CN105349620A

CN105349620A - 一种检测K-ras基因突变的试剂盒及应用

Info

Publication number: CN105349620A
Application number: CN201410415155.1A
Authority: CN
Inventors: 杨华卫; 曾冀
Original assignee: Beijing Biolkey Biotech Co Ltd
Priority date: 2014-08-20
Filing date: 2014-08-20
Publication date: 2016-02-24

Abstract

本发明公开了一种检测K-ras基因突变的试剂盒，其包括PCR反应试剂、负载有金属膜的固相支持物和含有碱性磷酸酶标记链霉亲和素的杂交液；其中，所述PCR反应试剂包括用于扩增靶核酸的生物素标记的引物，所述固相支持物的表面固定有用于检测K-ras基因突变的核酸探针。本发明的试剂盒是基于负载有金属膜的固相支持物开发的一种高灵敏的快速的反向杂交技术产品，试剂盒操作步骤少，流程简单，检测快速，能够用于高度灵敏、高度特异地检测临床结直肠癌组织样本核酸中K-ras基因的碱基突变，有利于指导临床直肠癌治疗的应用。

Description

一种检测K-ras基因突变的试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及基因突变的检测，具体涉及一种检测K-ras基因突变的试剂盒。

背景技术

结直肠癌是严重危害人类生命健康的临床最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在全球约排在第三位，在中国约排在第四位，寻找有效的结直肠癌治疗手段一直是肿瘤学界研究的方向。近年来出现的新的治疗方法-靶向治疗，使个体化治疗成为可能，明显提高了肿瘤治疗的疗效。在结直肠癌得靶向治疗中，两种抗EGFR的单抗类药物西妥昔单抗(Cetuximab，商品名Erbitux)和帕尼单抗(Panitumumab，商品名Vectibix)能特异性的抑制具有野生型K-ras基因的结直肠癌组织细胞的生长，使病人的预后得到改善。因此，结直肠癌组织细胞中K-ras基因的突变状态是决定西妥昔单抗和帕尼单抗是否有效的关键指标。目前已知在结直肠癌治疗过程中，抗EGFR单抗治疗K-ras野生型患者的获益显著优于突变性患者，K-ras基因突变状态是抗EGFR单抗类药物疗效的独立预测指标。K-ras基因突变状态与抗EGFR单抗类靶向药物治疗结直肠癌病人的疗效密切相关，只对K-ras基因野生型患者推荐接受EGFR抑制剂治疗。

K-ras基因突变检测是目前临床医生了解大肠癌患者癌基因状况最直接、最有效的方法，不仅可以深入了解癌基因的情况，更重要的是筛选出针对抗EGFR靶向药物治疗有效的结直肠癌患者，帮助临床医生选择制定对肿瘤患者最有效的治疗方法。目前在欧美等发达国家，K-ras基因检测已经成为结直肠癌患者内科治疗前的常规检查。在通常情况下，60％左右结直肠癌患者的K-ras基因都是野生型的，如果都接受了K-ras基因突变检测，通过个体化的综合治疗方案，在化疗基础上加靶向药物，有效率可达60％左右。所以，越早做K-ras基因检查，患者获益最大。

目前常用的K-ras点突变检测的方法有DNA直接测序法、单链构象多态性分析法(PCR-SSCP)、限制性片段长度多态性分析法(PCR-PFLP)、高分辨溶解曲线(HRM)、基因芯片、液相芯片法、荧光定量PCR法等。测序法是公认的基因突变检测的金标准，能够准确地显示可能存在的具体突变类型，但测序法所用的设备成本高、检测时间稍长、操作繁琐、灵敏度较低，而且结果判读较复杂，对操作者要求较高，难以形成商业化的诊断产品。单链构象多态性分析与限制性片段长度多态性分析步骤繁多、灵敏度低，而且检测结果经常需要测序法确认，也不是适用于临床检测的简便有效的方法。高分辨溶解曲线是近年来兴起的一种检测基因突变、进行基因分型和SNP检测的新工具，可以迅速的检测出核酸片段中单碱基的突变。但是该方法难于筛查纯合突变，并且假阳性假阴性较高，PCR条件苛刻，不能分型，而且检测结果需要测序法确认。基因芯片和液相芯片虽能准确区分具体的突变类型，但是其对设备要求高，难以大规模推广，多用于科研单位。荧光定量PCR法具有假阳性较高等缺点，难于大规模应用于临床诊断。

出于这种考虑，本发明的发明人进行了研究，目的是解决相关领域现有技术所暴露出来的问题，期望提供一种耗时短、易操作、高通量、成本低的检测K-ras基因突变的试剂盒及其应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测K-ras基因突变的试剂盒，其具有低成本、易操作、耗时短、灵敏度高和特异性好等突出技术效果，可广泛应用于临床诊断。

本发明的目的是通过如下技术方案来实现的：

本发明提供一种检测K-ras基因突变的试剂盒，其包括PCR反应试剂、负载有金属膜的固相支持物以及含有碱性磷酸酶标记链霉亲和素的杂交液；其中，所述PCR反应试剂包括用于扩增靶核酸的生物素标记的引物，所述固相支持物的表面固定有用于检测K-ras基因突变的核酸探针。

本发明的试剂盒将碱性磷酸酶标记链霉亲和素直接加入到杂交液中，可以在核酸探针与靶核酸杂交的过程中同步实现碱性磷酸酶标记链霉亲和素与生物素的结合过程，从而可以在金属膜表面直接形成碱性磷酸酶标记核酸杂交体的偶联物，不仅省去了传统杂交反应后需要单独进行酶联反应的步骤，缩短了传统反向斑点杂交的操作耗时，而且促进了核酸杂交，提高了碱性磷酸酶标记效率，使得金属膜表面单位面积上覆盖的碱性磷酸酶标记核酸杂交体的偶联物的数量大大增加，再通过显色反应，根据着色的深浅以及杂交信号与金属膜的强烈色差，可以用肉眼快速判断核酸杂交的结果，在同等条件下明显提高了传统核酸反向斑点杂交方法的检测灵敏度与分辨能力。

