CN1957091A - K－ras寡核苷酸微型阵列及用其检测K－ras突变的方法 - Google Patents

K－ras寡核苷酸微型阵列及用其检测K－ras突变的方法 Download PDF

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Abstract

由于本发明所述K－ras寡核苷酸微型阵列能够通过将竞争性DNA杂交方法应用到点样在一个固体矩阵上的寡核苷酸而检测K－ras突变，而该方法不同于以前报道过的突变检测方法，这样就使得分析更加精确，而且可以减少实验成本和时间。因此，本发明所述K－ras寡核苷酸微型阵列可被用于检测K－ras突变、解释信号传导机制和有关K－ras基因的肿瘤发生的研究。再则，由于本发明所述微型阵列可被用于有突变热点区域如K－ras的其他基因，该微型阵列具有广泛的应用范围。

Description

K-ras寡核苷酸微型阵列及用其检测K-ras突变的方法
                        技术领域
本发明涉及用于在K-ras基因突变热点区域检测突变的一种K-ras寡核苷酸微型阵列、其制造方法以及用其检测K-ras突变的一种方法。
                        背景技术
K-ras是在各种癌症中经过突变的ras基因的一种。在密码子12和13的K-ras基因突变参与肿瘤发生，其引起p21-ras蛋白质(一种K-ras基因产物)的功能修饰，使过度增长信号传到细胞核，刺激细胞生长和分裂。K-ras突变在胰癌的发生率约为90％，在结肠直肠癌的发生率约为50％，在非小细胞肺癌的发生率约为30％，其突变概图表明85％左右的突变发生在密码子12和13(Samowitz WS等人，CancerEpidemiol.Biomarkers Prev.9：1193-1197，2000)。因此，K-ras基因突变的辨别已广泛用作癌症诊断的有用工具，例如，胰癌、结肠直肠癌和非小细胞肺癌，而研究认为其可能同一些肿瘤表型有关(SamowitzWS等人，Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.9：1193-1197，2000；Andreyev HJ等人，BR.J.Cancer 85：692-696，2001；以及Brink M等人，Carcinogenesis 24：703-710，2003)。然而，这种研究通常需要大量的样品以找出K-ras突变和某些临床特征之间的有意义的联系(Andreyev HJ等人，Br.J.Cancer 85：962-696，2001)，在流行病学领域有着对高生产量技术的需求，例如，一种寡核苷酸微型阵列可以准确、快速地处理大量的样品。
具有突变热点的K-ras基因(密码子12和13)已被用作靶基因来测试新突变检测技术，例如“DNA芯片”。然而，以前的研究使用专门的硅装置或复杂的方案以改善其系统(Lopwz-Crapez E等人，Clin.Chem.47：186-192，2001；Prix L等人，Clin.Chem.48：428-435，2002)，现在这些装置或方案不适于对大量样品作准确和经济的评估。
所以，本发明开发了一种K-ras寡核苷酸微型阵列，其通过使用一个自动微型阵列在固体矩阵表面固定寡核苷酸而制得，寡核苷酸被设计成检测K-ras基因突变热点区域的各种突变，以及其使用一种称为竞争性DNA杂交(CDH)的新的杂交法，以便提高效率和产能。本发明所述K-ras寡核苷酸微型阵列可被用于研究中，以检测K-ras突变并解释信号传导机制和同K-ras基因相关的肿瘤发生。
                         发明概述
因而，本发明的一个目的是提供一种寡核苷酸微型阵列，其可被用作快速、可靠的基因诊断装置，以研究信号传导机制和同K-ras基因相关的肿瘤发生以及检测K-ras突变。
根据本发明所述的一个方面，提供了一种用以检测K-ras突变的寡核苷酸微型阵列，其包含多种固定在固体矩阵表面的寡核苷酸，其中寡核苷酸被设计成检测在K-ras基因突变热点的错义突变型，所述寡核苷酸包括具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列的野生型和具有SEQ IDNOs：2-10核苷酸序列的在密码子12上的错义突变型，以及具有SEQ IDNO.11的核苷酸序列的野生型和具有SEQ ID NOs：12-20核苷酸序列的在密码子13上的错义突变型。
