CN112538534B

CN112538534B - 与长毛兔粗毛率和被毛直径变异相关的分子标记及应用

Info

Publication number: CN112538534B
Application number: CN202011500609.7A
Authority: CN
Inventors: 樊新忠; 杨爱国; 乔西波; 宋靓; 吕肖雪; 胡家卿; 杨远峰
Original assignee: Shandong Xinhexin Technology Co ltd; Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Xinhexin Technology Co ltd; Shandong Agricultural University
Priority date: 2020-12-16
Filing date: 2020-12-16
Publication date: 2022-05-17
Anticipated expiration: 2040-12-16
Also published as: CN112538534A; US20220186324A1

Abstract

本发明涉及家兔分子标记育种技术领域，具体公开了一组与长毛兔粗毛率和被毛直径变异相关的分子标记及其应用。该分子标记包括FZD3基因的突变体、KRT26基因的突变体的至少一种，所述FZD3基因如SEQ ID NO:1所示，所述KRT26基因如SEQ ID NO:2所示，所述FZD3基因的突变体由FZD3基因位点第41019916处碱基T突变为C所形成，所述KRT26基因的突变体由KRT26基因位点第41842284处碱基G突变为A所形成和/或所述KRT26基因位点第41842481处碱基G突变为C所形成。该组分子标记分别控制长毛兔的粗毛率总体遗传变异的5.18％和2.43％，控制绒毛纤维直径总体遗传变异的17.39％，遗传效应极显著，为长毛兔粗毛率和毛纤维直径同质性的选育提供了重要标记。

Description

与长毛兔粗毛率和被毛直径变异相关的分子标记及应用

技术领域

本发明涉及家兔分子标记育种技术，尤其是涉及一组与长毛兔粗毛率和被毛直径变异相关的分子标记及应用。

背景技术

长毛兔被毛主要由粗毛和绒毛构成，其中绒毛是其主体部分，有着良好的理化特性和可纺性，兔绒毛织物质地轻盈、手感光滑柔软、色泽好、起绒效果以及保暖性好，其在很多方面都与山羊绒类似。兔毛生产受资源约束小，生产成本较山羊绒低，并且兔毛更耐酸碱，在清洗和染色中比羊绒有优势。随着毛纺技术提高和新产品不断开发，特别是精纺兔绒面料的成功研制，国内外市场对同质性好的细毛型兔毛需求量迅速增加。

但目前生产上缺乏优质绒毛型长毛兔群体，多年来长毛兔育种和生产过度追求产毛量，忽视对纤维品质的改良，导致兔毛纤维整体过粗，而且纤维直径的同质性很差，粗毛率高，严重影响纺织品质和织物价值。

兔毛的纺织价值主要取决于纤维细度、长度和同质性，迄今人们对长毛兔纤维品质育种的研究很少，常规育种方法难以兼顾兔毛产量和诸多品质指标，受养毛周期、测定水平、群体规模、遗传评估技术等影响，其选育效率和选择准确性相对较低。因此开发应用有效的分子标记，建立长毛兔纤维品质的精准育种技术，对于培育优质细毛型长毛兔新品种具有重要意义。

动物体内参与毛囊发育调控的基因众多，其中FZD3基因编码卷曲蛋白(frizzled，FZD)，该蛋白是Wnt途径的重要受体，与Wnt配体结合进而启动Wnt信号通路(卢友光，2009)。FZD3基因在表皮以及毛囊外部细胞层均有表达。WNT通过FZD受体家族成员在细胞膜上的作用控制下游靶基因的转录和表达，在各个类型的毛囊的形态形成中有着至关重要的作用。

KRT26(keratin 26)基因能够编码一种含468个氨基酸的蛋白质，作为特殊的一类Ⅰ型角蛋白特异地表达于毛囊的内根鞘中，主要调控整个毛囊的生长发育。

FZD3基因和KRT26基因与毛囊性能有着密切联系，其基因结构和功能变异可影响到动物的毛发纤维特性，目前FZD3基因和KRT26基因对长毛兔的被毛性状影响还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一组与长毛兔粗毛率和被毛直径变异相关的分子标记，该分子标记对长毛兔的粗毛率影响显著(P<0.05)，对绒毛纤维直径变异影响极显著(P<0.01)，在实际育种工作中，可对长毛兔的粗毛率和毛纤维直径的同质性选育提供辅助手段。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一组与长毛兔粗毛率和被毛直径变异相关的分子标记，所述分子标记包括FZD3基因的突变体、KRT26基因的突变体的至少一种，所述FZD3基因如SEQ ID NO:1所示，所述KRT26基因如SEQ ID NO:2所示，所述FZD3基因的突变体由FZD3基因位点第41019916处的碱基T突变为C所形成，所述KRT26基因的突变体由KRT26基因位点第41842284处的碱基G突变为A所形成和/或所述KRT26基因位点第41842481处的碱基G突变为C所形成。

