CN105648039A - 一种高灵敏度反向斑点杂交方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高灵敏度反向斑点杂交方法，该方法通过在金属膜表面上实现核酸杂交过程与碱性磷酸酶联过程合二为一进行，从而可以在金属膜表面直接形成碱性磷酸酶标记核酸杂交体的偶联物。本发明通过一步反应后的显色反应，根据着色的深浅以及杂交信号与金属膜的强烈色差，可以用肉眼快速判断核酸杂交的结果，极大提高了反向斑点杂交的检测灵敏度与分辨能力。

Description

一种高灵敏度反向斑点杂交方法及应用

技术领域

本发明涉及一种反向斑点杂交方法，特别涉及一种高灵敏度反向斑点杂交方法。

背景技术

斑点杂交方法首先由Kafato等发展起来，用于在固相支持物上固定几种核酸样品，然后用合适的探针与已固定的样品杂交，并由此判断靶序列的浓度。通过估计样品点发射出的信号强度，与已知浓度的标准品信号强度进行比较，该方法还可以进一步确定待测样品中靶序列的量。应用斑点杂交方法检测序列变异时，若靶序列内存在突变，则其扩增产物在严格的条件下无法与探针杂交，无杂交信号就表示目的基因存在突变。多年来，斑点杂交并未受到研究者的青睐，原因之一在于同一张膜上同样的样品杂交信号有时不稳定。此外，正向杂交须先将PCR扩增产物固定，再与探针进行杂交，这样就要对每个标本的扩增产物进行固定，增加了操作步骤。

反向斑点杂交则是由Saiki等提出的一种斑点杂交技术，该技术采用固化了多种特异性探针的固相支持物与扩增靶序列杂交，使一次杂交即可同时筛查被检DNA中的多种突变。这种以固相支持物上固定探针取代固定靶核酸的方式，改变了传统斑点杂交法一次只能检测一种突变的模式，具有快速、简便、重复性好以及信号稳定的特点，尤其在基因突变检测、基因分型、病原体的检测等领域有其独特的优势。

现有的反向斑点杂交技术都是以硝酸纤维素膜或尼龙膜作为固相支持物，不仅易于破碎，涉及的反应溶液和反应步骤众多，效率较低，而且检测待测样品中靶序列的灵敏度不高，分辨能力较差，容易出现假阳性和假阴性，难以满足医院临床检测的需求。

出于这种考虑，本发明的发明人进行了研究，目的是解决相关领域现有技术所暴露出来的问题，期望提供一种特异性高、耗时短、易操作的高灵敏度反向斑点杂交方法及其在检测K-ras基因突变中的应用。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种反向斑点杂交方法。该方法通过在金属膜表面上实现核酸杂交过程与碱性磷酸酶联过程合二为一进行，从而可以在金属膜表面直接形成碱性磷酸酶标记核酸杂交体的偶联物。本发明通过一步反应后的显色反应，根据着色的深浅以及杂交信号与金属膜的强烈色差，可以用肉眼快速判断核酸杂交的结果，极大提高了反向斑点杂交的检测灵敏度与分辨能力。

本发明的又一目的在于提供所述方法在检测K-ras基因突变中的应用。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种高灵敏度反向斑点杂交方法，其包括如下步骤：

A)将至少一种核酸探针固定在固相支持物负载的金属膜表面；

B)利用预处理液对所述金属膜表面进行预处理；

C)将所述核酸探针在包含碱性磷酸酶标记链霉亲和素的杂交液中与生物素标记的靶核酸进行一步反应；

D)步骤C)中反应完成后，利用后处理液对所述金属膜表面进行后处理；

E)将包含底物的显色溶液与金属膜表面接触进行显色反应。

本发明的方法在核酸探针与靶核酸杂交的过程中同步实现了碱性磷酸酶标记链霉亲和素与生物素的结合过程，从而可以在金属膜表面直接形成碱性磷酸酶标记核酸杂交体的偶联物，不仅省去了传统反向斑点杂交方法中在杂交反应后需要单独进行酶联反应的步骤，缩短了传统反向斑点杂交方法操作的耗时，而且促进了核酸杂交，提高了碱性磷酸酶标记效率，使得金属膜表面单位面积上覆盖的碱性磷酸酶标记核酸杂交体的偶联物的数量大大增加，再通过显色反应，根据着色的深浅以及杂交信号与金属膜的强烈色差，可以用肉眼快速判断核酸杂交的结果，在同等条件下明显提高了传统核酸反向斑点杂交方法的检测灵敏度与分辨能力。