在本发明的试剂盒中，所述碱性磷酸酶是一种同源二聚体蛋白，是一种含锌的金属酶。每分子酶至少含2个Zn原子。酶上包含3种类型的金属结合位点，即所谓的催化结合位点、结构结合位点和调节结合位点。其中两个催化结合位点的结合则只会导致一个亚单位的磷酸化，即负协作亚单位之间发生相互作用。

在本发明的试剂盒中，所述生物素有两个环状结构I和II。其中，I环为咪唑酮环，是其与链霉亲和素结合的主要部位；II环为噻吩环，C₂上有一戊酸侧链；生物素分子通过其末端的羧基与本发明所述的靶核酸连接，从而标记在靶核酸分子上。

在本发明的试剂盒中，所述链霉亲和素是由链霉菌分泌的一种蛋白质，其分子由4条相同的肽链组成，每条肽链都能结合一个生物素，因此每个链霉亲和素分子能结合4个生物素分子。此外，每条肽链的氨基酸组成中，甘氨酸和丙氨酸的含量较大，肽链中的色氨酸残基是连接生物素的活性基团。所述链霉亲和素与生物素二者亲和结合的常数(K)为1015L/mol。在本发明的试剂盒中，靶核酸与核酸探针杂交的同时，链霉亲和素与生物素也进行亲和结合，因此杂交液中的碱性磷酸酶标记链霉亲和素分子与固定在固相支持物表面的核酸探针分子在一步反应中竞争性结合生物素标记的靶核酸分子。

根据本发明的一个具体实施例，所述碱性磷酸酶标记链霉亲和素在杂交液中的浓度为0.05～2μg/ml，优选0.1～1.5μg/ml，更优选0.5～1.2μg/ml。在本发明的试剂盒中，可以列举的所述碱性磷酸酶标记链霉亲和素在杂交液中的浓度包括但不限于：0.05μg/ml、0.06μg/ml、0.07μg/ml、0.08μg/ml、0.09μg/ml、0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.3μg/ml、0.4μg/ml、0.5μg/ml、0.6μg/ml、0.7μg/ml、0.8μg/ml、0.9μg/ml、1μg/ml、1.1μg/ml、1.2μg/ml、1.5μg/ml和2μg/ml。

本发明的发明人经过大量实验与创造性劳动发现，本发明的试剂盒将所述碱性磷酸酶标记链霉亲和素直接加入到杂交液中，一方面能够使得碱性磷酸酶标记链霉亲和素与生物素标记靶核酸充分的结合；另一方面还能够促进核酸杂交效率，缩短核酸杂交反应的时间。

在本发明的试剂盒中，所述碱性磷酸酶标记链霉亲和素在杂交液中的浓度是本发明的重要方面。本发明的发明人经过大量试验与创造性劳动发现，如果碱性磷酸酶标记链霉亲和素在杂交液中的浓度过低，那么影响靶核酸检测的灵敏度；如果碱性磷酸酶标记链霉亲和素在杂交液中的浓度过高，那么容易带来非特异性吸附现象，影响靶核酸检测结果的准确性。

根据本发明的一个具体实施例，所述杂交液还包括锌离子、镁离子、表面活性剂和阳离子型聚合物；其中，所述表面活性剂选自吐温和曲拉通，所述阳离子型聚合物选自阳离子聚丙烯酰胺、多聚赖氨酸和聚合氯化铝。

根据本发明的一个具体实施例，在所述杂交液中，锌离子为0.001～0.1mol/L，镁离子为0.001～0.1mol/L，表面活性剂占杂交液的0.01～2％(v/v)，阳离子型聚合物占杂交液的0.01～0.5％(w/v)；优选地，锌离子为0.005～0.05mol/L，镁离子为0.005～0.05mol/L，表面活性剂占杂交液的0.05～1％(v/v)，阳离子型聚合物占杂交液的0.05～0.2％(w/v)。

根据本发明的一个具体实施例，所述锌离子可以选自含锌离子的可溶性盐。可用作本发明的所述含锌离子的可溶性盐的实例包括：硫酸锌、氯化锌以及其他各种在溶液状态可以解离出锌离子的盐。

根据本发明的一个具体实施例，所述镁离子可以选自含镁离子的可溶性盐。可用作本发明的所述含镁离子的可溶性盐的实例包括：硫酸镁、乙酸镁、氯化镁以及其他各种在溶液状态可以解离出镁离子的盐。

根据本发明的一个具体实施例，所述吐温选自吐温20(TWEEN-20)、吐温21(TWEEN-21)、吐温40(TWEEN-40)、吐温60(TWEEN-60)、吐温61(TWEEN-61)、吐温80(TWEEN-80)、吐温81(TWEEN-81)和吐温85(TWEEN-85)，其中吐温20是特别优选的。

根据本发明的一个具体实施例，所述曲拉通选自曲拉通X-100(TritonX-100)、曲拉通X-114(TritonX-114)和曲拉通X-200(TritonX-200)，其中，曲拉通X-100是特别优选的。

在本发明的试剂盒中，酸、碱、盐离子、温度条件的变化都会改变甚至使碱性磷酸酶完全失去活性，因此为了实现本发明的目的之一，杂交液成分的选择是极为重要的方面。本发明的试剂盒通过在杂交液中添加锌离子、镁离子、表面活性剂以及阳离子型聚合物，一方面有助于提高核酸杂交效率，另一方面防止杂交液中的碱性磷酸酶标记链霉亲和素因吸附而变性，再一方面防止碱性磷酸酶标记链霉亲和素分子之间因相互作用而导致的聚合变性。

