KR100705746B1

KR100705746B1 - 사람파필로마바이러스의 검출을 위한 프라이머

Info

Publication number: KR100705746B1
Application number: KR1020060023598A
Authority: KR
Inventors: 양주성; 차혜란
Original assignee: 학교법인 성균관대학
Priority date: 2005-03-14
Filing date: 2006-03-14
Publication date: 2007-04-09
Also published as: US7790375B2; US20090017450A1; GB2439375A; CA2546804C; GB0610705D0; WO2006098582A1; CA2546804A1; KR20060100229A

Abstract

본 발명은 HPV 유전형 11, 16, 18 및 31 유전자에 특이적인 각각의 프라이머를 제공하며, 이를 포함하는 HPV의 유전자 검출용 키트 및 상기 프라이머를 사용하여 HPV의 유전자를 검출하는 방법에 관한 것이다.

사람파필로마바이러스(Human Papillomavirus: HPV), 프라이머, 중합효소 연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction: PCR), 유전자 검출용 키트

Description

사람파필로마바이러스의 검출을 위한 프라이머{Primer for detection of Human Papillomavirus}

도 1은 HPV 유전형 11, 16, 18, 31의 L1 유전자를 증폭하여 제조한 재조합 플라스미드 및 재조합 플라스미드의 클로닝 확인 결과이다.

도 2는 HPV 16 L1 서열의 배열을 나타낸 것이다.

도 3은 HPV 31 L1 서열의 배열을 나타낸 것이다.

도 4는 HPV 11 L1 서열의 배열을 나타낸 것이다.

도 5는 HPV 18 L1 서열의 배열을 나타낸 것이다.

도 6은 HPV 유전형에 따른 염기서열 비교 결과이다.

도 7은 HPV 11, 16, 18, 31 L1 주형에 따른 민감성 실험 결과이다.

도 8은 HPV 11, 16, 18, 31 L1 주형에 따른 차별성 실험 결과이다.

도 9는 HPV L1 플라스미드 보관 3주 후 프라이머 열 안정성 및 장기 보존성 실험 결과이다.

도 10a, 도 10b는 HPV L1 플라스미드 보관 15주 후 프라이머 열 안정성 및 장기 보존성 실험 결과이다.

도 11은 일정량의 HPV L1 플라스미드에 다양한 DNA 배경을 첨가한 응용성 실 험 결과이다.

본 발명은 사람파필로마바이러스(Human Papillomavirus, 이하 HPV)의 유전자에 특이적인 프라이머, 이를 포함하는 HPV의 유전자 검출용 키트 및 상기 프라이머를 사용하여 HPV의 유전자를 검출하는 방법에 관한 것이다.

HPV는 8kb의 환상 이중나선 바이러스로서, 여성의 질 안에 기생하며 치료가 어렵고 잘 없어지지도 않는다. 사람뿐 아니라 포유동물의 우상피 세포에 감염되어 사마귀와 여러 가지 악성종양을 일으키는 증상과 밀접한 관계가 있는 HPV는 곤지름(condyloma accuminata, 성기나 항문 주위에 닭벼슬 모양으로 번지는 사마귀)의 90% 이상과 자궁경부암의 거의 100%에서 검출된다. 특히 자궁경부암은 한국 여성 암의 22.1%에 달하며, 사망률 2위를 차지하고 있다.

따라서 자궁경부암의 질병을 야기하는 HPV를 효과적으로 검출하는 방법을 제공하는 것은 질병의 진단, 예방 및 치료를 위해 중요하며, HPV 백신 처리 후 유효성 및 위해도 검증을 위해서도 HPV를 효과적으로 검출할 필요가 있다.