根据本发明的一个具体实施例，所述金属膜选自金膜、银膜、铜膜和铝膜，优选银膜和铝膜，所述金属膜的厚度为10nm～100nm。

金属是一种具有光泽的物质，其对可见光强烈反射。由于碱性磷酸酶催化底物可产生化学显色反应，能够在金属膜表面产生颜色变化，从而可以通过肉眼直观、快速地观察金属膜表面核酸杂交反应前后斑点颜色的深浅，以准确判断样品中含有的靶核酸情况。作为本发明的一个优选实施例，所述的金属膜优选银膜或铝膜。纳米级的银膜或铝膜能够呈现较好的反光性能，可以明显提高显色反应后检测靶核酸的分辨能力。此外，金属膜还结实耐用，易于清洗，容易去除杂交背景。

根据本发明的一个具体实施例，所述固相支持物选自硝酸纤维素膜、尼龙膜、硅片、载玻片或塑料片，优选塑料片，更优选环烯烃共聚物塑料片。

环烯烃共聚物是一种由环烯烃与α-烯烃聚合而成的高附加值热塑性工程塑料，具有很高的透明度。本发明的发明人经过大量实验与创造性劳动发现，环烯烃共聚物塑料表面能够很好地与金属膜结合，不仅金属膜不容易从塑料表面脱落，而且反光性能非常好，在其表面负载一层纳米厚度的金属膜后，碱性磷酸酶催化底物的显色反应效果更为明显，可以进一步提高本发明中的方法检测靶核酸的灵敏度与分辨能力。

根据本发明的一个优选实施例，负载有金属膜的固相支持物在使用前被真空封装。

在本发明的方法中，金属膜负载到固相支持物表面的方法以及核酸探针在金属膜表面的固定方法均在本领域技术人员的知识范围内。作为一个优选的实施例，金属膜可以通过真空镀膜的方法蒸镀到固相支持物表面，核酸探针可以通过末端连接的巯基基团与金属膜实现固定连接。

在本发明的方法中，所述碱性磷酸酶是一种同源二聚体蛋白，是一种含锌的金属酶。每分子酶至少含2个Zn原子。酶上包含3种类型的金属结合位点，即所谓的催化结合位点、结构结合位点和调节结合位点。其中两个催化结合位点的结合则只会导致一个亚单位的磷酸化，即负协作亚单位之间发生相互作用。

在本发明的方法中，所述生物素有两个环状结构I和II。其中，I环为咪唑酮环，是其与链霉亲和素结合的主要部位；II环为噻吩环，C₂上有一戊酸侧链；生物素分子通过其末端的羧基与本发明所述的靶核酸连接，从而标记在靶核酸分子上。

在本发明的方法中，所述链霉亲和素是由链霉菌分泌的一种蛋白质，其分子由4条相同的肽链组成，每条肽链都能结合一个生物素，因此每个链霉亲和素分子能结合4个生物素分子。此外，每条肽链的氨基酸组成中，甘氨酸和丙氨酸的含量较大，肽链中的色氨酸残基是连接生物素的活性基团。所述链霉亲和素与生物素二者亲和结合的常数(K)为1015L/mol。在本发明的方法中，靶核酸与核酸探针杂交的同时，链霉亲和素与生物素也进行亲和结合，因此杂交液中的碱性磷酸酶标记链霉亲和素分子与固定在固相支持物表面的核酸探针分子在一步反应中竞争性结合生物素标记的靶核酸分子。

本发明的发明人经过大量实验与创造性劳动发现，本发明的方法将所述碱性磷酸酶标记链霉亲和素直接加入到杂交液中，一方面能够使得碱性磷酸酶标记链霉亲和素与生物素标记靶核酸充分的结合；另一方面还能够促进核酸杂交效率，缩短核酸杂交反应的时间。

根据本发明的一个具体实施例，步骤C)中所述碱性磷酸酶标记链霉亲和素在杂交液中的浓度为0.05～2μg/ml，优选0.1～1.5μg/ml，更优选0.5～1.2μg/ml。在本发明的方法中，可以列举的所述碱性磷酸酶标记链霉亲和素在杂交液中的浓度包括但不限于：0.05μg/ml、0.06μg/ml、0.07μg/ml、0.08μg/ml、0.09μg/ml、0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.3μg/ml、0.4μg/ml、0.5μg/ml、0.6μg/ml、0.7μg/ml、0.8μg/ml、0.9μg/ml、1μg/ml、1.1μg/ml、1.2μg/ml、1.5μg/ml和2μg/ml。

在本发明的方法中，所述碱性磷酸酶标记链霉亲和素在杂交液中的浓度是本发明的重要方面。本发明的发明人经过大量试验与创造性劳动发现，如果碱性磷酸酶标记链霉亲和素在杂交液中的浓度过低，那么影响靶核酸检测的灵敏度；如果碱性磷酸酶标记链霉亲和素在杂交液中的浓度过高，那么容易带来非特异性吸附现象，影响靶核酸检测结果的准确性。