在本发明的技术方案中，长毛兔FZD3基因位点第41019916处的碱基T突变为C，含有等位基因C的长毛兔的粗毛率较低，含有等位基因T的长毛兔表现为较高的粗毛率，在实际育种过程中，可以提高等位基因C在长毛兔群体中的基因频率，以改善长毛兔粗毛率性状。

KRT26基因位点第41842284处的碱基G突变为A，含有等位基因A的长毛兔的粗毛率与绒毛纤维直径变异系数较低，含有等位基因G的长毛兔的粗毛率与绒毛纤维直径变异系数较高，在实际育种过程中，可以提高等位基因A和降低等位基因G在长毛兔群体中的基因频率，以改良长毛兔粗毛率和绒毛纤维直径变异等产毛性状。

KRT26基因位点第41842481处的碱基G突变为C，含有等位基因C的长毛兔的粗毛率较低，含有等位基因G的长毛兔的粗毛率较高，在实际育种过程中，可以提高等位基因C和降低等位基因G在长毛兔群体中的基因频率，以改良长毛兔粗毛率性状。

本发明还提供了一种上述分子标记在长毛兔粗毛率性状标记辅助选择中的应用。

本发明还提供了一种上述分子标记在长毛兔被毛直径变异性状标记辅助选择中的应用。

本发明还提供了一种检测上述分子标记的试剂，所述试剂包括扩增引物，所述扩增引物包括扩增FZD3基因的引物和/或扩增KRT26基因的引物，所述扩增FZD3基因的引物如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，所述扩增KRT26基因的引物如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

作为本发明所述试剂的优选实施方式，所述PCR试剂包括去离子水、Taq酶、10×PCR Buffer和MgCl₂。

本发明还提供了一种上述分子标记的筛选方法，包括以下步骤：构建基因组DNA混池，分别上述引物对待测长毛兔个体样品基因组DNA进行PCR扩增得PCR产物，根据PCR产物筛选出基因SNP位点，然后采用飞行质谱检测方法进行SNP分型，确定FZD3基因位点第41019916处的碱基为T还是突变为C，KRT26基因位点第41842284处的碱基为G还是突变为A，KRT26基因位点第41842481处的碱基为G还是突变为C。

作为本发明所述筛选方法的优选实施方式，所述飞行质谱检测方法进行SNP分型步骤为：

S1.根据SNP位点信息，设计PCR反应和单碱基扩增引物，进行基因组DNA样本质检，获得合格基因组DNA样本；

S2.将合格基因组DNA样本进行PCR反应，再进行SAP消化和延伸反应，最终得反应产物；

S3.将反应产物稀释，使用树脂脱盐，将脱盐处理后的样品点在样品靶上，自然结晶，然后上机进行质谱检测，收集数据。

所述PCR反应采用的试剂包含去离子水、MgCl₂、PCRBuffer、dNTPMix和HotStarTaq。

作为本发明所述筛选方法优选实施方式，所述FZD3基因扩增得到的PCR产物长度为750bp，所述KRT26基因扩增得到的PCR产物长度为500bp。

本发明采用飞行质谱检测方法对FZD3基因和KRT26基因存在的SNP位点进行SNP分型，通过序列对比发现，FZD3基因位点第41019916处的碱基T突变为C，KRT26基因位点第41842284处的碱基G突变为A，KRT26基因位点第41842481处的碱基G突变为C，将长毛兔的粗毛率和被毛直径变异与FZD3基因和KRT26基因进行关联分析，其中FZD3基因位点第41019916处碱基T突变为C时，SNP分型得到的三种基因型与长毛兔的粗毛率性状密切相关，TT基因型的粗毛率高于CC基因型和CT基因型；

当KRT26基因位点第41842284处的碱基G突变为A时，SNP分型得到的三种基因型与长毛兔的粗毛率和绒毛纤维直径变异性状密切相关，GG基因型的粗毛率和绒毛纤维直径变异系数均高于AA基因型和GA基因型的粗毛率和绒毛纤维直径变异系数；

当KRT26基因位点第41842481处的碱基G突变为C时，SNP分型得到的三种基因型与长毛兔的粗毛率性状密切相关，GG基因型的长毛兔的粗毛率高于CC基因型和GC基因型，以上位点对其余产毛性状均无显著影响(P>0.05)。