감염성 질병을 진단하는데 사용되는 핵산 관련 실험은 개체와 임상의 물질로부터 핵산을 분리하는 표준방법을 사용한다. 표적 DNA 혹은 RNA는 임상 표본에 적게 존재하기 때문에 여러 가지 신호증폭과 표적증폭기술은 진단 실험실에서 주요하 게 사용된다. 이러한 방법은 검출을 돕고, 배양되지 않은 개체의 확인에 유용하고, 진단과 또 감염성 병의 치료에도 도움을 준다. PCR은 핵산증폭기술(Nucleic acid amplification technique: NAT)의 한 방법으로 검출할 수 있는 수준에서 원하는 표적이 낮은 농도로 존재할 때 그것을 선택적으로 증폭시킬 수 있으므로 널리 이용되고 있다. NAT는 바이러스의 정성적인 검출뿐만 아니라 정량적인 면에서 임상시료 내의 바이랄 로드(viral load)의 진단법과 예측, 그리고 치료적인 모니터링을 위해 그 중요성이 인식되고 있다(Pfaller M.A Emer . Infect. Dis . 7, 2, 2001).

모든 유형의 HPV 유전자는 크게 초기 유전자(early gene)와 후기 유전자(late gene)로 구분된다. 약 4.5kb의 초기 유전자는 바이러스 DNA 복제(E1), 숙주 세포의 악성화 변형(malignant transformation)을 야기하는 단백질을 형성하는 DNA의 작용을 유발 또는 억제(E2), 숙주세포와 바이러스 성장과 관련된 단백질의 합성(E4), EGF(epidermal growth factor)와 CSF(colony stimulator factor) 수용체의 작동유발(E5), 세포의 영구생존 및 암 유전자의 활성과 암 억제인자의 비활성화 기전에 의한 악성화 변형(E7)을 담당한다. 특히 HPV가 숙주의 상피세포를 감염시킨 후에 발현되는 종양원성(oncogenic) 단백질인 E6과 E7은 각각 숙주세포의 종양 억제 단백질인 p53과 pRB와 결합하여 이들 종양 억제 단백질의 기능을 억제함으로써, 결과적으로 감염 세포의 형질전환에 따른 종양형성으로 발전하는 것으로 규명되고 있다. 한편, 2.5kb의 후기 유전자는 바이러스 주외피 단백질(L1)과 부외피 단백질(L2)의 합성을 담당하는 유전자와 이들의 전사와 번역 기능을 조절하는 비발현 부분(non-coding region)인 1kb 크기의 LCR(long control region)으로 이루어져 있 다.

최근 분자생물학적 기법의 급속한 발전에 따라 HPV의 유전학적 구조가 밝혀지면서 많은 유전형(genotype)의 HPV 게놈 염기서열이 밝혀지고 있다. HPV는 E6, E7, L1 유전자의 ORF 서열의 차이에 따라 유형이 결정되는데, 상기 ORF의 뉴클레오티드 서열이 10% 이상 다르면 새로운 유전형으로 정의되고, 2% 이상 10% 미만이 다르면 아형(subtype), 2% 미만이 다른 경우에는 변이체(variant)로 정의된다.

HPV 유전형 중 자궁경부암과 상피내암 조직에서 검출되어 고위험군으로 분류되는 HPV16, 18, 31과 저위험군으로 분류되는 HPV11을 각각 특이적으로 검출하기 위하여, 각 유전형별 바이러스에 특이적인 유전자를 검출하고자 하였으며, 이런 유전자로 L1 유전자를 선정하였다.

본 발명자는 HPV 유전자를 특이적으로 검출하기 위하여, 한국인 특이적인 HPV 11, 16, 18 및 31의 L1 유전자를 구축하고, 상기 유전자에 특이적으로 결합 가능한 프라이머를 제작한 뒤 이를 이용하여 PCR을 수행할 경우, 각 HPV 유전형을 특이적으로 검출가능하고 아주 적은 양까지 민감하게 정량 분석할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 사람파필로마바이러스(HPV)의 유전자와 상보적으로 결합 가능한 서열번호 1과 2, 서열번호 3과 4, 서열번호 5와 6 및 서열번호 7과 8로 기재된 염기서열을 가지는 프라이머 쌍 중에서 선택되는 프라이머 쌍을 제공하는 것 이다.