根据本发明的一个具体实施例，步骤B)中所述预处理液包括胱胺、脂肪醇聚氧乙烯醚和异构醇；其中，所述脂肪醇聚氧乙烯醚选自C₁₇～C₁₉的脂肪醇聚氧乙烯醚，所述异构醇选自C₁₀～C₁₃异构醇。

根据本发明的一个具体实施例，在所述预处理液中，胱胺为3～20重量份，脂肪醇聚氧乙烯醚为2～18重量份以及异构醇为0.2～9重量份；优选地，胱胺为5～10重量份，脂肪醇聚氧乙烯醚为3～12重量份以及异构醇为2～8重量份。

本发明的发明人经过大量实验与创造性劳动发现，胱胺与脂肪醇聚氧乙烯醚在预处理液中协同配合作用，不仅能够有效封闭金属膜表面的非特异性活性位点，提高检测的特异性，而且能够在金属膜表面形成一层保护层，有效防止使用中的金属膜表面被氧化。本发明采用高碳原子数的异构醇，一方面可以提高胱胺的溶解性，使其获得较高的增容参数与分子自组装活性能力，另一方面可以提高胱胺与脂肪醇聚氧乙烯醚在固相支持物表面的吸附效果。

根据本发明的一个具体实施例，步骤B)中所述预处理是将所述固相支持物浸泡在25～37℃温度的所述预处理液中30～60min。

预处理液的温度以及固相支持物在其中的浸泡时间直接影响胱胺与脂肪醇聚氧乙烯醚在固相支持物表面的吸附效果。温度较低或浸泡时间较短，吸附效果较差；温度过高或浸泡时间过长，不仅吸附在固相支持物表面的靶DNA构象变化，影响后期核酸杂交效率，而且固相支持物表面负载的金属膜有可能会脱落。本发明的发明人通过大量试验与创造性劳动发现，将所述固相支持物浸泡在25～37℃的所述预处理液中30～60min，预处理效果较好。

根据本发明的一个具体实施例，步骤C)中所述杂交液包括锌离子、镁离子、表面活性剂和阳离子型聚合物；其中，所述表面活性剂选自吐温和曲拉通，所述阳离子型聚合物选自阳离子聚丙烯酰胺、多聚赖氨酸和聚合氯化铝。

根据本发明的一个具体实施例，在所述杂交液中，锌离子为0.001～0.1mol/L，镁离子为0.001～0.1mol/L，表面活性剂占杂交液的0.01～2％(v/v)，阳离子型聚合物占杂交液的0.01～0.5％(w/v)；优选地，锌离子为0.005～0.05mol/L，镁离子为0.005～0.05mol/L，表面活性剂占杂交液的0.05～1％(v/v)，阳离子型聚合物占杂交液的0.05～0.2％(w/v)。

根据本发明的一个具体实施例，所述锌离子可以选自含锌离子的可溶性盐。可用作本发明的所述含锌离子的可溶性盐的实例包括：硫酸锌、氯化锌以及其他各种在溶液状态可以解离出锌离子的盐。

根据本发明的一个具体实施例，所述镁离子可以选自含镁离子的可溶性盐。可用作本发明的所述含镁离子的可溶性盐的实例包括：硫酸镁、乙酸镁、氯化镁以及其他各种在溶液状态可以解离出镁离子的盐。

根据本发明的一个具体实施例，所述吐温选自吐温20(TWEEN-20)、吐温21(TWEEN-21)、吐温40(TWEEN-40)、吐温60(TWEEN-60)、吐温61(TWEEN-61)、吐温80(TWEEN-80)、吐温81(TWEEN-81)和吐温85(TWEEN-85)，其中吐温20是特别优选的。

根据本发明的一个具体实施例，所述曲拉通选自曲拉通X-100(TritonX-100)、曲拉通X-114(TritonX-114)和曲拉通X-200(TritonX-200)，其中，曲拉通X-100是特别优选的。

在本发明的方法中，酸、碱、盐离子、温度条件的变化都会改变甚至使碱性磷酸酶完全失去活性，因此为了实现本发明的目的之一，杂交液成分的选择是极为重要的方面。在本发明的方法中，通过在杂交液中添加锌离子、镁离子、表面活性剂以及阳离子型聚合物，一方面有助于提高核酸杂交效率，另一方面防止杂交液中的碱性磷酸酶标记链霉亲和素因吸附而变性，再一方面防止碱性磷酸酶标记链霉亲和素分子之间因相互作用而导致的聚合变性。

在本发明的方法中，所述阳离子型聚合物能够与生物素标记的DNA探针产生静电吸附作用，使单链DNA分子(带许多负电荷)带上一个正电荷部分，从而在DNA杂交过程中同步吸附到固相支持物的表面。由于碱性磷酸酶标记链霉亲和素也带有正电荷，这样就避免了碱性磷酸酶非特异性吸附到固相支持物的表面。此外，所述阳离子型聚合物可以使得碱性磷酸酶标记链霉亲和素在杂交液中形成均匀悬液，使得杂交反应完成以后标记在核酸偶联物上的碱性磷酸酶保持活性状态，从而使得碱性磷酸酶构象的平衡转换朝着天然状态移动。