在本发明的试剂盒中，所述阳离子型聚合物能够与生物素标记的核酸探针产生静电吸附作用，使单链核酸分子(带许多负电荷)带上一个正电荷部分，从而在核酸杂交过程中同步吸附到固相支持物的表面。由于碱性磷酸酶标记链霉亲和素也带有正电荷，这样就避免了碱性磷酸酶非特异性吸附到固相支持物的表面。此外，所述阳离子型聚合物可以使得碱性磷酸酶标记链霉亲和素在杂交液中形成均匀悬液，使得杂交反应完成以后标记在核酸偶联物上的碱性磷酸酶保持活性状态，从而使得碱性磷酸酶构象的平衡转换朝着天然状态移动。

在本发明的试剂盒中，所述杂交液中还可以包括杂交促进剂，所述杂交促进剂在本质上是本领域技术人员所已知的，可作为本发明所述杂交促进剂的实例包括但不限于：硫酸葡聚糖、聚乙二醇、酚或硫氰酸胍。

在本发明的试剂盒中，所述杂交液中还可以包括其他成分，可以列举的杂交液中其他成分的实例包括但不限于：氯化钠、杂交缓冲溶液、Denhardt’s溶液、十二烷基肌氨酸钠或十二烷基磺酸钠。可以用于本发明所述杂交缓冲溶液的实例包括但不限于：柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液或Tris-盐酸缓冲溶液。

在本发明的试剂盒中，所述杂交液不包括乙二胺四乙酸盐、无机磷酸盐和乙醇胺。

根据本发明的一个具体实施例，所述PCR反应试剂包括用于扩增K-ras基因的引物对；其中，

用于扩增K-ras基因的上游引物序列如SEQIDNO：1所示，5’端生物素标记；

用于扩增K-ras基因的下游引物序列如SEQIDNO：2所示。

在本发明的试剂盒中，上述引物对对K-ras基因高度保守，能够高度特异地扩增K-ras基因的一段包括外显子2中第12、13密码子热点突变区在内的片段，用于下一步与金属膜上探针的反应。扩增长度约100bp左右，与更长的扩增片段相比，短片段具有更高的杂交效率，有利于提高一步反应的灵敏度。。

用于扩增K-ras基因的上游引物序列如SEQIDNO：3所示，5’端生物素标记；

用于扩增K-ras基因的下游引物序列如SEQIDNO：4所示。

在本发明的试剂盒中，上述引物对同样对K-ras基因高度保守，能够高度特异地扩增K-ras基因的一段包括外显子2中第12、13密码子热点突变区在内的片段，用于下一步与金属膜上探针的反应。扩增长度约100bp左右，与更长的扩增片段相比，短片段具有更高的杂交效率，有利于提高一步反应的灵敏度。

根据本发明的一个具体实施例，所述PCR反应试剂还包括TaqDNA聚合酶、4xdNTPs(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)、缓冲溶液剂、镁离子及其他必要成分。其中，所述缓冲溶液可以是10～50mmol/LTris-HCl缓冲溶液，镁离子的浓度为1.5mM～2.5mM，优选浓度是2mM。

根据本发明的一个具体实施例，所述核酸探针选自长度为15～40个碱基的寡核苷酸探针，优选选自长度为15～25个碱基的寡核苷酸探针。特别优选的核酸探针的长度包括15、16、17、18、19、20、21、22、23、24和25个碱基。

本发明的试剂盒通过调整核酸探针的长度和组成，降低了核酸探针与生物素标记靶核酸杂交的温度，从而使得杂交反应与酶联反应能够统一成一个反应过程进行。本发明的发明人经过大量实验发现，所述核酸探针选自长度为15～40个碱基的寡核苷酸探针时比较合适，优选选自长度为15～25个碱基的寡核苷酸探针，此时杂交反应的温度可以为37～42℃。

在本发明的试剂盒中，核酸探针长度的选择的依据是：如果核酸探针长度过低，虽然可以提高探针杂交的特异性，但是会显著降低探针杂交的灵敏度；如果核酸探针长度过长，可以进一步提高探针杂交的灵敏度，但探针杂交特异性会显著降低。对于过长的核酸探针，也不能够通过提高杂交温度来提高探针杂交的特异性，因为过高的温度会使得杂交体系中的碱性磷酸酶标记链霉亲和素失活。综合上面各种因素，同时考虑到探针的GC含量对杂交Tm值得影响，15～25个碱基的寡核苷酸探针是优选的。

根据本发明的一个具体实施例，所述核酸探针还包括阳性对照探针，其序列可以如SEQIDNO：16所示。本发明的阳性对照探针可以来自人体Actin基因序列，其不仅能够高度特异地检测样本中的人体基因组的存在，而且能够用于质控临床样本核酸的提取质量，并质控整个检测反应过程的正常进行。

根据本发明的一个具体实施例，所述核酸探针还包括阴性对照探针，其序列可以如SEQIDNO：17所示。本发明的阴性对照探针可以来自引物设计软件随机生成的一段序列，其特点是不与任何生物的核酸序列相似，其能够起到很好的阴性对照作用，质控检测反应的特异性。

