사용하여 바이러스 샘플을 농축시킬 수 있다. 상기의 예시와 유사하게, Amersham MidGee 및 QuixStand Instrument를 바이러스 농축에 사용하였다.
도 34 내지 도 35에는 SEC (도 34) 및 A/Beijing Vero 세포 배양액 수거물 (도 35)에 의한 A/Beijing 세포 배양액 증식의 모니터링을 나타낸다. SEC는 단시간내에 바이러스 증식을 모니터링하기 위한 효율적인 기법인 것이 명백하다. 또한, 이러한 모니터링에 소요되는 양은 통상적으로 작다 (예, 100 ㎕). 도 36은 2 ℓ의 A/Panama 세포 배양액 샘플의 농축을 예시한다. 2 ℓ의 바이러스 수거물을 QuixStand에 의하여 100 ㎖로 농축시킨다. 상기 참조. 1X 혼합물의 TCID50은 검출되지 않았으나, 20X 혼합물의 TCID50은 4.4이었다. 1X에 대한 20X의 피이크 면적비가 있다. Panama 세포 배양액 샘플의 농축은 교차 흐름 여과의 잇점을 예시하며, 예를 들면 바이러스 입자는 효과적으로 개선될 수 있으며, 저분자량 불순물은 용액으로부터 제거될 수 있으며, 투석여과는 용액의 추가의 "클린-업"에 대하여 수행될 수 있다. 도 37은 B/Hong Kong의 2 ℓ를 10 ㎖의 Vero 세포 성장된 배양물로의 농축을 예시한다. 1X에서, log 10 TCID50/㎖는 4.7이고, 18.8X에서는 5.8 (이에 대한 이론치는 5.95임)이고, 200X에서는 6.95 (이의 이론치는 7.00임)이었다.
상기 도면에서 알 수 있는 바와 같이, SEC는 세포 배양 샘플중의 바이러스 증식을 모니터링하기 위한 유용한 기법인 것을 나타내며, 매우 낮은 역가 바이러스는 바이러스 샘플의 농축후 분석할 수 있고, 낮은 역가 바이러스는 농축후 분석할 수 있다.
안정화제 / 완충액
본 발명은 바이러스 용액의 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 이러한 조성물은 임의로 해당 바이러스 및, 예를 들면 수크로스, 아르기닌, 젤라틴, EDTA 등의 조합을 포함하는 NAF (통상적으로는 분별 처리하지 않은 NAF)의 다양한 희석물을 포함한다. 본 발명의 각종 조성물은 10%~60%의 NAF를 포함한다. NAF는 뉴클레아제 리소자임과 같은 각종의 효소를 포함할 수 있으며, 이들은 바이러스 조성물의 안정성에 불리한 영향을 미칠 수 있다. 이러한 방법 및 조성물은 소정의 시간 동안 (통상적으로는 6 개월 이상, 9 개월 이상, 12 개월 이상, 15 개월 이상, 18 개월 이상, 24 개월 이상 등), 소정의 온도 (예, 통상적으로 4℃, 5℃, 8℃, 약 2℃~약 8℃ 또는 2℃ 이상, 등) 안정한 (즉, 역가에서 허용 가능하지 않은 손실을 나타내지 않음) 것이 바람직하다. 바람직한 구체예는 소정의 저장 기간동안 역가의 감소가 나타나지 않는다. 기타의 구체예에서는 10% 미만의 감소, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만 또는 1% 미만의 감소를 나타낸다. 바이러스 조성물의 역가는 FFU 또는 형광 집속 장치 (하기 FFA 분석의 설명 부분 참조)로 측정한다. 목표 FFU값은 통상적으로 시간 0에서의 바이러스 농축에 기초한다 (예를 들면 NAF의 희석에 기인함). 그래서, 바람직한 구체예는 출발값으로부터 감소가 적거나 또는 감소가 없는 것으로 나타났다. 본 명세서에서의 각종 조성물에서, 바이러스 용액은 약 5%~약 10%의 수크로스, 약 1%~약 4%의 아르기닌 및 약 1%~약 4%의 젤라틴을 포함한다. 특정의 바람직한 구체예는 약 7~10%의 수크로스, 약 2%의 아르기닌 및 약 2%의 젤라틴을 포함한다. 특정의 구체예에서, 안정성은 FluMist? Applicator/Accuspray 장치 또는 기타의 유사한 장치에서 소정의 온도에서 바이러스 배합물의 저장후 측정한다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 젤라틴 또는 젤라틴 관련 및/또는 유래 생성물 (예, 젤라틴 가수분해물)과 조합하여 또는 그 대신에 예를 들면 아르기닌 (약 7.0~약 7.2의 pH)의 안정화제를 포함하는 조성물을 포함한다. 표 1의 단계 12 및 15 참조. 그러나, 동물 및 동물 유래의 생성물, 예를 들면 젤라틴, 콜라겐 등 (예, 프리온, 미코플라즈마 또는 숙주 유래 바이러스와 같은 문제점에 의한)으로부터의 비의도적인 오염 가능성에 대한 통상의 조절 문제점 뿐 아니라, 동물 유래 생성물의 알레르기항원성에 관한 가능성에 대한 문제점은 비-동물계 안정화에 대한 수요를 창출하였다. 아르기닌 단독으로 또는 추가의 부형제, 예를 들면 금속 이온 킬레이트제 (예, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) 및/또는 이의 염) 또는 기타의 아미노산 (예, 히스티딘 및.또는 이의 염)은 비-동물 유래의 부형제를 사용한 저온 적용된 인플루엔자 바이러스 제제의 안정화 가능성을 제공한다.
다양한 구체예에서, 아르기닌은 경우에 따라 무기산을 가진 염 또는 유기산을 가진 염을 포함한다. 물론, 염은 백신 성분으로 사용되기 때문에, 통상적으로 약학적 허용 염을 포함한다. 통상적으로 바람직한 염은, 예를 들어, 염산염, 시트레이트 및 설페이트를 포함한다. 사용된 상기 안정화제의 양은 구체적인 특정 범위로 제한되지는 않지만, 통상적으로 사용되는 양의 범위는 바이러스 용액 1 ㎖당 약 5~약 60 ㎎이다. 사용된 양은 바이러스 용액 1 ㎖ 당 바람직하게는 약 10~약 50 ㎎, 더 바람직하게는 약 10~약 25 ㎎일 수 있다. 다른 구체예에서, 사용된 양의 범위는 바이러스 용액의 약 1~약 5%; 약 1.5~약 5%; 약 2~약 5%, 약 3~약 5%, 또는 약 4~약 5% 아르기닌 용액일 수 있다. 사용된 양은 본 발명의 상이한 구체예에서 다양할 수 있다. 본 발명의 다른 구체예에서, 바이러스 용액/백신 용액은 경우에 따라 인산칼륨을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 용액은 인산칼륨 약 11 mM을 포함한다. 다른 구체예에서, 용액은 인산칼륨 약 10~약 12 mM을 포함한다. 제형화한 조성물은 경우에 따라 상당한 양의 난 요막강액 성분(예, 단백질 및 대사산물) 및/또는 완충 희석액을 함유할 수 있다. 또한, 허용가능한 백신 조성물은, 예를 들어, 5~200 mM 범위의 농도에서의 일염기성 및 이염기성 인산나트륨염 또는 인산칼륨염, 또는 예를 들어, 25~100 mM 범위의 농도에서의 히스티딘 및/또는 이의 염의 혼합물과 같은 완충액 염을 함유할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 수크로스는 약 100~350 mM 범위의 농도로 존재한다.
많은 바이러스 용액/백신 용액에서, SPG(수크로스, 인산칼륨 및 글루탐산모노나트륨)의 염기 용액이 선택적으로 사용된다. 그러나, 본 발명의 몇몇 구체예에서, MSG는 바이러스/백신 용액의 일부가 아니다. 또한 다른 구체예에서, MSG의 수준은 감소된다. 본원의 구체예에서 사용할 수 있는 수크로스의 양은 매우 광범위하게 다양하다. 통상적인 구체예에서 약 0.2 M의 수크로스가 사용되지만(7% W/V), 최대 약 20% 수크로스를 포함하는 조성물은 바이러스 활성/효능에 해로운 영향을 주지 않을 수 있다. 조성물의 다양한 구체예에서의 계면활성제는, 예를 들어, 폴록사머 188(폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 블록 공중합체, 예, Pluronic F68) 및 Tween 20(폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트)을 약 0.01~0.1%(W/V%) 범위의 농도로 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 폴록사머, 젤라틴 가수분해물 및 아르기닌의 조합이 성분 중 하나만을 함유하는 임의의 용액보다 우수하며, 각 용액은 첨가된 성분 중 어느 것도 함유하지 않은 용액보다 더 안정하다.
또한 다른 구체예에서, 그룹 4에서의 단계(예, 표 1의 단계 15)는, 바이러스가 수크로스, 인산칼륨 및 글루탐산모노나트륨(SPG)의 완충액 또는 다른 단순 용액으로, 예를 들어, 감소된 MSG 등으로 현탁되어 있는 정상 요막강액(NAF) 전부 또는 일부분을 치환하는 것을 포함한다. NAF 희석액의 일부 또는 전부 대신 SPG를 사용하면 용액 중 바이러스의 안정성이 훨씬 커진다. 이 안정성은 또한 본 발명의 구체예의 새롭고 예상하지 못한 이점이다. 상기 기재된 제형 속성의 일부 또는 전부를 포함하는 대표적인 제형을 제조하여, 저온-적응성 바이러스 성분의 안정성을 평가하였다. 대표적인 제형의 조성물은 표 28에 나타나 있다. 5℃에서의 제형 안정성은 표 29에 나타나 있다.
수개월간 여러 온도에서 본 발명의 다양한 제형의 안정성에 대해 시험하였다. 예를 들어, 표 30은 12개의 상이한 제형을 예시한다. 제형 10 및 11은 건조된 바이러스 제조를 위해 사용된 제형을 기초로 하였다. 상기 표의 제형은 다양한 범위의 성분, 예를 들어 수크로스 및 젤라틴을 포함하였다. 표 31~34는 4개의 상이한 바이러스 균주를 포함하는 상기 제제의 6개월(매달 2개의 샘플 포인트) 간의 안정성을 나타낸다. 도 38은 사용된 B/Hong Kong 균주를 이용한 4개의 예시적인 제형의 결과에 대한 그래프이다. 표 35는 추가 제형의 조성물을 보여준다. 표 35의 조성물로는 리소자임 등과 같이 NAF 중에 존재하는 반대 성분을 잠재적으로 억제하도록 돕는 염기성 조성물(즉, 통상적으로 약 10% 수크로스, 약 2% 아르기닌 및 약 2% 젤라틴을 의미하는 10/2/2)에 대해 다양한 화합물의 첨가를 시험한다. 표 35의 제형의 안정성 결과는 표 36~39와 도 39 및 40에 나타나 있다. 표 40 및 41, 및 도41a-c는 제형(본원에서는 약 10% 수크로스, 약 1% 젤라틴 및 약 2% 아르기닌의 염기성 제형) 중 다양한 농도의 시트레이트를 조사한 것이다. 시트레이트를 가진 제형은 약 7~8개월 저장하면 침전물을 보였다. 표 42 및 43, 및 도 42a-c는 다양한 농도의 EDTA를 이용한 유사한 분석을 보여준다. 상기 실시예로부터의 예시적인 제형은 표 44 및 45a-d에 나타낸 추가 시험에 적용하였다. 다양한 농도의 수크로스, 젤라틴, 아르기닌 및 EDTA 등을 가진 추가 제형은 표 46~48에 나타나 있다.
본원의 다양한 1가 제형의 안정성을 추가로 예시하기 위해, 60% 요막강액을 포함하는 조성물로 안정성에 대해 시험하였다. 샘플은 5℃에서 저장하고, FFA 분석으로 검사하였다. 첫 두 달 동안은 2주에 한 번 샘플링하고, 그 뒤 9개월까지는 1달에 한 번 샘플링하였다. 심지어 몇 년 후 60% AF의 농도로 저 역가 균주를 이용해 필요한 효능에서 VH를 생산할 수 가능성이 높을 것이다. 미정제 VH를 사용하는 몇몇 제형은 모든 균주 테스트에 대해 충분한 안정성을 나타내어, 7개월 동안 5℃에서 0.5 로그값 감소 기준을 거의 꾸준하게 충족시켰다. 인플루엔자 균주 B/HongKong/330/01이 안정성에 대해 시험한 균주에서 가장 문제가 있는 것으로 나타났다. 13개의 상이한 제형에 대해 수크로스, 아르기닌, 젤라틴 및 다른 성분의 조성물을 백분율로 제공하는 표 30을 참조한다. 도 43은 9개월 후 상기 제형 중 4개의 바이러스 균주에 대한 안정성을 예시한다. 미정제 바이러스 조성물 제형의 예시적인 제형은, 예를 들어, VH, 10% 수크로스, 2% 아르기닌, 2% 젤라틴; VH, 10% 수크로스, 2% 아르기닌; VH, 10% 수크로스, 2% 아르기닌, 1% 덱스트란; VH, 10% 수크로스, 2% 아르기닌, 0.5% PVP; VH, 10% 수크로스, 2% 아르기닌, 2% 젤라틴, 2.5 mM EDTA; VH, 10% 수크로스, 2% 아르기닌, 2% 젤라틴, 시트레이트 완충액; 및 VH, 10% 수크로스, 2% 아르기닌, 2% 젤라틴, 히스티딘 완충액을 포함할 수 있다.
(예, 안정화 등을 위한) 바이러스/백신 용액 정제의 다른 방법은 (안정화제의 첨가와 함께) 분획화를 통해 모든 NAF를 제거하여 용액을 안정하게 하는 것과 같은 기법을 포함한다. 그러나 본 발명의 다양한 구체예는, 예를 들어, 바이러스/백신이 존재하는 NAF로부터의 희석을 포함한다. 예를 들어, 본원의 다양한 구체예에서, NAF의 농도는 경우에 따라 용액의 약 10~약 60%를 포함한다. 다른 구체예에서, NAF는 경우에 따라 용액의 약 20~약 50%, 또는 약 30~약 40%를 포함할 수 있다. 이와 같은 NAF 농도의 희석으로, 바이러스/백신 용액의 안정성을, 특히 액체형으로 소정의 온도(예, 4℃, 약 2~약 8℃ 등)에서 더 크게할 수 있다. 또한, 본 발명의 몇몇 구체예는 아르기닌의 사용으로 인해 감소된 NAF 농도를 포함한다(상기 참조). 본 발명의 다양한 제형을 NAF가 없는 정제된 제형이거나 또는 NAF가 감소된 (그러나 여전히 정제된 NAF) 제형인 바이러스 조성물과 안정성에 대해 비교하였다. 표 49는 본 발명의 다수의 조성물의 제형 뿐 아니라, VH가 다양한 방식으로 NAF로부터 정제된 다수의 제형을 예시한다. 표 49에 나타난 염기 제형이 통상적으로 약 2% 아르기닌, 약 2% 젤라틴, 약 1% PVP, 약 1% 덱스트란, 약 2.7 mM EDTA 및 약 100 mM 히스티딘을 포함한다는 것을 또한 이해할 것이다. 표 49의 수는 도 44~46에 나타낸 제형에 해당한다.
본 발명의 희석된 NAF 구체예는, 대안 안정화 방법론과 비교해 볼 때, 예를 들어, 최종 제형에서 10~25% 분획화된 NAF 또는 심지어 5% 분획화된 NAF 또는 더 적게 끝난다. 그러나, 당업자는 몇몇 본 구체예에서 제공된 NAF가 상기 분획화된 NAF를 포함하지 않는 대신 분획화되지 않은 NAF로 구성된다는 것을 이해할 것이다. 안정성의 관점에서 정제된 NAF(예, 분획화된 NAF 등)로부터 제조한 다른 바이러스 용액에 대해 본 발명의 제형을 비교하였다. 이 비교의 목적은, 2~8℃(예, 4℃)에서 저장되는 경우, 12개월 후 1.0 log 효능 상실보다 낮거나 동일하거나, 또는 0.080 log/개월 효능 상실보다 낮거나 동일하도록 도달하는 것이다. 본 발명의 제형에 대해 비교된 다른 바이러스 제형은, 예를 들어, 분획화, 정용여과 등을 통해 정제하였다. 3개의 상이한 인플루엔자 균주, 즉 H1N1 균주(A/New Caledonia/20/99 또는 A/NC), H3N2 균주(A/Panama/2007/99 또는 A/Pan 또는 A/PA), 및 B 균주(B/HongKong/330/01 또는 B/HK)로 상이한 제형을 시험하였고, Accusprayers(즉, FluMist?을 위한 배급 장치)에 상이한 제형을 채웠다. 제조 공정을 모방하기 위해, 샘플은 초기 단계로서 적어도 6일간 -25℃에서 동결하였다.
제1 비교에서는 안정성 측면에서 NAF 정제된 저온 적응된 3가 제형과 본 발명의 미정제 NAF 제형을 비교하였다. 상기 제형은 본 발명의 제형에 대해 7% 수크로스, 1% 젤라틴, 1% 아르기닌(3가 화학식을 비교하기 위한 표준임) 및 60% AF(요막강액)을 포함하였다. 6개월 후 본 발명의 제형은 A/NC에 대해서는 -0.035±0.016, A/PAN에 대해서는 -0.079±0.035 및 B/HK에 대해서는 -0.151±0.018을 나타냈다. 정제된 조성물에 대한 측정값은 A/NC에 대해서는 -0.020±0.027, A/PAN에 대해서는 -0.011±0.020 및 B/HK에 대해서는 -0.138±0.022였다. 상기 단위는 log FFU/개월이다. 표 50을 참조한다. 표 51은 본 발명의 제형이 10/2/2 조성물(상기 참조)을 사용하는 경우, 정제된 제형과 본 발명의 제형 간의 비교를 보여준다. 관찰된 높은 초기 효능 손실은 동결-해동 및/또는 블렌딩 손실에 영향을 준다고 생각된다. 표 52는 FluMist? 제형 중 히스티딘을 사용하는 것을 제외하면 유사한 비교를 나타내며, 초기 효능 손실이 관찰되지 않고 더 나은 안정성을 제공한다.