因而，根据本发明所述另一个方面，本发明提供了用于检测K-ras突变的方法。
                        附图说明
本发明上述以及其他目的和特征从下述发明描述并结合附图清晰可见；
图1a-1e说明使用本发明所述寡核苷酸微型阵列在结肠癌组织中检测K-ras突变时使用或不使用CDH方法的结果；
1a：D231-对照，                  1b：D231-CDH，
1c：D281-对照，                  1d：D281-CDH
1e：癌症患者的正常组织
                        发明详述
本发明提供了检测K-ras突变的一种寡核苷酸微型阵列，包括使用自动微型阵列仪固定在固体矩阵表面的寡核苷酸，其中寡核苷酸能够检测K-ras基因突变热点区域的各种突变。
首先，寡核苷酸被设计成检测在K-ras基因突变热点区域的密码子12和13的各种可能的错义突变。
具体地说，通过分别用TGT(半胱氨酸)、AGT(丝氨酸)、CGT(精氨酸)、GAT(门冬氨酸)、GCT(丙氨酸)、GTT(缬胺酸)、GGA(甘氨酸)、GGG(甘氨酸)、GGC(甘氨酸)替代GGT(甘氨酸)获得的九种替代寡核苷酸用于密码子1。通过分别用CGC(精氨酸)、AGC(丝氨酸)、TGC(半胱氨酸)、GCC(丙氨酸)、GAC(门冬氨酸)、GTC(缬胺酸)、GGT(甘氨酸)、GGA(甘氨酸)、GGG(甘氨酸)替代GGC(甘氨酸)获得的九种替代寡核苷酸用于密码子12。
根据本发明所述一个方面，本发明所述K-ras寡核苷酸微型阵列有18种点样和固定在固体矩阵表面上的寡核苷酸，寡核苷酸能检测在K-ras基因两个热点密码子的各种错义突变。九种寡核苷酸(M)被设计成包含在各个热点密码子上的所有可能的替代，而一种寡核苷酸(W)用于野生型。这样，共有18种寡核苷酸被用以检测密码子12和13的错义突变。
一种野生型寡核苷酸(W)使各种密码子直接与突变类型比较，其包括纯合和杂合的突变。例如，10种寡核苷酸被点样于密码子12，其中一种是正常的碱基序列，而其他九种则是突变的碱基序列。总的说来，18种突变物寡核苷酸被设计成用于两个热点密码子的18个错义突变类型，2个寡核苷酸用于野生型和阳性对照。每个寡核苷酸被水平四倍点样，以提高被测信号的精度，这样导致了总共点样80个寡核苷酸。由于本发明所述K-ras寡核苷酸微型阵列有三套独立点样于固体矩阵表面上的80个寡核苷酸，它能与三种不同的样品同时杂交。
本发明提供了可用于检测上述K-ras基因突变热点密码子12和13上的所有可能突变，这些突变在所有考察过的案例中以85％以上的频率出现。此外，由于用于本发明所述K-ras寡核苷酸微型阵列的寡核苷酸被用于检测在两种密码子上的所有可能的错义突变，它能检测这些密码子上未被发现的任何错义突变。这就是说，考虑到基因特性，由于本发明所述寡核苷酸被设计成专门用于检测K-ras基因热点区的突变，本发明所述K-ras寡核苷酸微型阵列提供了检测K-ras基因突变的改善的精度和效率。
本发明所述K-ras寡核苷酸微型阵列可以通过使用自动微型阵列在固体矩阵表面上固定多达80个寡核苷酸而制成，其包含下述步骤：
1)将每个寡核苷酸混合在一种微型点样溶液中并分布到一个孔板内；
2)用一个微型阵列将寡核苷酸点样在固体矩阵表面上；
3)在固体矩阵表面固定寡核苷酸并冲洗；
4)将固体矩阵浸泡在95摄氏度水中，使固定的寡核苷酸变性，然后用一种硼氢化钠溶液处理固体矩阵；和
5)冲洗并干燥固体矩阵。
用于步骤(1)中的每个寡核苷酸优选有一个功能基团，其可被用于与固体矩阵表面形成一个稳定的键。例如，每个寡核苷酸可以连接一个12碳间隔团，该间隔团有一个5’氨基修饰，如H2N-(CH2)12-寡核苷酸。这个胺基团和固体矩阵的一个醛基团进行希夫碱反应(Schiff’sbase reaction)，以在两者之间形成一个坚硬的键。12碳间隔团有助于使寡核苷酸和一个荧光染料标记的靶DNA进行接触，从而提高杂交率。
用于步骤(1)中的微型点样溶液可以包括适当的盐和聚合物，以保证固体矩阵上寡核苷酸的使用。