본 발명의 또 다른 목적은 HPV의 유전자와 상보적으로 결합 가능한 서열번호 1과 2, 서열번호 3과 4, 서열번호 5와 6 및 서열번호 7과 8로 기재된 염기서열을 가지는 프라이머 쌍 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 쌍을 사용하여 생물학적 시료의 DNA에 대해 중합효소 연쇄반응을 수행하여 HPV의 유전자를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 HPV의 유전자와 상보적으로 결합 가능한 서열번호 1과 2, 서열번호 3과 4, 서열번호 5와 6 및 서열번호 7과 8로 기재된 염기서열을 가지는 프라이머 쌍 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 HPV의 유전자 검출용 키트를 제공하는 것이다.

하나의 양태로서 본 발명은 HPV의 유전자와 상보적으로 결합 가능한 프라이머에 관한 것이다.

보다 구체적인 양태로서, 본 발명은 HPV의 유전자와 상보적으로 결합 가능한 서열번호 1과 2, 서열번호 3과 4, 서열번호 5와 6 및 서열번호 7과 8로 기재된 염기서열을 가지는 프라이머 쌍 중에서 선택되는 프라이머 쌍에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명의 목적상 프라이머는, 도 2에 기술된 HPV 16, 도 3에 기술된 HPV 31, 도 4에 기술된 HPV 11, 및 도 5에 기술된 HPV 18의 L1 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머이다. 고로, 본 발명의 프라이머는 상기 유전자에 상보적으로 결합 가능한 7 내지 50, 보다 바람직하게는 10 내지 30개의 염기서열을 가지는 정방향 및 역방향 프라이머 쌍으로 이루어져 있다. 구체적으로, HPV 11은 서열번호 1과 2의 염기서열을 가지는 프라이머 쌍, HPV 16은 서열번호 3과 4의 염기서열을 가지는 프라이머 쌍, HPV 18은 서열번호 5와 6의 염기서열을 가지는 프라이머 쌍, 그리고 HPV 31은 서열번호 7과 8의 염기서열을 가지는 프라이머 쌍에 의해 각각 L1 유전자의 특정 영역이 특이적으로 증폭될 수 있다.

본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그널을 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 바이오틴 등이 있다.

본 발명에서 제공하는 서열번호 1과 2, 서열번호 3과 4, 서열번호 5와 6 및 서열번호 7과 8의 염기서열을 가지는 프라이머로 PCR을 수행한 경우, 각각의 HPV 유전형을 특이적으로 검출할 뿐만 아니라 62.5 카피까지 증폭할 정도로 아주 민감한 것을 확인할 수 있었다.

따라서 상기 프라이머를 HPV 감염여부, 감염된 HPV 유전형의 확인, HPV 역학조사, HPV 백신의 유효성 및 위해도 조사 등에 효과적으로 사용할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 HPV의 유전자와 상보적으로 결합 가능한 서열번호 1과 2, 서열번호 3과 4, 서열번호 5와 6 및 서열번호 7과 8로 기재된 염기서열을 가지는 프라이머 쌍 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 쌍을 사용하여 생물학적 시료의 DNA에 대해 중합효소 연쇄반응을 수행하여 HPV의 유전자를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 용어 "생물학적 시료"란 HPV로 감염되거나, 감염을 의심받는 개체 또는 HPV 백신으로 백신화된 개체의 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

상기 HPV의 존재 및 유전형의 확인 방법은 상기의 프라이머를 이용하는 방법이면 특별히 제한되지 않는다. 이런 방법에는 특정한 가닥의 프라이머를 프로브로 사용하여 이를 검출하는 HPV DNA의 직접 확인법이 있고, 서던 블럿팅(southern blotting), 도트 블럿팅(dot blotting) 및 FISH(filter in situ hybridization) 등을 예로 들 수 있다. 다른 방법으로는 프라이머 쌍을 사용하여 HPV DNA의 증폭을 이용하는 방법이 있고, 유전형-특이적 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; 이하 PCR), 일반화된-프라이머(general-primer) PCR 등을 그 예로 들 수 있다. 보다 바람직하게는 PCR이다.