도 44는 상기 나타낸 초기 효능 손실(동결 및/또는 블렌딩 손실)이 인산 완충 제형과 독점적으로 관련 있음을 예시한다. 안정성에 대해 양성 효과를 주는 히스티딘 완충액을 사용하면 초기 효능 손실이 관찰되지 않는다. 도 44에 나타나 있는 제형은 표 49에 열거된 것들이다. 도 45는 6주 후 표 49의 제형의 안정성 기울기에 대한 "전체적인" 그림을 예시한다. 히스티딘 완충 10/2/2 제형이 안정성과 목표 모두를 가장 잘 충족시킨다는 것을 알 수 있다. 상기를 참조한다. 도 46은 유사한 데이터의 상이한 관점을 제시한다(즉, 개월의 개념이 아닌 주의 개념). 도 47은 젤라틴(L106) 또는 PVP/EDTA(L104)와 10/2/2 + 히스티딘 제형의 안정성을 예시하는 결과를 제공한 제2 연구를 예시한다. 도면에서 알 수 있듯이, PVP/EDTA을 이용한 젤라틴 치환이 젤라틴을 포함하는 것만큼 효과적인 안정성을 제공하였다. 도 48은 본 발명의 히스티딘계 10/2/2 제형의 최적 pH를 검사한다. 바람직한 구체예는 pH 7.0을 포함한다는 것을 알 수 있다. 상기 히스티딘 10/2/2 제형 100 mM에 대한 pH 범위 약 6.8~약 7.2 또한 본 발명의 구체예에 포함된다. 도 49는 본 발명의 구체예에서 수크로스 농도에 대한 바람직한 구체예의 시험을 보여준다. 몇몇 바람직한 구체예는 약 10% 수크로스를 포함하는 반면, 다른 구체예는 약 7%를 포함한다. 도 49의 염기성 제형은 수크로스 히스티딘의 첨가와 상기 10/2/2를 포함한다. 본원에 예시된 다양한 구체예에서, 몇몇 구체예는 완충 부가제로서의 히스티딘 및/또는 안정화제로서의 아르기닌 및/또는 덱스트란 및/또는 젤라틴을 대신하는 PVP를 포함한다.
본 발명의 다른 구체예는 경우에 따라 바이러스/백신 용액을 한외여과/농축을 사용하여 안정화시킨다. 상기 한외여과는 통상적으로 NAF의 감소/희석에 반하는 용액 안정성을 얻기 위한 대안 수단이다. 예를 들어, 몇몇 경우에 있어서, 특정 균주/용액의 역가 또는 효능이 낮다면, (경우에 따라 용액의 역가/효능을 더 감소시키도록 작용할 수 있는) NAF 희석을 대신하는 한외여과를 사용할 수 있다. 그룹 4 단계의 한외여과는 상기 기재된 바와 같은 정밀여과와 다소 상이하다. 본 그룹에서의 여과가 안정성 등을 고려하는 반면, 초기 그룹에서의 여과는, 예를 들어, 무균성을 위한 것이었고, 바이러스는 여과 중 유지된다. 상기를 참조한다.
효능 분석
본원의 몇몇 구체예에서, FluMist - 약독성 생 인플루엔자 백신 또는 다른 백신의 효능 측정을 위해, 바이러스/백신에 대한 효능 측정은 세포계 ELISA(Cell-based ELISA, 즉 CELISA)로 수행하였다. 상기 방법은 생 바이러스의 효능 측정을 위해, 더 전통적인 정중 조직 배양 감염 투여량(TCID50) 분석보다 더 단순하고 더 빠른 대안이다. 요컨대, 96-웰 마이크로타이터 플레이트 중 개의 원위세뇨관(MDCK) 세포의 융합 단층을 생 바이러스를 함유하는 샘플로 감염시키고, 포르말린으로 16~18시간 후-감염 고정시키고, 인플루엔자 바이러스 특이적인 모노클로날 항체(Mab)와 반응시켰다. 이어서 항-마우스 IgG-퍼옥시다제 및 퍼옥시다제 기질을 사용해 Mab에 결합된 바이러스 항원을 검출하여, 가용성 착색 생성물을 만들고, 흡광도(OD)는 분광광도계로 측정한다. 당업자는 인플루엔자 균주의 다양한 아형(예, 다양한 HA 등)에 의해 공유되는 에피토프/항원을 잘 알고 있을 것이다. 샘플 중의 생 바이러스 효능은 인가된 TCID50 효능 분석을 이용해 얻은 공지된 log10TCID50 값과 생 인플루엔자 바이러스 교정기(calibrator)를 사용하여 만든 표준 곡선으로부터 계산한다. CELISA는 4.9~6.7 log10TCID50 범위에서 직선(9.95보다 크거나 이와 동일한 r2)으로 나타난다. 일간, 분석간, 플레이트간, 플레이트 내 (잔여) 변이성(log10TCID50에서의 표준 편차)은 각각 0.06, 0.02, 0.05 및 0.03이었다. CELISA로 측정한 여러 백신 및 야생형 인플루엔자 A/H1N1, A/H3N2 및 B 균주의 효능은 인가된 TCID50 효능 분석으로 동시에 측정한 효능과 비교(±0.3 log10TCID50)할 수 있다. 인가된 TCID50 효능 분석을 위해 6일 후 2 샘플/플레이트와 대조되는 2일 후 최대 10 샘플/플레이트의 효능을 CELISA로 측정할 수 있다. 경우에 따라 다른 효능 분석 방법 대신, 또는 이 방법 외에 CELISA를 사용할 수 있다(예, FFA 및 TCID50, 하기 참조).
정중 조직 배양 감염 (또는 전염) 투여량 50%(TCID50) 분석(더 자세한 내용은 하기 참조)은 생 바이러스 및 생 바이러스 백신의 효능 측정을 위해 널리 사용되는 방법이다. 그러나, 본원에 몇몇 구체예에서는 경우에 따라, FluMist, 즉, 약독화 생 백신(또는 다른 유사한 백신)에서의 인플루엔자 바이러스의 효능을 측정하기 위해 전통적이고 시간 및 노동 집약적인 TCID 분석에 비해 더 간단하고 더 빠른 대안인 세포계 ELISA(CELISA)를 사용한다.
다른 통상적인 구체예에서, 경우에 따라 바이러스 용액의 효능 분석은 종래 기술에서 사용되는 통상적인 TCID50 분석에 반하는 형광 초점 분석(FFA)을 포함한다. 이 FFA는 자동조작을 할 수 있어서 백신 생산량을 더 높일 수 있다는 추가 이점을 가진다. TCID50 분석으로는 대개 특정 세포 배양액의 50%를 감염시킬 바이러스 부유액 또는 용액의 양을 측정한다. 이 측정의 결과는 정확하지만, FFA보다 느리기 때문에 백신 생산에 필요한 귀중한 시간을 다 사용할 것이다. FFA 분석은 통상적으로 감염된 세포에서 바이러스 항원을 검출하기 위해 형 및/또는 아형(또는 더 일반적인 항원) 특이적인 항-인플루엔자 항체(통상적으로는 항 HA 항체)를 사용한다. 항체가 인플루엔자의 상이한 형/아형과 교차 반응하지 않는 사용에서, 멀티-바이러스 제조 시 별도의 바이러스 형(예, 3가 백신 제형)을 정량화하기 위해 상기 제제를 사용할 수 있다. FFA 분석은 또한 특이적인 균주에 대한 동일성 시험으로 사용될 수 있다. 당업자는 바이러스/백신 시험 수행 시 FFA와 이의 용도를 상당히 잘 알 것이다.
반면, 형광 초점 분석은 (감염된 세포 또는 표지 세포에서) 세포 사멸 유도에 의존적이지 않다. 대신, 항체 염색법을 사용하여 세포 배양 단층에서 감염된 세포 내의 바이러스 항원을 검출할 수 있다. 이어서, 바이러스-특이적인 항체 상에서 형광 표지를 사용하여 상기 감염된 세포를 시각화 및 정량화한다. 본 발명의 통상적인 FFA는, 예를 들어, 형 및 아형 특이적 항-인플루엔자 HA 항체를 사용하여, 감염된 세포에서의 바이러스 항원을 시각화한다.
다른 구체예에서, FFA(및 경우에 따라 본원의 다른 분석)는 경우에 따라 특이적 형/아형 인플루엔자 항원에 대해서는 비특이적이지만 일반적인 인플루엔자 항원에 대해서는 특이적인 일반적인 제제(또는 일반적인 항원)를 사용한다. 따라서, 일반적인 제제는 경우에 따라 상이한 다수의 스크리닝을 위한 FFA에 대해 유용하고, 형/아형 특이적 항체는 발현 및 만들 필요가 없으며, 상이한 바이러스는 매번 분석한다.
본원의 다른 구체예는 세포계 형광광도 분석(CFA)을 사용하는 바이러스 효능 결정을 포함한다. FFA 분석이 다수의 구체예에서 상당히 유용하지만, CFA 분석이 다른 구체예에서 더 바람직하게 사용된다. FFA 분석의 이미지 처리 및 판독이 약 20 플레이트/사람/일 (또는 약 5 플레이트/시 이미지 처리)에서 마무리될 수 있지만, CFA 분석으로부터의 이미지 처리 및 판독이 최대 약 4배 더 빠를 수 있다. 또한, FFA 역가가 인플루엔자 B 균주에 대한 TCID50 역가와 상이할 수 있는 반면, CFA 역가는 분석 표준 또는 교정기의 사용으로 인해 TCID50(또는 FFA) 역가와 유의적으로 상이함을 나타내지 않는다. 요컨대, CFA 분석으로는 96 웰 플레이트에서 생장하는 MDCK 세포에서 감염성 인플루엔자 바이러스를 측정한다. FFA와 같이, CFA는 제1 감염 주기 도중 MDCK 세포의 바이러스 감염으로부터 기인한 바이러스 단백질 발현을 검출한다. CFA 분석은 역가 측정에 대한 교정기 또는 분석 표준을 이용한다. CFA 제제에 대해, 통상적인 항체 제제는, HA 또는 A 균주 및 B 균주(인플루엔자에 대한)에 특이적인 제1 항체, 및 예를 들어 Alexa 488과 결합한 염소 항-마우스 IgG의 제2 항체를 포함할 수 있다. CFA에 대한 분석 표준은 동일한 균주의 바이러스 수확을 공지된 FFA 또는 TCID 역가로 시험한 샘플로서 포함할 수 있다. CFA에 대한 분석 참조는, 공지된 FFA 또는 TCID 역가 및 공지된 직선 기울기를 이용한 바이러스 수확을 포함할 수 있다(샘플로서 동일한 균주를 시험할 필요는 없음). 샘플 1차 항체는, 예를 들어 1:2000의 작업 희석비(working dilution)에서 (예, Takara로부터의) A/H1N1 또는 A/H2N2 균주에 특이적인 항체; 예를 들어 1:1000의 작업 희석비에서 (예, Takara로부터의) A/H3N2 균주에 특이적인 항체; 및, 예를 들어 1:1000의 작업 희석비에서 (예, Chemicon으로부터의) B 균주에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 통상적인 CFA 분석 절차는 바이러스 접종 후 33℃에서의 18시간 항온 배양, 이어서 실온에서 15분간의 고정화 및 항온 배양을 포함한다. 이어서 37℃에서 60분간 제1 항체를 항온 배양한 뒤 37℃에서 60분간 제2 항체를 항온 배양한다. 이어서 형광계를 이용해 플레이트를 판독하고, 데이터를 분석한다. CFA에 대한 몇몇 구체예에서, 웰 등의 감염 수준은 단백질 발현을 통해 측정한다(감염된 세포 수를 측정하는 통상적인 FFA 분석과는 상반됨). 당업자는 통상적인 FFA 분석 및 형광계 및 CFA 분석에 적용할 수 있는 유사한 것들을 알고 있을 것이다.
반자동화 TCID 50 분석
전술한 바와 같이, 본 발명의 몇몇 구체예는 TCID50 분석 및 이것의 다양한 변형법 등을 포함한다. 예를 들어, 몇몇 구체예는 하기의 설명에 의해 예시되는 것과 같은 반자동화 버젼을 포함한다.
본 섹션에서는, 생, 약독화 인플루엔자 바이러스 백신, 예를 들어 FluMist(등록상표) 또는 기타 유사한 백신의 효능 측정을 위한 수작업 및 반자동화 중간 조직 배양 감염 용량(Median Tissue Culture Infective Dose; TCID50) 분석을 제시한다. TCID50 효능 분석은 경우에 따라 FluMist 또는 다른 유사한 백신의 효능 측정을 위해 사용된다. 검증된 수작업 효능 분석의 2 단계의 노동 집약적 단계를 개선시킨 반자동화 TCID50 효능 분석에 관해 기술한다. 이것은 (i) 수차례의 수작업 반복 희석 단계 대신에 MDCK 단층 세포의 샘플 희석 및 감염을 위해 자동화된 피펫팅 스테이션을 사용하는 것, 및 (ii) 감염 6일 경과 후, MDCK 세포에서 인플루엔자 바이러스 유도된 세포 변성 효과(CPE)의 존재를 평가하기 위해 모든 분석 평판에서 96웰 각각을 광학 현미경으로 수작업으로 관찰하는 대신에, 세포 건강/생존율의 인디케이터로서 널리 사용되는 MTT, 즉 바이탈(vital) 염료인 (3-[4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드)의 생성물을 분광분석으로 측정하기 위해 96웰 평판 판독기를 사용하는 것이다.
본원의 몇몇 구체예에서 이용되는 반자동화 TCID50 효능 분석은 정확도(반복성: < 0.25 log10TCID50; 중간 정확도: SD(일) < 0.3 log10TCID50; SD( 분석물 ) 및 SD(장치) < 0.4 log10TCID50; 및 재현성: 90% 신뢰 수준 ± 0.3 log10TCID50), 선형도, 정밀도 및 범위(기울기 1±0.1)를 입증하기 위해 개발하여 검증하였다. 자동화된 피펫팅 스테이션 및 MTT 염료를 사용하는 반자동화 TCID50 효능 분석은 검증된 수작업 TCID50 효능 분석과 대등한 결과를 산출하는 것으로 확인되었다(90% 신뢰 수준 ± 0.3 log10TCID50). 요약하면, 본원의 결과는 인플루엔자 바이러스, 예를 들어 FluMist(등록상표) 제품의 효능을 측정하기 위해 피펫팅 스테이션과 MTT 염료를 사용할 수 있음을 뒷받침해준다. 또한 상기한 개선점들은 테스트 처리량도 증가시킨다.
감염성/효능(1가) 분석의 검증
1가 인플루엔자 균주의 효능 측정을 위한 현행 수작업 방법의 반자동화 버젼은, 경우에 따라 FluMistTM 백신 및 기타 유사한 백신의 제조를 위해 사용된다. 반자동화 효능 분석은 평판 세척과 연속 희석 단계의 자동화, 및 수작업 현미경 검출을 대체하기 위한 바이러스 유도된 세포 변성 효과(CPE)의 자동화된 염료계 검출을 포함한다. 평판 세척과 연속 희석 단계의 자동화는, 분석 처리량을 증가시키고 이 분석을 수행하는 품질 관리 분석자에 대해서는 반복 동작의 상해 위험을 감소시킨다. 바이러스 유도된 CPE의 자동화된 염료계 검출은 현미경 검출의 필요성을 없애 분석 일관성 및 처리량을 향상시킨다.
반자동화 분석의 몇몇 단계/측면은 보다 전통적인 TCID50 분석과 유사한 반면, 다른 단계/측면은 매우 상이하다. 분석 단계는 메딘-다비 개 신장(Madin-Darby canine kidney; MDCK) 단층 세포를 포함하는 분석 평판의 준비, 배양 및 세척 과정, 상기 분석 평판의 감염 및 감염 후 배양, 및 CPE 양성 웰의 수 및 양 분석에서의 샘플 테스트 구성에 기초한 효능 계산을 포함한다. 반자동화 효능 분석은 검증되었으며, 분석의 성능은 발명자와 공동 연구자에 의해 현행 수작업 분석과 유사한 것으로 입증되었다. 이러한 반자동화 분석은, 경우에 따라 증폭된 야생형 인플루엔자(eWT), 마스터 바이러스 시드(Master Virus Seed; MVS), 제조업자의 워킹 바이러스 시드(Manufacturer's Working Virus Seed; MWVS) 및 바이러스 하비스트(Virus Harvest; VH) 샘플의 감염성/효능 측정을 위한 기본적인 방법으로서 이용된다. 수작업 분석은 경우에 따라, 반자동화 분석을 수행할 수 없는 상황, 예를 들어 장치 고장이 장기화되는 경우에 보완 수단으로서 이용된다.
전통적 중간 조직 배양 감염 용량(TCID50) 분석은 감염성 살세포성 비리온을 측정하는 세포계 방법이다. MDCK 세포는 96웰 평판에서 배양하며, 융합성 단층 세포에 바이러스 샘플의 연속 희석물을 접종한다. MDCK 세포 내에서의 바이러스의 복제는 세포 사멸을 초래한다. 후손 바이러스는 다른 세포를 감염시켜, 결국 단층 세포를 파괴하게 된다. 감염으로 인한 CPE는 6일간의 접종 기간 동안 발달하게 된다. 개별 웰은 현미경으로 판독하여 각 웰 내의 CPE의 존재를 측정한다. 이러한 절차에 의해 3일간 매일 4회의 개별 측정을 수행하고, 12개 모두의 적정 결과를 평균내어 1회 테스트 결과를 산출한다. 각 분석자는 샘플 이외에도 하나의 1가 대조군을, 3일 동안 매일 4중의 중복 측정과 함께 분석한다.