FZD3基因和KRT26基因多态位点的检出，不仅为分子育种提供了新的素材，也为长毛兔产毛性状的标记辅助选择提供了科学依据和辅助手段。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明首次提供了一组与长毛兔粗毛率和被毛直径变异相关的分子标记，该分子标记对长毛兔的粗毛率影响显著(P<0.05)，对绒毛纤维直径变异影响极为显著(P<0.01)，在实际育种工作中，可对长毛兔的粗毛率和毛纤维直径选育提供辅助选择。

附图说明

图1为PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测结果示意图；

图2-1为FZD3基因位点第41019916处的PCR扩增产物克隆测序结果示意图；

图2-2为FZD3基因位点第41019916处的PCR扩增产物基因测序峰图；

图3-1为KRT26基因位点第41842284处的PCR扩增产物克隆测序结果示意图；

图3-2为KRT26基因位点第41842284处的PCR扩增产物基因测序峰图；

图4-1为KRT26基因位点第41842481处的PCR扩增产物克隆测序结果示意图；

图4-2为KRT26基因位点第41842481处的PCR扩增产物基因测序峰图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例

1.样品采集：本发明以山东蒙阴益达兔业有限公司和山东农业大学联合培育的长毛兔为试验材料，样本共计1009只，在同一条件下饲养。在其出生后第283天剪毛，养毛期73天，分别测定每只个体产毛量、粗毛率、绒毛直径、粗毛直径等指标。用剪刀紧贴皮肤剪下体侧中心部位的毛样，用手术剪剪取一块黄豆粒大小的耳组织，将剪下的耳组织放入盛有75％酒精的1.5mL离心管中，带回试验室，-20℃保存，用于基因组DNA的提取。

2.实验方法：所采耳组织样品用高盐法提取基因组DNA，用分光光度计检测DNA浓度和质量。提取的DNA于-20℃保存。

3.混池测序筛选基因SNP位点

(1)DNA混池构建：随机抽取100个基因组DNA样品，每20个基因组DNA样品等体积混成一个DNA池。

(2)候选基因引物设计：根据ensemble数据库上兔FZD3基因和KRT26基因，采用Primer5.0设计上述基因5＇、3＇调控区以及外显子编码区引物，引物由上海生工技术服务有限公司合成，引物信息见表1。根据合成的引物信息进行梯度PCR，摸索最佳退火温度，然后利用最佳的退火温度扩增出特定的目的片段。

表1扩增基因组DNA引物

4.PCR扩增：

PCR扩增反应体系如下表2所示：

表2 PCR扩增体系

PCR扩增温度的设置：

预变性95℃ 10min；

35个循环：变性95℃，45sec；

退火温度为53℃；

延伸72℃，30sec；

延伸72℃，10min；

反应完成后将PCR产物置于4℃冰箱内保存，用于上样检测和后续试验分析。

PCR产物检测：采用琼脂糖凝胶电泳的方法对上述得到的PCR产物进行检测，结果见图1，发现PCR产物的特异性较好，扩增片段与目的片段大小一致，可用于下一步试验。

产物测序：将合格的PCR产物送至上海生工技术服务有限公司进行测序，筛选出基因SNP位点；采用飞行质谱检测方法进行SNP分型，将测序结果用DNAMAN和Chromas软件进行序列比对找寻SNPs(参考图2-1、2-2、3-1和3-2)。

5.SNP分型：SNP分型试验由北京康普森生物科技有限公司完成，具体步骤如下：

(1)引物设计：根据SNP位点信息，利用MassARRAY公司设计软件AssayDesignSuitev2.0设计PCR反应和单碱基扩展引物，通过UCSC在线检验引物特异性。

(2)基因组DNA质检：通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度，纯度和降解程度，检测结果判读标准：电泳检测胶图中，DNA条带单一、清晰、无杂质，没有弥散、拖尾现象。