본 발명에서 용어 "중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR)"은 특정 DNA 영역을 시험관 내에서 효소를 이용하여 원하는 부분을 증폭하는, 대표적인 핵산증폭기술(NAT) 중의 하나이다. 1985년 물리스(Mullis) 등에 의해 개발되었고, DNA 분자의 어느 부분이든지 그 경계 서열만 알면 이 방법을 통해서 증폭할 수 있다. PCR은 기본적으로 변성, 결합, 연장의 세 단계로 구성되어 있고, 이 과정이 반복되면서 DNA가 증폭된다. PCR의 제 1단계는 주형 DNA를 단일쇄로 변성시킨다(변성단계). 제 2단계는 목적하는 영역을 사이에 두는 두 종류의 단일쇄 DNA에 결합시킨다(결합단계). 제 3단계는 프라이머로부터 고열에 내성인 DNA 폴리머라제에 의해 DNA를 합성하고 이상의 사이클을 25 내지 30회 반복한다.

PCR 결과의 신뢰성을 결정하는 가장 큰 요소는 프라이머로, 프라이머 서열에 따라서는 비특이적 증폭에 의해 잘못된 결과를 내릴 수도 있다. 그런 점에서, 본 발명은 신뢰할 수 있는 프라이머 쌍을 제공하는데 의의가 있다. 본 발명의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하면 각 유전형별 HPV를 정확하게 검출 가능하고 아주 적은 양까지도 민감하게 정량 분석이 가능하다. 또한, 본 발명의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하면 반복 측정 시에도 일관된 결과를 나타낸다. 즉, 본 발명의 프라이머 쌍은 타당도(validity)와 신뢰도(reliability)가 높은 프라이머로, 이를 이용하여 얻은 결과를 신뢰할 수 있다.

바람직한 양태로서, 본 발명은 서열번호 1과 2의 염기서열을 가지는 프라이머 쌍을 사용하여 HPV11-L1 유전자를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

또 다른 바람직한 양태로서, 본 발명은 서열번호 3과 4의 염기서열을 가지는 프라이머쌍을 사용하여 HPV16-L1 유전자를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

또 다른 바람직한 양태로서, 본 발명은 서열번호 5와 6의 염기서열을 가지는 프라이머쌍을 사용하여 HPV18-L1 유전자를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

또 다른 바람직한 양태로서, 본 발명은 서열번호 7과 8의 염기서열을 가지는 프라이머쌍을 사용하여 HPV31-L1 유전자를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 프라이머를 사용하여 HPV 유전자, 구체적으로 L1 유전자를 증폭하는 PCR 반응은 통상적인 공지된 PCR 방법에 의해 수행될 수 있으며, 변성, 결합, 연장 반응을 수행하는 시간, 온도, 사이클 수 등은 다양하게 조절가능하다. 본 발명에서는 94℃에서 1분간 변성, 51℃에서 1분간 결합 및 72℃에서 1분 또는 1분 30초간 연장하는 반응을 35회 수행하였다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 HPV의 유전자와 상보적으로 결합 가능한 서열번호 1과 2, 서열번호 3과 4, 서열번호 5와 6 및 서열번호 7과 8로 기재된 염기서열을 가지는 프라이머 쌍 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 HPV의 유전자 검출용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 검출용 키트는, 상기 프라이머 쌍 외에도 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분의 조성물, 용액 또는 장치로 구성될 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 키트는 다음 구성 성분들을 포함한다: 검출 프라이머를 포함하는 용기; 그 외 증폭반응튜브 또는 다른 적절한 컨테이너; 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양); dNTPs; Taq-폴리머라제와 같은 효소; RNAse; 및 멸균수 등을 포함할 수 있다. 더욱 바람직하게, 상기 키트는 정량분석이 가능하도록 양성대조군으로서 HPV의 유전자를 포함하는 플라스미드를 더 포함할 수 있으며, 이들 플라스미드는 후술하는 실시예에서 기술하는 바와 같이 pGEM-HPV11 L1, pGEM-HPV16 L1, pGEM-HPV18 L1 및 pGEM-HPV31 L1 중에서 선택되는 하나 이상의 플라스미드일 수 있다.