根据本发明的一个具体实施例，所述核酸探针包括：

用于检测K-ras基因外显子2中第12密码子上34G＞A突变的核酸探针，其序列如SEQIDNO：7所示；

用于检测K-ras基因外显子2中第12密码子上34G＞T突变的核酸探针，其序列如SEQIDNO：8所示；

用于检测K-ras基因外显子2中第12密码子上34G＞C突变的核酸探针，其序列如SEQIDNO：9所示；

用于检测K-ras基因外显子2中第12密码子上35G＞A突变的核酸探针，其序列如SEQIDNO：10所示；

用于检测K-ras基因外显子2中第12密码子上35G＞T突变的核酸探针，其序列如SEQIDNO：11所示；

用于检测K-ras基因外显子2中第12密码子上35G＞C突变的核酸探针，其序列如SEQIDNO：12所示；

用于检测K-ras基因外显子2中第13密码子上37G＞C突变的核酸探针，其序列如SEQIDNO：13所示；

用于检测K-ras基因外显子2中第13密码子上38G＞A突变的核酸探针，其序列如SEQIDNO：14所示；

用于检测K-ras基因34、35、37和38位点野生型的核酸探针，其序列如SEQIDNO：15所示。

本发明的核酸探针用于检测K-ras基因的单核苷酸多态性(SNP)，也就是K-ras基因中发生的单碱基突变，因此更优选长度为15～16个碱基的寡核苷酸探针，这个长度的寡核苷酸探针对靶核酸中的单碱基的变异具有较高的分辨力。对初步设计的备选探针做了大量的筛选验证工作后，获得了高度特异、分辨力高而且灵敏度相对较高的一批突变检测探针，即分别检测34G＞A、34G＞T、34G＞C、35G＞A、35G＞T、35G＞C、37G＞C和38G＞A突变的探针序列，SEQIDNO：7、8、9、10、11、12、13、14、和15。

在本发明的试剂盒中，用于检测K-ras基因34、35、37和38位点野生型的核酸探针的作用是检测样本中人体正常组织没有发生K-ras基因外显子2中第12、13密码子突变的情况，同时作为突变型检测探针检测过程的质控。

根据本发明的一个具体实施例，所述试剂盒还包括预处理液、后处理液和显色试剂。

本发明的试剂盒通过预处理液和后处理液对一步反应前后的金属膜表面进行协同配合处理，进一步提高了金属膜表面检测K-ras基因突变的特异性，有效避免了检测结果的假阳性。显色试剂使得金属膜表面能够顺利实现酶联显色。

根据本发明的一个具体实施例，所述预处理液包括胱胺、脂肪醇聚氧乙烯醚和异构醇；其中，所述脂肪醇聚氧乙烯醚选自C₁₇～C₁₉脂肪醇聚氧乙烯醚，所述异构醇选自C₁₀～C₁₃异构醇。

根据本发明的一个具体实施例，在所述预处理液中，胱胺为3～20重量份，脂肪醇聚氧乙烯醚为2～18重量份以及异构醇为0.2～9重量份；优选地，胱胺为5～10重量份，脂肪醇聚氧乙烯醚为3～12重量份以及异构醇为2～8重量份。

本发明的发明人经过大量实验与创造性劳动发现，在本发明的试剂盒中，胱胺与脂肪醇聚氧乙烯醚在预处理液中协同配合作用，不仅能够有效封闭金属膜表面的非特异性活性位点，提高检测的特异性，而且能够在金属膜表面形成一层保护层，有效防止使用中的金属膜表面被氧化。

本发明的发明人经过大量实验与创造性劳动发现，在本发明的试剂盒中，高碳原子数的异构醇一方面可以提高胱胺的溶解性，使其获得较高的增容参数与分子自组装活性能力；其另一方面可以提高胱胺与脂肪醇聚氧乙烯醚在固相支持物表面的吸附效果。

根据本发明的一个具体实施例，所述后处理液包括C₈～C₁₈烷基葡萄糖苷，优选C₉～C₁₃烷基葡萄糖苷；所述烷基葡萄糖苷占后处理液的0.5～5％(w/v)，优选1～4％(w/v)。

根据本发明的一个具体实施例，所述后处理液的PH为9.0～10.0。

本发明的试剂盒利用后处理液对一步反应完成后的固相支持物表面进行洗涤是非常重要的，一方面可以将未与靶核酸杂交的以及非特异性杂交的生物素标记核酸探针分子从固相支持物表面洗去，并将特异性杂交体保留在固相支持物表面；另一方面能够保持碱性磷酸酶的活性，可以保证显色的效率，背景反差对比更好。

根据本发明的一个具体实施例，所述后处理是指利用后处理液对所述金属膜表面洗涤3～5次。

根据本发明的一个具体实施例，所述金属膜选自金膜、银膜、铜膜和铝膜，优选银膜和铝膜；所述金属膜的厚度为10nm～100nm。

金属是一种具有光泽的物质，其对可见光强烈反射。由于碱性磷酸酶催化底物可产生化学显色反应，能够在金属膜表面产生颜色变化，本发明的试剂盒可以通过肉眼直观、快速地观察金属膜表面核酸杂交反应前后斑点颜色的深浅，以准确判断样品中含有的靶核酸情况。作为本发明的一个优选实施例，所述的金属膜优选银膜或铝膜。纳米级的银膜或铝膜能够呈现较好的反光性能，可以明显提高显色反应后检测靶核酸的分辨能力。此外，金属膜还结实耐用，易于清洗，容易去除杂交背景。

根据本发明的一个具体实施例，所述固相支持物选自硝酸纤维素膜、尼龙膜、硅片、载玻片和塑料片，优选为塑料片，更优选为环烯烃共聚物塑料片。

环烯烃共聚物是一种由环烯烃与α-烯烃聚合而成的高附加值热塑性工程塑料，具有很高的透明度。本发明的发明人经过大量实验与创造性劳动发现，环烯烃共聚物塑料表面能够很好地与金属膜结合，不仅金属膜不容易从塑料表面脱落，而且反光性能非常好，在其表面负载一层纳米厚度的金属膜后，碱性磷酸酶催化底物的显色反应效果更为明显，可以进一步提高本发明试剂盒检测靶核酸的灵敏度与分辨能力。