用于步骤(2)中的固体矩阵可以用玻璃、改性的硅树脂、塑料盒或如聚碳酸酯或其凝胶之类的聚合物组成。固体矩阵表面可以涂有化学成分的化合物，其可将寡核苷酸和矩阵基质连接在一起。可用作这种涂料的优选化学品具有功能基团，如醛或环氧基团。在一个优选的实施方案中，本发明使用涂有醛的玻璃滑片。
根据步骤(1)和(2)所述的一个实施方案，用自动定位微型阵列以特殊的方式将80个寡核苷酸安置在固体矩阵上。每个寡核苷酸点优选呈环形，直径范围为100-500微米。固体矩阵的一个优选实施例是3.7cm×7.6cm玻璃滑片，其每个芯片可以容纳100-10,000个点。优选共80个寡核苷酸点，每个点直径为130微米，可以以200-800微米的间隔安排成多行多列，优选为300微米间隔。
在步骤(3)中，通过希夫碱反应，在寡核苷酸胺基团和固体矩阵醛基团之间形成共价键，将寡核苷酸固定在固体矩阵上。用SDS(十二烷基硫酸钠)、SSC(标准柠檬酸盐)、SSPE(盐-磷酸钠-EDTA)等冲洗固体矩阵，以此去除游离未反应的寡核苷酸。
在步骤(4)中，固定的寡核苷酸被变性，通过硼氢化钠处理还原并失活留在固体矩阵上的未反应醛基团。
本发明所述的用上述方法制得的K-ras寡核苷酸微型阵列可以有利地用于检测基因突变，本发明所述的方法比任何传统的基因突变检测方法简单和经济得多。如使用传统方法如SSCP(单链构象多态形)、PTT(蛋白截断试验)、RFLP(限制内切片段多态形)、克隆、直接测序等研究基因突变是否存在平均需花费几天到几个月时间，而使用本发明所述K-ras寡核苷酸微型阵列分析DNA样品的K-ras基因突变所需时间少于10或11小时。另外，本发明所述K-ras寡核苷酸微型阵列的制备简单得多，其生产成本远远低于传统芯片。一旦合成所需的寡核苷酸，就有可能大规模生产本发明的滑片。如使用本发明所述K-ras寡核苷酸微型阵列，所需的试剂数量远远少于任何传统方法要求的数量。
本发明所述K-ras寡核苷酸微型阵列容易用一个定位微型阵列制得，而现有的Affymetrix寡核苷酸微型阵列必须使用复杂昂贵的照相平版技术来制备。
再则，用本发明所述K-ras寡核苷酸微型阵列可以提纯和修饰寡核苷酸，而Affymetrix寡核苷酸微型阵列是通过在固体矩阵表面上直接合成寡核苷酸而制得的，其间不能提纯或修饰寡核苷酸。在本发明所述K-ras寡核苷酸微型阵列中，可以通过提纯寡核苷酸，增加其纯度以及很容易地修饰寡核苷酸来点样高质量的寡核苷酸，减少实验错误。考虑到待点样寡核苷酸的质量决定寡核苷酸微型阵列整体反应的准确度，本发明所述K-ras寡核苷酸微型阵列能够提供较以往更高的实验准确度。
本发明提供了使用K-ras寡核苷酸微型阵列检测K-ras突变的方法，该方法包含下列步骤：
1)制备一个荧光染料标记的DNA样品；
2)使标记的DNA样品与K-ras寡核苷酸微型阵列上的寡核苷酸斑点进行反应；
3)冲洗反应后的阵列，去除未结合的样品DNA；
4)利用荧光读数器检测特定寡核苷酸斑点的杂交模式；和
5)检查是否有基因突变。
在步骤(1)中，通过PCR用荧光染料标记患者的肿瘤样品或血样以制备DNA样品。可以使用适当的软件以及荧光读数器分析荧光染料标记的DNA与寡核苷酸微型阵列上特定的寡核苷酸斑点的杂交。优选的荧光染料包括，但不限于Cy5、Cy3、AlexaTM594氟、Texas Red、荧光素和Lissamine。
在步骤(2)中，将在步骤(1)中制备的荧光染料标记的DNA样品与杂交试液混合并转送到每个寡核苷酸。这时，可以根据竞争性DNA杂交(CDH)法进行杂交反应，该方法基于这样的原理：从病人得到放大的每种混合荧光染料标记的DNA在有限数量的点样寡核苷酸内，在杂交反应中互相竞争。
至于CDH法，除了步骤(1)使用的荧光染料外，DNA样品再被其它两种荧光染料进一步标记。用于该步骤的其它荧光染料包括除步骤(1)使用的荧光染料以外所有可以买到的荧光染料。在本发明所述的一个优选实施方案中，三种荧光染料，即Cy3、Cy5、AlexaTM594氟通过分别用Cy3-、Cy5-、AlexaTM594氟标记的dNTPs放大每个DNA样品而引入DNA。混合各个Cy3-、Cy5-、AlexaTM594氟标记的DNA样品，并在一个微型阵列点样区域内杂交。杂交反应在水蒸气饱和的45-60摄氏度的恒温箱内进行三小时。