수작업 분석은 노동력 집약적이며 샘플 처리량이 제한적이다. 각각의 개별 측정은 수동 피펫터를 사용하여 수행되는, 수차례의 세포 세척 및 연속 희석 단계를 이용한다. 96웰 분석 평판 내의 각 웰은 CPE의 존재 또는 부재에 대해 현미경 관찰에 의해 평가하여야 한다. 다수의 평판 세척 및 희석 단계는 분석자에게 반복 동작의 상해 위험을 부과한다. 게다가, 96웰 평판 내의 각 개별 웰의 현미경 판독은 피곤한 작업이며, 이로 인하여 1인의 분석자가 수행할 수 있는 분석의 수가 1일에 약 20개 평판으로 한정된다. 1회 테스트 결과는 3일 테스트 기간에 대한 12회 측정값의 평균으로서 얻어지며, 각 분석자는 샘플 이외에도 하나의 1가 대조군 분석을 수행한다. 이는 3일의 테스트 기간에 분석자 1인당 9개 샘플만을 처리할 수 있게 한다(분석자 1인당 1일 평균 3개 샘플). 이 분석에 의해 1가 인플루엔자 백신 제품의 각각의 개별적인 서브-로트(로트당 약 40~50개 서브-로트)가 테스트되기 때문에, 한정된 처리량은 백신(예, FluMistTM 백신 등)의 대규모의 상업화를 위한 용량을 제한할 수 있다.
전통적 분석의 자동화, 특히 평판 세척 및 피펫팅 단계의 자동화와, CPE의 MTT (3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]2,5-디페닐-테트라졸륨 브로마이드) 염료계 검출에 의해, 인플루엔자 바이러스 1가에 대한 반자동화된 TCID50 효능 분석의 개발이 실현된다. 반자동화 분석은 세척 단계에 SkatronTM 세포 세척기를 사용하는데, 이 때 잔해물 및 사용된 배지는 세포 배양 평판으로부터 제거되고 새로운 배지로 대체된다. Matrix SerialMate(등록상표명) 다채널 피펫팅 스테이션을 이용하여, 바이러스의 연속 10배 희석을 수행하고, 희석된 샘플을 96웰 분석 평판 내의 세포 배양 단층물 상에 이전한다. 물론, 이 때 경우에 따라 유사한 기능을 수행하는 다른 장치로 대체할 수 있으며, 달리 명시하지 않는다면 특정 상표명 또는 유형의 장치를 구체적으로 언급한 것이 제한적 의미로 간주되어서는 안된다. 6일간의 항온처리 기간 후에, 96웰 분석 평판을 세포 대사 및 생존율의 인디케이터로서 널리 인정되는 MTT 염료와 함께 6 시간 동안 항온처리한다. 항온 처리 기간 동안, 무결한 세포와 건강한 세포의 단층물은 염료를 처리하여 불용성의 자줏빛 포르마잔 생성물을 형성하며, 이것은 세포 내에 축적된다. 세포 단층물이 파괴되지 않은 웰에서는, 염료 생성물이 형성되지 않는다. 그 후 20%의 계면활성제 소듐 도데실 설페이트(SDS)를 함유하는 0.01 N 염산의 가용화 용액을 첨가하고, 평판을 밤새 항온처리하여 불용성 염료 생성물을 용해시킨다. 570 nm에서의 흡광도를 측정하여 자줏빛 포르마잔 염료 생성물을 정량한다. 흡광도 판독값은 마이크로소프트 엑셀TM 매크로 프로그램(또는 다른 유사한 프로그램)을 이용하여 처리하여, CPE 양성 또는 음성 웰을 확인하여 그 수를 측정하고 TCID50 역가를 계산한다. 무결한 세포 단층물을 포함하는 웰은 소정의 컷오프값과 비교할 때 더 높은 흡광도를 나타내며 CPE 음성으로서 확인되는 반면, CPE 양성 웰은 컷오프값 이하의 흡광도 판독값을 나타낸다(도 50 참조). 그 후 각 희석율에서 CPE를 나타내는 웰의 수를 이용하여, Reed-Muench 법의 Karber 변형법에 기초하여 역가(log10 TCID50/ml)를 계산한다. 세포 세척, 연속 희석 및 바이러스 접종 단계의 자동화 및 MTT 염료계 CPE 검출에 대해서는 이하에서 상세히 설명한다.
Skatron TM 세포 세척기를 사용한 세포 세척 단계의 자동화
수작업 분석에서는, 96웰 평판 내의 MDCK 세포 단층물을 포함하는 평판을 희석된 바이러스 샘플을 접종하기 전에 2회 세척한다. 4일간의 세포 배양으로부터 발생한 폐기물 및 소 태아 혈청(FBS)을 함유하는 사용된 배지는 제거하고, FBS를 포함하지 않는 새로운 바이러스 배양 배지(VGM)로 대체한다. 그 후 세포를 33±1℃ 및 5±1% CO2에서 적어도 10분간 항온처리한 다음, VGM을 제거하고, 두 번째로 새로운 VGM으로 대체한다. 각 세척 단계에서는, 각각의 평판을 깨끗한 종이 타월 위에 뒤집어 놓고 가볍게 눌러 웰로부터 배지를 제거하고, 그 후 각 웰에 새로운 VGM 200 ㎕를 수동식 다채널 피펫터를 사용하여 재충전한다. 이 과정은 처리해야 하는 평판의 수가 많을 경우 노동력 집약적이며 시간 소모적이다.
SkatronTM Skanwasher(시리즈 300, 모델 12010)는 마이크로프로세서로 제어되는 96-채널 세포 세척기로서, 상기 세척 단계들을 자동적으로 수행한다. Skanwasher는 6-풋 층류 생물안전성 후드에 고정시킬 수 있을 정도로 충분히 작다. SkatronTM Skanwasher를 사용하는 세포 평판 세척 단계의 자동화는 사용된 배지를 평판으로부터 흡입하고 그 후 새로운 VGM을 빈 웰에 분주하는 세척 프로그램을 이용한다. 개별 평판을 Skanwasher에 로딩하고, 그 후 꺼내어 세척 사이클의 마지막에 33±1℃ 및 5±1% CO2 항온처리기로 옮긴다. 평판을 최소 10분간 항온처리하고, 그 후 2차 세척을 위해 Skanwasher에 로딩한 다음, 이들을 다시 항온처리기로 반송한다. 이러한 세척 단계에서의 SkatronTM Skanwasher의 성능은 세포 세척 단계에 사용하기에 적합한 것으로 확인되었다. 용량 200 ㎕에 대한 분주 정확도는 CV < 10%와 관련되며, 분주 정밀도 10% 내에 속한다. 흡입 단계에 있어서의 잔류 용량은 1% 미만이다. 따라서 SkatronTM Skanwasher는 적합한 성능을 제공하는 한편, 사용이 용이하고 세포 세척 단계의 처리량 효율을 개선시킨다. 역시, 경우에 따라 동일한 기준 내에서 성능을 발휘할 수 있는 유사한 장치를 본 발명에 사용할 수도 있다는 것을 이해할 것이다.
Matrix SerialMate (등록상표) 다채널 피펫팅 스테이션을 사용한 자동화된 연속 희석 및 바이러스 접종
전통적인 수작업 TCID50 분석의 연속 희석 및 바이러스 접종 단계를 수동식 다채널 마이크로피펫을 사용하여 수행한다. 연속 희석은 두 단계로 수행한다. 제1 세트의 5개의 연속 희석물은 0.5 ml 희석 블록에서 수행하고, 그 후 제1 블록으로부터의 해당 희석물을 최종 5개의 연속 희석물을 위해 2 ml 희석 블록으로 옮긴다. 이러한 연속 희석은 신중하게 수행하여야 하는데, 왜냐하면 어느 한 희석 단계에서의 피펫팅 오차는 증폭되어 후속의 일련의 작업을 거쳐 확대될 수 있기 때문이다. 후속 바이러스 접종 단계는 희석된 바이러스를, 융합성 세포 단층물을 함유하는 분석 평판의 복수개의 행 또는 열로 반복 피펫팅하는 것을 포함한다. 이러한 작업에 필요한 정확도를 제공하기 위해 사용되는 수동식 다채널 마이크로피펫의 장시간 사용은 심각한 근육 피로와 건염을 유발할 수 있으며, 이는 1인의 분석자가 1일에 수행할 수 있는 평판의 수를 제한하여 전체 작업의 처리량을 제한한다.
연속 희석 및 바이러스 접종 단계에의 Matrix SerialMate(등록상표) 피펫팅 스테이션의 사용은, 사용의 용이성 및 분석의 처리량을 향상시키고, 작업자의 상해 발생률을 감소시키는 한편, 이러한 작업에 필요한 정확도 및 정밀도를 제공한다. Matrix SerialMate(등록상표) 피펫팅 스테이션은 5~225 ㎕ 범위의 용량을 흡입하여 분주할 수 있는 12-채널 노즐 헤드가 구비된 벤치 탑 액체 핸들링 스테이션이다. 이 장치는 표준 4-풋 또는 6-풋 생물안전성 캐비넷에 장착할 수 있을 정도로 소형이고 사용이 용이하다. Matrix SerialMate(등록상표)는 이송 용량 5~225 ㎕에 대하여 0.5 ㎕보다 우수한 정확도 및 1.0 ㎕보다 우수한 정밀도를 제공한다. 이는 연속 희석 단계에서 사용되는 30 ㎕ 이송 용량에 대하여 ±1.7%보다 우수한 정확도 및 ±3.3%보다 우수한 정밀도에 해당한다. 자동화 분석 및 현행 수작업 분석을 이용하여 얻은 분석 결과의 유사성을 하기와 같이 확인한다. 역시, 경우에 따라 동일한 기준 내에서 성능을 발휘할 수 있는 유사한 장치를 본 발명에 사용할 수도 있음을 이해할 것이다.
MTT 염료계 검출에 관한 설명
TCID50 분석에서의 최종 단계는 CPE의 검출 및 바이러스의 정량이다. 현행(수작업) TCID50 분석의 경우, 각 웰 내의 CPE의 징후를 조사하기 위해 각 웰을 현미경으로 판독한다. 이러한 징후는 촛점 영역, 세포 단층물의 부분적 또는 완전한 붕괴 및 파괴된 세포 단층물 상부에서의 둥근 형태의 검은 세포의 존재를 포함한다. 분석자가 다수의 평판을 계측해야 하기 때문에 심각한 눈 피로가 발생하여, 실제적으로는 1인의 분석자가 셀 수 있는 평판수의 한계를 약 20개로 설정하는 것이 준수되고 있다. 이러한 단계는 수작업 분석의 처리량의 속도 제한 단계이다.
테트라졸륨 염료는 세포 생존율 인디케이터로서 널리 사용된다. 가장 흔히 사용되는 염료는 옐로우 MTT 염료이다. 활성 마이토콘드리아를 보유하는 생존 세포는 MTT 염료를 불용성의 자줏빛 포르마잔 생성물로 환원시키며, 이 생성물은 가용화 단계 후에 570 nm에서 검출할 수 있다. 대다수의 세포가 파괴된 CPE 양성 웰에서는, 염료 생성물이 거의 또는 전혀 형성되지 않으며, 훨씬 더 낮은 흡광도가 관찰된다.
반자동화 TCID50 분석에서는, 평판의 감염 및 6일간의 항온처리 후에, 사용된 배지를 제거하고, 새로운 바이러스 배양 배지 중의 0.5 mg/ml MTT 염료 용액 100 ㎕를 96웰 평판의 각 웰에 첨가하고, 세포를 37±1℃ 및 5±1% CO2에서 6 시간 동안 항온처리한다. 염료 생성물은 37±1℃에서 밤새 항온처리하여 가용화시킨 다음, 가용화제(0.01 N HCl 중 20% SDS) 100 ㎕를 첨가하고, 그 후 자줏빛 포르마잔 염료 생성물로 인한 570 nm에서의 흡광도를 평판 판독기로 측정한다. 흡광도 데이터는 미리 설정된 컷오프값에 기초하여 흡광도 판독값을 CPE 총계로 변환시키는 검증된 마이크로소프트 엑셀TM 매크로(또는 다른 유사한 프로그램)으로 전송한다. 무결한 세포 단층물을 함유하는 웰은 소정의 컷오프값에 비해 더 높은 흡광도를 산출하며, CPE 음성인 것으로 확인된다. CPE 양성 웰은 컷오프값 이하의 흡광도 판독값을 나타낸다. 그 후 각 희석율에서 CPE를 나타내는 웰의 수를 이용하여 Reed-Muench 법의 Karber 변형법에 기초하여 역가(log10TCID50/ml)를 계산한다.
자동화된 염료계 검출은 CPE 판독값의 일관성을 향상시키고 분석 처리량을 증가시킨다. 염료계 검출과 수작업 현미경 CPE 검출의 유사성은, 분석이 여러 종류의 백신 및 야생형 균주와, 상이한 세포 계대 배양수 및 접종 밀도를 갖도록 준비된 평판을 사용하여 수행되는 집중적인 연구로 확인한다. 이러한 분석에서, 평판은 먼저 수작업 현미경 관찰에 의해 판독하고, 그 후 염료계 흡광도 검출에 의해 확인한다. 이들 연구로부터의 결과를 분석하여 유니버셜 흡광도 컷오프를 결정하는데, 이는 양 분석 방법에 의해 유사한 CPE 총계를 제공하였다. 570 nm에서의흡광도에 대한 0.5254의 유니버셜 컷오프값은 정밀한 연구(하기 참조)로 확인하였는데, 이 때 9인의 다른 분석자가 3개의 상이한 장치에서 6일의 분석일에 걸쳐 총 573개의 분석 평판에 대하여 분석을 수행하였다. 각 웰(총 45,840웰에 대하여 평판당 바이러스 접종 웰 수 80개) 내의 CPE의 존재 또는 부재는 수작업 현미경 관찰에 의해 먼저 판독하고 염료계 흡광도 검출로 판독하였다.
도 50은 웰로부터의 흡광도 판독값을 값의 빈도(흡광도값에서의 웰 판독의 수)에 대하여 작도하여 도출한 히스토그램이다. 빈도 측정은, A570 = 0.5254의 흡광도 컷오프가 CPE 음성 웰의 분포의 최좌측 테일에 위치하고(확률 = 0.007%), CPE 양성 웰의 분포의 최우측 테일에 위치한다(확률 = 0.02%)는 것을 보여준다. 이러한 컷오프값을 이용하여 양 방법에 의해 각 웰의 CPE 검출을 비교한 결과, 염료계 검출 및 현미경 관찰 둘 다에 의해, CPE 양성인지 CPE 음성인지를 확인하기 위한 대부분의 웰에서 일대일 대응을 나타내었다(45840 중 45279, 98.78%).
반자동 효능 에세이의 확인
1가의 인플루엔자 백신 바이러스의 분석을 위한 반자동 중앙값 조직 배양 감염 용량(median tissue culture infectious dose, TCID50) 효능 에세이는 확장된 야생형 인플루엔자(eWT), 마스터 바이러스 시드(MVS), 제조자의 작업 바이러스 시드(MWVS) 및 바이러스 채집(VH) 시료들의 감염성/효능 측정을 의도한 것이다. 에세이는 반자동 TCID50 에세이의 정밀성(반복성, 실내 재현 정밀성(intermediate precision) 및 실간 재현 정밀성(reproducibility)), 선형성, 정확성 및 범위를 실증하여 확인되었고 수동 TCID50에 필적할만한 결과를 나타낸다. 확인 테스트는 하나의 Type A/H1N1, 하나의 Type A/H3N2 균주 및 하나의 Type B 균주를 포함하여 선택된 3개의 상이한 1가 백신 균주로 수행되었다. 에세이 확인은 실험실-대-실험실의 실간 재현 정밀성을 실증하기 위하여 상이한 실험실에서 두개의 분리된 군으로 수행되었다. 표 53에서 반자동 에세이의 정밀성(테스트 간의 변화), 선형성, 정확성 및 범위를 수동 에세이에서 관측된 것들과 비교한다.
반자동 에세이의 테스트 간 표준 편차(SD)는 동일한 분석군에 의하여 동일한 피펫팅 스테이션(pipetting station)에서, 3개의 백신 균주 각각에서 수행된 6개의 테스트로부터 평가되었다(각 테스트 결과는 3일에 걸쳐서 얻은 12개의 측정값을 평균내어 얻는다). 반자동 에세이의 테스트 간의 변화를 위한 허용 기준은 0.25 log10 TCID50/ml이었고, 이는 수동 에세이의 관찰된 최고 변화(0.11 log10 TCID50단위)에 기초하여 단일 테스트 결과를 위한 95% 신뢰구간의 절반의 폭이다. 3개의 균주를 위한 반자동 에세이에서 얻어진 실제 SD 수치는 0.06-0.09 log10TCID50/mL 범위였다. 이러한 수치는 SD<0.25 log10 TCID50단위 의 허용기준 내이고, 3개의 균주 각각의 3개의 독립적인 로트(lot)에서 수행된 9번의 반복 테스트로부터 수동 TCID50 에세이에서 관찰된 테스트 간의 변화(0.07 내지 0.11 log10 TCID50 단위)에 필적할만한 것이다.
TCID50 타이터의 계산값 및 측정값의 관계가 1% 유의성 수준에서 선형모델 적합성 부족을 위한 테스트를 통과하였음을 보여줌으로써, 105배 희석 범위(4.2-9.3 log10TCID50/mL)에서 선형성임이 나타났다. 에세이는 3개의 균주에 대하여 1.00-1.02의 기울기로서 정확하였고, 이는 모두 허용 기준인 1±0.1의 기울기 이내이었다. 반자동 에세이의 선형성, 정확성 및 범위는 수동 에세이에 필적할만하다. 표 53 참조.