根据本发明的一个优选实施例，负载有金属膜的固相支持物在使用前被真空封装。

在本发明的试剂盒中，金属膜负载到固相支持物表面的方法以及核酸探针在金属膜表面的固定方法均在本领域技术人员的知识范围内。作为一个优选的实施例，金属膜可以通过真空镀膜的方法蒸镀到固相支持物表面，核酸探针可以通过末端连接的巯基基团与金属膜实现固定连接。

根据本发明的一个具体实施例，所述显色试剂包括显色缓冲溶液和底物，所述底物包括但不限于：硝基蓝四氮唑(NBT)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸(BCIP)、坚牢红或萘酚ASMX，优选硝基蓝四氮唑(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸(BCIP)。在碱性磷酸酶的催化下，BCIP会被水解产生强反应性的产物，该产物会和NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的NBT-formazan。

在本发明的试剂盒中，所述的“核酸探针”是指在含有与靶序列互补的碱基序列核酸中，固定于固相支持物表面的核酸片段，核酸探针具有与所述靶序列至少一部分互补的序列，由此，可在适宜的条件下与靶序列进行杂交。

在本发明的试剂盒中，所述的“靶核酸”是指具有靶序列的核酸，其可以来自于被检测者的结直肠癌变组织的活检样本或者石蜡包埋组织样本的人体基因组的分离纯化的核酸。

在本发明的试剂盒中，所述的“靶序列”是指在靶核酸中包含的序列，靶序列用于检测靶核酸。

本发明的试剂盒可以使用常规核酸提取方法或市售的核酸提取试剂盒从临床样品中提取靶核酸。

本发明的试剂盒在金属膜表面上实现核酸杂交过程与碱性磷酸酶联过程合二为一进行，从而可以在金属膜表面直接形成碱性磷酸酶标记核酸杂交体的偶联物。本发明通过一步反应后的显色反应，根据着色的深浅以及杂交信号与金属膜的强烈色差，可以用肉眼快速判断核酸杂交的结果，提高了K-ras基因突变检测的灵敏度与分辨能力，其中K-ras基因突变检测的灵敏度可以达到0.05ng/μl。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图做简单地介绍，显而易见，下面简述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1表示本发明实施例1的显色结果图。

图2表示本发明实施例2的显色结果图。

图3表示本发明实施例3的显色结果图。

图4表示本发明实施例4的显色结果图。

图5表示本发明实施例5的显色结果图。

图6表示本发明实施例6的显色结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

在以下实施例中，牛血清白蛋白(以下简称BSA)、阳离子型聚丙烯酰胺(以下简称CPAM)、碱性磷酸酶标记链霉亲和素(以下简称SA-AP)、多聚赖氨酸(以下简称PLL)、聚乙二醇8000以及烷基葡萄糖苷的浓度是以g/ml计的质量体积百分比(w/v)浓度；Tween-20和TritonX-100的浓度(v/v)是指体积百分比浓度。

以下为检测K-ras基因突变的试剂盒的制备实施例

实施例1：

主要原料及试剂

环烯烃共聚物塑料片及99.99％的银丝；

20×SSC缓冲溶液，其配制过程如下：称取88.2g柠檬酸三钠(购自上海生工)和175.3gNaCl溶解于800ml纯水中，充分混匀，用浓HCl调节溶液pH值至7.0±0.1，补加纯水至1000ml即可；

扩增K-ras基因的引物对，其中用于扩增K-ras基因的上游引物序列如SEQIDNO：1所示，5’端生物素标记；用于扩增K-ras基因的下游引物序列如SEQIDNO：2所示。委托上海生工合成，将引物干粉分别加水配制成浓度均为20μM；

扩增人Actin基因的引物对，其中上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：6所示，上游引物的5’端用生物素标记。委托上海生工合成，将引物干粉分别加水配制成浓度均为20μM；

GoTaq酶：5U/μl，购自promega公司；

10×Taq酶反应缓冲溶液：购自promega公司；

MgCl₂：25mM，购自promega公司；

dNTPsMix：10mM，购自promega公司；

11种5’端巯基修饰的核酸探针，均委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成，包括：

(1).用于检测K-ras基因外显子2中第12密码子上34G＞A突变的核酸探针，其序列如SEQIDNO：7所示；

(2).用于检测K-ras基因外显子2中第12密码子上34G＞T突变的核酸探针，其序列如SEQIDNO：8所示；

(3).用于检测K-ras基因外显子2中第12密码子上34G＞C突变的核酸探针，其序列如SEQIDNO：9所示；

(4).用于检测K-ras基因外显子2中第12密码子上35G＞A突变的核酸探针，其序列如SEQIDNO：10所示；

(5).用于检测K-ras基因外显子2中第12密码子上35G＞T突变的核酸探针，其序列如SEQIDNO：11所示；

(6).用于检测K-ras基因外显子2中第12密码子上35G＞C突变的核酸探针，其序列如SEQIDNO：12所示；

(7).用于检测K-ras基因外显子2中第13密码子上37G＞C突变的核酸探针，其序列如SEQIDNO：13所示；

(8).用于检测K-ras基因外显子2中第13密码子上38G＞A突变的核酸探针，其序列如SEQIDNO：14所示；

(9).用于检测K-ras基因34、35、37和38位点野生型的核酸探针，其序列如SEQIDNO：15所示。

(10).核苷酸序列如SEQIDNO：16所示的人Acticn基因检测探针，作为阳性对照；和

(11).核苷酸序列如SEQIDNO：17所示的随机序列探针，作为阴性对照；

将上述(1)～(11)所述的核酸探针干粉分别加水配制成11种核酸探针的浓度均为100μM(即100pmol/μl)的溶液备用；

磷酸二氢钾(KH₂PO₄)：购自Sigma-Aldrich公司；

PEG8000：购自Sigma-Aldrich公司；

胱胺、脂肪醇聚氧乙烯醚和异构醇均购自Sigma-Aldrich公司；

20×SSC溶液，由3.0mol/LNaCl和0.3mol/L柠檬酸钠构成，pH7.0；

碱性磷酸酶标记链霉亲和素：购自Gibcol公司；

氯化锌和六水和氯化镁：均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；

Tween-20、多聚赖氨酸、聚乙二醇8000、烷基葡萄糖苷、硝基蓝四氮唑(简称为NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸(简称为BCIP)均直接购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