然后，冲洗微型阵列，去除未结合的样品DNA，并予以干燥(步骤3)，运用适当的软件(步骤4)用荧光读数器分析得到的荧光。根据每个荧光染料的激发波长，对Cys5、Cy3和Alexa氟分别在632.8纳米、543.8纳米和594纳米处扫描杂交的微型阵列(Lavmar L等人，Nucleic Acids Res.31：e129，2003)。
在步骤(5)中确定了在99％可靠范围的最大值作为阈值，任何荧光水平高于该阈值的信号可以被认为突变存在呈阳性。
本发明所述K-ras寡核苷酸微型阵列可以有效地被用于诊断癌症，如结肠直肠癌、胰癌、非小细胞肺癌、腺癌、鳞状癌等。再则，本发明所述K-ras寡核苷酸微型阵列可以被用作研究信号传导机制和与K-ras基因有关的肿瘤发生的有效诊断工具。
以CDH方法运用K-ras寡核苷酸微型阵列检测K-ras突变的优点如下；
1)可以减少小的DNA断片引起的非特异性结合信号，这些小断片可能和点样寡核苷酸有同一性，在杂交时产生竞争。
2)通过计算突变信号对野生型的比率来进行突变分析(Kim IJ等人，Hardiman G编辑，Microarrays Methods and applications-nuts&bolts.Eagleville，DNA press，249-272，2003；Prix L等人，Clin.Chem.48：428-435，2002)。然后本发明所述方法可以将大于阈值的比率认做突变。所以，他们的比率越大，对做出精确的分析就越有帮助。
3)通过将标有三种不同荧光染料的三种样品混合，本发明所述方法可以减少试验成本和时间。此外，K-ras寡核苷酸微型阵列被设计成有三组独立的寡核苷酸，因此，每个微型阵列能够研究九(3×3)个样品。
尽管基因型和强调并联基因型的DNA汇集中已使用多个荧光团(Lovmar L等人，Nucleic Acids Res.31：e129，2003；Hirschhom JN等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：12164-12169，2000；Lindroos K等人，Nucleic Acids Res.30：e70，2002)，本发明不仅使用标记多种荧光染料的多个DNA样品，而且使它们互相竞争。此外，本发明旨在减少“crosstalk”问题，这是一种一个荧光团的信号在一个以上的波长上被检测出来的现象(Hirschhom JN等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：12164-12169，2000)。由于一些荧光团的激发和发射光谱可能重叠，其信号可以在另一波长激发时发射。为了避免这种现象，本发明使用三种具有不同光谱的不同的荧光染料标记的dNTPs，Cy5-dCTP、Cy3-dCTP和Alexa氟-dUTP，进行CDH法。结果是，通过减少非特异的杂交信号，本发明所述CDH法显示了更清晰的微型阵列的图像(见附图1a-1e)。。还检测到两种野生型信号(密码子12和13)略有减少，原因是各个样品的野生型DNA片段为了杂交而互相竞争。但是，在三种混合样品中少有的同型突变DNA并不竞争，保留了其原有的信号。结果是，当样品有突变时，突变和野生型的信号比率从0.91上升到1.66(见附图1a和1b)，从0.28上升到0.56(见附图1c和1d)。
204个结肠直肠癌患者接受了体细胞K-ras突变存在与否的调查。结果，用K-ras寡核苷酸微型阵列在结肠直肠癌中总共认定50个突变(50/204，24.5％)。其中，28个来自近侧结肠癌(28/103，27.2％)，22个来自远侧结肠直肠癌(22/101，21.8％)。上述检测到的突变被分成四种错义突变，它们造成密码子12和13的氨基酸变化。最常见的突变种类是密码子13中的GGC(Gly)到GAC(Asp，21/50)的突变。其余种类是从GGT(Gly)到GAT(Asp，16/50)、GTT(Val，8/50)和TGT(Cys，5/50)的变化。