이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 보다 상세히 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 재조합 HPV L1 플라스미드(표준품) 제조

유전자은행(GenBank)에 등록되어 있는 서로 다른 HPV 주외피 단백질(HPV L1) 서열을 통해 저위험군 11 및 고위험군 16, 18, 31에 유형 특이적인 PCR 프라이머를 고안하였다. 한국인에게서 많이 발견되는 HPV 유전형을 수득하기 위해, 한국인 자궁경부암 환자의 조직을 임상 병원으로부터 확보하고, 이로부터 HPV 유전자원인 게놈 DNA를 추출하였다. 생체조직 시료는 병리 검사를 위하여 마련된 파라핀 섹션 혹은 생체검사 시료를 사용하였다. 이를 주형으로 하고 표 1에 나와 있는 서열번호 9 내지 16으로 제작된 프라이머를 이용하여 약 1.6kb 가량의 PCR 산물을 수득하였다.

HPV L1 유전자의 한국인 표준품을 제작하기 위한 프라이머 서열

유전형	PCR 단편길이	PCR 프라이머 서열
HPV16	1596bp	sense	5'GCCCCCAAGCTTGCCGCCACCATGCAGGTGACTTTTATTTACATCC 3'(서열번호 9)
		anti-sense	5'ATCGGGCTCGAGCAGCTTACGTTTTTTGCGTTTAGC 3' (서열번호 10)
HPV18	1707bp	sense	5'GCCCCCAAGCTTGCCGCCACCATGTGCCTGTATACACGG 3'(서열번호 11)
		anti-sense	5'ATCGGGGAATTCCTTCCTGGCACGTACACGCACACG 3' (서열번호 12)
HPV31	1515bp	sense	5'GCCCCCAAGCTTGCCGCCACCATGTCTCTGTGGCGGCCTAGC 3'(서열번호 13)
		anti-sense	5'ATCGGGGAATTCCTTTTTAGTTTTTTTACGTTTTGCTGGTGTAGTGG 3' (서열번호 14)
HPV11	1506bp	sense	5'GCCCCCAAGCTTGCCGCCACCATGTGGCGGCCTAGCGACAGC 3'(서열번호 15)
		anti-sense	5'ATCGGGGAATTCCTTTTTGGTTTTGGTACGTTTTCGTTTGGG 3'(서열번호 16)

다음과 같은 조건으로 PCR을 수행하였다. 환자의 조직에서 확보한 DNA를 주형으로 하고, 2.5mM dNTP, 반응 버퍼, 표 1의 프라이머쌍(20 pmol)을 넣고 슈퍼 Taq 플러스를 사용하여 PCR을 수행하였다. 프라이머의 최적 결합 온도에 따라서 변성(94℃, 1분), 결합(Ta, 1분), 연장(72℃, 1분 30초) 사이클을 35회 반복 후, 마지막으로 72℃에서 10분 동안 연장하였다. PCR 산물을 pGEM-T-easy vector (Promega, USA)에 바로 삽입하여 대장균 DH5α를 통하여 클로닝한 후에, 제한효소 Eco RI으로 처리하여 삽입물이 존재하는지 확인하였다(도1).