(一)负载有金属膜的固相支持物的制备

1.1表面负载有金属膜的固相支持物的制备：首先将市购环烯烃共聚物塑料片裁剪成尺寸为25mm×30mm的基底，然后将其浸入95％乙醇溶液中超声清洗10分钟，取出后再次用新的95％乙醇溶液反复冲洗10次，并用氮气吹干，最后利用ZZSX-800AZ型真空镀膜机，以钨舟作为蒸发源，通过真空蒸发法在环烯烃共聚物塑料片表面负载一层厚度为30nm、纯度为99.99％的银膜。表面负载有银膜的环烯烃共聚物塑料片制备好后，真空环境下密封保存备用。

1.2配制组分如下所示的11种核酸探针的溶液(点样液)：1MKH2PO4、4％PEG8000和10μM核酸探针，余量为水。

1.3核酸探针的固定，步骤如下所示：

使用优级乙醇摇洗步骤1.1中得到的表面负载有30nm厚银膜的环烯烃共聚物塑料片3次，每次5min，然后用高纯氮气吹干；

每次用移液器取1μl的点样溶液，将1.2步骤中配制的11种点样液分别点于清洗后的银膜的表面，然后将塑料片置于湿盒内，室温孵育1h；

再使用纯化灭菌水摇洗孵育后的塑料片3次，每次5min，最后用高纯氮气吹干塑料片，真空保存备用。

核酸探针在银膜表面的排列方式如下表1所示：

表1

(二)预处理液的配制

表2

原料名称	每1000ml预处理液的用量
		NaCl	58.4g
Tris	12.1g
		纯水	800ml
胱胺	75g
		C₁₇脂肪醇聚氧乙烯醚	75g
C₁₀异构醇	50g

分别称取58.4gNaCl和12.1gTris-HCl加入800ml纯水中，充分溶解混匀，用浓HCl调节溶液pH值至7.5±0.1，然后分别加入75g的胱胺、75g的C₁₇脂肪醇聚氧乙烯醚和50g的C₁₀异构醇，充分溶解、混匀，补加纯水至1000ml即可得到组成如下的预处理液：

PH7.5、0.1mol/LTris-HCl、1mol/LNaCl、7.5份胱胺、7.5份C₁₇脂肪醇聚氧乙烯醚和5份C₁₀异构醇，余量为水。

(三)PCR反应试剂的制备

按照下列比例配制50μl反应体系的PCR反应试剂：

GoTaq酶：1U；

酶反应缓冲溶液：1×；

用于扩增K-ras基因的上游引物序列(SEQIDNO：1)，5’端生物素标记，浓度为0.2μM；

用于扩增K-ras基因的下游引物序列(SEQIDNO：2)，浓度为0.2μM。

用于扩增人Actin基因的引物的上游引物的序列SEQIDNO：5所示，5’端用生物素标记，浓度为0.2μM；

用于扩增人Actin基因的引物的下游引物的序列如SEQIDNO：6所示，浓度为0.2μM；

MgCl₂：2.0mM；

dNTPsMix：每种核苷酸的浓度均为0.2mM；

余量为水；

将上述各组分混匀，即可配成PCR反应试剂。

(四)杂交液的配制

表3

原料名称	每1000ml杂交液的用量
		20×SSC	150ml
ZnCl₂	2.72g
		MgCl₂·6H₂O	4.06g
Tween-20	5ml
		PLL	1g
聚乙二醇8000	20g
		SA-AP	1mg
纯水	700ml

分别量取150ml的20×SSC缓冲液和700ml的纯水，充分混匀；然后向其中分别加入2.72g的ZnCl₂，4.06g的MgCl₂·6H₂O，5ml的Tween20，1g的PLL，20g的聚乙二醇8000以及1mg的SA-AP，充分溶解、混匀，补加纯水至1000ml，即可得到组成如下的杂交液：

pH7.0、3×SSC、1μg/mlSA-AP、20mMZnCl₂、20mMMgCl₂、0.5％Tween-20、0.1％PLL和2％聚乙二醇8000，余量为水。

(五)后处理液的配制

表4

原料名称	每1000ml后处理液的用量
		NaCl	5.8g
MgCl₂·6H₂O	10.2g
		Tris	12.1g
正十二烷基葡萄糖苷	25g
		纯水	900ml

分别称取5.8gNaCl和12.1gTris加入到800ml纯水中，充分溶解混匀，用浓HCl调节溶液pH值至9.5±0.1，然后加入25g正十二烷基葡萄糖苷，充分溶解混匀，转移到容量瓶中加纯水定容至1000ml，得到组成如下的后处理液：

PH9.5、0.1mol/LTris-HCl、0.1mol/LNaCl和2.5％正十二烷基葡萄糖苷，余量为水。

(六)显色缓冲溶液的制备

表5

原料名称	每1000ml显色缓冲溶液的用量
		NaCl	5.8g
MgCl₂·6H₂O	10.2g
		Tris	12.1g
纯水	900ml

在900ml纯水中，加入5.8gNaCl、10.2gMgCl₂·6H₂O以及12.1gTris充分溶解混匀，用浓HCl调节溶液pH值至10.0±0.1，转移到容量瓶中加纯水定容至1000ml，得到组成如下的显色缓冲液：