突变结果与直接测序100％一致，说明既无假阳性，也无假阴性。为了考查突变概图和表型之间的显著性，运用SPSS软件使用x2或Fisher’s精确试验进行了数据分析。α＝0.05定为显著性水平。发现GGT到GAT的突变类型在近侧结肠癌(13/28)中比远侧结肠癌(3/22，p＝0.014)更普遍，这同以前的报告(Samowitz WS等人，标记CancerEpidemiol.Biomarkers Prev.9：1193-1197，2000；Brink M等人，Carcinogenesis 24：703-710，2003)是一致的。然而，在K-ras突变和性别、年龄、肿瘤大小、分化和TNM阶段之间没有发现有任何显著性关系。
总之，已发现K-ras寡核苷酸微型阵列的结果正好同传统的自动测序相吻合，而根据本发明所述使用CDH法的K-ras寡核苷酸微型阵列可以增加分析多种样品的效率。K-ras寡核苷酸微型阵列是一种敏感快速、高产量的系统，因此适用于需要大量样品的研究，如基于人口的研究。
下述实施例和试验例只用于说明目的，无意限制发明的种类。
实施例1：K-ras寡核苷酸微型阵列的制造
18种寡核苷酸被设计成包括在K-ras基因的两种突变热点密码子(密码子11和12)上的一切可能的替代物，而2种寡核苷酸被用为野生型。所有寡核苷酸均为21个碱基对，各个错配序列位于寡核苷酸中央，如表1所示。在一个热点密码子上有错义突变的寡核苷酸是：在密码子12上SEQ ID NOs.2-10描述的寡核苷酸；在密码子13上SEQ IDNOs.12-20描述的寡核苷酸。SEQ ID NOs.1和11描述的寡核苷酸是野生型。
表1
  SEQ ID NO.   寡核苷酸   序列(5’-3’)
  1   12Wa   GTTGGAGCTGGTGGCGTAGGC
  2   12Mb1   AGTTGGAGCT TGTGGCGTAGG
  3   12M2   AGTTGGAGCT AGTGGCGTAGG
  4   12M3   AGTTGGAGCT CGTGGCGTAGG
  5   12M4   GTTGGAGCT GATGGCGTAGGC
  6   12M5   GTTGGAGCT GCTGGCGTAGGC
  7   12M6   GTTGGAGCT GTTGGCGTAGGC
  8   12M7   TTGGAGCT GGAGGCGTAGGCA
  9   12M8   TTGGAGCT GGGGGCGTAGGCA
  10   12M9   TTGGAGCT GGCGGCGTAGGCA
  11   13W   GGAGCTGGT GGCGTAGGCAAG
  12   13M1   TGGAGCTGGT CGCGTAGGCAA
  13   13M2   TGGAGCTGGT AGCGTAGGCAA
  14   13M3   TGGAGCTGGT TGCGTAGGCAA
  15   13M4   GGAGCTGGT GCCGTAGGCAAG
  16   13M5   GGAGCTGGT GACGTAGGCAAG
  17   13M6   GGAGCTGGT GTCGTAGGCAAG
  18   13M7   GAGCTGGT GGTGTAGGCAAGA
  19   13M8   GAGCTGGT GGAGTAGGCAAGA
  20   13M9   GAGCTGGT GGGGTAGGCAAGA
 aW：野生型，bM：突变型
所有20个寡核苷酸，每个寡核苷酸在5’端有一个用胺残基修饰的12-碳间隔团，其可与醛基团发生希夫碱反应，这些寡核苷酸均从Metabion(德国)获得，并由HPLC提纯。
本发明所述K-ras寡核苷酸微型阵列由上述方法(Kim IJ等人，Hardiman G编辑，Microarrays methods and applications-nuts&bolts.Eagleville，DNApress，249-72，2003)制得。尤其是，每个寡核苷酸用一种微型点样试液(TeleChem International Inc，Sunnyvale，CA)以1∶1的混合率混合，40微升的每种寡核苷酸的被转到一个96孔板。40pmol/μl的寡核苷酸被用于密码子12和13的点样。带电的96孔板被置于一个定位微型阵列内后(Microsys 5100Cartesian，Cartesian TechnologiesInc，Irvine，CA)，每个寡核苷酸被印在一个涂有醛的玻璃滑片上(26×76×1mm，CEL Associates Inc，Houston，TX)。每个直径为130μm的斑点以300微米的间隔被排列成多行多列。共有80(20×4)个寡核苷酸以四倍的形式排列，包括覆盖了K-ras基因的密码子12和13的2种野生型和18个错义突变型。3套寡核苷酸在一个滑片上分开点样，这样3个不同的样品可以用一个微型阵列杂交。