반자동 에세이의 실내 재현 정밀성은 하나의 type A 및 하나의 type B 백신 바이러스 균주에 대한 9일의 상이한 에세이일 동안 2개의 분석군에서 얻은 18개 테스트값의 세트에 무작위 효과 모델을 맞춰봄으로써 실증하였다. 일간 변화(SD(일)), 분석군간 변화(SD(분석자)) 및 도구간 변화(SD(도구))에 대한 측정된 표준편차 범위는 각각 0.04-0.08, 0.14-0.16 및 0.000-0.03이었고, 허용 기준인 SD(일)<0.3, SD(분석자)<0.4 및 SD(도구)<0.4를 만족하였다.
에세이의 실험실간 재현성을 두개의 상이한 실험실에서 하나의 Type A/H1N1, 하나의 TypeA/H3N2 및 하나의 Type B 균주에 대하여 에세이를 수행하여 실증하였다. 실험실-대-실험실 재현성의 허용기준은 두 개의 실험실로부터의 평균 결과값 차이의 양측 90% 신뢰 구간이 ±0.3 log10TCID50/mL 이내일 것을 요구하였다. 이러한 허용 기준은 3개의 모든 균주에 대하여 각각 -0.05 초과 +0.15 미만의 90% 신뢰 구간의 하한 및 상한을 갖고, 만족되었다.
상세한 통계적 비교가 수행되어 수동 및 반자동 에세이의 동등성을 실증하였다. 두개의 백신 균주, 하나의 Type A/H1N1(A/New Caledonia/20/99) 및 하나의 Type B(B/Yamanashi/166/98)가 수동으로 에세이되어 각 균주에 대하여 18개의 테스트 결과를 얻었다. 각 균주에 대하여 수동으로 얻어진 18개의 테스트 결과 모두의 자료를 풀(pool)화하였고, 반자동화된 테스트를 위하여 수행된 정밀성 및 실내 재현 정밀성 연구로부터 얻은 풀화된 테스트 결과들(각 균주 당 18개의 테스트 결과)과 비교하였다. SAS에서 프록 믹스드 방법(Proc Mixed method)을 사용하여 방법 간 평균 차이 및 이의 90% 신뢰 구간(CI)을 예측하였다. 허용 기준은 90% CI가 ±0.3 log10TCID50/mL, 즉 90% CI의 하한(LB)이 -0.3을 초과하고, 상한(UB)이 0.3미만이어야 하였다. 결과는 에세이 확인 보고서에 제시하고 이하의 표 54에 요약된다. 결과로부터 알 수 있듯이, 양측 90% 신뢰 구간은 두 균주 모두에서 상한과 하한의 실제 예측값이 -0.05 내지 0.10 log10TCID50/mL 범위로서, 허용 기준인 ±0.3 log10TCID50/mL 이내였다.
따라서, 요약하면, 인플루엔자 바이러스 1가에 대한 수동 TCID50 효능 에세이가 1가 인플루엔자 백신 균주의 감염성/효능 측정을 위하여 확장된 야생형 인플루엔자(eWT), 마스터 바이러스 시드(MVS), 제조자의 작업 바이러스 시드(MWVS) 및 바이러스 채집(VH) 시료에서 전통적으로 확인된 에세이지만, 이는 수많은 수동 피펫팅 단계들과 관련된 노동-집약적 방법이고, 반복적인 운동 손상 위험을 분석자에게 준다. 또한, 이는 수동 현미경 CPE 해독을 사용하여 분석자 당 테스트일 당 3개의 테스트로 에세이 작업 처리량을 제한한다. 플레이트-세척 및 수동 피펫팅 단계의 자동화 및 수동 현미경적 해독을 CPE의 MTT 염료에 기초한 탐지로 대체한 것은 인플루엔자 바이러스 1가에 대한 반자동 TCID50 효능 에세이의 발전을 일으킬 수 있다. 1가 물질을 테스트하기 위한 반자동 에세이의 실행은 선택적으로 에세이 작업 처리량을 2-3배 증가시키고, 시장을 위하여 예상된 수준의 용량에서 FluMist™과 같은 백신의 실제적인 상업화를 허용한다. 추가적인 잇점은 품질 관리 분석자들을 위한 반복적인 운동 손상의 위험성 감소이다.
반자동 에세이는 하나의 군에서 4.2-9.3 log10TCID50/mL의 타이터 범위에서 바이러스 물질의 에세이를 위하여 반복성, 실내 재현 정밀성, 선형성 및 정확성을 나타내는 것으로 확인되었다. 에세이는 또한 또 다른 군과의 실험실간 재현성을 나타내는 것으로 확인되었다.
하나의 Type A 및 하나의 Type B 인플루엔자 균주의 반복된 효능 측정을 위하여, 반자동 에세이 및 수동 에세이 모두를 사용하여 얻어진 결과의 상세한 통계적 비교는 또한 두 에세이가 동등하다고 할만한 결과를 산출한다는 것을 나타내었다. 따라서, 반자동 에세이는 확장된 야생형 인플루엔자, FluMist™ 마스터 바이러스 시드(MVS), 제조자의 작업 바이러스 시드(MWVS) 및 바이러스 채집(VH) 시료들의 효능 측정에 사용되기 위하여 수동 에세이에 필적할만한 것으로 나타난다.
반자동 TCID 50 에세이에서 CPE 의 보편적인 컷오프 수치
본원의 또 다른 구체예에서 TCID50 에세이의 다른 변화 및 변형들이 백신/바이러스의 효능을 측정하기 위하여 사용된다. 그러한 변형 하나는 인플루엔자 바이러스 1가의 TCID50 반자동 효능 에세이를 위하여 CPE의 평가를 위한 보편적인 컷오프 수치의 확인이다. "인플루엔자 바이러스 1가를 위한 반자동 TCID50 효능 에세이"(상기 참조)는 살아 있는 세포 염료 MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드)를 사용하여 MDCK 세포의 감염된 단일층에서 세포변성 효과(CPE)를 채점한다. CPE 양성 웰의 수를 탐지하는 MTT 비색 종점을 이용하여 신뢰성있게 바이러스 효능 수치를 측정하기 위하여, 재현성 있게 CPE 양성 웰과 CPE 음성 웰을 구별하는 흡광도 컷오프 수치를 확립하는 것이 유용하다. 본 발명자들의 다른 작업에서 기술된 바와 같이, 0.5254의 "보편적인 컷오프" 흡광도(A570) 수치가 결정되었다. "인플루엔자 바이러스 1가의 반자동 TCID50 에세이"에서, 웰은A570<0.5254인 흡광도 수치를 가지면 CPE 양성으로 간주된다; CPE 음성 웰은 A570>0.5254인 흡광도 수치를 갖는다.
이 부분에서 요약된 자료는 이전에 결정된 보편적인 컷오프 수치를 확인한다. 저온 적응된 인플루엔자 균주, A/New Caledonia/20/99(type A/H1N1), A/Sydney/05/97(type A/H3N2) 및 B/Yamanashi/166/98(type B)의 광범위한 테스트는 보편적인 컷오프 할당을 위한 자료의 강화를 가져올 뿐 아니라 분석자 및 도구 간의 비교를 허용한다. 여기에서 제시된 자료는 반자동 TCID50 에세이의 강건함, 재현성 및 신뢰성을 실증하고, 확인된 수동 효능 에세이에 대한 동등성을 실증한다. 따라서 구체예들의 강점을 설명하는 것은 이러한 측정들을 포함한다.
앞서 설명한 바와 같이, 중앙값 조직 배양 감염 용량(TCID50) 에세이는 세포살상 비리온의 효능을 측정하는 세포에 기초한 에세이이다. 바이러스 시료의 순차적 희석물을 96-웰 플레이트에서 성장시킨 마딘-다비(Madin-Darby) 개 신장(MDCK) 세포의 융합성 단일층에 가한다. MDCK 세포에서 바이러스의 복제는 세포의 대사에 영향을 미치고, 궁극적으로 자손 바이러스의 배양 상층액으로의 방출 및 세포의 죽음을 일으킨다. 차례로 자손 바이러스는 다른 세포를 감염시켜서 단일층의 궁극적인 파괴를 야기한다. 감염으로 인한 세포 살상 효과(CPE)는 6일의 인큐베이션 기간 동안 발생되게 된다. 이 기간 후에, MTT가 세포 단일층에서 CPE의 존재 또는 부재를 탐지하기 위하여 사용된다. MTT와 같은 필수적인 염료가 세포에 기초한 바이오에세이에서 세포의 죽음 및 생존의 표시자로서 광범위하게 사용되어 왔다(Denizot et al., J. Immun . Methods(1986) 89:271-277; Gerlier et al., (1986) J. Immuno . Methods 94:57-63, Heeg, et al., J. Immuno Methods(1985) 77:237-246, Mooseman J. Immuno . Methods(1983) 65:55-63, Tada, et al., J. Immuno . Methods(1986) 93:147-165, 및 Vistica, Cancer Research(1991) 51: 2515-2520 참조). 살아있는 세포(CPE-음성)의 완전한 단일층을 포함하는 웰은 염료를 자줏빛 포르마잔 염료 생성물로 만들고 570nm(A570)에서 높은 흡광도 수치를 산출해낸다. 반대로, CPE-양성 웰은 바이러스에 의하여 야기된 부분적 또는 완전한 단일층 파괴 때문에 낮은 흡광도 수치로 표지된다. 바이러스 효능 수치를 CPE-양성 웰의 수를 탐지하는 비색 종점을 이용하여 신뢰성 있게 측정하기 위하여 CPE-양성과 CPE-음성 웰을 재현성 있게 구별하는 흡광도 컷오프 수치를 확립하는 것이 유용하다. 보편적인 컷오프 수치와 결합되어 사용되어서, 바이러스 테스트 시료로부터 얻은 흡광도 수치는 CPE-양성 또는 CPE-음성으로 채점된다. CPE-양성 웰의 수는 바이러스 타이터(log10 TCID50/mL)를 계산하기 위하여 사용된다.
본 발명자들 및 공동 작업자들에 의한 작업은 3개의 인플루엔자 바이러스 균주로 다수의 분석자에 의한 다수 일에 걸쳐 수행된 두개의 연구에 기초하여 보편적인 컷오프 수치의 초기 권장안을 제공한다. 기술된 바와 같이, 웰은 A570<0.5254인 흡광도 수치를 가지면 CPE 양성으로 간주되었다; CPE 음성 웰은 A570≥0.5254인 흡광도 수치를 가졌다. 현재 부분은 이전에 결정된 흡광도 컷오프 수치를 확인하기 위하여 고안된 추가적인 실험을 기술한다. 두개의 독립적인 에세이 군으로부터 다수의 분석자들은 반자동 TCID50 에세이를 이용하여 3개의 참조 바이러스 균주의 효능을 측정하였다. 기술된 바와 같이, 확인된 현미경적 검사의 수동 방법에 의하여 평가된 CPE는 "골드 스탠다드(gold standard)"로 간주되었고 MTT에 의하여 측정된 CPE와 비교되었다. A/New Caledonia/20/99(type A/H1N1), A/Sydney/05/97(type A/H3N2) 및 B/Yamanashi/166/98(type B)의 광범위한 테스트는 보편적인 컷오프 할당을 위한 자료의 강화를 가져왔을 뿐 아니라 분석자 및 도구 간의 비교를 허용하였다. 여기에서 제시된 자료는 반자동 TCID50 에세이의 강건함, 재현성 및 신뢰성을 실증하고, 확인된 수동 효능 에세이에 대한 동등성을 실증한다.
반자동 효능 에세이의 개발은 확인된 수동 효능 에세이를 이용하여 이전에 측정된 공지의 효능 수치를 갖고 참조 바이러스 균주를 사용하는 것을 요구했다. 참조 저온-적응된 바이러스 균주는 다음과 같았다: A/New Caledonia/20/99, type A/H1N1 바이러스; A/Sydney/05/97, type A/H3N2 바이러스; B/Yamanashi/166/98, type B 바이러스. 저온-적응된 대조군 바이러스 균주, A/Sydney/05/97이 시스템 적합성을 확인하기 위하여 사용되었다.
하프-플레이트 복제물을 위한 전체적인 에세이 배치, 시각적인 CPE 채점 방법 뿐만 아니라, 인플루엔자 1가의 반자동 TCID50 효능 에세이를 위한 방법이 본 발명자 및 공동 작업자들에 의하여 개발되었다. 상기한 바를 참조하라. 간략하게, 96-웰 플레이트에서 MDCK 세포의 융합성 단일층이 Skatron™ 세포 세척기를 사용하여 바이러스 성장 배지(VGM)로 2회 세척된다. 바이러스 시료의 순차적인 10배 희석물들이 MatrixTM SerialMate 피펫팅 스테이션 및 96-웰 희석 블록들을 이용하여 TPCK-트립신을 함유하는 VGM에서 제조된다. 최종 5 개의 순차적인 희석물(10-5 내지 10-9)이 MDCK 세포 플레이트로 이동되어 초기 출발 타이터에 비하여 10-6 내지 10-10 범위의 최종 바이러스 농도를 얻는다. 이러한 포맷은 각 플레이트로부터 두개의 효능 자료점을 유도한다. 각 시료가 두개의 플레이트 상에서 에세이되기 때문에, 4개의 복제 효능 수치가 얻어진다. 16개의 대조군 웰(플레이트 컬럼 6 및 7)은 바이러스가 없는 VGM을 수용하여 세포 대조군으로 기능한다. 6일의 인큐베이션(5±1% CO2를 갖고 33±1℃) 후에 모든 웰을 현미경으로 검사하고 CPE의 존재 또는 부재를 위하여 채점하였다. 따라서, 단일층이 바이러스 파괴의 임의의 증거를 포함하였다면 웰은 CPE-양성으로 채점된다. 반대로, CPE-음성 세포에서의 단일층은 완벽하게 완전하였다.
CPE를 위하여 플레이트 위에서 단일층을 시각적으로 채점한 후에, 배지를 버리고 인산완충 식염수에서 제조된 MTT(0.5mg/mL),(US Biochemical Corporation, Cleveland, OH)를 각 웰에 분배한다(100μL/웰). 단일층은 MTT와 같이 6±0.5시간 동안 5±1%의 CO2를 갖는 37±1℃에서 인큐베이션된다. 가용화 버퍼(0.01N HCl에서의 20% SDS의 100μL)가 각 웰에 가해지고 플레이트는 16 내지 20시간 동안 5±1%의 CO2 환경의 37±1℃에서 인큐베이션된다. 570nm에서의 흡광도 수치는 PerkinElmer-Wallac 1420 멀티레이블 카운터 스펙트로포토미터를 이용하여 측정되고 MicrosoftTM 엑셀 매크로로 이출되었다; CPE-양성 세포의 수로부터 바이러스 타이터(log10 TCID50/mL)을 계산하기 위하여 사용된 프로그램.
허용 기준이 이 부분 내에서 구체예에 적용된다. 따라서, 각 플레이트 위의 16개의 세포 대조군 웰 중 하나 이하가 CPE, 세포 독성 또는 미생물 오염의 시각적 증거를 나타내었다면, 플레이트가 유효한 것으로 간주되었다. 또한, 각 하프-플레이트가 유효한 것은 5개 이상 36개 웰 이하가 CPE-양성으로 채점되어야 하였다. 최종적으로, 1가 바이러스 대조군 시료(A/Sydney/05/97)를 위하여 얻어진 4개의 복제 TCID50 타이터 수치의 평균 및 표준 편차(SD) 모두가 검정받은 대조군 증명에서 보고된 검정된 범위 내이어야 하였다.
민감성 및 특이성의 예측값을 이하에서 나타낸 "골드 스탠다드" CPE 및 MTT-평가된 CPE 간의 관계에 기초하여 계산하였다. TP는 "진정 양성"을 나타내고, FP는 "거짓 양성"이고, FN은 "거짓 음성"이며, TN은 "진정 음성"이다. 따라서, "모든 양성"은 TP+FN의 합계이고, "모든 음성"은 FP+TN의 합계일 것이다. 표 55를 참조하라. 각 복제물의 민감성 = (TP)/(모든 CPE 양성) 및 각 복제물의 특이성 = (TN)/(모든 CPE 음성)으로 계산된다.
도구에 도구 비교를 수행하게 하기 위하여, 6명의 분석자가 제1군에서 반자동 TCID50 에세이를 이용하여 3개의 참조 바이러스 시료를 위하여 효능 수치를 측정하였다. 두 세트의 실험실 도구, AZ-039 및 AZ-040이 3일에 걸쳐 사용되었다. 테스터들의 제2군은 하나의 도구 시스팀 AZ-036을 사용하였다. 그 군으로부터 3명의 분석자들이 반자동 TCID50 에세이를 3개의 참조 바이러스 시료를 사용하여 3일 수행하였다.
분석자에게 분석자 비교를 수행하기 위하여, 1군에서 테스트하는 각 분석자들(분석자 #1-6)이 3일에 걸쳐 도구 AZ-039를 사용하여 3개의 참조 균주에 대하여 반자동 TCID50 효능 에세이를 수행하였다. 제2군에서, 3명의 분석자들 각각이(분석자 #7-9) 3일에 걸쳐 도구 AZ-036을 사용하여 동일한 3개의 참조 균주로 반자동 TCID50 효능 에세이를 수행하였다.
MTT를 이용한 반자동 TCID50 효능 에세이에서 CPE-양성 및 CPE-음성 웰을 신뢰성 있게 구별하기 위하여, 보편적인 컷오프 수치가 통계적으로 결정되었다. 이러한 컷오프 수치의 사용을 확인하기 위하여, 두 군에 의한 추가의 독립적인 평가가 추가적인 45,840 흡광도 수치를 발생시켰다. 결과는 이하에 제시한다.