(3)电泳条件：

①0.8％琼脂糖凝胶，170V，25min

②上样量：500ng样品+3μl Loading Buffer

③Marker：Trans2000 Plus3μl

(4)PCR反应：

①PCR反应体系如表3所示：

表3 PCR反应体系

②PCR反应的循环参数如表4所示：

表4 PCR反应的循环参数

(5)SAP消化

①SAP消化反应体系如表5所示：

表5 SAP消化反应体系

②SAP消化的循环参数如表6所示：

表6 SAP消化的循环参数

(6)延伸反应

①延伸反应体系如表7所示：

表7延伸反应体系

②延伸反应的循环参数如表8所示：

表8延伸反应的循环参数

(7)上机检测：

①将反应产物(共9ul)稀释3倍，使用树脂进行脱盐；

②将脱盐处理后的样品点在样品靶上，自然结晶；

③上机进行质谱检测，并收集数据。

根据分型结果，运用R软件、SAS软件进行SNPs群体遗传学分析及其与长毛兔粗毛率和被毛直径变异性状的关联分析。

通过分析图2-1、3-1和4-1，结果显示：通过序列比对发现，FZD3基因位点第41019916处的碱基T突变为C，KRT26基因位点第41842284处的碱基G突变为A，KRT26基因位点第41842481处的碱基G突变为C；也可通过峰图2-2、3-2和4-2所示同一序列位点上出现不同的峰，表明位点处发生了碱基突变，双峰说明是杂合子，单峰说明是纯合子。

实验例、长毛兔粗毛率、绒毛纤维直径变异性状与FZD3基因、KRT26基因的关联分析及群体验证

运用SAS9.2的GLM程序进行方差分析，对多态位点的各个基因型与产毛性状进行关联分析。BLUP模型为：

Y＝Xb+Za+e

Y：产毛性状表型值；X：与固定效应有关的个体数矩阵；b：固定效应(SNP位点、性别效应)；Z：个体加性遗传效应的个体数矩阵；a：个体加性遗传效应；e：随机误差。

按照GBT13835《兔毛纤维试验方法》测定粗毛率该性状，采用直径投影显微镜法所描述的试验步骤进行测定并计算绒毛纤维直径变异系数；根据FZD3基因SNPs、KRT26基因SNPs分别进行等位基因及基因型频率计算，并对其进行哈代温伯格平衡检验，分别得到基因型CC、CT和TT；基因型AA、AG和GG；基因型CC、GC和GG，各基因型对应粗毛率的结果见表9-11，基因型AA、AG和GG对应绒毛纤维直径变异系数的结果见表10。

表9 FZD3基因与长毛兔粗毛率性状关联分析与群体验证结果

表10 KRT26基因第41842284处突变与长毛兔粗毛率和绒毛纤维直径关联分析结果

表11 KRT26基因第41842481处突变与长毛兔粗毛率性状关联分析结果表

根据表9-表11的数据可知，在FZD3基因位点第41019916处对长毛兔的粗毛率影响极显著(P<0.01)，其中TT基因型比CC基因型和CT基因型分别高2.69％、0.23％。该碱基替换控制粗毛率总体遗传变异的5.18％。

当FZD3基因位点第41019916处点碱基T突变为C，含有等位基因C的长毛兔的粗毛率较低。含有等位基因T的长毛兔表现为较高的粗毛率。在育种工作中，建立等位基因C纯合型群体，可显著降低长毛兔群体粗毛率。

KRT26基因位点第41842284处对长毛兔的粗毛率影响显著(P<0.05)、对绒毛纤维直径变异系数影响极显著(P<0.01)，其中GG基因型的粗毛率比AA基因型高1.95％；GG基因型的绒毛纤维直径变异系数比AA基因型与GA基因型分别高1.44％、1.32％。该碱基替换控制粗毛率总体遗传变异的2.43％，同时粗毛率总体遗传变异的17.39％，遗传效应极显著。

当KRT26基因位点第41842284处碱基G突变为A，含有等位基因A的长毛兔的粗毛率与绒毛纤维直径变异系数较低；含有等位基因G的长毛兔的粗毛率与绒毛纤维直径变异系数较高。在育种工作中，通过选择提高等位基因A和降低等位基因G在长毛兔群体中的基因频率，可改良长毛兔粗毛率与绒毛纤维直径的同质性。

KRT26基因位点第41842481处对长毛兔的粗毛率影响显著(P<0.05)其中GG基因型的粗毛率比CC基因型与GC基因型分别高2.1％、0.86％。当KRT26基因位点第41842481处碱基G突变为C，含有等位基因C的长毛兔的粗毛率较低，含有等位基因G的长毛兔的粗毛率较高。在育种工作中，提高等位基因C和降低等位基因G在长毛兔群体中的基因频率，可改良长毛兔粗毛率性状。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学，山东新合心技术有限公司