用0.2％SDS冲洗点样有寡核苷酸的玻璃滑片两次，然后再用蒸馏水冲洗一次。玻璃滑片被浸泡在95度热水中使寡核苷酸变性，然后浸泡在硼氢化钠试液中5分钟，失活未反应的醛基团。然后，用0.2％SDS清洗玻璃滑片两次，然后再用蒸馏水清洗一次，离心，并干燥。
实施例2：用K-ras寡核苷酸微型阵列研究K-ras突变
(步骤1)DNA样品的制备
首尔国立大学医院和韩国国立癌症中心共有204名结肠直肠癌患者接受体细胞是否存在K-ras的调查。从所有病人那儿获得了书面同意。在204个结肠直肠癌中，103个来自近侧结肠(盲肠至脾弯处)，101个来自远结肠直肠(脾弯处至直肠)。再者，结肠直肠癌患者的正常组织被用作阴性对照。
使用TRI试剂(分子研究中心，美国俄亥俄州辛辛那提市)，如以前所述(Kim IJ等人，Clin.Cancer Res.9：2920-2925，2003)从冰冻样品中提取基因组DNA，。为产生荧光染料标记的DNA样品，用提取的DNA作为模板，用SEQ ID NOs 21和22这两对引物(Metabion，Germany)进行PCR放大，方法如以前所述(Kim IJ等人，Clin.Cancer Res.8：457-463，2002；Kim IJ等人，Clin.Cancer Res.9：2920-2925，2003)。
PCR反应溶液(25ul)包括100ng基因组DNA，10pmol的各种引物，dATP，dTTP和dGTP(MBIFermentas)各50μM，的荧光染料标记的Cy5-dCTP(AmershamBioscience)和dCTP各10μM。在可程控的热循环控制装置(Perkin Elmer Cetus 9600；罗氏分子系统公司，新泽西)中，在94摄氏度条件下变性五分钟，引发反应。PCR条件包括94摄氏度30秒、56摄氏度30秒和72摄氏度1分钟，共35各循环，最后在72摄氏度时延长7分钟。
至于CDH法，DNA样品标有另一荧光染料：Cy3-dCTP(AmershamBioscience)或CromatideTM-dUTP-Alexa氟594(MolecularProbe)。在CDH的PCR反应中，每个样品用那些荧光标记的dNTPs放大，与DNA融合。
PCR反应后，用一个提纯试剂盒(QIAquick PCR提纯试剂盒，Qiagen Inc，Valencia，CA)提纯每种Cy5-、Cy3-和AlexaTM 594标记的PCR产物，并用0.05U的DNase I(Takara，Shiga，Japan)在25摄氏度时消化3分钟。剩余的酶在80摄氏度时失活10分钟，分别回收Cy5-、Cy3-和AlexaTM 594标记样品。
(步骤2)杂交反应与分析
混合在步骤(1)中制备的Cy5-、Cy3-和AlexaTM 594标记的DNA样品，并在5x杂交试液中(Hybit，TeleChem International Inc，Sunnyvale，CA)再悬浮到2-4μl的容积。2μl的混合DNA样品被滴到实施例1制造的玻璃滑片上，玻璃滑片盖着一个盖玻片。杂交反应通过在56摄氏度在一个饱和蒸汽管对玻璃滑片孵育于时反应2.5小时进行。样品这一程序使得从病人那儿得到放大并有特定标记的DNA样品在有限量的点样寡核苷酸的杂交反应中互相竞争。
在0.2％SDS+0.5xSSC的缓冲剂中室温下清洗杂交的玻璃滑片15-30分钟，然后在蒸馏水中清洗5分钟，接着离心和干燥。通过ScanArray Lite的图像分析法(Parkard Instrument Co，Meriden，CT)和QuantArray(version 2.0，Parkard Instrument Co，Meriden，CT)扫描玻璃滑片，计算每个斑点的密度，其代表了来自肿瘤的杂交DNA的量。根据每个荧光染料的激发波长，对于Cy5、Cy3、AlexaTM594，分别用632.8纳米、543.8纳米和594纳米的波长扫描杂交的微型阵列(Lovmar L等人，Nucleic Acids Res.31：e129，2003).