민감성 및 특이성 측정을 참조 스탠다드처럼 수동 현미경적 방법을 이용하여 계산하였다. 두 군(n=45,840)으로부터 조합된 자료를 표 56에 나타낸다. 0.5254의 권장 컷오프 수치를 사용하여 98.45%의 민감성 및 99.12%의 특이성을 초래하였다. 또한, 민감성 및 특이성 측정을 위한 제2군으로부터 얻은 자료는 각각 99.15% 및 99.99%이었다. 마찬가지로, 민감성 및 특이성을 위한 제1군으로부터 얻은 자료는 각각 98.13% 및 98.71%이었다. 상기 모든 자료(>95% 민감성 및 >95% 특이성)는, 99.05%의 민감성 및 99.99%의 특이성이 측정된 측정 자료와 상관관계가 있다.
도 51은 수치들의 빈도(N=45,840)에 대하여 흡광도 해독값을 플롯하여 유도된 히스토그램을 나타낸다. 이전의 정보와 일치하여, 두 군으로부터 조합된 자료는 0.5254의 보편적인 컷오프 수치가 CPE-양성 및 CPE-음성 웰의 분포 간의 중간지점 근처에 있다는 것을 나타낸다. 빈도 분포는 권장된 컷오프 수치가 대조군 웰의 분포에서 가장 왼쪽 꼬리에 있다는 것을 나타내는데, 이는 왼쪽으로 연장된 꼬리에서 0.007%의 가능성에 대응된다. 컷오프 수치, 0.5254는 또한 컷오프 수치를 모든 CPE-양성 웰로부터의 흡광도 수치를 이용하여 예측하였을 때, 0.02%의 꼬리 가능성에 대응된다. 게다가, 도 51에 명시된 분포 프로파일은 CPE-양성 웰을 위한 흡광도 수치가 CPE-음성 웰을 위한 흡광도 수치로부터 넓게 분리되어 있다는 것을 강조한다.
CPE-음성 대조군 웰을 위하여 얻은 평균 흡광도 수치의 비교는 이전에 행해진 6720 대조군 웰로부터의 흡광도 수치에 기초하여 0.5254의 예측된 컷오프 수치를 발생시켰다. 대조군 웰로부터 얻은 1.261의 평균 흡광도 수치는 0.15의 표준편차를 가지고 얻어졌다. 표 57에 나타낸 바와 같이, 현재 연구는 추가적인 9168개의 대조군 웰을 발생시켰다; 2880개는 제2군으로부터 얻었고, 6288개는 제1군으로부터 얻었다. 1.226 및 1.235의 평균 흡광도 수치를 1.231의 전체적인 평균 흡광도 수치를 가지고, 제2군 및 제1군 각각으로부터 얻었다. 조합된 평균 흡광도 수치와 이전에 보고된 것과의 차이는 단지 0.03 흡광도 수치이었다(표 57 참조). 이는 자료가 6개월에 걸쳐 발생되었다는 것을 고려할 때 매우 작은 차이이다. 이전에 기술된 연구들은 연속 2달에 걸쳐 수행되었던 반면에, 여기에 기술된 연구들은 제1군에 의하여 행해지기에 4달 앞서서 제2군에서 수행되었다.
표 58은 도구가 도구 비교를 수행하기 위하여 2군에서 상이한 도구를 사용하여 3개의 참조 바이러스 균주에 대하여 얻어진 효능 수치를 요약한다. 제1군으로부터 6명의 분석자가 두 세트의 도구(AZ-039 및 AZ-040으로 지정된)를 사용하여, 반자동 TCID50 에세이를 수행하였다. A/New Caledonia/20/99에 대하여 전체 평균은 9.2 내지 9.3 log10 TCID50/mL 범위였고 타이터는 AZ-039와 AZ-040간에서 0.09 log10 TCID50/mL이상으로 변화하지는 않았다(표 58 참조). A/Sydney/05/97에 대하여 전체 평균은 8.5 내지 8.6 log10TCID50/mL 범위였고, AZ-039와 AZ-040간에서 0.02 log10 TCID50/mL이상으로 변화하지는 않았다. B/Yamanashi/166/98에 대하여 전체 평균은 8.3 내지 8.4 log10 TCID50/mL 범위였고 AZ-039와 AZ-040간에서 0.12 log10 TCID50/mL이상으로 변화하지는 않았다. 제2군은 하나의 도구 시스템(AZ-036)을 사용한 결과를 산출하였다. 세명의 분석자가 3개의 참조 바이러스 시료로 반자동 TCID50 에세이를 3일 수행하였다. 제2군 및 품질 관리 실험실에서 도구들간의 평균 차이의 결과는 A/New Caledonia/20/99에서 0.09 log10TCID50/mL, A/Sydney/05/97에서 0.08 log10TCID50/mL, B/Yamanashi/166/98에서 0.12 log10 TCID50/mL 이상으로 변화하지는 않았다. 제1군에서 두 도구(AZ-039 및 AZ-040) 사이 및 제1군과 제2군(AZ-036)사이의 평균 차이 자료가 계산되었다.
분석자들이 분석자 비교를 하기 위하여, 제1군에서 각 분석자(분석자 1 내지 6)이 A/New Caledonia/20/99, A/New Sydney/05/97, 및 B/Yamanashi/166/98에 대하여 3일에 걸쳐 도구 AZ-039상에서 반자동 TCID50 효능 에세이를 수행하였다. 제2군에서, 3명의 분석자 각각이(분석자 7 내지 9) 동일한 바이러스 균주로 3일에 걸쳐 도구 AZ-063상에서 반자동 TCID50 효능 에세이를 수행하였다. 효능 수치는 각 바이러스에 대하여 계산되었고 표 59에 나타낸다. 제1군의 결과들 간의 변화는 테스트된 3개의 바이러스 시료에 대하여 0.3 log10TCID50/mL이하였다. 유사하게, 제2군의 효능 수치 간의 변화는 0.2 log10TCID50/mL이하였다. 두 군의 분석자들 사이의 전체적인 비교는 3개의 참조 바이러스 시료에 대하여 ±0.3 log10TCID50/mL 미만이었다. 테스트 결과(3일에 걸쳐 테스트된 4개의 복제물)의 표준편차(SD)는 0.11 내지 0.27 범위였다. SD 수치가 0.50의 허용 기준 미만이었기 때문에, 모두 유효하였다.
이 부분에서 제공된 결과는 "보편적인 컷오프" 흡광도 수치(0.5254)를 확인한다. 비교적 긴 기간에 걸쳐서 독립적인 에세이 군에서 다수의 분석자들에 의하여 산출된 것임에도 불구하고 연구가 강력하게 일치하는 자료를 생산하기 때문에, 보편적인 컷오프 수치에 고도의 신뢰성이 있다. 요약하면, 두 군에서 산출된 대조군(CPE-음성) 흡광도 수치는 서로 일치할 뿐만 아니라, 이전에 보고된 평균 수치와 사실상 동일하였다(표 57 참조). 민감성 및 특이성 수치는 두 군 사이에 매우 유사하였고; 이전의 작업과 일치하였다(도 51 및 표 57). 두 군에서, CPE를 평가하기 위하여 MTT를 이용하는, 반자동 TCID50 효능 에세이를 위한 "보편적인 컷오프"는 서로 그리고 확인된 수동 TCID50 효능 에세이에 의하여 얻어진 것과 동등할만한 효능 수치를 생산하였다. 결국, 반자동 시스템은 수동 방법에 비하여 다수의 절차적 잇점을 갖는다. 수동적인 피펫팅과 에세이 플레이트를 현미경적으로 검사하는 것의 노동집약적 단계를 대체하는 도구화의 이용은 능력을 증가시켜서 높은 작업 처리량을 허용한다. 또한, 분광광도적 CPE 해독 및 이후의 자동화된 효능 계산은 결과의 출력 및/또는 전자적 기록을 제공한다.
정의
달리 정의하지 않는 한, 모든 과학적 용어 및 기술적 용어는 이들이 속하는 분야에서 일반적으로 사용되는 것과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해해야 한다. 본 발명의 목적을 위해, 하기 용어들은 하기와 같이 정의된다.
"핵산", "폴리뉴클레오타이드", "폴리뉴클레오타이드 서열" 및 "핵산 서열" 이라는 용어는 단일 스트랜드 또는 이중 스트랜드의 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 중합체, 또는 이의 키메라 또는 유사체를 지칭한다. 본 명세서 사용된 상기 용어는 임의로 이들이 천연 생성 뉴클레오티드(예, 펩티드 핵산)과 유사한 방식으로 단일 스트랜드 핵산에 하이브리드화하는 천연 뉴클레오티드의 필수 성질을 갖는 천연 생성 뉴클레오티드의 유사체의 중합체를 포함한다. 달리 명시하지 않는 한, 특정 핵산 서열은 임의로 상기 명백한 서열 이외에, 상보 서열을 포함한다.
"유전자"라는 용어는 생물적 기능과 관련된 임의의 핵산을 지칭하는 데에 널리 사용된다. 따라서, 유전자는 이들의 발현에 필요한 코딩 서열 및/또는 조절 서열을 포함한다. "유전자"라는 용어는 유전자 서열에 의해 엔코딩된 cDNA 또는 mRNA 뿐 아니라, 특정 유전자 서열에도 적용된다.
유전자는 또한 예컨대, 기타 단백질의 인지 서열을 형성하는 비발현 핵산 세그먼트를 포함한다. 비발현 조절 서열은 전사 인자와 같은 조절 단백질이 결합하여 인접한 또는 가까운 서열의 전사를 일으키는 "촉진자" 및 "증강인자"를 포함한다. "조직 특정" 촉진자 또는 증강인자는 특정 조직 유형 또는 세포 유형 또는 유형들 중 전사를 조절하는 것이다.
"벡터"라는 용어는 핵산이 유기체, 세포 또는 세포 성분 사이에 증식 및/또는 전달될 수 있는 수단을 지칭한다. 벡터는 자율 복제되거나 숙주 세포의 염색체로 통합될 수 있는 플라스미드, 바이러스, 박테리오파지, 프로바이러스, 파게미드, 트랜스포손 및 인공 염색체 등을 포함한다. 벡터는 또한 자율 복제되지 않는 동일 스트랜드내의 DNA 및 RNA, 폴리-리신-컨쥬게이트된 DNA 또는 RNA, 펩티드-컨쥬게이트된 DNA 또는 RNA, 리포좀-컨쥬게이트된 DNA 등으로 이루어진 네이키드(naked) RNA 폴리뉴클레오타이드, 네이키드 DNA 폴리뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 더욱 일반적으로, 본 명세서에서 벡터는 플라스미드를 지칭한다.
"발현 벡터"는 벡터에 혼입된 핵산의 복제 뿐 아니라, 발현을 촉진할 수 있는 플라스미드와 같은 벡터이다. 통상적으로, 발현되는 핵산은 촉진자 및/또는 증강인자에 "실시가능하게 결합"되고, 촉진자 및/또는 증강인자에 의해 전사 조절 제어를 받는다.
"이방향 발현 벡터"는 발현이 양쪽 방향으로 개시될 수 있어서 예컨대, 양쪽 플러스(+) 또는 센스 스트랜드, 및 네거티브(-) 또는 안티센스 스트랜드 RNA의 전사를 일으키도록, 2개의 촉진자 사이에 위치한 핵산에 대해 반대 방향으로 배향된 2개의 대체 촉진자에 특징이 있다.
본 발명의 명세서에서, "분리된다"라는 용어는 천연 생성 환경에서 일반적으로 동반하거나 상호작용하는 성분들이 실질적으로 존재하지 않는, 핵산 또는 단백질과 같은 생물학적 물질을 지칭한다. 분리된 물질은 임의로 자연 환경, 예컨대, 세포내 물질에서 발견되지 않는 물질을 포함한다. 예컨대, 물질이 세포와 같은 자연 환경에 놓여 있을 경우, 물질은 그러한 환경에서 발견되는 물질에 고유하지 않은 세포내 위치(예, 게놈 또는 유전자 원소)에 위치한다. 예컨대, 천연 생성 핵산(예, 코딩 서열, 촉진자, 증강인자 등)은 이것이 핵산에 고유하지 않는 게놈의 로커스(예, 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 벡터, 또는 앰플리콘)에 비천연 생성 수단에 의해 도입된 경우 분리된다. 이러한 핵산을 "이종 유래" 핵산으로도 지칭한다.
"재조합"이라는 용어는 물질(예, 핵산 또는 단백질)이 인공적으로 또는 합성적으로(비천연적으로) 변경된 것을 지칭한다. 이 변경은 자연 환경 또는 상태에서 물질 상에 수행될 수 있거나, 자연 환경 또는 상태로부터 제거될 수 있다. 특히, 바이러스를 지칭할 경우, 재조합 핵산의 발현에 의해 제조된 경우, 인플루엔자 바이러스는 재조합체이다.
바이러스를 지칭할 경우 "재배열(reassortant)"라는 용어는, 바이러스가 하나 이상의 부모 바이러스 스트랜드 또는 공급원으로부터 유래한 유전자 성분 및/또는 폴리펩티드 성분을 포함하는 것을 지칭한다. 예컨대, 7:1 재배열은 제1 부모 바이러스로부터 유래한 7개의 바이러스 게놈 세그먼트(또는 유전자 세그먼트), 및 제2 부모 바이러스 유래의 단일 상보 바이러스 게놈 세그먼트, 예컨대, 엔코딩 적혈구 응집소 또는 뉴라미니다제를 포함한다. 6:2 재배열은 제1 부모 바이러스 유래의 6개의 게놈 세그먼트, 가장 일반적으로 6개의 내부 유전자, 및 상이한 부모 바이러스 유래의 2개의 상보 세그먼트, 예컨대, 적혈구 응집소 및 뉴라미니다제를 포함한다.
이종 유래 또는 분리된 핵산을 지칭할 경우 "도입된다"라는 용어는 핵산이 세포의 게놈(예, 염색체, 플라스미드, 플라스티드 또는 미토콘드리아 DNA)에 혼입될 수 있거나, 자율 복제단위로 전환될 수 있거나, 또는 일시적으로 발현될 수 있는(예, 형질감염 mRNA) 진핵 세포 또는 원핵 세포로의 핵산의 혼입을 지칭한다. 이 용어는 "감염", "형질감염", "형질전환" 및 "형질도입"과 같은 방법을 포함한다. 본 발명의 명세서에서, 전기 천공, 인산칼슘 침전, 지질 매개 형질감염(리포펙션: lipofection) 등을 비롯한 다양한 방법들이 핵산의 원핵 세포로의 도입에 이용될 수 있다.
"숙주 세포"라는 용어는 벡터와 같은 이종 유래 핵산을 포함하고, 핵산의 복제 및/또는 발현을 지지하는 세포를 의미한다. 숙주 세포는 이. 콜리와 같은 원핵 세포, 또는 효모와 같은 진핵 세포, 곤충 세포, 양서류 세포, 조류 세포 또는 인간 세포를 비롯한 포유동물 세포일 수 있다. 본 발명의 명세서에서 예시적인 숙주 세포는 베로(Vero: 아프리카 녹색 원숭이 신장) 세포, BHK(유아 햄스터 신장) 세포, 1차 병아리 신장(PCK) 세포, MDCK(Madin-Darby Canine Kidney) 세포, MDBK(Madin-Darby Bovine Kidney) 세포, 293 세포(예, 293T 세포) 및 COS 세포(예, COS1, COS7 세포)를 포함한다.
인플루엔자 바이러스
본 명세서의 조성물 및 방법은 우선 백신용 인플루엔자 바이러스의 제조과 관련된다. 인플루엔자 바이러스는 분절된 단일 스트랜드의 RNA 게놈을 함유하는 내부 리보핵산단백 핵과 매트릭스 단백질에 의해 결합된 외부 지질단백 외피로 이루어진다. 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B 바이러스는 각각 8개 세그먼트의 단일 스트랜드의 네거티브 센스 RNA를 함유한다. 인플루엔자 A 게놈은 11개의 폴리펩티드를 엔코딩한다. 세그먼트 1-3은 RNA-의존성 중합 효소를 구성하는 3개의 폴리펩티드를 엔코딩한다. 세그먼트 1은 중합효소 컴플렉스 단백질 PB2를 엔코딩한다. 나머지 중합 효소 단백질 PB1 및 PA는 세그먼트 2 및 세그먼트 3에 의해 각각 엔코딩된다. 또한, 일부 인플루엔자 스트랜드의 세그먼트 1은 PB1 코딩 구역내 대체 해독 프레임으로부터 제조된 소단백질 PB1-F2를 엔코딩한다. 세그먼트 4는 감염 중 세포 부착 및 출입에 관련된 적혈구 응집소(HA) 표면 글리코프로테인을 엔코딩한다. 세그먼트 5는 바이러스 RNA에 관련된 주된 구조 성분인 뉴클레오캡시드 뉴클레오프로테인(NP) 폴리펩티드를 엔코딩한다. 세그먼트 6은 뉴라미니다제(NA) 외피 글리코프로테인을 엔코딩한다. 세그먼트 7은 상이하게 스플라이스된 mRNA로부터 해독된 M1 및 M2로 명명된 2개의 매트릭스 단백질을 엔코딩한다. 세그먼트 8은 대체 스플라이스된 mRNA 변이체로부터 해독된 2개의 비구조화 단백질인 NS1과 NS2를 엔코딩한다.
인플루엔자 B의 8개의 게놈 세그먼트는 11개의 단백질을 엔코딩한다. 3개의 가장 큰 유전자는 RNA 중합 효소, PB1, PB2 및 PA 성분을 코딩한다. 세그먼트 4는 HA 단백질을 엔코딩한다. 세그먼트 5는 NP를 엔코딩한다. 세그먼트 6은 NA 단백질 및 NB 단백질을 엔코딩한다. 양쪽 단백질 NB 및 NA는 양시트론성(biscistronic) mRNA의 오버랩핑 해독 프레임으로부터 해독된다. 인플루엔자 B의 세그먼트 7은 또한 2개의 단백질인 M1 및 BM2를 엔코딩한다. 가장 작은 세그먼트는 전장 RNA로부터 해독된 NS1 및 스플라이스된 mRNA 변이체로부터 해독된 NS2의 2개의 생성물을 엔코딩한다.