PH10.0，0.1mol/LNaCl，0.1mol/LTris，50mMMgCl₂，余量为水。

(七)底物的制备

7.1底物1的制备：称取100mg的NBT溶于1ml的70％二甲基甲酰胺配成100mg/ml的NBT水溶液，即底物1。

7.2底物2的制备：称取50mg的BCIP溶于1ml的100％二甲基甲酰胺配成50mg/ml的BCIP水溶液，即底物2。

因此，本实施例的一种检测K-ras基因突变的试剂盒的具体组分如下表6所示，包括PCR反应试剂、负载有金属膜的固相支持物和含有碱性磷酸酶标记链霉亲和素的杂交液；其中，所述PCR反应试剂包括用于扩增靶核酸的生物素标记的引物，所述固相支持物的表面固定有用于检测K-ras基因突变的的核酸探针。

表6

实施例2：

同实施例1，不同之处在于将实施例1中的预处理液组成调整为：5份胱胺、3份C₁₇脂肪醇聚氧乙烯醚和2份C₁₁异构醇，余量为水；杂交液组成调整为：3×SSC、0.5μg/mlSA-AP、5mMZnCl₂、5mMMgCl₂、0.05％TritonX-100、0.05％PLL和2％聚乙二醇8000，余量为水；后处理液调整为：PH9.0、0.1mol/LTris-HCl、0.1mol/LNaCl和1％正辛基葡萄糖苷，余量为水。其他条件不变。

实施例3：

同实施例1，不同之处在于将实施例1中的固相支持物替换为为载玻片，固相支持物表面负载的金属膜变为厚度60nm、纯度99.9％的铝膜；预处理液组成调整为：10份胱胺、12份C₁₈脂肪醇聚氧乙烯醚和8份C₁₂异构醇，余量为水；杂交液组成调整为：3×SSC、1.2μg/mlSA-AP、50mMZnCl₂、50mMMgCl₂、1％Tween-20、0.2％CPAM和4％聚乙二醇8000，余量为水；后处理液调整为：PH10.0、0.1mol/LTris-HCl、0.1mol/LNaCl和4％正癸基葡萄糖苷，余量为水。其他条件不变。

实施例4：

同实施例1，不同之处在于将实施例1中的预处理液组成调整为：6份胱胺、5份C₁₉脂肪醇聚氧乙烯醚和4份C₁₃异构醇，余量为水；将杂交液组成调整为：3×SSC、0.2μg/mlSA-AP、2mMZnCl₂、2mMMgCl₂、0.02％TritonX-100、0.02％PLL和3％聚乙二醇8000，余量为水；将后处理液调整为：PH9.5、0.1mol/LTris-HCl、0.1mol/LNaCl和0.5％正癸基葡萄糖苷，余量为水。其他条件不变。

实施例5：

同实施例3，不同之处在于将实施例3中的预处理液组成调整为：8份胱胺、10份C₁₈脂肪醇聚氧乙烯醚和7份C₁₂异构醇，余量为水；将杂交液组成调整为：3×SSC、1.5μg/mlSA-AP、80mMZnCl₂、80mMMgCl₂、1.5％Tween-20、0.4％CPAM和6％聚乙二醇8000，余量为水；将后处理液调整为：PH10.0、0.1mol/LTris-HCl、0.1mol/LNaCl和5％正十六烷基葡萄糖苷，余量为水。其他条件不变。

实施例6：

同实施例1，不同之处在于将实施例1中PCR反应试剂中的扩增K-ras基因的引物对替换为：用于扩增K-ras基因的上游引物序列如SEQIDNO：3所示，5’端生物素标记；用于扩增K-ras基因的下游引物序列如SEQIDNO：4所示。其他条件不变。

以下为检测K-ras基因突变的试剂盒的应用实施例

实施例7：用实施例1的试剂盒对临床样品进行检测

本实施例中的临床样品来自一例结直肠癌患者的石蜡包埋组织样本分离纯化的浓度为0.05ng/μl的人体基因组核酸，其经过PCR测序确认为K-ras基因外显子2中第12密码子35G＞A突变。

(一)靶核酸的提取

采用Qiagen公司的石蜡包埋组织中纯化基因组试剂盒(商品名称为QIAampDNAFFPETissueKit)提取上述临床样本中的靶核酸。基本步骤如下：

用二甲苯溶解并去除石蜡。在变性条件下，利用短时间的蛋白酶K酶切裂解样本。在90℃下孵化，逆转福尔马林交联。DNA结合至膜上，污染物则通过膜。洗掉残留的污染物。使用BufferATE或水洗脱DNA，立即用于扩增反应或置于-20℃保存。

(二)靶核酸的扩增

2.1加模板：取49μlPCR反应试剂，加入1μl步骤(一)中提取的核酸提取液。

2.2PCR扩增反应：首先95℃预变性5min；然后95℃1.0min；50℃1.5min；72℃，1min，40个循环；最后72℃延伸5min。

2.3PCR产物的变性：首先在95℃孵育10min，然后冰浴5min。

(三)一步反应

取表面固定有核酸探针的负载有金属膜的固相支持物放入1ml杂交液中，同时加入10μl的步骤(二)中变性后的PCR产物，混匀后于37℃反应15min。

(四)后处理

将经步骤(三)中一步反应后的负载有金属膜的固相支持物转入后处理液中洗涤3次，每次洗涤5min。

(五)显色反应

5.1配制显色溶液：在显色缓冲液中分别加入底物1和底物2各33μl，配制成10ml组分如下所示的显色溶液：PH9.5、0.1mol/LTris、0.1mol/LNaCl、50mMMgCl20.33mg/mlNBT和0.17mg/mlBCIP，余量为水。