在本发明的方法中，所述杂交液中还可以包括杂交促进剂，所述杂交促进剂在本质上是本领域技术人员所已知的，可作为本发明所述杂交促进剂的实例包括但不限于：硫酸葡聚糖、聚乙二醇、酚或硫氰酸胍。

在本发明的方法中，所述杂交液中还可以包括其他成分，可以列举的杂交液中其他成分的实例包括但不限于：氯化钠、杂交缓冲溶液、Denhardt’s溶液、十二烷基肌氨酸钠或十二烷基磺酸钠。可以用于本发明所述杂交缓冲溶液的实例包括但不限于：柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液或Tris-盐酸缓冲溶液。

在本发明的方法中，所述杂交液不包括乙二胺四乙酸盐、无机磷酸盐和乙醇胺。

根据本发明的一个具体实施例，步骤D)中所述后处理液包括C₈～C₁₈烷基葡萄糖苷，优选C₉～C₁₃烷基葡萄糖苷；所述烷基葡萄糖苷占后处理液的0.5～5％(w/v)，优选1～4％(w/v)。

根据本发明的一个具体实施例，步骤D)中所述后处理液的PH为9.0～10.0。

本发明的方法利用后处理液对杂交反应完成后的固相支持物表面进行洗涤是非常重要的步骤，一方面该步骤可以将步骤C)中未与靶DNA杂交的以及非特异性杂交的生物素标记DNA探针分子从固相支持物表面洗去，并将特异性杂交体保留在固相支持物表面；另一方面该步骤能够保持碱性磷酸酶的活性，可以保证后续步骤E)中的显色的效率，背景反差对比更好。

根据本发明的一个具体实施例，步骤D)中所述后处理是指利用后处理液对所述金属膜表面洗涤3～5次。

根据本发明的一个具体实施例，步骤C)中所述反应的温度为35～50℃，反应时间为5～30min；优选地，反应温度37～42℃，反应时间10～15min。

在本发明的方法中，由于在核酸探针与靶核酸杂交反应的过程中同步实现了酶联反应过程，因此需要严格控制杂交反应的时间和温度。本发明的发明人经过大量实验和创造性劳动发现，如果杂交反应时间较短或杂交反应温度较低，核酸杂交效率将会降低，难以在固相支持物表面形成稳定的双链，影响靶核酸检测的灵敏度；反之，如果杂交反应时间较长或杂交反应温度较高，碱性磷酸酶标记链霉亲和素在杂交液中容易失活，影响靶核酸检测的特异性。反应温度为35～50℃、反应时间为5～30min时比较合适，优选反应温度为37～42℃，反应时间为10～15min，此时靶核酸检测的灵敏度和特异性较高。

根据本发明的一个具体实施例，所述核酸探针选自长度为15～40个碱基的寡核苷酸探针，优选选自长度为15～25个碱基的寡核苷酸探针。特别优选的核酸探针的长度包括15、16、17、18、19、20、21、22、23、24和25个碱基。

本发明的方法通过调整核酸探针的长度和组成，降低了核酸探针与生物素标记靶核酸杂交的温度，从而使得杂交反应与酶联反应能够统一成一个反应过程进行。本发明的发明人经过大量实验发现，所述核酸探针选自长度为15～40个碱基的寡核苷酸探针时比较合适，优选选自长度为15～25个碱基的寡核苷酸探针，此时一步反应的温度可以为37～42℃。

在本发明的方法中，核酸探针长度的选择的依据是：如果核酸探针长度过低，虽然可以提高探针杂交的特异性，但是会显著降低探针杂交的灵敏度；如果核酸探针长度过长，可以进一步提高探针杂交的灵敏度，但探针杂交特异性会显著降低。对于过长的核酸探针，也不能够通过提高杂交温度来提高探针杂交的特异性，因为过高的温度会使得杂交体系中的碱性磷酸酶标记链霉亲和素失活。综合上面各种因素，同时考虑到探针的GC含量对杂交Tm值得影响，并经实验验证，15～25个核苷酸的寡核苷酸探针是特别优选的。

根据本发明的一个具体实施例，步骤A)中所述核酸探针还包括阳性质控探针和阴性质控探针。其中，所述阳性质控探针可以是人Actin基因探针；所述阴性探针可以是引物设计软件随机生成的一段序列，其特点是不与任何生物的核酸序列相似。

根据本发明的一个具体实施例，在步骤A)之前还包括使用用于扩增靶核酸的生物素标记的引物进行PCR反应而扩增样品中靶核酸的步骤。

在本发明的方法中，所述生物素标记靶核酸可以通过如下方法制备得到：首先对样品中的靶核酸进行分离纯化，然后使用用于扩增靶核酸的生物素标记的引物对分离纯化的靶核酸进行PCR扩增得到扩增样品的靶核酸，以提高检测的灵敏度。