PCR 산물의 핵산서열을 분석하고, 이를 기존에 알려진 유전형의 L1 단백질을 코딩하는 핵산서열과 비교하였다. HPV 16은 AF402678, HPV 31은 J04353, HPV 11은 NC_001525, HPV 18은 NC_001357과 비교하였다. 그 결과, 상기 방법에 의해 밝혀진 4가지의 유전형별 L1 단백질을 코딩하는 핵산서열은 기존 유전형별 L1 단백질을 코딩하는 핵산서열과 서열이 아주 유사함을 알 수 있었다.

< 실시예 2> 재조합 HPV L1 플라스미드 대량 배양 및 정량

암피실린을 포함한 LB 액체 배지 10㎖에 실시예 1에서 제조한 재조합 HPV L1의 플라스미드를 포함한 대장균을 접종하여 37℃ 진탕 배양기(shaking incubator)에서 배양하였다. 밤새 배양 후 알칼라인 라이시스 방법을 이용하여 표적 플라스미드 DNA를 분리하였다. 분광광도계를 이용하여 DNA의 양을 정확하게 정량하고 플라스미드의 카피수를 다음과 같은 방법으로 계산하였다.

1kb 단편의 카피수 = (1000bp × 660g/mole) / (6.023 × 10 ²³ molecules) = 1 × 10 ^-18 g (1 fg )

상기 식이 의미하는 것은 다음과 같다. 즉, 1kb(1000bp) 크기의 플라스미드 1 카피의 무게는 1 X 10^-18 g(1 fg)이며, 1kb 플라스미드 DNA 1g에는 10¹⁸개 카피의 플라스미드가 존재한다는 것이다.

상기 식을 사용하여, 서로 다른 유전형의 플라스미드의 카피수를 계산하고, 2000 카피에서부터 2배씩 차례로 희석하여서 사용하였다. 각각 10㎕ 에 2000, 1000, 500, 250, 125, 62.5 카피의 플라스미드를 포함하는 용액을 만들어 사용하였다.

< 실시예 3> 재조합 HPV L1 플라스미드를 이용한 특정 프라이머 민감도 실험

실시예 2에서 제조한 2000, 1000, 500, 250, 125, 62.5/10㎕를 가지고 있는 DNA 용액을 주형으로 하여 PCR을 실시한 결과, 카피수에 의존적으로 민감성을 나타내었다(DNA 용액 10㎕ 내에는 각각 2000, 1000, 500, 250, 125, 62.5 카피의 DNA를 포함하고 있는 것이라 할 수 있다). 도 6에 따라서 PCR 프라이머 서열번호 1 내지 8(표 2)을 선정하였다.

HPV의 유전자 검출용 프라이머

Genotype	sense primer	anti-sense primer
HPV11	TTAGGCGTTGGTGTTAGTGG(서열번호 1)	AAAATTCATAGCACCAAAGC(서열번호 2)
HPV16	TTAGGTGTGGGCATTAGTG(서열번호 3)	AAAGTCCATAGCACCAAAGC(서열번호 4)
HPV18	TTAGGTGTTGGCCTTAGTG(서열번호 5)	AAAGTCCATGGCACCATAT(서열번호 6)
HPV31	TTAGGTGTAGGTATTAGTG(서열번호 7)	AAAATCCATAGCTCCAAAG(서열번호 8)