인플루엔자 바이러스 백신
역사적으로, 인플루엔자 바이러스 백신은 관련 스트랜드의 실험적 예측을 기준으로 하여 선택된 바이러스의 스트랜드를 이용하여 발육 달걀에서 우선 제조되었다. 더욱 최근에, 재배열 바이러스는 입증된 약독화 온도 민감성 마스터 스트랜드의 견지에서 선택된 적혈구 응집소 및 뉴라미니다제 항원을 혼입하여 제조되었다. 달걀에서 여러번 통과시켜 바이러스를 배양한 후, 인플루엔자 바이러스를 회수하고, 임의로 포름알데히드 및/또는 β-플로피오락톤을 이용하여 비활성화시킨다(또는 대안으로 생 약독화 백신에서 사용됨).
그러나, 이러한 방법으로 인플루엔자 백신을 제조하는 것은 몇 가지 중요한 문제 가 있다. 예컨대, 달걀로부터 남겨진 오염물은 높은 항원성 및/또는 발열성을 가질 수 있고, 이는 종종 투여시 유의적인 역효과를 일으킬 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 한 구체예는 에그 성분의 일부를 동물성 없는 배지로 대체하는 것을 포함한다. 더욱 중요하게는, 백신 제조를 위해 지정된 바이러스 스트랜드는 통상적으로 인플루엔자 백신의 제조와 비활성화를 위한 시간을 두기 위해 다음 플루 시기 몇 달 전에 선택되고 분배되어야 한다. 또한, 따라서 예컨대, 본 발명의 방법과 조성물의 이용을 통한 제조 기간의 임의의 개선이 매우 요망된다.
세포 배양물에서 재조합 및 재배열 백신을 제조하려는 시도는 백신 제조를 위해 승인된 일부 스트랜드가 표준 세포 배양 조건 하에서 효율성을 높일 수 없기 때문에 방해를 받는다. 따라서, 본 발명자들 및 이들의 동료에 의한 선행 작업은 벡터 시스템, 및 배양물 중에서 재조합 및 재배열 바이러스를 제조하기 위한 방법을 제공하여, 하나 또는 다수의 선택된 바이러스의 항원 스트랜드에 상응하는 백신을 빠르게 제조할 수 있도록 하였다. 상기 기재한 문헌[Multi-Plasmid System for the production of Influenza virus] 참조. 물론, 이러한 재배열은 임의로 달걀에서 더 증폭된다. 통상적으로, 배양물은 온도가 35℃를 초과하지 않기 위해 항온기와 같은 온도 조절기를 이용하여, 일정한 온도에서, 제어된 습도 및 CO2 하에, 세포 배양 배양기와 같은 시스템에서 유지시킨다. 기타 백신 제조 뿐 아니라, 이러한 도전적인 작업은 전체로 또는 부분적으로 본 발명을 이용하여 더욱 최적화되고 능률화될 수 있다.
재배열 인플루엔자 바이러스는 목적하는 스트랜드(예, 목적하는 항원 변이체)로부터 유래한 상보 세그먼트와 조합하여 마스터 인플루엔자 바이러스의 게놈 세그먼트에 상응하는 벡터의 아집단을 도입함으로써 용이하게 얻을 수 있다. 통상적으로, 마스터 스트랜드는 백신 투여에 대한 바람직한 특성을 기준으로 하여 선택된다. 예컨대, 백신 제조, 예컨대, 생 약독화 백신의 제조를 위해, 마스터 도너 바이러스 스트랜드는 약독화 표현형, 추위 적응 및/또는 온도 민감성에 대해 선택될 수 있다.
FluMist TM
상기 언급한 바와 같이, 인플루엔자 백신의 다수의 예 및 유형이 존재한다. 예시적인 인플루엔자 백신은 인플루엔자 질환으로부터 어린이와 어른을 보호하는 생 약독화 백신인 FluMistTM이다[문헌들(Belshe et al.(1998) The efficacy of live attenuated, cold - adapted , trivalent , intranasal influenza virus vaccine in children N. Engl . J. Med . 338: 1405-12; Nichol et al.(1999) Effectiveness of live, attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy , working adults: a randomized controlled trial JAMA 282: 137-44) 참조]. 통상적인 구체예에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 바람직하게는 FluMistTM 백신의 제조에 적용되거나 또는 FluMistTM 백신의 제조에 사용된다. 그러나, 당업자는 본 명세서의 단계/조성물은 동일하거나 또는 심지어 상이한 바이러스 백신의 제조에도 적용될 수 있음을 이해할 것이다.
FluMistTM 백신 스트랜드는 예컨대, 백신이 일반 마스터 도너 바이러스(MDV) 유래의 6개의 유전자 세그먼트인 PB1, PB2, PA, NP, M 및 NS를 따라 주재하는 야생형 스트랜드로부터 유래한 HA 및 NA 유전자 세그먼트를 함유한다. FluMist의 인플루엔자 A 스트랜드용 MDV(MDV-A)를 연속 저온에서 1차 치킨 신장 조직 배양물에서 야생형 A/Ann Arbor/6/60(A/AA/6/60) 스트랜드를 연속 통과시켜 생성시켰다[문헌(Maassab(1967) Adaptation and growth characteristics of influenza virus at 25 degrees C Nature 213: 612-4) 참조]. MDV-A는 25℃에서 효율적으로 복제되었으나(ca, 추위 적응), 이의 성장은 38℃ 및 39℃로 제한되었다(ts, 온도 민감성). 또한, 이 바이러스는 감염된 흰족제비의 폐에서는 복제되지 않았다(att, 약독화). ts 표현형은 기도의 가장 차가운 구역을 제외하고 모든 구역에서 이의 복제를 제한함으로써 인간내에서 백신의 약독화에 기여하는 것으로 여겨진다. 이 특성의 안정화는 동물 모델 및 임상 연구에서도 증명되었다. 화학 돌연변이에 의해 생성된 인플루엔자 스트랜드의 ts 표현형과는 대조적으로, MDV-A의 ts 특성은 감염된 햄스터를 통해 또는 어린이로부터의 쉐드 분리(shed isolate)에서 다음 통로로 돌아가지 않는다{최근 리뷰를 위해 문헌[Murphy & Coelingh(2002) Principles underlying the development and use of live attenuated cold - adapted influenza A and B virus vaccines Viral Immunol . 15: 295-323] 참조}.
12개의 개별 6:2 재배열 스트랜드와 관련된 20,000명의 어른과 어린이에 대한 임상 연구는 이들 백신이 약독성이 있고, 안전하며, 효능이 있음을 입증하였다[문헌들(Belshe et al.(1998) The efficacy of live attenuated , cold - adapted , trivalent, intranasal influenza virus vaccine in children N. End . J. Med . 338: 1405-12; Boyce et al.(2000) Safety and immunogenicity of adjuvanted and unadjuvanted subunit influenza vaccines administered intranasally to healthy adults Vaccine 19: 217-26; Edwards et al.(l994) A randomized controlled trial of cold adapted and inactivated vaccines for the prevention of influenza A disease J. Infect . Dis . 169: 68-76; Nichol et al.(1999) Effectiveness of live, attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy , working adults: a randomized controlled trial JAMA 282: 137-44) 참조]. 야생형 바이러스의 MDV-A의 6개의 내부 유전자 및 2개의 HA 및 NA 유전자 세그먼트를 운반하는 재배열체(예, 6:2 재배열체)는 일관성있게 ca, ts 및 att 표현형을 유지한다[문헌(Maassab et al.(1982) Evaluation of a cold - recombinant influenza virus vaccine in ferrets J. Infect . Dis . 146: 780-900) 참조]. 그러나, 인플루엔자의 B 스트랜드를 이용하는 이러한 재배열 바이러스의 제조는 더욱 어렵다.
최근의 연구[상기 언급한 문헌(Multi-Plasmid System for the Production of Influenza Virus) 참조]는 전적으로 클론화 cDNA로부터의 인플루엔자 B 바이러스의 생성을 위한 8개의 플라스미드 시스템, 및 비강 투여에 유용한 생 바이러스 백신 제제와 같은 백신 제제에 적합한 생 약독화 인플루엔자 A 및 B 바이러스의 제조를 위한 방법을 제시하였다.
상기 설명한 시스템 및 방법은 FluMist(등록상표)와 같이 비강 투여에 적합한 백신과 같은 생 약독화 백신을 비롯하여, 백신으로서 사용하기에 적합한 바이러스 백신을 비롯한 재조합 및 재배열 인플루엔자 A 및 B 바이러스의 세포 배양물 중의 빠른 제조에 유용하다. 본 명세서에서의 본 발명의 방법은 임의로 더욱 안정되고 일관적이면서 제조적인 방법으로 백신용 바이러스를 제조하기 위한 예컨대, 백신 제조용 재배열 인플루엔자 바이러스와 관련하여 이전의 연구와 결합하여 또는 조합하여 사용된다.
세포 배양물
상기 설명한 바와 같이, 인플루엔자 바이러스는 임의로 세포 배양물에서 성장할 수 있다. 통상적으로, 바이러스의 증식은 숙주 세포가 일반적으로 배양되는 배지 조성물 중에서 달성된다. 인플루엔자 바이러스의 복제에 적절한 숙주 세포는 예컨대 베로 세포, BHK 세포, MDCK 세포, 293T 세포와 COS7 세포를 비롯한 293 세포 및 COS 세포를 포함한다. 일반적으로, 예컨대, MDCK세포 및 293T 또는 COS 세포와 같은 상기한 세포주 중 2개를 포함하는 공동 배양물은 복제 효율을 개선하기 위해 예컨대 1:1의 비율로 사용된다. 통상적으로, 세포는 중성 완충 pH(예, 7.0~7.2의 pH)를 유지하기에 적합한 제어된 습도 및 CO2 농도 하에 혈청(예, 10% 우태아 혈청)으로 보충시킨 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)과 같은 표준 상업 배양 배지 내에서 또는 혈청이 없는 배지 내에서 배양된다. 임의로, 배지는 박테리아 성장을 방지하기 위한 항생제, 예컨대, 페니실린, 스트렙토마이신 등, 및/또는 추가의 영양소, 예컨대, L-글루타민, 나트륨 피루베이트, 비필수 아미노산, 바람직한 성장 특성을 촉진하기 위한 추가의 보충물, 예컨대, 트립신, β-머캅토에탄올 등을 함유한다.
배양물 중 포유동물 세포를 유지하기 위한 처리는 폭넓게 보고되어 있고, 당업자에게는 잘 알려져 있다. 일반적인 프로토콜은 예컨대, 문헌들[Freshney(1983) Culture of Animal Cell : Manual of Basic Technique, Alan R. Liss, New York; Paul(1975) Cell and Tissue Culture, 5th ed., Livingston, Edinburgh; Adams(1980) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Cell Culture for Biochemists, Work and Burdon(eds.) Elsevier, Amsterdam]에 제공된다. 시험관내 인플루엔자 바이러스의 제조에 대한 특정 목적의 조직 배양 절차에 관한 추가 상세 정보는 이를 위해 그 전체를 본 명세서에서 참고로 인용한 예컨대, 문헌[Merten et al.(1996) Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation in Cohen and Shafferman(eds.) Novel Strategies in Design and Production of Vaccines ] 참조. 또한, 본 발명에 적용된 이러한 절차의 변형예는 일상적인 실험을 통해 용이하게 측정되며, 또한 당업자에게 친숙할 것이다.
인플루엔자 바이러스 제조용 세포는 혈청 함유 또는 혈청 비함유 배지 중에 배양될 수 있다. 예컨대, 정제된 바이러스의 제조를 위한 경우와 같은 일부 경우에서, 혈청 비함유 조건에서 숙주 세포를 성장시키는 것이 통상적으로 바람직하다. 세포는 플라스크, 병 또는 반응기 배양물 중에서, 소규모, 예컨대, 25 ml 미만의 배지, 배양관 또는 플라스크에서, 또는 교반하면서 대용량 플라스크내에서 또는 회전자 병내에서 또는 마이크로캐리어 비드(microcarrier bead)(예, 도르마셀, 프페이퍼 앤드 랑겐과 같은 DEAE-덱스트란 마이크로캐리어 비드; 수퍼비드, 플로우 래보러토리즈; 힐렉스, 솔로힐, 앤 아보와 같은 스티렌 공중합체-트리-메틸아민 비드) 상에서 배양될 수 있다. 마이크로캐리어 비드는 세포 배양물의 부피당 접착 세포 성장을 위한 큰 표면적을 제공하는 소형 구(직경 100~200 마이크론)이다. 예컨대, 1 l의 배지는 8000 cm2 이상의 성장 표면을 제공하는 2000만개 이상의 마이크로캐리어 비드를 포함할 수 있다. 예컨대, 백신 제조와 같은 바이러스의 상업적 제조를 위해, 생물반응기 또는 발효통에 세포를 배양하는 것이 종종 바람직하다. 생물반응기는 1 l 이하에서 100 l를 초과하는 부피에 이르는 제품, 예컨대, Cyto3 생물반응기(미국 미네소타주 미네톤카 소재, 오스모닉사 제품; NBS 생물반응기(미국 뉴저지주 에디슨 소재, 뉴 브런스윅 사이언티픽사 제품); B. 브라운 바이오테크 인터내셔널사로부터 구입한 연구 및 상업적 규모의 생물반응기(독일 멜스운젠 소재, B. 브라운 바이오테크사 제품)이 유용하다.
배양물 부피와 관계없이, 본 발명의 다수의 바람직한 구체예에서, 온도 의존성 멀티 플라스미드 시스템을 이용하여[상기 언급한 문헌(Multi-Plasmid System for the Production of Influenza Virus) 참조] 재조합 및/또는 재배열 인플루엔자 바이러스의효율적인 회수를 보장하기 위해, 여과 등을 위해 바이러스 용액을 가열하면서 적당한 온도에서 배양물을 유지하는 것이 중요하다. 통상적으로, 적절한 시기 동안(예, 바이러스 복제 등) 온도를 정확한 수준으로 유지하기 위해, 세포 배양 시스템 및/또는 기타 용액의 온도를 감지하고 유지하기 위한 조절기, 예컨대, 항온기 또는 기타 장치가 사용된다.
본 명세서의 일부 구체예(예, 재배열 바이러스가 벡터 상에서 세그먼트로부터 제조된 경우)에서, 인산칼슘 공동침전법, 전기천공, 현미주사, 리포펙션 및 폴리아민 형질감염 시약을 이용하는 형질감염을 비롯하여 이종 유래 핵산을 진핵 세포에 도입하기 위해 당업계에 잘 알려진 방법에 따라, 인플루엔자 게놈 세그먼트를 포함하는 벡터를 숙주 세포에 도입(예, 형질감염)한다. 예컨대, 플라스미드와 같은 벡터는 재배열 바이러스를 제조하기 위한 제조자의 사용 설명서에 따라 폴리아민 형질감염 시약 TransIT-LT1(Mirus)을 이용하여, COS 세포, 293T 세포 또는 COS 또는 293T의 조합물 및 MDCK 세포와 같은 숙주 세포로 형질감염될 수 있다. 약 2 ㎕의 TranslT-LT1을 이용하여 숙주 세포의 개체에 도입되는 약 1 ㎍의 각 벡터를 총 부피가 200 ㎕가 되도록 160 ㎕의 배지, 바람직하게는 혈청이 없는 배지에 희석하였다. DNA:형질감염 시약 혼합물을 45 분간 상온에서 항온 처리하고, 80 ㎕의 배지를 첨가하였다. 형질감염 혼합물을 숙주 세포에 첨가하고, 이 세포를 상기한 대로 배양하거나, 또는 당업자에게 잘 알려진 다른 방법을 통해 배양하였다. 따라서, 세포 배양물중 재조합 또는 재배열 바이러스의 제조를 위해, 8개의 게놈 세그먼트(PB2, PB1, PA, NP, M, NS, HA 및 NA) 각각을 혼입하는 벡터를 약 20 ㎕의 TransIT-LT1과 혼합하고, 숙주 세포에 형질감염시켰다. 임의로, 혈청 함유 배지를 형질감염시키기 전, 혈청이 없는 배지, 예컨대, Opti-MEM I로 대체하고, 4~6 시간 동안 항온 처리하였다.
대안으로, 인플루엔자 게놈 세그먼트를 숙주 세포에 혼입하는 이러한 벡터를 도입하기 위해 전기천공을 이용할 수 있다. 예컨대, 인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B 바이러스를 혼입하는 플라스미드 벡터는 하기 절차에 따라 전기천공을 이용하여 베로 세포에 도입하는 것이 바람직하다. 간단히 말하면, 예컨대 10% 우태아 혈청(FBS)으로 보충된 개량된 MEM(Modified Eagle's Medium)에서 성장시킨 약 5×106 개의 베로 세포를 0.4 ml의 OptiMEM에 재현탁하고, 전기천공 큐벳에 넣는다. 25 ㎕ 이하의 부피 중 20 ㎍의 DNA를 큐벳내 세포에 첨가하고, 그 다음 이를 태핑(tapping)에 의해 살살 혼합하였다. 제조자의 사용 설명서(예, BioRad Gene Pulser II with Capacitance Extender Plus connected)에 따라 25~33 msec 사이의 일정한 시간으로 300 볼트, 950 microFarad에서 전기천공을 수행한다. 세포를 살살 태핑하여 재혼합하고, 전기천공 약 1~2 분후, 10% FBS와 함께 0.7 ml의 MEM을 큐벳에 직접 첨가한다. 그 다음 세포를 2 ml의 MEM, 10% FBS를 함유하는 표준 6 웰 조직 배양 접시 중 2개의 웰에 형질감염시킨다. 큐벳을 세척하여 임의의 잔류 세포를 회수하고, 세척 현탁액을 2개의 웰에 나눈다. 최종 부피는 약 3.5 ml이다. 그 다음 세포를 바이러스 성장에 허가된 조건 하에, 예컨대 추위 적응 스트랜드에 대해 약 33℃에서 항온 처리하였다.