根据本发明的一个具体实施例，在步骤A)之前还包括在生物素标记脱氧核苷酸的存在下进行PCR反应而扩增样品中靶核酸的步骤。

在本发明的方法中，所述生物素标记靶核酸可以通过如下方法制备得到：首先对样品中的靶核酸进行分离纯化，然后在生物素标记脱氧核苷酸的存在下对分离纯化的靶核酸进行PCR扩增得到扩增样品的靶核酸，以提高检测的灵敏度。

根据本发明的一个具体实施例，所述包含底物的显色溶液包括但不限于：硝基蓝四氮唑(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸(BCIP)的混合溶液或坚牢红与萘酚ASMX的混合溶液。在碱性磷酸酶的催化下，BCIP会被水解产生强反应性的产物，该产物会和NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的NBT-formazan。

根据本发明的一个具体实施例，所述生物素标记的靶核酸在进行杂交反应前需要进行变性，变性的方法可以是本领域技术人员所熟知的。

根据本发明的又一方面，本发明还提供了所述方法在检测K-ras基因突变中的应用。

将本发明的方法用于检测K-ras基因突变，在核酸探针与靶核酸杂交的过程中同步实现了碱性磷酸酶标记链霉亲和素与生物素的结合过程，从而可以在金属膜表面直接形成碱性磷酸酶标记核酸杂交体的偶联物，不仅省去了传统缩短了传统K-ras基因突变检测操作的耗时，而且促进了核酸杂交，提高了碱性磷酸酶标记效率，使得金属膜表面单位面积上覆盖的碱性磷酸酶标记核酸杂交体的偶联物的数量大大增加，再通过显色反应，根据着色的深浅以及杂交信号与金属膜的强烈色差，可以用肉眼快速判断核酸杂交的结果，在同等条件下明显提高了传统K-ras基因突变的检测灵敏度与分辨能力。

在本发明的方法中，所述的“核酸”术语是总括表示核糖核酸(即RNA)、脱氧核糖核酸(即DNA)、肽核酸(即PNA)、甲基磷酸酯核酸、S-低聚、cDNA和cRNA，以及任何低聚核苷酸和多核苷酸等、核酸及核酸类似体的术语，这样的核酸可以是天然存在的，也可以是人工合成的。

在本发明的方法中，所述的“核酸探针”是指在含有与靶序列互补的碱基序列核酸中，固定于固相支持物表面的核酸片段，核酸探针具有与所述靶序列至少一部分互补的序列，由此，可在适宜的条件下与靶序列进行杂交。

在本发明的方法中，所述的“靶核酸”是指通过本发明的方法检测的具有靶序列的核酸。

在本发明的方法中，所述的“靶序列”是指在靶核酸中包含的序列，靶序列用于检测靶核酸。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图做简单地介绍，显而易见，下面简述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1表示本发明实施例1的显色结果图。

图2表示本发明实施例2的显色结果图。

图3表示本发明实施例3的显色结果图。

图4表示本发明实施例4的显色结果图。

图5表示本发明实施例5的显色结果图。

图6表示本发明实施例6的显色结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：

(一)固相支持物表面金属膜的负载

首先将市购环烯烃共聚物塑料片裁剪成尺寸为25mm×30mm的基底；然后将其浸入95％乙醇溶液中超声清洗10分钟，取出后再次用新的95％乙醇溶液反复冲洗10次，并用氮气吹干；最后利用ZZSX-800AZ型真空镀膜机，以钨舟作为蒸发源，通过真空蒸发法在环烯烃共聚物塑料片表面负载一层厚度为30nm、纯度为99.99％的银膜。

真空蒸镀银膜所经历的过程为：银原子蒸发、蒸汽凝集、成核、核生长以及形成连续膜。由于烯烃共聚物塑料片的温度远低于蒸发源的温度，因此，银原子很容易在塑料片的表面直接发生由气相到固相的转变，形成厚度为30nm的固体薄膜。

表面负载有银膜的环烯烃共聚物塑料片制备好后，真空环境下密封保存备用。

(二)靶核酸的扩增

靶核酸：从一例结直肠癌患者的石蜡包埋组织样本分离纯化的浓度为0.05ng/μl的人体基因组核酸(经过PCR测序确认为K-ras基因外显子2中第12密码子35G＞A突变)

扩增K-ras基因的引物对，其中上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：7所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示，上游引物的5’端用生物素标记，上游引物和下游引物的浓度均为0.2μM。

扩增人Actin基因的引物对，其中上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：9所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：10所示，上游引物的5’端用生物素标记，上游引物和下游引物的浓度均为0.2μM。