两个野生型信号互相比较，通过信号标准化调整到相同。每个密码子上其余的18个信号作为野生型信号以同样方式予以调整。在信号标准化后，如前所述对所有信号进行重新分析(Kim，IJ等人，Clin.Cancer Res.8：457-463，2002)。计算背景信号的平均值(BA)和标准偏差(BSD)，截止阈确定为BA+2.58BSD。(BA+2.58BSD)指99％信任区间的上限，高于该值的信号认作为有意义信号。所有数据分析使用SigmaPlot(SPSS Inc.，San Rafael，CA)进行，使用Microsoft Excel程序计算平均值和标准偏差。
结果是，结肠直肠癌中共有50个(50/204，24.5％)突变用K-ras寡核苷酸微型阵列得到了辨认。其中，28个来自近侧结肠癌(28/103，27.2％)，22个来自远结肠直肠癌(22/101，21.8％)。检测到共有四种错义突变造成了密码子12和13处的氨基酸变化。最常见的突变类型是密码子13处的GGC(Gly)变成GAC(Asp，21/50)。其他突变类型是从GGT(Gly)变化为GAC(Asp，16/50)，GTT(Val，8/50)和TGT(Cys，5/50)。但是，在癌症病人的正常组织中没有检测到这种突变类型。
附图1a-1e表示使用(CDH组)和不使用CDH法(对照组)时K-ras寡核苷酸微型阵列的扫描图像及其信号强度。附图1a是用D231样品的常规杂交结果，该样品用Cy5标记的dCTP放大(D231-对照)。附图1b是用D231样品的竞争性杂交，该样品用Cy5-，Cy3-和AlexaTM594标记的dCTP放大(D231-CDH)。附图1c是用D281样品的常规杂交，该样品用Cy3标记的dCTP放大(D281-对照)。附图1d是用D231样品的竞争性杂交，该样品用Cy5-，Cy3-和AlexaTM594标记的dCTP放大(D281-CDH)。使用Cy5标记的dCTP在D231样品中检测到密码子13的错义突变(GGC突变为GAC)，使用Cy3标记的dCTP在D281样品中检测到密码子12的错义突变(GGT突变为GAT)。附图1e是癌症患者正常组织(阴性对照)的竞争性杂交的结果，其中没有检测到K-ras突变。突变用箭头表示，基于野生型信号的标准化后，对点样寡核苷酸的信号强度作图。还检测到一些非特异结合(*)。将CDH(附图1b和1d)和其对照(附图1a和1c)相比较，发现非特异性结合的信号减少，而突变和野生比率(R)增加(D231；0.91变为1.66，D281；0.28变为0.56)。还检测到野生型的两个信号(密码子12和13)有所降低。原因是每个样品的野生型DNAs断片参与了杂交。但是，突变DNA在三种混合样品的状态中很少有共同序列，不参与竞争，保留了其原始信号。
为了调查突变概图和表型的显著性，以SPSS软件使用x2或Fisher’s精确试验进行了数据分析。α＝0.05定为显著性水平。结果是，发现GGT变为GAT的类型在近侧结肠癌(13/28)中比远侧结肠癌(3/22，p＝0.014)更普遍，符合原先的报告(Samowitz WS等人，标记Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.9：1193-1197，2000；Brink M等人，Carcinogenesis 24：703-710，2003).然而，K-ras突变与性别、年龄、肿瘤大小、分化和TNM之间没有检测到显著性关系。
实施例3：通过K-ras寡核苷酸微型阵列检测到的K-ras突变的确以
为了确认本发明所述的K-ras寡核苷酸微型阵列检测到的K-ras突变，对205个结肠直肠癌样品作了双向测序分析，如前描述(Park，JH等人，Clin.Genet.64：48-53，2003)。关于测序，使用了原先报告过的SEQ ID NOs：23和24引物(Lagarda H等人，J.Pathol.193：193-199，2001)。用与实施例2的步骤(1)中描述的同样方法进行了PCR，不过使用的是传统的dNTP混合物。
使用Taq双脱氧终止子循环测序试剂盒(Taq dideoxy terminatorcyclesequencing kit)和ABI 3100DNA测序仪(Applied Biosystems，Forster City，CA)进行双向测序。
结果是，突变结果100％与直接测序吻合，表明既无假阳性，亦无假阴性。
尽管本发明的实施方案已描述和说明，但是显然只要不偏离本发明所述的主旨可以进行各种变化和改动，该变化和改动受到权利要求所述范围的限制。
                           序列表
<110>国立癌中心
<120>K-ras寡核苷酸微型阵列及用其检测K-ras突变的方法
<130>PCA40217-NCC
<150>KR10-2004-28926
<151>2004-04-27
<160>24
<170>Kopatentln 1.71
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>12W
<400>1
gttggagctg gtggcgtagg c                                              21
<210>2
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>12M1
<400>2
agttggagct tgtggcgtag g                                              21
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
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agttggagct agtggcgtag g                                              21
<210>4
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>4
agttggagct cgtggcgtag g                                              21
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<212>DNA
<213>人工序列
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gttggagctg atggcgtagg c                                              21
<210>6
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<212>DNA
<213>人工序列
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gttggagctg ctggcgtagg c                                              21
<210>7
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>12M6
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gttggagctg ttggcgtagg c                                              21
<210>8
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>12M7