PCR을 실시하기 위해 2.5mM dNTP 5 ㎕, 10X 버퍼 5 ㎕, 서열번호 1 내지 8의 프라이머(20 pmol)와 Taq 중합효소 0.5㎕와 증류수를 최종 부피 40㎕가 되도록 맞춘 혼합물을 제조한 후에 이 혼합물에 각각의 주형 10㎕씩 분주하여 PCR 혼합물을 제조하였다. PCR 조건은 변성(94℃, 1 분), 결합(51℃, 1 분), 연장(72℃, 1분)을 35 사이클 반복한 후에 마지막으로 72℃에서 10분 동안 연장하였다. PCR이 끝난 후에 PCR 산물을 1.5% 아가로스 겔에서 40분 동안 러닝시킨 후에 에티디움 브로마이드(Ethidium bromide; EtBr)로 염색해서 밴드의 세기(intensity)를 확인하였다. 각각의 세기는 Quantity One(bio-rad)이라는 소프트웨어를 사용해서 같은 범위 내에 세기를 측정한 후에, 세기와 카피수와의 상관관계를 알아보는 회기 함수를 구하고, 상관계수(relative coefficient; R)를 계산하여서 0.9 이상이 되는지 확인하였다. PCR 증폭법의 민감성을 알아보기 위해서 실험한 결과, 도 7에서 보는 바와 같이 모든 유전형에서 카피수에 의존적으로 밴드의 세기가 줄어들었고, 62.5 카피까지 검출하는 민감도를 나타내는 것을 확인하였다. DNA를 아가로스 겔에 러닝시켜 세기와 카피수의 상관관계를 알아본 결과, 도 7에서 보는 바와 같이 상관계수가 0.9 이상으로 나오는 것을 확인할 수 있었고, 이를 통하여 본 발명의 방법을 통한 카피수 검정은 신뢰할 수 있음을 알 수 있었다.

< 실시예 4> 재조합 HPV L1 플라스미드를 이용한 프라이머 특이성 실험

실시예 3에서 사용한 프라이머가 각각의 유전형에 특이하게 증폭을 하는지 알아보기 위하여, 각각 다른 유전형의 프라이머를 가지고 다른 유전형의 HPV L1 주형을 차별적으로 증폭하는지의 여부를 알아보았다. 실시예 3에서 시행한 PCR 조건과 똑같이 하되, 주형의 농도는 각각 1000 카피로 고정하였다. 이 경우 각각 서로 다른 유형의 주형을 사용하되, 프라이머는 오직 한 유형의 프라이머를 사용하여서 PCR을 수행하였다. 한 가지의 프라이머를 가지고 서로 다른 유전형의 DNA 1000 카피를 주형을 사용해서 PCR을 수행한 결과, 11, 16, 18, 31 프라이머 모두 특이적으로 자신의 주형만을 증폭시켰다(도 8). 본 발명의 프라이머는 최적화한 PCR 증폭 조건 하에서 자신의 유형만을 확실히 검출하는 것으로 보아, 서로 다른 프라이머를 가지고 임상시료 내의 HPV 유전자 타이핑이 가능하며, 자궁경부암으로 발전할 가능성이 큰 고위험군에 속하는 HPV 11, 16, 18 유전형을 차별적으로 검출 가능하므로 임상 진단에 매우 중요한 수단이 될 수 있음을 확인할 수 있었다.

< 실시예 5> 재조합 HPV L1 플라스미드를 이용한 프라이머 열 안정성 및 장기 보존 실험

열 안정성 실험 및 장기 보존 실험을 위해서 1000 카피의 플라스미드 30㎕을 DNase 및 RNase가 없는 용기에 15개씩 분주하였다. 열 안정성 실험을 위해 4℃, 22℃, 37℃의 세 가지 온도에 각각 보관하고, 장기 보존 실험을 위해 -80℃의 온도에 각각 보관하였다. 보관 후 3주마다 각각의 온도에서 한 개의 바이알(vial)씩 꺼내어 실시예 3의 방법으로 민감도 실험을 수행하였다. 22℃와 37℃에서 보관 3주 후의 PCR 결과는 대부분 음성이었고 이는 22℃와 37℃에 보관된 표준품의 안전성이 매우 낮음을 의미하였다(도 9). 그러나 4℃와 -80℃에 DNA 표준품을 보관한 지 15주 후에 실험을 수행한 결과 여전히 민감도를 강하게 나타나는 것을 알 수 있었으며, 본 DNA 표준품은 -80℃에서 장기 보존이 가능하다는 것을 보여주었다(도 10a, 도 10b).