GoTaq酶：5U/μl，购自promega公司。

10×Taq酶反应缓冲溶液：购自promega公司。

MgCl₂：25mM，购自promega公司。

dNTPsMix：10mM，购自promega公司

2.2操作步骤：

2.2.1配制PCR反应体系(使用下列50μl的PCR扩增体系)：

GoTaq酶：1U；

酶反应缓冲溶液：1×；

扩增K-ras基因的上游引物(SEQIDNO：7)：0.2μM；

扩增K-ras基因的下游引物(SEQIDNO：8)：0.2μM；

扩增人Actin基因的上游引物(SEQIDNO：9)：0.2μM；

扩增人Actin基因的下游引物(SEQIDNO：10)：0.2μM；

MgCl₂：2.0mM；

dNTPsMix：0.2mM

模板：1μl

余量为水。

2.2.2PCR扩增反应：首先95℃预变性5min；然后95℃1.0min；50℃1.5min；72℃，1min，40个循环；最后72℃延伸5min。

2.2.3PCR产物的变性：首先在95℃孵育10min，然后冰浴5min。

(三)核酸探针在金属膜表面的固定

3.1实验材料：

核酸探针：

(1).核苷酸序列如SEQIDNO：1所示的35G＞A突变检测探针，5’端巯基修饰，用于检测结直肠癌患者癌组织样本中的K-ras基因外显子2中第12密码子35G＞A突变；

(2).核苷酸序列如SEQIDNO：2所示的35G＞T突变检测探针，5’端巯基修饰，用于检测结直肠癌患者癌组织样本中的K-ras基因外显子2中第12密码子35G＞T突变；

(3).核苷酸序列如SEQIDNO：3所示的35G＞C突变检测探针，5’端巯基修饰，用于检测结直肠癌患者癌组织样本中的K-ras基因外显子2中第12密码子35G＞C突变；

(4).核苷酸序列如SEQIDNO：4所示的35位点野生型检测探针，5’端巯基修饰，用于检测结直肠癌患者癌组织样本中的K-ras基因的35位点野生型；

(5).核苷酸序列如SEQIDNO：5所示的人Acticn基因检测探针，5’端巯基修饰，作为阳性对照；

(6).核苷酸序列如SEQIDNO：6所示的随机序列探针，5’端巯基修饰，作为阴性对照；

将上述(1)～(6)所述的核酸探针分别加水配制成6种核酸探针的浓度均为100μM(即100pmol/μl)的溶液备用。

磷酸二氢钾(KH₂PO₄)：购自Sigma-Aldrich公司；

PEG8000：购自Sigma-Aldrich公司；

3.2操作步骤：

3.2.1配制组分如下所示的6种核酸探针的溶液(以下简称点样液)：1MKH₂PO₄、4％PEG8000和10μM核酸探针，余量为水。

3.2.2核酸探针的固定，步骤如下所示：

使用优级乙醇摇洗步骤(一)中得到的表面负载有30nm厚银膜的环烯烃共聚物塑料片3次，每次5min，然后用高纯氮气吹干；

每次用移液器取1μl的点样溶液，将步骤3.2.1中配制的6种点样液分别点于清洗后的银膜的表面，然后将塑料片置于湿盒内，室温孵育1h；

再使用纯化灭菌水摇洗孵育后的塑料片3次，每次5min，最后用高纯氮气吹干塑料片，真空保存备用。

核酸探针在银膜表面的排列方式如下表1所示：

表1

35G＞A突变检测探针	35G＞T突变检测探针	阳性对照
			35G＞C突变检测探针	35位点野生型检测探针	阴性对照

(四)预处理

4.1实验材料：

胱胺、脂肪醇聚氧乙烯醚和异构醇均购自Sigma-Aldrich公司。

4.2操作步骤

3.2.1配制组成如下所示的预处理液：7.5份胱胺、7.5份C₁₇脂肪醇聚氧乙烯醚和5份C₁₀异构醇，余量为水。

4.2.2预处理：将步骤(三)中表面固定有核酸探针的环烯烃共聚物塑料片浸泡在温度为37℃的预处理液中30min，期间翻动一次。

(五)一步反应

5.1实验材料：

20×SSC溶液：3.0mol/LNaCl，0.3mol/L柠檬酸钠，pH7.0；

碱性磷酸酶标记链霉亲和素：购自Gibcol公司；

氯化锌：购自生工生物工程(上海)股份有限公司；

六水氯化镁：购自生工生物工程(上海)股份有限公司；

Tween-20：购自生工生物工程(上海)股份有限公司；

多聚赖氨酸：购自生工生物工程(上海)股份有限公司；

聚乙二醇8000：购自生工生物工程(上海)股份有限公司；

5.2操作步骤：

5.2.1配制组成如下所示的杂交液：3×SSC，1μg/mlSA-AP、20mMZnCl₂、20mMMgCl₂、0.5％Tween-20、0.1％多聚赖氨酸和2％聚乙二醇8000，余量为水。