키트
본 발명의 방법 및 조성물의 이용을 촉진하기 위해, 임의의 백신 성분 및/또는 조성물, 예컨대, 요막액 중 재배열 바이러스 및 다양한 제제 등, 및 실험 또는 치료 백신 목적용 인플루엔자 바이러스의 포장 및 감염에 유용한 완충액, 세포, 배양 배지와 같은 추가의 성분을 키트의 형태로 포장할 수 있다. 통상적으로, 키트는 상기 성분 이외에 예컨대, 본 발명의 방법을 수행하기 위한 사용 설명서, 포장 물질 및 용기를 포함할 수 있는 추가의 물질을 포함한다.
상기한 발명은 명확성과 이해의 목적으로 그 일부를 구체적으로 설명하였으나, 당업자는 본 발명의 진정한 기술 사상에서 벗어나지 않는 한, 형식 및 구체적인 부분에서 다양한 변형이 이루어질 수있음을 본 설명을 읽음으로써 이해할 수 있을 것이다. 예컨대, 상기한 모든 기법 및 장치는 다양하게 조합하여 사용될 수 있다. 각각의 개별 간행물, 특허, 특허 출원 또는 기타 서류가 개별적으로 참고를 목적으로 참고로 인용된다고 기재되어 있지만, 본 출원에 언급된 모든 간행물, 특허, 특허 출원 또는 기타 서류는 동일한 정도로 참고를 위해 그 전체가 참고로 인용된다.
[표 1]
Figure pat00001
[표 2]
Figure pat00002
[표 3]
Figure pat00003
[표 4]
Figure pat00004
[표 5]
A/시드니/05/97 바이러스 포텐시 [로그10 TCID50/mL]
Figure pat00005
NA = 분석하지 않음
표 5에서의 모든 여과는 동일한 날의 수확으로부터 수행하였다. 여과에 앞서 Sartoclean CA 및 Sartopore2 필터를 통해 VAF를 60분 동안 5 ± 3℃, 20 ± 3℃, 및 31 ± 3℃에 노출시켰다.
[표 6]
A/시드니/05/97 뉴라미니다제 활성 [μU/mL]
Figure pat00006
BD = 검출치 이하 (5μU/mL 이하)
표 6에서의 모든 여과는 동일한 날의 수확으로부터 수행하였다. 여과에 앞서 Sartoclean CA 및 Sartopore2 필터를 통해 VAF를 60분 동안 5 ± 3℃, 20 ± 3℃, 및 31 ± 3℃에 노출시켰다.
[표 7]
A/시드니/05/97 헤마글루티닌 활성 [HA 타이터]
Figure pat00007
표 7에서의 모든 여과는 동일한 날의 수확으로부터 수행하였다. 여과에 앞서 Sartoclean CA 및 Sartopore2 필터를 통해 VAF를 60분 동안 5 ± 3℃, 20 ± 3℃, 및 31 ± 3℃에 노출시켰다.
[표 8]
A/시드니/05/97 바이러스 포텐시 [로그10 TCID50/mL]
Figure pat00008
표 8에서의 모든 여과는 동일한 날의 수확으로부터 수행하였다. 여과에 앞서 Sartoclean CA 및 Sartopore2 필터를 통해 VAF를 60분 동안 5 ± 3℃, 20 ± 3℃, 및 31 ± 3℃에 노출시켰다.
[표 9]
A/시드니/05/97 뉴라미니다제 활성 [μU/mL]
Figure pat00009
BD = 검출치 이하 (5μU/mL 이하)
표 9에서의 모든 여과는 동일한 날의 수확으로부터 수행하였다. 여과에 앞서 Sartoclean CA 및 Sartopore2 필터를 통해 VAF를 60분 동안 5 ± 3℃, 20 ± 3℃, 및 31 ± 3℃에 노출시켰다.
[표 10]
A/시드니/05/97 헤마글루티닌 활성 [HA 타이터]
Figure pat00010
* 모든 실험에 부피를 맞추기 위해 10% PBS를 첨가하였다.
표 10에서의 모든 여과는 동일한 날의 수확으로부터 수행하였다. 여과에 앞서 Sartoclean CA 및 Sartopore2 필터를 통해 VAF를 60분 동안 5 ± 3℃, 20 ± 3℃, 및 31 ± 3℃에 노출시켰다.
[표 11]
A/시드니/05/97 바이러스 포텐시 [로그10 TCID50/mL]
Figure pat00011
모든 여과는 동일한 날의 수확으로부터 수행하였다. 여과에 앞서 Sartoclean CA 및 Sartopore2 필터를 통해 VAF를 30분, 90분 또는 180분 동안 31 ± 3℃에 노출시켰다.
[표 12]
A/시드니/05/97 뉴라미니다제 활성 [μU/mL]
Figure pat00012
모든 여과는 동일한 날의 수확으로부터 수행하였다. 여과에 앞서 Sartoclean CA 및 Sartopore2 필터를 통해 VAF를 30분, 90분 또는 180분 동안 31 ± 3℃에 노출시켰다.
[표 13]
A/시드니/05/97 헤마글루티닌 활성 [HA 타이터]
Figure pat00013
* VAF를 4개의 개별 실험(0, 30, 60 또는 90분 온도 처리)으로 분리하기 이전에 안정화시킨 VAF 및 원심분리 안정화시킨 VAF (대조군) 시료를 풀로부터 취하였다.
NA = 데이타 수집 불가
모든 여과는 동일한 날의 수확으로부터 수행하였다. 여과에 앞서 Sartoclean CA 및 Sartopore2 필터를 통해 VAF를 30분, 90분 또는 180분 동안 31 ± 3℃에 노출시켰다.
[표 14]
A/시드니/05/97 바이러스 포텐시 [로그10 TCID50/mL]
Figure pat00014
모든 여과는 동일한 날의 수확으로부터 수행하였다. 여과에 앞서 Sartoclean CA 및 Sartopore2 필터를 통해 VAF를 0, 30분, 90분 또는 180분 동안 31 ± 3℃에 노출시켰다.
[표 15]
A/시드니/05/97 뉴라미니다제 활성 [μU/mL]
Figure pat00015
모든 여과는 동일한 날의 수확으로부터 수행하였다. 여과에 앞서 Sartoclean CA 및 Sartopore2 필터를 통해 VAF를 0, 30분, 90분 또는 180분 동안 31 ± 3℃에 노출시켰다.
[표 16]
A/시드니/05/97 헤마글루티닌 활성 [HA 타이터]
Figure pat00016
* VAF를 4개의 개별 실험(0, 30, 60 또는 90분 온도 처리)으로 분리하기 이전에 안정화시킨 VAF 및 원심분리 안정화시킨 VAF (대조군) 시료를 풀로부터 취하였다.
모든 여과는 동일한 날의 수확으로부터 수행하였다. 여과에 앞서 Sartoclean CA 및 Sartopore2 필터를 통해 VAF를 0, 30분, 90분 또는 180분 동안 31 ± 3℃에 노출시켰다.
[표 17]
바이러스 포텐시 [로그10 TCID50/mL]
Figure pat00017
모든 여과는 동일한 날의 수확으로부터 수행하였다. 여과에 앞서 Sartoclean CA 및 Sartopore2 필터를 통해 VAF를 0, 30분, 90분 또는 180분 동안 31 ± 3℃에 노출시켰다.
[표 18]
뉴라미니다제 활성 μU/mL
Figure pat00018
모든 여과는 동일한 날의 수확으로부터 수행하였다. 여과에 앞서 Sartoclean CA Sartopore2 필터를 통해, VAF를 0, 30분, 90분 또는 180분 동안 31 ± 3℃에 노출시켰다.
[표 19]
헤마글루티닌 활성
Figure pat00019
* VAF를 4개의 개별 실험(0, 30, 60 또는 90분 온도 처리)으로 분리하기 이전에 안정화시킨 VAF 및 원심분리 안정화시킨 VAF (대조군) 시료를 풀로부터 취하였다.
모든 여과는 동일한 날의 수확으로부터 수행하였다. 여과에 앞서 Sartoclean CA Sartopore2 필터를 통해 VAF를 0, 30분, 90분 또는 180분 동안 31 ± 3℃에 노출시켰다.
[표 20]
6개의 인플루엔자 스트레인의 바이러스 포텐시 [로그10 TCID50/mL]
Figure pat00020
* VAF를 개별 실험(RT 및 31 ± 3℃)으로 분리하기 이전에 안정화시킨 VAF 및 원심분리 안정화시킨 VAF (대조군) 시료를 풀로부터 취하였다.
** RT 실온
동일한 스트레인에 대한 두 여과는 동일한 날의 수확으로부터 수행하였다. 여과에 앞서 Sartoclean CA 및 Sartopore2 필터를 통해 VAF를 0(RT) 또는 60분 동안 31 ± 3℃에 노출시켰다.
[표 21]
6개의 인플루엔자 스트레인의 뉴라미니다제 활성 [μU/mL]
Figure pat00021
* VAF를 개별 실험(RT 및 31 ± 3℃)으로 분리하기 이전에 안정화시킨 VAF 및 원심분리 안정화시킨 VAF (대조군) 시료를 풀로부터 취하였다.
** RT 실온
동일한 스트레인에 대한 두 여과는 동일한 날의 수확으로부터 수행하였다. 여과에 앞서 Sartoclean 및 CA Sartopore2 필터를 통해 VAF를 0(RT) 또는 60분 동안 31 ± 3℃에 노출시켰다.
[표 22]
6개의 인플루엔자 스트레인의 헤마클루티닌 활성 [HA 타이터]
Figure pat00022
* VAF를 개별 실험(RT 및 31 ± 3℃)으로 분리하기 이전에 안정화시킨 VAF 및 원심분리 안정화시킨 VAF (대조군) 시료를 풀로부터 취하였다.
** RT 실온
동일한 스트레인에 대한 두 여과는 동일한 날의 수확으로부터 수행하였다. 여과에 앞서 Sartoclean 및 CA Sartopore2 필터를 통해 VAF를 0(RT) 또는 60분 동안 31 ± 3℃에 노출시켰다.
[표 23]
6개의 인플루엔자 스트레인의 바이러스 포텐시 [로그10 TCID50/mL]
Figure pat00023
* VAF를 개별 실험(RT 및 31 ± 3℃)으로 분리하기 이전에 안정화시킨 VAF 및 원심분리 안정화시킨 VAF (대조군) 시료를 풀로부터 취하였다.
** RT = 실온
동일한 스트레인에 대한 두 여과는 동일한 날의 수확으로부터 수행하였다. 여과에 앞서 Sartoclean CA 및 Sartopore2 필터를 통해 VAF를 0(RT) 또는 60분 동안 31 ± 3℃에 노출시켰다.
[표 24]
6개의 인플루엔자 스트레인의 뉴라미니다제 활성 [μU/mL]
Figure pat00024
* VAF를 개별 실험(RT 및 31 ± 3℃)으로 분리하기 이전에 안정화시킨 VAF 및 원심분리 안정화시킨 VAF (대조군) 시료를 풀로부터 취하였다.
** RT = 실온
동일한 스트레인에 대한 두 여과는 동일한 날의 수확으로부터 수행하였다. 여과에 앞서 Sartoclean CA 및 Sartopore2 필터를 통해 VAF를 0(RT) 또는 60분 동안 31 ± 3℃에 노출시켰다.
[표 25]
6개의 인플루엔자 스트레인의 헤마클루티닌 활성 [HA 타이터]
Figure pat00025
* VAF를 개별 실험(RT 및 31 ± 3℃)으로 분리하기 이전에 안정화시킨 VAF 및 원심분리 안정화시킨 VAF (대조군) 시료를 풀로부터 취하였다.
** RT = 실온
동일한 스트레인에 대한 두 여과는 동일한 날의 수확으로부터 수행하였다. 여과에 앞서 Sartoclean CA 및 Sartopore2 필터를 통해 VAF를 0(RT) 또는 60분 동안 31 ± 3℃에 노출시켰다.
[표 26]
SEC 분석 - 피크 면적 비교
Figure pat00026
[표 27]
A/뉴 칼레도니아 - CELISA 수치
Figure pat00027
[표 28]
Figure pat00028
[표 29]
대표적 조성에서 바이러스의 안정도 (타이터의 손실 log10/mL/개월)
Figure pat00029
[표 30]
Figure pat00030
[표 31]
1차 타이터 : FFA 분석에 의한 포텐시
Figure pat00031
[표 32]
Figure pat00032
[표 33]
1차 타이터 : FFA 분석에 의한 포텐시
Figure pat00033
[표 34]
Figure pat00034
[표 35]
조성 : 2차 타이터
Figure pat00035
[표 36]
2차 타이터 : FFA 분석에 의한 포텐시
Figure pat00036
[표 37]
2차 타이터 : FFA 분석에 의한 포텐시
Figure pat00037
[표 38]
2차 타이터 : FFA 분석에 의한 포텐시
Figure pat00038
[표 39]
2차 타이터 : FFA 분석에 의한 포텐시
Figure pat00039
[표 40]
Figure pat00040
[표 41]
결과 : FFA 분석에 의한 포텐시
Figure pat00041
베이스 조성 : 60% NAF, 10% 수크로즈, 1% 젤라틴, 2% 아르기닌
[표 42]
Figure pat00042
[표 43]
결과 : FFA 분석에 의한 포텐시
Figure pat00043
베이스 조성 : 100 mM KPO4, 60% NAF, 10% 수크로즈, 1% 젤라틴, 2% 아르기닌
[표 44]
조성 : 3차 타이터
Figure pat00044
[표 45]
Figure pat00045
[표 46]
조성 : P-B-4-레벨 커스텀 스크린
Figure pat00046
[표 47]
P-B 커스텀 스크린 4-레벨: FFA 분석에 의한 포텐시
Figure pat00047
[표 48]
P-B 커스텀 스크린 4-레벨
Figure pat00048
[표 49]
비교 연구에서의 조성
Figure pat00049
[표 50]
정제 VH vs. 미정제 VH (플러미스트)의 안정도: 둘 다 정제 조성에 의해 안정화시킴
6개월에서 안정화 기울기 @ 4℃ (±SE)
Figure pat00050
조성 : 7% 수크로즈, 1% 젤라틴, 1% 아르기닌 ['7/1/1' 조성]
* 60% AF 레벨
[표 51]
정제 VH vs. 플러미스트의 안정도: 플러미스트를 '10/2/2' 조성에 의해 안정화시킴
Figure pat00051
정제 VH 조성 : 7% 수크로즈, 1% 젤라틴, 1% 아르기닌 ['7/1/1' 조성], AF 추가 없음
* 플러미스트 조성 : 10% 수크로즈, 2% 젤라틴, 2% 아르기닌 ['10/2/2' 조성], 60% AF 레벨
** 선형 회귀에 기초하였음
[표 52]
정제 VH 조성 vs. 플러미스트의 안정도: 플러미스트를 '10/2/2 히스티딘' 조성에 의해 안정화시킴
Figure pat00052
정제 VH 조성 : 7% 수크로즈, 1% 젤라틴, 1% 아르기닌 ['7/1/1' 조성], AF 추가 없음
* 플러미스트 조성 : 히스티딘, 10% 수크로즈, 2% 젤라틴, 2% 아르기닌 ['10/2/2' 조성], 60% AF 레벨
** 선형 회귀에 기초하였음
[표 53]
방법 성능의 비교
Figure pat00053
1 사이 테스트 SD - 동일한 물질 상에서 (각 테스트 결과는 3일에 걸쳐 12회 측정의 평균), 동일한 분석 그룹에 의해, 동일 피펫팅 스테이션 상에서, 9회 테스트로부터 얻음. 테스트한 물질은 3개의 바이러스 스트레인 (H1N1, H3N2 및 B)의 각 3개 독립 제조 로트를 포함한다.
2 사이 테스트 SD - 동일한 물질 상에서 (각 테스트 결과는 3일에 걸쳐 12회 측정의 평균), 동일한 분석 그룹에 의해, 동일 피펫팅 스테이션 상에서, 6회 테스트로부터 얻음. 테스트한 물질은 3개의 바이러스 스트레인 (H1N1, H3N2 및 B)의 각 3개 독립 제조 로트를 포함한다.
3 인플루엔자 바이러스 단일가에 대한 반-자동화 TCID50 포텐시 분석에 대한 평가 보고
[표 54]
분석간 비교
Figure pat00054
[표 55]
Figure pat00055
[표 56]
인플루엔자 바이러스 단일가에 대한 반 자동화 TCID50 포텐시 분석:
"골드 표준" 평가 매뉴얼 CPE 판독 및 A570 컷오프 수치 0.5254에 기초한 민감도 및 특이성 평가
Figure pat00056
A 민감도 = 진정 포지티브(TP) / 모든 포지티브
B 특이도 = 진정 네가티브(TN) / 모든 네가티브
[표 57]
두개의 그룹에 의해 얻어진 대조군 웰(CPE-네가티브) 흡광도 수치와 비교 시험에서 이미 보고된 종래 수치
Figure pat00057
[표 58]
장비-장비 비교: 참조 바이러스 스트레인에 대한 반자동화 TCID50 포텐시 수치
Figure pat00058
1 테스트 번호 (AZ-036, N=9; AZ-039, N=5; AZ-040, N=2);
1st = 제1그룹, 2nd = 제2그룹
2 AZ-039의 경우, 일간-SD 허용 크리테리아의 실패로 인하여 1회 테스트 결과를 제외시켰다.
3 AZ-040의 경우, 일간-SD 허용 크리테리아의 실패 또는 플레이트의 미숙 조작으로 인하여 4회 테스트 결과를 제외시켰다.
[표 59]
분석-분석 비교: AZ-039 또는 AZ-036 장비를 사용한 참조 바이러스 스트레인에 대한 반자동화 TCID50 포텐시 수치
Figure pat00059
1 평균 포텐시 수치는 3일에 걸친 테스트에서 얻어진 4회 반족으로부터 유래한 것이다 (n=12).