< 실시예 6> 재조합 HPV L1 플라스미드를 이용한 프라이머 응용가능성

본 발명에서 개발한 HPV L1 주형 및 프라이머를 이용하여 인간 임상 시료 내에 존재하는 HPV 유전자를 어느 정도로 검출할 수 있는지 알아보기 위하여 실험을 하였다. 횡문근육종(Human rhabdomyosarcoma; RD), HeLa, SLK 세포의 게놈 DNA(genomic DNA)를 게놈 DNA 추출 키트(Qiagen)를 사용하여 추출한 후 분광광도계를 통해서 게놈 DNA의 농도를 계산하였다. 각각의 DNA를 10ng, 100ng으로 희석하고, 100㎕씩 분주하여 -20℃에 보관하였다. 게놈 DNA 배경(genomic DNA background)이 100ng, 1㎍이 되도록 하고 실시예 3의 민감도 실험에서와 같은 주형을 사용하여서 PCR을 수행하였다. PCR 산물의 분석방법은 민감성 시험을 위한 방법과 동일하게 수행하였다. 도 11에서 보는 바와 같이 게놈 DNA의 배경에서 PCR을 수행한 결과 게놈 DNA가 없는 조건에서와 마찬가지로 62.5 카피까지 감지할 수 있었으며, HPV 18 유전자가 존재하는 HeLa 세포에서는 모든 레인에서 양성 반응을 나타냈다.

상기에서 언급한 바와 같이, 본 발명의 HPV 11, 16, 18 및 31의 L1 유전자에 특이적인 프라이머쌍을 사용하여 HPV 감염여부, 감염된 HPV 유전형의 확인, HPV 백신의 유효성 및 위해도 등을 효과적으로 조사할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

사람파필로마바이러스(HPV)의 유전자와 상보적으로 결합 가능한 서열번호 1과 2, 서열번호 3과 4, 서열번호 5와 6 및 서열번호 7과 8로 기재된 염기서열을 가지는 프라이머쌍 중에서 선택되는 프라이머쌍.
HPV의 유전자와 상보적으로 결합 가능한 서열번호 1과 2, 서열번호 3과 4, 서열번호 5와 6 및 서열번호 7과 8로 기재된 염기서열을 가지는 프라이머쌍 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머쌍을 포함하는 HPV의 유전자 검출용 키트.
HPV의 유전자와 상보적으로 결합 가능한 서열번호 1과 2, 서열번호 3과 4, 서열번호 5와 6 및 서열번호 7과 8로 기재된 염기서열을 가지는 프라이머쌍 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머쌍을 사용하여 생물학적 시료의 유전자에 대해 중합효소 연쇄반응을 수행하는 것을 포함하는 HPV의 유전자를 검출하는 방법.
제 3항에 있어서, 서열번호 1과 2로 기재된 염기서열을 가지는 프라이머쌍을 사용하여 HPV11-L1 유전자를 검출하는 방법.
제 3항에 있어서, 서열번호 3과 4로 기재된 염기서열을 가지는 프라이머쌍을 사용하여 HPV16-L1 유전자를 검출하는 방법.
제 3항에 있어서, 서열번호 5와 6으로 기재된 염기서열을 가지는 프라이머쌍을 사용하여 HPV18-L1 유전자를 검출하는 방법.
제 3항에 있어서, 서열번호 7과 8로 기재된 염기서열을 가지는 프라이머쌍을 사용하여 HPV31-L1 유전자를 검출하는 방법.
제 2 항에 있어서, 정량분석이 가능하도록 양성대조군으로서 pGEM-HPV11 L1, pGEM-HPV16 L1, pGEM-HPV18 L1 및 pGEM-HPV31 L1 중에서 선택되는 하나 이상의 플라스미드를 더 포함하는 HPV의 유전자 검출용 키트.