5.2.2一步反应：将步骤(四)经预处理后得到的表面固定有核酸探针的环烯烃共聚物塑料片放入1ml杂交液中，同时加入10μl的步骤(二)中变性后的PCR产物，混匀后于37℃反应15min。

(六)后处理

6.1实验材料：

正十二烷基葡萄糖苷：购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

三羟甲基氨基甲烷(Tris)：购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

NaCl：购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

6.2操作步骤

6.2.1配制组成如下所示的后处理液：PH9.5、0.1mol/LTris-HCl、0.1mol/LNaCl和2.5％正十二烷基葡萄糖苷，余量为水。

6.2.2后处理：利用后处理液洗涤经上述步骤(五)中一步反应后的环烯烃共聚物塑料片表面负载的银膜3次，每次洗涤5min。

(七)显色反应

7.1实验材料：

硝基蓝四氮唑(NBT)：购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸(BCIP)：购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

三羟甲基氨基甲烷(Tris)：购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

NaCl：购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

7.2操作步骤

7.2.1配制组成如下所示的显色溶液：PH10.0、0.1mol/LTris-HCl、0.1mol/LNaCl、50mMMgCl₂、0.33mg/mlNBT和0.17mg/mlBCIP，余量为水。

7.2.2显色反应：将经步骤(六)中后处理的环烯烃共聚物塑料片表面负载的银膜浸没在上述显色溶液中，显色5～10min，观察显色结果。

本实施例的显色结果如图1所示。

实施例2：

同实施例1，不同之处在于将实施例1中的预处理液组成调整为：5份胱胺、3份C₁₇脂肪醇聚氧乙烯醚和2份C₁₁异构醇，余量为水；杂交液组成调整为：3×SSC、0.5μg/mlSA-AP、5mMZnCl₂、5mMMgCl₂、0.05％曲拉通X-100，0.05％多聚赖氨酸和2％聚乙二醇8000，余量为水；后处理液调整为：PH9.0、0.1mol/LTris-HCl、0.1mol/LNaCl和1％正辛基葡萄糖苷，余量为水。其他条件不变。

本实施例的显色结果如图2所示。

实施例3：

同实施例1，不同之处在于将实施例1中的固相支持物替换为载玻片，固相支持物表面负载的金属膜变为厚度60nm、纯度99.9％的铝膜；预处理液组成调整为：10份胱胺、12份C₁₈脂肪醇聚氧乙烯醚和8份C₁₂异构醇，余量为水；杂交液组成调整为：3×SSC，1.2μg/mlSA-AP、50mMZnCl2、50mMMgCl2、1％Tween-20、0.2％多聚赖氨酸和4％聚乙二醇8000，余量为水；后处理液组成调整为：PH10.0、0.1mol/LTris-HCl、0.1mol/LNaCl和4％正癸基葡萄糖苷，余量为水。其他条件不变。

本实施例的显色结果如图3所示。

实施例4：

同实施例1，不同之处在于将实施例1中的预处理液组成调整为：6份胱胺、5份C₁₉脂肪醇聚氧乙烯醚和4份C₁₃异构醇，余量为水；将杂交液组成调整为：3×SSC，0.2μg/mlSA-AP，2mMZnCl₂，2mMMgCl₂，0.02％曲拉通X-100，0.02％阳离子聚丙烯酰胺和3％聚乙二醇8000，余量为水；将后处理液调整为：PH9.5、0.1mol/LTris-HCl、0.1mol/LNaCl和0.5％正癸基葡萄糖苷，余量为水。其他条件不变。

本实施例的显色结果如图4所示。

实施例5：

同实施例3，不同之处在于将实施例3中的预处理液组成调整为：8份胱胺、10份C₁₈脂肪醇聚氧乙烯醚和7份C₁₂异构醇，余量为水；将杂交液组成调整为：3×SSC，1.5μg/mlSA-AP，80mMZnCl₂，80mMMgCl₂，1.5％Tween20，0.4％多聚赖氨酸和6％聚乙二醇8000，余量为水；将后处理液调整为：PH10.0、0.1mol/LTris-HCl、0.1mol/LNaCl和5％正十六烷基葡萄糖苷，余量为水。其他条件不变。

本实施例的显色结果如图5所示。

实施例6：

同实施例1，不同之处在于将实施例1中4.2.2一步反应的条件变为：42℃反应8min。其他条件不变。

本实施例的显色结果如图6所示。

从图1～6可见，35G＞A突变检测探针呈阳性，35G＞T突变检测探针和35G＞C突变检测探针呈阴性，同时35位点野生型检测探针也为阳性，所以判定该例结直肠癌患者的K-ras基因外显子2中第12密码子发生了35G＞A突变。由于组织核酸样本中含有K-ras基因的35G＞A突变型，所以35G＞A突变检测探针为阳性，同时该组织中还含有人体正常未癌变的组织，因此35位点野生型检测探针也为阳性。此外，阳性对照探针显示阳性，阴性对照探针显示阴性，表明整个检测过程正常，实验结果可信。