SEQUENCE LISTING <110> MedImmune Vaccines, Inc. <120> METHODS OF PRODUCING INFLUENZA VACCINE COMPOSITIONS <130> FL300PCT <140> PCT/US04/005697 <141> 2004-02-25 <150> US 60/450,181 <151> 2003-02-25 <160> 10 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 163 <212> PRT <213> Influenza B virus <400> 1 Met Gly Thr Thr Ala Thr Lys Lys Lys Gly Leu Thr Leu Ala Glu Arg 1 5 10 15 Lys Met Arg Arg Cys Val Ser Phe His Glu Ala Phe Glu Ile Ala Glu 20 25 30 Gly His Glu Ser Ser Ala Leu Leu Tyr Cys Leu Met Val Met Tyr Leu 35 40 45 Asn Pro Gly Asn Tyr Ser Met Gln Val Lys Leu Gly Thr Leu Cys Ala 50 55 60 Leu Cys Glu Lys Gln Ala Ser His Ser His Arg Ala His Ser Arg Ala 65 70 75 80 Ala Arg Ser Ser Val Pro Gly Val Arg Arg Glu Met Gln Met Val Ser 85 90 95 Ala Met Asn Thr Ala Lys Thr Met Asn Gly Met Gly Lys Gly Glu Asp 100 105 110 Val Gln Lys Leu Ala Glu Glu Leu Gln Ser Asn Ile Gly Val Leu Arg 115 120 125 Ser Leu Gly Ala Ser Gln Lys Asn Gly Glu Gly Ile Ala Lys Asp Val 130 135 140 Met Glu Val Leu Lys Gln Ser Ser Met Gly Asn Ser Ala Leu Val Lys 145 150 155 160 Lys Tyr Leu <210> 2 <211> 248 <212> PRT <213> Influenza B virus <400> 2 Met Ser Leu Phe Gly Asp Thr Ile Ala Tyr Leu Leu Ser Leu Thr Glu 1 5 10 15 Asp Gly Glu Gly Lys Ala Glu Leu Ala Glu Lys Leu His Cys Trp Phe 20 25 30 Gly Gly Lys Glu Phe Asp Leu Asp Ser Ala Leu Glu Trp Ile Lys Asn 35 40 45 Lys Arg Cys Leu Thr Asp Ile Gln Lys Ala Leu Ile Gly Ala Ser Ile 50 55 60 Cys Phe Leu Lys Pro Lys Asp Gln Glu Arg Lys Arg Arg Phe Ile Thr 65 70 75 80 Glu Pro Leu Ser Gly Met Gly Thr Thr Ala Thr Lys Lys Lys Gly Leu 85 90 95 Ile Leu Ala Glu Arg Lys Met Arg Arg Cys Val Ser Phe His Glu Ala 100 105 110 Phe Glu Ile Ala Glu Gly His Glu Ser Ser Ala Leu Leu Tyr Cys Leu 115 120 125 Met Val Met Tyr Leu Asn Pro Gly Asn Tyr Ser Met Gln Val Lys Leu 130 135 140 Gly Thr Leu Cys Ala Leu Cys Glu Lys Gln Ala Ser His Ser His Arg 145 150 155 160 Ala His Ser Arg Ala Ala Arg Ser Ser Val Pro Gly Val Arg Arg Glu 165 170 175 Met Gln Met Val Ser Ala Met Asn Thr Ala Lys Thr Met Asn Gly Met 180 185 190 Gly Lys Gly Glu Asp Val Gln Lys Leu Ala Glu Glu Leu Gln Ser Asn 195 200 205 Ile Gly Val Leu Arg Ser Leu Gly Ala Ser Gln Lys Asn Gly Glu Gly 210 215 220 Ile Ala Lys Asp Val Met Glu Val Leu Lys Gln Ser Ser Met Gly Asn 225 230 235 240 Ser Ala Leu Val Lys Lys Tyr Leu 245 <210> 3 <211> 248 <212> PRT <213> Influenza B virus <400> 3 Met Ser Leu Phe Gly Asp Thr Ile Ala Tyr Leu Leu Ser Leu Thr Glu 1 5 10 15 Asp Gly Glu Gly Lys Ala Glu Leu Ala Glu Lys Leu His Cys Trp Phe 20 25 30 Gly Gly Lys Glu Phe Asp Leu Asp Ser Ala Leu Glu Trp Ile Lys Asn 35 40 45 Lys Arg Cys Leu Thr Asp Ile Gln Lys Ala Leu Ile Gly Ala Ser Ile 50 55 60 Cys Phe Leu Lys Pro Lys Asp Gln Glu Arg Lys Arg Arg Phe Ile Thr 65 70 75 80 Glu Pro Leu Ser Gly Met Gly Thr Thr Ala Thr Lys Lys Lys Gly Leu 85 90 95 Ile Leu Ala Glu Arg Lys Met Arg Arg Cys Val Ser Phe His Glu Ala 100 105 110 Phe Glu Ile Ala Glu Gly His Glu Ser Ser Ala Leu Leu Tyr Cys Leu 115 120 125 Met Val Met Tyr Leu Asn Pro Gly Asn Tyr Ser Met Gln Val Lys Leu 130 135 140 Gly Thr Leu Cys Ala Leu Cys Glu Lys Gln Ala Ser His Ser His Arg 145 150 155 160 Ala His Ser Arg Ala Ala Arg Ser Ser Val Pro Gly Val Arg Arg Glu 165 170 175 Met Gln Met Val Ser Ala Met Asn Thr Ala Lys Thr Met Asn Gly Met 180 185 190 Gly Lys Gly Glu Asp Val Gln Lys Leu Ala Glu Glu Leu Gln Ser Asn 195 200 205 Ile Gly Val Leu Arg Ser Leu Gly Ala Ser Gln Lys Asn Gly Glu Gly 210 215 220 Ile Ala Lys Asp Val Met Glu Val Leu Lys Gln Ser Ser Met Gly Asn 225 230 235 240 Ser Ala Leu Val Lys Lys Tyr Leu 245 <210> 4 <211> 248 <212> PRT <213> Influenza B virus <400> 4 Met Ser Leu Phe Gly Asp Thr Ile Ala Tyr Leu Leu Ser Leu Thr Glu 1 5 10 15 Asp Gly Glu Gly Lys Ala Glu Leu Ala Glu Lys Leu His Cys Trp Phe 20 25 30 Gly Gly Lys Glu Phe Asp Leu Asp Ser Ala Leu Glu Trp Ile Lys Asn 35 40 45 Lys Arg Cys Leu Thr Asp Ile Gln Lys Ala Leu Ile Gly Ala Ser Ile 50 55 60 Cys Phe Leu Lys Pro Lys Asp Gln Glu Arg Lys Arg Arg Phe Ile Thr 65 70 75 80 Glu Pro Leu Ser Gly Met Gly Thr Thr Ala Thr Lys Lys Lys Gly Leu 85 90 95 Ile Leu Ala Glu Arg Lys Met Arg Arg Cys Val Ser Phe His Glu Ala 100 105 110 Phe Glu Ile Ala Glu Gly His Glu Ser Ser Ala Leu Leu Tyr Cys Leu 115 120 125 Met Val Met Tyr Leu Asn Pro Gly Asn Tyr Ser Met Gln Val Lys Leu 130 135 140 Gly Thr Leu Cys Ala Leu Cys Glu Lys Gln Ala Ser His Ser Gln Arg 145 150 155 160 Ala His Ser Arg Ala Ala Arg Ser Ser Val Pro Gly Val Arg Arg Glu 165 170 175 Met Gln Met Val Ser Ala Val Asn Thr Ala Lys Thr Met Asn Gly Met 180 185 190 Gly Lys Gly Glu Asp Val Gln Lys Leu Ala Glu Glu Leu Gln Ser Asn 195 200 205 Ile Gly Val Leu Arg Ser Leu Gly Ala Ser Gln Lys Asn Gly Glu Gly 210 215 220 Ile Ala Lys Asp Val Met Glu Val Leu Lys Gln Ser Ser Met Gly Asn 225 230 235 240 Ser Ala Leu Val Lys Lys Tyr Leu 245 <210> 5 <211> 248 <212> PRT <213> Influenza B virus <400> 5 Met Ser Leu Phe Gly Asp Thr Ile Ala Tyr Leu Leu Ser Leu Thr Glu 1 5 10 15 Asp Gly Glu Gly Lys Ala Glu Leu Ala Glu Lys Leu His Cys Trp Phe 20 25 30 Gly Gly Lys Glu Phe Asp Leu Asp Ser Ala Leu Glu Trp Ile Lys Asn 35 40 45 Lys Arg Cys Leu Thr Asp Ile Gln Lys Ala Leu Ile Gly Ala Ser Ile 50 55 60 Cys Phe Leu Lys Pro Lys Asp Gln Glu Arg Lys Arg Arg Phe Ile Thr 65 70 75 80 Glu Pro Leu Ser Gly Met Gly Thr Thr Ala Thr Lys Lys Lys Gly Leu 85 90 95 Ile Leu Ala Glu Arg Lys Met Arg Arg Cys Val Ser Phe His Glu Ala 100 105 110 Phe Glu Ile Ala Glu Gly His Glu Ser Ser Ala Leu Leu Tyr Cys Leu 115 120 125 Met Val Met Tyr Leu Asn Pro Gly Asn Tyr Ser Met Gln Val Lys Leu 130 135 140 Gly Thr Leu Cys Ala Leu Cys Glu Lys Gln Ala Ser His Ser His Arg 145 150 155 160 Ala His Ser Arg Ala Ala Arg Ser Ser Val Pro Gly Val Arg Arg Glu 165 170 175 Met Gln Met Val Ser Ala Met Asn Thr Ala Lys Thr Met Asn Gly Met 180 185 190 Gly Lys Gly Glu Asp Val Gln Lys Leu Ala Glu Glu Leu Gln Ser Asn 195 200 205 Ile Gly Val Leu Arg Ser Leu Gly Ala Ser Gln Lys Asn Gly Glu Gly 210 215 220 Ile Ala Lys Asp Val Met Glu Val Leu Lys Gln Ser Ser Met Gly Asn 225 230 235 240 Ser Ala Leu Val Lys Lys Tyr Leu 245 <210> 6 <211> 109 <212> PRT <213> Influenza B virus <400> 6 Met Leu Glu Pro Phe Gln Ile Leu Ser Ile Cys Ser Phe Ile Leu Ser 1 5 10 15 Ala Leu His Phe Met Ala Trp Thr Ile Gly His Leu Asn Gln Ile Lys 20 25 30 Arg Gly Val Asn Leu Lys Ile Arg Ile Arg Asn Pro Asn Lys Glu Thr 35 40 45 Ile Asn Arg Glu Val Ser Ile Leu Arg His Ser Tyr Gln Lys Glu Ile 50 55 60 Gln Ala Lys Glu Thr Met Lys Glu Val Leu Ser Asp Asn Met Glu Ile 65 70 75 80 Leu Ser Asp His Ile Val Ile Glu Gly Leu Ser Ala Glu Glu Ile Ile 85 90 95 Lys Met Gly Glu Thr Val Leu Glu Val Glu Glu Leu Gln 100 105 <210> 7 <211> 109 <212> PRT <213> Influenza B virus <400> 7 Met Leu Glu Pro Phe Gln Ile Leu Ser Ile Cys Ser Phe Ile Leu Ser 1 5 10 15 Ala Leu His Phe Met Ala Trp Thr Ile Gly His Leu Ser Gln Ile Lys 20 25 30 Arg Gly Val Asn Met Lys Ile Arg Ile Lys Gly Pro Asn Lys Glu Thr 35 40 45 Ile Asn Arg Glu Val Ser Ile Leu Arg His Ser Tyr Gln Lys Glu Ile 50 55 60 Gln Ala Lys Glu Thr Met Lys Glu Val Leu Ser Asp Asn Met Glu Ala 65 70 75 80 Leu Ser Asp His Ile Val Ile Glu Gly Leu Ser Ala Glu Glu Ile Ile 85 90 95 Lys Met Gly Glu Thr Val Leu Glu Val Glu Glu Leu His 100 105 <210> 8 <211> 109 <212> PRT <213> Influenza B virus <400> 8 Met Leu Glu Pro Phe Gln Ile Leu Ser Ile Cys Ser Phe Ile Leu Ser 1 5 10 15 Ala Leu His Phe Met Ala Trp Thr Ile Gly His Leu Asn Gln Ile Lys 20 25 30 Arg Gly Val Asn Met Lys Ile Arg Ile Lys Gly Pro Asn Lys Glu Thr 35 40 45 Ile Asn Arg Glu Val Ser Ile Leu Arg His Ser Tyr Gln Lys Glu Ile 50 55 60 Gln Ala Lys Glu Thr Met Lys Glu Val Leu Ser Asp Asn Met Glu Val 65 70 75 80 Leu Ser Asp His Ile Val Ile Glu Gly Leu Ser Ala Glu Glu Ile Ile 85 90 95 Lys Met Gly Glu Thr Val Leu Glu Ile Glu Glu Leu His 100 105 <210> 9 <211> 109 <212> PRT <213> Influenza B virus <400> 9 Met Leu Glu Pro Phe Gln Ile Leu Ser Ile Cys Ser Phe Ile Leu Ser 1 5 10 15 Ala Leu His Phe Met Ala Trp Thr Ile Gly His Leu Asn Gln Ile Lys 20 25 30 Arg Gly Val Asn Met Lys Ile Arg Ile Lys Gly Pro Asn Lys Glu Thr 35 40 45 Ile Asn Arg Glu Val Ser Ile Leu Arg His Ser Tyr Gln Lys Glu Ile 50 55 60 Gln Ala Lys Glu Thr Met Lys Glu Val Leu Ser Asp Asn Met Glu Val 65 70 75 80 Leu Asn Asp His Ile Val Ile Glu Gly Leu Ser Ala Glu Glu Ile Ile 85 90 95 Lys Met Gly Glu Thr Val Leu Glu Ile Glu Glu Leu His 100 105 <210> 10 <211> 109 <212> PRT <213> Influenza B virus <400> 10 Met Leu Glu Pro Phe Gln Ile Leu Ser Ile Cys Ser Phe Ile Leu Ser 1 5 10 15 Ala Leu His Phe Met Ala Trp Thr Ile Gly His Leu Asn Gln Ile Lys 20 25 30 Arg Gly Val Asn Met Lys Ile Arg Ile Lys Ser Pro Asn Lys Glu Thr 35 40 45 Ile Asn Arg Glu Val Ser Ile Leu Arg His Ser Tyr Gln Lys Glu Ile 50 55 60 Gln Ala Lys Glu Thr Met Lys Glu Val Leu Ser Asp Asn Met Glu Val 65 70 75 80 Leu Ser Asp His Ile Val Ile Glu Gly Leu Ser Ala Glu Glu Ile Ile 85 90 95 Lys Met Gly Glu Thr Val Leu Glu Ile Glu Glu Leu His 100 105

Claims (22)

  1. (a) 생 인플루엔자 바이러스 수확물을 교차 흐름 여과(cross flow filtration)로 농축하는 단계; 및
    (b) 농축된 바이러스 수확물을 완충액으로 세척하는 단계
    를 포함하는 액상의 냉장 안정한 생 인플루엔자 바이러스 백신 조성물을 제조하는 방법으로서,
    상기 조성물은 약 5~10%의 수크로스, 약 1~5%의 아르기닌, 약 1~4%의 젤라틴, 및 5% 미만의 정상 요막액(normal allantoic fluid)을 포함하고, 상기 조성물은 약 2~8℃에서 저장시, 12개월 이내에서는 1.0 log 이하의 포텐시 손실을 나타내거나 1개월당 0.080 log 이하의 포텐시 손실을 나타내는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 바이러스 수확물이 에그로부터 유래된 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 바이러스 수확물이 세포 배양물로부터 유래된 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 인플루엔자 바이러스 수확물이 10X 내지 200X로 농축되는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 농축된 바이러스 수확물이 약 10 부피의 완충액으로 세척되며, 이때 1 부피가 농축 이전 바이러스 수확물의 부피와 동일한 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 세척 이후 부피가 세척 이전의 농축된 바이러스의 부피와 동일한 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 완충액이 수크로스, 인산칼륨 및글루타메이트(SPG)를 포함하는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 수확물이 농축 이전에 안정화되는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 바이러스 수확물이 SPG를 포함하는 완충액을 추가하여 안정화되는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 수확물이 농축 이전에 정화되는(clarified) 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 약 1~2%의 아르기닌을 포함하는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 인플루엔자 바이러스 조성물이 약 1%의 젤라틴을 포함하는 것인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 약 7~10%의 수크로스를 포함하는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 정상 요막액을 실질적으로 함유하지 않는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 약 5~200 mM 인산칼륨 완충액을 더 포함하는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 인산칼륨 완충액의 pH가 7.2인 것인 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 조성물이 약 100 mM 인산칼륨 완충액을 포함하는 것인 방법.
  18. 제15항 또는 제16항에 있어서, 조성물이 약 10~12 mM 인산칼륨 완충액을 포함하는 것인 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물의 pH가 7.2인 것인 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 EDTA를 포함하지 않는 것인 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 인플루엔자 바이러스가 추위 적응된(cold adapted) 것인 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 포텐시는 형광 포커스 유닛(fluorescent focus unit)으로 측정되는 것인 방법.
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