<120> 与长毛兔粗毛率和被毛直径变异相关的分子标记及应用

<130> 2020.10.12

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1018

<212> DNA

<213> FZD3基因

<400> 1

gttcccagat tgtgatgagc cgtatcctcg acttgtggat ctgaatttag ttggagatcc 60

aactgaagga gccccagtgg cagtgcagag ggactatggt ttttggtgtc cccgagaatt 120

gaaaattgat cctgatcttg gttattcatt tttgcacgtg cgtgattgtt cacctccttg 180

tccaaatatg tattttagga gagaagaact gtcatttgct cgctatttca taggactgat 240

ttcaatcatt tgcctttctg ccacgttgtt tactttttta acttttttga ttgatgtcac 300

aagattccgt tatcctgaaa ggcctattat attttatgca gtctgctata tgatggtatc 360

tttaattttc ttcattgggt ttttgcttga agaccgagta gcctgcaacg catctagccc 420

tgcgcaatat aaagcttcta cagtgacaca aggatctcat aataaagcct gtaccatgct 480

ttttatggta ctttattttt tcaccatggc tggaagtgta tggtgggtaa ttcttaccat 540

cacatggttt ctagcagctg tgccaaagtg gggtagtgaa gctattgaga agaaagcatt 600

gctatttcac gccagtgcat ggggcatccc tggaactcta actatcatcc ttttagcgat 660

gaataaaatt gaaggtgaca acattagtgg cgtgtgtttt gttggcctct acgatgttga 720

cgcattgaga tactttgttc ttgctcccct ctgcctatat gtggtagttg gggtttcact 780

cttgttagct ggcattatat ccctaaacag agttcgaatt gagattccat tagaaaagga 840

gaaccaagat aaattagtga agtttatgat ccggattggt gttttcagca ttctttatct 900

cgtaccactc ttggttgtaa ttggatgcta cttttacgaa caagcctacc gtggcatctg 960

ggaaacaaca tggatacaag aacgctgcag agaatatcac attccatgcc catatcag 1018

<210> 2

<211> 899

<212> DNA

<213> KRT26基因

<400> 2

ccacctgttc tagcacttcc caactgcggg aagcttcaga aatgtgtcca ggacacgaaa 60

cgccgttaaa agtggcgcct ggctcccgcc tacgacagtt ctcaagcagc ttaatgactt 120

tcaggtacga gaacgagctg gctctgcacc agagcgtgga ggccgacacc aacggcctcc 180

gcagggtgct ggaggagctg accctcagcg cggcggacct ggagacccag tgcgagaccc 240

tccgtgagga gctggcgtat ctcaaagcaa accaccagga ggtaaggagc ctgagggcgg 300

cttcgatcgc cgctctctcc cgcttcaagc ccgctgctcc ttccacagcc cgcgactgtc 360

cgccagggtc cccggctgtg ggtaggcaca cggacccctc ttccaggaaa tgcaagtcct 420

gcaaagtgcg tcagggggaa acgtgagtgt agagatggac gcagccccgg gcgtggacct 480

gactcttctg ttgaacaaca tgagggctga gtatgagcac ctggccgagg agaaccgcag 540

agacgcggag gccaggttca acgagaaggt acttccgccg cggccggcac acaccgcgcg 600

tgttcagggc acggtctcgc gggccactaa cgcttctgaa aatcgctctt cagagtgcgc 660

tgctgcagca acagatttcc aatgatgtgg gggcagccgc agcagccaga aatgagctgc 720

ggagctgaaa cgcagcctgc aaaccctgga aatagaactg cagtccctcc aggctgtggt 780

atgtcgcaac caccattgaa tcgggggtgt gcgtgagtgt gcatgtgtgt gtgagtgtgt 840

gtatgtgtgt gagtgtgtat gtatgtgtgt gctatgtgtg tatatgtatc agtatatgt 899

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> FZD3基因的正向引物

<400> 3

gctggaagtg tatggtgggt aa 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> FZD3基因的反向引物

<400> 4

tctcaatgcg tcaacatcgt ag 22

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> KRT26基因的正向引物

<400> 5

gtacgagaac gagctggc 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> KRT26基因的反向引物

<400> 6

cacagcctgg agggactg 18

Claims

1.一种与长毛兔粗毛率相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记为FZD3基因的突变体，所述FZD3基因的突变体由SEQ ID NO:1所示序列中第550位点的碱基T突变为C所形成。

2.一种与长毛兔粗毛率和绒毛纤维直径相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记为KRT26基因的突变体，所述KRT26基因的突变体由SEQ ID NO:2所示序列中第354位点的碱基G突变为A所形成。

3.一种与长毛兔粗毛率相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记为KRT26基因的突变体，所述KRT26基因的突变体由SEQ ID NO:2所示序列中第547位点的碱基G突变为C所形成。

4.一种如权利要求1-3任一项所述的分子标记在长毛兔粗毛率性状标记辅助选择中的应用。

5.一种如权利要求2所述的分子标记在长毛兔绒毛纤维直径性状标记辅助选择中的应用。