相比于现有技术中的反向斑点杂交技术，本发明的方法通过在金属膜表面上实现核酸杂交过程与碱性磷酸酶联过程合二为一进行，从而可以在金属膜表面直接形成碱性磷酸酶标记核酸杂交体的偶联物。本发明通过一步反应后的显色反应，根据着色的深浅以及杂交信号与金属膜的强烈色差，可以用肉眼快速判断核酸杂交的结果，极大提高了反向斑点杂交的检测灵敏度与分辨能力。

应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

Claims (16)

1.一种高灵敏度反向斑点杂交方法，其包括如下步骤：

A)将至少一种核酸探针固定在固相支持物负载的金属膜表面；

B)利用预处理液对所述金属膜表面进行预处理；

C)将所述核酸探针在包含碱性磷酸酶标记链霉亲和素的杂交液中与生物素标记的靶核酸进行一步反应；

D)步骤C)中反应完成后，利用后处理液对所述金属膜表面进行后处理；

E)将包含底物的显色溶液与金属膜表面接触进行显色反应。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述金属膜选自金膜、银膜、铜膜和铝膜，优选银膜和铝膜，所述金属膜的厚度为10nm～100nm。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤B)中所述预处理液包括胱胺、脂肪醇聚氧乙烯醚和异构醇；其中，所述脂肪醇聚氧乙烯醚选自C₁₇～C₁₉的脂肪醇聚氧乙烯醚，所述异构醇选自C₁₀～C₁₃异构醇。

4.根据权利要求1～3中任意一项所述的方法，其特征在于，在所述预处理液中，胱胺为3～20重量份，脂肪醇聚氧乙烯醚为2～18重量份以及异构醇为0.2～9重量份；优选地，胱胺为5～10重量份，脂肪醇聚氧乙烯醚为3～12重量份以及异构醇为2～8重量份。

5.根据权利要求1～4中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤C)中所述碱性磷酸酶标记链霉亲和素在杂交液中的浓度为0.05～2μg/ml，优选0.1～1.5μg/ml，更优选0.5～1.2μg/ml。

6.根据权利要求1～5中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤C)中所述杂交液包括锌离子、镁离子、表面活性剂和阳离子型聚合物；其中，所述表面活性剂选自吐温和曲拉通，所述阳离子型聚合物选自阳离子聚丙烯酰胺、多聚赖氨酸和聚合氯化铝。

7.根据权利要求1～6中任意一项所述的方法，其特征在于，在所述杂交液中，锌离子为0.001～0.1mol/L，镁离子为0.001～0.1mol/L，表面活性剂占杂交液的0.01～2％(v/v)，阳离子型聚合物占杂交液的0.01～0.5％(w/v)；优选地，锌离子为0.005～0.05mol/L，镁离子为0.005～0.05mol/L，表面活性剂占杂交液的0.05～1％(v/v)，阳离子型聚合物占杂交液的0.05～0.2％(w/v)。

8.根据权利要求1～7中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤D)中所述后处理液包括C₈～C₁₈烷基葡萄糖苷，优选C₉～C₁₃烷基葡萄糖苷；所述烷基葡萄糖苷占后处理液的0.5～5％(w/v)，优选1～4％(w/v)。

9.根据权利要求1～8中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤D)中所述后处理液的PH为9.0～10.0。

10.根据权利要求1～9中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤B)中所述预处理是将所述固相支持物浸泡在25～37℃温度的所述预处理液中30～60min。

11.根据权利要求1～10中任意一项所述的方法，其特征在于，所述核酸探针选自长度为15～40个碱基的寡核苷酸探针，优选选自长度为15～25个碱基的寡核苷酸探针。

12.根据权利要求1～11中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤C)中所述反应的温度为35～50℃，反应时间为5～30min；优选地，反应温度37～42℃，反应时间10～15min。

13.根据权利要求1～12中任意一项所述的方法，其特征在于，在步骤C)之前还包括使用用于扩增靶核酸的生物素标记的引物进行PCR反应而扩增靶核酸的步骤。

14.根据权利要求1～12中任意一项所述的方法，其特征在于，在步骤C)之前还包括在生物素标记脱氧核苷酸的存在下进行PCR反应而扩增靶核酸的步骤。

15.根据权利要求1～14中所述的方法，其特征在于，所述固相支持物选自硝酸纤维素膜、尼龙膜、硅片、载玻片或塑料片，优选塑料片，更优选环烯烃共聚物塑料片。

16.权利要求1～15中任意一项所述的方法在检测K-ras基因突变中的应用。