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ttggagctgg aggcgtaggc a                                              21
<210>g
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<212>DNA
<213>人工序列
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ttggagctgg gggcgtaggc a                                              21
<210>10
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>12M9
<400>10
ttggagctgg cggcgtaggc a                                              21
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>13W
<400>11
ggagctggtg gcgtaggcaa g                                              21
<210>12
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>12
tggagctggt cgcgtaggca a                                              21
<210>13
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<212>DNA
<213>人工序列
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<400>13
tggagctggt agcgtaggca a                                              21
<210>14
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>13M3
<400>14
tggagctggt tgcgtaggca a                                              21
<210>15
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>12M4
<400>15
ggagctggtg ccgtaggcaa g                                              21
<210>16
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>13M5
<400>16
ggagctggtg acgtaggcaa g                                              21
<210>17
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>13M6
<400>17
ggagctggtg tcgtaggcaa g                                              21
<210>18
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>13M7
<400>18
gagctggtgg tgtaggcaag a                                              21
<210>19
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>13M8
<400>19
gagctggtgg agtaggcaag a                                              21
<210>20
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>13M9
<400>20
gagctggtgg ggtaggcaag a                                              21
<210>21
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正义引物
<400>21
ggcctgctga aaatgactga atat                                           24
<210>22
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义引物
<400>22
tgttggatca tattcgtcca caaaatg                                        27
<210>23
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>测序用正义引物
<400>23
ggtggagtat ttgatagtgt a                                              21
<210>24
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>测序用反义引物
<400>24
ggtcctgcac cagtaatatg ca                                             22

Claims (9)

1.一种用于检测K-ras突变的K-ras寡核苷酸微型阵列，其包含多种固定在固体矩阵表面的寡核苷酸，其中寡核苷酸被设计成用于检测在K-ras基因突变热点区的错义突变型，所述寡核苷酸包括具有SEQID NO.1的核苷酸序列的野生型和具有SEQ ID NOs：2-10核苷酸序列的密码子12的错义突变型，以及具有SEQ ID NO.11的核苷酸序列的野生型和具有SEQ ID NOs：12-20核苷酸序列的密码子13的错义突变型。
2.如权利要求1所述的K-ras寡核苷酸微型阵列，其中每个寡核苷酸有一个含5’氨基修饰的12碳间隔团，其中固体矩阵涂有醛或胺。
3.如权利要求2所述的K-ras寡核苷酸微型阵列，其中通过在寡核苷酸的胺基团和固体矩阵的醛基团之间以希夫碱反应的方式形成共价键，将寡核苷酸固定在固体矩阵表面。
4.一种使用权利要求1所述的K-ras寡核苷酸微型阵列检测K-ras突变的方法，包括
1)制备荧光染料标记的DNA；
2)使标记的DNA样品在K-ras寡核苷酸微型阵列上与寡核苷酸斑点进行反应；
3)冲洗反应后的微型阵列，去除未结合的样品DNA；
4)利用荧光读数器检测特异的寡核苷酸斑点的杂交形式；和
5)检查是否有基因突变的存在。
5.如权利要求4所述的方法，其中样品是从目标病人得到的肿瘤样品或血样。
6.如权利要求4所述的方法，其中杂交反应根据竞争性DNA杂交(CDH)法进行。
7.如权利要求4所述的方法，其中竞争性DNA杂交法包括下述步骤：混合用不同荧光染料标记的dNTP放大的至少两个样品；将样品混合物滴于微型阵列表面一个点样的寡核苷酸内；使样品在有限数量内的点样的寡核苷酸的杂交反应中互相竞争。
8.如权利要求7所述的方法，其中荧光染料选自Cy5，Cy3，Alexa氟，Texas Red，荧光素和Lissanmine。
9.如权利要求4所述的方法，其中杂交反应在充满水蒸气的45-60摄氏度的恒温室进行3-9小时。
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