5.2显色反应：将经步骤(四)中后处理的环烯烃共聚物塑料片表面负载的银膜浸没在上述步骤5.1中配制好的显色溶液中，显色5～10min，观察显色结果。

本实施例的显色结果如图1所示。

实施例8

同实施例7，不同之处在于利用实施例2的试剂盒对临床样品进行检测，其他条件保持不变。

本实施例的显色结果如图2所示。

实施例9

同实施例7，不同之处在于利用实施例3的试剂盒对临床样品进行检测，其他条件保持不变。

本实施例的显色结果如图3所示。

实施例10

同实施例7，不同之处在于利用实施例4的试剂盒对临床样品进行检测，其他条件保持不变。

本实施例的显色结果如图4所示。

实施例11

同实施例7，不同之处在于利用实施例5的试剂盒对临床样品进行检测，其他条件保持不变。

本实施例的显色结果如图5所示。

实施例12

同实施例7，不同之处在于利用实施例6的试剂盒对临床样品进行检测，其他条件保持不变。

本实施例的显色结果如图6所示。

从图1～6可见，利用本发明的试剂盒检测一例结直肠癌患者的石蜡包埋组织样本分离纯化的临床样本核酸结果可以看出：35G＞A突变检测探针点呈阳性，35G＞T突变检测探针点呈阴性，35G＞C突变检测探针呈阴性，34G＞A突变检测探针点呈阴性，34G＞T突变检测探针点呈阴性，34G＞C突变检测探针点呈阴性，37G＞C突变检测探针点呈阴性，38G＞A突变检测探针点呈阴性，同时35位点野生型检测探针点也为阳性，所以判定该例结直肠癌患者的K-ras基因外显子2中第12密码子发生了35G＞A突变。这是由于组织核酸样本中含有K-ras基因的35G＞A突变型，所以35G＞A突变检测探针为阳性，同时该组织中还含有人体正常未癌变的组织，因此35位点野生型检测探针也为阳性。此外，阳性对照探针显示阳性，阴性对照探针显示阴性，表明整个检测过程正常，实验结果可信。

由此可见，本发明的试剂盒在金属膜表面上实现了核酸杂交过程与碱性磷酸酶联过程合二为一进行，从而可以在金属膜表面直接形成碱性磷酸酶标记核酸杂交体的偶联物。本发明的试剂盒通过一步反应后的显色反应，根据着色的深浅以及杂交信号与金属膜的强烈色差，可以用肉眼快速判断核酸杂交的结果，提高了K-ras基因突变检测的灵敏度与分辨能力，其中K-ras基因突变检测的灵敏度可以达到0.05ng/μl。此外，本发明的试剂盒的使用操作步骤少，流程简单，检测快速，能够高度灵敏、高度特异地检测临床结直肠癌组织样本核酸中K-ras基因的碱基突变，有利于指导临床直肠癌治疗的应用，具有重要的临床应用价值。

应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

Claims

1.一种检测K-ras基因突变的试剂盒，其包括PCR反应试剂、负载有金属膜的固相支持物以及含有碱性磷酸酶标记链霉亲和素的杂交液；其中，所述PCR反应试剂包括用于扩增靶核酸的生物素标记的引物，所述固相支持物的表面固定有用于检测K-ras基因突变的核酸探针。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述碱性磷酸酶标记链霉亲和素在杂交液中的浓度为0.05～2μg/ml，优选0.1～1.5μg/ml，更优选0.5～1.2μg/ml。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述杂交液还包括锌离子、镁离子、表面活性剂和阳离子型聚合物；其中，所述表面活性剂选自吐温和曲拉通，所述阳离子型聚合物选自阳离子聚丙烯酰胺、多聚赖氨酸和聚合氯化铝。

4.根据权利要求1～3中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，在所述杂交液中，锌离子为0.001～0.1mol/L，镁离子为0.001～0.1mol/L，表面活性剂占杂交液的0.01～2％(v/v)，阳离子型聚合物占杂交液的0.01～0.5％(w/v)；优选地，锌离子为0.005～0.05mol/L，镁离子为0.005～0.05mol/L，表面活性剂占杂交液的0.05～1％(v/v)，阳离子型聚合物占杂交液的0.05～0.2％(w/v)。

5.根据权利要求1～4中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应试剂包括用于扩增K-ras基因的引物对；其中，

用于扩增K-ras基因的下游引物序列如SEQIDNO：2所示。

6.根据权利要求1～4中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应试剂包括用于扩增K-ras基因的引物对；其中，

用于扩增K-ras基因的下游引物序列如SEQIDNO：4所示。

7.根据权利要求1～6中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸探针包括：

8.根据权利要求1～7中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括预处理液和后处理液。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述预处理液包括胱胺、脂肪醇聚氧乙烯醚和异构醇；其中，所述脂肪醇聚氧乙烯醚选自C₁₇～C₁₉脂肪醇聚氧乙烯醚，所述异构醇选自C₁₀～C₁₃异构醇。

10.根据权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于，在所述预处理液中，胱胺为3～20重量份，脂肪醇聚氧乙烯醚为2～18重量份以及异构醇为0.2～9重量份；优选地，胱胺为5～10重量份，脂肪醇聚氧乙烯醚为3～12重量份以及异构醇为2～8重量份。

11.根据权利要求8～10中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述后处理液包括C₈～C₁₈烷基葡萄糖苷，优选C₉～C₁₃烷基葡萄糖苷；所述烷基葡萄糖苷占后处理液的0.5～5％(w/v)，优选1～4％(w/v)。

12.根据权利要求8～11中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述后处理液的PH为9.0～10.0。

13.根据权利要求1～12中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述金属膜选自金膜、银膜、铜膜和铝膜，优选银膜和铝膜；所述金属膜的厚度为10nm～100nm。

14.根据权利要求1～13中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述固相支持物选自硝酸纤维素膜、尼龙膜、硅片、载玻片和塑料片，优选为塑料片，更优选为环烯烃共聚物塑料片。